JP6496484B2 - 創傷治癒剤 - Google Patents
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Description
本発明は、創傷治癒剤に関する。
熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創や、褥瘡性皮膚潰瘍及び糖尿病性皮膚潰瘍等の創傷を治癒するためには、創傷部を適度な湿潤環境に保ち、細胞増殖を促す環境を作り出す必要がある。そのために患部に適応される創傷被覆材として、従来、ガーゼ及び脱脂綿等が用いられている。これらは、滲出液の吸収が早い反面、細菌に感染しやすく、また、創面が乾燥してしまうと取り外す際に痛みや出血等を伴うという問題がある。また、創面を乾燥させないために、創傷被覆材と軟膏等を併用することも行われているが、滲出液の吸収が不充分となり、創面が過度に湿った状態になってしまう問題がある。
また、ガーゼ、脱脂綿及び軟膏等に代わり、適度な湿潤環境を維持するために、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲル（特許文献１）等の湿潤環境維持を目的とした創傷被覆材が用いられる場合がある。しかしながら、ＣＭＣゲルは滲出液等によりゲル構造を保持することが難しく、創傷部から脱離したり、菌感染の温床になる問題がある。
一方で、湿潤環境を保つだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する創傷治癒剤として、コラーゲンスポンジ（特許文献２）が知られている。コラーゲンスポンジは生体適合性が良いなどの特徴を有するものの、湿潤環境維持に乏しく、細菌に感染しやすい、細菌が増殖しやすい、滲出液により劣化する、及び材料が入手困難である等の問題がある。
また、従来の創傷治癒剤を用いた場合、肉芽組織が形成されても、その後肉芽組織の線維化が進まず、不良肉芽や過剰肉芽となる場合がある。また、肉芽組織の線維化を促進させる剤は知られていない。
また、ガーゼ、脱脂綿及び軟膏等に代わり、適度な湿潤環境を維持するために、カルボキシメチルセルロース（ＣＭＣ）ゲル（特許文献１）等の湿潤環境維持を目的とした創傷被覆材が用いられる場合がある。しかしながら、ＣＭＣゲルは滲出液等によりゲル構造を保持することが難しく、創傷部から脱離したり、菌感染の温床になる問題がある。
一方で、湿潤環境を保つだけでなく、肉芽組織形成や上皮化を促進する創傷治癒剤として、コラーゲンスポンジ（特許文献２）が知られている。コラーゲンスポンジは生体適合性が良いなどの特徴を有するものの、湿潤環境維持に乏しく、細菌に感染しやすい、細菌が増殖しやすい、滲出液により劣化する、及び材料が入手困難である等の問題がある。
また、従来の創傷治癒剤を用いた場合、肉芽組織が形成されても、その後肉芽組織の線維化が進まず、不良肉芽や過剰肉芽となる場合がある。また、肉芽組織の線維化を促進させる剤は知られていない。
本発明は、菌増殖を抑制し、かつ肉芽組織形成や上皮化を促進し、さらに肉芽組織の線維化を促進する創傷治癒剤を提供することを目的とする。
本発明の創傷治癒剤は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が２５〜６０％であり、創傷治癒剤の下記複素せん断弾性率が１×１０4〜１×１０8Ｐａである創傷治癒剤である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
複素せん断弾性率：創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測し、複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
複素せん断弾性率：創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測し、複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値。
本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制作用があり、肉芽組織形成や上皮化促進作用に優れ、肉芽組織の線維化促進作用に優れているという効果を奏する。
本発明において、タンパク質（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、タンパク質（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
本発明の創傷治癒剤は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水とを含む創傷治癒剤であって、（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が２５〜６０％であり、創傷治癒剤の下記複素せん断弾性率が１×１０4〜１×１０8Ｐａである創傷治癒剤である。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
複素せん断弾性率：創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測し、複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値。
本発明において、βシート構造率が上記範囲であることで、タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）が効率よく細胞と相互作用し、肉芽組織形成作用や上皮化促進作用に優れる。さらに、長期的にゲル構造を保持することができる。また、創傷治癒剤の複素せん断弾性率が上記範囲であることで、形成された肉芽組織の線維化促進作用に優れる。また、本発明の創傷治癒剤は、時間の経過及び熱等の刺激を加える等によりゲル化するので、創傷に適用した際にゲル化し、創傷部を密閉することができ、菌の増殖を抑制することができる。また、ゲル化物は、湿潤環境を維持し、細胞の増殖を促すことができる。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
複素せん断弾性率：創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測し、複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値。
本発明において、βシート構造率が上記範囲であることで、タンパク質（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）が効率よく細胞と相互作用し、肉芽組織形成作用や上皮化促進作用に優れる。さらに、長期的にゲル構造を保持することができる。また、創傷治癒剤の複素せん断弾性率が上記範囲であることで、形成された肉芽組織の線維化促進作用に優れる。また、本発明の創傷治癒剤は、時間の経過及び熱等の刺激を加える等によりゲル化するので、創傷に適用した際にゲル化し、創傷部を密閉することができ、菌の増殖を抑制することができる。また、ゲル化物は、湿潤環境を維持し、細胞の増殖を促すことができる。
本発明のタンパク質（Ａ）は、（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が２５〜６０％であるタンパク質である。タンパク質の配列が同じでも、タンパク質の作製方法、タンパク質の精製方法、タンパク質を溶解させる溶媒のｐＨ及び溶媒の極性等によりβシート構造率は異なる。
βシート構造率は、ゲル化能維持の観点から、２５．５〜６０％が好ましく、さらに好ましくは３０〜６０％、特に好ましくは３５〜６０％である。
βシート構造率は、（Ａ）を硫安沈殿、限外濾過、アフィニティクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー等により、リフォールディングすることによって増加させることができる。また、変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率は、下記測定法によって測定する。
βシート構造率は、ゲル化能維持の観点から、２５．５〜６０％が好ましく、さらに好ましくは３０〜６０％、特に好ましくは３５〜６０％である。
βシート構造率は、（Ａ）を硫安沈殿、限外濾過、アフィニティクロマトグラフィー及び陰イオン交換クロマトグラフィー等により、リフォールディングすることによって増加させることができる。また、変性剤や熱等で変性させることによって低下させることができる。
（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率は、下記測定法によって測定する。
＜βシート構造率の測定方法＞
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製した（Ａ）の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０型：日本分光株式会社製）にてβシート構造率を算出する。
タンパク質を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質の水溶液を作製する。作製した（Ａ）の水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光株式会社製、「Ｊ−８２０」）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０型：日本分光株式会社製）にてβシート構造率を算出する。
タンパク質（Ａ）は、１分子中にアミノ酸配列（Ｘ）又は（Ｘ’）を少なくとも１個有していればよいが、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、（Ａ）中のアミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（質量％）は、（Ａ）の分子質量を基準として３５〜９５質量％が好ましく、さらに好ましくは５０〜９０質量％である。
また、タンパク質（Ａ）１分子中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の含有量（質量％）は、βシート構造率を適度にする観点から、（Ａ）の分子質量を基準として、５〜６５質量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜５０質量％である。
また、タンパク質（Ａ）１分子中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の含有量（質量％）は、βシート構造率を適度にする観点から、（Ａ）の分子質量を基準として、５〜６５質量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜５０質量％である。
タンパク質（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の含有量と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の含有量と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の含有量（質量％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の分子質量｝×｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数｝］／｛（Ａ）の分子質量｝×１００
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（質量％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛（Ａ）の分子質量｝×１００
＜ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の含有量と、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量の測定法＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法から２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の含有量（質量％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の分子質量｝×｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数｝］／｛（Ａ）の分子質量｝×１００
アミノ酸配列（Ｘ）及びアミノ酸配列（Ｘ’）の合計含有量（質量％）＝［｛アミノ酸配列（Ｘ）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ）の数｝＋｛アミノ酸配列（Ｘ’）の分子質量｝×｛アミノ酸配列（Ｘ’）の数｝］／｛（Ａ）の分子質量｝×１００
タンパク質（Ａ）において、全アミノ酸数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める割合［｛（Ａ）中のＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／（Ａ）の全アミノ酸数×１００］は、βシート構造率を適度にする観点から、５〜５５％が好ましく、さらに好ましくは１０〜５５％であり、特に好ましくは２０〜５５％である。
タンパク質（Ａ）における全アミノ酸数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
タンパク質（Ａ）における全アミノ酸数のうちＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求める。
＜ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が占める割合＞
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
特定のアミノ酸残基で切断出来る切断方法の２種類以上を用いて、タンパク質（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）にて分離した後、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、タンパク質（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の測定式にてＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の占める割合（％）＝［｛ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数×６｝／｛（Ａ）中の全アミノ酸の数｝×１００
タンパク質（Ａ）は、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するが、βシート構造率を適度にする観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、βシート構造率を適度にする観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。
ポリペプチド鎖（Ｓ）において、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が連続する個数は、βシート構造率を適度にする観点から、２〜１００個が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個であり、特に好ましくは２〜１０個である。
本発明において、タンパク質（Ａ）は、アミノ酸配列（Ｘ）を少なくとも１個及び／又はアミノ酸配列（Ｘ’）を少なくとも１個有するものである。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ）としては、細胞との相互作用のしやすさ（細胞親和性）及び（Ａ）がゲル化する観点から、ＶＰＧＶＧ配列（２）及び／又はＧＶＧＶＰ配列（３）が好ましい。
アミノ酸配列（Ｘ’）として、具体的には、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）、ＧＫＧＲＰ配列（９）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）等が挙げられる。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、細胞親和性及び（Ａ）がゲル化する観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。
アミノ酸配列（Ｘ’）は、細胞親和性及び（Ａ）がゲル化する観点から、ＧＫＧＶＰ配列（７）、ＧＫＧＫＰ配列（８）及びＧＲＧＲＰ配列（１０）からなる群より選ばれる少なくとも１種の配列が好ましく、さらに好ましくはＧＫＧＶＰ配列（７）及び／又はＧＫＧＫＰ配列（８）である。
タンパク質（Ａ）は、細胞親和性及び（Ａ）がゲル化する観点から、アミノ酸配列（Ｘ）の１種が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は下記ポリペプチド鎖（Ｙ’）を有することが好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）において、（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）：（Ｙ）において、（Ｙ）中の全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖。
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、具体的には、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列である。（なお、ｂ〜ｄは、それぞれ、アミノ酸配列（Ｘ）の連続する個数であり、２〜２００の整数である）。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、細胞親和性、（Ａ）がゲル化する及びβシート構造率を適度にする観点から、（ＶＰＧＶＧ）b配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）c配列が好ましい。
タンパク質（Ａ）１分子中に、ポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、（ＶＰＧＶＧ）b配列、（ＧＶＧＶＰ）c配列及び（ＧＡＨＧＰＡＧＰＫ）d配列からなる群から選ばれる１種を有してもよく、２種以上を有してもいい。
また、タンパク質（Ａ）中にポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有する場合は、上記（Ｘ）の連続する個数は、（Ｙ）ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、（Ｘ）の連続する個数ｂ〜ｄが同じポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよく、ｂ〜ｄが異なるポリペプチド鎖（Ｙ）を複数有してもよい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）としては、細胞親和性、（Ａ）がゲル化する及びβシート構造率を適度にする観点から、（ＶＰＧＶＧ）b配列及び／又は（ＧＶＧＶＰ）c配列が好ましい。
ポリペプチド鎖（Ｙ）は、アミノ酸配列（Ｘ）が２〜２００個連続した（上記ｂ〜ｄが２〜２００）ポリペプチド鎖であるが、細胞親和性、（Ａ）がゲル化する及びβシート構造率を適度にする観点から、連続する個数は２〜１００個（上記ｂ〜ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０個（上記ｂ〜ｄが２〜５０）、特に好ましくは２〜４０個（ｂ〜ｄが２〜４０個）である。
また、ポリペプチド鎖（Ｙ’）は、（Ｙ）における全アミノ酸数の０．１〜２０％のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたポリペプチド鎖であり、具体的には、アミノ酸配列（Ｘ）が連続したポリペプチド鎖（Ｙ）において、アミノ酸配列（Ｘ）の一部又は全部がアミノ酸配列（Ｘ’）に置き換わったポリペプチド鎖が含まれる。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、（Ｙ）中の全アミノ酸数のうちリシン又はアルギニンで置換された合計割合は、（Ａ）の水への溶解性、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）において、（Ｙ）中の全アミノ酸数のうちリシン又はアルギニンで置換された合計割合は、（Ａ）の水への溶解性、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、０．５〜１０％が好ましく、さらに好ましくは１〜５％である。
ポリペプチド鎖（Ｙ’）であるかどうかは、タンパク質（Ａ）の配列中の全てのＫ及びＲを、他のアミノ酸（Ｇ、Ａ、Ｖ、Ｐ又はＨ）に置きかえたときに、ポリペプチド鎖（Ｙ）となるかによって判断する。
タンパク質（Ａ）中の（Ｙ）と（Ｙ’）との合計個数は、（Ａ）の水への溶解性、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜８０個であり、特に好ましくは１〜６０個である。
タンパク質（Ａ）中に、（Ｘ）の種類及び／又は連続する個数が異なる（Ｙ）を有している場合は、それぞれを１個として数え、（Ｙ）の個数はその合計である。（Ｙ’）も同様である。
タンパク質（Ａ）が、ポリペプチド鎖（Ｙ）、ポリペプチド鎖（Ｙ’）、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）及びポリペプチド鎖（Ｓ）を合計２個以上有する場合は、ポリペプチド鎖とポリペプチド鎖との間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。（Ｚ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）では無いペプチド配列である。（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。（Ｚ）として、具体的には、ＶＡＡＧＹ配列（１１）、ＧＡＡＧＹ配列（１２）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
（Ａ）中の（Ｚ）の含有量（質量％）は、（Ａ）の分子質量を基準として、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、０〜２０質量％が好ましく、さらに好ましくは０〜１０質量％である。
（Ａ）中の（Ｚ）の含有量（質量％）は、（Ａ）の分子質量を基準として、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、０〜２０質量％が好ましく、さらに好ましくは０〜１０質量％である。
（Ａ）は、ＧＡＧＡＧＳ、（Ｘ）、（Ｘ’）、（Ｚ）以外にも、両末端に末端アミノ酸配列（Ｔ）を有していてもよい。（Ａ）の両末端の構造が、（Ｙ）に（Ｔ）が結合した構造であることが好ましい。（Ｔ）は、アミノ酸が１個又は２個以上結合したペプチド配列であって、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）では無いペプチド配列である。（Ｔ）を構成するアミノ酸の数は、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。（Ｔ）として、具体的には、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１３）等が挙げられる。
（Ａ）中の（Ｔ）の含有量（質量％）は、（Ａ）の分子質量を基準として、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、０〜１０質量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５質量％である。
（Ａ）中の（Ｔ）の含有量（質量％）は、（Ａ）の分子質量を基準として、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、０〜１０質量％が好ましく、さらに好ましくは０〜５質量％である。
タンパク質（Ａ）は、上記（Ｔ）以外に、発現させた（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、（Ａ）のＮ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９TM、ＣｒｕｚＴａｇ２２TM、ＣｒｕｚＴａｇ４１TM、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるタンパク質（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
タンパク質（Ａ）において、ポリペプチド鎖（Ｙ）及び／又は（Ｙ’）並びにＧＡＧＡＧＳ配列（１）及び／又はポリペプチド鎖（Ｓ）を含む場合、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、ポリペプチド鎖（Ｙ）又は（Ｙ’）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）又はポリペプチド鎖（Ｓ）とが交互に化学結合していることが好ましい。
また、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と、アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）の数との比［配列（１）：｛（Ｘ）及び（Ｘ’）｝］は、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、１：１〜１：１２が好ましく、さらに好ましくは１：１〜１：６であり、次にさらに好ましくは１：１〜１：４である。
また、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）の数と、アミノ酸配列（Ｘ）及び（Ｘ’）の数との比［配列（１）：｛（Ｘ）及び（Ｘ’）｝］は、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、１：１〜１：１２が好ましく、さらに好ましくは１：１〜１：６であり、次にさらに好ましくは１：１〜１：４である。
タンパク質（Ａ）のＳＤＳ−ＰＡＧＥ（ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動）法による分子質量は、細胞親和性及びβシート構造率を適度にする観点から、１５〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは３０〜１５０ｋＤａであり、特に好ましくは４０〜１２０ｋＤａである。
好ましいタンパク質（Ａ）の一部を以下に例示する。
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１４）が化学結合した分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１４）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
（Ａ１）アミノ酸配列（Ｘ）がＧＶＧＶＰ配列（３）であるタンパク質
（Ａ１１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）中のアミノ酸がＫ（リシン）で置換されたポリペプチド鎖（Ｙ’１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
（Ａ１１−１）ＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１１）の１個のアミノ酸がＫで置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）（Ｙ’１１）と、ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）を有するタンパク質
（Ａ１１−１−１）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）と（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１４）が化学結合した分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のタンパク質（ＳＥＬＰ８Ｋ）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）2配列（１４）及び（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）をそれぞれ１７個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約８２ｋＤａの配列（１５）のタンパク質（ＳＥＬＰ０Ｋ）
（Ａ１２）ＧＶＧＶＰ配列（３）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ１）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｓ１）とを有するタンパク質
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）8配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）8配列（１７）をそれぞれ１２個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約９０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（ＳＥＬＰ３）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）8配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）40配列（１９）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）
（ｉｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）6配列（２１）及び（ＧＶＧＶＰ）2配列（２２）をそれぞれ２９個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１２０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＬＰ４．１）
具体的には、下記タンパク質が含まれる。
（ｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）8配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）8配列（１７）をそれぞれ１２個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約９０ｋＤａの配列（１８）のタンパク質（ＳＥＬＰ３）
（ｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）8配列（１６）及び（ＧＶＧＶＰ）40配列（１９）をそれぞれ５個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１１０ｋＤａの配列（２０）のタンパク質（ＳＥＬＰ６．１）
（ｉｉｉ）（ＧＡＧＡＧＳ）6配列（２１）及び（ＧＶＧＶＰ）2配列（２２）をそれぞれ２９個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約１２０ｋＤａの配列（２３）のタンパク質（ＳＬＰ４．１）
（Ａ２）アミノ酸配列（Ｘ）がＶＰＧＶＧ配列（２）であるタンパク質
（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、（ＶＰＧＶＧ）4配列（２４）及び（ＶＰＧＶＧ）8配列（２５）をそれぞれ４０個有し、これらが配列（２４）、配列（１）、配列（２５）の順に結合したブロックが４０個化学結合してなる構造を有する分子質量約２００ｋＤａの配列（２６）のタンパク質（ＥＬＰ１．１）
（Ａ２１）ＶＰＧＶＧ配列（２）が２〜２００個連続したポリペプチド鎖（Ｙ２）とＧＡＧＡＧＳ配列（１）を有するタンパク質
（ｉ）ＧＡＧＡＧＳ配列（１）、（ＶＰＧＶＧ）4配列（２４）及び（ＶＰＧＶＧ）8配列（２５）をそれぞれ４０個有し、これらが配列（２４）、配列（１）、配列（２５）の順に結合したブロックが４０個化学結合してなる構造を有する分子質量約２００ｋＤａの配列（２６）のタンパク質（ＥＬＰ１．１）
本発明の創傷治癒剤は、上記タンパク質（Ａ）及び水を含むものである。
創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の含有量（重量％）は、（Ａ）の水への溶解性、（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５〜４０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０重量％、特に好ましくは１５〜４０重量％である。
創傷治癒剤中の水の含有量（重量％）は、（Ａ）の水への溶解性、（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、６０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは６０〜９０重量％であり、特に好ましくは６０〜８５重量％である。
創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の含有量（重量％）は、（Ａ）の水への溶解性、（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、５〜４０重量％が好ましく、さらに好ましくは１０〜４０重量％、特に好ましくは１５〜４０重量％である。
創傷治癒剤中の水の含有量（重量％）は、（Ａ）の水への溶解性、（Ａ）がゲル化する観点及び創傷への適用のしやすさの観点から、創傷治癒剤の重量を基準として、６０〜９５重量％が好ましく、さらに好ましくは６０〜９０重量％であり、特に好ましくは６０〜８５重量％である。
創傷治癒剤中の水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではない。滅菌方法としては、０．２μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌した脱イオン水等が挙げられる。
本発明の創傷治癒剤は、タンパク質（Ａ）及び水以外に無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩として、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と浸透圧を同等にする観点及び複素せん断弾性率を適度にするという観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．４〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．２重量％、特に好ましくは０．６〜１．１重量％である。
創傷治癒剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と浸透圧を同等にする観点及び複素せん断弾性率を適度にするという観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．４〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．５〜１．２重量％、特に好ましくは０．６〜１．１重量％である。
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
創傷治癒剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、創傷治癒の観点から、創傷治癒剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
創傷治癒剤のｐＨは、（Ａ）の安定性及び創傷治癒の観点から、５〜９が好ましく、さらに好ましくは６〜８．５である。
この範囲であれば、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）が変性することなく、βシート構造率を維持でき、創傷治癒剤を用いて菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進し、拘縮抑制をすることができる。
この範囲であれば、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）が変性することなく、βシート構造率を維持でき、創傷治癒剤を用いて菌増殖を抑制し、肉芽組織形成や上皮化を促進し、拘縮抑制をすることができる。
本発明の創傷治癒剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。１例を下記に示す。
（１）本発明のタンパク質（Ａ）及び水を４〜２５℃で混合し、創傷治癒剤とする。水中には必要により塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。また、タンパク質（Ａ）を水に溶解させた後、必要により塩及び／又はリン酸（塩）を含むようにしてもよい。
（１）本発明のタンパク質（Ａ）及び水を４〜２５℃で混合し、創傷治癒剤とする。水中には必要により塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。また、タンパク質（Ａ）を水に溶解させた後、必要により塩及び／又はリン酸（塩）を含むようにしてもよい。
本発明の創傷治癒剤の下記複素せん断弾性率は１×１０4〜１×１０8Ｐａであるが、菌増殖抑制、皮膚への追随性の観点から、１×１０5〜１×１０7Ｐａが好ましく、さらに好ましくは５×１０5〜５×１０6Ｐａである。
複素せん断弾性率は、（Ａ）を溶解させる溶媒のイオン強度を高く（無機塩濃度を高く）したり、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の濃度を上昇させることで大きくすることができる。
複素せん断弾性率：創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測し、複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値。
複素せん断弾性率は下記測定法により求めることができる。
複素せん断弾性率は、（Ａ）を溶解させる溶媒のイオン強度を高く（無機塩濃度を高く）したり、創傷治癒剤中のタンパク質（Ａ）の濃度を上昇させることで大きくすることができる。
複素せん断弾性率：創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測し、複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値。
複素せん断弾性率は下記測定法により求めることができる。
＜複素せん断弾性率の測定方法＞
創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（ティー・エイ・インスツルメント社製、回転数：１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測する。複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値を複素せん断弾性率とする。
創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（ティー・エイ・インスツルメント社製、回転数：１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測する。複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値を複素せん断弾性率とする。
創傷治癒剤の患部への適用方法としては、菌増殖抑制、肉芽組織形成、上皮化促進及び拘縮抑制の観点から、患部の欠損部分を埋めるように注入することが好ましい。
患部への適用方法の一例を示す。
（１）患部に創傷治癒剤を投与する。
（２）投与後、創傷治癒剤が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。
患部への適用方法の一例を示す。
（１）患部に創傷治癒剤を投与する。
（２）投与後、創傷治癒剤が患部から流出しないように、適当なドレッシングで被覆する。
上記（２）で使用するドレッシングの材質としては、特に限定されないが、ポリウレタン、シリコーン、ポリビニルアルコール、ポリプロピレン、ポリエステル、ポリスチレン、ポリエチレン、エチレン酢酸ビニル共重合体及びナイロン等が挙げられる。
ドレッシングの形状としては、創傷治癒剤を投与後に、創傷治癒剤が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。
ドレッシングの形状としては、創傷治癒剤を投与後に、創傷治癒剤が患部から流出しないように被覆できれば制限なく使用できるが、フィルム状が好ましい。
本発明の創傷治癒剤は、菌増殖抑制の観点から、タンパク質（Ａ）及び水等を混合した直後は溶液状であるが、時間の経過、熱等の刺激を加える等により流動性が低くなりゲル化することが好ましい。
創傷治癒剤をゲル化させる温度は、創傷治癒剤を短時間でゲル化させる観点から、創傷治癒剤を２５℃〜８０℃が好ましい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
また、創傷治癒剤を使用する場合、適用時の創傷治癒剤の温度は、タンパク質（Ａ）の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃、次にさらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
創傷治癒剤をゲル化させる温度は、創傷治癒剤を短時間でゲル化させる観点から、創傷治癒剤を２５℃〜８０℃が好ましい。８０℃以下であると、組織再生用材料の機能を低下させずにゲル化させることができ、また、ゲル化までの時間が適度である。
また、創傷治癒剤を使用する場合、適用時の創傷治癒剤の温度は、タンパク質（Ａ）の熱安定性及びハンドリング性の観点から、４〜８０℃が好ましく、さらに好ましくは４〜６０℃、次にさらに好ましくは２５〜５０℃、特に好ましくは３０〜４０℃である。
以下に実施例として本発明を更に詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り部は重量部を意味する。
＜製造例１＞
［タンパク質（Ａ１−１）の作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、配列（２７）のタンパク質（Ａ）であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。
［タンパク質（Ａ１−１）の作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の生産
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、配列（２７）のタンパク質（Ａ）であるＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）を生産する方法を示す。
○ＳＥＬＰ８Ｋタンパク質（Ａ１）の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液が濁度ＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、４０ｍｌを４２℃に前もって温めたフラスコに移し、同じ温度で約２時間培養した。培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
○タンパク質（Ａ１−１）の精製
集菌した大腸菌を、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥を行うことにより大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のタンパク質（Ａ）である精製したタンパク質（Ａ１−１）を得た。
集菌した大腸菌を、下記１：菌体溶解、２：遠心分離による不溶性細片の除去、３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー、６：限外濾過、７：凍結乾燥を行うことにより大腸菌バイオマスから精製した。このようにして、分子質量が約８０ｋＤａの配列（２７）のタンパク質（Ａ）である精製したタンパク質（Ａ１−１）を得た。
１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
３：硫安沈殿
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。溶解した液に対して、同様に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
４：限外濾過
３で得た溶液を分子質量３０,０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
３で得た溶液を分子質量３０,０００カットの限外濾過装置（ホロファーバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。３で得た溶液に対して、１０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のタンパク質を得た。
５：陰イオン交換クロマトグラフィー
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ １０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
限外濾過後のタンパク質を１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に溶解して２０ｇ／Ｌとし、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ １０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
６：限外濾過
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
５で得た溶液を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のタンパク質を得た。
７：凍結乾燥
タンパク質を脱イオン水に溶解して１０ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、８時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、７０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、１０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したタンパク質（Ａ１−１）を得た。
タンパク質を脱イオン水に溶解して１０ｇ／Ｌとし、水位が１５ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れる。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−４０℃、８時間かけて凍結させる。凍結後、真空度が８Ｐａ以下、−２０℃で、７０時間かけて１次乾燥、真空度が８Ｐａ以下、１０℃で、２４時間かけて２次乾燥させ、精製したタンパク質（Ａ１−１）を得た。
○タンパク質（Ａ１−１）の同定
得られたタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対する抗ラビット６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロットにより分析した。見かけ分子質量８０ｋＤａのタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ分析供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７重量％），アラニン（１２．３重量％），セリン（５．３重量％），プロリン（１１．７重量％）及びバリン（２１．２重量％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５重量％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、タンパク質（Ａ１−１）はＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）であり、（Ｙ）中のＶのうち１個がＫに置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（２７）のタンパク質であることを確認した。
得られたタンパク質（Ａ１−１）を下記の手順で同定した。
抗ラビットＳＥＬＰ８Ｋ抗体及びＣ末端配列の６×Ｈｉｓタグに対する抗ラビット６×Ｈｉｓ抗体（Ｒｏｌａｎｄ社製）を用いたウエスタンブロットにより分析した。見かけ分子質量８０ｋＤａのタンパク質バンドが、各抗体に抗体反応性を示した。また得られたタンパク質をアミノ分析供した結果、該生成物が、グリシン（４３．７重量％），アラニン（１２．３重量％），セリン（５．３重量％），プロリン（１１．７重量％）及びバリン（２１．２重量％）に富むものであった。また、該生成物はリシンを１．５重量％含んでいた。下記の表１は、精製された生成物の組成と、合成遺伝子配列から推測された予測理論組成との相関関係を示す。
したがって、タンパク質（Ａ１−１）はＧＶＧＶＰ配列（３）が８個連続したポリペプチド鎖（Ｙ）であり、（Ｙ）中のＶのうち１個がＫに置換された（ＧＶＧＶＰ）4ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）3配列（６）のポリペプチド鎖（Ｙ’１１）を１３個及びＧＡＧＡＧＳ配列（１）が４個連続した（ＧＡＧＡＧＳ）4配列（５）のポリペプチド鎖（Ｙ１１）を１２個有し、これらが交互に化学結合してなる配列（２７）のタンパク質であることを確認した。
＜ウエスタンブロット法＞
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６重量％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３重量％ ブロモフェノールブルー、及び３０重量％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５重量％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、分解吸収され、無くなったと判断した。
ウエスタンブロット用サンプル２０μＬに３×ＳＤＳ処理バッファ（１５０ｍＭ Ｔｒｉｓ ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、３００ｍＭ ジチオスレイトール、６重量％ ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、０．３重量％ ブロモフェノールブルー、及び３０重量％ グリセロールを含む）１０μＬを添加して９５℃５分間加温し、泳動用試料を調製した。この泳動用試料１５μＬを用いてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。泳動後のゲルをＰＶＤＦメンブレンにトランスファーし、これをブロッキングバッファ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０、及び５重量％ スキムミルクを含む）に浸漬して１時間室温で振蕩することによりメンブレンのブロッキング処理を行った。ブロッキング処理後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔ（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ（ｐＨ７．６）、１３７ｍＭ ＮａＣｌ、及び０．１重量％ Ｔｗｅｅｎ２０を含む）で２分間洗浄した。次に、メンブレンを一次抗体溶液（一次抗体：抗Ｈｉｓ−ｔａｇ抗体（Ｒｏｃｋｌａｎｄ社製）をＴＢＳ−Ｔで５００分の１に希釈した溶液）に浸漬し、４℃で一晩静置して抗体反応を行った。反応後、このメンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、一次抗体に結合可能であり且つ標識酵素として西洋ワサビペルオキシダーゼを結合させた二次抗体の溶液（二次抗体：ＥＣＬ ａｎｔｉ−ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ＨＲＰ ｌｉｎｋｅｄ Ｆ（ａｂ’）２ ｆｒａｇｍｅｎｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）をＴＢＳ−Ｔで２０００分の１に希釈した溶液）にメンブレンを浸漬し、３０分間室温で静置して抗体反応を行った。反応後、メンブレンをＴＢＳ−Ｔで５分間、４回洗浄した後、ＥＣＬ−Ａｄｖａｎｃｅ Ｗｅｓｔｅｒｎ Ｂｌｏｔｔｉｎｇ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＧＥヘルスケアバイオサイエンス社製）により酵素反応を行った。ルミノメーターＦｏｒＥＣＬ（アマシャム社製）を用いて、高感度インスタント黒白フィルム（富士フイルム株式会社製）に感光させ、バンドを可視化した。肉眼でバンドが確認できない場合、分解吸収され、無くなったと判断した。
○βシート構造率の測定
得られたタンパク質（Ａ１−１）について、下記手順でβシート構造率を測定した。
タンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０：日本分光株式会社製）にてβシート構造率を算出した。結果を表２に示す。
得られたタンパク質（Ａ１−１）について、下記手順でβシート構造率を測定した。
タンパク質（Ａ１−１）を０．３ｍｇ／ｍｌとなるように脱イオン水（４℃）に溶解し、タンパク質（Ａ１−１）水溶液を作製した。作製したタンパク質（Ａ１−１）水溶液を円二色性スペクトル測定器（日本分光：Ｊ−８２０）にて測定し（測定温度：４℃）、二次構造解析プログラム（ＪＷＳＳＥ型−４８０：日本分光株式会社製）にてβシート構造率を算出した。結果を表２に示す。
＜製造例２＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「タンパク質（Ａ１−１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１−２）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計５回繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
製造例１の「タンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「タンパク質（Ａ１−１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」と「６：限外濾過」との間に、下記「５−２：リフォールディング（大希釈法）」を行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１−２）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。
５−２：リフォールディング（大希釈法）
陰イオン交換クロマトグラフィーの溶出画分をタンパク質変性剤である１０Ｍウレア溶液にて、６Ｍウレア溶液となるように調製し、１２時間、４℃で静置した。調製した溶液を透析膜（Ｖｉｓｋａｓｅ Ｃｏｍｐａｎｉｅｓ，Ｉｎｃ．社製）に投入し、溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。その後、脱イオン水を捨て、新たに溶出画分の１０倍容量の脱イオン水にて１２時間、透析した。この操作を残り３回、計５回繰り返した後、透析膜中の溶液を回収した。
＜比較製造例１＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「タンパク質（Ａ１−１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、タンパク質（Ａ１−３）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。
製造例１の「タンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「タンパク質（Ａ１−１）の精製」の「５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施しない以外は同様にして、タンパク質（Ａ１−３）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。
＜比較製造２＞
製造例１の「タンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「タンパク質（Ａ１−１）の精製」の「３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施せず、上記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１−４）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。
５’：アフィニティクロマトグラフィー
「２：遠心分離による不溶性細片の除去」後のタンパク質（Ａ１−１）を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。
製造例１の「タンパク質（Ａ１−１）の作製」において、「タンパク質（Ａ１−１）の精製」の「３：硫安沈殿、４：限外濾過、５：陰イオン交換クロマトグラフィー」を実施せず、上記「５’：アフィニティクロマトグラフィー」行う以外は同様にして、タンパク質（Ａ１−４）を作製し、βシート構造率を測定した。結果を表２に示す。
５’：アフィニティクロマトグラフィー
「２：遠心分離による不溶性細片の除去」後のタンパク質（Ａ１−１）を、Ｈｉｓ−ｔａｇを用いたアフィニティクロマトグラフィー（クロンテック社製、ＴＡＬＯＮ（登録商標）Ｓｉｎｇｌｅ Ｓｔｅｐ Ｃｏｌｕｍｎｓ）にて精製し、溶出画分を回収した。
＜実施例１＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１）を作製した。
＜実施例２＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：１３ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（２）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：１３ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（２）を作製した。
＜実施例３＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：４．８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（３）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：４．８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（３）を作製した。
＜実施例４＞
タンパク質（Ａ１−２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（４）を作製した。
タンパク質（Ａ１−２）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（４）を作製した。
＜実施例５＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、３０重量％となるように調整した創傷治癒剤（５）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、３０重量％となるように調整した創傷治癒剤（５）を作製した。
＜実施例６＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、４０重量％となるように調整した創傷治癒剤（６）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、４０重量％となるように調整した創傷治癒剤（６）を作製した。
＜実施例７＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、１５重量％となるように調整した創傷治癒剤（７）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、１５重量％となるように調整した創傷治癒剤（７）を作製した。
＜比較例１＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：２１．３ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（８）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：２１．３ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（８）を作製した。
＜比較例２＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：０．８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（９）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：０．８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（９）を作製した。
＜比較例３＞
タンパク質（Ａ１−３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１０）を作製した。
タンパク質（Ａ１−３）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１０）を作製した。
＜比較例４＞
タンパク質（Ａ１−４）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：０．８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１１）を作製した。
タンパク質（Ａ１−４）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：０．８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１１）を作製した。
＜比較例５＞
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、１０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１２）を作製した。
タンパク質（Ａ１−１）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、１０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１２）を作製した。
＜比較例６＞
タンパク質（Ａ１−４）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１３）を作製した。
タンパク質（Ａ１−４）を、２０ｍＭリン酸緩衝液（ＮａＣｌ：８ｇ／Ｌ、ＫＣｌ：０．２ｇ／Ｌ、ｐＨ７．４）に溶解し、２０重量％となるように調整した創傷治癒剤（１３）を作製した。
○複素せん断弾性率の測定
創傷治癒剤（１）〜（１３）を３７℃で７５時間、レオメーター（ティー・エイ・インスツルメント社製、回転数：１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測した。複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値を複素せん断弾性率とした。
創傷治癒剤（１）〜（１３）を３７℃で７５時間、レオメーター（ティー・エイ・インスツルメント社製、回転数：１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測した。複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値を複素せん断弾性率とした。
＜評価１＞
（タンパク質（Ａ）のゲル化能評価）
創傷治癒剤（１）〜（１３）を３７℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。ゲル化をしたかどうかの確認は、創傷治癒剤（１００μＬ）が入ったプラスティックチューブ容器（エッペンドルフチューブ、１．５ｍＬ）を５分毎に転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合もしくはゲル化するまでに３００分を超える場合はゲル化しないと判断した。結果を表２に示す。
（タンパク質（Ａ）のゲル化能評価）
創傷治癒剤（１）〜（１３）を３７℃で静置し、ゲル化するまでの時間を測定した。ゲル化をしたかどうかの確認は、創傷治癒剤（１００μＬ）が入ったプラスティックチューブ容器（エッペンドルフチューブ、１．５ｍＬ）を５分毎に転倒し、溶液が垂れない場合はゲル化しているとし、溶液が垂れる場合もしくはゲル化するまでに３００分を超える場合はゲル化しないと判断した。結果を表２に示す。
＜評価２＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１３）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１種類につき１１個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表２に示す。
なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表２に示す。
なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの治療試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、創傷治癒剤（１）〜（１３）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間５、１０日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、病理標本（ＨＥ染色）を作製した。それぞれの創傷治癒剤について、病理標本を１種類につき１１個作製した。
作製した治療期間５日目の病理標本用いて、パニキュラス（筋様膜）からの肉芽組織高をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表２に示す。
なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
また、治療期間１０日目の病理標本用いて、正常組織から伸長した上皮化長をマイクロルーラーを使用して測定した。評価結果は表２に示す。
なお、評価結果は、病理標本１１個の平均値である。
＜評価３＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの菌増殖抑制試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、緑膿菌１０6個／１創傷部となるように播種し、創傷治癒剤（１）〜（１３）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、細菌コロニー法にて細菌数を測定した。評価結果は表２に示す。
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの菌増殖抑制試験）
健常モルモット♀ ｓｔｄ Ｈａｒｔｌｅｙ（日本エスエルシー社製）７週齢を麻酔下で除毛し、消毒したモルモット背部皮膚に脂肪層が完全に露出した創面１０×１０ｍｍの全層皮膚欠損創を作製し、止血、乾燥した後、緑膿菌１０6個／１創傷部となるように播種し、創傷治癒剤（１）〜（１３）を各々、注入し、ポリウレタンフィルムを貼付した。その後、各創傷部の上にガーゼをのせて、ナイロン糸で創傷部周囲と固定した。治療期間３日目に検体を擬死させ、創傷部を含む皮膚を採取し、細菌コロニー法にて細菌数を測定した。評価結果は表２に示す。
＜評価４＞
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの肉芽組織の線維化スコアリング試験）
評価２において、治療期間１４日目で検体を擬死させる以外は同様にして、それぞれの創傷治癒剤（１）〜（１３）について、病理標本を１種類につき１３個作製した。作製した病理標本について、形成された肉芽組織の中でも新生血管及び線維芽細胞に富み、膠原線維の再生を伴う部分（線維性肉芽組織）を、以下の５段階の評価基準で評価し、点数化した。結果を表２に示す。なお、評価結果は、病理標本１３個の平均値である。
１点：欠損部に対して全く肉芽組織が形成していない状態又は肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が０％
２点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が０％より大きく２５％未満
３点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が２５％以上５０％未満
４点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が５０％以上７５％未満
５点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が７５％以上
（健常モルモットを用いた全層欠損層モデルでの肉芽組織の線維化スコアリング試験）
評価２において、治療期間１４日目で検体を擬死させる以外は同様にして、それぞれの創傷治癒剤（１）〜（１３）について、病理標本を１種類につき１３個作製した。作製した病理標本について、形成された肉芽組織の中でも新生血管及び線維芽細胞に富み、膠原線維の再生を伴う部分（線維性肉芽組織）を、以下の５段階の評価基準で評価し、点数化した。結果を表２に示す。なお、評価結果は、病理標本１３個の平均値である。
１点：欠損部に対して全く肉芽組織が形成していない状態又は肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が０％
２点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が０％より大きく２５％未満
３点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が２５％以上５０％未満
４点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が５０％以上７５％未満
５点：肉芽組織が形成された部分の面積内、線維性肉芽組織が７５％以上
表２の結果から、本発明の創傷治癒剤は、肉芽組織形成、上皮化、菌増殖抑制及び線維化に優れた効果を発揮することが分かる。また、複素せん断弾性率は、線維化促進作用にとって非常に重要な因子であることが分かる。
本発明の創傷治癒剤は、肉芽組織形成、上皮化促進作用及び線維化促進作用に優れている。したがって、熱傷、採皮創、皮膚剥削創及び外傷性皮膚欠損創等の疾患ないし創傷による患部を治癒する創傷治癒剤として有効である。
Claims (2)
- ＧＡＧＡＧＳ配列（１）並びに下記アミノ酸配列（Ｘ）及び／又は下記アミノ酸配列（Ｘ’）を有するタンパク質（Ａ）と水と無機塩とを含む創傷治癒剤であって、無機塩の含有量が創傷治癒剤の重量に基づいて ０．４〜１．３重量％であり、タンパク質（Ａ）が配列表の配列番号２７のタンパク質であり、（Ａ）の円二色性スペクトル法によるβシート構造率が２５〜６０％であり、創傷治癒剤の下記複素せん断弾性率が１×１０４〜１×１０８Ｐａである創傷治癒剤。
アミノ酸配列（Ｘ）：ＶＰＧＶＧ配列（２）、ＧＶＧＶＰ配列（３）及びＧＡＨＧＰＡＧＰＫ配列（４）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列。
アミノ酸配列（Ｘ’）：アミノ酸配列（Ｘ）中の１〜２個のアミノ酸がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
複素せん断弾性率：創傷治癒剤を３７℃で７５時間、レオメーター（１０ｒｐｍ）にて複素せん断弾性率を測定し、１０分おきに値を観測し、複素せん断弾性率の変化量が１％以内になったときの値。 - 創傷治癒剤の重量を基準として、タンパク質（Ａ）が５〜４０重量％、水が６０〜９５重量％である請求項１に記載の創傷治癒剤。
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