PT1343909E - Métodos para produção em grande escala do domínio protease de serina kringle 2 plus (k2s) do plasminogénio em procariotas - Google Patents

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DESCRIÇÃO "MÉTODOS PARA PRODUÇÃO EM GRANDE ESCALA DO DOMÍNIO PROTEASE DE SERINA KRINGLE 2 PLUS (K2S) DO PLASMINOGÉNIO EM PROCARIOTAS" A invenção pertence ao campo da produção de proteínas em células procariotas. A invenção refere-se aos métodos de produção do domínio protease de serina kringle 2 plus (K2S) do activador do plasminogénio tecidularderivado de ADN recombinante em células procariotas, em que a referida K2S é segregada extracelularmente como uma proteína activa e correctamente enrolada e a célula procariota contém e expressa um vector compreendendo ADN codificando para a referida proteína heteróloga operativamente ligada ao ADN codificando para o péptido sinal OmpA. Técnica Anterior

Os sistemas de expressão procariotas para proteínas heterólogas são normalmente utilizados para proteínas que não requerem padrões de glicosilação de mamífero, dado que estes proporcionam um modo económico de produzir grandes quantidades da referida proteína. Na expressão em nível elevado de muitas proteínas heterólogas em E. coli pode ser normalmente verificada a formação de proteínas altamente agregadas ou de corpos de inclusão. Uma forma de produção de proteínas é através de corpos de inclusão, os quais se desenvolvem no citoplasma. Os 1 componentes da parede celular e da membrana externa das células procariotas utilizadas para produção (e. g., E. coli) contaminam, normalmente, o lisado celular contendo a proteína heteróloga quando os referidos corpos de inclusão são preparados por centrifugação a baixa velocidade. 0 componente da membrana externa pode ser eliminado por extracção selectiva com detergentes e concentrações baixas da ureia ou de guanidina·HC1.

Um exemplo dessa proteína heteróloga é um derivado de tPA. 0 activador do plasminogénio tecidular (tPA) é um polipéptido contendo 527 resíduos de aminoácido (27) com uma massa molecular de 72 kDa. A molécula é dividida em cinco domínios estruturais. Próximo da região do terminal N existe um domínio de dedo em ansa, o qual é seguido por um domínio de factor de crescimento. Seguem-se dois domínios semelhantes, kringle 1 e kringle 2. O domínio em dedo e o kringle 2 ligam-se especificamente aos coágulos de fibrina, acelerando, deste modo, a activação pela proteína tPA do plasminogénio ligado. A jusante da kringle 2 encontra-se a protease de serina, cujo local catalítico se localiza no terminal C. A protease de serina é responsável por converter plasminogénio em plasmina, uma reacção importante na homeostase da formação da fibrina e da dissolução dos coágulos. 0 enrolamento correcto do tPA requer o emparelhamento correcto de 17 pontes persulfureto na molécula (D .

Clinicamente, o tPA é um agente trombolítico de eleição para o tratamento do enfarte do miocárdio agudo. Este tem a vantagem de não causar quaisquer efeitos secundários sobre hemorragias sistémicas e a depleção do fibrinogénio (7) . Foram inicialmente utilizadas células do melanoma de Bowes como uma 2 fonte de produção de tPA para finalidades terapêuticas (12). Uma vez que é necessário um processo consistente com uma produção eficiente da proteína altamente purificada, com um bom rendimento para utilização clínica, a construção de tPA recombinante (r-tPA) de comprimento total progrediu para células de mamífero. Foram transfectadas células de ovário de hamster chinês com o gene tPA para sintetizar o r-tPA (8, 22) . Foi recolhido o produto recombinante produzido por um sistema de fermentação de mamífero a partir do meio de cultura. Foram investigados vários esforços na produção r-tPA a partir de bactérias, especialmente de Escherichia coli (10, 13, 30), atraídos pela simplicidade e pela economia de produção. No que respeita ao rendimento baixo e a formação de corpos de inclusão, os quais resultam em enrolamento incorrecto e numa enzima inactiva, foram propostas numerosas estratégias para superar estes problemas. 0 critério principal é sintetizar a menor molécula que seja ainda activa em lugar do tPA de comprimento total.

Foram consideradas várias variantes de mutantes de eliminação, incluindo a protease de serina kringle 2 plus (K2S). No entanto, a actividade enzimática da K2S recombinante (r-K2S) foi obtida apenas quando foram conseguidos processos de re-enrolamento dos corpos de inclusão purificados a partir do compartimento citoplasmático (16, 29). Para evitar os processos de re-enrolamento complicados e a distribuição periplásmica de proteína, foram explorados sistemas de expressão bacterianos especiais (6, 31). Apesar da expressão periplásmica do tPA, a sobre-expressão originou agregados inactivos, mesmo nas condições de oxidação relativamente elevadas no periplasma. 3

Na técnica anterior existem algumas descrições de métodos para a preparação de K2S recombinante em E. coli. No entanto, não existe qualquer divulgação de um método originando um método rentável para produção em grande escala de K2S biologicamente activa.

Obukowicz et al. (25) expressaram e purificaram r-K2S a partir do espaço periplásmico. A desvantagem óbvia deste método foi um passo de extracção periplásmica extra, o qual não é adequado para a produção em grande escala.

Saito et al. (29) divulgam a expressão citoplasmática de r-K2S. Os autores utilizaram um processos de renaturação in vivo da r-K2S expressa, a qual foi purificada a partir do espaço citoplasmático de E. coli, sob a forma de corpo de inclusão. A Boehringer Mannheim utiliza um processo complicado de desnaturação/re-enrolamento semelhante, envolvendo os passos de digestão da célula, solubilização sob condições desnaturantes e redutoras e reactivação sob condições oxidantes na presença de GSH/GSSG, o que não é rentável e requer a mutação da sequência de aminoácidos (24).

Em 1991, Waldenstrõm et al. (34) construíram um vector (pEZZK2P) para a secreção de domínio protease de serina kringle 2 plus para o sobrenadante de cultura de E. coli. Foi utilizada hidroxilamina para remover o péptido de fusão ZZ a partir da fracção purificada com IgG-Sepharose. 0 agente de quebra hidroxilamina requereu modificação dos locais de quebra da protease de serina kringle 2 plus (Asn -* Ser e Asn -> Gin) para, deste modo, os proteger da digestão pela hidroxilamina. No entanto, a molécula K2S não-nativa resultante, não enrolada apropriadamente não é adequada para finalidades terapêuticas. A 4 sequência invulgar pode mesmo activar o sistema imunitário humano. Hua et al. (37) divulgam a secreção de um polipéptido de fusão OmpA-K2 para o periplasma de E. coli. 0 problema subjacente à presente invenção era, então, proporcionar um método comercialmente aplicável para a produção em grande escala de K2S, em que a proteina é segregada para o sobrenadante de cultura, sob a sua forma biologicamente activa.

Descrição da invenção 0 problema foi resolvido dentro do âmbito das reivindicações e da descrição da presente invenção. A utilização do singular ou plural nas reivindicações ou na descrição não pretende de modo algum ser limitante e inclui também a outra forma. A invenção refere-se ao método da produção de K2S derivada de ADN recombinante em células procariotas, em que a referida proteína heteróloga é segregada extracelularmente como uma proteína activa e correctamente enrolada, caracterizada por a célula procariota conter e expressar um vector compreendendo ADN codificando para a referida proteina heteróloga operativamente ligada ao ADN codificando para o péptido sinal OmpA.

Surpreendentemente, a utilização do péptido sinal OmpA em combinação com os aminoácidos do terminal N SEGNSD (SEQ ID N°: 3) translocaliza as proteínas derivadas de ADN recombinante para a superfície externa e facilita a libertação da molécula funcional e activa para o meio de cultura numa maior 5 extensão do que qualquer outro método da técnica anterior. Antes de atravessar a membrana externa, a proteína derivada de ADN recombinante é enrolada correctamente de acordo com o método da presente invenção. 0 péptido sinal é quebrado para produzir uma molécula madura. Surpreendentemente, a eficiência da remoção de péptido sinal é muito elevada e leva ao enrolamento correcto da proteína derivada de ADN recombinante. Este método exemplificado para o domínio protease de serina kríngle 2 plus (K2S) da proteína do activador do plasminogénio tecidular, no exemplo 1, é também descrita para a expressão de várias proteínas e polipéptidos diferentes que não requerem glicosilação de mamífero em células hospedeiras procariotas. 0 método de acordo com a invenção tem vantagens em relação a métodos conhecidos na técnica - não apenas por ser um método de produção económico devido às células hospedeiras procariotas utilizadas, surpreendentemente, é segregada uma molécula correctamente enrolada para o sobrenadante. 0 especialista na técnica pode obter facilmente a sequência de ADN da K2S a ser expressa pelo método de acordo com a invenção, a partir de bases de dados adequadas e cloná-la de forma a ser utilizada no método de acordo com a invenção. O referido péptido sinal OmpA interage com a SecE e é distribuído através da membrana interna pela energia produzida por SecA, a qual se liga a componentes Sec (SecE-SecY) .A SecY forma um poro de secreção para expedir a proteína derivada de ADN recombinante de acordo com a invenção. 0 espaço entre a membrana externa e a membrana interna de bactérias Gram negativas, o periplasma, tem um estado oxidativo mais elevado em comparação com o espaço citoplasmático. Isto suporta a formação 6 de ligações persulfureto e enrolamento adequado da K2S no periplasma, para produzir uma molécula activa. De acordo com a presente invenção, o péptido sinal irá ser quebrado de forma a produzir uma molécula madura. 0 complexo entre a secretina GspD e a lipoproteina GspS na membrana externa serve de canal porta para segregar a proteína recombinante de acordo com a invenção para o meio extracelular. Este processo de secreção requer energia, a qual é produzida no citoplasma pela proteína GspE de ligação a nucleótidos, depois transferida para proteína da membrana interna (Gsp G-J, F e k-n) . A GspC transfere a energia para GspD formando um reticulado entre um conjunto de proteínas da membrana interna (Gsp G-J, F e K-N) e GspD. A proteína recombinante é correctamente enrolada antes de atravessar a membrana externa com sucesso.

De acordo com a invenção, operativamente ligado, significa que o ADN codificando K2S compreendendo o ácido nucleico codificando SEGNSD na sua porção N terminal é clonado directamente a jusante do ADN de OmpA no vector, para realizar a expressão da proteína de fusão OmpA - proteína heteróloga e para dirigir a secreção para fora da célula hospedeira procariota. Tipicamente, a maioria da K2S é segregada e pode ser, depois purificada por métodos adequados, tal como precipitação com sulfato de amónio. A invenção inclui também a utilização de indutores, tais como IPTG ou IPTG, em combinação com glicerol, a melhoria das condições de incubação e do período de recolha para maximizar a quantidade da proteína activa.

Os requerentes verificaram surpreendentemente que o péptido sinal OmpA ligado operativamente aos aminoácidos caracterizados pela sequência SEGNSD (SEQ ID N°: 3) conduz à secreção da 7 proteína heteróloga para o meio e não à acumulação no espaço periplásmico. 0 referido ADN codificando o péptido sinal OmpA é fundido com um péptido curto caracterizado pela sequência de aminoácidos SEGNSD (SEQ id N°:3) ou pela sequência de ácidos nucleicos codificante TCTGAGGGAAACAGTGAC (SEQ ID N°: 5) e localizada na porção do terminal N de K2S. Deste modo, a referida proteína de fusão consiste em 0mpA-SEGNSD-K2S.

Deste modo, num método preferido de acordo com a invenção, a referida célula procariota contém e expressa um vector compreendendo o ADN codificando para a K2S operativamente ligado ao ADN codificando para o péptido sinal OmpA, o qual está operativamente ligado à molécula de ácidos nucleicos definida pela sequência TCTGAGGGAAACAGTGAC (SEQ ID N°: 5). 0 método de acordo com a invenção compreende células hospedeiras procariotas tais como, mas não limitadas a Escherichia coli (E. coli), Bacillus subtilis, Streptomyces, Pseudomonas, e. g., Pseudomonas putida, Proteus mirabilis ou Staphylococcus, e. g., Staphylococcus carnosus. De um modo preferido, as referidas hospedeiras de acordo com a invenção, são bactérias Gram negativas.

De um modo preferido, um método de acordo com a invenção é também caracterizado por a célula procariota ser E. coli. As estirpes adequadas incluem, mas não estão limitadas a E. coli XL-1 blue, E. coli BL21 (DE3), E. coli JM109, E. coli série DH, E. coli TOPIO e E. coli HB101.

De um modo preferido, um método de acordo com a invenção é também caracterizado por serem realizados os passos seguintes: a) o ADN codificando K2S é amplificado por PCR; b) o produto de PCR é purificado; c) o referido produto de PCR é inserido num vector compreendendo o ADN codificando para o péptido sinal OmpA e o ADN codificando para gpm, de forma a que o referido produto de PCR esteja ligado operativamente, a montante, ao ADN codificando para a sequência sinal OmpA e esteja ligado, a jusante, ao ADN codificando para gpm do referido vector; d) que esteja inserido um codão de terminação entre a referida proteína heteróloga e gpIII; e) o referido vector é expresso pela célula procariota f) a proteína heteróloga é purificada.

Para o passo a) de acordo com a invenção, a selecção/concepção dos iniciadores é importante para clonar o ADN na posição e direcção correctas do vector de expressão (ver o exemplo 1). Deste modo, são descritos os iniciadores como exemplificados no exemplo 1 e na figura 4. Com gp III do passo c) pretende-se significar o gene da proteína III que está maioritariamente presente em vectores fagemídicos. É inserido o codão de terminação para evitar a transcrição da gp III, originando deste modo, eventualmente, a secreção de K2S. Pode ser utilizado qualquer método adequado na inserção do codão de 9 terminação, tal como mutagénese dirigida para um local (e. g.,

Weiner MP, Costa GL (1994) PCR Methods Appl 4(3) : S131-136;

Weiner MP, Costa GL, Schoettlin w, Cline J, Mathur E, Bauer IC (1994) Gene 151 (1-2):119-123; ver também o exemplo 1).

Pode ser utilizado qualquer vector no método de acordo com a invenção, de um modo preferido, o referido vector é um vector fagemidico (ver abaixo). A região não traduzida pode conter um elemento regulador, tais como, e. g., uma unidade de iniciação da transcrição (promotor) ou um intensificador. 0 referido promotor pode ser, por exemplo, um promotor constitutivo, induzivel ou controlado pelo desenvolvimento. De um modo preferido, sem excluir outros promotores conhecidos, os promotores constitutivos do Citomegalovirus humano (CMV) e do virus do sarcoma de Rous (RSV), assim como o promotor do virus Simio 40 (SV 40) e do Herpes simplex. Os promotores induzíveis de acordo com a invenção compreendem promotores resistentes a antibióticos, promotores de choque térmico, induzíveis por hormonas, "Promotor de vírus de tumor mamário" e promotor da metalotioneína. Os promotores preferidos incluem o promotor T3, o promotor T7, Lac/aral e Ltet0-1.

De um modo mais preferido, um método de acordo com a invenção é também caracterizado por o ADN codificando para a proteína heteróloga ser precedido por um promotor lac e/ou um local de ligação ao ribossoma, tal como a sequência de Shine-Dalgarno (ver também o exemplo).

Os vectores adequados de acordo com a invenção incluem, mas não estão limitados a vectores virais, tais como, e. g., 10

Vaccinia, Vírus da Floresta de Semliki e Adenovírus, veetores fagemídicos e semelhantes. São preferidos veetores que possam ser vantajosamente utilizado em E. coli, mas também em qualquer outro hospedeiro procariota tais como pPROTet.E, pPROLar.A, membros da família pBAD, família pSE, família pQE e pCAL.

Outra forma de realização preferida da invenção refere-se ao vector pComb3HSS contendo um ADN de acordo com a invenção, em que a expressão da proteína gp III é suprimida ou inibida por eliminação da molécula de adn codificando a referida proteína gp III ou por um codão de terminação entre o gene codificando para um polipéptido contendo a proteína heteróloga e o gene da proteína III. As proteínas tPA podem incluir um, vários ou todos os seguintes domínios ou suas subunidades ou variantes: 1) Domínio em dedo (4-50) 2) Domínio do factor de crescimento (50-87) 3) Domínio Kringle 1 (87-176) 4) Domínio Kringle 2 (176-262) 5) Domínio de protease (276-527) A numeração/denominação dos domínios está de acordo com o número de acesso Genbank GI 137119 ou Nature 301 (5897), 214-221 (1983) .

Um método de acordo com a invenção é caracterizado por ser produzido o domínio protease de serina (5.) Kringle 2 (4.) plus K2S do activador do plasminogénio tecidular humano ou uma sua 11 variante funcional. De um modo mais preferido, um método de acordo com a invenção é também caracterizado por o vector ser um vector fagemidico compreendendo ADN codificando o péptido sinal OmpA e ADN codificando para gpIII. 0 exemplo seguinte pretende auxiliar a compreensão da invenção e não deve de modo algum ser considerado como um limitação do âmbito da invenção.

Exemplo 1

MATERIAIS E MÉTODOS

Concepção de iniciadores. Foi sintetizado um par de iniciadores SK21174 [5' GAGGAGGAGGTGGCCCAGGCGGCCTCTGAGGGAAACAG

TGAC 3'] (SEQIDN0: 6) e ASSP [5' GAGGAGGAGCT GGCCGGCCTGGCCCGGTCGCATGTTGTCACG 3'] (SEQ ID N° : 7) (Life

Technologies, Grand Island, NI), Para amplificar uma parte especifica do gene tPA. Estes iniciadores foram concebidos com base no gene tPA humano obtido das bases de dados NCBI (gl37119). Estes foram sintetizados com locais de clonagem terminais Sfi I (sublinhados) de forma a que a grelha de leitura ATG do gene gpIII no vector fagemidico, pComb3HSS, seja mantida ao longo da sequência inserida.

Foi concebido um outro conjunto de iniciadores para mutagénese dirigida para um local para emparelhar com a sequência situada entre o gene K2S e o gene III no pComb3H-K2S. As sequências dos iniciadores com mutação de bases (sublinhadas) para produzir um novo codão de terminação foram 12 MSTPA [5' ACATGCGACCGTGACAGGCCGGCCAG 3'] (SEQ ID N° : 8) e MASTPA [5' CTGGCCGGCCTGTCACGGTCGCATGT 3'J (SEQ ID N°: 9).

Amplificação do gene K2S por PCR. Foi suspenso um pg dos iniciadores SK.2/174 e ASSP em conjunto com 50 ng de molde p51-3 (obtido do Dr. Hiroshi Sasaki, Fujisawa Pharmaceutical, Japão) em 100 pL de mistura de PCR. Foi finalmente adicionada uma quantidade de 2,5 U de polimerase Taq (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) à solução. A condição de amplificação titulada foi iniciada com arranque a 85 °C durante 4 min, seguida de desnaturação a 95 °C durante 50 s, emparelhamento a 42 °C durante 50 s, extensão a 72 °C durante 1,5 min. Foram realizados trinta e cinco ciclos repetidamente. A mistura foi incubada adicionalmente a 72 °C durante 10 min. O produto amplificado com 1110 pb foi adicionalmente purificado por QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, Hilden, Alemanha). A correcção do produto purificado foi confirmada por enzimas de restrição.

Construção do fagemidio expressando K2S. O produto de PCR purificado de K2S e o fagemidio pComb3HSS (gentilmente proporcionado pelo Dr. Carlos F. Barbas, Scripps Institute, EUA) foram digeridos com Sfi I (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) para preparar locais de clonagem coesivos específicos. Foram digeridas quatro pg do produto de PCR purificado com 60 U de Sfi I a 50 °C durante 18 h. Para pComb3HSS, foram tratados 20 pg de vectores fagemidico com 100 U de Sfi I. Os produtos digeridos do produto de PCR purificado de K2S e pComb3HSS (-3300 pb) foram subsequentemente, purificados em gel com o Kit QIAquick Gel Extraction (QIAGEN, Hilden, Alemanha). Foram introduzidas 5 U de ligase de T4 (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) numa mistura de 0,7 pg 13 de pComb3HSS digerido com Sfi I purificado e 0,9 pg de produto de PCR digerido com Sfi I purificado. A reacção de ligação foi incubada a 30 °C durante 18 h, O fagemidio construído de novo foi designado pComb3H-K2S.

Transformação de xl-1 Blue. Foram transformados duzentos pL de E. coli XL-1 Blue competente com CaCl2 (Stratagene, La Jolla, CA) com 70 ng de produto ligado ou transformado. As células transformadas foram propagadas por espalhamento em agar LB contendo ampicilina 100 pg/mL e tetraciclina 10 pg/mL (Sigma, Saint Louis, MO) . Após cultura a 37 °C durante 18 h, foram seleccionadas várias colónias resistentes a antibiótico para minipreparações de plasmideo utilizando o método de lise alcalina. Cada plasmideo purificado foi submetido a análise de local de restrição Sfi I. Foi, subsequentemente, propagado um transformante contendo um plasmideo com o(s) local(ais) de restrição Sfi I correcto(s), durante 18 h, a 37 °C em 100 mL de meio liquido LB com ampicilina 100 pg/mL e tetraciclina 10 pg/mL. Foi realizada uma maxipreparação de plasmideo utilizando o Kit QIAGEN Plasmid Maxi (QIAGEN, Hilden, Alemanha). O plasmideo purificado foi re-examinado para locais de restrição específicos por Sfi I e foi sequenciado com o Kit AmpliTaq DNA Polymerase Terminator Cycle Sequencing (Perkin-Elmer Corporation, Forster City, CA).

Mutagénese dirigida para um local de pComb3H-K-2S. Foram misturados 10 ng do molde pComb3H-K2S com 125 ng de iniciadores MSTPA e MASTPA. Foi adicionada polimerase de ADN de PfuTurbo (Stratagene, LA Jolla, CA) a 2,5 U à mistura para a amplificação em ciclos. A reacção iniciou-se com um ciclo de 95 °C durante 30 s. Consequentemente foi seguida por 16 ciclos consistindo em 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 1 min e 68 °C durante 9 min. O 14 tubo de reacção foi, subsequentemente, colocado em gelo durante 2 min. Foram adicionadas 10 U de enzima de restrição Dpn I (Stratagene, LA Jolla, CA) à reacção de amplificação e foram incubadas durante 1 h a 37 °C, para destruir as cadeias molde. Este produto sintetizado (MpComb3H-K2S) foi utilizado adicionalmente para transformar E. coli XL-1 Blue.

Preparação da apresentação em fagos da K2S recombinante. Após pComb3H-K2S ter sido transformada em E. coli XL-1 Blue, foi realizada a técnica de apresentação em fagos. Foi propagado um clone de E. coli XL-1 Blue transformado com pComb3H-K2S em 10 mL de super meio liquido contendo ampicilina 100 pg/mL e tetraciclina 10 pg/mL a 37 °C até ser obtida a D.O. [600 nm] de 1,5. A cultura bacteriana foi subsequentemente propagada em 100 mL do mesmo meio e foi cultivada durante 2 h. Foi utilizada uma quantidade de 1012 pfu de fago auxiliador VCSM13 (Stratagene, La Jolla, CA) para infectar a E. coli XL-1 Blue transformada. Após 3 h de incubação, foi adicionada canamicina numa concentração final de 70 pg/mL de concentração final à cultura. A cultura foi mantida sob agitação (200 RPM) durante 18 h a 37 °C. Foram então recolhidos os bacteriófagos contendo K2S em gp3 (k2S-<|>) adicionando PEG MW 8000 (Sigma, Saint Louis, MO) 4% p/v e NaCl 3% p/v. Finalmente, o fago recolhido foi ressuspenso em 2 mL de PBS a pH 7,4. O número de fagos foi determinado por infecção de E. coli XL-1 Blue. Foram calculadas as unidades formadoras de colónias por mililitro (cfu/mL), como descrito anteriormente (21) .

Expressão de K2S recombinante em frascos de agitadora. Foi cultivada XL-1 Blue transformada com MpComb3H-K2S em 100 mL de super meio líquido (triptona 3% p/v, extracto de levedura 2% p/v e MOPS 1% p/v) a pH 7,0 na presença de ampicilina (100 pg/mL) a 15 37 °C até ser obtida a D.O. [600 nm] de 0,8. Subsequentemente, a síntese proteica foi induzida com IPTG (Promega, Madison, WI) 1 mM. As bactérias foram cultivadas adicionalmente agitando (200 RPM) durante 6 h, a 30 °C. O sobrenadante de cultura foi reunido e foi precipitado com sulfato de amónio saturado a 55% (32). O precipitado foi reconstituído com PBS, pH 7,2 e foi dialisado na mesma solução tampão a 4 °C durante 18 h. Foram extraídas as proteínas periplásmicas das células bacterianas utilizando um choque de clorofórmio como anteriormente descrito por Ames et al. (2).

Quantificação da K2S recombinante por imunoensaio. Foi revestida fase sólida com monoclonal anti-domínio kringle 2 (16/B) (generosamente proporcionado pelo Dr. Ute Zacharias, Central Institute of Molecular Biology, Berlim-Buch, Alemanha) para detectar a r-K2S. Foram realizados os processos ELISA padrão de lavagem e bloqueio. Foram adicionados cinquenta pL de K2S—φ 1011 cfu/mL ou r-K2S secretora a cada poço revestido com anti-kringle 2. A detecção antigénio-anticorpo foi realizada como se segue. Foi adicionado anti-Ml3 de ovelha conjugado com hrp (Pharmacia Biotech, Upsala, Suécia) ou anti-tPA de ovelha conjugado com HRP (Cedarlane, Ontário, Canadá), a cada poço de reacção, após o passo de lavagem. Foi submetido substrato TMB a cada poço e a reacção foi finalmente terminada com uma solução de H2SO4, após uma incubação de 30 min. Foi utilizado tPA de melanoma 86/670 padrão (National Institute for Biological

Standards and Control, Hertfordshine, UK) como controlo positivo.

Ensaio da actividade amidolítica. Foi adquirido um kit de testes para a detecção da actividade amidolítica de tPA de Chromogenix (Molndal, Suécia). Foi utilizada a mistura de 16 substrato contendo plasminogénio e S-2251 para determinar a actividade enzimática protease de serina. Foi ensaiada a diluição de 1CT2 de cada amostra precipitada com amónio e sem fragmentos de fibrinogénio humanos estimuladores. 0 processo de ensaio foi de acordo com o manual COASET t-PA. SDS-PAGE e imunotransferência. 0 produto precipitado dialisado do sobrenadante de cultura foi adicionalmente concentrado 10 vezes com centricon 10 (AMICON, Beverly, MA) . A amostra concentrada foi submetida a separação de proteínas por SDS-PAGE, gel de resolução a 15%, em tampão redutor, seguida de electrotransferência para nitrocelulose. A nitrocelulose foi então bloqueada com leite desnatado a 4% durante 2 h. Foi aplicada uma diluição adequada de anti-tPA de ovelha conjugado com HRP à nitrocelulose, para detectar a r-K2S. A banda imunorreactiva foi visualizada através de um sistema de detecção sensivel, Kit Amplified Opti-4CN (BIORAD, Hercules, CA) .

Electroforese em gel de poliacrilamida copolimerizado com plasminogénio. Foi copolimerizado um gel de resolução a 11% de poliacrilamida com plasminogénio e gelatina como anteriormente descrito por Heussen et al. (14). O gel de empacotamento foi preparado numa concentração de 4% sem plasminogénio e gelatina. A electroforese foi realizada a 40 °C a uma corrente constante de 8 mA. O SDS residual no bloco de gel foi removido após agitação suave à temperatura ambiente durante 1 h em Triton X-100 a 2,5%. Depois, o bloco de gel foi incubado em glicina-NaOH 0,1 M, pH 8,3, durante 5 h, a 37 °C. Finalmente, o bloco de gel foi corado e descorado com o sistema de coloração azul brilhante de Coomassie (R-250) normal. A posição do péptido possuindo actividade enzimática não foi corada pelo corante em contraste com o fundo de cor azul. 17

RESULTADOS

Construção de vector contendo o gene K2S. Os requerentes amplificaram a porção protease de serina kringle 2 plus de tPA (Ser174 do domínio kringle 2 até Pro527 na protease de serina) a partir do vector p51-3, utilizando os iniciadores SK2/174 e ASSP. 0 produto com 1110 pb amplificado foi revelado por electroforese em gel de agarose (fig. 1, faixa 2) e foi inserido no fagemídio pComb3HSS através de locais de quebra Sfi I duplos nas extremidades 5' e 3' na grelha de leitura correcta. Deste modo foi produzido um novo vector, pComb3H-K2S, contendo a K2S. Neste vector, a K2S está flanqueada a montante pela sequência sinal OmpA e a jusante por gp3. A inserção correcta da K2S foi verificada tanto por análise de restrição com Sfi I (fig. 2, faixa 3), ou por análise por PCR (revelação de uma única banda com 1110 pb), como por sequenciação do ADN. Na fig. 3 é proporcionado o diagrama esquemático do mapa do pComb3H-K2S. r-K2S apresentada em fagos. Foi utilizado o fago filamentoso VCSM13 para infectar E. coli XL-1 Blue transformada com pComb3H-K2S, X[K2S]. O VCSM13 foi propagado e incorporou a proteína de fusão K2Sgp3 durante os processos de empacotamento virai. O fago recombinante recolhido (K2S<|)) originou uma concentração de 5,4 x 1011 cfu/mL determinada por reinfecção de E. coli XL-1 Blue com fagos precipitados com PEG. Estas partículas fágicas recombinantes foram verificadas para a expressão da r-K2S por ELISA em sanduíche. A proteína K2S heteróloga ligada ao fago foi reconhecida pelo anticorpo monoclonal anti-Aríngle 2 (16/B) utilizando o sistema de

detecção de anticorpo anti-tPA de ovelha conjugado com HRP. A absorvência deste ensaio foi de 1,12 ± 0,03 (Tabela 1). A quantidade de K2S detectável em 1012 partículas de fago é igual a 18 336 ng da proteína em relação ao tPA de melanoma padrão. 0 anticorpo anti-tPA de ovelha conjugado com HRP foi substituído por anticorpo anti-Ml3 de ovelha conjugado com HRP, para confirmar que a proteína de fusão K2S-gp3 estava associada com partículas de fago. Esta imuno-reacção apresentou uma absorvência de 1,89 ± 0,07 (Tabela 1). Pelo contrário, se o anticorpo de captura era anticorpo anti-Ml3 de ovelha, foi observada uma K2S extremamente baixa com anticorpo anti-tPA de ovelha conjugado com HRP; a absorvência foi de apenas 0,17 ± 0,01 (Tabela 1) . Isto sugeriu que apenas uma minoria das partículas de fago purificadas continha a proteína de fusão K2S-gp3. Foi utilizado VCSM13 preparado a partir de E. coli XL-1 Blue não-transformada como um controlo negativo.

Construção de MpComb3H-K2S. Os requerentes produziram um codão de terminação entre K2S e gp3 em pComb3H-K2S com o auxílio dos iniciadores mutagénicos (MSTPA e MASTPA) (Fig. 4) . Para enriquecer o MpComb3H-K2S sintetizado de novo e transformado, a mistura de amplificação em ciclos foi totalmente digerida com Dpn I para degradar o molde pComb3H-K2S anterior metilado com dam (a Dpn prefere ADN metilado com dam) . Após a transformação de E. coli XL-1 Blue com MpComb3H-K2S, foi seleccionado um transformante XM[K2S] para estudo adicional. Como consequência da substituição de pb, foi perdido um local de quebra Sfi I próximo da extremidade 3' do gene K2S após a mutagénese dirigida para um local. Foi observada uma versão linear com 4319 pb de MpComb3H-K28 quebrado com Sfi sem o aparecimento do fragmento do gene K2S inserido (Fig. 5, faixa 3) . Deste modo, o gene K2S codificado por MpComb3H-K28 foi expresso em E. coli XM[K2S] na forma de fusão não-gp3. 19

Expressão e purificação da K2S. A expressão da K2S em E. coli XM [K2S] foi induzida por IPTG. A r-K2S foi detectável utilizando ELISA tanto no espaço periplásmico como no sobrenadante de cultura. A quantidade de proteína heteróloga em cada preparação foi determinada por ELISA em sanduíche e estava relacionada com o padrão tPA. A fracção periplásmica produziu 1,38 pg de r-K2S (aproximadamente 32%) enquanto que foram obtidas 2,96 pg de r-K2S (aproximadamente 68%) no sobrenadante de cultura precipitado com amónio, a partir de 100 mL de cultura bacteriana em frascos de agitadora com D.O. [600 nm] de 50. Foi utilizado ELISA em sanduiche para verificar o fago precipitado com PEG a partir de E. coli XM [K2S] infectada com VCSM13. Não foi detectado qualquer r-K2S capturado por anticorpo monoclonal anti-Aríngle 2 por anti-Ml3 conjugado com HRP, indicando que a K2S não é apresentada nas partículas de fago, se gp3 estiver ausente.

Medição da actividade amidolítica. Se o domínio de protease de serina estiver presente na amostra, o plasminogénio irá ser convertido em plasmina. A plasmina produzida irá digerir adicionalmente o substrato S-2251 num produto corado, p-nitroanilina, o qual tem um máximo de absorvência a 405 nm. A actividade específica do produto recombinante está de acordo com a absorvência. Foi avaliada e comparada a actividade enzimática dependente do fibrinogénio de cada amostra i.e., K2S-(|), r-K2S periplásmica ou r-K2S do sobrenadante de cultura. Tanto a k2S —φ como a r-K2S periplásmica apresentavam actividade enzimática notavelmente baixa, a qual estava abaixo da sensibilidade do teste (0,25 iU/mL). A r-K2S do sobrenadante de cultura originou uma actividade enzimática dependente do fibrinogénio de 7 IU/mL. Deste modo, os requerentes obtiveram um total de 700 IU de 20 actividade enzimática a partir de 100 mL de cultura. Não foi observada qualquer actividade enzimática da r-K2S purificada a partir do sobrenadante de cultura na ausência de fibrinogénio -enquanto que o tPA de melanoma padrão apresentou alguma actividade.

Demonstração de proteína recombinante por imunotransferência. A K2S parcialmente purificada proveniente do sobrenadante de cultura de E. coli XM[K2S] revelou uma massa molecular de 39 kDa utilizando anticorpos anti-tPA de ovelha (Fig. 6). O controlo negativo, sobrenadante de cultura de E. coli XLl-blue não-transformada parcialmente purificado, não continha qualquer banda reactiva com um tamanho semelhante.

Localização de enzima activa por PAGE. O plasminogénio foi copolimerizado e foi imobilizado com gelatina em gel de poliacrilamida antes da electroforese. Foram analisados os sobrenadantes de cultura de E. coli XL-1 Blue, E. coli XL-1 Blue transformada com pComb3HSS e E. coli XM[K2S] precipitados com sulfato de amónio (Fig. 7) . Todas as amostras foram processadas em condições não redutoras para preservar a conformação correcta e a actividade do domínio protease de serina. Foram observadas áreas transparentes de plasminogénio digerido com protease de serina apenas nas posições de 34 e 37 kDa dos sobrenadantes de cultura de E. coli XM [K2S] precipitados com sulfato de amónio. As outras amostras não originaram qualquer zona de transparência. A faixa de controlo positivo de tPA de melanoma padrão apresentou, também, actividade enzimática nas posições de 66 e 72 kDa. 21

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Legendas das Figuras FIG. 1. Validação do produto de amplificação por PCR do gene K2S do vector p51-3 utilizando os iniciadores SK2/174 e ASSP. A faixa 1 mostra o marcador de 1 kb (Roche Molecular Biochemicals, Indianapolis, IN) . A faixa 2 foi carregada com 1 pL do produto amplificado. É representada uma banda única a 1110 pb. A electroforese foi realizada num gel de agarose a 1%. FIG. 2. Foi demonstrada a identificação do gene K2S inserido a 1110 pb(*) após digestão de pComb3H-K2S com Sfi na faixa 3. A Faixa 1 mostra o marcador de 1 kb. A faixa 2 28 foi carregada com pComb3H-K2S não cortado. A electroforese foi realizada num gel de agarose a 1%. FIG. 3. Esquema de pComb3H-K2S mostrando dois locais de clonagem Sfi I nos quais o gene K2S foi inserido. São também representados a sequência sinal (OmpA), o local de ligação do ribossoma (RIBS), o promotor lac e o gene gpIII. FIG. 4. Diagrama esquemático do local de mutação na junção entre os genes K2S e gpm em pComb3H-K2S. 0 local de emparelhamento de pComb3H-K2S está ligado a um conjunto de iniciadores de mutação (MSTPA e MASTPA) contendo oligonucleósidos modificados (sublinhados). Após a realização da amplificação em ciclos, o local 1 de Sfi I (a negrito) é modificado e é perdido na cadeia sintetizada de novo. FIG. 5. Caracterização de MpComb3H-K2S sintetizado de novo pela enzima de restrição Sfi I. É observada uma banda única a 4319 pb na faixa 3 que se refere a um local de quebra único de MpComb3H-K2S. Não é possível visualizar qualquer banda de K2S inserida a 1110 pb. A Faixa 1 mostra o marcador de 1 kb. A faixa 2 foi carregada com MpComb3H-K2S não cortado. A electroforese foi realizada em gel de agarose a 1%. FIG. 6. Identificação de uma banda reactiva imunológica da proteína recombinante purificada a partir de sobrenadante de cultura de E. coli xm [K2S] com anti-tPA de ovelha conjugado com HRP. A Faixa I foi carregada com 40 ng de tPA de melanoma padrão (86/670), o qual apresentou a banda reactiva a 70 kDa. Foram aplicados os sobrenadantes de 29 concentrados cultura parcialmente purificados e provenientes de E. coli XLl-Blue não-transformada e E. coli XM[K2S], respectivamente, às faixas 2 e 3. A banda reactiva característica foi particularmente revelada na faixa 3 a 39 kDa.

FIG. 7. Determinação do peso molecular de r-K2S extracelular contendo o domínio de protease de serina activo por electroforese em gel de poliacrilamida copolimerizado com plasminogénio. A faixa 1 continha os padrões de peso molecular indicados (x 1CT3), SDS-6H (Sigma, Saint Louis, MO) . Foram carregados cinquenta pg de sobrenadantes de cultura de E. coli XL-1 Blue, E. coli XL-1 Blue transformada com pComb3HSS e E. coli XM[K2S] precipitados com sulfato de amónio saturado a 55%, respectivamente, nas faixas 2, 3 e 4. A faixa 5 continha 50 mIU de tPA de melanoma padrão (86/670). São visíveis zonas transparentes de plasminogénio digerido no gel de poliacrilamida apenas na faixa 4 a um peso molecular de 34 e 37 kDa (B) e na faixa 5 a um peso molecular de 66 e 72 kDa (A).

FIG. 8. Estrutura A

Molécula K2S nativa a partir dos aminoácidos 174-527 sem modificação (SEQ ID N°: 10). FIG. 9. Estrutura B-0

Molécula nativa K2S a partir dos aminoácidos 197-527 sem modificação. (SEQ ID N°: 11) 30 FIG. 10. Estrutura B-l

Molécula K2S a partir dos aminoácidos 193-527, em que foram adicionados os aminoácidos SEGN à estrutura B-0 da Fig. 9 na porção do terminal N (SEQ ID N°: 12). FIG. 11. Estrutura B-2

Molécula K2S a partir dos aminoácidos 193-527, como na Fig. 10, em que Cys-261 foi permutado por Ser (SEQ ID N°: 13). FIG. 12. Estrutura B-3

Molécula K2S a partir dos aminoácidos 191-527, em que foram adicionados os aminoácidos SEGNSD à estrutura B-0 da Fig. 9 na porção do terminal N (SEQ ID N°: 14). FIG. 13. Estrutura B-4

Molécula K2S a partir dos aminoácidos 191-527, como na Fig. 12, em que Cys-261 foi trocado por Ser (SEQ ID N°: 15) .

FIG. 14. Estrutura C

Molécula K2S nativa a partir dos aminoácidos 220-527 sem modificação. Esta molécula pode ser adicionalmente modificada de uma forma semelhante como divulgado para a estrutura B nas figuras 10-13 (SEQ ID N°: 16). 31

FIG. 15. Estrutura D

Molécula nativa K2S a partir dos aminoácidos 260-527 sem modificação. Esta molécula pode ser adicionalmente modificada de uma forma semelhante como divulgado para a estrutura B nas figuras 10-13 (SEQ ID N°: 17). FIG. 16. Molécula tPA (SEQ ID N°: 18)

Tabela TABELA 1. Detecção da molécula r-K2S numa preparação de fagos por ELISA em sanduíche

Anticorpo detector (conjugado com HRP) Anticorpo de captura Anti-tPA Anti-M13 k2 S—φ VCSM13a K2 S—φ VCSM13 Anti-kringle 2b 1, 12 ± O O o O +1 CM i—1 O 03 1,89 ± 0,02 0,16 ± 0, 02 Anti-M13 0, 17 ± 0, 01 o +1 i—1 o 05 1,91 ± 0,02 1,88 ± 0, 03 a VCSM13 foi recolhida a partir de XL-1 Blue transformada com pComb3HSS. b Foi utilizado monoclonal de murganho anti-kringle 2 (16/B). Os outros anticorpos foram preparados a partir de imunoglobulina de ovelhas. c O valor é a média da absorvência de cada amostra, a qual foi ensaiada em triplicado. 32

Listagem de Sequências <110> Boehringer Ingelheim International GmbH <120> Métodos de Grande Produção de Proteínas em Procariotas <130> caso de protocolo de sequência 1 1169 <140> <141> <150> GB 0027782.2 <151> 2000-11-14 <16 0> 18 <170> Patent In Ver. 2.1 <210> 1 (SEQ ID N°: 1)

<211> 66 <212> ADN <213> Escherichia coli <400> 1 atgaaaaaga cagctatcgc gattgcagtg gcactggctg gtttcgctac cgtggcccag 60 gcggcc 66 33 <210> 2 (SEQ ID N°: 2)

<211> 4 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: parte do terminal N da molécula K2S <400> 2

Ser Glu Gly Asn 1 <210> 3 (SEQ ID N°: 3)

<211> 6 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220>

<223> Descrição de Sequência Artificial: parte do terminal N da molécula K2S <400> 3

Ser Glu Gly Asn Ser Asp 1 5 <210> 4 (SEQ ID N°: 4)

<211> 12 <212> ADN <213> Sequência Artificial 34 <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência

codificante da parte do terminal N da molécula K2S < 4 0 0 > 4 tctgagggaa ac 12 <210> 5 (SEQ ID N°: 5)

<211> 18 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência

codificante da parte do terminal N da molécula K2S < 4 0 0 > 5 tctgagggaa acagtgac 18 <210> 6 (SEQ ID N°: 6)

<211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência oligonucleotidica 35 < 4 Ο Ο > 6 gaggaggagg tggcccaggc ggcctctgag ggaaacagtg ac 42 <210> 7 (SEQ ID N°: 7)

<211> 42 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência oligonucleotidica <400> 7 gaggaggagc tggccggcct ggcccggtcg catgttgtca cg 42 <210> 8 (SEQ ID N°: 8)

<211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência oligonucleotidica <400> 8 acatgcgacc gtgacaggcc ggccag 26 <210> 9 (SEQ ID N°: 9)

<211> 26 <212> ADN <213> Sequência Artificial 36 < 2 2 Ο > <223> Descrição de Sequência Artificial: sequência oligonucleotídica <400> 9 ctggccggcc tgtcacggtc gcatgt 26 <210> 10 (SEQ ID N°: 10)

<211> 354 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante <400> 10

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg 1 5 10 15 Gly Thr His Ser Leu Thr Glu Ser' Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn 20 25 30 Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala 35 40 45 Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly 50 55 60 Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp 65 70 75 80 37

Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr 85 90 95 Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala 100 105 110 Ser Hís Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro 115 120 125 Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile 130 135 140 Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu 145 150 155 160 Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu 165 170 175 Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp 180 185 190 Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser 195 200 205 Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro 210 215 220 Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly 225 230 235 240 Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys 245 250 255 Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His 260 265 270 Leu Leu Asn Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr 275 280 285 Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp 290 295 300 Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai 305 310 315 320 Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly 325 330 335 Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met 340 345 350 Arg Pro 38 <210> 11 (SEQ ID N°: 11)

<211> 331 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante <400> 11

Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys 1 5 10 15 Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys 20 25 30 His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His 35 40 45 Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser 50 55 60 Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile 65 70 75 80 Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala 85 90 95 Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly 100 105 110 Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe 115 120 125 Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr 130 135 140 Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys 145 150 155 160 Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile 165 170 175 Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser 180 185 190 39

Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro 195 200 205 Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu 210 215 220 Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr 225 230 235 240 Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Vai Thr 245 250 255 Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pr o Gin Ala 260 265 270 Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys 275 280 285 Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu 290 295 300 Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn 305 310 315 320 Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 325 330 <210> 12 (SEQ ID N°: 12)

<211> 339 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante (modificada) <400> 12

Ser Leu Thr Glu 5 Leu Ile Gly Lys Gly Leu Gly Lys 40 Ser Gly Ala Ser 10 Vai Tyr Thr Ala 25 His Asn Tyr Cys

Cys Leu Pro Trp 15 Gin Asn Pro Ser 30 Arg Asn Pro Asp

Ser Glu Gly Asn 1

Asn Ser Met Ile 20

Ala Gin Ala Leu 35 40 45

Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr 50 55 60 Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin 65 70 75 80 Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile 85 90 95 Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser 100 105 110 Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp 115 120 125 Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His 130 135 140 Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu 145 150 155 160 Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp 165 170 175 Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp 180 185 190 Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu 195 200 205 Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser 210 215 220 Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu 225 230 235 240 Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin 245 250 255 His Leu Leu Asn Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp 260 265 270 Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly 275 280 285 Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu 290 295 300 Vai Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro 305 310 315 320 Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn 325 330 335

Met Arg Pro 41 <210> 13 (SEQ ID N°: 13)

<211> 335 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante (modificada) <400> 13

Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile 1 5 10 15 Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu 20 25 30 Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys 35 40 45 Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys 50 55 60 Asp Vai Pro Ser Ser Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro 65 70 75 80 Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro 85 90 95 Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg 100 105 110 Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala 115 120 125 Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile 130 135 140 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe 145 150 155 160 Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr 165 170 175 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys 180 185 190 42

Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp 195 200 205 Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 210 215 220 His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His 225 230 235 240 Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn 245 250 255 Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly 260 265 270 Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly 275 280 285 Pro Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile 290 295 300 Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr 305 310 315 320 Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 325 330 335 <210> 14 (SEQ ID N°: 14)

<211> 343 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante (modificada) <400> 14

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala 20 25 30 Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys 35 40 45 43

Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn 50 55 60 Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu 85 90 95 Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys 100 105 110 His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile 115 120 125 Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe 130 135 140 Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai 145 150 155 160 Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His 165 170 175 Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr ASp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin 180 185 190 Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg 195 200 205 Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu 210 215 220 Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr 225 230 235 240 Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg 245 250 255 Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu 260 265 270 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp 275 280 285 Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly 290 295 300 Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin 305 310 315 320 44

Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp 325 330 335

Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 340

<210> 15 (SEQ ID N°: 15) <211> 343 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante (modificada) <400> 15

Ser Glu Gly Asn Ser Asp Thr His Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser 1 5 10 15 Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala 20 25 30 Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys 35 40 45 Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn 50 55 60 Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Ser Ser Thr Cys 65 70 75 80 Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu 85 90 95 Phe Ala Asp •Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys 100 105 110 His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile 115 120 125 Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe 130 135 140 Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai 145 150' 155 160 45

Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His 165 170 175 Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin 180 185 190 Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg 195 200 205 Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu 210 215 220 Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr 225 230 235 240 Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg 245 250 255 Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu 260 265 270 Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp 275 280 285 Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly 290 295 300 Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin 305 310 315 320 Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp 325 330 335 Ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 340 <210> 16 (SEQ ID N°: 16)

<211> 308 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante (modificada) 46 <400> 16

Ser Ala Gin Ala Leu Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro 1 5 10 15 Asp Gly Asp Ala Lys Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu 20 25 30 Thr Trp Glu Tyr Cys Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg 35 40 45 Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp 50 55 60 Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg 65 70 75 80 Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys 85 90 95 Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His 100 105 110 His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu 115 120 125 Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe 130 135 140 Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser 145 150 155 160 Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys 165 170 175 Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu 180 185 190 Ser Gly Tyr Gly Lys > His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg 195 200 205

Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser 210 215 220

Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly 225 230 235 240

Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin 245 250 255

Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr 260 265 270

Leu Vai Gly Ile Ile Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai 275 280 285 47

Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp Ile Arg Asp 290 295 300

Asn Met Arg Pro 305

<210> 17 (SEQ ID N°: 17) <211> 268 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> Descrição de Sequência Artificial: parte da molécula K2S recombinante (modificada) <400> 17

Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro Gin Phe Arg 1 5 10 15 Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro Trp Gin Ala 20 25 30 Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg Phe Leu Cys 35 40 45 Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala Ala His Cys 50 55 60 Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile Leu Gly Arg 65 70 75 80 Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe Glu Vai Glu 85 90 95 Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr Asp Asn Asp 100 105 110 Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys Ala Gin Glu 115 120 125 Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp Leu Gin Leu 130 135 140 Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys His Glu Ala 145 150 155 160 48

Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His Vai Arg Leu 165 170 175 Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn Arg Thr Vai 180 185 190 Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly Gly Pro Gin 195 200 205 Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Vai 210 215 220 Cvs Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ue Ue Ser Trp Gly 225 230 235 240 Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr Lys Vai Thr 245 250 255 Asn Tyr Leu Asp Trp Ue Arg Asp Asn Met Arg Pro 260 265 <210> 18 (SEQ ID N°: 18) <211> 527

<212> PRT <213> Homo sapiens (tpA) < 4 0 0 > 18

Ser Tyr Gin Vai Ue Cys Arg Asp Glu Lys Thr Gin Met Ue Tyr Gin 1 5 10 15 Gin His Gin Ser Trp Leu Arg Pro Vai Leu Arg Ser Asn Arg Vai Glu 20 25 30 Tyr Cys Trp Cys Asn Ser Gly Arg Ala Gin Cys His Ser Vai Pro Vai 35 40 45 Lys Ser Cys Ser Glu Pro Arg Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Gin Gin 50 55 60 Ala Leu Tyr Phe Ser Asp Phe Vai Cys Gin Cys Pro Glu Gly Phe Ala 65 70 75 80 Gly Lys Cys Cys Glu Ue Asp Thr Arg Ala Thr Cys Tyr Glu Asp Gin 85 90 95 Gly Ile Ser ' Tyr Arg Gly Thr Trp Ser Thr Ala Glu Ser Gly Ala Glu 100 105 110 49

Cys Thr Asn Trp Asn Ser Ser Ala Leu Ala Gin Lys Pro Tyr Ser Gly 115 120 125 Arg Arg Pro Asp Ala Ile Arg Leu Gly Leu Gly Asn His Asn Tyr Cys 130 135 140 Arg Asn Pro Asp Arg Asp Ser Lys Pro Trp Cys Tyr Vai Phe Lys Ala 145 150 155 160 Gly Lys Tyr Ser Ser Glu Phe Cys Ser Thr Pro Ala Cys Ser Glu Gly 165 170 175 Asn Ser Asp Cys Tyr Phe Gly Asn Gly Ser Ala Tyr Arg Gly Thr His 180 185 190 Ser Leu Thr Glu Ser Gly Ala Ser Cys Leu Pro Trp Asn Ser Met Ile 195 200 205 Leu Ile Gly Lys Vai Tyr Thr Ala Gin Asn Pro Ser Ala Gin Ala Leu 210 215 220 Gly Leu Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Gly Asp Ala Lys 225 230 235 240 Pro Trp Cys His Vai Leu Lys Asn Arg Arg Leu Thr Trp Glu Tyr Cys 245 250 255 Asp Vai Pro Ser Cys Ser Thr Cys Gly Leu Arg Gin Tyr Ser Gin Pro 260 265 270 Gin Phe Arg Ile Lys Gly Gly Leu Phe Ala Asp Ile Ala Ser His Pro 275 280 285 Trp Gin Ala Ala Ile Phe Ala Lys His Arg Arg Ser Pro Gly Glu Arg 290 295 300 Phe Leu Cys Gly Gly Ile Leu Ile Ser Ser Cys Trp Ile Leu Ser Ala 305 310 315 320 Ala His Cys Phe Gin Glu Arg Phe Pro Pro His His Leu Thr Vai Ile 325 330 335 Leu Gly Arg Thr Tyr Arg Vai Vai Pro Gly Glu Glu Glu Gin Lys Phe 340 345 350 Glu Vai Glu Lys Tyr Ile Vai His Lys Glu Phe Asp Asp Asp Thr Tyr 355 360 365 Asp Asn Asp Ile Ala Leu Leu Gin Leu Lys Ser Asp Ser Ser Arg Cys 370 375 380 Ala Gin Glu Ser Ser Vai Vai Arg Thr Vai Cys Leu Pro Pro Ala Asp 385 390 395 400 50

Leu Gin Leu Pro Asp Trp Thr Glu Cys Glu Leu Ser Gly Tyr Gly Lys 405 410 415 His Glu Ala Leu Ser Pro Phe Tyr Ser Glu Arg Leu Lys Glu Ala His 420 425 430 Vai Arg Leu Tyr Pro Ser Ser Arg Cys Thr Ser Gin His Leu Leu Asn 435 440 445 Arg Thr Vai Thr Asp Asn Met Leu Cys Ala Gly Asp Thr Arg Ser Gly 450 455 460 Gly Pro Gin Ala Asn Leu His Asp Ala Cys Gin Gly Asp S$r Gly Gly 465 470 475 480 Pro Leu Vai Cys Leu Asn Asp Gly Arg Met Thr Leu Vai Gly Ile Ile 485 490 495 Ser Trp Gly Leu Gly Cys Gly Gin Lys Asp Vai Pro Gly Vai Tyr Thr 500 505 510 Lys Vai Thr Asn Tyr Leu Asp Trp ile Arg Asp Asn Met Arg Pro 515 520 525

Lisboa, 4 de Setembro de 2009 51

Claims (7)

1. REIVINDICAÇÕES 1. Método para a produção do domínio protease de Serina Kringle plus (K2S) do activador do plasminogénio tecidular humano activo e correctamente enrolado, ou de uma sua variante funcional, no sobrenadante de células procariotas, caracterizado por a célula procariota conter e expressar um vector compreendendo um ADN codificando para o péptido sinal da proteína A da membrana externa (OmpA), o qual está fundido, a jusante, com um ADN codificando para um péptido curto caracterizado pela sequência de aminoácidos SEGNSD (SEQ ID N°: 3), o qual está, por sua vez, fundido, a jusante, a um ADN codificando para o domínio protease de Serina Kringle plus do activador do plasminogénio tecidular humano ou para uma sua variante funcional.
2. 2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a célula procariota ser E. coli.
3. 3. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado por serem realizados os passos seguintes: a) o ADN codificando a protease de Serina Kringle plus é amplificado por PCR; b) o produto de PCR é purificado; c) o referido produto de PCR é inserido num vector compreendendo o ADN codificando para o péptido sinal OmpA e o ADN codificando para gpIII de forma a que o referido produto de PCR esteja operativamente ligado, a 1 montante, ao ADN codificando para a sequência sinal OmpA e esteja ligado, a jusante, ao ADN codificando para a gpm do referido vector; d) que esteja inserido um codão de terminação entre o referido dominio protease de Serina Kringle plus e gpm; e) o referido vector é expresso pela célula procariota; f) o dominio protease de Serina Kringle plus é purificado.
4. 4. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado por o vector ser um vector fagemidico compreendendo o ADN codificando para o péptido sinal OmpA e o ADN codificando para gpIII.
5. 5. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado por o vector ser o fagemídio pComb3HSS.
6. 6. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado por a Sequência de ADN de OmpA consistir na seguinte sequência: ATGAAAAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGT GGCCCAGGCGGCC (SEQID N°: 1)
7. 7. Método de acordo com uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado por o ADN codificando para o péptido sinal da proteina A da membrana externa (OmpA), o qual está por sua vez fundido a jusante com um ADN codificando para um 2 péptido curto caracterizado por a sequência de aminoácidos SEGNSD (SEQ ID N°: 3), o qual está, por sua vez, fundido, a jusante, com um ADN codificando para o domínio protease de Serina Kringle plus do activador do plasminogénio tecidularou para uma sua variante funcional está precedido por um promotor lac e/ou um local de ligação de ribossomas. Lisboa, 4 de Setembro de 2009 3 1/15 1 2 1636> 1018>

   Fig 1 2/15 1 2 3 5090> 3054> 1018>

   * \ Fig 2 Amp R

   Figura 3 3'-TGTACGCTGGCACTGTCCGGCCGGTC-5' masTPA. TTCGTGACAACATGCGACCGGGCCAGGCCGGCCAGGAGGGTGGT< <gene K2S Operão Lac 2316-2513 RBS ’ 2514-2533 Omp A 2534-2599 K2S 2600-3664 gp m 3665-4219 Amp R 515-1394 gene gp III> •AAGCACTGTTGTACGCTGGCCCGGTCCGGCCGGTCCTCCCACCA 57 -ACATGCGÁCCGTGACAGGCCGGCCAG-3' MSTPA 4/15 1 2 3 5090 3054>

   Fig 5 5/15 5/15 1 70 kDa>

   2 3 / j IsS'* <39 kDa Fig 6 6/15 205 "T μ xz&w·-'1?' & 116 .. = ·ρ,ί*#··Ρ^ : 5 ’ > "ί 97 ΖΖ* tt^HÉÉÉÉÉ^MlÉHHÉIjMir 66 ?PÍ;;1:;nfjijijlJ^^ 45 liiiSililiifcfflilll ^HH^HIRBIIlli ]b 29

   Fig 7 7/15 r„T r/iL "«k

   uy (r) ® (D te,' jjy © λ.® Fig. 8 8/15

   Fig. 9 9/15

   Fig. 10 10/15 (sT ^κΓ <&(£l. ^

   Fig. 11 11/15

   Fig. 12 12/15

   Fig. 13 13/15

   Fig. 14 14/15

   15/15

   Fig. 16