JP2015177968A - 癒着防止剤及び癒着防止剤組成物 - Google Patents
癒着防止剤及び癒着防止剤組成物 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2015177968A JP2015177968A JP2015032808A JP2015032808A JP2015177968A JP 2015177968 A JP2015177968 A JP 2015177968A JP 2015032808 A JP2015032808 A JP 2015032808A JP 2015032808 A JP2015032808 A JP 2015032808A JP 2015177968 A JP2015177968 A JP 2015177968A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- sequence
- amino acid
- adhesion
- artificial protein
- agent
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
Images
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Description
すなわち、本発明の癒着防止剤は、人工タンパク質(A)及び水を含む癒着防止剤であって、(A)が、GVGVP配列(1)、PGVGV(2)、VPGVG(3)、GVPGV配列(4)、VGVPG配列(5)、GPP配列、GAP配列及びGAHGPAGPK配列(6)のうちいずれか1種のアミノ酸配列(X)が2〜200個連続したポリペプチド鎖(Y)並びに/又は下記ペプチド鎖(Y’)を有し、(A)中に含まれる下記アミノ酸配列(X’)の合計個数が1〜20個であり、(A)の疎水性度が0.2〜1.2である癒着防止剤である。
アミノ酸配列(X’):アミノ酸配列(X)の全アミノ酸の個数のうち20〜40%がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖(Y’):アミノ酸配列(X)とアミノ酸配列(X’)とが合計2〜200個結合したポリペプチド鎖。
アミノ酸配列(X’):アミノ酸配列(X)の全アミノ酸の個数のうち20〜40%がそれぞれリシン(K)又はアルギニン(R)で置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖(Y’):アミノ酸配列(X)とアミノ酸配列(X’)とが合計2〜200個結合したポリペプチド鎖。
有機合成法及び遺伝子組み換え法はともに、人工タンパク質(A)を製造できるが、アミノ酸配列を簡便に変更でき、安価に大量生産できるという観点及び分子量の大きいタンパク質を生産する場合における生産性の観点等から、遺伝子組み換え法が好ましい。
人工タンパク質(A)1分子中にポリペプチド鎖(Y)を複数有する場合は、上記ポリペプチド鎖を1種有してもよく、2種以上有してもよい。
また、人工タンパク質(A)中にアミノ酸配列(X)が同種類のポリペプチド鎖(Y)を複数有する場合は、上記(X)の連続する個数は、(Y)ごとに同一でも異なっていてもよい。すなわち、上記a〜hが同じポリペプチド鎖(Y)を複数有してもよく、a〜hが異なるポリペプチド鎖(Y)を複数有してもいい。
ポリペプチド鎖(Y)としては、癒着防止性、溶解性(特に水への溶解性)及びゲル化時間の観点の観点から、(GVGVP)b配列(Y1)、(PGVGV)b配列(Y2)、(VPGVG)c配列(Y3)、(GVPGV)d配列(Y4)及び(VGVPG)e配列(Y5)が好ましく、さらに好ましくは(GVGVP)b配列(Y1)及び(VPGVG)c配列(Y3)である。
アミノ酸配列(X’):アミノ酸配列(X)の全アミノ酸の個数のうち20〜40%がそれぞれK又はRで置換されたアミノ酸配列。
(A)の疎水性度は、(A)分子の疎水性の度合いを示すものであり、(A)分子を構成するそれぞれのアミノ酸の数(Mα)、それぞれのアミノ酸の疎水性度(Nα)及び(A)1分子中のアミノ酸の総数を、下記数式に当てはめることにより算出することができる。なお、それぞれのアミノ酸の疎水性度は、非特許文献(アルバート・L.レーニンジャー、デビット・L.ネルソン、レ−ニンジャ−の新生化学 上、廣川書店、2010年9月、p.346−347)に記載されている下記の数値を用いる。
疎水性度=Σ(Mα×Nα)/(MT)
Mα:(A)1分子中のそれぞれのアミノ酸の数
Nα:各アミノ酸の疎水性度
MT:(A)1分子中のアミノ酸の総数
A(アラニン):1.8
R(アルギニン):−4.5
N(アスパラギン):−3.5
D(アスパラギン酸):−3.5
C(システイン):2.5
Q(グルタミン):−3.5
E(グルタミン酸):−3.5
G(グリシン):−0.4
H(ヒスチジン):−3.2
I(イソロイシン):4.5
L(ロイシン):3.8
K(リシン):−3.9
M(メチオニン):1.9
F(フェニルアラニン):2.8
P(プロリン):−1.6
S(セリン):−0.8
T(トレオニン):−0.7
W(トリプトファン):−0.9
Y(チロシン):−1.3
V(バリン):4.2
例えば、(A)が(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3配列(19)である場合、(A)の疎水性度={16(Gの数)×(−0.4)+15(Vの数)×4.2+8(Pの数)×(−1.6)+1(Kの数)×(−3.9)}/40(アミノ酸の総数)=1.00である。
(A)は配列(X)を有する場合、細胞との親和性および細胞非接着性は高いが、疎水性度が上記範囲外となり、溶解性(特に水への溶解性)の低下及びゲル化時間が増加する場合がある。その場合、アミノ酸配列(X)中のアミノ酸の一部をK又はRで置換することにより、疎水性度を小さくすることができ、溶解性(特に水への溶解性)の向上及びゲル化時間を短縮でき、癒着防止膜として有用になる。
ポリペプチド鎖(S)において、GAGAGS配列(7)が連続する数は、(A)の溶解性(特に水への溶解性)及びゲル化時間観点から、2〜10個が好ましく、さらに好ましくは2〜8個であり、次にさらに好ましくは2〜6個であり、特に好ましくは2〜4個である。
(A)において、ポリペプチド鎖(S)を有する際、(A)1分子中に(S)を1つ以上有すればよいが、ゲル化時間の観点から、2〜20個が好ましく、さらに好ましくは5〜18個である。
(T)として、具体的には、MDPVVLQRRDWENPGVTQLNRLAAHPPFASDPM配列(16)等が挙げられる。
以下に、各精製タグ(i)とそのタグを認識結合するリガンド(ii)との組み合わせの一例を示す。
(i−1)グルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GTS) (ii−1)グルタチオン
(i−2)マルトース結合タンパク質(MBP) (ii−2)アミロース
(i−3)HQタグ (ii−3)ニッケル
(i−4)Mycタグ (ii−4)抗Myc抗体
(i−5)HAタグ (ii−5)抗HA抗体
(i−6)FLAGタグ (ii−6)抗FLAG抗体
(i−7)6×Hisタグ (ii−7)ニッケル又はコバルト
前記精製タグ配列の導入方法としては、発現用ベクターにおける人工タンパク質(A)をコードする核酸の5’又は3’末端に精製タグをコードする核酸を挿入する方法や市販の精製タグ導入用ベクターを使用する方法等が挙げられる。
<ポリペプチド鎖(Y)及び(Y’)の合計含有量の測定法>
津製作所社製ペプチドシーケンサー(プロテインシーケンサ)PPSQ−33Aを用いて、アミノ酸配列を決定する。決定したアミノ酸配列から、下記数式(1)によりポリペプチド鎖(Y)及び(Y’)の合計含量を求める。
ポリペプチド鎖(Y)及び(Y’)の合計含有量=Σ(γ×β)/Σ(α×β)×100 (1)
α:人工タンパク質(A)中の各アミノ酸の数
β:各アミノ酸の分子量
γ:ポリペプチド鎖(Y)及び(Y’)中の各アミノ酸の個数
なお、人工タンパク質(A)の分子質量は、SDS−PAGE(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)法により、測定サンプルを分離し、泳動距離を標準物質と比較する方法によって求められる。
(1)アミノ酸配列(X)がGVGVP配列(1)の人工タンパク質(A1−1)
アミノ酸配列(X)としてGVGVP配列(1)を有し、アミノ酸配列(X’)としてGKGVP配列(8)を有する人工タンパク質(A1)であり、さらに好ましくは、(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3配列(19)であるポリペプチド鎖(Y’1−1)及び(GAGAGS)4配列(17)であるポリペプチド鎖(S1−1)を有する人工タンパク質(A1−1)、ポリペプチド鎖(Y’1−1)及び(GAGAGS)2配列(18)であるポリペプチド鎖(S1−2)を有する人工タンパク質(A1−2)、並びにポリペプチド鎖(Y’1−1)、ポリペプチド鎖(S1−1)及びポリペプチド鎖(S1−2)を有する人工タンパク質(A1−3)である。具体的には、下記人工タンパク質が挙げられる。
(i)GAGAGS配列(7)が4個連続した(GAGAGS)4配列(17)のポリペプチド鎖(S1−1)を12個及びGVGVP配列(1)が8個連続したポリペプチド鎖(Y1−1)中のV(バリン)のうち1個がK(リシン)に置換された(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3配列(19)(Y’1−1)を13個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)1個が化学結合した構造を有する分子質量が約70kDaの配列(21)の人工タンパク質(SELP8K、疎水性度0.618)
(ii)GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)及び(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3配列(19)のポリペプチド鎖(Y’1−1)をそれぞれ17個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約77kDaの配列(22)の人工タンパク質(SELP0K、疎水性度0.718)
(iii)GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)を16個、及びGVGVP配列(1)が16個連続したポリペプチド鎖(Y1−1)中のV(バリン)のうち1個がK(リシン)に置換された(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)11配列(20)(Y’1−2)を8個有し、これらが{(S1−2)(Y’1−2)(S1−2)}8の順で化学結合してなる分子質量が約71kDaの配列(23)の人工タンパク質(SELP415K、疎水性度0.693)
(iv)GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)を6個、GVGVP配列(1)が16個連続したポリペプチド鎖(Y1−1)中のV(バリン)のうち1個がK(リシン)に置換された(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)11配列(20)(Y’1−2)を6個、及びGAGAGS配列(7)が4個連続した(GAGAGS)4配列(17)のポリペプチド鎖(S1−1)を6個有し、これらが{(S1−2)(Y’1−2)(S1−1)}6の順で化学結合してなる分子質量が約65kDaの配列(24)の人工タンパク質(SELP815K、疎水性度0.607)
細胞接着率:1cm2当たり2.5μgの人工タンパク質(A)を有する基材を作製し、基材にMC3T3−E1細胞を播種したとき、基材に接着するMC3T3−E1細胞の割合。
細胞接着率は、疎水性度を高くすることによって高くすることができる。また、人工タンパク質(A)のアミノ酸配列中に細胞接着性のアミノ酸配列{RGD配列等}を組み込む等により、高くすることができる。
なお、「細胞接着性」とは、特定の最小アミノ酸配列が細胞のインテグリンレセプターに認識され、細胞が基材に接着しやすくなる性質を意味する(大阪府立母子医療センター雑誌、第8巻 第1号、58〜66頁、1992年)。
細胞接着性のアミノ酸配列としては、例えば、「病態生理、第9巻 第7号、527〜535頁、1990年」や「大阪府立母子医療センター雑誌、第8巻 第1号、58〜66頁、1992年」に記載されているもの等が用いられる。
<細胞接着率の測定方法>
(1)細胞接着率測定用プレートの作成
人工タンパク質(A)1mgを0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2、99.5重量%塩化ナトリウムを0.85重量%含有する:以下、PBSと記載)1mLに溶解し、さらに、PBSで希釈して、溶液(D1)〜(D4){溶液(D1)〜(D4)中の人工タンパク質(A)の濃度(μg/mL);(D1):0.01、(D2):1、(D3):10、(D4):100}を作製する。この溶液(D1)〜(D4)を96穴のポリスチレンプレート(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)中の8穴ずつにそれぞれ50μL/穴で投入し、室温(約25℃)で2時間放置する。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、PBSで100μL/穴で2回洗浄し、さらに脱イオン水100μL/穴で洗浄して、基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレート(P1)〜(P5)を作成する。
次に、細胞接着率測定用プレート(P1)〜(P5)の表面のポリペプチドによるコーティング量を測定する。Micro BCATM protein assay kit(THERMO Fisher Scientific社製)に付属のReagent A溶液:Reagent B溶液:Reagent C溶液=25:24:1の混合液(C)を得る。細胞接着測定用プレート(P1)〜(P5)の各ウェルに混合液(C)を100μL加え、37℃で2時間静置する。
2時間後に、ビシンコニン酸(BCA)とCu+とからなるキレートの生成量を、450nm(対照波長630nm)の吸光度でプレートリーダー(コロナ電気株式会社製MTP−32)を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量(μg/cm2)を得る。
血清を含まないDMEM培地を50μL/穴でプレート(P1)〜(P5)にそれぞれ添加し、37℃インキュベーター内に1時間保存する。1時間後、MC3T3−E1細胞を104cells/50μL/穴で添加し、37℃、二酸化炭素濃度5容量%のインキュベーター中にて2時間放置して培養する。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら100μL/穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去する。次にPBSを50μL/穴で添加し、さらにテトラカラーワン(生化学工業株式会社)を10μL/穴で添加して、37℃、二酸化炭素濃度5容量%のインキュベーター中に4時間放置する。
4時間後に、ホルマザン生成量(X)を、450nm(参照波長630nm)の吸光度でプレートリーダー(コロナ電気株式会社製MTP−32)を用いて測定し、それぞれ8穴分の平均データとする。
人工タンパク質(A)の代わりにフィブロネクチンを用いて比較用細胞接着率測定用プレートを作成し、上記と同様の実験を行う。比較用のプレートに播種したすべての細胞が接着したことを、顕微鏡観察で確認し、ホルマザン生成量(X0)を測定する。(X0)が細胞接着率100%であるとして、(X)及び(X0)を下記式に当てはめ、プレート(P1)〜(P5)の細胞接着率を算出する。
細胞接着率(%)=(X)/(X0)×100
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロットし、近似直線を描き、コーティング量が2.5(μg/cm2)のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とする。
水としては、滅菌されたものであれば特に限定するものではなく、滅菌方法としては、0.2μm以下の孔径を持つ精密ろ過膜を通した水、限外ろ過膜を通した水、逆浸透膜を通した水及びオートクレーブで121℃20分加熱して過熱滅菌したイオン交換水等が挙げられる。
緩衝成分としては、リン酸等有機酸やグッドバッファー等が挙げられる。
癒着防止剤中の水の含有量は、ゲル化時間の観点から、70〜95重量%が好ましく、さらに好ましくは80〜90重量%である。
癒着防止剤中の緩衝成分の含有量は、ゲル化時間の観点から、0〜50mMが好ましく、さらに好ましくは0〜10mMである。
ゲル化の観点から、塩の濃度は、0〜0.8重量%が好ましく、さらに好ましくは0.7〜0.6重量%である。
ゲル化時間は、癒着防止剤中の人工タンパク質(A)の濃度を高くしたり、人工タンパク質(A)中のアミノ酸配列(X)及びアミノ酸配列(X’)の合計個数に対するGAGAGS配列(7)の比率を大きくすることにより短くすることができる。
<ゲル化時間の測定>
癒着防止剤100μLをマイクロチュブ(2mL)に量りとり、37℃のインキュベーターに放置する。5分おきに、マイクロチューブを180度傾けて、癒着防止剤が垂れるかを確認する。癒着防止剤が垂れなくなった時間をゲル化時間とする。
添加物質としては、ゲル化時間を調整する観点や癒着防止性向上の観点から、増粘物質、架橋剤及び/又は抗炎症剤が好ましい。
癒着防止剤のゲル化時間は、下記測定法によって測定する。
○人工タンパク質(A1)含有癒着防止剤(1)の作製
特表平3−502935号公報中の実施例記載の方法に準じて、遺伝子組換え大腸菌により製造し、カラムクロマトグラフィーにて精製し、GAGAGS配列(7)が4個連続した(GAGAGS)4配列(17)のポリペプチド鎖(S1−1)を12個及びGVGVP配列(1)が8個連続したポリペプチド鎖(Y1−1)中のV(バリン)のうち1個がK(リシン)に置換された(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3配列(19)(Y’1−1)を13個有し、これらが交互に化学結合してなるものに、GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)1個が化学結合した構造を有する分子質量が約70kDaの配列(21)の人工タンパク質(SELP8K)(A1)を得た。
人工タンパク質(A1)を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ5、20、30重量%の濃度となるようにPBS:脱イオン水=7:3に溶解し、それぞれ癒着防止剤(1−1、1−2、1−3)を作製した。
○人工タンパク質(A2)含有癒着防止剤(2)の作製
実施例1と同様にして、GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)及び(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3配列(19)のポリペプチド鎖(Y’1−1)をそれぞれ17個有し、これらが交互に化学結合してなる構造を有する分子質量が約77kDaの配列(22)の人工タンパク質(SELP0K)(A2)を作製した。
人工タンパク質(A2)を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ5、20、30重量%の濃度となるようにPBS:脱イオン水=7:3に溶解し、それぞれ癒着防止剤(2−1、2−2、2−3)を作製した。
○人工タンパク質(A3)含有癒着防止剤(3)の作製
実施例1と同様にして、GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)を16個、及びGVGVP配列(1)が16個連続したポリペプチド鎖(Y11)中のV(バリン)のうち1個がK(リシン)に置換された(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)11配列(20)(Y’1−2)を8個有し、これらが{(S1−2)(Y’1−2)(S1−2)}8の順で化学結合してなる分子質量が約71kDaの配列(23)の人工タンパク質(SELP415K)(A3)を作製した。
人工タンパク質(A3)を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ5、20、30重量%の濃度となるようにPBS:脱イオン水=7:3に溶解し、それぞれ癒着防止剤(3−1、3−2、3−3)を作製した。
○人工タンパク質(A4)含有癒着防止剤(4)の作製
実施例1と同様にして、GAGAGS配列(7)が2個連続した(GAGAGS)2配列(18)のポリペプチド鎖(S1−2)を6個、GVGVP配列(1)が16個連続したポリペプチド鎖(Y11)中のV(バリン)のうち1個がK(リシン)に置換された(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)11配列(20)(Y’1−2)を6個、及びGAGAGS配列(7)が4個連続した(GAGAGS)4配列(17)のポリペプチド鎖(S1−1)を6個有し、これらが{(S1−2)(Y’1−2)(S1−1)}6の順で化学結合してなる分子質量が約65kDaの配列(24)の人工タンパク質(SELP815K)(A4)を作製した。
人工タンパク質(A4)を癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ5、20、30重量%の濃度となるようにPBS:脱イオン水=7:3に溶解し、それぞれ癒着防止剤(4−1、4−2、4−3)を作製した。
○人工タンパク質(A1)含有癒着防止剤組成物(5)の作製
実施例1と同様にして得られた人工タンパク質(A1)を癒着防止剤の重量に基づいて20重量%の濃度となるようにPBS:脱イオン水=7:3に溶解し、次いで、この溶液に粘度300〜400cpのアルギン酸ナトリウムを癒着防止剤の重量に基づいてそれぞれ0.25、1、4重量%の濃度となるように溶解し、癒着防止剤組成物(5−1、5−2、5−3)を作製した。
セプラフィルム(科研薬社製)を比較用の癒着防止剤として用いた。
ラットを開腹し、盲腸を取り出した。ラット盲腸先端部位9点(直径約1mm)をハンダゴテで焼灼した。癒着防止剤(1)〜(4)及び癒着防止剤組成物(5)100μlを焼灼部位に塗布した。また、ラット盲腸末端部も同様に焼灼し、セプラフィルムを貼り付けた。その後、閉腹した。なお、癒着防止剤1種に対して3つの試験体を作成した。
7日間後、再び開腹し、癒着度合いを評価した。癒着の評価は以下の基準で評価し、3つの試験体のそれぞれの評価結果及び3つの平均を表1に示す。
グレード1:癒着なし
グレード2:容易に剥離可能な軽度の癒着
グレード3:軽度の牽引に耐えうる程度の癒着
グレード4:重度の癒着で剥離により一部の損傷を伴う(強い脂肪の癒着)
グレード5:強い臓器の癒着
(1)細胞接着率測定用プレートの作成
実施例1〜4で得た人工タンパク質(A1)〜(A4)について、それぞれ1mgを0.02Mリン酸緩衝液(pH7.2、99.5重量%塩化ナトリウムを0.85重量%含有する:以下、PBSと記載)1mLに溶解し、さらに、PBSで希釈して、それぞれ溶液(D1)〜(D4){溶液(D1)〜(D4)中の人工タンパク質(A)の濃度(μg/mL);(D1):0.01、(D2):1、(D3):10、(D4):100}を作製した。この溶液(D1)〜(D4)を96穴のポリスチレンプレート(日本ベクトン・ディッキンソン株式会社)中の8穴ずつにそれぞれ50μL/穴で投入し、室温(約25℃)で2時間放置する。アスピレーターを用いて溶液を除去した後、PBSで100μL/穴で2回洗浄し、さらに脱イオン水100μL/穴で洗浄して、アスピレーターを用いて脱イオン水を除去して、基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレート(P1)〜(P4)を作成した。また、(A1)を実施例5で得た人工タンパク質(A1)組成物に置き換えた以外は前記基材の表面にポリペプチドを有する細胞接着率測定用プレートと同様にして(P5)を作成した。
次に、細胞接着率測定用プレート(P1)〜(P5)の表面のポリペプチドによるコーティング量を測定した。Micro BCATM protein assay kit(THERMO Fisher Scientific社製)に付属のReagent A溶液:Reagent B溶液:Reagent C溶液=25:24:1の混合液(C)を得た。細胞接着測定用プレート(P1)〜(P5)の各ウェルに混合液(C)を100μL加え、37℃で2時間静置した。
2時間後に、ビシンコニン酸(BCA)とCu+とからなるキレートの生成量を、450nm(対照波長630nm)の吸光度でプレートリーダー(コロナ電気株式会社製MTP−32)を用いて測定し、あらかじめウシ血清アルブミンにより作成した検量線からコーティング量(μg/cm2)を得た。
血清を含まないDMEM培地を50μL/穴でプレート(P1)〜(P5)にそれぞれ添加し、37℃インキュベーター内に1時間保存する。1時間後、MC3T3−E1細胞(DSファーマバイオメディカル(株)製)を104cells/50μL/穴で添加し、37℃、二酸化炭素濃度5容量%のインキュベーター中にて2時間放置して培養した。
培養終了後、アスピレーターを用いて培地を除去し、生理食塩水を細胞に直接当たらないように注意しながら100μL/穴で添加し、アスピレーターを用いて生理食塩水を除去した。次にPBSを50μL/穴で添加し、さらにテトラカラーワン(生化学工業株式会社)を10μL/穴で添加して、37℃、二酸化炭素濃度5容量%のインキュベーター中に4時間放置した。
4時間後に、ホルマザン生成量(X)を、450nm(参照波長630nm)の吸光度でプレートリーダー(コロナ電気株式会社製MTP−32)を用いて測定し、それぞれ8穴分の平均データとした。
人工タンパク質(A)の代わりにフィブロネクチン(和光純薬工業(株)製、品名「フィブロネクチン溶液」)を用いて比較用細胞接着率測定用プレートを作成し、上記と同様の実験を行った。比較用のプレートに播種したすべての細胞が接着したことを、顕微鏡観察で確認し、ホルマザン生成量(X0)を測定した。(X0)が細胞接着率100%であるとして、(X)及び(X0)を下記式に当てはめ、プレート(P1)〜(P5)の細胞接着率を算出した。
細胞接着率(%)=(X)/(X0)×100
得られた細胞接着率と、プレート表面のコーティング量をプロット(図1)し、近似直線を描き、コーティング量が2.5(μg/cm2)のときの細胞接着率を、上記の細胞接着率とした。結果を表2に示す。
実施例1〜5で得た癒着防止剤(1)〜(4)及び癒着防止剤組成物(5)をそれぞれ100μL、マイクロチュブ(2mL)に量りとり、37℃のインキュベーターに入れた。5分おきに、マイクロチューブを180度傾けて、癒着防止剤が垂れるかを確認した。癒着防止剤が垂れなくなった時間をゲル化時間とした。1つの癒着防止剤について、3つのサンプルを作成し、実験を行った。3つのサンプルのゲル化時間及び平均値を表3に示す。
Claims (11)
- 人工タンパク質(A)及び水を含む癒着防止剤であって、
(A)が、GVGVP配列(1)、PGVGV(2)、VPGVG(3)、GVPGV配列(4)、VGVPG配列(5)、GPP配列、GAP配列及びGAHGPAGPK配列(6)のうちいずれか1種のアミノ酸配列(X)が2〜200個連続したポリペプチド鎖(Y)並びに/又は下記ペプチド鎖(Y’)を有し、
(A)中に含まれる下記アミノ酸配列(X’)の合計個数が1〜20個であり、
(A)の疎水性度が0.2〜1.2である癒着防止剤。
アミノ酸配列(X’):アミノ酸配列(X)の全アミノ酸の個数のうち20〜40%がそれぞれリシン又はアルギニンで置換されたアミノ酸配列。
ペプチド鎖(Y’):アミノ酸配列(X)とアミノ酸配列(X’)とが合計2〜200個結合したポリペプチド鎖。 - 人工タンパク質(A)が、さらにGAGAGS配列(7)が2〜50個連続して結合したポリペプチド鎖(S)を有する請求項1に記載の癒着防止剤。
- 人工タンパク質(A)1分子中の、GAGAGS配列(7)の個数とアミノ酸配列(X)及び下記アミノ酸配列(X’)の合計個数との比率(GAGAGS配列(7):アミノ酸配列(X)及び(X’)の合計)が、1:2〜1:20である請求項1又は2に記載の癒着防止剤。
- 人工タンパク質(A)のSDS−PAGE(SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動)法による分子量が15〜200kDaである請求項1〜3のいずれかに記載の癒着防止剤。
- 人工タンパク質(A)が、GVGVP配列(1)であるアミノ酸配列(X)と、GVGVP配列(1)中のアミノ酸がリシンで置換されたアミノ酸配列(X’1)とを有する人工タンパク質(A1)である請求項1〜4のいずれかに記載の癒着防止剤。
- 人工タンパク質(A)が、(GAGAGS)4配列(17)であるポリペプチド鎖(S1−1)と(GVGVP)4GKGVP(GVGVP)3配列(19)であるポリペプチド鎖(Y’1−1)とを有する人工タンパク質(A11)である請求項1〜5のいずれかに記載の癒着防止剤。
- 人工タンパク質(A)の下記細胞接着率が0〜20%である請求項1〜6のいずれかに記載の癒着防止剤。
細胞接着率:1cm2当たり2.5μgの人工タンパク質(A)を有する基材を作成し、基材にMC3T3−E1細胞を播種したとき、基材に接着するMC3T3−E1細胞の割合。 - 癒着防止剤が、癒着防止剤中の人工タンパク質(A)の含有量が5〜30重量%であり、水の含有量が70〜95重量%である請求項1〜7のいずれかに記載の癒着防止剤。
- 37℃で500分以内にゲル化する請求項1〜8のいずれかに記載の癒着防止剤。
- 請求項1〜9のいずれかに記載の癒着防止剤と、添加物質とを含む癒着防止剤組成物。
- 添加物質が、増粘物質、架橋剤及び/又は抗炎症剤である請求項10に記載の癒着防止剤組成物。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2015032808A JP6498961B2 (ja) | 2014-02-27 | 2015-02-23 | 癒着防止剤及び癒着防止剤組成物 |
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2014036456 | 2014-02-27 | ||
JP2014036456 | 2014-02-27 | ||
JP2015032808A JP6498961B2 (ja) | 2014-02-27 | 2015-02-23 | 癒着防止剤及び癒着防止剤組成物 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2015177968A true JP2015177968A (ja) | 2015-10-08 |
JP6498961B2 JP6498961B2 (ja) | 2019-04-10 |
Family
ID=54262463
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2015032808A Active JP6498961B2 (ja) | 2014-02-27 | 2015-02-23 | 癒着防止剤及び癒着防止剤組成物 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP6498961B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018000957A (ja) * | 2016-06-27 | 2018-01-11 | 三洋化成工業株式会社 | 体液漏出防止剤 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03500498A (ja) * | 1988-04-21 | 1991-02-07 | ユーエービー リサーチ ファウンデイション | 創傷治療部位における癒着の発生からの保護に適するバイオエラストマー材料 |
JPH09509840A (ja) * | 1994-03-03 | 1997-10-07 | プロテイン ポリマー テクノロジーズ,インコーポレイティド | 酵素架橋できる基質を含んで成る生成物 |
JPH11502537A (ja) * | 1995-05-05 | 1999-03-02 | プロテイン ポリマー テクノロジーズ インコーポレイテッド | 合成架橋を用いる組織接着剤 |
WO2012111438A1 (ja) * | 2011-02-18 | 2012-08-23 | 国立大学法人京都大学 | 組織再生用材料、これを含むタンパク質水溶液及びこれをゲル化させる方法 |
JP2013176547A (ja) * | 2012-02-02 | 2013-09-09 | Sanyo Chem Ind Ltd | 組織再生用材料及び組織再生用タンパク質溶液 |
JP2013208425A (ja) * | 2012-02-28 | 2013-10-10 | Sanyo Chem Ind Ltd | 組織再生用ゲル、組織再生用タンパク質溶液及び組織再生用ゲルの製造方法 |
JP2013249272A (ja) * | 2012-05-31 | 2013-12-12 | Sanyo Chem Ind Ltd | 皮膚弾性向上材及び皮膚弾性向上用タンパク質溶液 |
-
2015
- 2015-02-23 JP JP2015032808A patent/JP6498961B2/ja active Active
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPH03500498A (ja) * | 1988-04-21 | 1991-02-07 | ユーエービー リサーチ ファウンデイション | 創傷治療部位における癒着の発生からの保護に適するバイオエラストマー材料 |
JPH09509840A (ja) * | 1994-03-03 | 1997-10-07 | プロテイン ポリマー テクノロジーズ,インコーポレイティド | 酵素架橋できる基質を含んで成る生成物 |
JPH11502537A (ja) * | 1995-05-05 | 1999-03-02 | プロテイン ポリマー テクノロジーズ インコーポレイテッド | 合成架橋を用いる組織接着剤 |
WO2012111438A1 (ja) * | 2011-02-18 | 2012-08-23 | 国立大学法人京都大学 | 組織再生用材料、これを含むタンパク質水溶液及びこれをゲル化させる方法 |
JP2013176547A (ja) * | 2012-02-02 | 2013-09-09 | Sanyo Chem Ind Ltd | 組織再生用材料及び組織再生用タンパク質溶液 |
JP2013208425A (ja) * | 2012-02-28 | 2013-10-10 | Sanyo Chem Ind Ltd | 組織再生用ゲル、組織再生用タンパク質溶液及び組織再生用ゲルの製造方法 |
JP2013249272A (ja) * | 2012-05-31 | 2013-12-12 | Sanyo Chem Ind Ltd | 皮膚弾性向上材及び皮膚弾性向上用タンパク質溶液 |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2018000957A (ja) * | 2016-06-27 | 2018-01-11 | 三洋化成工業株式会社 | 体液漏出防止剤 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JP6498961B2 (ja) | 2019-04-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6159359B2 (ja) | 自己組織化ペプチドおよび高強度ペプチドゲル | |
JP5833096B2 (ja) | 両親媒性直鎖状ペプチド/ペプトイドおよびそれを含むヒドロゲル | |
JP4766528B2 (ja) | 自己組織化ペプチドおよびそれより得られるゲル | |
Echalier et al. | Sol–gel synthesis of collagen-inspired peptide hydrogel | |
Luo et al. | Self‐organization of a chiral D‐EAK16 designer peptide into a 3D nanofiber scaffold | |
Liu et al. | Versatile engineered protein hydrogels enabling decoupled mechanical and biochemical tuning for cell adhesion and neurite growth | |
Qi et al. | Novel mussel-inspired universal surface functionalization strategy: protein-based coating with residue-specific post-translational modification in vivo | |
Li et al. | Protein-cross-linked hydrogels with tailored swelling and bioactivity performance: A comparative study | |
JP6498961B2 (ja) | 癒着防止剤及び癒着防止剤組成物 | |
JP6084352B2 (ja) | 高強度ペプチドゲル | |
Liu et al. | Functionalized self-assembled peptide RAD/Dentonin hydrogel scaffold promotes dental pulp regeneration | |
JP6912953B2 (ja) | 体液漏出防止剤 | |
JP2013176547A (ja) | 組織再生用材料及び組織再生用タンパク質溶液 | |
CN108948208A (zh) | 一种可注射自修复水下蛋白及其用途 | |
ES2595208T3 (es) | Biopolímero termosensible y bioactivo y método de recolección celular asociado | |
JP6982395B2 (ja) | インターロイキン10の産生量増加剤 | |
JP5860268B2 (ja) | 化学修飾した細胞接着性ポリペプチド | |
JP6058367B2 (ja) | インプラント用コーティング剤、インプラント及びインプラントの製造方法 | |
US20100159597A1 (en) | Cell culture membrane, cell culture kit, porous material, production method for cell culture membrane and production method for porous material | |
JP2017186264A (ja) | タンパク質組成物 | |
El Yaagoubi et al. | Peptoid self-assembly and opportunities for creating protein-mimetic biomaterials and biointerfaces | |
JP2018000861A (ja) | 細胞移植用組成物及びそれを含む細胞移植用溶液 | |
JP7142310B2 (ja) | フィブリノゲンフラグメントとラミニンフラグメントを含むキメラタンパク質およびその利用 | |
Azam | Engineering Advanced Materials using Type III Secretion in Salmonella enterica | |
JP2009051773A (ja) | 細胞接着能を有するhsp70ファミリータンパク質 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20171130 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20181002 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20181129 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20190312 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20190314 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6498961 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |