JPH11178574A

JPH11178574A - 新規コラーゲン様タンパク質

Info

Publication number: JPH11178574A
Application number: JP9353216A
Authority: JP
Inventors: Tsutomu Kajino; 勉梶野; Haruo Takahashi; 治雄高橋; Yukio Yamada; 幸生山田; Masakata Hirai; 正名平井; Hiroaki Takagi; 広明高木; Shiyougo Ebisu; 省吾恵比須; Fumiko Watanabe; 史子渡辺
Original assignee: Higeta Shoyu Co Ltd; Toyota Central R&D Labs Inc
Current assignee: Higeta Shoyu Co Ltd; Toyota Central R&D Labs Inc
Priority date: 1997-12-22
Filing date: 1997-12-22
Publication date: 1999-07-06

Abstract

(57)【要約】【課題】新規コラーゲン様タンパク質（ペプチド）及
びその製造方法の提供。【解決手段】新規コラーゲン様タンパク質。該タンパ
ク質のアミノ酸配列をコードする遺伝子を組み込んだバ
チルス・ブレビスを培養することによる該タンパク質を
製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、新規コラーゲン様
タンパク質及び該タンパク質のアミノ酸配列をコードす
る遺伝子並びに該遺伝子を組込んだバチルス・ブレビス
（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅｖｉｓ）を培養し、培養物
中に生成したコラーゲン様タンパク質を採取することを
特徴とする新規コラーゲン様タンパク質の製造方法に関
する。

【０００２】

【従来の技術】遺伝子組換え技術の発展により、多くの
タンパク質は細菌、真菌、ほ乳類をはじめとする多様な
発現系により遺伝子工学的に発現されるようになってき
た。しかしながら、異種タンパク質、殊にアミノ酸の繰
り返し配列を有するタンパク質（ペプチド）の発現に関
して細菌を宿主細胞として使用すると、多くの場合問題
が発生する。

【０００３】例えば、大腸菌または他の細菌宿主の系を
用いた場合、生産された異種タンパク質は菌体内に蓄積
され、多くの場合細胞封入体を形成する。封入体を形成
した異種タンパク質は、その存在状態故に生物学的ある
いは生化学的に不活性であるため、活性型のタンパク質
を得るためには、可溶化、再生の操作がさらに必要とな
る。すなわち、可溶化、再生の操作が成功しない場合、
活性型のタンパク質はほとんど得られない。しかしなが
ら可溶化、再生の条件、操作は未だ確立されておらず、
技術的に困難な場合が多い。

【０００４】さらに、異種タンパク質が封入体を形成し
ない場合であっても、菌体内に生産、蓄積された異種タ
ンパク質は、菌体からの抽出およびその抽出液からの精
製に多大の時間と労力を要するだけでなく、目的とする
タンパク質を完全な形で純粋に得ることが容易ではな
い。またアミノ酸の繰り返し構造を有するタンパク質に
おいては、大腸菌のように一般的に菌体内にタンパク質
を生産する菌では生産効率が悪く、１００mg／１以上の
生産量を達成することが困難な場合が多い。

【０００５】一方、バチルス属に属する微生物は、古く
から種々の菌体外酵素の生産菌として工業的に利用され
ている。これらの菌体外酵素の内、バチルス・アミロリ
クイファシエンスのα−アミラーゼ遺伝子〔I. Palva e
t. al, Gene, 22, 229 (1983）〕、バチルス・リカニフ
ォルミスのペニシリナーゼ遺伝子や枯草菌のα−アミラ
ーゼ遺伝子等が既にクローン化され、これらのプロモー
ターおよびシグナルペプチドを利用した異種タンパク質
の菌体外分泌生産系が報告されている。この菌体外分泌
生産系では、上記の菌体内生産系で問題となる封入体形
成はほとんど認められず、可溶化状態での異種タンパク
質の生産を可能にすると共に、菌体からの抽出操作が不
要なため、生産コストを大幅に削減できる。

【０００６】しかしながら、分泌生産系により、殊にア
ミノ酸の繰り返し配列を有するタンパク質（ペプチド）
を生産する場合、他の不具合を呈することが多い。例え
ば、アミノ酸の繰り返し配列を有するタンパク質では同
じ配列の遺伝子が並ぶために相同組換えが起こり異種タ
ンパク質の高レベル分泌生産を困難にすることが知られ
ている。

【０００７】これらの点において、当業界で現在使用さ
れている組換え発現系による、アミノ酸の繰り返し配列
を有するタンパク質の生産技術は満足のいくものではな
く、研究、診断、治療および工業材料適用における使用
を目的とするアミノ酸の繰り返し配列を有するタンパク
質の製造および精製に関する生産方法が依然として要望
されている。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】上記のようにアミノ酸
の繰り返し配列を有するタンパク質の発現系において
は、封入体の形成、相同組換え等の問題で、現在報告さ
れているいずれの生産系も満足できるものとはいいがた
い。本発明は新規コラーゲン様タンパク質（アミノ酸の
繰り返し配列を有するタンパク質）及び該タンパク質の
アミノ酸配列をコードする遺伝子並びに該遺伝子を組み
込んだバチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓｂｒｅ
ｖｉｓ）を培養し、培養物中に生成した該コラーゲン様
タンパク質を採取する方法を提供するものである。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、組換え発
現系において安定的に異種タンパク質を培地中に発現で
きる組換え分泌発現系の開発を行ってきた。特に、分泌
効率が低いアミノ酸の繰り返し配列を有するタンパク質
を効率的に分泌発現できる組換え発現系を作出すべく研
究を重ねたところ、アミノ酸の繰り返し配列を有するタ
ンパク質をコードする遺伝子をアミノ酸が変異しない範
囲でＤＮＡに変異を加えることにより、目的異種タンパ
ク質を効率的に分泌生産できることを見出した。さらに
プロモーター活性の弱い発現ベクターを用いることによ
りさらに効率的な発現が可能であることを見出した。

【００１０】したがって、前記課題はアミノ酸の繰り返
し配列を有するタンパク質（ペプチド）をコードするＤ
ＮＡにおいて、アミノ酸が変異を生じない範囲でアミノ
酸をコードするコドンに変異を与えた組換えＤＮＡの使
用ならびにプロモーターの変換により解決される。すな
わち、本発明によれば、通常限られた量のタンパク質が
培地中に蓄積されるある種の宿主細胞において、望まし
い立体構造を有する新規コラーゲン様タンパク質を培地
中に多量に蓄積させることを可能にするＤＮＡ構成、お
よびそれらを保持する宿主細胞を栄養培地に培養するこ
とを特徴とする新規コラーゲン様タンパク質の製造方法
が提供される。

【００１１】

【発明の実施の形態】この発明によると、ある種の宿主
細胞において、安定した可溶性のコラーゲン様タンパク
質を培地中に多量に製造することができる。コラーゲン様タンパク質をコードするＤＮＡの構築方法天然のコラーゲンはＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙは任意のア
ミノ酸を示すがＸの位置にはプロリンがＹの位置にはハ
イドロキシプロリンが存在することが多い）なるアミノ
酸配列の繰り返し構造を有する。

【００１２】従って本発明においてもこのＧｌｙ−Ｘ−
Ｙというアミノ酸配列を基本構造としてコラーゲン様タ
ンパク質（ペプチド）を設計している。この様な繰り返
しのアミノ酸配列では、その遺伝子において同じ塩基配
列が繰り返されることがあり、このことが原因で相同組
換えが起こり、目的タンパク質の生産量が著しく少なく
なることが考えられる。従って本発明のコラーゲン様タ
ンパク質（ペプチド）のＤＮＡ配列はアミノ酸レベルで
の変異が起こらない範囲でＤＮＡに変異を与えたものの
混合物として合成する。

【００１３】少なくとも配列番号１，２，４，９及び１
７に示す３０アミノ酸の中で、繰り返しのアミノ酸配列
（Ｇｌｙ−Ｘ−Ｙ）をコードするＤＮＡの塩基配列がそ
れぞれ全く同一にならないようにＤＮＡをあらかじめデ
ザインしておく。本発明のコラーゲン様タンパク質のＤ
ＮＡの塩基配列の構築は、当業界における一般的な遺伝
子工学技術を使用する〔サムブルック等、「モレキュラ
ー・クローニング．ア・ラボラトリー・マニュアル」、
コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー，コー
ルド・スプリング・ハーバー，ニューヨーク（１９８
８）参照〕。

【００１４】対象タンパク質この発明は特定のアミノ酸を有するコラーゲン様タンパ
ク質に限定されるわけではなく、多様なアミノ酸配列の
コラーゲン様タンパク質を含むものである。この発明の
組成物および方法は組換え分泌生産系において非常に少
量しか発現されないコラーゲン様タンパク質に特に有用
であって、コラーゲン様タンパク質はいずれかの発現系
において治療、診断、研究または工業材料に適用される
あらゆるタンパク質を含みうる。

【００１５】コラーゲン様タンパク質としては、配列番
号１，２，４，９及び１７に示す３０アミノ酸からなる
ユニットが１〜３０個連結されたものなどが挙げられる
が、配列番号１，２，４，９及び１７に示す３０アミノ
酸からなるユニットが５〜８個連結されたものがより好
ましい。この３０アミノ酸からなるユニットは同じ配列
のユニットを連結しても良いし、異なる配列のユニット
を連結しても良い。

【００１６】また、本発明はその他繰り返しのアミノ酸
配列を有するタンパク質、例えばエラスチン、絹、蜘蛛
糸等あるいはこれらの一部を変換若しくは他の化合物若
しくはタンパク質（ペプチド）で修飾したタンパク質に
も適用可能であり、これらのタンパク質も本発明により
バチルス・ブレビス菌による発現系により効率的に分泌
生産されうる。この発明を説明している実施例には、本
発明の対象タンパク質としてコラーゲン（ゼラチン）が
例示されている。これらのタンパク質をバチルス・ブレ
ビス以外の細菌を宿主とする生産系で発現すると、発現
量が著しく少ないか、発現されても不活性化してしま
う。

【００１７】発現ベクター上記のような目的異種タンパク質をコードするＤＮＡ分
子は、この発現による異種タンパク質発現のための他の
配列を伴いうる。すなわち、この発明による望ましいＤ
ＮＡ配列は、所望の宿主細胞におけるタンパク質の発現
を指図しうる発現制御配列が随伴し、その制御下にある
上記融合配列を含む。例えば宿主細胞がバチルス・ブレ
ビス株である場合、ＤＮＡ分子はバチルス・ブレビスで
機能するプロモーター、リボソーム結合部位を含み、ま
た融合タンパク質の分泌を指図する分泌シグナル配列を
有する。

【００１８】また所望により、選択可能なマーカー遺伝
子を含んでもよく、さらにＤＮＡ分子が宿主細胞内にお
いて染色体外に存在する場合、複製開始点を含んでもよ
い。バチルス・ブレビス株で機能する具体的な前記配列
は鵜高らにより公知である（蛋白質核酸酵素、３７，２
５８−２６８（１９９２））。細菌での発現に関してそ
れに使用される発現ベクターも公知にされているほか、
当業界では前記の成分を含む多くの細菌用発現ベクター
が知られており、標準的な分子生物学技術により容易に
構築されうる。ＤＮＡ分子は、当業界で通常行われると
おり選択した宿主細胞での発現を最適化するようにコド
ンの選択が修飾されうる。

【００１９】宿主本発明に適した宿主細胞は、好ましくは細菌細胞であ
る。当業界において分泌発現宿主細胞としてよく知られ
ているバチルス・ブレビスは鵜高らにより公知であるほ
か、下記実施例で使用されるバチルス・ブレビス３１−
ＯＫ株は工業技術院生命工学工業技術研究所にＦＥＲＭ
Ｐ−１３２７４として寄託されている。またバチルス
・サチルスをはじめとするバチルス属やシュードモナス
属等の様々な株もこの発明において使用されうる。

【００２０】本発明によりコラーゲン様タンパク質のよ
うにＧｌｙ−Ｘ−Ｙ（Ｘ，Ｙは任意のアミノ酸を示すが
Ｘの位置にはプロリンがＹの位置にはハイドロキシプロ
リンが存在することが多い）なるアミノ酸配列の繰り返
し構造を有し、例えば３０個のアミノ酸からなるユニッ
トが１〜３０個、より好ましくは５〜８個連結したよう
な構造を有する人工的にデザインしたタンパク質の大量
分泌発現が可能となった。また、目的タンパク質のアミ
ノ酸配列を変えないようにユニット内のＤＮＡの塩基配
列を変えることによりＤＮＡの相同組換えなど従来技術
の不具合を回避できることができる。以下に人工的にデ
ザインしたコラーゲン様タンパク質（ゼラチン）の生産
に関する実施例を示す。同様の手法を用いることによっ
て絹、エラスチン、蜘蛛糸などの繰り返し配列をもった
タンパク質の大量生産が可能である。

【００２１】

【実施例】実施例１．人工コラーゲン（ゼラチン）をコ
ードするＤＮＡのデザイン（１）中性ゼラチンをコードするＤＮＡのデザインヒトＩ型コラーゲンの部分アミノ酸配列を基に、ヒトＩ
型コラーゲンの平均疎水性度を示す３０アミノ酸からな
る中性ゼラチンのモノマーユニットアミノ酸配列を設計
した。

【００２２】そのアミノ酸配列をコードする塩基配列の
中に後でマルチマー化が可能となるように互いに相補的
な付着末端を有するＢｇ１II及びＢａｍＨＩサイトを有
するように、また正しい方向でゼラチンユニットが連結
できるようにＢａｎIIサイトを配した。またＮ末端側に
はバチルス・ブレビスの分泌シグナルに連結できるよう
にＮｃｏＩサイトを、Ｃ末端側にはＨｉｎｄIII サイト
を配した。ここで設計したＤＮＡの塩基配列を配列番号
８に示す（図１）。またこの中性ゼラチンのモノマーユ
ニットのアミノ酸配列を配列番号９に示す。

【００２３】（２）親水性ゼラチンをコードするＤＮＡ
のデザイン（１）と同様に、ヒトＩ型コラーゲン部分アミノ酸を基
に、ヒトＩ型コラーゲンの最高親水性度を示す３０アミ
ノ酸からなる親水性ゼラチンのモノマーユニットアミノ
酸配列を設計した。そのアミノ酸配列をコードする塩基
配列の中に後にマルチマー化が可能となるように互いに
相補的な付着末端を有するＢｓｐＥＩ，ＸｍａＩサイト
を有するように、また正しい方向でゼラチンユニットが
連結できるようにＢａｎIIサイトを配した。また、Ｎ末
端側にはバチルス・ブレビスの分泌シグナルに連結でき
るようにＮｃｏＩサイトを、Ｃ末端側にはＢａｍＨＩサ
イトを配した。ここで設計したＤＮＡの塩基配列は配列
番号１０に示す。またこの親水性ゼラチンのモノマーユ
ニットのアミノ酸配列を配列番号４に示す。実施例２．人工ゼラチンをコードするＤＮＡの大腸菌用
プラスミドへの導入及びマルチマー化（１）中性ゼラチンをコードするＤＮＡの大腸菌用プラ
スミドへの導入及びマルチマー化（図１）バチルス・ブレビスの分泌シグナル配列とその後に続く
マルチクローニングサイトを含むＤＮＡ配列をＤＮＡシ
ンセサイザーにより合成し、配列番号１１及び１２に示
すＤＮＡを得た。これらのＤＮＡをアニール後、Ｈｐａ
ＩとＨｉｎｄIII で切断し、プラスミドｐＢＲ３２２
（宝酒造（株）製）のＮｒｕＩとＨｉｎｄIII サイトに
挿入し、大腸菌用のプラスミドｐＡＮ３を得た。

【００２４】実施例１（１）でデザインした配列番号８
とその相補鎖のＤＮＡをＤＮＡシンセサイザーにより合
成し、アニール後、先に得たプラスミドｐＡＮ３のＮｃ
ｏＩ，ＨｉｎｄIII サイトに導入してマルチマー化用の
ベクターＢ８とした。次に、配列番号１３，１４，１
５，１６の塩基配列で示されるＤＮＡを合成し、１３と
１４及び１５と１６をそれぞれアニール後ＢａｎIIで切
断し、先に構築したマルチマー化用ベクターのＢａｎII
サイトに挿入した。この際作られるゼラチンのモノマー
ユニットのアミノ酸配列を配列番号１７に示す。

【００２５】この結果、ゼラチンのモノマーユニットを
３個保有するプラスミドｐＡＮ３−１及び５個保有する
プラスミドｐＡＮ３−２が得られた。ここで得たｐＡＮ
３−２をＢｇ１II，ＨｉｎｄIII で切断したｌａｒｇｅ
ｆｒａｇｍｅｎｔと、ｐＡＮ３−１をＢａｍＨＩ，Ｈ
ｉｎｄIII で切断したｓｍａｌｌｆｒａｇｍｅｎｔを
回収し、ＤＮＡｌｉｇａｓｅで結合し、ゼラチンのモ
ノマーユニットを８個保有するプラスミドｐＡＮ３−Ｂ
８を得た。このゼラチンのモノマーユニットの８個の連
結体の塩基配列は配列番号６に示した。

【００２６】（２）親水性ゼラチンをコードするＤＮＡ
の大腸菌用プラスミドへの導入及びマルチマー化（図
２）実施例１（２）でデザインした配列番号１０とその相補
鎖のＤＮＡをＤＮＡシンセサイザーにより合成し、アニ
ール後、（１）で調製した大腸菌用のプラスミドである
ｐＡＮ３のＮｃｏＩ，ＢａｍＨＩサイトに導入してマル
チマー化用のベクターＰ６とした。

【００２７】次に、配列番号１８のアミノ酸をコードす
るＤＮＡ配列をアミノ酸が変異しない範囲でコドンのサ
ードレターを中心に変異を与え、制限酵素切断部位に関
係ない位置のグリシンは、ＧＧＴ，ＧＧＣ，ＧＧＡ及び
ＧＧＧの混合物として合成した。合成したＤＮＡ配列を
配列番号１９に示す。この混合物を鋳型として配列番号
２０及び２１のプライマーＤＮＡを用いてＰＣＲを行っ
た。このプライマーは、マルチマー化用のベクターに連
結できるようにＮ末端側、Ｃ末端側にそれぞれＢａｎII
サイトを配した。このＰＣＲ産物をＢａｎIIで切断し、
先に構築したマルチマー化用ベクターのＢａｎIIサイト
に挿入した。

【００２８】その結果、ゼラチンのモノマーユニットを
３個保有するプラスミドが２つ得られた（ｐＡＮ３−
３，ｐＡＮ３−４）。ｐＡＮ３−３を、ＸｍａＩ，Ｂａ
ｍＨＩで切断したｌａｒｇｅｆｒａｇｍｅｎｔと、ｐ
ＡＮ３−４をＢｓｐＥＩ，ＢａｍＨＩで切断したｓｍａ
ｌｌｆｒａｇｍｅｎｔを回収し、ＤＮＡｌｉｇａｓ
ｅで結合し、ゼラチンのモノマーユニットを６個有する
プラスミドｐＡＮ３−Ｐ６を得た。このゼラチンのモノ
マーユニットの６個の連結体の塩基配列は配列番号７に
示した。

【００２９】実施例３．ブレビス菌による人工ゼラチン
の分泌発現（１）中性ゼラチンのブレビス菌による分泌発現プラスミドｐＮＵ２１２−Ｂ８，ｐＮＨ３００Ｎｃ
−Ｂ８の構築プラスミドｐＮＵ２１０（山形秀夫ら、蛋白質核酸酵
素、３７，２５８−２６８（１９９２））１０ngを鋳型
ＤＮＡとし、配列番号２２及び２３で示されるプライマ
ーＤＮＡを用いてＰＣＲを行った。得られたＰＣＲ産物
をＴ４ポリメラーゼで処理して末端を平滑化し、Ｔａｋ
ａｒａＤＮＡライゲーションキット（宝酒造（株）
製）でセルフライゲーションを行ってプラスミドｐＮＵ
２１２を得た。

【００３０】一方、実施例２（１）で調製した中性ゼラ
チンのマルチマー化した遺伝子ｐＡＮ３−Ｂ８をＮｃｏ
ＩおよびＨｉｎｄIII で切断した。これを、先に得たエ
リスロマイシン耐性遺伝子を有するｐＮＵ２１２のＮｃ
ｏＩ，ＨｉｎｄIII サイトに導入し疎水性ゼラチン遺伝
子ユニットが８個入ったプラスミドｐＮＵ２１２−Ｂ８
を得た。

【００３１】また、プラスミドｐＮＵ２１０を鋳型ＤＮ
Ａとし、このプラスミドに存在するバチルス・ブレビス
の細胞壁タンパク質（ＭＷＰ）の遺伝子〔山形ら、J. B
acteriol., 169, 1239-1245 (1987)〕のプロモーターの
一部、ＭＷＰのシグナル配列及びマルチクローニングサ
イトが増幅されるように、配列番号２４及び２５で示さ
れるプライマーＤＮＡを合成し、ＰＣＲを行った。得ら
れたＰＣＲ反応液を制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩで消
化した。

【００３２】一方、プラスミドｐＵＢ１１０（宝酒造
（株）製）をＥｃｏＲＩ制限酵素とＰｖｕIIで消化し、
この消化物と前記制限酵素ＳｍａＩとＥｃｏＲＩ消化物
を混合し、ＴａｋａｒａＤＮＡライゲーションキット
（宝酒造（株）製）でライゲーション反応を行ってプラ
スミドｐＮＨ３００を得た。

【００３３】次にｐＮＨ３００を鋳型として、配列番号
２４及び２５で示されるプライマーＤＮＡを用いてＰＣ
Ｒを行った。得られたＰＣＲ産物をＴ４ポリメラーゼで
処理して末端を平滑化し、ＴａｋａｒａＤＮＡライゲ
ーションキット（宝酒造（株）製）でセルフライゲーシ
ョンを行い、プラスミドｐＮＨ３００Ｎｃを得た。ここ
で得たｐＮＨ３００ＮｃをＮｃｏＩ，ＨｉｎｄIII で処
理し、このＤＮＡ断片に実施例２（１）で調製したｐＡ
Ｎ３−Ｂ８のＮｃｏＩ，ＨｉｎｄIII 断片を加えてライ
ゲーションを行い中性ゼラチン遺伝子のユニットが８個
入ったプラスミドｐＮＨ３００Ｎｃ−Ｂ８を得た。

【００３４】形質転換体の取得形質転換は、高木らのエレクトロポレーション法（Agri
c. Biol. Chem., 53,3099-3100 (1989)）により行っ
た。ＤＮＡリガーゼで結合させた発現ベクターｐＮＵ２
１２−Ｂ８およびｐＮＨ３００Ｎｃ−Ｂ８を約５００ng
用いてバチルス・ブレビス３１−ＯＫ株を形質転換し、
各々形質転換体を得た（バチルス・ブレビス３１−ＯＫ
／ｐＮＵ２１２−Ｂ８、バチルス・ブレビス３１−ＯＫ
／ｐＮＨ３００Ｎｃ−Ｂ８）。

【００３５】中性人工ゼラチンの発現で得られた形質転換体各々をＹＣ培地〔３０ｇポリペ
プトンＰ１（日本製薬）、２ｇ酵母エキス、３０ｇグル
コース、０．１ｇＣａＣｌ₂・２Ｈ₂Ｏ，０．１ｇ
ＭｇＳＯ₄・７Ｈ₂Ｏ，１０mg ＦｅＳＯ₄・７Ｈ
₂Ｏ，１０mg ＭｎＳＯ₄・４Ｈ₂Ｏ，１mg ＺｎＳＯ
₄・７Ｈ₂Ｏ／１；pH７．２〕で３０℃、６日間培養し
た。培養上清１０μｌを用いてその中のタンパク質をＳ
ＤＳ−ＰＡＧＥ（１２％）により分離し、ウエスタンブ
ロットの手法を用いてニトロセルロース膜上に固定し
た。

【００３６】免疫染色に用いた抗人工ゼラチンペプチド
抗体（１次抗体）は化学合成した中性人工ゼラチンの約
３０個のペプチドをＫＬＨ等に化学的に結合させたもの
をラビットに免疫して得たものを用いた。ブロットした
ニトロセルロースフィルターを第一抗体と反応させた
後、第２抗体としてアルカリフォスファターゼ標識抗ラ
ビットＩｇＧ抗体を用いて、ＢＣＩＰ／ＮＢＴ（バイオ
ラッド社発色キット）を用いて検出した。

【００３７】その結果、バチルス・ブレビス３１−ＯＫ
／ｐＮＵ２１２−Ｂ８の中性人工ゼラチンの発現量は１
０mg／ｌ程度であった。一方、バチルス・ブレビス３１
−ＯＫ／ｐＮＨ３００−ＮｃＢ８の中性人工ゼラチンの
発現量は大幅に上昇し数百mg／ｌであった（図３）。こ
のようにｐＮＨ３００Ｎｃを用いることによって、大幅
に発現量が上昇し、かつ、安定に発現することが可能に
なった。

【００３８】（２）親水性ゼラチンのブレビス菌による
分泌発現プラスミドｐＮＨ３００Ｎｃ−Ｐ６の構築（１）と同様の方法で実施例２（２）で調製した親水
性ゼラチンのマルチマー化した遺伝子ｐＡＮ３−Ｐ６を
プラスミドｐＮＨ３００Ｎｃに組み込んで、親水性ゼラ
チン遺伝子のユニットが６個入ったプラスミドｐＮＨ３
００Ｎｃ−Ｐ６を得た。

【００３９】形質転換体の取得（１）と同様の方法でで得たプラスミドｐＮＨ３０
０Ｎｃ−Ｐ６でバチルス・ブレビス３１−ＯＫ株を形質
転換し、形質転換体バチルス・ブレビス３１−ＯＫ／ｐ
ＮＨ３００Ｎｃ−Ｐ６を得た。親水性人工ゼラチンの発現で得られた形質転換体をＹＣ培地で３０℃、６日間培
養し、培養上清を（１）と同様の方法でウエスタンブ
ロットを行って、発現量を測定した。親水性人工ゼラチ
ンの発現量は、数百mgであった。実施例４．人工ゼラチンの精製と構造解析（１）発現させたゼラチンの精製実施例３（１）で調製した疎水性人工ゼラチン発現ベク
ターを有するブレビス菌（バチルス・ブレビス３１−Ｏ
Ｋ／ｐＮＨ３００−ＮｃＢ８）を３０℃、６日間、ＹＣ
培地中で培養し、人工ゼラチンを分泌生産させた。培養
液を６０００rpm 、１０分間遠心して培養上清を回収し
た。この培養上清に３０％飽和となるように硫安を溶解
し、室温で３０分間撹拌して上清を回収した。更にこの
上清に４５％飽和となるように硫安を溶解して、室温で
３０分間撹拌した後、遠心により沈殿を回収した。得ら
れた沈殿画分を蒸留水に溶解し、この溶液を１０００倍
量の蒸留水に対して、４℃、一晩透析して、硫安３０−
４５％飽和画分を得た。

【００４０】さらに、この画分に含まれる人工ゼラチン
を陰イオン交換クロマトにより精製した。硫安３０−４
５％飽和画分に含まれる人工ゼラチンを陰イオン交換カ
ラム（ＭｏｎｏＱ５／５、ファルマシア）に吸着させた
後、塩化ナトリウムにより溶出した。人工ゼラチンが含
まれる溶出画分は、免疫染色により同定した。以上の方
法により人工ゼラチンはＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一バン
ドに精製された（図４）。精製された人工ゼラチンは、
陰イオンクロマト溶出液を１０００倍量の蒸留水に透析
後、凍結乾燥により粉末化した。

【００４１】（２）人工ゼラチンの構造解析上記実施例で得られた人工ゼラチンと比較例として市販
の天然ゼラチン（新田ゼラチン製）の０．０３％水溶液
を調製した。両者について、２３０〜１８５nmの波長領
域に於ける円偏光二色性スペクトル（日本分光製；ＣＤ
−７２０）を比較した（図５）。上記実施例で得られた
人工ゼラチンは、天然ゼラチンとほぼ同じＣＤスペクト
ルを示し、人工ゼラチンが天然ゼラチンと同様な構造特
性を有することが確認された。

【００４２】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴 Xal 〜Xa20はハイドロキシプロリンを含む任意のアミノ
酸配列 Gly Xa1 Xa2 Gly Xa3 Xa4 Gly Xa5 Xa6 Gly Xa7 Xa8 Gly Xa9 Xa10 Gly 1 5 10 15 Xall Xa12 Gly Xa13 Xa14 Gly Xa15 Xa16 Gly Xa17 Xa18 Gly Xa19 Xa20 20 25 30

【００４３】配列番号：２配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列の特徴 Xal はAsp またはPro, Xa2はLeu またはArg 配列 Gly Pro Ala Gly Xa1 Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Xa2 Gly Glu Thr 20 25 30

【００４４】配列番号：３配列の長さ：２３１配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：タンパク質配列 Gly Pro Ala Gly Asp Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro 20 25 30 Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val 35 40 45 Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly 50 55 60 Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro 65 70 75 80 Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro 85 90 95 Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly 100 105 110 Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala 115 120 125 Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser 130 135 140 Gly Asp Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly 145 150 155 160 Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro 165 170 175 Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala 180 185 190 Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly 195 200 205 Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys 210 215 220 Ser Gly Asp Leu Gly Glu Thr 225 230

【００４５】配列番号：４配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15 Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr 20 25 30

【００４６】配列番号：５配列の長さ：１６８配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Glu Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15 Arg Asp Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Glu 20 25 30 Ser Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp 35 40 45 Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Glu Ser Gly 50 55 60 Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser 65 70 75 80 Pro Gly Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp 85 90 95 Gly Ser Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Glu Ser Gly 100 105 110 Arg Glu Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser 115 120 125 Pro Gly Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Glu Ser Gly Arg Glu 130 135 140 Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly 145 150 155 160 Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr 165

【００４７】配列番号：６配列の長さ：６９３配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGTCCTGCTG GGGATCCTGG AGCCCCGGGT GCACCAGGCG CACCTGGACC AGTCGGGCCG 60 GCAGGTAAAT CAGGTGATCG CGGAGAGACA GGTCCTGCTG GCCCGCCTGG AGCCCCGGGT 120 GCACCAGGCG CACCTGGACC AGTCGGGCCG GCAGGTAAAT CAGGTGATCG CGGAGAGACA 180 GGTCCTGCTG GCCCGCCTGG AGCCCCAGGC GCGCCGGGGG CGCCGGGACC AGTCGGGCCG 240 GCAGGTAAAT CCGGGGACCG CGGAGAAACA GGTCCCGCTG GACCGCCTGG AGCCCCAGGC 300 GCGCCGGGGG CGCCGGGACC AGTCGGGCCG GCAGGTAAAT CCGGGGACCG CGGAGAAACA 360 GGTCCCGCTG GACCGCCTGG AGCCCCAGGT GCACCTGGCG CTCCAGGTCC AGTTGGTCCA 420 GCAGGTAAAT CTGGAGATCC TGGAGCCCCA GGCGCGCCGG GGGCGCCGGG ACCAGTCGGG 480 CCGGCAGGTA AATCCGGGGA CCGCGGAGAA ACAGGTCCCG CTGGACCGCC TGGAGCCCCG 540 GGTGCACCAG GCGCACCTGG ACCAGTCGGG CCGGCAGGTA AATCAGGTGA TCGCGGAGAG 600 ACAGGTCCTG CTGGCCCGCC TGGAGCCCCA GGTGCACCTG GCGCTCCAGG TCCAGTTGGT 660 CCAGCAGGTA AATCTGGAGA TCTTGGTGAA ACT 693

【００４８】配列番号：７配列の長さ：５０４配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGTGAATCCG GACGTGAAGG AGCCCCCGGC GCAGAGGGTT CGCCGGGTCG GGATGGATCA 60 CCAGGAGCGA AGGGGGATCG CGGTGAAACG GGAGAGTCAG GCCGAGAAGG AGCCCCCGGT 120 GCCGAGGGTT CACCGGGTCG AGATGGGTCG CCAGGAGCGA AGGGAGATCG AGGCGAGACA 180 GGTGAGTCTG GCCGTGAGGG AGCCCCAGGT GCAGAGGGAT CTCCAGGCCG TGATGGTTCT 240 CCCGGACGTG AAGGAGCCCC CGGCGCGGAG GGTTCGCCGG GTCGCGACGG CTCTCCAGGA 300 GCGAAGGGGG ACCGAGGCGA GACTGGTGAA TCTGGCCGTG AGGGAGCCCC TGGTGCTGAG 360 GGTTCTCCCG GCCGTGACGG TTCGCCAGGA GCGAAGGGAG ATCGGGGCGA AACAGGGGAG 420 TCGGGTCGCG AGGGAGCCCC AGGTGCAGAG GGATCTCCAG GCCGTGATGG TTCTCCCGGG 480 GCCAAGGGTG ATCGTGGTGA AACC 504

【００４９】配列番号：８配列の長さ：１１９配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCATGGCTTT CGCAGGTCCT GCTGGGGATC CTGGAGCCCC AGGTGCACCT GGCGCTCCAG 60 GTCCAGTTGG TCCAGCAGGT AAATCTGGAG ATCTTGGTGA AACTTAAGGT ACCAAGCTT 119

【００５０】配列番号：９配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Pro Ala Gly Asp Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Leu Gly Glu Thr 20 25 30

【００５１】配列番号：１０配列の長さ：１１３配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 CCATGGCTTT CGCAGGTGAA TCCGGACGTG AAGGAGCCCC AGGTGCAGAG GGATCTCCAG 60 GCCGTGATGG TTCTCCCGGG GCCAAGGGTG ATCGTGGTGA AACCTAAGGT ACC 113

【００５２】配列番号：１１配列の長さ：１０８配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GTTAACAGTG TATTGGCTAG TGCACTCGCA CTTACTGTTG CTCCCATGGC TTTCGCTGCA 60 GGATCCGTCG ACTCTAGAGG TACCAGATCT CTCGAGGAGC TCAAGCTT 108

【００５３】配列番号：１２配列の長さ：１０８配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAGCTTGAGC TCCTCGAGAG ATCTGGTACC TCTAGAGTCG ACGGATCCTG CAGCGAAAGC 60 CATGGGAGCA ACAGTAAGTG CGAGTGCACT AGCCAATACA CTGTTAAC 108

【００５４】配列番号：１３配列の長さ：９６配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GAGCCCCGGG TGCACCAGGC GCACCTGGAC CAGTCGGGCC GGCAGGTAAA TCAGGTGATC 60 GCGGAGAGAC AGGTCCTGCT GGCCCGCCTG GAGCCC 96

【００５５】配列番号：１４配列の長さ：９６配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGGCTCCAGG CGGGCCAGCA GGACCTGTCT CTCCGCGATC ACCTGATTTA CCTGCCGGCC 60 CGACTGGTCC AGGTGCGCCT GGTGCACCCG GGGCTC 96

【００５６】配列番号：１５配列の長さ：９６配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GAGCCCCAGG CGCGCCGGGG GCGCCGGGAC CAGTCGGGCC GGCAGGTAAA TCCGGGGACC 60 GCGGAGAAAC AGGTCCCGCT GGACCGCCTG GAGCCC 96

【００５７】配列番号：１６配列の長さ：９６配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGGCTCCAGG CGGTCCAGCG GGACCTGTTT CTCCGCGGTC CCCGGATTTA CCTGCCGGCC 60 CGACTGGTCC CGGCGCCCCC GGCGCGCCTG GGGCTC 96

【００５８】配列番号：１７配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Pro Ala Gly Pro Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly Ala Pro Gly 1 5 10 15 Pro Val Gly Pro Ala Gly Lys Ser Gly Asp Arg Gly Glu Thr 20 25 30

【００５９】配列番号：１８配列の長さ：３０配列の型：アミノ酸トロポジー：直鎖状配列の種類：ペプチド配列 Gly Ala Pro Gly Ala Glu Gly Ser Pro Gly Arg Asp Gly Ser Pro Gly 1 5 10 15 Ala Lys Gly Asp Arg Gly Glu Thr Gly Glu Ser Gly Arg Glu 20 25 30

【００６０】配列番号：１９配列の長さ：１１５配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列の特徴 N はA, C, G またはT, YはC またはT, RはG またはA 配列 GGACGTGAAG GAGCCCCNGG NGCNGAGGGT TCNCCNGGNC GNGAYGGNTC NCCAGGAGCG 60 AAGGGNGAYC GNGGNGARAC NGGNGARTCN GGNCGNGARG GAGCCCAGGT GCAGA 115

【００６１】配列番号：２０配列の長さ：１７配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 GGACGTGAAG GAGCCCC 17

【００６２】配列番号：２１配列の長さ：１６配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TCTGCACCTG GGGCTC 16

【００６３】配列番号：２２配列の長さ：１８配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 TGGAGAGAAA AGAAAATC 18

【００６４】配列番号：２３配列の長さ：１７配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AGGTCTCACT TTTCCAC 17

【００６５】配列番号：２４配列の長さ：３０配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAACCCGGGA ATATACTAGA GATTTTTAAC 30

【００６６】配列番号：２５配列の長さ：２７配列の型：核酸トロポジー：一本鎖配列の種類：他の核酸合成ＤＮＡ配列 AAAGAATTCA AGCTTGAGCT CCTCGAG 27

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は中性ゼラチン遺伝子のマルチマー化の原
理を示す図である。

【図２】図２は親水性ゼラチン遺伝子のマルチマー化の
原理を示す図である。

【図３】図３はバチルス・ブレビス宿主中で合成遺伝子
から生産されたタンパク質の電気泳動図である。

【図４】図４は、バチルス・ブレビス宿主中で合成遺伝
子から生産されたタンパク質の電気泳動図である。

【図５】図５は本発明の方法により組換え生産された人
工ゼラチンタンパク質と天然ゼラチンのＣＤスペクトル
を比較した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:08） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:08） (72)発明者高橋治雄愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者山田幸生愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者平井正名愛知県愛知郡長久手町大字長湫字横道41番地の１株式会社豊田中央研究所内 (72)発明者高木広明茨城県鹿島郡波崎町7707−８ (72)発明者恵比須省吾千葉県銚子市清水町2798−１ (72)発明者渡辺史子千葉県銚子市三軒町８−９

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】バチルス・ブレビス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｂｒｅｖｉｓ）由来のプロモター領域を含有するＤＮ
Ａの３′末端にタンデムに連結したタンパク質（ペプチ
ド）をコードするＤＮＡを連結した組換えＤＮＡ。
【請求項２】配列表の配列番号１のアミノ酸配列が１
〜３０個連結された新規コラーゲン様タンパク質。
【請求項３】配列番号２のアミノ酸配列が１〜３０個
連結された請求項２に記載の新規コラーゲン様タンパク
質。
【請求項４】配列番号３のアミノ酸配列で示される請
求項２又は３に記載の新規コラーゲン様タンパク質。
【請求項５】配列番号４のアミノ酸配列が１〜３０個
連結された請求項２に記載の新規コラーゲン様タンパク
質。
【請求項６】配列番号５のアミノ酸配列で示される請
求項２又は５に記載の新規コラーゲン様タンパク質。
【請求項７】請求項２〜６のいずれか１項に記載の新
規コラーゲン様タンパク質のアミノ酸配列をコードする
遺伝子。
【請求項８】配列番号６又は配列番号７の塩基配列で
示される請求項７に記載の遺伝子。
【請求項９】請求項２〜６のうちのいずれかに記載の
アミノ酸配列をコードする遺伝子あるいは請求項７又は
８の遺伝子を組み込んだバチルス・ブレビスを培養する
ことにより、新規コラーゲン様タンパク質を培養物中に
生成、蓄積せしめ、これを採取することを特徴とする新
規コラーゲン様タンパク質の製造方法。