JP2015003905A - 創傷治癒剤 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】 GAGAGS配列(1)並びに下記アミノ酸配列(X)及び/又は下記アミノ酸配列(X’)を有するタンパク質(A)と水とを含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求められる(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が40〜60%であり、(A)中の全アミノ酸数に対する全ての(X)中のアミノ酸数と全ての(X’)中のアミノ酸数の合計数の割合が5〜45%であり、(A)中の全アミノ酸数に対する全ての配列(1)中のアミノ酸数の割合が40〜80%である創傷治癒剤である。
アミノ酸配列(X):3種の特定の配列からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列(X’):(X)中の特定数のアミノ酸がリシン及び/又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
【選択図】なし
Description
また、ガーゼ、脱脂綿及び軟膏等に代わり、適度な湿潤環境を維持するために、カルボキシメチルセルロース(CMC)ゲル(特許文献1)等の湿潤環境維持を目的とした創傷被覆材が用いられる場合がある。しかしながら、CMCゲルは滲出液等によりゲル構造を保持することが難しく、創傷部からの脱離や、菌感染の温床になる問題がある。
また、熱傷や褥瘡性皮膚潰瘍等では、患部から壊死組織を除去(デブリードマン)し、止血処理を実施した後に、創傷治療剤を適用する場合がある。この時、止血処理が不十分であったり、患部を動かしたりすることで、二次的に出血(二次出血)することがある。二次出血すると、患部全体に痂皮が形成され、創傷被覆材や創傷治癒剤の効果が薄れて、治癒の遅延をもたらす問題がある。二次出血の恐れがある場合、止血効果のあるアルギン酸創傷被覆材を使用する場合があるが、効果は限定的である。
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が40〜60%であり、前記タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列(X)中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列(X’)中のアミノ酸数の合計数の割合が5〜45%であり、前記タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全ての前記GAGAGS配列(1)中のアミノ酸数の割合が40〜80%である創傷治癒剤。
アミノ酸配列(X):VPGVG配列(2)、GVGVP配列(3)及びGAHGPAGPK配列(4)からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列(X’):前記アミノ酸配列(X)中の1個のアミノ酸がリシン(K)若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列(X)中の2個のアミノ酸がリシン(K)及び/若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列。
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が40〜60%であり、前記タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列(X)中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列(X’)中のアミノ酸数の合計数の割合が5〜45%であり、前記タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全ての前記GAGAGS配列(1)中のアミノ酸数の割合が40〜80%である創傷治癒剤である。
アミノ酸配列(X):VPGVG配列(2)、GVGVP配列(3)及びGAHGPAGPK配列(4)からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列(X’):前記アミノ酸配列(X)中の1個のアミノ酸がリシン(K)若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列(X)中の2個のアミノ酸がリシン(K)及び/若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列。
また、タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が上記範囲であることで、タンパク質(A)中のアミノ酸配列(X)及び/又はアミノ酸配列(X’)の細胞親和性が高くなることから、肉芽組織形成作用や上皮化促進作用に優れる。さらに、滲出液等を吸収しても膨潤することなく、長期的にゲル構造を保持することができる。加えて、時間の経過及び熱等の刺激を加える等によりゲル化するので、創傷部が創傷治癒剤で密閉され、菌の増殖を抑制することができる。またゲル化物は、湿潤環境を維持し細胞の増殖を促すことができる。
また、タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合及びタンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全てのGAGAGS配列(1)中のアミノ酸数の割合が上記範囲であることで、創傷治癒剤の弾性率が皮膚の弾性率に近づく、即ち皮膚への追随性に優れたものとなることから、止血効果が高くなり患部の二次出血が抑制される。
タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は、細胞親和性、細胞の増殖促進及び二次出血抑制の観点から40〜57.5%が好ましく、さらに好ましくは40〜55%である。
上記割合は、タンパク質(A)をリフォールディングさせることによって増加させることができる。また、上記割合はタンパク質(A)を変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合は、下記測定法によって求める。
タンパク質を0.3mg/mlとなるように脱イオン水(4℃)に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製したタンパク質の水溶液を円二色性スペクトル測定器(日本分光株式会社製、「J−820」)にて測定し(測定温度:4℃)、二次構造解析プログラム(JWSSE型:日本分光株式会社製)を用いてβターン構造の割合とランダムコイル構造の割合とを算出し、これらの合計をβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合とする。
アミノ酸配列(X):VPGVG配列(2)、GVGVP配列(3)及びGAHGPAGPK配列(4)からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列(X’):アミノ酸配列(X)中の1個のアミノ酸がリシン(K)若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列又はアミノ酸配列(X)中の2個のアミノ酸がリシン(K)及び/若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列。
なお、タンパク質(A)は、アミノ酸配列(X)及びアミノ酸配列(X’)をそれぞれ複数個有していてもよく、複数個ある場合のアミノ酸配列(X)及びアミノ酸配列(X’)はそれぞれ同一でも異なっていてもよく、アミノ酸配列(X)とアミノ酸配列(X’)とを共に有していてもよい。
アミノ酸配列(X’)は、細胞親和性及びタンパク質(A)のゲル化能の観点から、GKGVP配列(7)、GKGKP配列(8)及びGRGRP配列(10)からなる群より選ばれる少なくとも1種の配列が好ましく、さらに好ましくはGKGVP配列(7)及び/又はGKGKP配列(8)である。
ポリペプチド鎖(Y’):ポリペプチド鎖(Y)中の全アミノ酸数の0.1〜20%のアミノ酸がリシン(K)及び/又はアルギニン(R)で置換されたポリペプチド鎖。
タンパク質(A)1分子中に、ポリペプチド鎖(Y)を複数有する場合は、ポリペプチド鎖(Y)は同一でも異なっていてもよく、さらにタンパク質(A)中にポリペプチド鎖(Y)を複数有する場合は、上記アミノ酸配列(X)の連続する個数は、ポリペプチド鎖(Y)ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、アミノ酸配列(X)の連続する個数b〜dが同じポリペプチド鎖(Y)を複数有してもよく、b〜dが異なるポリペプチド鎖(Y)を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖(Y)としては、細胞親和性及びタンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、(VPGVG)b配列及び/又は(GVGVP)c配列が好ましい。
ポリペプチド鎖(Y’)において、ポリペプチド鎖(Y)中の全アミノ酸数に対するリシン(K)及びアルギニン(R)で置換されたアミノ酸数の合計数の割合は、タンパク質(A)の水への溶解性、細胞親和性及びタンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、0.5〜10%が好ましく、さらに好ましくは1〜7%である。
タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列(X)中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列(X’)中のアミノ酸数の合計数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から2種類以上を用いて、タンパク質(A)を30残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質(A)の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全てのアミノ酸配列(X)中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列(X’)中のアミノ酸数の合計数の割合を算出する。
タンパク質(A)中の全てのアミノ酸配列(X)中のアミノ酸数と全てのアミノ酸配列(X’)中のアミノ酸数の合計数の割合(%)=[{アミノ酸配列(X)の数}×{アミノ酸配列(X)中のアミノ酸数}+{アミノ酸配列(X’)の数}×{アミノ酸(X’)中のアミノ酸数}]/{タンパク質(A)中の全アミノ酸数}×100
まず、各種類のアミノ酸配列(X)について、「{アミノ酸配列(X)の数}×{アミノ酸配列(X)中のアミノ酸数}」を求める。その全種類についての合計値を、上記式中の「{アミノ酸配列(X)の数}×{アミノ酸配列(X)中のアミノ酸数}」とする。
タンパク質(A)が、複数種類のアミノ酸配列(X)に対応する複数種類のアミノ酸配列(X’)を有する場合も同様にして、上記式中の「{アミノ酸配列(X’)の数}×{アミノ酸配列(X’)中のアミノ酸数}」を求める。
タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全てのGAGAGS配列(1)中のアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の2種類以上を用いて、タンパク質(A)を30残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー(HPLC)にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質(A)の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてタンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全てのGAGAGS配列(1)中のアミノ酸数の割合を算出する。
タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全てのGAGAGS配列(1)中のアミノ酸数の割合(%)=[{GAGAGS配列(1)の数×6}/{タンパク質(A)中の全アミノ酸の数}×100
ポリペプチド鎖(S)において、GAGAGS配列(1)が連続する個数は、細胞親和性、二次出血抑制及びβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、2〜100個が好ましく、さらに好ましくは2〜50個であり、特に好ましくは2〜25個、最も好ましくは2〜15である。
タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全ての介在アミノ酸配列(Z)中のアミノ酸数の割合[Σ{(介在アミノ酸配列(Z)中のアミノ酸数)×(介在アミノ酸配列(Z)の数)}/{タンパク質(A)中の全アミノ酸数}×100]は、タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を適度にする観点から、0〜20%が好ましく、さらに好ましくは0〜15%であり、特に好ましくは0〜10%である。
以下に、各精製タグ(i)とそのタグを認識結合するリガンド(ii)との組み合わせの一例を示す。
(i−1)グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GTS) (ii−1)グルタチオン
(i−2)マルトース結合タンパク質(MBP) (ii−2)アミロース
(i−3)HQタグ (ii−3)ニッケル
(i−4)Mycタグ (ii−4)抗Myc抗体
(i−5)HAタグ (ii−5)抗HA抗体
(i−6)FLAGタグ (ii−6)抗FLAG抗体
(i−7)6×Hisタグ (ii−7)ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質(A)をコードする核酸の5’又は3’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
(A1)アミノ酸配列(X)がGVGVP配列(3)であるタンパク質
(A11)GVGVP配列(3)が2〜200個連続したポリペプチド鎖(Y1)中のアミノ酸がリシン(K)で置換されたポリペプチド鎖(Y’1)とGAGAGS配列(1)が2〜200個連続したポリペプチド鎖(S1)とを有するタンパク質
(A11−1−1)GAGAGS配列(1)が7個連続した(GAGAGS)7配列(5)と(GVGVP)2GKGVP配列(6)とを有するタンパク質
(i)(GAGAGS)7配列(5)及び(GVGVP)2GKGVP配列(6)をそれぞれ13個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約85kDaの配列(15)のタンパク質(SELPS1K)
(ii)(GAGAGS)7配列(5)及び(GVGVP)2GKGVP配列(6)をそれぞれ20個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約95kDaの配列(16)のタンパク質(SELPS1K−20)
(A11−1−2)GAGAGS配列(1)が10個連続した(GAGAGS)10配列(25)と(GVGVP)2GKGVP配列(6)とを有するタンパク質
(i)(GAGAGS)10配列(25)及び(GVGVP)2GKGVP配列(6)をそれぞれを20個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約140kDaの配列(22)のタンパク質(SELPS2K−20)
(A11−2−1)GAGAGS配列(1)が4個連続した(GAGAGS)4配列(26)と(GVGVP)3GKGVP配列(27)とを有するタンパク質
(i)(GAGAGS)4配列(26)及び(GVGVP)3GKGVP配列(27)をそれぞれ15個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約65kDaの配列(24)のタンパク質(SELPS4K−15)
(A12−1)GVGVP配列(3)が1個と、GAGAGS配列(1)が11個連続した(GAGAGS)11配列(28)とを有するタンパク質
(i)GVGVP配列(3)、(GAGAGS)11配列(28)及びGAAYYAAG配列(12)をそれぞれ13個有し、これらが交互に化学結合した分子質量が約90kDaの配列(23)のタンパク質(SELPS3K−13)
(A21)VPGVG配列(2)が2〜200個連続したポリペプチド鎖(Y2)中のアミノ酸がK(リシン)で置換されたポリペプチド鎖(Y’2)とGAGAGS配列(1)が2〜200個連続したポリペプチド鎖(S1)とを有するタンパク質
創傷治癒剤中のタンパク質(A)の含有量(重量%)は、タンパク質(A)の水への溶解性、タンパク質(A)のゲル化能及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、5〜30重量%が好ましく、さらに好ましくは10〜30重量%、特に好ましくは15〜30重量%である。
創傷治癒剤中の水の含有量(重量%)は、タンパク質(A)の水への溶解性、タンパク質(A)のゲル化能及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、50〜95重量%が好ましく、さらに好ましくは55〜90重量%であり、特に好ましくは70〜85重量%である。
無機塩としては、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。なお、本明細書においてリン酸(塩)は無機塩に含まない。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量(重量%)は、人間の体液と浸透圧を同等にするという観点から、創傷治癒剤の重量を基準として0.5〜1.3重量%が好ましく、さらに好ましくは0.7〜1.1重量%、特に好ましくは0.85〜0.95重量%である。
リン酸塩としては、リン酸のアルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸(塩)の含有量(重量%)は、創傷治癒の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として0.10〜0.30重量%が好ましく、さらに好ましくは0.12〜0.28重量%、特に好ましくは0.14〜0.26重量%である。
(創傷治癒剤の製造方法)
(1)本発明のタンパク質(A)及び水を4〜25℃で混合し、創傷治癒剤とする。水中には必要により無機塩及び/又はリン酸(塩)が含まれていてもよい。また、タンパク質(A)を水に溶解させた後、必要により無機塩及び/又はリン酸(塩)を含むようにしてもよい。
また、創傷治癒剤を予めゲル化させて用いる場合のゲル化させる温度は、創傷治癒剤を短時間でゲル化させる観点から、25℃〜80℃が好ましい。80℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
患部への適用方法の1例を下記に示す。
(創傷治癒剤の患部への適用方法)
(1)患部に創傷治癒剤を投与する。
(2)投与後、創傷治癒剤が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。
ドレッシングの形状としては、創傷治癒剤を投与後に、創傷治癒剤が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。
[SELPS1Kタンパク質(A1−1)の作製]
○SELPS1Kタンパク質(A1)の生産
特許第4088341号公報の実施例記載の方法に準じて、SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、SELPS1K生産株を得た。以下、このSELPS1K生産株を用いて、タンパク質(A)の一種である配列(15)のSELPS1Kタンパク質(A1)を生産する方法を示す。
30℃で生育させたSELPS1K生産株の一夜培養液を使用して、250mlフラスコ中のLB培地50mlに接種した。カナマイシンを最終濃度50μg/mlとなるように加え、該培養液を30℃で攪拌しながら(200rpm)インキュベートした。培養液が濁度OD600=0.8(吸光度計UV1700:島津製作所製を使用)となった時に、40mlを42℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約2時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度OD600を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
集菌した大腸菌を用い、下記1:菌体溶解、2:遠心分離による不溶性細片の除去、3:硫安沈殿、4:限外濾過、5:陰イオン交換クロマトグラフィー、6:限外濾過、7:凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約85kDaの配列(15)のタンパク質(A1)の精製物であるSELPS1Kタンパク質(A1−1)を得た。
集菌した大腸菌100gに対して、脱イオン水200gを加えて、高圧ホモジナイザー(55MPa)にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてpH4.0に調整した。
さらに菌体溶解液を遠心分離(6300rpm、4℃、30分間)して、上清を回収した。
回収した上清に硫安濃度が25重量%となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、8〜12時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が25重量%となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、8〜12時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
3で得た溶液を分子質量30,000カットの限外濾過装置(ホロファイバー:GEヘルスケア製)に供した。3で得た溶液に対して、20倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
限外濾過後のタンパク質を10mM酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して20g/Lとし、陰イオン交換カラムHiPrepSP XL16/10(GEヘルスケア社製)をセットしたAKTAPrime(アマシャム社製)に供した。溶出液として500mM酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
5で得た溶液を上記「4:限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
タンパク質を脱イオン水に溶解して3g/Lとし、水位が10mm以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機(日本テクノサービス社製)に入れて、−30℃、24時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が5Pa以下、−30℃で、110時間かけて1次乾燥、真空度が5Pa以下、30℃で、48時間かけて2次乾燥させ、精製したSELPS1Kタンパク質(A1−1)を得た。
得られたSELPS1Kタンパク質(A1−1)を下記の手順で同定した。
抗ラビットSELPS1K抗体及びC末端配列の6×Hisタグに対する抗6×His抗体(Roland社製)を用いたウエスタンブロット法により分析した。ウエスタンブロット法の手順は下記の通りとした。見かけ分子質量85kDaの位置に、各抗体に抗体反応性を示すバンドが見られた。 また、アミノ酸分析システム(Prominence島津製作所製)を用いたアミノ酸組成分析より得られたSELPS1Kタンパク質(A1−1)のアミノ酸の組成比率(実測値)と、合成遺伝子配列から推測されるSELPS1Kタンパク質(A1−1)のアミノ酸の組成比率(理論値)を表1に示す。
これらから、SELPS1Kタンパク質(A1−1)はGVGVP配列(3)が3個連続したポリペプチド鎖(Y)中のバリン(V)のうち1個がリシン(K)に置換された(GVGVP)2GKGVP配列(6)のポリペプチド鎖(Y’11)及びGAGAGS配列(1)が7個連続した(GAGAGS)7配列(5)のポリペプチド鎖(Y11)をそれぞれ13個有し、これらが交互に化学結合してなる配列(15)のタンパク質であることを確認した。
ウエスタンブロット用サンプル20μLに3×SDS処理バッファ(150mM Tris HCl(pH6.8)、300mM ジチオスレイトール、6% ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、0.3% ブロモフェノールブルー、及び30% グリセロールを含む)10μLを添加して95℃で5分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料15μLを用いてSDS−PAGEを行った。泳動後のゲルをフッ化ポリビニリデンメンブレン(以下、単に「メンブレン」ともいう)にトランスファーし、これをブロッキングバッファ(20mM Tris(pH7.6)、137mM NaCl、0.1% Tween20、及び5% スキムミルクを含む)に浸漬して1時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをTBS−T(20mM Tris(pH7.6)、137mM NaCl、及び0.1% Tween20を含む)で2分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液(一次抗体:抗SELPS1K抗体及び抗His−tag抗体(Rockland社製)をTBS−Tで500分の1に希釈した溶液)に浸漬し、4℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをTBS−Tで5分間、4回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液(二次抗体:ECL anti−rabbit IgG HRP linked F(ab’)2 fragment(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)をTBS−Tで2000分の1に希釈した溶液)にメンブレンを浸漬し、30分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをTBS−Tで5分間、4回洗浄した後、ECL−Advance Western Blotting Detection Kit(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)により酵素反応を行った。ルミノメーターForECL(アマシャム社製)を用いて、高感度インスタント黒白フィルム(富士フイルム株式会社製)に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、SELPS1Kタンパク質(A1−1)が分解吸収され、無くなったと判断した。
得られたSELPS1Kタンパク質(A1−1)を用いて下記の手順でβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。
<βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合の測定>
SELPS1Kタンパク質(A1−1)を0.3mg/mlとなるように脱イオン水(4℃)に溶解し、SELPS1Kタンパク質(A1−1)水溶液を作製した。作製したSELPS1Kタンパク質(A1−1)水溶液を円二色性スペクトル測定器(日本分光:J−820)にて測定し(測定温度:4℃)、二次構造解析プログラム(JWSSE型:日本分光株式会社製)を用いて、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を算出した。結果を表2に示す。
製造例1の「SELPS1Kタンパク質(A1−1)の作製」において、「SELPS1Kタンパク質(A1)の精製」の「5:陰イオン交換クロマトグラフィー」と「6:限外濾過」との間に、下記「5−2:リフォールディング(大希釈法)」を行う以外は同様にして、SELPS1Kタンパク質(A1−2)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
5−2:リフォールディング(大希釈法)
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である10Mウレア溶液にて、8Mウレア溶液となるように調製し、12時間、4℃で静置した。調製した溶液を透析膜(Viskase Companies,Inc.社製)に投入し、溶出画分の10倍容量の脱イオン水にて12時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の10倍容量の脱イオン水にて12時間、透析した。この操作を残り3回、計3回の透析を繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約95kDaの配列(16)のSELPS1K−20タンパク質(A2)をコードしたpPTS0002」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A2−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約140kDaの配列(22)のSELPS2K−20タンパク質(A8)をコードしたpPTS0008」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A8−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約90kDaの配列(23)のSELPS3K−13タンパク質(A9)をコードしたpPTS0009」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A9−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約65kDaの配列(24)のSELPS4K−15タンパク質(A10)をコードしたpPTS0010」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A10−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1の「SELPS1Kタンパク質(A1−1)の作製」において、「SELPS1Kタンパク質(A1)の精製」の「5:陰イオン交換クロマトグラフィー」に代えて下記「5’’:アフィニティクロマトグラフィー」とする以外は同様にして、SELPS1Kタンパク質(A1−3)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
5’’:アフィニティクロマトグラフィー
「4:限外濾過」後のタンパク質を、His−tagを用いたアフィニティクロマトグラフィー(クロンテック社製、TALON(登録商標)Single Step Columns)にて精製し、溶出画分を回収した。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約85kDaの配列(17)のタンパク質(A3)をコードしたpPTS0003」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A3−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約60kDaの配列(18)のタンパク質(A4)をコードしたpPTS0004」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A4−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約110kDaの配列(19)のタンパク質(A5)をコードしたpPTS0005」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A5−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約125kDaの配列(20)のタンパク質(A6)をコードしたpPTS0006」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A6−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1において、「SELPS1KをコードしたプラスミドpPTS0001」に代えて、「分子質量が約50kDaの配列(21)のタンパク質(A7)をコードしたpPTS0007」を用いる以外は同様にして、タンパク質(A7−1)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
製造例1の「SELPS1Kタンパク質(A1−1)の作製」において、「SELPS1Kタンパク質(A1−1)の精製」の「5:陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、SELPS1Kタンパク質(A1−4)を作製し、βターン構造とランダムコイル構造の合計の割合を測定した。結果を表2に示す。
SELPS1Kタンパク質(A1−1)を、20mMリン酸緩衝液(NaCl:8g/L、KCl:0.2g/L、pH7.4)に溶解し、20重量%となるように調整した創傷治癒剤(1)を作製した。
実施例1において、「SELPS1Kタンパク質(A1−1)」に代えて表3に記載のタンパク質(A)を用いる以外は同様にして、創傷治癒剤(2)〜(6)を作製した。
実施例1において、「SELPS1Kタンパク質(A1−1)」に代えて表3に記載のタンパク質(A)を用いる以外は同様にして、比較用の創傷治癒剤(7)〜(13)を作製した。
カルボキシメチルセルロースゲルであるイントラサイトゲル(スミス&ネフュー社製)を比較用の創傷治癒剤(14)として用いた。
(タンパク質(A)のゲル化能評価)
創傷治癒剤(1)〜(14)を37℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。ゲル化をしたかどうかの確認は、創傷治癒剤(100μL)が入ったプラスティックチューブ容器(エッペンドルフチューブ、1.5mL)を5分毎に転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合はゲル化していないと判断した。また、ゲル化するまでに2時間以上を要する場合はゲル化しないと判断した。結果を表3に示す。
(健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験)
健常モルモット♀ std Hartley(日本エスエルシー社製)7週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面10×10mmの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤(1)〜(14)を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間5、10日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本(HE染色)を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を11個作製した。
作製した治療期間5日目の病理標本用いて、パニキュラス(筋様膜)からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表3に示す。なお、評価結果は病理標本11個の平均値である。
また、治療期間10日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表3に示す。なお、評価結果は病理標本11個の平均値である。
(健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの菌増殖抑制試験)
健常モルモット♀ std Hartley(日本エスエルシー社製)7週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面10×10mmの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、緑膿菌106個/1創傷部となるように播種し、創傷治癒剤(1)〜(14)を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間3日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、細菌コロニー法にて細菌数を測定した。評価結果は表3に示す。
(ミニブタを用いた全層欠損層モデルでの二次出血スコアリング試験)
クラウン系ミニブタ(株式会社ジャパンファーム クラウン研究所製)10ヶ月齢を麻酔下で除毛し、消毒したミニブタ背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面(直径17mm)の全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤(1)〜(14)を各々注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間3日目に検体を犠死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本(HE染色)を作製した。なお、創傷治癒剤についてそれぞれ病理標本を13個作製した。作製した病理標本について、患部全体に対する痂皮の割合を、以下の5段階の評価基準で評価し、スコアリングした。結果を表3に示す。なお、評価結果は病理標本13個の平均値である。下記点数が低いほど、二次出血が抑制できていることを示す。
1点:患部全体に対する痂皮の割合が20%未満
2点:患部全体に対する痂皮の割合が20%以上40%未満
3点:患部全体に対する痂皮の割合が40%以上60%未満
4点:患部全体に対する痂皮の割合が60%以上80%未満
5点:患部全体に対する痂皮の割合が80%以上
Claims (7)
- GAGAGS配列(1)並びに下記アミノ酸配列(X)及び/又は下記アミノ酸配列(X’)を有するタンパク質(A)と水とを含む創傷治癒剤であって、
円二色性スペクトル法により求められる前記タンパク質(A)中のβターン構造とランダムコイル構造の合計の割合が40〜60%であり、前記タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全ての前記アミノ酸配列(X)中のアミノ酸数と全ての前記アミノ酸配列(X’)中のアミノ酸数の合計数の割合が5〜45%であり、前記タンパク質(A)中の全アミノ酸数に対する全ての前記GAGAGS配列(1)中のアミノ酸数の割合が40〜80%である創傷治癒剤。
アミノ酸配列(X):VPGVG配列(2)、GVGVP配列(3)及びGAHGPAGPK配列(4)からなる群より選ばれる少なくとも1種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列(X’):前記アミノ酸配列(X)中の1個のアミノ酸がリシン(K)若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列又は前記アミノ酸配列(X)中の2個のアミノ酸がリシン(K)及び/若しくはアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列。 - 前記GAGAGS配列(1)の個数と前記アミノ酸配列(X)及び前記アミノ酸配列(X’)の合計個数との比[GAGAGS配列(1):{アミノ酸配列(X)及びアミノ酸配列(X’)の合計}]が1:0.1〜1:6である請求項1に記載の創傷治癒剤。
- 前記タンパク質(A)が、前記アミノ酸配列(X)の1種が2〜200個連続したポリペプチド鎖(Y)及び/又は下記ポリペプチド鎖(Y’)を有し、
前記タンパク質(A)中の前記ポリペプチド鎖(Y)と前記ポリペプチド鎖(Y’)の合計個数が1〜100個である請求項1又は2に記載の創傷治癒剤。
ポリペプチド鎖(Y’):前記ポリペプチド鎖(Y)中の全アミノ酸数の0.1〜20%のアミノ酸がリシン(K)及び/又はアルギニン(R)で置換されたポリペプチド鎖。 - 前記タンパク質(A)が、前記GAGAGS配列(1)が2〜200個連続したポリペプチド鎖(S)を有する請求項1〜3のいずれかに記載の創傷治癒剤。
- 前記タンパク質(A)が、(GAGAGS)7配列(5)及び(GVGVP)2GKGVP配列(6)を有するタンパク質、(GAGAGS)11配列(5)及びGVGVP配列(3)を有するタンパク質又は(GAGAGS)4配列(5)及び(GVGVP)3GKGVP配列(27)を有するタンパク質である請求項4に記載の創傷治癒剤。
- 前記タンパク質(A)のSDS−PAGE(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)法による分子質量が40〜200kDaである請求項1〜5のいずれかに記載の創傷治癒剤。
- 創傷治癒剤の重量を基準として、前記タンパク質(A)が5〜30重量%である請求項1〜6のいずれかに記載の創傷治癒剤。
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JP2000135092A (ja) * | 1986-11-04 | 2000-05-16 | Syntro Corp | オリゴペプチド反復単位を有する大ポリペプチド |
WO2012111438A1 (ja) * | 2011-02-18 | 2012-08-23 | 国立大学法人京都大学 | 組織再生用材料、これを含むタンパク質水溶液及びこれをゲル化させる方法 |
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