JP2024508694A - バクテリオファージリシン、そのキメラおよびその使用 - Google Patents
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Abstract
キューティバクテリウム・アクネスによって引き起こされるざ瘡若しくは感染症、またはキューティバクテリウム・アクネスに関連する疾患を予防、治療または改善するための医薬品、化粧品、または治療装置の製造における、バクテリオファージリシンまたはバクテリオファージリシンキメラの使用が提供される。また、バクテリオファージリシンキメラが提供される。【選択図】図１
Description
本出願は、以下の優先権を主張する：中国特許出願ＣＮ２０２１１０１８７０３０．８、出願日２０２１年２月８日。
本発明は、医学生物学の分野に関し、具体的には、抗キューティバクテリウム・アクネス活性を有するバクテリオファージリシン、そのキメラおよび使用を提供する。
ざ瘡は、皮膚、特に顔、首、肩、胸、背中および上腕の炎症性疾患である。毛包脂腺ユニットは、過剰な油分分泌での詰まりおよび病原性キューティバクテリウム・アクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、略称Ｃ．ａｃｎｅｓ、以下同じ）の増殖に起因する死んだ皮膚細胞の蓄積のため炎症を起こす。国立衛生研究所によると、１１歳から３０歳までの人々の８０％がある程度のざ瘡を有する。ざ瘡は通常、思春期に始まり、４０代および５０代まで続き得る。ストレス、ホルモンレベルにおける変化、アレルゲンなどの、さまざまな要因が、ざ瘡の発生を引き起こし得る。２０１０年の世界疾病負担調査は、ざ瘡は、世界人口の９．４％に影響を及ぼし、世界で８番目に蔓延している疾患としてランク付けられると推定した。米国皮膚科学会は、２０１３年において、ざ瘡患者を治療する費用および生産性の低下は１２億ドルを超えていると推定した。それ自体、生命を脅かすことはめったにないが、それは、皮膚上の長続きする傷跡および患者にとっての相当な精神的苦痛を引き起こし得る。
軽度のざ瘡を治療するための現在の選択肢は、過酸化ベンゾイル、レゾルシノール、サリチル酸、および硫黄などの化学物質を含有する市販の局所薬、並びに抗生物質、過酸化ベンゾイル、ノニル二酸、ダプソン、コルチコステロイド、レチノイド（ｒｅｔｉｎｏｉｄ）と呼ばれるビタミンＡ誘導体などの処方箋による局所薬の使用である。中等度から重度の疾患は、処方箋による局所薬または経口薬で治療することができる。介入の目的は、死んだ皮膚細胞および余分な油分を除去して毛包脂腺ユニットの詰まりを取り除き、細菌の負荷を低下させることである。ざ瘡は慢性疾患であるため、長期間の治療およびときどき再発の予防を必要とする。しかしながら、既存の治療選択肢はいずれも、長期治療に適していない。これらの薬を長期間使用すると、たとえ最も穏やかな化学物質でさえ、アレルギー反応および皮膚の刺激を引き起こし、乾燥、剥離、ひび割れなどを引き起こし得る。抗生物質治療の選択肢は、耐性菌であるキューティバクテリウム・アクネスが世界でより蔓延しているため、ますます限られている。さらに、慢性的な抗生物質の使用は、耐性菌種に選択圧を及ぼすことにより微生物叢の恒常性を乱すことが示されている。これは、腸内毒素症および免疫異常などの無数の合併症につながる。文献において、ざ瘡患者の皮膚のブドウ球菌叢が、抗生物質治療中に、ほとんど抗生物質感受性からほぼ耐性に変化することが示されている。患者自身だけでなく、患者の濃厚接触者もまた、多剤耐性菌によって影響を受ける。注目すべきことに、長期の抗生物質治療を受けたざ瘡患者は、呼吸器感染症を発症する可能性が２倍高かった。従って、より安全で、より効果的で、長期使用により適した治療選択肢が、緊急に必要とされている。そのようなアプローチの１つは、抗生物質耐性に関係なく、他の共生細菌に影響を与えることなくキューティバクテリウム・アクネスを特異的に死滅させる病原体特異的抗菌剤である。
さらに、キューティバクテリウム・アクネスは、術後の肩感染症および椎間板感染症を含む、広範な侵襲性感染症と関連している。そのような感染症の中で、キューティバクテリウム・アクネスは、ゆっくりと進行するバイオフィルム様感染症を示す。バイオフィルム中で見られる細菌は、本質的に抗生物質に対して耐性である。強い抗バイオフィルム特性を有するキューティバクテリウム・アクネス抗菌剤は、そのような感染症の治療に理想的である。
病原体特異的抗菌剤についての代替品は、バクテリオファージエンドリシンである。バクテリオファージは、これらの酵素を使用して細胞壁を不安定にして溶解し、細胞の内部からバクテリオファージの子孫を放出する。それらは、細菌ペプチドグリカンにおけるさまざまな結合を切断するペプチドグリカン加水分解酵素として分類される。ごくわずかな例外を除いて、各リシンは、単一の属または種に属する細菌を標的とする。グラム陽性菌に対する組換えリシンは、低張溶解を引き起こすことができる効果的な殺菌剤であることが示されている（例えばいくつかの連鎖球菌に対するＰｌｙＣ、炭疽菌に対するＰｌｙＧ等）。リシンが細胞への感染を成功させ続けるために何十億年にもわたって選択的進化圧力下にあったことを考えると、目的のペプチドグリカン結合は、高度に保存されており、細菌によって容易に変更されそうにない。この特性により、標的細菌がリシンに対する耐性を発現する可能性がほとんどないため、それは、長期の治療用途に適している。それぞれのバクテリオファージリシンに対する細菌耐性は、これまでのところ検出されていない。一般に、グラム陽性菌に対するリシンは、１つまたは２つのＮ末端触媒ドメイン（ＣＤ）およびＣ末端細胞壁結合ドメイン（ＢＤ）で構成され、ドメイン間には異なる長さのリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）がある。リシンは、モジュール式タンパク質であり、キメラリシンは、異なるリシンからの触媒ドメインおよび結合ドメインを組み合わせることによって作製することができる。リンカーもまた、長さおよび配列において可変である。しかしながら、抗菌剤としてのリシンの開発における主なボトルネックは、高活性リシンを可溶性発現できないことである。実際、これまでのところ、高レベルの可溶性発現を有し、キューティバクテリウム・アクネスを効果的に死滅させるリシンは、報告されていない。
中国特許出願公開ＣＮ１０２４８２６５５Ａは、グラム陽性菌の細胞壁を分解する活性を有するエンドリシン、およびＮ末端若しくはＣ末端または両端でエンドリシンに融合した両親媒性ペプチドセグメントで構成され、グラム陽性菌感染症の治療または予防に、診断手段としてまたは化粧品物質として使用することができる抗菌剤を開示する。しかしながら、該特許は、ＰＡ６が抗Ｐ．ａｃｎｅｓ ＤＳＭＺ１８９７株およびＤＳＭＺ１６３７９株活性を有することを記載するが、初期ｃｆｕ／ｍＬを提供せず；さらに、ＰＡ６は、可溶性発現レベルを増加させるという問題を解決することができない。
要約すると、キューティバクテリウム・アクネスに対する新たな治療法が強く求められていることは明らかであるが、これまでのところ、工業規模での生産に適した高いキューティバクテリウム・アクネス殺傷活性を有するバクテリオファージリシンは、報告されていない。他の共生細菌を無傷のまま残しながら、キューティバクテリウム・アクネスを特異的かつ効率的に死滅させるバクテリオファージリシンの能力は、腸内毒素症および耐性獲得の高いリスクなく、長期使用に安全で効果的なざ瘡解決策を提供し得る。
発明の内容
上記の技術的状況を目指して、本発明は、抗キューティバクテリウム・アクネス活性を有するバクテリオファージリシン、そのキメラおよび使用を提供する。本発明の詳細は以下のとおりである。
上記の技術的状況を目指して、本発明は、抗キューティバクテリウム・アクネス活性を有するバクテリオファージリシン、そのキメラおよび使用を提供する。本発明の詳細は以下のとおりである。
本発明は、キューティバクテリウム・アクネスによって引き起こされるざ瘡若しくは感染症、またはキューティバクテリウム・アクネスに関連する疾患を予防、治療または改善するための医薬品、化粧品、または医療装置の製造におけるバクテリオファージリシンまたはそのキメラの使用を提供し、該バクテリオファージリシンは、ノカルディオ科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）またはプロピオニバクテリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌由来のバクテリオファージリシンを含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、ノカルディオ科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）細菌は、ミクロプルイナ属（Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ）、プロピオニシモナス属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ）、プロピオニシセラ属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ）、フリードマンニエラ属（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ）細菌を含み；プロピオニバクテリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌は、プロピオニフェラクス属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｆｅｒａｘ）、マリニルテコッカス属（Ｍａｒｉｎｉｌｕｔｅｉｃｏｃｃｕｓ）、グラヌリコッカス属（Ｇｒａｎｕｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ナウマンネラ属（Ｎａｕｍａｎｎｅｌｌａ）、プロピオニシクラバ属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ）、オーラティコッカス属（Ａｕｒａｔｉｃｏｃｃｕｓ）、ミクロルナタス属（Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ）、エストゥアリイミクロビウム属（Ａｅｓｔｕａｒｉｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、ルテオコッカス属（Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、テサラコッカス属（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ブルックローニア属（Ｂｒｏｏｋｌａｗｎｉａ）、プロピオニミクロビウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キューティバクテリウム属（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム属（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはシュードプロピオニバクテリウム属（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌、好ましくはプロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キューティバクテリウム属（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム属（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはシュードプロピオニバクテリウム属（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌を含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、バクテリオファージリシンは、キューティバクテリウム・アクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、プロピオニバクテリウム・ヒューメルシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｅｒｕｓｉｉ）、キューティバクテリウム・アビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）、キューティバクテリウム・グラヌロサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム・トエニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・ジェンセニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、エストゥアリイミクロビウム・クァンヤンゲンセ（Ａｅｓｔｕａｒｉｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｋｗａｎｇｙａｎｇｅｎｓｅ）、グラヌリコッカス・フェノリボランス（Ｇｒａｎｕｌｉｃｏｃｃｕｓ ｐｈｅｎｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、ミクロルナタス・フォスフォボラス（Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｕｓ）、シュードプロピオニバクテリウム・プロピオニカム（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、テサラコッカス属の種（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、プロピオニシセラ・スーパーファンディア（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ ｓｕｐｅｒｆｕｎｄｉａ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ亜種フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ亜種シャーマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディファシエンス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロピオニバクテリウム・リンフォフィラム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ）、プロピオニバクテリウム属の細菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属の種オーラルタクソン１９２（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １９２）、プロピオニフェラクス・イノキュア（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｆｅｒａｘ ｉｎｎｏｃｕａ）、ナウマンネラ・ハロトレランス（Ｎａｕｍａｎｎｅｌｌａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、プロピオニシクラバ・タルダ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ ｔａｒｄａ）、ミクロプルイナ・グリコジェニカ（Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ ｇｌｙｃｏｇｅｎｉｃａ）、プロピオニシモナス・パルディコラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）、オーラティコッカス・、モニュメンティ（Ａｕｒａｔｉｃｏｃｃｕｓ ｍｏｎｕｍｅｎｔｉ）、ルテオコッカス・ジャポニカス（Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、テサラコッカス・オレイアグリ（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｉａｇｒｉ）、テサラコッカス・ベンディゴエンシス（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｂｅｎｄｉｇｏｅｎｓｉｓ）、テサラコッカス・ラピディカプタス（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｌａｐｉｄｉｃａｐｔｕｓ）、アシディプロピオニバクテリウム・ミクロアエロフィラム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム・オリバエ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｌｉｖａｅ）、アシディプロピオニバクテリウム・ダムノサム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｎｏｓｕｍ）由来のバクテリオファージリシンを含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、バクテリオファージリシンは、アシディプロピオニバクテリウム・ジェンセニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・トエニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・ミクロアエロフィラム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム・オリバエ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｌｉｖａｅ）、アシディプロピオニバクテリウム・ダムノサム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｎｏｓｕｍ）、キューティバクテリウム・アクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、キューティバクテリウム・アビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）、キューティバクテリウム・グラヌロサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）、シュードプロピオニバクテリウム・プロピオニカム（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のバクテリオファージリシンを含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、バクテリオファージリシンは、配列番号１～配列番号２８のいずれか一つに示すアミノ酸配列を有する；
本発明の使用において、実施態様の１つとして、バクテリオファージリシンは、配列番号２９～配列番号５６のいずれか一つに示すヌクレオチド配列を有する；
本発明の使用において、実施態様の１つとして、バクテリオファージリシンは好ましくは、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有するＰＡＣＬ１０を有する；
本発明の使用において、実施態様の１つとして、バクテリオファージリシンは好ましくは、配列番号３８に示すヌクレオチド配列を有するＰＡＣＬ１０である。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラは、バクテリオファージリシン由来の触媒ドメイン、またはバクテリオファージリシン由来の触媒ドメインおよび結合ドメインの組合せを含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、触媒ドメインは、完全なＣ末端リンカーを有するか、半分のＣ末端リンカーを有するか、Ｃ末端リンカーを有さないか、または該リンカーの任意の部分を有し；結合ドメインは、完全なＮ末端リンカーを有するか、半分のＮ末端リンカーを有するか、Ｎ末端リンカーを有さないか、または該リンカーの任意の部分を有する。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、合成リンカーを使用し得、これはまた、合成リンカーを含む。バクテリオファージリシンに由来する可能なリンカーの非限定的な例を、以下の表３に示す。合成リンカーの非限定的な例については、以下の表４を参照されたい。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラは、異なるバクテリオファージリシン由来の触媒ドメインおよび結合ドメインを対にすることによって形成される。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラは、結合ドメインなしに、１つまたは２つの触媒ドメインを含む；
実施態様の１つとして、キメラは、１つ以上の触媒ドメインおよび１つ以上の結合ドメインを含む；
実施態様の１つとして、キメラは、単一の結合ドメインに接続された１つ以上の触媒ドメインであり得る；
実施態様の１つとして、キメラは、単一の結合ドメインに接続された単一の触媒ドメインであり得る；
実施態様の１つとして、キメラは、リシンのＣ末端における単一の結合ドメインに連結されたリシンのＮ末端における単一の触媒ドメインであり得る。
さらに、１つ以上の触媒ドメインを、結合ドメインの非存在下で使用し得る。さらに、検出などの特殊な使用については、１つ以上の結合ドメインを、触媒ドメインの非存在下で使用して、検出を容易にするために異なる分子に融合させることができる。そのような分子は、ビオチン、フラグタグ、ｍｙｃタグ、アビジン、ストレプトアビジン、オボアルブミン、ホタルルシフェラーゼ、ビオチン、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒなどの蛍光分子を含むが、これらに限定されない。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラはさらに、触媒ドメインと結合ドメインとの間にリンカーを含み、該リンカーは：
１）該触媒ドメインが由来する親リシン分子に由来するリンカー領域またはその任意の部分；
本発明の使用において、実施態様の１つとして、親リシン分子由来のリンカー領域は、配列番号３４３～配列番号３６７のいずれか一つに示すアミノ酸配列を有する。
１）該触媒ドメインが由来する親リシン分子に由来するリンカー領域またはその任意の部分；
本発明の使用において、実施態様の１つとして、親リシン分子由来のリンカー領域は、配列番号３４３～配列番号３６７のいずれか一つに示すアミノ酸配列を有する。
２）該結合ドメインが由来する親リシン分子に由来するリンカー領域またはその任意の部分；
本発明の使用において、実施態様の１つとして、親リシン分子由来のリンカー領域は、配列番号３６８～配列番号３９２に示すいずれかのヌクレオチド配列を有する；または
本発明の使用において、実施態様の１つとして、親リシン分子由来のリンカー領域は、配列番号３６８～配列番号３９２に示すいずれかのヌクレオチド配列を有する；または
３）配列番号３９３～配列番号４０６のいずれか一つに示すアミノ酸配列、若しくは（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇｌｙ）３－８、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡのアミノ酸配列（式中、１≦ｎ≦１５であり、ｎは、整数である）を有する合成リンカードメイン、例示的な説明として、ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４または１５であり得る
を含む。
を含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラは、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３５、または配列番号１３６に示すアミノ酸配列を有する触媒ドメインを含み；
結合ドメインは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２４，配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３７、配列番号１３８または配列番号１３９に示すアミノ酸配列を有する。
結合ドメインは、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２４，配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３７、配列番号１３８または配列番号１３９に示すアミノ酸配列を有する。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、触媒ドメインは、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２１９に示すヌクレオチド配列を有し；
結合ドメインは、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１９２、配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２０、配列番号２２１、または配列番号２２２に示すヌクレオチド配列を有する。
結合ドメインは、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１９２、配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２０、配列番号２２１、または配列番号２２２に示すヌクレオチド配列を有する。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラは、配列番号２２３～配列番号２８２のいずれか一つに示すアミノ酸配列；好ましくは、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２７１または配列番号２７２に示すアミノ酸配列；より好ましくは、配列番号２６０または配列番号２７１に示すアミノ酸配列を有する；
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラは、配列番号２８３～配列番号３４２のいずれか一つに示すヌクレオチド配列；好ましくは、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３２９または配列番号３３０に示すヌクレオチド配列；より好ましくは、配列番号３１８または配列番号３２９に示すヌクレオチド配列を有する。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キューティバクテリウム・アクネスによって引き起こされる感染症は、侵襲性感染症、術後感染症および／または器具関連感染症を含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、器具関連感染症は、人工関節、シャントチューブおよび人工心臓弁－関連感染症を含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、感染症は、骨および／または関節感染症、特に術後肩感染症、並びに口腔、眼、椎間板および脳感染症を含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キューティバクテリウム・アクネスに関連する疾患は、癌性前立腺炎、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、ざ瘡、膿痂疹、肥大、骨炎）症候群、サルコイドーシス、または坐骨神経痛を含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、医療装置は、リシン若しくはそのキメラを患部に放出するための任意の装置、好ましくは皮膚表面に適用されるクランプ若しくはパッチまたはスプレー、リシン若しくはそのキメラの皮膚浸透を増強するためのマイクロニードルを使用する装置、リシン若しくはそのキメラを特にざ瘡の影響を受けた毛包に適用するために美容専門家によって使用される微細針、または他の類似の装置を含む。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、医療装置は、リシンまたはそのキメラを、キューティバクテリウム・アクネス感染症を受けやすい位置に固定化する補綴装置、好ましくは特にキューティバクテリウム・アクネス感染症を受けやすい肩の手術に使用される補綴インプラントを含む。
本発明はまた、前述の使用において記載したバクテリオファージリシンキメラを提供する。実施態様の１つとして、キメラは、配列番号２２３～配列番号２８２のいずれか一つに示すアミノ酸配列；好ましくは、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２７１または配列番号２７２に示すアミノ酸配列；より好ましくは、配列番号２６０または配列番号２７１に示すアミノ酸配列を有する。
本発明の使用において、実施態様の１つとして、キメラは、配列番号２８３～配列番号３４２のいずれか一つに示すヌクレオチド配列；好ましくは、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３２９または配列番号３３０に示すヌクレオチド配列；より好ましくは、配列番号３１８または配列番号３２９に示すヌクレオチド配列を有する。
本発明はまた、
（１）ドメイン配列、およびドメイン配列を増幅するためのプライマーを合成すること；
（２）ドメイン配列を増幅するためにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲを使用すること；
（３）ＰＣＲ産物をゲル精製し、発現プラスミドｐＥＴ２８と連結すること；
（４）組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入すること；
（５）キメラを得るために、該組換えプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養し、発現を誘導し、遠心分離により細胞を収集し、溶解し、および精製すること
を含む、前述のキメラを製造する方法を提供する。
（１）ドメイン配列、およびドメイン配列を増幅するためのプライマーを合成すること；
（２）ドメイン配列を増幅するためにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲを使用すること；
（３）ＰＣＲ産物をゲル精製し、発現プラスミドｐＥＴ２８と連結すること；
（４）組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入すること；
（５）キメラを得るために、該組換えプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養し、発現を誘導し、遠心分離により細胞を収集し、溶解し、および精製すること
を含む、前述のキメラを製造する方法を提供する。
本発明の製造方法において、実施態様の１つとして、該方法はさらに：
組換えキメラリシン発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養を続けること。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で再懸濁し、高圧下で均一に溶解すること。可溶性の粗溶解物を収集するために、溶解物を再び遠心分離すること。可溶性画分を等量の５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物を疎水性カラム上にロードすること。サンプルロード後、カラムをカラム容量の５倍の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄すること。次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で組換えキメラリシンを溶出すること
を含む。あるいは、発現および精製は、当業者によって最適化することができ、リシンを、異なる温度、通気および誘導時間で異なる濃度のＩＰＴＧを使用して、ＬＢ中で発現させることができる。細胞を、さまざまな緩衝液中で再懸濁して溶解度を高め、機械的または化学的手段によって溶解することができる。さまざまなタンパク質クロマトグラフィー法を、リシンを精製するために使用することができる。これらの変数は、より良好なリシンタンパク質収量のために最適化することができる。
組換えキメラリシン発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養を続けること。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で再懸濁し、高圧下で均一に溶解すること。可溶性の粗溶解物を収集するために、溶解物を再び遠心分離すること。可溶性画分を等量の５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物を疎水性カラム上にロードすること。サンプルロード後、カラムをカラム容量の５倍の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄すること。次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で組換えキメラリシンを溶出すること
を含む。あるいは、発現および精製は、当業者によって最適化することができ、リシンを、異なる温度、通気および誘導時間で異なる濃度のＩＰＴＧを使用して、ＬＢ中で発現させることができる。細胞を、さまざまな緩衝液中で再懸濁して溶解度を高め、機械的または化学的手段によって溶解することができる。さまざまなタンパク質クロマトグラフィー法を、リシンを精製するために使用することができる。これらの変数は、より良好なリシンタンパク質収量のために最適化することができる。
本発明はまた、抗生物質、他のリシン、または不活性賦形剤をさらに含む、キメラを含有する製剤を提供する。
本発明はまた、前述のキメラをコードするアミノ酸配列、または該配列と８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、若しくは９９％以上の類似性を有するアミノ酸配列、または同じ官能基を有する代替アミノ酸配列を提供する。例示的な例として、本発明はまた、前述の配列と８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の類似性を有するアミノ酸配列を提供する。
実施態様の１つとして、代替アミノ酸配列は、同じアミノ酸群中のアミノ酸を使用する保存的置換であり、該アミノ酸群は：
脂肪族：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
ヒドロキシルまたは硫黄／セレンを含む：セリン、システイン、スレオニン、メチオニン；
環状：プロリン；
芳香族：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；
塩基性：ヒスチジン、リジン、アルギニン；
酸性およびそのアミド：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン
を含む。
脂肪族：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン；
ヒドロキシルまたは硫黄／セレンを含む：セリン、システイン、スレオニン、メチオニン；
環状：プロリン；
芳香族：フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン；
塩基性：ヒスチジン、リジン、アルギニン；
酸性およびそのアミド：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン
を含む。
本発明はまた、前述のキメラをコードするヌクレオチド配列、またはその同義コドン配列を提供する。
本発明はまた、ＰＣＲベースのキットを使用するＤＮＡ抽出およびタイピングのための細菌溶解用の試薬としての前述のキメラの使用を提供する。
本発明はまた、プランクトン形態またはバイオフィルム中のキューティバクテリウム・アクネスを除去する、好ましくは外科的処置中に外科用装置または補綴インプラント装置を消毒することによって感染症を予防するための、非生物学的表面上の消毒剤または滅菌剤としての前述のキメラの使用を提供する。
本発明はまた、キューティバクテリウム・アクネス用診断ツールの製造における、前述のキメラ、該キメラ中の単一の結合ドメイン、または該キメラ中の類似の若しくは異なる結合ドメインの一連の組合せの使用であって、該リシン、キメラまたは結合ドメインが、検出マーカーと組み合わせて使用される、使用を提供する。
実施態様の１つとして、リシン、キメラまたは結合ドメインおよびシグナル分子は、遺伝子融合または化学的カップリングを通して融合体を形成する。
実施態様の１つとして、融合体は、顕微鏡スライド上のキューティバクテリウム・アクネスを蛍光または他の手段によって直接検出するために、免疫組織化学によってキューティバクテリウム・アクネスを標識するために、ＥＬＩＳＡアッセイにおける検出試薬として、ウエスタンブロットにおける検出試薬として、ＭＡＣＳまたは他のプルダウンアッセイにおける磁気ビーズへの付着のために、または抗体が検出試薬として使用されるアッセイにおける検出試薬として、使用される。実施態様の１つとして、シグナル分子は、タンパク質または化学蛍光色素、タンパク質タグ、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、オボアルブミン、ビオチン、クリック化学標識感受性タグ、インテイン、またはシグナルを生成する二次タンパク質若しくは分子の動員を引き起こし得る他の分子を含み、ここで、
該蛍光色素は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ３またはＣｙ５を含み；
該タンパク質タグは、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、ｈａｌｏタグ、ｈｉｓタグ、または抗体若しくは他の高親和性分子と結合してシグナルを生成し得る任意の他のタグを含み；
該酵素は、ホタルルシフェラーゼ、β－ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、または光、色の変化、基質の沈着、若しくは試験中に検出することができる他の反応を引き起こす任意の他の酵素を含む。
該蛍光色素は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ３またはＣｙ５を含み；
該タンパク質タグは、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、ｈａｌｏタグ、ｈｉｓタグ、または抗体若しくは他の高親和性分子と結合してシグナルを生成し得る任意の他のタグを含み；
該酵素は、ホタルルシフェラーゼ、β－ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、または光、色の変化、基質の沈着、若しくは試験中に検出することができる他の反応を引き起こす任意の他の酵素を含む。
本発明はまた、キューティバクテリウム・アクネス感染症の治療のための薬剤の製造における、前述のキメラ中の触媒ドメインの使用であって、該触媒ドメインがターゲティングモジュールと組み合わされる、使用を提供する。
本発明は、キューティバクテリウム・アクネス感染症および皮膚定着、並びにそのような感染症または定着に関連するざ瘡病変を予防および治療するための組成物および方法を提供する。広い態様において、本発明は、ざ瘡病変の発症または悪化、およびざ瘡病変の二次感染症に関与する皮膚関連微生物（プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キューティバクテリウム属（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム属（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードプロピオニバクテリウム属（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の細菌を含むが、これらに限定されない）に対する広い殺傷活性を有するリシンの用途および使用を提供する。特に、本発明は、キューティバクテリウム・アクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ、以前は、Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓとして知られていた）に特に重点を置いた、皮膚における確立された細菌叢の除菌、分散および除去のための方法を記載する。さらに、本発明は、改善された活性、宿主範囲、発現、溶解性、安定性または商業化へのよりよい適性を含むがこれらに限定されないさまざまな有利な特性をもたらす、異なるリシンからの触媒ドメインおよび結合ドメインを含むキメラリシンを製造する方法を提供する。
本発明によれば、本発明の方法および使用において、使用するバクテリオファージリシンは、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キューティバクテリウム属（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム属（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、シュードプロピオニバクテリウム属（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌に由来する。表２は、本発明において使用するリシンおよびポリペプチドを提供する。
本発明の一態様において、配列番号１～配列番号２８に示すリシンは、配列番号２９～配列番号５６に示すヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明はまた、異なるバクテリオファージリシンの結合ドメインと触媒ドメインとの間でキメラを製造する方法を提供する。配列番号５７～配列番号１３９は、本発明の、バクテリオファージリシン由来の触媒ドメインおよび結合ドメインをコードするポリペプチド配列の例を提供する非限定的な配列リストを示す。
本発明の一態様において、配列番号５７～配列番号１３９に示す触媒ドメインおよび結合ドメインは、配列番号１４０～配列番号２２２に示すヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明はまた、本明細書において記載する、異なるリシンの触媒ドメインおよび結合ドメインを対にすることによって製造されるキメラリシンの非限定的な例を提供する。配列番号２２３～配列番号２８２は、本発明の方法によって製造される、キューティバクテリウム・アクネスに対して活性なキメラリシンの非限定的な配列リストを提供する。
本発明の一態様においては、配列番号２８３～配列番号３４２に記載のヌクレオチド配列を使用して、本発明において記載するキメラリシンを製造する。
本発明の一態様において、ポリペプチド配列は、発現ベクターｐＥＴ２８中に挿入されたヌクレオチド配列によってコードされる。
本発明の一態様において、本発明のポリペプチドをコードする発現ベクターは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＢＬ２１（ＤＥ３）株において発現される。
さらに、本発明は、キューティバクテリウム・アクネスに対するバクテリオファージリシンの活性をスクリーニングおよび評価する方法を提供する。
さらに、本発明は、キューティバクテリウム・アクネスに対する規定のバクテリオファージリシンの活性を実証する。
本発明の一態様において、プロピオニバクテリウムを治療するためのリシンは、ＰＡＣＬ１０である。本発明は、ＰＡＣＬ１０を発現および精製する方法を提供する。さらに、本発明は、ＰＡＣＬ１０がキューティバクテリウム・アクネスに対してより高い抗菌活性を有することを証明する。
異なる分岐群の一連のキューティバクテリウム・アクネス株に対するＰＡＣＬ１０の活性を、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）試験および時間殺菌試験によって評価し、その結果は、ＰＡＣＬ１０が高い有効性を有することを一貫して示した。
本発明において製造されるバクテリオファージリシンおよびその誘導体は、工業規模の生産に適しており、他の共生細菌を無傷に保ちながら、特異的かつ効果的にキューティバクテリウム・アクネスを死滅させることができ、長期使用に適した安全で効果的な、腸内毒素症および耐性獲得の高いリスクのない、ざ瘡溶液を提供し得る。本発明において製造されるバクテリオファージリシンおよびその誘導体は、以下の利点を有する：
（１）自然界の細菌叢を損傷することなく、キューティバクテリウム・アクネス（Ｃ．ａｃｎｅｓ）を死滅させることができる。
（２）効果が現れるまでに長時間かかる抗生物質と比較して、迅速な活性（数分以内）。
（３）薬剤耐性がない。細菌は、素早く抗生物質に対する耐性を獲得するため、リシンが解決策である。Ｃ．ａｃｎｅｓは、バイオフィルムを強力に分泌する微生物である。抗生物質に感受性のある微生物であっても、バイオフィルムの形態で見つけられると、抗生物質に対して耐性になり得る。リシンは、バイオフィルムに対して高度に効果的である。
（４）本発明は、他のリシンと比較してより効率的であり、他のアッセイにおいてＭＩＣが低く活性が高い。
（５）可溶性発現が可能であり、収率も高く、大量生産および工業生産に適している。
（６）全ての分岐群のＰ．ａｃｎｅｓに対して有効である。
（１）自然界の細菌叢を損傷することなく、キューティバクテリウム・アクネス（Ｃ．ａｃｎｅｓ）を死滅させることができる。
（２）効果が現れるまでに長時間かかる抗生物質と比較して、迅速な活性（数分以内）。
（３）薬剤耐性がない。細菌は、素早く抗生物質に対する耐性を獲得するため、リシンが解決策である。Ｃ．ａｃｎｅｓは、バイオフィルムを強力に分泌する微生物である。抗生物質に感受性のある微生物であっても、バイオフィルムの形態で見つけられると、抗生物質に対して耐性になり得る。リシンは、バイオフィルムに対して高度に効果的である。
（４）本発明は、他のリシンと比較してより効率的であり、他のアッセイにおいてＭＩＣが低く活性が高い。
（５）可溶性発現が可能であり、収率も高く、大量生産および工業生産に適している。
（６）全ての分岐群のＰ．ａｃｎｅｓに対して有効である。
定義
Ｓｃｈｏｌｚらによるプロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の再分類により、新旧の名称の比較の非限定的な例を、以下の表１に示す：
Ｓｃｈｏｌｚらによるプロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）の再分類により、新旧の名称の比較の非限定的な例を、以下の表１に示す：
当業者は、細菌の再分類、新旧名称、および中国語名称が細菌の同定に影響を与えるべきではないことを理解すべきである。本発明において新名称または旧名称のいずれが採用されたとしても、それは、同じ細菌種を表す。
本発明に関連する配列の非限定的な例は、以下の表２のとおりである。
本発明において記載する天然リンカーの非限定的な例を、以下の表３に示す：
本発明において記載する合成リンカーの非限定的な例を、以下の表４に示す：
以下の実施例および／または実験例は、本発明をさらに例示するためにのみ使用され、本発明の有効範囲を決して限定するものではない。実験を標準的な実験方法を使用して行い、実施例に示す結果を得た。
実施例１
プロピオニバクテリウム科細菌のゲノムにおけるプロファージの配列を分析することにより、我々は、可溶性発現および精製が可能なキューティバクテリウム・アクネスバクテリオファージリシンを同定した。バクテリオファージリシンを発現する遺伝子配列は、Ｓａｎｇｏｎによって合成され、発現プラスミドｐＥＴ２８と連結させた。次いで、各組換えプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
プロピオニバクテリウム科細菌のゲノムにおけるプロファージの配列を分析することにより、我々は、可溶性発現および精製が可能なキューティバクテリウム・アクネスバクテリオファージリシンを同定した。バクテリオファージリシンを発現する遺伝子配列は、Ｓａｎｇｏｎによって合成され、発現プラスミドｐＥＴ２８と連結させた。次いで、各組換えプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）株に形質転換した。
実施例２
キメラを、間に可変長のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を挟んだ、Ｎ末端触媒ドメイン（ＣＤ）およびＣ末端結合ドメイン（ＢＤ）として構築した。ドメインは、ＮＣＢＩ定常領域データベースおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏタンパク質構造予測用のＲａｐｔｏｒＸウエブサーバーを使用した配列分析によって同定した。触媒ドメインは、完全なＣ末端リンカー、半分のＣ末端リンカーを有するか、またはＣ末端リンカーがない。同様に、結合ドメインは、完全なＮ末端結合、半分のＮ末端結合を有するか、またはＮ末端結合がない。ドメイン配列を増幅するためのプライマーは、ＧｅｎｅＣｒｅａｔｅによって合成した。ドメイン配列は、アニーリング温度５５℃でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、発現プラスミドｐＥＴ２８と連結した。次いで、組換えプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。
キメラを、間に可変長のリンカー（ｌｉｎｋｅｒ）を挟んだ、Ｎ末端触媒ドメイン（ＣＤ）およびＣ末端結合ドメイン（ＢＤ）として構築した。ドメインは、ＮＣＢＩ定常領域データベースおよびｉｎ ｓｉｌｉｃｏタンパク質構造予測用のＲａｐｔｏｒＸウエブサーバーを使用した配列分析によって同定した。触媒ドメインは、完全なＣ末端リンカー、半分のＣ末端リンカーを有するか、またはＣ末端リンカーがない。同様に、結合ドメインは、完全なＮ末端結合、半分のＮ末端結合を有するか、またはＮ末端結合がない。ドメイン配列を増幅するためのプライマーは、ＧｅｎｅＣｒｅａｔｅによって合成した。ドメイン配列は、アニーリング温度５５℃でＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲを使用して増幅した。ＰＣＲ産物を、ゲル精製し、発現プラスミドｐＥＴ２８と連結した。次いで、組換えプラスミドを、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入した。
実施例３
キューティバクテリウム・アクネスカバレッジテストにより、リシンの抗菌活性を確認した。簡単に説明すると、組換えリシンプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）クローンを、誘導のためにＩＰＴＧを含むＬＢ寒天上にプレーティングした。リシンが過剰発現すると、大腸菌クローンは、浸透圧的にリシンを放出する。キューティバクテリウム・アクネスが埋め込まれた軟寒天を、重層し、キューティバクテリウム・アクネスを増殖させるために培養した。活性リシンが存在すると、大腸菌の周囲に透明なゾーンまたはハローが形成される。実験結果を、図１に示す。
キューティバクテリウム・アクネスカバレッジテストにより、リシンの抗菌活性を確認した。簡単に説明すると、組換えリシンプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）クローンを、誘導のためにＩＰＴＧを含むＬＢ寒天上にプレーティングした。リシンが過剰発現すると、大腸菌クローンは、浸透圧的にリシンを放出する。キューティバクテリウム・アクネスが埋め込まれた軟寒天を、重層し、キューティバクテリウム・アクネスを増殖させるために培養した。活性リシンが存在すると、大腸菌の周囲に透明なゾーンまたはハローが形成される。実験結果を、図１に示す。
同様の実験で、組換えリシンプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）クローンを、液体培地中で誘導した。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４緩衝液中で超音波処理した。溶解物を遠心分離して、可溶性画分および不溶性画分を分離する。可溶性の粗溶解物を、キューティバクテリウム・アクネスが埋め込まれた軟寒天上にスポットした。可溶性の粗溶解物中の活性リシンは、キューティバクテリウム・アクネスを増殖させるための培養後にクリアリングゾーンを形成した。実験結果を、図２に示す。
実施例４
ＰＡＣＬ１０の発現および精製
ＰＡＣＬ１０の発現および精製は、以下のとおりであった。簡単に説明すると、組換えＰＡＣＬ１０発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養を続けた。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で再懸濁し、高圧下で均一に溶解した。溶解物を再び遠心分離して、可溶性の粗溶解物を収集した。可溶性画分を等量の５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物を疎水性カラム上にロードした。サンプルロード後、カラムを５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。次いで、ＰＡＣＬ１０を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で溶出した。実験結果を、図３に示す。
ＰＡＣＬ１０の発現および精製
ＰＡＣＬ１０の発現および精製は、以下のとおりであった。簡単に説明すると、組換えＰＡＣＬ１０発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養を続けた。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で再懸濁し、高圧下で均一に溶解した。溶解物を再び遠心分離して、可溶性の粗溶解物を収集した。可溶性画分を等量の５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物を疎水性カラム上にロードした。サンプルロード後、カラムを５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。次いで、ＰＡＣＬ１０を、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で溶出した。実験結果を、図３に示す。
実施例５
キメラリシンを、ＰＡＣＬ１０と同様の方法で発現および精製した。組換えキメラリシン発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養を続けた。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で再懸濁し、高圧下で均一に溶解した。溶解物を再び遠心分離して、可溶性の粗溶解物を収集した。可溶性画分を等量の５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物を疎水性カラム上にロードした。サンプルロード後、カラムを５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。次いで、組換えキメラリシンを、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で溶出した。
キメラリシンを、ＰＡＣＬ１０と同様の方法で発現および精製した。組換えキメラリシン発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養を続けた。細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で再懸濁し、高圧下で均一に溶解した。溶解物を再び遠心分離して、可溶性の粗溶解物を収集した。可溶性画分を等量の５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物を疎水性カラム上にロードした。サンプルロード後、カラムを５カラム容量の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄した。次いで、組換えキメラリシンを、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で溶出した。
実施例６
最小発育阻止濃度の決定
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定方法は、以下のとおりである。まず、コロニー懸濁液を、ＯＤ６００が０．０５になるように０．９％生理食塩水中で調製し、ｍＬあたり１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）に相当する接種材料を調製する。懸濁液を、寒天を含まない強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）中で５×１０５ｃｆｕ／ｍＬの接種材料まで２０倍希釈した。ＰＡＣＬ１０またはバンコマイシンの２倍連続希釈液を０．９％生理食塩水で調製し、総培養物の１０分の１を超えないように添加する。培養物を、嫌気条件下３７℃で３日間増殖させた。ＭＩＣは、肉眼でキューティバクテリウム・アクネスの増殖が観察されないＰＡＣＬ１０またはバンコマイシンの最低濃度である。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０を含有する強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）プレート上で上記の培養物を継代培養することによって決定した。ＭＢＣは、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）プレート上でキューティバクテリウム・アクネスコロニーが見られないＰＡＣＬ１０またはバンコマイシンの最低濃度である。
最小発育阻止濃度の決定
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定方法は、以下のとおりである。まず、コロニー懸濁液を、ＯＤ６００が０．０５になるように０．９％生理食塩水中で調製し、ｍＬあたり１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）に相当する接種材料を調製する。懸濁液を、寒天を含まない強化クロストリジウム培地（ＲＣＭ）中で５×１０５ｃｆｕ／ｍＬの接種材料まで２０倍希釈した。ＰＡＣＬ１０またはバンコマイシンの２倍連続希釈液を０．９％生理食塩水で調製し、総培養物の１０分の１を超えないように添加する。培養物を、嫌気条件下３７℃で３日間増殖させた。ＭＩＣは、肉眼でキューティバクテリウム・アクネスの増殖が観察されないＰＡＣＬ１０またはバンコマイシンの最低濃度である。最小殺菌濃度（ＭＢＣ）は、０．１％Ｔｗｅｅｎ－８０を含有する強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）プレート上で上記の培養物を継代培養することによって決定した。ＭＢＣは、強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）プレート上でキューティバクテリウム・アクネスコロニーが見られないＰＡＣＬ１０またはバンコマイシンの最低濃度である。
実験結果：表６－１は、バンコマイシンと比較した、ＩＡ１、ＩＡ２、ＩＩ分岐群のキューティバクテリウム・アクネス菌株のＰＡＣＬ１０～１２株の最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）および最小殺菌濃度（ＭＢＣ）を示す。
実施例７
時間殺菌試験
時間殺菌試験方法は、以下のとおりである。キューティバクテリウム・アクネス３４Ａ株コロニーを、ＯＤ６００が０．０５（１０７ｃｆｕ／ｍＬに相当）になるまで０．９％生理食塩水中で再懸濁する。懸濁液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で約１０６ｃｆｕ／ｍＬまで１０倍希釈した。ＰＡＣＬ１０の２倍連続希釈の０、０．５×、１×、２×ＭＩＣを、それぞれ３４Ａ株に添加する。試験からの１０倍段階希釈液（０、１、２、３ｌｏｇ）を各時点で強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）上にプレーティングし、嫌気条件下３７℃で３日間培養した。実験結果を、図４に示す。
時間殺菌試験
時間殺菌試験方法は、以下のとおりである。キューティバクテリウム・アクネス３４Ａ株コロニーを、ＯＤ６００が０．０５（１０７ｃｆｕ／ｍＬに相当）になるまで０．９％生理食塩水中で再懸濁する。懸濁液を、５０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ６．０）中で約１０６ｃｆｕ／ｍＬまで１０倍希釈した。ＰＡＣＬ１０の２倍連続希釈の０、０．５×、１×、２×ＭＩＣを、それぞれ３４Ａ株に添加する。試験からの１０倍段階希釈液（０、１、２、３ｌｏｇ）を各時点で強化クロストリジウム寒天（ＲＣＡ）上にプレーティングし、嫌気条件下３７℃で３日間培養した。実験結果を、図４に示す。
実施例８
一段階精製後の選択されたリシンの最小発育阻止濃度
実施例１～４の方法に従ってＰＡＣＬ１０、３９０、３９１、３９２、４０３および４０４を発現させ、以下の一段階精製を行う：各組換え発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍで３時間、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養した。細胞を、遠心分離によって収集し、高圧下で均一に溶解した。目的のタンパク質を発現する大腸菌培養培地１Ｌからの清澄な溶解物を、７０ｍＬの精製樹脂を含有する２６ｍｍ／２００ｍｍカラム上にロードした。リシンを、表８－１の条件に従って精製し、一段階精製後のリシンの純度測定を、図５に示す。これらのリシンは、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために使用した。
一段階精製後の選択されたリシンの最小発育阻止濃度
実施例１～４の方法に従ってＰＡＣＬ１０、３９０、３９１、３９２、４０３および４０４を発現させ、以下の一段階精製を行う：各組換え発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を、自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍで３時間、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養した。細胞を、遠心分離によって収集し、高圧下で均一に溶解した。目的のタンパク質を発現する大腸菌培養培地１Ｌからの清澄な溶解物を、７０ｍＬの精製樹脂を含有する２６ｍｍ／２００ｍｍカラム上にロードした。リシンを、表８－１の条件に従って精製し、一段階精製後のリシンの純度測定を、図５に示す。これらのリシンは、最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）を決定するために使用した。
最小発育阻止濃度（ＭＩＣ）の測定方法は、以下のとおりである。キューティバクテリウム・アクネスを、強化クロストリジウム寒天（１．５％寒天を有する強化クロストリジウム培地ＲＣＭ、ＲＣＭは改訂されたレシピに従って調製した、１リットルあたり－酸加水分解カゼイン１０ｇ、ビーフエキス１０ｇ、酵母エキス３ｇ、Ｄ－グルコース５ｇ、塩化ナトリウム５ｇ、酢酸ナトリウム３ｇ、Ｌ－システイン塩酸塩０．５ｇ）上で画線培養した。プレートを、嫌気的に３７℃で７２時間培養した。まず、ＭＩＣ測定用の接種材料を、ＲＣＡからの単一クローンを０．９％生理食塩水中で再懸濁することによって、ｍＬあたり１０７コロニー形成単位（ｃｆｕ／ｍＬ）に相当する、ＯＤ６００が０．０５になるように調製した。懸濁液をＲＣＭ中で２０倍希釈して、５×１０５ｃｆｕ／ｍＬの接種材料とした。各リシンの２倍連続希釈液を、０．９％生理食塩水で調製し、総培養容量の１０分の１を超えないように添加した。培養物を、嫌気条件下３７℃で４８～７２時間増殖させた。ＭＩＣは、肉眼でキューティバクテリウム・アクネスの増殖が観察されないリシンの最低濃度である。ＭＩＣの結果を、表８－２に示す。
実施例９
ＰＡＣＬ３９２の精製および殺菌活性
ＰＡＣＬ３９２を、組換え発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を自己誘導培地に置き、３７℃、３００ｒｐｍで３時間培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養することにより発現させた。細胞を、遠心分離によって収集し、高圧下で２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で均一に溶解した。溶解物を、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離した。上清を、等量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１Ｍ硫酸アンモニウムと混合し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１時間再び遠心分離した。上清を、０．２２μｍフィルター膜で濾過し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、および０．５Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した混合モードクロマトグラフィーカラム（７０ｍＬ精製樹脂の２６ｍｍ／２００ｍｍカラム）上にロードした。サンプルロード後、カラムを、一連の緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ硫酸アンモニウム；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２．５Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、および５０ｍＭピペラジン、ｐＨ１０．０２、５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。ＰＡＣＬ３９２を、５０ｍＭピペラジン、ｐＨ１０．０２、および７５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出液を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４に対して透析して、ｐＨを中和し、カチオンを除去した。透析サンプルを、濾過し、イオン交換カラム（７０ｍＬ精製樹脂の２６ｍｍ／２００ｍｍカラム）上にロードした。ＰＡＣＬ３９２精製の最終結果を、図６に示す。
ＰＡＣＬ３９２の精製および殺菌活性
ＰＡＣＬ３９２を、組換え発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を自己誘導培地に置き、３７℃、３００ｒｐｍで３時間培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養することにより発現させた。細胞を、遠心分離によって収集し、高圧下で２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で均一に溶解した。溶解物を、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離した。上清を、等量の２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１Ｍ硫酸アンモニウムと混合し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１時間再び遠心分離した。上清を、０．２２μｍフィルター膜で濾過し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、および０．５Ｍ硫酸アンモニウムで平衡化した混合モードクロマトグラフィーカラム（７０ｍＬ精製樹脂の２６ｍｍ／２００ｍｍカラム）上にロードした。サンプルロード後、カラムを、一連の緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．５Ｍ硫酸アンモニウム；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２．５Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、および５０ｍＭピペラジン、ｐＨ１０．０２、５０ｍＭ ＮａＣｌで洗浄した。ＰＡＣＬ３９２を、５０ｍＭピペラジン、ｐＨ１０．０２、および７５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出した。溶出液を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４に対して透析して、ｐＨを中和し、カチオンを除去した。透析サンプルを、濾過し、イオン交換カラム（７０ｍＬ精製樹脂の２６ｍｍ／２００ｍｍカラム）上にロードした。ＰＡＣＬ３９２精製の最終結果を、図６に示す。
ＰＡＣＬ３９２の殺菌活性を、ＮａＣｌ、ＣａＣｌ２、ＭｇＣｌ２、ＥＤＴＡ、ＤＴＴ、Ｔｗｅｅｎ－２０、Ｔｗｅｅｎ－８０およびヒアルロン酸などの一連の添加剤（濃度は、図７に示す）の存在下、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中でのＣＦＵの減少によって測定した。
実施例１０
ＰＡＣＬ４０３の精製および殺菌作用
ＰＡＣＬ４０３を、組換え発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を自己誘導培地に置き、３７℃、３００ｒｐｍで３時間培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養することにより発現させた。細胞を、遠心分離によって収集し、高圧下で２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で均一に溶解した。溶解物溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌに調整し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離した。上清を、０．２２μｍフィルター膜で濾過し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、および１Ｍ ＮａＣｌで平衡化した混合モードクロマトグラフィーカラム（７０ｍＬ精製樹脂の２６ｍｍ／２００ｍｍカラム）上にロードした。サンプルロード後、カラムを、一連の緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２．５Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、および再び２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で洗浄した。ＰＡＣＬ４０３を、５０ｍＭピペラジン、ｐＨ９．５、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。５倍量の５００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４を添加することによって、高ｐＨを中和した。次いで、溶出液を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４に対して透析して、カチオンを除去した。透析サンプルを濾過する。ＰＡＣＬ４０３精製の最終結果を、図８に示す。
ＰＡＣＬ４０３の精製および殺菌作用
ＰＡＣＬ４０３を、組換え発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を自己誘導培地に置き、３７℃、３００ｒｐｍで３時間培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養することにより発現させた。細胞を、遠心分離によって収集し、高圧下で２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で均一に溶解した。溶解物溶液を、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌに調整し、１２，０００ｒｐｍ、４℃で１時間遠心分離した。上清を、０．２２μｍフィルター膜で濾過し、２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、および１Ｍ ＮａＣｌで平衡化した混合モードクロマトグラフィーカラム（７０ｍＬ精製樹脂の２６ｍｍ／２００ｍｍカラム）上にロードした。サンプルロード後、カラムを、一連の緩衝液：２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、１Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、２．５Ｍ ＮａＣｌ；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４；２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４、０．１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ－１１４、および再び２０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４で洗浄した。ＰＡＣＬ４０３を、５０ｍＭピペラジン、ｐＨ９．５、１Ｍ ＮａＣｌで溶出した。５倍量の５００ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４を添加することによって、高ｐＨを中和した。次いで、溶出液を５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４に対して透析して、カチオンを除去した。透析サンプルを濾過する。ＰＡＣＬ４０３精製の最終結果を、図８に示す。
ＰＡＣＬ４０３の殺菌活性を、図９に示す濃度のＴｗｅｅｎ－２０およびＴｗｅｅｎ－８０の存在下、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．０中でのＯＤの減少によって測定した。
ＰＡＣＬ４０３の殺菌活性を、図１０に示す濃度のＴｗｅｅｎ－２０およびＴｗｅｅｎ－８０の存在下、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．０中でのＣＦＵの減少によって測定した。
ＰＡＣＬ４０３はまた、バイオフィルム関連キューティバクテリウム・アクネスも死滅させた（図１１）。ＯＤ６００が１．０の株１０を、９６ウェルポリスチレンプレートに添加して、嫌気性ガス混合物中で一晩バイオフィルムに接種した。上清を除去し、ウェルを０．９％ＮａＣｌで穏やかにリンスした。バイオフィルム形成培地（ＲＣＭ＋５％グルコース）を添加して、嫌気性ガス混合物中で一晩バイオフィルムを増殖させた。培地を除去し、ウェルを０．９％ＮａＣｌで穏やかにリンスした。次いで、バイオフィルムを、緩衝液またはＰＡＣＬ４０３で、嫌気条件下、２５℃で一晩処理した。緩衝液またはＰＡＣＬ４０３を除去し、ウェルを０．９％ＮａＣｌでリンスした。０．９％ＮａＣｌ中で再懸濁し、ＲＣＭ寒天上にプレーティングし、バイオフィルム関連ＣＦＵをカウントする。
Claims (38)
- キューティバクテリウム・アクネスによって引き起こされるざ瘡若しくは感染症、またはキューティバクテリウム・アクネスに関連する疾患の予防、治療、または改善のための医薬品、化粧品、または医療装置の製造におけるバクテリオファージリシンまたはそのキメラの使用であって、前記バクテリオファージリシンがノカルディオ科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）またはプロピオニバクテリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌由来のバクテリオファージリシンを含む、使用。
- 前記ノカルディオ科（Ｎｏｃａｒｄｉｏｉｄａｃｅａｅ）細菌が、ミクロプルイナ属（Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ）、プロピオニシモナス属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ）、プロピオニシセラ属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ）、フリードマンニエラ属（Ｆｒｉｅｄｍａｎｎｉｅｌｌａ）細菌を含み；前記プロピオニバクテリウム科（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ）細菌が、プロピオニフェラクス属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｆｅｒａｘ）、マリニルテコッカス属（Ｍａｒｉｎｉｌｕｔｅｉｃｏｃｃｕｓ）、グラヌリコッカス属（Ｇｒａｎｕｌｉｃｏｃｃｕｓ）、ナウマンネラ属（Ｎａｕｍａｎｎｅｌｌａ）、プロピオニシクラバ属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ）、オーラティコッカス属（Ａｕｒａｔｉｃｏｃｃｕｓ）、ミクロルナタス属（Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ）、エストゥアリイミクロビウム属（Ａｅｓｔｕａｒｉｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、ルテオコッカス属（Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ）、テサラコッカス属（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ）、ブルックローニア属（Ｂｒｏｏｋｌａｗｎｉａ）、プロピオニミクロビウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キューティバクテリウム属（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム属（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはシュードプロピオニバクテリウム属（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌；
好ましくはプロピオニバクテリウム属（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、キューティバクテリウム属（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム属（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、またはシュードプロピオニバクテリウム属（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）細菌を含む、請求項１に記載の使用。 - 前記バクテリオファージリシンが、キューティバクテリウム・アクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、プロピオニバクテリウム・ヒューメルシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｈｕｍｅｒｕｓｉｉ）、キューティバクテリウム・アビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）、キューティバクテリウム・グラヌロサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム・トエニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・ジェンセニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、エストゥアリイミクロビウム・クァンヤンゲンセ（Ａｅｓｔｕａｒｉｉｍｉｃｒｏｂｉｕｍ ｋｗａｎｇｙａｎｇｅｎｓｅ）、グラヌリコッカス・フェノリボランス（Ｇｒａｎｕｌｉｃｏｃｃｕｓ ｐｈｅｎｏｌｉｖｏｒａｎｓ）、ミクロルナタス・フォスフォボラス（Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓ ｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｕｓ）、シュードプロピオニバクテリウム・プロピオニカム（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）、テサラコッカス属の種（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．）、プロピオニシセラ・スーパーファンディア（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｅｌｌａ ｓｕｐｅｒｆｕｎｄｉａ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ亜種フロイデンライシイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ）、プロピオニバクテリウム・フロイデンライシイ亜種シャーマニイ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｆｒｅｕｄｅｎｒｅｉｃｈｉｉ ｓｕｂｓｐ． ｓｈｅｒｍａｎｉｉ）、プロピオニバクテリウム・アシディファシエンス（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｆａｃｉｅｎｓ）、プロピオニバクテリウム・リンフォフィラム（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｌｙｍｐｈｏｐｈｉｌｕｍ）、プロピオニバクテリウム属の細菌（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、プロピオニバクテリウム属の種オーラルタクソン１９２（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｓｐ． ｏｒａｌ ｔａｘｏｎ １９２）、プロピオニフェラクス・イノキュア（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｆｅｒａｘ ｉｎｎｏｃｕａ）、ナウマンネラ・ハロトレランス（Ｎａｕｍａｎｎｅｌｌａ ｈａｌｏｔｏｌｅｒａｎｓ）、プロピオニシクラバ・タルダ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｃｌａｖａ ｔａｒｄａ）、ミクロプルイナ・グリコジェニカ（Ｍｉｃｒｏｐｒｕｉｎａ ｇｌｙｃｏｇｅｎｉｃａ）、プロピオニシモナス・パルディコラ（Ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉｍｏｎａｓ ｐａｌｕｄｉｃｏｌａ）、オーラティコッカス・、モニュメンティ（Ａｕｒａｔｉｃｏｃｃｕｓ ｍｏｎｕｍｅｎｔｉ）、ルテオコッカス・ジャポニカス（Ｌｕｔｅｏｃｏｃｃｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）、テサラコッカス・オレイアグリ（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｏｌｅｉａｇｒｉ）、テサラコッカス・ベンディゴエンシス（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｂｅｎｄｉｇｏｅｎｓｉｓ）、テサラコッカス・ラピディカプタス（Ｔｅｓｓａｒａｃｏｃｃｕｓ ｌａｐｉｄｉｃａｐｔｕｓ）、アシディプロピオニバクテリウム・ミクロアエロフィラム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム・オリバエ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｌｉｖａｅ）、またはアシディプロピオニバクテリウム・ダムノサム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｎｏｓｕｍ）由来のバクテリオファージリシンを含む、請求項１に記載の使用。
- 前記バクテリオファージリシンが、アシディプロピオニバクテリウム・ジェンセニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｊｅｎｓｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・トエニイ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｔｈｏｅｎｉｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・アシディプロピオニシ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｃｉ）、アシディプロピオニバクテリウム・ミクロアエロフィラム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｍｉｃｒｏａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）、アシディプロピオニバクテリウム・オリバエ（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｏｌｉｖａｅ）、アシディプロピオニバクテリウム・ダムノサム（Ａｃｉｄｉｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｄａｍｎｏｓｕｍ）、キューティバクテリウム・アクネス（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｃｎｅｓ）、キューティバクテリウム・アビダム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ａｖｉｄｕｍ）、キューティバクテリウム・グラヌロサム（Ｃｕｔｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｇｒａｎｕｌｏｓｕｍ）、またはシュードプロピオニバクテリウム・プロピオニカム（Ｐｓｅｕｄｏｐｒｏｐｉｏｎｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｐｒｏｐｉｏｎｉｃｕｍ）由来のバクテリオファージリシンを含む、請求項１に記載の使用。
- 前記バクテリオファージリシンが、配列番号１～配列番号２８のいずれか一つに示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の使用。
- 前記バクテリオファージリシンが、配列番号１０に示すアミノ酸配列を有する、請求項１に記載の使用。
- 前記バクテリオファージリシンが、配列番号２９～配列番号５６のいずれか一つに示すヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の使用。
- 前記バクテリオファージリシンが、配列番号３８に示すヌクレオチド配列を有する、請求項１に記載の使用。
- 前記キメラが、バクテリオファージリシンの触媒ドメイン、またはバクテリオファージリシンの触媒ドメインおよび結合ドメインの組合せを含む、請求項１に記載の使用。
- 前記触媒ドメインが、完全なＣ末端リンカーを有するか、半分のＣ末端リンカーを有するか、Ｃ末端リンカーを有さないか、または該リンカーの任意の部分を有し；前記結合ドメインが、完全なＮ末端リンカーを有するか、半分のＮ末端リンカーを有するか、Ｎ末端リンカーを有さないか、または該リンカーの任意の部分を有する、請求項９に記載の使用。
- 前記触媒ドメインが、１つ、２つまたは３つ以上の触媒ドメインを含む、請求項９に記載の使用。
- 前記結合ドメインが、１つ、２つまたは３つ以上の結合ドメインを含む、請求項９に記載の使用。
- 前記キメラがさらに、触媒ドメインと結合ドメインとの間にリンカーを含み、該リンカーが：
１）配列番号３４３～配列番号３６７のいずれか一つに示すアミノ酸配列；
２）配列番号３６８～配列番号３９２のいずれか一つに示すアミノ酸配列；
３）配列番号３９３～配列番号４０６のいずれか一つに示すアミノ酸配列；または
４）（ＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＳ）ｎ、（ＧＧＧＧＧＳ）ｎ、（Ｇｌｙ）３－８、（ＥＡＡＡＫ）ｎ、（Ａｌａ－Ｐｒｏ）ｎ、若しくはＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（式中、１≦ｎ≦１５であり、ｎは、整数である）
を含む、請求項９に記載の使用。 - 前記キメラが、配列番号５７、配列番号５８、配列番号５９、配列番号６１、配列番号６２、配列番号６３、配列番号６４、配列番号６５、配列番号６６、配列番号６７、配列番号６９、配列番号７０、配列番号７１、配列番号７３、配列番号７４、配列番号７７、配列番号８０、配列番号８１、配列番号８５、配列番号８６、配列番号８７、配列番号９１、配列番号９３、配列番号９５、配列番号９７、配列番号９８、配列番号９９、配列番号１００、配列番号１０２、配列番号１０４、配列番号１０５、配列番号１０６、配列番号１０７、配列番号１０８、配列番号１１０、配列番号１１１、配列番号１１３、配列番号１１４、配列番号１１７、配列番号１１８、配列番号１２１、配列番号１２２、配列番号１２５、配列番号１２７、配列番号１２８、配列番号１３１、配列番号１３２、配列番号１３３、配列番号１３５、または配列番号１３６に示すアミノ酸配列を有する前記触媒ドメインを含み；
前記結合ドメインが、配列番号６０、配列番号６２、配列番号６８、配列番号７２、配列番号７５、配列番号７６、配列番号７８、配列番号７９、配列番号８２、配列番号８３、配列番号８４、配列番号８８、配列番号８９、配列番号９０、配列番号９２、配列番号９４、配列番号９６、配列番号１０１、配列番号１０３、配列番号１０９、配列番号１１２、配列番号１１５、配列番号１１６、配列番号１１９、配列番号１２０、配列番号１２３、配列番号１２４，配列番号１２６、配列番号１２９、配列番号１３０、配列番号１３４、配列番号１３７、配列番号１３８または配列番号１３９に示すアミノ酸配列を有する、
請求項９に記載の使用。 - 前記触媒ドメインが、配列番号１４０、配列番号１４１、配列番号１４２、配列番号１４４、配列番号１４６、配列番号１４７、配列番号１４８、配列番号１４９、配列番号１５０、配列番号１５２、配列番号１５３、配列番号１５４、配列番号１５６、配列番号１５７、配列番号１６０、配列番号１６３、配列番号１６４、配列番号１６８、配列番号１６９、配列番号１７０、配列番号１７４、配列番号１７６、配列番号１７８、配列番号１８０、配列番号１８１、配列番号１８２、配列番号１８３、配列番号１８５、配列番号１８７、配列番号１８８、配列番号１８９、配列番号１９０、配列番号１９１、配列番号１９３、配列番号１９４、配列番号１９６、配列番号１９７、配列番号２００、配列番号２０１、配列番号２０４、配列番号２０５、配列番号２０８、配列番号２１０、配列番号２１１、配列番号２１４、配列番号２１５、配列番号２１６、配列番号２１８、配列番号２１９に示すヌクレオチド配列を有し；
前記結合ドメインが、配列番号１４３、配列番号１４５、配列番号１５１、配列番号１５５、配列番号１５８、配列番号１５９、配列番号１６１、配列番号１６２、配列番号１６５、配列番号１６６、配列番号１６７、配列番号１７１、配列番号１７２、配列番号１７３、配列番号１７５、配列番号１７７、配列番号１７９、配列番号１８４、配列番号１８６、配列番号１９２、配列番号１９５、配列番号１９８、配列番号１９９、配列番号２０２、配列番号２０３、配列番号２０６、配列番号２０７、配列番号２０９、配列番号２１２、配列番号２１３、配列番号２１７、配列番号２２０、配列番号２２１、または配列番号２２２に示すヌクレオチド配列を有する、
請求項９に記載の使用。 - 前記キメラが、配列番号２２３～配列番号２８２のいずれか一つに示すアミノ酸配列；好ましくは、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２７１または配列番号２７２に示すアミノ酸配列；より好ましくは、配列番号２６０または配列番号２７１に示すアミノ酸配列を有する、請求項９に記載の使用。
- 前記キメラが、配列番号２８３～配列番号３４２のいずれか一つに示すヌクレオチド配列；好ましくは、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３２９または配列番号３３０に示すヌクレオチド配列；より好ましくは、配列番号３１８または配列番号３２９に示すヌクレオチド配列を有する、請求項９に記載の使用。
- 前記キューティバクテリウム・アクネスによって引き起こされる感染症が、侵襲性感染症、術後感染症および／または器具関連感染症を含む、請求項１に記載の使用。
- 前記器具関連感染症が、人工関節、シャントチューブおよび人工心臓弁－関連感染症を含む、請求項１８に記載の使用。
- 前記感染症が、骨および／または関節感染症、特に術後肩感染症、並びに口腔、眼、椎間板および脳感染症を含む、請求項１８に記載の使用。
- 前記キューティバクテリウム・アクネスに関連する疾患が、癌性前立腺炎、ＳＡＰＨＯ（滑膜炎、ざ瘡、膿痂疹、肥大、骨炎）症候群、サルコイドーシス、または坐骨神経痛を含む、請求項１に記載の使用。
- 前記医療装置が、リシン若しくはそのキメラを患部に放出するための任意の装置、好ましくは皮膚表面に適用されるクランプ若しくはパッチまたはスプレー、リシン若しくはそのキメラの皮膚浸透を増強するためのマイクロニードルを使用する装置、リシン若しくはそのキメラを特にざ瘡の影響を受けた毛包に適用するために美容専門家によって使用される微細針、または他の類似の装置を含む、請求項１に記載の使用。
- 前記医療装置が、リシンまたはそのキメラを、キューティバクテリウム・アクネス感染症を受けやすい位置の補綴装置、好ましくは特にキューティバクテリウム・アクネス感染症を受けやすい肩の手術に使用される補綴インプラント上に固定化すること含む、請求項１に記載の使用。
- 前記キメラが、配列番号２２３～配列番号２８２のいずれか一つに示すアミノ酸配列；好ましくは、配列番号２５８、配列番号２５９、配列番号２６０、配列番号２７１または配列番号２７２に示すアミノ酸配列；より好ましくは、配列番号２６０または配列番号２７１に示すアミノ酸配列を有する、請求項１～２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシンキメラ。
- 前記キメラが、配列番号２８３～配列番号３４２のいずれか一つに示すヌクレオチド配列；好ましくは、配列番号３１６、配列番号３１７、配列番号３１８、配列番号３２９または配列番号３３０に示すヌクレオチド配列；より好ましくは、配列番号３１８または配列番号３２９に示すヌクレオチド配列を有する、請求項２４に記載のキメラ。
- 請求項１～２３のいずれか一項または請求項２４～２５のいずれか一項に記載のキメラを製造する方法であって、該方法が、
（１）ドメイン配列、およびドメイン配列を増幅するためのプライマーを合成すること；
（２）ドメイン配列を増幅するためにＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼＰＣＲを使用すること；
（３）ＰＣＲ産物をゲル精製し、発現プラスミドｐＥＴ２８と連結すること；
（４）組換えプラスミドを大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に導入すること；
（５）キメラを得るために、該組換えプラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を培養し、発現を誘導し、遠心分離により細胞を収集し、溶解し、および精製すること
を含む、方法。 - 組換えキメラリシン発現プラスミドを含有する大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）を自己誘導培地中で３７℃、３００ｒｐｍでＯＤ６００が０．６～０．８に達するまで培養し、次いで１８℃、３００ｒｐｍで１６～１８時間培養を続けること；細胞を、遠心分離によって収集し、５０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中で再懸濁し、高圧下で均一に溶解すること；可溶性の粗溶解物を収集するために、溶解物を再び遠心分離すること；可溶性画分を等量の５Ｍ ＮａＣｌと混合し、混合物を疎水性カラム上にロードすること；サンプルロード後、カラムをカラム容量の５倍の２０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）、２．５Ｍ ＮａＣｌで洗浄すること；次いで、１０ｍＭリン酸ナトリウム（ｐＨ７．４）で組換えキメラリシンを溶出することをさらに含む、請求項２６に記載の方法。
- 請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシン若しくはそのキメラ、または請求項２４から２５のいずれか一項に記載のキメラを含有する製剤であって、該製剤が、抗生物質、他のリシン、または不活性賦形剤をさらに含む、製剤。
- 請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシン若しくはそのキメラ、または請求項２４から２５のいずれか一項に記載のキメラ、または請求項２６において製造されるキメラをコードするアミノ酸配列、または８０％以上、８５％以上、９０％以上、９５％以上、若しくは９９％以上の類似性を有するアミノ酸配列、または同じ官能基を有する代替アミノ酸配列。
- 前記代替アミノ酸配列が、同じアミノ酸群中のアミノ酸を使用する保存的置換であり、該アミノ酸群が：
脂肪族：グリシン、アラニン、バリン、ロイシン若しくはイソロイシン；
ヒドロキシルまたは硫黄／セレンを含む：セリン、システイン、スレオニン若しくはメチオニン；
環状：プロリン；
芳香族：フェニルアラニン、チロシン若しくはトリプトファン；
塩基性：ヒスチジン、リジン、若しくはアルギニン；または
酸性およびそのアミド：アスパラギン酸、グルタミン酸、アスパラギン、グルタミン
を含む、請求項２９に記載のアミノ酸配列。 - 請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシン若しくはそのキメラ、または請求項２４から２５のいずれか一項に記載のキメラ、または請求項２６において製造されるキメラをコードするヌクレオチド配列、またはその同義コドン配列。
- 細菌溶解のための試薬としての、請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシン若しくはそのキメラ、または請求項２４から２５のいずれか一項に記載のキメラ、または請求項２６において製造されるキメラの使用であって、該細菌溶解が、ＰＣＲベースのキットを使用するＤＮＡ抽出およびタイピングに使用される、使用。
- 非生物学的表面上の消毒剤または滅菌剤としての、請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシン若しくはそのキメラ、または請求項２４から２５のいずれか一項に記載のキメラ、または請求項２６において製造されるキメラの使用であって、該消毒剤または滅菌剤が、プランクトン形態またはバイオフィルム中のキューティバクテリウム・アクネスを除去することによって感染症を予防し、好ましくは手術中の外科用装置または補綴インプラント装置を消毒する、使用。
- キューティバクテリウム・アクネス用診断ツールの製造における、請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシン若しくはそのキメラ、または請求項２４から２５のいずれか一項に記載のキメラ、または請求項２６において製造されるキメラ、または上記分子中の単一の結合ドメイン、または上記分子中の類似若しくは異なる結合ドメインの一連の組合せの使用であって、該リシン、キメラまたは結合ドメインが、シグナル分子と組み合わせて使用される、使用。
- 前記リシン、キメラまたは結合ドメインおよびシグナル分子が、遺伝子融合または化学的カップリングを通して融合体を形成する、請求項３４に記載の使用。
- 前記融合体が、顕微鏡スライド上のキューティバクテリウム・アクネスを蛍光または他の手段によって直接検出するために、免疫組織化学によってキューティバクテリウム・アクネスを標識するために、ＥＬＩＳＡアッセイにおける検出試薬として、ウエスタンブロットにおける検出試薬として、ＭＡＣＳまたは他のプルダウンアッセイにおける磁気ビーズへの付着のために、または抗体が検出試薬として使用されるアッセイにおける検出試薬として、使用される、請求項３５に記載の使用。
- 前記シグナル分子が、タンパク質または化学蛍光色素、タンパク質タグ、酵素、アビジン、ストレプトアビジン、オボアルブミン、ビオチン、クリック化学標識感受性タグ、インテイン、またはシグナルを生成する二次タンパク質若しくは分子の動員を引き起こし得る他の分子を含み、ここで、
該蛍光色素は、ＧＦＰ、ＲＦＰ、ｍＣｈｅｒｒｙ、ＦＩＴＣ、ＴＲＩＴＣ、Ａｌｅｘａｆｌｕｏｒ ４８８、Ｃｙ３またはＣｙ５を含み；
該タンパク質タグは、Ｆｌａｇタグ、ｍｙｃタグ、ｈａｌｏタグ、ｈｉｓタグ、または抗体若しくは他の高親和性分子と結合してシグナルを生成し得る任意の他のタグを含み；
該酵素は、ホタルルシフェラーゼ、β－ラクタマーゼ、アルカリホスファターゼ、ホースラディッシュペルオキシダーゼ、または光、色の変化、基質の沈着、若しくは試験中に検出することができる他の反応を引き起こす任意の他の酵素を含む、
請求項３４に記載の使用。 - キューティバクテリウム・アクネス感染症の治療のための薬剤の製造における、請求項１から２３のいずれか一項に記載の使用におけるバクテリオファージリシン若しくはそのキメラ、または請求項２４から２５のいずれか一項に記載のキメラ、または請求項２６の方法によって製造されるキメラにおける触媒ドメインの使用であって、該触媒ドメインがターゲティングモジュールと組み合わされる、使用。
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