JP5020487B2 - 融合タンパク質発現用新規dna及び該dnaを用いたタンパク質の製造方法 - Google Patents
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Description
更に、本発明は、P45タンパク質遺伝子の下流に目的タンパク質遺伝子を連結したDNAを組み込んだ融合タンパク質発現用ベクターを提供する。
また更に、本発明は、該融合タンパク質発現用ベクターを保持する宿主細胞を培養する工程を含むタンパク質の生産方法を提供する。
a)P45融合タンパク質遺伝子x−r−zを組み込んだP45融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを作製する。
b)P45融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを宿主細胞に導入し宿主細胞の形質転換体を作製する。
c)宿主細胞の形質転換体を培養し、P45融合タンパク質遺伝子x−r−zを発現させ、P45融合タンパク質X’−R−Zを培地中に分泌生産させる。
d)培養上清中からP45融合タンパク質X’−R−Zを回収する。
e)回収した融合タンパク質からP45融合パートナーX’を切断処理し目的タンパク質Zを単離する。
f)単離した目的タンパク質Zを精製する。
まず、P45融合タンパク質遺伝子x−r−zを組み込んだP45融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを作製する。
a)で構築したP45融合タンパク質遺伝子発現用ベクターを宿主細胞に導入し、宿主細胞の形質転換体を作製する。
次に、b)で作製した宿主細胞の形質転換体を培養し、P45融合タンパク質遺伝子x−r−zを発現させ、P45融合タンパク質X’−R−Zを培地中に分泌生産させる。
次いで、培養上清中から融合タンパク質X’−R−Zを回収する。
次いで、d)で回収した融合タンパク質から融合パートナーX’を切断処理し目的とするタンパク質Zを単離する。
更に、e)で単離した目的とするタンパク質Zを精製する。
P45タンパク質の遺伝子を以下の手順によりクローン化した。
下記の2本の合成DNAをプライマーに用い、ブレビバチルス・チョウシネンシスHPD31−S5のゲノムDNAを鋳型に用いてPCRを行い、配列番号5:図5の配列に示す、P45タンパク質の2番めのメチオニン以降をコードするDNA断片の増幅を行った。該2本のプライマーの内、P45−N(forward)を配列番号12(図11上段)及びP45−C(backward)を配列番号13(図11下段)にそれぞれ示した。
ブタIFN−γは、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする組換えタンパク質生産において生産が極めて困難なタンパク質であり、通常の遺伝子組換えによる方法では発現用ベクターの構築すら不可能だった。そこで、上記の実施例2で構築したP45融合発現用ベクターpNY−P45にブタIFN−γ遺伝子を組み込み、P45融合タンパク質法によるブタIFN−γの生産を試みた。
madin−darby bovine kidney epithelial cell(MDBK細胞)を96穴マイクロプレート上で37℃2日間培養した。次いで、3−2で得た凍結乾燥したブタIFN−γを溶解し希釈した希釈サンプルを培養細胞に加え37℃24時間培養した。更に、培養細胞にvesicular stomatitis virus(VSV)を加え37℃で24時間培養した。培養終了後、20%ホルマリンを含むクリスタルバイオレット溶液で固定および生存している細胞の染色を行い、570nmの吸収を測定した。この際、細胞を50%生存させる時のブタIFN−γの量を抗ウィルス活性1ユニット(1U)と定義した。以上により測定したブタIFN−γの活性は6.0U/ngであった。
ウシIFN−τは、ブレビバチルス属細菌を宿主細胞とする通常の遺伝子組換えによる方法では、最も生産量が多い場合でも10〜20mg/l程度の生産量しかなく、全く生産されない場合も多かった。
madin−darby bovine kidney epithelial cell(MDBK細胞)を96穴マイクロプレート上で37℃2日間培養した。次いで、4−2で得た凍結乾燥したウシIFN−τを溶解し希釈した希釈サンプルを培養細胞に加え37℃24時間培養した。更に、培養細胞にvesicular stomatitis virus(VSV)を加え37℃で24時間培養した。培養終了後、20%ホルマリンを含むクリスタルバイオレット溶液で固定および生存している細胞の染色を行い、570nmの吸収を測定した。この際、細胞を50%生存させる時のウシIFN−τの量を抗ウィルス活性1ユニット(1U)と定義した。以上により測定したウシIFN−τの活性は4.0U/ngであった。
Claims (7)
- ブレビバチルス(Brevibacillus)属細菌を宿主とする融合タンパク質発現法における融合パートナーとして用いられる配列番号4または5の塩基配列からなるDNAを含有する融合タンパク質発現用ベクター。
- ブレビバチルス(Brevibacillus)属細菌を宿主とする組換えタンパク質生産に用いられる分泌シグナルをコードするDNAの下流に配列番号6の塩基配列からなるDNAを連結したDNAを含有する融合タンパク質発現用ベクター。
- 請求項1または2に記載のDNAの3'末端側に結合され、酵素によって特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするDNAを含有する請求項1または2に記載のベクター。
- 酵素によって特異的に認識され切断される部位を含むアミノ酸配列をコードするDNAの3'末端側に結合され、生産を目的とするタンパク質またはポリペプチドをコードするDNAを含有する請求項3に記載のベクター。
- 請求項4に記載のベクターを保持するブレビバチルス(Brevibacillus)属細菌形質転換体。
- ブレビバチルス・チョウシネンシス(Brevibacillus choshinensis)である請求項5に記載の形質転換体。
- 請求項5または6に記載の形質転換体を培養する工程を含むこと、を特徴とするタンパク質またはポリペプチドを生産する方法。
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