JP2018154578A - 抗炎症剤 - Google Patents
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Abstract
【課題】マクロファージを炎症部位に遊走させ、抗炎症作用を誘導するインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生量を増加させることができる抗炎症剤を提供する。【解決手段】ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を合計１〜２００個有するポリペプチド（Ａ）及び／又は前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列との相同性が８５％以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ａ’）を含有する抗炎症剤。【選択図】なし
Description
本発明は、抗炎症剤に関する。
炎症とは、異物や組織の障害等により、生体にとって有害な刺激が侵入又は内部で形成された場合に生じる局所的な生体防御反応であり、生体にとって有害な刺激を認識、排除することで、局所の機能や構造を回復して正常に保ちつづけるために重要な役割を果たしている。しかしながら、活性化されたさまざまな生体反応システムは、自己免疫疾患等に見られるように、ときに正常な組織や機能に障害を与える場合もあることから、過剰なものは病的現象として治療の対象となる。これらの疾患に対しては抗炎症剤として従来、ステロイド性又は非ステロイド性薬剤等が使用されている。しかしながら、これらの抗炎症剤には、白血球異常や血小板異常等の副作用があるため、使用が制限されることもある。
本発明は、マクロファージを炎症部位に遊走させ、抗炎症作用を誘導するインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生量を増加させることができる抗炎症剤を提供することを目的とする。
本発明の抗炎症剤は、ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を合計１〜２００個有するポリペプチド（Ａ）及び／又は前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列との相同性が８５％以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ａ’）を含有する抗炎症剤である。
本発明の抗炎症剤は、マクロファージを炎症部位に遊走させ、抗炎症作用を誘導するインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生量を増加させることができるという効果を奏する。
以下、本発明の抗炎症剤について具体的な実施形態を示しながら説明する。しかしながら、本発明は、以下の実施形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を変更しない範囲において適宜変更して適用することができる。
本発明の抗炎症剤は、ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を合計１〜２００個有するポリペプチド（Ａ）及び／又は前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列との相同性が８５％以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ａ’）を含有する。
本発明の抗炎症剤が、上記構成であることにより、マクロファージを炎症部位に遊走させ、抗炎症作用を誘導するＩＬ−１０の産生量を増加させることができる。したがって、組織の修復を促すことが期待される。
本発明の抗炎症剤が、上記構成であることにより、マクロファージを炎症部位に遊走させ、抗炎症作用を誘導するＩＬ−１０の産生量を増加させることができる。したがって、組織の修復を促すことが期待される。
まず、本発明の抗炎症剤に含有されるポリペプチド（Ａ）について説明する。
ポリペプチド（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、ポリペプチド（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
ポリペプチド（Ａ）は、天然物からの抽出、有機合成法（酵素法、固相合成法及び液相合成法等）及び遺伝子組み換え法等によって得られる。有機合成法に関しては、「生化学実験講座１、タンパク質の化学ＩＶ（１９８１年７月１日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」又は「続生化学実験講座２、タンパク質の化学（下）（昭和６２年５月２０日、日本生化学会編、株式会社東京化学同人発行）」に記載されている方法等が適用できる。遺伝子組み換え法に関しては、特許第３３３８４４１号公報に記載されている方法等が適用できる。天然物からの抽出、有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、ポリペプチド（Ａ）を得られるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
ポリペプチド（Ａ）は、ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を合計１〜２００個有するポリペプチドである。また、ポリペプチド（Ａ）は、抗炎症性の向上の観点から、上記アミノ酸配列を合計１〜１５０個有することが好ましく、１〜１００個有することがさらに好ましい。
ポリペプチド（Ａ）が、ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を合計２個以上有する場合、各アミノ酸配列は同一でも異なっていてもよい。また、同一のアミノ酸配列を複数含む場合、連続していてもよい。具体的には、（ＶＧＶＰＧ）ａ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列及び（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列からなる群より選ばれる少なくとも１種を含むものであってもよい。
なお、上記においてａ〜ｃは、それぞれアミノ酸配列の連続する数であり、２〜２００の整数である。
各アミノ酸配列が連続する数は、抗炎症性の向上の観点から、２〜１００（上記ａ〜ｃが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０（上記ａ〜ｃが２〜５０）であり、特に好ましくは２〜１０（上記ａ〜ｃが２〜１０）である。
なお、上記においてａ〜ｃは、それぞれアミノ酸配列の連続する数であり、２〜２００の整数である。
各アミノ酸配列が連続する数は、抗炎症性の向上の観点から、２〜１００（上記ａ〜ｃが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０（上記ａ〜ｃが２〜５０）であり、特に好ましくは２〜１０（上記ａ〜ｃが２〜１０）である。
また、ポリペプチド（Ａ）において、各アミノ酸配列が連続するものである場合、ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列の連続する個数は、それぞれ同一でも異なっていてもよい。
すなわち、（ＶＧＶＰＧ）ａ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列及び（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列の、ａ、ｂ及びｃが同一であってもよく、異なっていてもよい。
すなわち、（ＶＧＶＰＧ）ａ配列、（ＧＶＧＶＰ）ｂ配列及び（ＶＰＧＶＧ）ｃ配列の、ａ、ｂ及びｃが同一であってもよく、異なっていてもよい。
ポリペプチド（Ａ）は、抗炎症性の向上の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）を１〜２００個有していることが好ましい。
また、ポリペプチド（Ａ）は、抗炎症性の向上の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）を、１〜１００個有することが好ましく、１〜６０個有することがさらに好ましい。
また、ポリペプチド（Ａ）が、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）を２個以上有する場合、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）は連続していてもよい。具体的には、ポリペプチド（Ａ）は（ＧＡＧＡＧＳ）ｄ配列を含むものであってもよい。
なお、上記においてｄはＧＡＧＡＧＳ配列（４）の連続する数であり、整数である。
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が連続する数は、抗炎症性の向上の観点から、２〜１００（上記ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０（上記ｄが２〜５０）であり、特に好ましくは２〜１０（上記ｄが２〜１０）である。
また、ポリペプチド（Ａ）は、抗炎症性の向上の観点から、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）を、１〜１００個有することが好ましく、１〜６０個有することがさらに好ましい。
また、ポリペプチド（Ａ）が、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）を２個以上有する場合、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）は連続していてもよい。具体的には、ポリペプチド（Ａ）は（ＧＡＧＡＧＳ）ｄ配列を含むものであってもよい。
なお、上記においてｄはＧＡＧＡＧＳ配列（４）の連続する数であり、整数である。
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）が連続する数は、抗炎症性の向上の観点から、２〜１００（上記ｄが２〜１００）が好ましく、さらに好ましくは２〜５０（上記ｄが２〜５０）であり、特に好ましくは２〜１０（上記ｄが２〜１０）である。
ポリペプチド（Ａ）は、抗炎症性の向上の観点から、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）を１〜５０個有することが好ましい。
また、ポリペプチド（Ａ）は、抗炎症性の向上の観点から、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）を、１〜４０個有することが好ましく、さらに好ましくは１〜２０個有することである。
また、ポリペプチド（Ａ）が、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）を２個以上有する場合、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）は連続していてもよい。具体的には、ポリペプチド（Ａ）は（ＧＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ）ｅ配列を含むものであってもよい。
なお、上記においてｅはＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）が連続する数であり、整数である。
ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）が連続する数は、抗炎症性の向上の観点から、２〜３０（上記ｅが２〜３０）が好ましく、さらに好ましくは２〜１０（上記ｅが２〜１０）である。
また、ポリペプチド（Ａ）は、抗炎症性の向上の観点から、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）を、１〜４０個有することが好ましく、さらに好ましくは１〜２０個有することである。
また、ポリペプチド（Ａ）が、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）を２個以上有する場合、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）は連続していてもよい。具体的には、ポリペプチド（Ａ）は（ＧＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ）ｅ配列を含むものであってもよい。
なお、上記においてｅはＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）が連続する数であり、整数である。
ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）が連続する数は、抗炎症性の向上の観点から、２〜３０（上記ｅが２〜３０）が好ましく、さらに好ましくは２〜１０（上記ｅが２〜１０）である。
ポリペプチド（Ａ）は、さらに、ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）、ＧＡＧＡＧＳ配列（４）及びＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列同士の間に、介在アミノ酸配列（Ｚ）を有していてもいい。介在アミノ酸配列（Ｚ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したアミノ酸配列である。介在アミノ酸配列（Ｚ）を構成するアミノ酸の数は、細胞及び組織への親和性の観点から、１〜３０個が好ましく、さらに好ましくは１〜１５個、特に好ましくは１〜１０個である。
介在アミノ酸配列（Ｚ）の具体例としては、ＶＡＡＧＹ配列（８）、ＧＡＡＧＹ配列（９）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
介在アミノ酸配列（Ｚ）の具体例としては、ＶＡＡＧＹ配列（８）、ＧＡＡＧＹ配列（９）及びＬＧＰ配列等が挙げられる。
ポリペプチド（Ａ）のＮ及び／又はＣ末端には、末端アミノ酸配列（Ｓ）があってもよい。末端アミノ酸配列（Ｓ）は、アミノ酸１個又はアミノ酸が２個以上結合したペプチド配列である。末端アミノ酸配列（Ｓ）を構成するアミノ酸の数は、細胞及び組織への親和性の観点から、１〜１００個が好ましく、さらに好ましくは１〜５０個、特に好ましくは１〜４０個である。
末端アミノ酸配列（Ｓ）の具体例としては、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１０）等が挙げられる。
末端アミノ酸配列（Ｓ）の具体例としては、ＭＤＰＶＶＬＱＲＲＤＷＥＮＰＧＶＴＱＬＮＲＬＡＡＨＰＰＦＡＳＤＰＭ配列（１０）等が挙げられる。
ポリペプチド（Ａ）は、上記末端アミノ酸配列（Ｓ）以外に、発現させたポリペプチド（Ａ）の精製又は検出を容易にするために、ポリペプチド（Ａ）のＮ又はＣ末端に特殊なアミノ酸配列を有するタンパク質又はペプチド（以下これらを「精製タグ」と称する）を有してもいい。精製タグとしては、アフィニティー精製用のタグが利用される。そのような精製タグとしては、ポリヒスチジンからなる６×Ｈｉｓタグ、Ｖ５タグ、Ｘｐｒｅｓｓタグ、ＡＵ１タグ、Ｔ７タグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、ＤＤＤＤＫタグ、Ｓタグ、ＣｒｕｚＴａｇ０９ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ２２ＴＭ、ＣｒｕｚＴａｇ４１ＴＭ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕタグ、Ｈａ．１１タグ及びＫＴ３タグ等がある。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるポリペプチド（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
以下に、各精製タグ（ｉ）とそのタグを認識結合するリガンド（ｉｉ）との組み合わせの一例を示す。
（ｉ−１）グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＴＳ） （ｉｉ−１）グルタチオン
（ｉ−２）マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ） （ｉｉ−２）アミロース
（ｉ−３）ＨＱタグ （ｉｉ−３）ニッケル
（ｉ−４）Ｍｙｃタグ （ｉｉ−４）抗Ｍｙｃ抗体
（ｉ−５）ＨＡタグ （ｉｉ−５）抗ＨＡ抗体
（ｉ−６）ＦＬＡＧタグ （ｉｉ−６）抗ＦＬＡＧ抗体
（ｉ−７）６×Ｈｉｓタグ （ｉｉ−７）ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおけるポリペプチド（Ａ）をコードする核酸の５’又は３’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
ポリペプチド（Ａ）がＶＧＶＰＧ配列（１）を含む場合、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸数の割合は、抗炎症性の向上の観点から、３５〜１００％であることが好ましく、さらに好ましくは４０〜１００％であり、次にさらに好ましくは４０〜９５％であり、特に好ましくは４５〜８０％である。
ポリペプチド（Ａ）がＧＶＧＶＰ配列（２）を含む場合、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＧＶＧＶＰ配列（２）のアミノ酸数の割合は、抗炎症性の向上の観点から、３５〜１００％であることが好ましく、さらに好ましくは４０〜１００％であり、次にさらに好ましくは４０〜９５％であり、特に好ましくは４５〜８０％である。
ポリペプチド（Ａ）がＶＰＧＶＧ配列（３）を含む場合、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸数の割合は、抗炎症性の向上の観点から、３５〜１００％であることが好ましく、さらに好ましくは４０〜１００％であり、次にさらに好ましくは４０〜９５％であり、特に好ましくは４５〜８０％である。
ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列のアミノ酸数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜アミノ酸の数の割合の測定方法１＞
特定のアミノ酸残基でポリペプチドを切断するプロテアーゼを２種類以上用いてポリペプチド（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と記載する）にて切断したポリペプチドを分離し、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、ポリペプチド（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の式により、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸の数の割合を算出する。
ＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＧＶＰＧ配列（１）の数×５／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
ＧＶＧＶＰ配列（２）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＶＧＶＰ配列（２）の数×５／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
ＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＰＧＶＧ配列（３）の数×５／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
＜アミノ酸の数の割合の測定方法１＞
特定のアミノ酸残基でポリペプチドを切断するプロテアーゼを２種類以上用いてポリペプチド（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、高速液体クロマトグラフィー（以下、「ＨＰＬＣ」と記載する）にて切断したポリペプチドを分離し、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、ポリペプチド（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の式により、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸の数の割合を算出する。
ＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＧＶＰＧ配列（１）の数×５／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
ＧＶＧＶＰ配列（２）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＶＧＶＰ配列（２）の数×５／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
ＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＰＧＶＧ配列（３）の数×５／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合は、抗炎症性の向上の観点から、０〜６５％であることが好ましく、さらに好ましくは０〜６０％であり、次にさらに好ましくは５〜６０％であり、特に好ましくは２０〜５５％である。
ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合は、プロテインシークエンサーによって求めることができる。具体的には、下記の測定法により求めることができる。
＜アミノ酸の数の割合の測定方法２＞
特定のアミノ酸残基でポリペプチドを切断するプロテアーゼを２種類以上用いてポリペプチド（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、ＨＰＬＣにて切断したポリペプチドを分離し、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、ポリペプチド（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の式により、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸数の割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）の数×６／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
＜アミノ酸の数の割合の測定方法２＞
特定のアミノ酸残基でポリペプチドを切断するプロテアーゼを２種類以上用いてポリペプチド（Ａ）を３０残基以下程度まで分解する。その後、ＨＰＬＣにて切断したポリペプチドを分離し、プロテインシークエンサーにてアミノ酸配列を読み取る。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、ポリペプチド（Ａ）の全配列を決定する。その後、以下記載の式により、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸数の割合を算出する。
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）の数×６／ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数｝×１００
ポリペプチド（Ａ）のゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法による分子質量は、抗炎症性の向上の観点から、０．４〜２００ｋＤａが好ましく、さらに好ましくは０．４〜１２０ｋＤａである。
なお、ＧＰＣ法による分子質量の測定条件は以下の通りである。
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
移動相：０．１５Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
移動相：０．１５Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
好ましいポリペプチド（Ａ）の例を以下に示す。
（ｉ）ＶＧＶＰＧ配列（１）からなるポリペプチド。
（ｉｉ）ＧＶＧＶＰ配列（２）からなるポリペプチド。
（ｉｉｉ）ＶＰＧＶＧ配列（３）からなるポリペプチド。
（ｉｖ）ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）からなるポリペプチド。
（ｖ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（６）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を有するポリペプチド。
具体例としては、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（６）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるポリペプチドに、さらに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１１）が１個化学結合した、分子質量が約８０ｋＤａの配列（１２）のポリペプチド（ＳＥＬＰ８Ｋ）；（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１１）を１７個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を１７個有し、これらが交互に化学結合してなる、分子質量が約８２ｋＤａの配列（１３）のポリペプチド（ＳＥＬＰ０Ｋ）等が挙げられる。
（ｉ）ＶＧＶＰＧ配列（１）からなるポリペプチド。
（ｉｉ）ＧＶＧＶＰ配列（２）からなるポリペプチド。
（ｉｉｉ）ＶＰＧＶＧ配列（３）からなるポリペプチド。
（ｉｖ）ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）からなるポリペプチド。
（ｖ）（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（６）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を有するポリペプチド。
具体例としては、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（６）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を１３個有し、これらが交互に化学結合してなるポリペプチドに、さらに、（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１１）が１個化学結合した、分子質量が約８０ｋＤａの配列（１２）のポリペプチド（ＳＥＬＰ８Ｋ）；（ＧＡＧＡＧＳ）２配列（１１）を１７個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を１７個有し、これらが交互に化学結合してなる、分子質量が約８２ｋＤａの配列（１３）のポリペプチド（ＳＥＬＰ０Ｋ）等が挙げられる。
本発明の抗炎症剤は、上記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列との相同性が８５％以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ａ’）を含有していてもよい。
ポリペプチド（Ａ’）のアミノ酸配列と、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列の相同性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
なお、本発明の抗炎症剤は、ポリペプチド（Ａ）及びポリペプチド（Ａ’）の内、ポリペプチド（Ａ）のみを含有していてもよく、ポリペプチド（Ａ’）のみを含有していてもよく、ポリペプチド（Ａ）及びポリペプチド（Ａ’）の両方を含有していてもよい。
ポリペプチド（Ａ’）のアミノ酸配列と、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列の相同性は、９０％以上であることが好ましく、９５％以上であることがより好ましい。
なお、本発明の抗炎症剤は、ポリペプチド（Ａ）及びポリペプチド（Ａ’）の内、ポリペプチド（Ａ）のみを含有していてもよく、ポリペプチド（Ａ’）のみを含有していてもよく、ポリペプチド（Ａ）及びポリペプチド（Ａ’）の両方を含有していてもよい。
本発明の抗炎症剤は、上記ポリペプチド（Ａ）及び／又は上記ポリペプチド（Ａ’）を含有するものである。
ポリペプチド（Ａ）及び／又はポリペプチド（Ａ’）の合計含有量は、抗炎症性の向上の観点から、抗炎症剤の重量を基準として、０．０００１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜２０重量％である。
ポリペプチド（Ａ）及び／又はポリペプチド（Ａ’）の合計含有量は、抗炎症性の向上の観点から、抗炎症剤の重量を基準として、０．０００１〜３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．０１〜２０重量％である。
本発明の抗炎症剤には、ポリペプチド（Ａ）及び／又はポリペプチド（Ａ’）以外に、水を含んでもよい。
水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２０μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
抗炎症剤中の水の含有量（重量％）は、細胞及び組織への親和性の観点から、下限は、好ましくは６８．７９重量％であり、次にさらに好ましくは６８．６２重量％であり、次にさらに好ましくは６８．４０重量％であり、次にさらに好ましくは７０．００重量％であり、次にさらに好ましくは７８．４０重量％であり、特に好ましくは７８．６２重量％であり、次に特に好ましくは７８．７９重量％であり、最も好ましくは８０．００重量％である。また、上限は、好ましくは９９．９９９９重量％であり、さらに好ましくは９９．９９００重量％であり、次にさらに好ましくは９９．３９９９重量％であり、次にさらに好ましくは９９．３９００重量％であり、次にさらに好ましくは９９．１７９９重量％であり、特に好ましくは９９．１７００重量％であり、次に特に好ましくは９９．００９９重量％であり、最も好ましくは９９．００００重量％である。
水としては、特に限定するものではなく、滅菌されたものが好ましい。滅菌方法としては、０．２０μｍ以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで１２１℃２０分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
抗炎症剤中の水の含有量（重量％）は、細胞及び組織への親和性の観点から、下限は、好ましくは６８．７９重量％であり、次にさらに好ましくは６８．６２重量％であり、次にさらに好ましくは６８．４０重量％であり、次にさらに好ましくは７０．００重量％であり、次にさらに好ましくは７８．４０重量％であり、特に好ましくは７８．６２重量％であり、次に特に好ましくは７８．７９重量％であり、最も好ましくは８０．００重量％である。また、上限は、好ましくは９９．９９９９重量％であり、さらに好ましくは９９．９９００重量％であり、次にさらに好ましくは９９．３９９９重量％であり、次にさらに好ましくは９９．３９００重量％であり、次にさらに好ましくは９９．１７９９重量％であり、特に好ましくは９９．１７００重量％であり、次に特に好ましくは９９．００９９重量％であり、最も好ましくは９９．００００重量％である。
本発明の抗炎症剤は、さらに無機塩及び／又はリン酸（塩）を含んでもいい。
無機塩として、具体的には、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硫酸カルシウム、硫酸マグネシウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸水素カリウム、炭酸水素カルシウム及び炭酸水素マグネシウム等が挙げられる。リン酸塩は無機塩に含まない。
抗炎症剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と同等にするという観点から、抗炎症剤の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
抗炎症剤中の無機塩の含有量（重量％）は、人間の体液と同等にするという観点から、抗炎症剤の重量を基準として０．５〜１．３重量％が好ましく、さらに好ましくは０．７〜１．１重量％、特に好ましくは０．８５〜０．９５重量％である。
リン酸（塩）は、リン酸及び／又はリン酸塩を意味する。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
抗炎症剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、皮膚弾性を向上する観点から、抗炎症剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
リン酸（塩）としては、リン酸及びリン酸塩が挙げられる。
塩としては、アルカリ金属塩及びアルカリ土類金属塩が挙げられ、具体的には、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩及びマグネシウム塩等が挙げられる。
抗炎症剤中のリン酸（塩）の含有量（重量％）は、皮膚弾性を向上する観点から、抗炎症剤の重量を基準として０．１０〜０．３０重量％が好ましく、さらに好ましくは０．１２〜０．２８重量％、特に好ましくは０．１４〜０．２６重量％である。
本発明の抗炎症剤は、さらに抗炎症作用を奏する化合物、アスコルビン酸、グルタチオン、α−トコフェロール、ポリフェノール、トリプトファン、レズベラトロール等を含有していてもよい。
抗炎症剤のｐＨは、抗炎症剤の安定性の観点から、６．８〜８．８が好ましく、さらに好ましくは７．３〜８．３である。
本発明の抗炎症剤は、各成分を混合することにより得られ、製造方法は特に限定されるものではない。
本発明の抗炎症剤は、細胞や、組織等の生体材料を培養する際に、該生体材料の炎症を抑える目的で、該生体材料の培地に加えてもよい。
生体材料の培地としては、特に限定されないが、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地及びαＭＥＭ培地等が挙げられる。
また、本発明の抗炎症剤は、最終濃度が０．００００１〜３０重量％となるように培地に加えられることが好ましく、０．００１〜８０重量％となるように加えられることが望ましい。
培養対象の生体材料としては、特に限定されないが、移植用細胞、移植用組織等が挙げられる。また、本発明の抗炎症剤を培地に加え、該培地を生体の創傷部位に適用してもよい。すなわち、生体に直接使用してもよい。
生体材料の培地としては、特に限定されないが、例えば、ＲＰＭＩ１６４０培地、ＤＭＥＭ培地及びαＭＥＭ培地等が挙げられる。
また、本発明の抗炎症剤は、最終濃度が０．００００１〜３０重量％となるように培地に加えられることが好ましく、０．００１〜８０重量％となるように加えられることが望ましい。
培養対象の生体材料としては、特に限定されないが、移植用細胞、移植用組織等が挙げられる。また、本発明の抗炎症剤を培地に加え、該培地を生体の創傷部位に適用してもよい。すなわち、生体に直接使用してもよい。
以下に実施例として本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれら実施例のみに限定されるものではない。なお、以下において、特記しない限り「部」は重量部を意味する。
＜製造例１＞
［ＳＥＬＰ８Ｋの作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋ生産株の作製
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、ポリペプチド（Ａ）の一種である（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（６）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を１３個有し、これらが交互に化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１２）のポリペプチドであるＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を生産する方法を示す。
［ＳＥＬＰ８Ｋの作製］
○ＳＥＬＰ８Ｋ生産株の作製
特許第４０８８３４１号公報の実施例記載の方法に準じて、ＳＥＬＰ８ＫをコードしたプラスミドｐＰＴＳ０３４５を作製した。
作製したプラスミドを大腸菌にトランスフォーメーションし、ＳＥＬＰ８Ｋ生産株を得た。以下、このＳＥＬＰ８Ｋ生産株を用いて、ポリペプチド（Ａ）の一種である（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（６）を１２個及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を１３個有し、これらが交互に化学結合した構造を有する分子質量が約８０ｋＤａの配列（１２）のポリペプチドであるＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を生産する方法を示す。
○ＳＥＬＰ８Ｋ生産株の培養
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。該ＬＢ培地に、カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え培養液とし、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液の濁度がＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、該培養液４０ｍｌを、４２℃に温められた別のフラスコに移し、４２℃で約２時間培養した。その後、培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
３０℃で生育させたＳＥＬＰ８Ｋ生産株の一夜培養液を使用して、２５０ｍｌフラスコ中のＬＢ培地５０ｍｌに接種した。該ＬＢ培地に、カナマイシンを最終濃度５０μｇ／ｍｌとなるように加え培養液とし、該培養液を３０℃で攪拌しながら（２００ｒｐｍ）インキュベートした。培養液の濁度がＯＤ６００＝０．８（吸光度計ＵＶ１７００：島津製作所製を使用）となった時に、該培養液４０ｍｌを、４２℃に温められた別のフラスコに移し、４２℃で約２時間培養した。その後、培養した培養液を氷上で冷却し、培養液の濁度ＯＤ６００を測定し、遠心分離にて大腸菌を集菌した。
○ＳＥＬＰ８Ｋの精製
集菌した大腸菌を用い、下記工程１：菌体溶解、工程２：遠心分離による不溶性細片の除去、工程３：硫安沈殿、工程４：限外濾過、工程５：陰イオン交換クロマトグラフィー、工程６：限外濾過、工程７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８５ｋＤａの精製したＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を得た。
集菌した大腸菌を用い、下記工程１：菌体溶解、工程２：遠心分離による不溶性細片の除去、工程３：硫安沈殿、工程４：限外濾過、工程５：陰イオン交換クロマトグラフィー、工程６：限外濾過、工程７：凍結乾燥により大腸菌バイオマスからタンパク質を精製した。このようにして、分子質量が約８５ｋＤａの精製したＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を得た。
工程１：菌体溶解
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
集菌した大腸菌１００ｇに対して、脱イオン水２００ｇを加えて、高圧ホモジナイザー（５５ＭＰａ）にて菌体溶解し、溶解した菌体を含む菌体溶解液を得た。その後、菌体溶解液を氷酢酸にてｐＨ４．０に調整した。
工程２：遠心分離による不溶性細片の除去
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
さらに菌体溶解液を遠心分離（６３００ｒｐｍ、４℃、３０分間）して、上清を回収した。
工程３：硫安沈殿
工程２で回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。次に、溶解した液に対して、硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
工程２で回収した上清に硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解した。次に、溶解した液に対して、硫安濃度が２５重量％となるように飽和硫安溶液を投入した。その後、８〜１２時間静置した後、遠心分離にて沈殿物を回収した。回収した沈殿物を脱イオン水に溶解し、溶液を得た。
工程４：限外濾過
工程３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファイバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。工程３で得た溶液に対して、２０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のポリペプチド溶液を得た。
工程３で得た溶液を分子質量３０，０００カットの限外濾過装置（ホロファイバー：ＧＥヘルスケア製）に供した。工程３で得た溶液に対して、２０倍量の脱イオン水を用いて、限外濾過を実施し、限外濾過後のポリペプチド溶液を得た。
工程５：陰イオン交換クロマトグラフィー
ポリペプチドの濃度が２０ｇ／Ｌとなるように限外濾過後のポリペプチド溶液を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に加え、その後、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
ポリペプチドの濃度が２０ｇ／Ｌとなるように限外濾過後のポリペプチド溶液を、１０ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液に加え、その後、陰イオン交換カラムＨｉＰｒｅｐＳＰ ＸＬ１６／１０（ＧＥヘルスケア社製）をセットしたＡＫＴＡＰｒｉｍｅ（アマシャム社製）に供した。溶出液として５００ｍＭ酢酸ナトリウム緩衝液を用いて、溶出画分を回収した。
工程６：限外濾過
工程５で得た溶出画分を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のポリペプチド溶液を得た。
工程５で得た溶出画分を上記「４：限外濾過」と同様にして処理し、限外濾過後のポリペプチド溶液を得た。
工程７：凍結乾燥
ポリペプチド濃度が３ｇ／Ｌとなるように、工程６で得たポリペプチド溶液を脱イオン水で希釈し、水位が１０ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−３０℃、２４時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が５Ｐａ以下、−３０℃で、１１０時間かけて１次乾燥、真空度が５Ｐａ以下、３０℃で、４８時間かけて２次乾燥させ、ＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を得た。また、得られたＳＥＬＰ８Ｋを用いて、下記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ＳＥＬＰ８Ｋ中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
ポリペプチド濃度が３ｇ／Ｌとなるように、工程６で得たポリペプチド溶液を脱イオン水で希釈し、水位が１０ｍｍ以下となるようにステンレス製のバットに入れた。その後、凍結乾燥機（日本テクノサービス社製）に入れて、−３０℃、２４時間かけて凍結させた。凍結後、真空度が５Ｐａ以下、−３０℃で、１１０時間かけて１次乾燥、真空度が５Ｐａ以下、３０℃で、４８時間かけて２次乾燥させ、ＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を得た。また、得られたＳＥＬＰ８Ｋを用いて、下記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ＳＥＬＰ８Ｋ中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
＜アミノ酸の数の割合の測定方法３＞
トリプシン（プロメガ（株）製）又はエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）を用いてＳＥＬＰ８Ｋを３７℃で２４時間反応し、３０残基以下程度まで分解した。その後、ＨＰＬＣにて分離し、ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ １．２（日本ウォーターズ（株）製）にてアミノ酸配列を読み取った。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、ＳＥＬＰ８Ｋの全配列を決定した。その後、以下記載の式により、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を算出した。
ＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＧＶＰＧ配列（１）の数×５／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
ＧＶＧＶＰ配列（２）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＶＧＶＰ配列（２）の数×５／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
ＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＰＧＶＧ配列（３）の数×５／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）の数×６／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
トリプシン（プロメガ（株）製）又はエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）を用いてＳＥＬＰ８Ｋを３７℃で２４時間反応し、３０残基以下程度まで分解した。その後、ＨＰＬＣにて分離し、ＢｉｏｐｈａｒｍａＬｙｎｘ １．２（日本ウォーターズ（株）製）にてアミノ酸配列を読み取った。得られたアミノ酸配列からペプチドマッピングして、ＳＥＬＰ８Ｋの全配列を決定した。その後、以下記載の式により、ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を算出した。
ＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＧＶＰＧ配列（１）の数×５／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
ＧＶＧＶＰ配列（２）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＶＧＶＰ配列（２）の数×５／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
ＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＶＰＧＶＧ配列（３）の数×５／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
ＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合（％）＝｛ＧＡＧＡＧＳ配列（４）の数×６／ＳＥＬＰ８Ｋのアミノ酸の総数｝×１００
＜製造例２＞
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で２０分反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより以下の条件で分離し、分子質量が約４０ｋＤａであるポリペプチド（Ａ２）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ２）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ２）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で２０分反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより以下の条件で分離し、分子質量が約４０ｋＤａであるポリペプチド（Ａ２）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ２）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ２）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
＜ＨＰＬＣによる分子質量の測定条件＞
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
移動相：０．１５Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
装置：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣシステム
カラム：Ｓｈｏｄｅｘ ＯＨｐａｋ ＳＢ−８０６Ｍ ＨＱ
移動相：０．１５Ｍ リン酸緩衝液 ｐＨ７．０
流速：０．５ｍｌ／ｍｉｎ
検出器：ＡＣＱＵＩＴＹ ＵＰＬＣ ＲＩＤ検出器
温度：４０℃
＜製造例３＞
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で３０分反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより上記条件で分離し、分子質量が約２０ｋＤａであるポリペプチド（Ａ３）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ３）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ３）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で３０分反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより上記条件で分離し、分子質量が約２０ｋＤａであるポリペプチド（Ａ３）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ３）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ３）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
＜製造例４＞
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で１２０分反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより上記条件で分離し、分子質量が約５ｋＤａであるポリペプチド（Ａ４）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ４）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ４）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で１２０分反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより上記条件で分離し、分子質量が約５ｋＤａであるポリペプチド（Ａ４）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ４）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ４）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
＜製造例５＞
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で２４時間反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより上記条件で分離し、分子質量が約１．５ｋＤａであるポリペプチド（Ａ５）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ５）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ５）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
水溶液ａ［製造例１のＳＥＬＰ８Ｋ（ポリペプチド（Ａ１））を１０ｍｇ及び５ｍＭの塩化カルシウムを含む１０ｍＭトリス緩衝液（ｐＨ８．８）］１ｍＬに、２ｍｇ／ｍＬのエラスターゼ（ブタ膵臓由来、和光純薬（株）製）２．５μＬを加えて、反応溶液とし、４０℃で２４時間反応を行った。反応後のサンプル溶液を、ＨＰＬＣにより上記条件で分離し、分子質量が約１．５ｋＤａであるポリペプチド（Ａ５）を得た。また、得られたポリペプチド（Ａ５）を用いて、上記「アミノ酸の数の割合の測定方法３」により、ポリペプチド（Ａ５）中のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）、ＶＰＧＶＧ配列（３）及びＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合を測定した。結果を表１に示す。
＜製造例６＞
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＶＧＶＰＧ配列（１）であるポリペプチド（Ａ６）を得た。
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＶＧＶＰＧ配列（１）であるポリペプチド（Ａ６）を得た。
＜製造例７＞
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＧＶＧＶＰ配列（２）であるポリペプチド（Ａ７）を得た。
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＧＶＧＶＰ配列（２）であるポリペプチド（Ａ７）を得た。
＜製造例８＞
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＶＰＧＶＧ配列（３）であるポリペプチド（Ａ８）を得た。
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＶＰＧＶＧ配列（３）であるポリペプチド（Ａ８）を得た。
＜製造例９＞
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）であるポリペプチド（Ａ９）を得た。
ペプチド合成（ライフテクノロジース社）によりアミノ酸配列がＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）であるポリペプチド（Ａ９）を得た。
＜実施例１〜９＞
ポリペプチド（Ａ１）〜（Ａ９）をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地で０．０１重量％になるように調製し、実施例１〜９に係る抗炎症剤（１）〜（９）とした。
ポリペプチド（Ａ１）〜（Ａ９）をそれぞれＲＰＭＩ１６４０培地で０．０１重量％になるように調製し、実施例１〜９に係る抗炎症剤（１）〜（９）とした。
＜比較例１＞
ＳＥＷ２８７１（ケイマンケミカル（株）製）をＲＰＭＩ１６４０培地で０．０１重量％になるように調製し、比較例１に係る抗炎症剤（１’）とした。
ＳＥＷ２８７１（ケイマンケミカル（株）製）をＲＰＭＩ１６４０培地で０．０１重量％になるように調製し、比較例１に係る抗炎症剤（１’）とした。
＜マクロファージ遊走細胞数及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生量測定＞
マクロファージの遊走作用は、マウス腹腔マクロファージに対する作用をボイデンチャンバー法に従って評価した。マクロファージはＣ５７ＢＬ／６Ｎ（雌、６−９週齢）の腹腔に４％チオグリコレート（日本製薬製）を投与し、４日後に腹腔から採取した。これをＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、細胞浮遊液（５×１０６個／ｍＬ）として試験に使用した。２４穴ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、ポアサイズ８μｍ、コーニング社製）は上室に細胞浮遊液１００μＬ、下室に実施例１に係る抗炎症剤（１）を６００μＬ加えた。これを、炭酸ガスインキュベータ（５％二酸化炭素、９５％空気環境下）を用いて３７℃で４時間インキュベートし、膜下面に遊走した細胞をヘマカラー染色キット（メルク社製）を使用して染色し、顕微鏡下（４００×）で染色された細胞数の計数を７視野で行った。その結果、遊走された細胞数は７視野平均で２０５個であった。また、試験後の下室のＲＰＭＩ１６４０培地上清中のＩＬ−１０の量をＩＬ−１０定量ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムス社製）を用いて定量したところ、８４３ｐｇ／ｍＬであった。結果を表１に示す。
マクロファージの遊走作用は、マウス腹腔マクロファージに対する作用をボイデンチャンバー法に従って評価した。マクロファージはＣ５７ＢＬ／６Ｎ（雌、６−９週齢）の腹腔に４％チオグリコレート（日本製薬製）を投与し、４日後に腹腔から採取した。これをＲＰＭＩ１６４０培地に懸濁し、細胞浮遊液（５×１０６個／ｍＬ）として試験に使用した。２４穴ボイデンチャンバー（Ｔｒａｎｓｗｅｌｌ、ポアサイズ８μｍ、コーニング社製）は上室に細胞浮遊液１００μＬ、下室に実施例１に係る抗炎症剤（１）を６００μＬ加えた。これを、炭酸ガスインキュベータ（５％二酸化炭素、９５％空気環境下）を用いて３７℃で４時間インキュベートし、膜下面に遊走した細胞をヘマカラー染色キット（メルク社製）を使用して染色し、顕微鏡下（４００×）で染色された細胞数の計数を７視野で行った。その結果、遊走された細胞数は７視野平均で２０５個であった。また、試験後の下室のＲＰＭＩ１６４０培地上清中のＩＬ−１０の量をＩＬ−１０定量ＥＬＩＳＡキット（Ｒ＆Ｄシステムス社製）を用いて定量したところ、８４３ｐｇ／ｍＬであった。結果を表１に示す。
また、実施例１に係る抗炎症剤（１）に替えて、実施例２〜９に係る抗炎症剤（２）〜（９）若しくは比較例１に係る抗炎症剤（１’）、又は、ブランクとして抗炎症剤を添加していないＲＰＭＩ１６４０培地を加え、上記＜マクロファージ遊走細胞数及びインターロイキン１０（ＩＬ−１０）の産生量測定＞に記載の方法と同様にマクロファージ遊走細胞数及びＩＬ−１０の産生量を測定した。結果を表１に示す。
実施例１〜９に係る抗炎症剤を用いると、マクロファージの遊走細胞数が比較例１に係る抗炎症剤を用いた場合及びブランクと同等又はそれ以上であった。
また、実施例１〜９に係る抗炎症剤を用いることにより、ＩＬ−１０の産生量を極めて多くすることができ、マクロファージの遊走細胞１個に対するＩＬ−１０の産生量を極めて多くすることができる。従って、実施例１〜９の抗炎症剤は、抗炎症剤として優れていることがわかった。
なお、ＩＬ−１０は、炎症性サイトカインの産生を始めとする免疫機能を抑制性に制御する機能を有する。
また、実施例１〜９に係る抗炎症剤を用いることにより、ＩＬ−１０の産生量を極めて多くすることができ、マクロファージの遊走細胞１個に対するＩＬ−１０の産生量を極めて多くすることができる。従って、実施例１〜９の抗炎症剤は、抗炎症剤として優れていることがわかった。
なお、ＩＬ−１０は、炎症性サイトカインの産生を始めとする免疫機能を抑制性に制御する機能を有する。
本発明の抗炎症剤は、炎症部位に使用することで抗炎症作用を誘導し、ＩＬ−１０の産生量を増加させることができる。従って、医薬品等や創傷被覆材、細胞移植用基材等の医療機器として有用である。
また、本発明の抗炎症剤の対象疾患としては、熱傷、皮膚剥削創、難治性皮膚潰瘍、褥瘡、筋疾患、自己免疫疾患、関節疾患等が挙げられる。
また、本発明の抗炎症剤の対象疾患としては、熱傷、皮膚剥削創、難治性皮膚潰瘍、褥瘡、筋疾患、自己免疫疾患、関節疾患等が挙げられる。
Claims (10)
- ＶＧＶＰＧ配列（１）、ＧＶＧＶＰ配列（２）及びＶＰＧＶＧ配列（３）からなる群より選ばれる少なくとも１種のアミノ酸配列を合計１〜２００個有するポリペプチド（Ａ）及び／又は前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸配列との相同性が８５％以上のアミノ酸配列を有するポリペプチド（Ａ’）を含有する抗炎症剤。
- 前記ポリペプチド（Ａ）は、ＶＧＶＰＧ配列（１）を含んでおり、
前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＧＶＰＧ配列（１）のアミノ酸の数の割合が３５〜１００％である請求項１に記載の抗炎症剤。 - 前記ポリペプチド（Ａ）は、ＧＶＧＶＰ配列（２）を含んでおり、
前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＧＶＧＶＰ配列（２）のアミノ酸の数の割合が３５〜１００％である請求項１に記載の抗炎症剤。 - 前記ポリペプチド（Ａ）は、ＶＰＧＶＧ配列（３）を含んでおり、
前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＶＰＧＶＧ配列（３）のアミノ酸の数の割合が３５〜１００％である請求項１に記載の抗炎症剤。 - 前記ポリペプチド（Ａ）が、さらにＧＡＧＡＧＳ配列（４）を１〜２００個有する請求項１〜４のいずれかに記載の抗炎症剤。
- 前記ポリペプチド（Ａ）のアミノ酸の総数に対するＧＡＧＡＧＳ配列（４）のアミノ酸の数の割合が０〜６５％である請求項５に記載の抗炎症剤。
- 前記ポリペプチド（Ａ）が、ＧＶＧＶＰＧＡＧＡＧＳ配列（５）を１〜５０個有するポリペプチドである請求項１に記載の抗炎症剤。
- 前記ポリペプチド（Ａ）が、（ＧＡＧＡＧＳ）４配列（６）及び（ＧＶＧＶＰ）４ＧＫＧＶＰ（ＧＶＧＶＰ）３配列（７）を有するポリペプチドである請求項１に記載の抗炎症剤。
- 前記ポリペプチド（Ａ）のゲル濾過クロマトグラフィー（ＧＰＣ）法による分子質量が０．４〜２００ｋＤａである請求項１〜８のいずれかに記載の抗炎症剤。
- 前記抗炎症剤の重量を基準として、前記ポリペプチド（Ａ）及び／又は前記ポリペプチド（Ａ’）の合計含有量が０．０００１〜３０重量％である請求項１〜９のいずれかに記載の抗炎症剤。
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