JP2016183118A - 増殖因子前駆体のリフォールディング方法 - Google Patents
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Abstract
【解決の手段】 遺伝子組換え体の培養液から増殖因子前駆体のインクルージョンボディを調製し、アルギニン、ジメチルスルフォキシド及び還元型グルタチオンを含む緩衝液によってリフォールディングを行う。
【選択図】 図2
Description
(1)TGFβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体を微生物細胞内で不溶性発現させた後、アルギニン、ジメチルスルフォキシド、及び還元型グルタチオンを含む緩衝液によりリフォールディングすることを特徴とする細胞増殖因子前駆体の製造方法。
(2)TGFβスーパーファミリーに属する増殖因子の前駆体がTGFβである(1)に記載の製造方法。
(3)TGFβの前駆体がTGFβ3である(2)に記載の製造方法。
(4)前記緩衝液中のアルギニン濃度が0.1〜2M、ジメチルスルフォキシドが5〜60%(V/V)、還元型グルタチオンが0.002〜20mMであり、弱アルカリ性の緩衝液を用いる(1)〜(3)に記載の製造方法。
(5)弱アルカリ性の緩衝液がpH8.5〜10の緩衝液である(2)〜(4)に記載の製造方法。
本明細書においてproTGFβ3は、ヒトproTGFβ3のpro領域と成熟体領域を含むものであり、
(i)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも24番目のロイシンから412番目のセリンまでのアミノ酸残基を含むタンパク質や、
(ii)配列番号1に記載のアミノ酸配列のうち少なくとも24番目のロイシンから412番目のセリンまでのアミノ酸残基を含み、かつ前記アミノ酸残基のうちの一つ以上が他のアミノ酸残基に置換、挿入または欠失したタンパク質、があげられる。
(1)配列番号1のアミノ酸配列のうち、24番目のロイシンがメチオニンに置換され、25番目のセリンから412番目のセリンまでの領域をコードし、かつ5’末端付近に6塩基の余分配列とMscIサイトが付加され、3’末端にXhoIサイトと6塩基の余分配列が付加された配列番号2の塩基配列のDNAを化学合成した。
(2)(1)のDNAを制限酵素MscI(東洋紡)及びXhoI(タカラバイオ)で切断した後、キアゲン社製PCR精製キットを用いて、約1.2kbpのDNA溶液を50μlを得た。
(3)市販大腸菌用発現ベクターpET22b(+)を制限酵素MscI及びXhoIで切断した後、アルカリフォスファターゼ処理を行い(タカラバイオ)、キアゲン社製PCR精製キットを用いて、約5.5kbpのDNA溶液を50μlを得た。
(4)(2)と(3)で得たオリゴヌクレオチドを混合し、DNA Ligation kit(タカラバイオ社製)を用いてライゲーションし、これを用いて大腸菌JM109株(タカラバイオ社製)を形質転換した。
(5)得られた形質転換体を50μg/mLのカナマイシン(和光純薬社製)を含むLB培地にて培養後、QIAprep Spin Miniprep kit(キアゲン社製)を用いて、発現ベクターpETproTGFb3を抽出した。
(6)(5)で作製した発現ベクターpETproTGFb3の(2)のDNA挿入領域について、チェーンターミネータ法に基づくBig Dye Terminator Cycle Sequencing FS read Reaction kit(ライフテクノロジー社製)を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動DNAシークエンサーABI Prism 3700 DNA analyzer(ライフテクノロジー社製)にてヌクレオチド配列を解析した。なお当該解析の際、配列番号3(5’−TAATACGACTCACTATAGG−3’)または配列番号4(5’−GCTAGTTATTGCTCAGCGG−3’)に記載のオリゴヌクレオチドのいずれかをシークエンス用プライマーとして使用した。解析の結果設計通りであることを確認した。
(7)(5)で得られた発現ベクターpETproTGFb3で大腸菌Rosetta−gami2(DE3)のコンピテントセル(メルク社製)を形質転換し、発現菌株Rosetta−gami2(DE3)/pETproTGFb3を得た。
(1)実施例1で得た発現菌株Rosetta−gami2(DE3)/pETproTGFb3をアンピシリン(100μg/ml)、テトラサイクリン(20μg/ml)およびクロラムフェニコール(50μg/ml)を含む2YT培地(酵母エキス10g/L、バクトペプトン16g/L、NaCl 5g/L)3mlに植菌して、37℃で一晩培養した。
(2)(1)の培養液1mlを同じ培地100mlを入れた500ml容のフラスコ3本に植菌し、37℃で3時間培養した。ついで、培養温度を25℃に変更して、0.5M IPTG水溶液を0.2ml(終濃度1mM)加えて一晩培養した。
(3)培養液より、7,500rpm、30分の遠心分離によって菌体を回収し、8M塩酸グアニジンを含む0.1M リン酸ナトリウム緩衝液(pH8.0)に懸濁して、室温で1.5時間、マグネチックスターラーで攪拌して、インクルージョンボディを抽出した。次いで7,500rpm、30分の遠心分離によって上清を回収した。
(4)His−Trap−Resin(Novagen社)のカラム(ベッド容量30ml)を予め6M尿素、250mM NaCl、0.05%NP−40を含む−20mMトリス塩酸緩衝液(pH8.0)で平衡化し、(5)の上清を通液して、インクルージョンボディを吸着させた。このカラムをpH6.8に調整した同じ緩衝液で洗浄し、次いでpH4.2に調整した同じ緩衝液で溶出することにより精製されたインクルージョンボディの溶液(濃度1.5mg/ml)、20mlを得た。
実施例2のインクルージョンボディ18.5mlを、260mlの40%(V/V)ジメチルスルフォキシド(DMSO)、1M NaCl 、0.5M L−アルギニン を含む0.1M トリス塩酸バッファー(pH9.5)で希釈し、還元型グルタチオンを5mMになるように添加して4℃で3日間静置した。次いで、5Lの20mMイミダゾールと1.5M尿素を含む20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)に対して2回透析を行った。さらに予め20mMイミダゾールと250mM NaClを含む20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)で平衡化したHis−Trap−Resinのカラム(ベッド容量30ml)に通液して、リフォールディングされたproTGFβ3を吸着させ、同じ緩衝液でカラムを洗浄した後に、250mMイミダゾールと250mM NaClを含む20mM トリス塩酸緩衝液(pH7.5)で溶出し、可溶化された0.25mg/mlのproTGFβ3の溶液5mlを得た。
(1) 配列番号5に示す合成DNAを用いた他、実施例1(1)〜(6)と同様にして発現ベクターpETCyt3proTGFβ3を調製し、配列を確認した。
(2)このベクターを実施例1(7)と同様に形質転換して発現菌株Rosetta−gami2(DE3)/pETCyt3proTGFb3を得た。
(3)実施例2と同様に精製インクルージョンボディを調製した。
(4)実施例3と同様にリフォールディング操作を行った。この溶液をHis−Trap−Resin(ベッド容量3ml)に吸着させ、20mMイミダゾールと250mMNaClを含む20mMトリス塩酸緩衝液 (pH8.0)で洗浄した後に、250mMイミダゾールと250mMNaClを含む20mMトリス塩酸緩衝液 (pH4.3)で溶出しproTGFβ3濃度0.1mg/mlの溶液6mlを得た。
Claims (5)
- TGFβスーパーファミリーに属する細胞増殖因子前駆体を微生物細胞内で不溶性発現させた後、アルギニン、ジメチルスルフォキシド、及び還元型グルタチオンを含む緩衝液によりリフォールディングすることを特徴とする細胞増殖因子前駆体の製造方法。
- TGFβスーパーファミリーに属する増殖因子の前駆体がTGFβである請求項1に記載の製造方法。
- TGFβの前駆体がTGFβ3である請求項2に記載の製造方法。
- 前記緩衝液中のアルギニン濃度が0.1〜2M、ジメチルスルフォキシドが5〜60%(V/V)、還元型グルタチオンが0.002〜20mMであり、弱アルカリ性の緩衝液を用いる請求項1〜3に記載の製造方法。
- 弱アルカリ性の緩衝液がpH8.5〜10の緩衝液である請求項2〜4に記載の製造方法。
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JOURNAL OF CELL SCIENCE, 2003, VOL.116, PP.217-224, JPN6018040933 * |
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