JPH07163346A - 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

Info

Publication number
JPH07163346A
JPH07163346A JP6257008A JP25700894A JPH07163346A JP H07163346 A JPH07163346 A JP H07163346A JP 6257008 A JP6257008 A JP 6257008A JP 25700894 A JP25700894 A JP 25700894A JP H07163346 A JPH07163346 A JP H07163346A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
plasmid
dna
coli
dna fragment
cloning
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP6257008A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2570633B2 (ja
Inventor
Mineo Niwa
峰雄 丹羽
Yoshimasa Saito
善正 斎藤
Hitoshi Sasaki
斉 佐々木
Masako Hayashi
雅子 林
Joji Notani
譲二 野谷
Masakazu Kobayashi
正和 小林
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Original Assignee
Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB878718298A external-priority patent/GB8718298D0/en
Priority claimed from GB878725052A external-priority patent/GB8725052D0/en
Priority claimed from GB878726683A external-priority patent/GB8726683D0/en
Application filed by Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd filed Critical Fujisawa Pharmaceutical Co Ltd
Publication of JPH07163346A publication Critical patent/JPH07163346A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP2570633B2 publication Critical patent/JP2570633B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6456—Plasminogen activators
    • C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
    • C12P21/02—Preparation of peptides or proteins having a known sequence of two or more amino acids, e.g. glutathione
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)

Abstract

(57)【要約】 【構成】 少なくともフィンガーおよび成長因子ドメイ
ンが欠如しているグリコシル化されていない変異t−PA 【効果】 この発明の変異t−PAは遺伝子組み換え技術
により大腸菌で製造した時にもリホーディング効率がよ
くかつ血栓溶解剤として血中半減期も長いという好まし
い理化学的性質および生理学的性質を有する

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、新規な組織プラスミ
ノーゲン活性化因子に関するものである。詳細には、プ
ラスミノーゲンを、血栓のフイブリン網目構造を崩壊さ
せて可溶性生成物を生ぜしめるプラスミンへ転換させる
強い活性をもち、血栓溶解剤として有用な、新規な組織
プラスミノーゲン活性化因子、それのアミノ酸配列をコ
ードするDNA、それの製造法およびそれを含有する医薬
組成物に関するものである。
【０００２】
【従来の技術およびこの発明が解決しようとする問題
点】天然のヒト「組織プラスミノーゲン活性化因子」（以
下「t-PA」という）の全アミノ酸配列および構造ならび
にヒトメラノーマ細胞（Bowes）に由来するそれをコー
ドするDNA配列は、組換えDNA技術によって既に明らかに
されている［Nature301,214 (1983) 参照］。しかしな
がら、天然t-PAのアミノ酸配列を大腸菌で発現させて得
られた天然t-PAはリホールディングが困難で、従って、
培養大腸菌細胞からは活性なt-PAは極めて少量しか回収
できない。
【０００３】
【発明の構成および効果】この発明の発明者らは、種々
研究の結果、たとえ、組換大腸菌細胞から得たものであ
ってもよくリホールディングされる活性なt-PAを与え、
天然t-PAよりも長い半減期を呈し、さらに血栓溶解活性
も優れた新規t-PAを創製することに成功した。この発明
の新規t-PAは、その一次構造としての次のアミノ酸配列
(Ｉ)によって表わすことができる。
【化３】 （式中、ＲはSer−または
【化４】 であり、Ｘは−Lys−、−Ile−または結合手であり、Ｙ
は−TyrSerGlnProGlnPheArgIle−，−TyrSerGlnProGlnP
heAspIle−，−TyrSerGlnProIleProArgSer−または−Th
rLeuArgProArgPheLysIle−である）
【０００４】上記アミノ酸配列において、Asn184、Asn
218およびAsn448は、組換えDNA技術における宿主細胞の
種類に応じてグリコシル化されたものが製造できるが、
そのようなt-PAもこの発明の範囲に包含される。なお、
この明細書において、t-PAのアミノ酸配列の番号付け
は、特に断わり書きのない限り、Nature 301, 217 (198
3)に記載されている天然のt-PAの番号付けに従う。例え
ばAsn184は天然のt-PAのアミノ酸配列における第184番
目のアミノ酸であるアスパラギンを意味する。この明細
書においては、便宜上この発明の新t-PAについて次のコ
ード名を使用する。
【０００５】TTktPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、ＲがSer−であり、Ｘ
が−Lys−であり、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPheArgIle−
であるt-PAを意味する。 TTitPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、ＲがSer−であり、Ｘ
が−Ile−であり、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPheArgIle−
であるt-PAを意味する。 TQitPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、Ｒが天然t-PAのCys92
からSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Ile−で
あり、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPheArgIle−であるt-PAを
意味する。
【０００６】TQktPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、Ｒが天然tPAのCys92か
らSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Lys−であ
り、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPheArgIle−であるt-PAを意
味する。 STTktPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、ＲがSer−であり、Ｘ
が−Lys−であり、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPheAspIle−
であるt-PAを意味する。 STQktPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、Ｒが天然tPAのCys92か
らSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Lys−であ
り、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPheAspIle−であるt-PAを意
味する。
【０００７】STQitPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、Ｒが天然tPAのCys92か
らSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Ile−であ
り、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPheAspIle−であるt-PAを意
味する。 thTTtPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、ＲがSer−であり、Ｘ
が結合手であり、Ｙが−TyrSerGlnProIleProArgSer−で
あるt-PAを意味する。 uTTtPA 上記アミノ酸配列(Ｉ)において、ＲがSer−であり、Ｘ
が−Lys−であり、Ｙが−ThrLeuArgProArgPheLysIle−
であるt-PAを意味する。
【０００８】天然のt-PAは、単一のジスルフイド結合で
結合されるＨおよびＬ鎖の２鎖形態にプラスミンによっ
て転換されるところの単鎖セリンプロテアーゼである。
軽鎖(Ｌ)はプロテアーゼドメインであり、従ってこの酵
素の活性部位を含んでいる。重鎖(Ｈ)はフインガードメ
イン(Ｆ)（フイブロネクチン対して相同性をもつ）、成
長因子ドメイン(Ｅ)(表皮成長因子と相同性)および３つ
のジスルフイド結合をもつ２つのクリングル（すなわち
クリングル１およびクリングル２ドメイン；Ｋ1 および
Ｋ2 ）を有する。従って、天然のt-PAは５つの機能性ド
メインＦ、Ｅ、Ｋ1 、Ｋ2 およびＬからなる［ヨーロッ
パ特許出願公開公報第0196920号およびProc. Natl. Aca
d. Sci. USA 83, 4670 (1986)参照］。それゆえ、この
発明は、(1) フインガードメインおよび成長因子ドメイ
ンを欠く、グリコシル化されていないt-PAおよび(2) フ
インガードメインおよび成長因子ドメインを欠き、ヒト
および動物起源の他の蛋白質を本質的に含まないt-PAを
も提供するものであることを理解されたい。
【０００９】上に定義したt-PAは、天然t-PAのＨ鎖のク
リングル１およびクリングル２ドメインおよびＬ鎖から
なるt-PAならびに該t-PAのアミノ酸配列の欠失または置
換によって調製されたt-PA（たとえば、天然t-PAのＨ鎖
のクリングル２ドメインとＬ鎖とからなるt-PA、Lys277
がIle277で置換されており、および／またはArg275がGl
y275、Glu275、Asp275等で置換されている上に例示した
t-PA）を包含する。この発明の新規t-PAは、組換えDNA
技術およびポリペプチド合成によって製造される。すな
わち、この発明の新規なt-PAは、該新規t-PAのアミノ酸
配列をコードするDNAを含んでいる発現ベクターで形質
転換した宿主細胞を培地に培養し、培養物から該新規t-
PAを採取することによって製造できる。
【００１０】上記製造法の詳細を以下に説明する。宿主
細胞は、微生物［細菌（たとえば、大腸菌（Escherichi
a coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、等）、酵母
（たとえばパン酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）、
等］、培養ヒト細胞および培養動物細胞（たとえばCHO
細胞、Ｌ929細胞、等）および培養植物細胞を包含しう
る。微生物の好ましい例は細菌、とくにエシエリヒア属
に属する菌株（たとえば E. coli HB101ATCC 33694, E.
coliHB101-16 FERM BP-1872, E.coli 294 ATCC 31446,
E. coli X 1776 ATCC 31537,等）パン酵母、動物細胞
（例えばマウスＬ929細胞、チャイニーズ・ハムスター
・オバリー（CHO）細胞等）などが含まれる。細菌、特
に大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクタ
ーは、通常、少なくともプロモーター・オペレーター領
域、開始コドン、新規t-PAのアミノ酸配列をコードする
DNA、終止コドン、ターミネーター領域および自己複製
可能ユニットから構成されるのが通常であり、酵母や動
物細胞を宿主細胞として用いる場合には、発現ベクター
は少なくともプロモーター領域、開始コドン、シグナル
・ペプチドおよび新規t-PAのアミノ酸配列をコードする
DNAならびに終止コドンから構成されるのが好ましく、
さらにエンハンサー配列、天然t-PAの５′−および３′
−非コード領域、スプライシング・ジャンクション、ポ
リアデニル化部位および自己複製可能単位を挿入するこ
ともできる。プロモーター・オペレーター領域は、プロ
モーター、オペレーターおよびシヤイン−ダルガーノ
（SD）配列（たとえばAAGG、等）からなり、プロモータ
ー・オペレーター領域の例としては、慣用のプロモータ
ー・オペレーター領域（たとえば、ラクトースオペロ
ン、PL−プロモーター、trp−プロモーター、等）が挙
げられ、哺乳動物細胞における新規t-PAの発現のための
プロモーター領域としては、HTLV−プロモーター、SV40
初期および後期プロモーター、LTR−プロモーター、マ
ウス・メタロチオネインＩ（MMT）−プロモーターおよ
びワクシニア−プロモーター等が挙げられる。
【００１１】好ましい開始コドンはメチオニンコドン(A
TG)が挙げられる。シグナル・ペプチドをコードするDNA
としてはt-PAをコードするDNAが挙げられる。新規t-PA
またはシグナル・ペプチドのアミノ酸配列をコードする
DNAは、たとえば、DNA合成装置を用いての部分または全
DNA合成あるいは形質転換体［たとえば E. coli LE 392
λ+ (pTPA21), E. coli JA 221 (pTPA25) ATCC 39808,
E. coli JA 221 (pTPA102) (Lys 277→Ile) ATCC 3981
1, E. coli JM 109 (p51H) FERM P-9774, E. coli JM 1
09(pN53) FERM P-9775、E. coli DH-l(pST112) FERM BP-
l966等］から得られるベクター[たとえば、pTPA21、pTP
A25、pTPA102(Lys 277→Ile)、p51H、pST112等] に挿入
された天然または変異t-PAをコードする完全なDNA配列
またはゲノムの常法による処理（たとえば、制限酵素に
よる消化、細菌アルカリホスフアターゼによる脱燐酸、
T4DNAリガーゼを用いたライゲーション）によって調製
することができる。 終止コドンとしては慣用されている終止コドン（たとえ
ばTAG、TGA、等）が挙げられる。
【００１２】ターミネーター領域としては、天然または
合成のターミネーター（たとえば、合成fdファージター
ミネーター、等）が挙げられる。自己複製可能ユニット
としては、それに属する全DNAを宿主細胞中で自己複製
しうるDNA配列で、天然のプラスミド、人工的に修飾し
たプラスミド（たとえば、天然プラスミドから調製した
DNA断片）および合成プラスミドが挙げられる。このプ
ラスミドの好ましい例としては、大腸菌を宿主細胞とす
る場合に例えばプラスミドpBR322またはその人工修飾体
（pBR322の適当な制限酵素処理によって得られたDNA断
片）が挙げられ、動物細胞を宿主細胞とする場合に例え
ばプラスミド、pRSVneo ATCC37198、プラスミドpSV2dhf
r ATCC37145、プラスミドpdBPV-MMTneo ATCC37224、プ
ラスミドpSV2neo ATCC37149が挙げられる。エンハンサ
ー配列としては、例えばSV40のエンハンサー配列が挙げ
られる。ポリアデニル化部位としては、例えばSV40のポ
リアデニル化部位が挙げられる。
【００１３】スプライシング・ジャンクションとして
は、例えばSV40のスプライシング・ジャンクションが挙
げられる。プロモーター−オペレーター領域、開始コド
ン、新規t-PAのアミノ酸配列をコードするDNA、終止コ
ドンおよびターミネーター領域は、適当な自己複製可能
ユニット（プラスミド）と共に、連続的に環状に、所望
により適当なDNA断片（例えば、リンカー、他の制限部
位、等）を用いて、常法（例えば、制限酵素による消
化、T4ポリヌクレチドキナーゼを用いた燐酸化、T4DNA
リガーゼを用いたライゲーション）により連結して、発
現ベクターを調製でき、哺乳動物細胞を宿主として用い
る場合には、エンハンサー配列、プロモーター領域、天
然t-PAの５′−非コード領域、開始コドン、シグナル・
ペプチドおよび新規t-PAのアミノ酸配列をコードするDN
A、終止コドン、３′−非コード領域、スプライシング
・ジャンクションおよびポリアデニル化部位を上記慣用
の手法で適当な自己複製可能ユニットに連続的にかつ環
状に連結して発現ベクターを調製してもよい。その発現
ベクターを宿主細胞に導入する。導入は常法（たとえ
ば、形質転換、マイクロインジエクション、等）によっ
て実施でき、形質転換体が得られる。この発明の製法に
おける新規t-PAの製造のためには、このようにして得た
発現ベクター含有形質転換体を培地に培養する。
【００１４】培地は、炭素源（たとえば、グルコース、
グリセリン、マンニトール、フルクトース、ラクトー
ス、等）および無機または有機の窒素源（たとえば、硫
酸アンモニウム、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解
物、酵母エキス、ポリペプトン、バクトトリプトン、牛
肉エキス、等）を含有する。所望により、他の成分［た
とえば、無機塩類（たとえば、重燐酸ナトリウムまたは
カリウム、燐酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫
酸マグネシウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（たと
えば、ビタミンＢ1 ）、抗生物質（たとえば、アンピシ
リン）、等］を培地に加えてもよい。形質転換体の培養
は、一般に、pH5.5〜8.5（好ましくはpH７〜7.5）、18
〜40℃（好ましくは25〜38℃）で、５〜50時間にわたっ
て実施すればよい。大腸菌のような細菌を宿主細胞とし
て用いる場合には、製造された新規t-PAは、通常、培養
形質転換体細胞中に存在するので、細胞を濾過または遠
心分離によって集め、細胞壁および／または細胞膜を常
法（たとえば、超音波および／またはリゾチームによる
処理、等）により破壊して、デブリスとする。このデブ
リスから、新規t-PAを、天然または合成の蛋白質の精
製、単離に一般的に用いられている通りの常法［たとえ
ば、適当な溶媒（たとえば、８Ｍ尿素水溶液、６Ｍグア
ニジウム塩水溶液、等）による蛋白質の溶解、透析、ゲ
ル濾過、カラムクロマトグラフィー、高速液体クロマト
グラフィー、等］により精製、単離でき、動物細胞を宿
主細胞として用いる場合には、製造された新規t-PAは通
常、培養液中に存在するので、培養濾液（上澄液）を濾
過または遠心により培養物から得て、これから上述した
ような常法により精製することができる。
【００１５】このようにして製造した新規t-PAのリホー
ルディングのためには、新規t-PAのグアニジンまたは尿
素溶液を、還元型グルタチオン（GSH）および酸化型グ
ルタチオン（GSSG）の存在下に、半透膜の内側および外
側のグルタチオン濃度を同じにして、４〜40℃で２〜60
時間透析することからなる透析法を採用するのが好まし
い。この方法では、グルタチオン濃度は２mM以上である
ことが好ましく、還元型グルタチオンと酸化型グルタチ
オンの比率は10：１とするのが好ましい。なお、この方
法では、両グルタチオンをシステインおよびシスチンで
置き換えることができる。これらの方法は、組換えDNA
技術により製造された、天然t-PAを含む全てのt-PAのリ
ホールディングのために好ましく使用できる。この発明
の新規t-PAは、血管疾患（たとえば、心筋梗塞、卒中、
心臓発作、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末梢動脈閉塞、
等）の治療のための血栓溶解剤として有用である。この
発明の新規t-PAは、医薬として許容しうる担体と混合し
て、注入剤のごとき医薬製剤の形で、ヒトを含めた哺乳
動物に非経口的に投与できる。医薬として許容できる担
体は、ペプチドまたは蛋白質（たとえば、血清アルブミ
ン、等）を含有する医薬組成物の調製に慣用されている
種々の有機または無機の担体材料を包含しうる。
【００１６】この発明の新規t-PAの投与量は、疾患の種
類、患者の体重および／または年令、さらに投与経路の
種類のごとき種々の因子に応じて変動するが、この発明
の新規ｔ-PAの最適投与量は、通常、注射または注入の
場合は0.1〜10mg／kg／日の中から選択される。上記の
一日量は、数時間ごとに分割して患者に与えてもよい。
（オリゴヌクレオチドの）モノ（またはジ、またはト
リ）マ−は、たとえば広瀬の方法［蛋白質核酸酵素 25,
255(1980)参照］により調製でき、カップリングは、た
とえばセルロースまたはポリスチレンポリマー上で燐酸
トリエステル法［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids Research）9, 1691(1981),同誌 10, 1
755(1982)参照］によって実施できる。以下の実施例は
この発明をさらに詳細に説明するためのものであって、
それらに限定されるものではない。実施例中、使用した
酵素（たとえば、制限酵素、細菌アルカリホスファター
ゼ、T4DNAリガーゼ等）は全て市販のものであり、それ
ら酵素の使用条件は、たとえば市販の酵素に添付されて
いる説明書を参照すれば、当業者にとっては自明のとこ
ろである。
【００１７】実施例１（オリゴヌクレオチドの合成） 下記オリゴヌクレオチド類を、上記のごとく常法によ
り、調製した。 1) pHVBB用：
【化５】 HP10;AG-CTT-CAG-GAT HP7 ;ATC-GAA-GGT-AGA-TCT-G HP11;C-GAT-ATC-CTG-A HP9 ;GA-TCC-AGA-TCT-ACC-TT 2) pTQiPAΔtrpおよびpTQkPAΔtrp用：
【化６】 HP23;C-GAT-AAA-AT HP24;G-TGT-TAT-GAG HP25;ACA-CAT-TTT-AT HP26;GTC-CTC-ATA TQitPAまたはTQktPAのCys1 は、ネイチャー（Nature）3
01, 214 (1983)に報告されている天然t-PAのCys92に対
応している。 3) pTTkPAΔtrpおよびpTTiPAΔtrp用：
【化７】 HP31;C-GAT-AAA-ATG-TC HP32;TC-AGA-CAT-TTT-AT TTktPAまたはTTitPAのSer1 は、ネイチャー301,214 (19
83)に報告されている天然t-PAのSer174に対応してい
る。
【００１８】 実施例２（プラスミドpHVBBの構築およびクローニン
グ） （第１図に図示）オリゴデオキシリボヌクレオチドHP７
およびHP11（各0.2ナノモル 実施例１−(1)参照）を、
ライゲーション緩衝液（１mM ATP, 50mM トリス−HCl
（pH7.6）,10mM MgCl2, 20mMジチオスレイトール, １mM
スペルミジン, 50μg／mlウシ血清アルブミン）20μl中
で、T4ポリヌクレオチドキナーゼ（宝酒造）2.5単位を
用いて、37℃で１時間燐酸化した。熱による酵素不活性
化ののち、反応混合物に他のオリゴデオキシリボヌクレ
オチドHP10およびHP９（各0.4ナノモル）、20mM ATP１
μlおよびT4 DNAリガーゼ（宝酒造）900単位を加えた。
得られた混合物を15℃で30分間加温して、粗製の27bpDN
A断片を得た。他方、pCLaHtrp3t（α−hANPのための発
現ベクター、その調製法は、例えばヨーロッパ特許出願
公開公報第0206769号に記載されている）をBamHIおよび
HindＩＩＩにより消化した。生じた4137bp DNA断片を0.
8％アガロースゲル電気泳動により単離し、T4 DNAリガ
ーゼの存在下に、前記27bp DNA断片に連結した。ライゲ
ーション混合物を用いてE.coli DH-１［マニアティス
（Maniatis）, T.ほか, モレキュラークローニング（Mo
lecular Cloning）, ページ505（1982）, コールドスプ
リングハーバーラボラトリー（ニューヨーク）参照］を
形質転換した。アンピシリン耐性形質転換体の一つか
ら、所望のプラスミドpHVBB(4164bp)を単離し、制限酵
素(BglＩＩ, EcoRV, PstＩ, HindＩＩＩおよびBamHI)消
化によって特性を確認した。
【００１９】実施例３（プラスミドpCLiPAxtrpの構築お
よびクローニング） （第２図に図示）pHVBBをBglＩＩにより消化した。生じ
た4164bp線状DNAを、200mMトリス−HCl（pH8.0）中で、
細菌アルカリホスファターゼ（宝酒造）とともに37℃で
１時間加温して、該DNAの両５′末端を脱燐酸した。生
じたDNAを５％ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAG
E）により単離した。他方、pTPA102(Lys277→Ile)[変異
t-PA(Lys277→Ile)のための発現ベクター、これを含有
する形質転換体は E. coli JA221（pTPA102）（Lys277
→Ile）ATCC 39811］をBglＩＩにより消化し、1974bpの
DNA断片（そのDNA配列は第３図に示されている）を単離
した。この断片を、T4DNAリガーゼの存在下に4164bp DN
A断片に連結した。E. coli MM294 ATCC 33625を形質転
換後、ペプチドCLa遺伝子の下流に時計の針の回転方向
に1974 bpのt-PA遺伝子が挿入された所望のプラスミドp
CLiPAxtrp（6138 bp）を担持するアンピシリン抵抗性形
質転換体を得た。pCLiPAxtrpを、制限エンドヌクレアー
ゼ（PvuＩＩ, EcoRIおよびBglＩＩ）消化により特性決
定した。
【００２０】実施例４（プラスミドpCLiPAΔxtrpの構築
およびクローニング） （第４図に図示）pCLiPAxtrpをBamHIおよびSacＩにより
消化し、生じた5388bpのDNA断片を単離した。他方、pCL
iPAxtrpをSau3AIおよびSacＩで消化した。生じた389bp
のDNA断片を、T4 DNAリガーゼの存在下に、5388bpのDNA
断片に連結した。ライゲーション混合物を用いて E. co
li DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転
換体の一つから、所望のプラスミドpCLiPAΔxtrp（5777
bp）を単離し、制限エンドヌクレアーゼ（ClaＩ、EcoR
I、XhoＩ、NarＩおよびSacＩ）消化により特性決定し
た。
【００２１】実施例５（プラスミドpTQiPAΔtrpの構築
およびクローニング） （第５図に図示）上記のpTPA102（Lys277→Ile）をAva
ＩＩおよびBbeＩ（４ヌクレオチド長の単鎖粘着末端を
生じるNarＩのイソシゾマー）で消化し、生じた50bp
の、天然t-PAのAsp95−Ala111をコードするDNA断片を単
離した。他方、HP23、HP24、HP25およびHP26（実施例１
参照）からT4ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4 DNAリ
ガーゼを用いて19bpの合成ClaＩ−AvaＩＩDNA断片を調
製した。これを、T4 DNAリガーゼを用いて、50bpDNA断
片に連結して、69bpのClaＩ−BbeＩDNA断片を構築し
た。pCLiPAΔxtrpを、BbeＩによる部分消化によって線
状化した。生じた5777bpのDNA断片をClaＩで消化し、51
49bpのDNA断片を単離した。これを、T4 DNAリガーゼの
存在下に、69bpのClaＩ−BbeＩDNA断片に連結した。ラ
イゲーション混合物を用いて E. coli DH−１を形質転
換した。アンピシリン抵抗性形質転換体の一つから、所
望のプラスミドpTQiPAΔtrp（5218 bp）を得て、これを
制限エンドヌクレアーゼ消化によって特性決定した。E.
coli HB101−16［HB101（recA+, supE+ htpR16(am), t
etr ）FERM BP-1872をpTQiPAΔtrpにより形質転換し
て、形質転換体 E. coli HB101−16（pTQiPAΔtrp）を
得た。
【００２２】実施例６（プラスミドpTA9004の構築およ
びクローニング） （第６図に図示）pCLiPAΔxtrpをDdeＩおよびEcoRIによ
り消化し、天然t-PAのGlu175−Trp204をコードする91bp
のDNA断片を単離した。得られたDNAを、T4ポリヌクレオ
チドキナーゼおよびT4DNAリガーゼを用いて、オリゴデ
オキシリボヌクレオチドHB31およびHB32（実施例１−
(3)参照）に連結した。生じた103bpのClaＩ−EcoRI DNA
断片を、T4DNAリガーゼの存在下に、pCLiPAΔxtrpの439
7bp ClaＩ−EcoRI断片に連結した。ライゲーション混合
物を用いて、E. coli DH−１を形質転換した。アンピシ
リン抵抗性形質転換体の一つから、所望のプラスミドpT
A9004（4500bp）を得た。
【００２３】実施例７（プラスミドpTTkPAΔtrpの構築
およびクローニング） （第７図に図式）pTA9004をEcoRIで消化し、生じたDNA
断片(4500bp)を細菌アルカリホスファターゼを用いて脱
燐酸した。他方、天然t-PAをコードする完全なcDNA配列
および３′−非コード領域の一部を含むプラスミドpTPA
21をEcoRIで消化し、天然t-PAのAsn205−Lys361をコー
ドする472bpのDNA断片（そのDNA配列は第８図に示され
ている）を単離した。得られたDNA断片を、T4DNAリガー
ゼの存在下に、脱燐酸した4500bpのEcoRI DNA断片に連
結した。ライゲーション混合物を用いてE. coli DH−１
を形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換体の一つ
から、所望のプラスミドpTTkPAΔtrp(4972bp)を単離し
た。E. coli HB101-16をpTTkPAΔtrpで形質転換して、
形質転換体E. coli HB101−16（pTTkPAΔtrp）を得た。
【００２４】実施例８（プラスミドpTTiPAΔtrpの構築
およびクローニング） （第９図に図示）pTA9004をEcoRIにより消化し、得られ
たDNAを細菌アルカリホスファターゼを用いて脱燐酸し
た。他方、上述の pTPA102(Lys277→Ile)をEcoRIで消化
し、変異t-PA（Lys277→Ile）のAsn205−Lys361をコー
ドする472bpのDNA断片を単離した。得られたDNA断片
を、T4DNAリガーゼの存在下に、脱燐酸した4500bpのEco
RIDNA断片に連結した。ライゲーション混合物を用いて
E. coli DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性形
質転換体の一つから、所望のプラスミドpTTiPAΔtrp（4
972bp）を単離した。E. coli HB101−16をpTTiPAΔtrp
で形質転換して、形質転換体 E. coli HB101−16（pTTi
PAΔtrp）を得た。
【００２５】実施例９（発現および単離） E. coli HB101−16（pTTkPAΔtrp）の単一コロニーを、
試験管中の、バクトトリプトン10ｇ、酵母エキス５ｇ、
NaCl５ｇ、アンピシリン50μg／mlを滅菌LA培地（pH7.2
−7.4）５ml中へ接種し、振とう条件下に37℃で８時間
加温した。培養物を、フラスコ中の新鮮な滅菌LA培地10
0mlに加え、振とう条件下に37℃で15時間加温した。得
られた培養物の一部（20ml）を、25μg／mlのアンピシ
リンを含有する滅菌M9CA培地400mlに加え、37℃で加温
した。培養物のA600がおよそ0.6に達したとき、培養物
にβ−インドールアクリル酸を最終濃度10μg／mlとな
るように添加した。得られたブロスを37℃で３時間加温
し、４℃、8,900×ｇで10分間遠心分離した。集めた細
胞を、５mM EDTA含有10mMトリス−HCl（pH8.0）100mlに
懸濁し、４℃で50mgのリゾチームで１時間処理した。得
られた混合物をバイオトロン（Biotron）ブレンダーに
よりホモジナイズし、４℃、8,900×ｇで30分間遠心分
離した。ペレットを50％グリセロール水溶液100mlで洗
い、８Ｍ尿素含有10mMトリス−HCl（pH8.0）800mlに溶
解した。この尿素溶液に、GSH（興人）480mgおよびGSSG
（興人）96mgを加えた。生じた混合物を、20mM酢酸、40
mMアンモニア、２mM GSHおよび0.2mM GSSGを含有する緩
衝液（pH9.5）16ｌに対して２回、４℃で15時間透析し
た。混合物を遠心分離後、上澄液を、次のフィブリンプ
レートアッセイによって検定した。フィブリンプレート
アッセイ(FPA)は、アストルプーミュラーツ法［Astrup
T. と Mullertz S., アーカイヴズ・オブ・バイオケミ
ストリ・アンド・バイオフィジックス(Arch. Biochem.
Biophys.)40 346−351 (1952)］に従い、これを僅かに
変法して実施した。100mM燐酸緩衝液（pH7.2）中の1.2
％ヒトプラスミノーゲン・リッチ・フィブリノーゲン
（ミドリ十字）溶液５mlを同じ緩衝液中のトロンビン
（持田、50単位）溶液５mlと混合し、室温で１時間放置
することにより、フィブリンプレートを調製した。検体
溶液またはヒト天然t-PA（WHO標準品）（各10μl）を37
℃で18時間インキュベートした。ヒト天然t-PAを標準と
して、試料の活性を溶解帯域の面積から計算した。アッ
セイの結果、TTkPAを含有する上澄液のt-PA活性は、2.3
×105 IU（天然t-PAの）／ｌであった。
【００２６】実施例10（発現および単離） E. coli HB101−16（pTTiPAΔtrp）の単一コロニーを、
実施例９に記載したのと実質的に同様にして培養し、得
られた培養物からTTitPAを単離した。得られたTTitPA含
有上澄液のt-PA活性は2.0×104 IU（天然t-PAの）／ｌ
であった。
【００２７】実施例11（発現および単離） E. coli HB101−16（pTQiPAΔtrp）の単一コロニーを、
実施例９に記載したのと実質的に同様にして、培養し、
得られた培養物からTQitPAを単離した。得られたTQiTPA
含有上澄み液t-PA活性は2.0×104 IU（天然t-PAの）／
ｌであった。
【００２８】実施例12（TTktPAの精製） 全ての操作を冷室（４−６℃）で行った。プラスミノー
ゲン活性化因子、リホールディグされた上澄液中のTTkt
PA、を次のようにして単離、精製した。第一工程では、
実施例９に記載した方法と同様にして得た培養物20リッ
トルから調製した上澄液［全TTktPA活性：3.4×106 IU
（天然t-PA（WHO）の）］を、１Ｍ NaClおよび0.01％(v
/v)トウィーン（Tween）80を含有する0.05Ｍトリス−HC
l（pH8.0）により平衡化したベンズアミジン・セファロ
ース・カラム［1.6cm×３cm；文献：ラス・ホルムバー
グ（Las Holmberg）ら、BBA, 445, 215-222(1976)記載
のカルボジイミド法によってｐ−アミノベンズアミジン
を共役結合によりCHセファロース４Ｂ（ファルマシア）
に結合させた］にかけ、同じ緩衝液で洗浄した。プラス
ミノーゲン活性化因子を、１Ｍアルギニンおよび0.01％
(v/v)のトウィーン80を含有する0.05Ｍトリス−HCl(pH
8.0)で溶出した。
【００２９】次の工程では、プールした活性画分を、0.
1Ｍトリス−HCl（pH8.0）で平衡化したIgG結合セファロ
ース（FTP1163）カラム(1.6cm×３cm)［モノクローナル
抗t-PA抗体：FTP1163（カイズ・ツトムら、トロンボー
シス・リサーチ（ThrombosisResearch, 40, 91−99(198
5)を、メーカーの指示に従って、CNBr活性化セファロー
ス４Ｂに結合させた］にかけた。カラムを、１M NaCl、
0.01％（v/v）トウィーン80およびアプロチニン（10KIU
／ml、シグマ）を含有する0.1Ｍトリス−HCl（pH8.0）
で洗浄した。溶出は、0.5M NaCl、0.01％トウィーン８
０およびアプロチニン（10KIU／ml）を含有する0.1Ｍグ
リシン−HCl（pH2.5）を用いて行った。最後の工程で
は、IgGセファロース(FTP 1163)カラムから得てプール
した活性画分を、1.6M KSCNおよび0.01％（v/v）トウィ
ーン80を含有する0.01Ｍ燐酸緩衝液（pH7.4）１リット
ルに対して透析した。透析した溶液を、固体ポリエチレ
ングリコール20,000に対する透析によって約２mlに濃縮
した。得られた濃縮物を、1.6M KSCNおよび0.01％（v/
v）トウィーン80を含有する0.01Ｍ燐酸緩衝液（pH7.4）
中、セファクリルS200HR(ファルマシア、1.6cm×90cm)
でゲル濾過した。プールした活性画分を、固体ポリエチ
レングリコール20,000に対する透析によって約10mlに濃
縮し、濃縮物をついで、0.15M NaClおよび0.01％（v/
v）トウィーン80を含有する0.1Ｍ重炭酸アンモニウムに
対して透析し、精製TTktPA（3.4mg,7.35×105 IU（天然
t-PA（WHO）の）／mg蛋白質）を含有する透析物を得
た。
【００３０】精製したTTktPAは次の特性を有する： (ｉ) SDS PAGE分析 ラエムリの方法［U. K. Laemmli, ネイチャー（Natur
e）（ロンドン）227, 680−685 (1970)］に従って、15
％ポリアクリルアミドゲルを調製した。このゲルを銀染
色した［ペーリング(H. M.Poehling)ら、エレクトロフ
ォレシス（Electrophoresis）, 2, 141 (1981)］。この
ようにして精製されたTTktPAは、SDS-PAGEに際して、還
元条件下では35ｋドルトンのところに単一のバンドとし
て、非還元的条件下では32ｋドルトンのところに単一バ
ンドとして、それぞれ泳動する。一方、プラスミンセフ
ァロース［パ−・ウォリン（Per Wallin）ら、BBA, 71
9, 318−328 (1982)］と共に加温した試料は、還元剤の
存在下では30ｋドルトン（プロテアーゼドメイン）およ
び13.5ｋドルトン（クリングルドメイン）のところに２
つのバンドを生じ、還元剤不在下では32ｋドルトンのと
ころに単一のバンドを与えた。
【００３１】(ｉｉ) HPLC 精製TTktPAを（4.6mm×75mm）ウルトラポアRPSCカラム
（ベックマン、米国）にかけた。溶出は、0.1％（v/v）
トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの線状勾配（10−
60％(v/v)）を用い、流速1.0ml／分で30分間にわたって
行った。この系では、TTktPAは、アセトニトリル濃度お
よそ36.5％（v/v）で単一の主要種として溶出された。 (ｉｉｉ) Ｎ末端配列分析 精製一本鎖TTktPAを還元し、カルボキシメチル化し、HP
LC（ウルトラポアRPSC）カラムで脱塩し、スピード・ヴ
ァク（Speed Vac）濃縮装置（サヴァント(Savant)）で
濃縮し、370A型気相シーケンサー（アプライドバイオシ
ステム）を用いて分析した。TTktPAのＮ末端アミノ酸配
列は次の通りであった。SerGluGlyAsn−
【００３２】実施例13（プラスミドpTQkPAΔtrpの構築
およびクローニング） （第10図に図示）プラスミドpTQiPAΔtrpをEcoRIで消化
した。反応混合物を細菌アルカリホスファターゼを用い
て脱燐酸し、生じた4744bp DNA 断片を単離した。他
方、プラスミドpTPA21をEcoRIで消化し、生じた472bpの
DNA断片を単離した。この472bp DNA断片を、T4DNAリガ
−ゼの存在下に、4744bp DNA断片に連結し、ライゲーシ
ョン混合物を用いて E. coli DH−１を形質転換した。
アンピシリン抵抗性の形質転換体の一つから、所望のプ
ラスミドpTQkPAΔtrpを単離し、制限マッピングにより
特性決定をした。E. coli HB101−16をプラスミドpTQkP
AΔtrpで形質転換して、形質転換株E. coliHB101−16
（pTQkPAΔtrp）を得た。
【００３３】実施例14（オリゴヌクレオチドの合成） 上記した通りの常法により、下記オリゴヌクレオチドを
調製した。 1) pSTTktrpおよびpSTQktrp用のリンケージ配列：
【化８】 2) pSTQitrp用のリンケージ配列
【化９】 3) pthTTtrp用のリンケージ配列
【化１０】 4) puTTtrp用のリンケージ配列
【化１１】 アミノ酸上方の番号は、ペニカ（Pennica）ら［ネイチ
ャー301, 214−221 (1983)］の報告している天然t-PAで
の位置を示している。
【００３４】実施例15（プラスミドpMH9003の構築およ
びクローニング） （第11図に図示）プラスミドpTA9004をEcoRIおよびStu
Ｉで消化し、生じた4329bp DNA断片を単離した。このDN
A断片を、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4DNAリガ
ーゼを用いて、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドSK
１およびSK２に連結した。反応混合物をEcoRIで処理し
て、EcoRI消化粘着末端を再構築し、生じたEcoRI−Dde
Ｉ DNA断片（4367bp）を、T4 DNAリガーゼの存在下に、
プラスミドpCLiPAΔxtrpから得た天然t-PAのAsn205−Le
u266をコードする184bpのEcoRI−DdeＩ DNA断片に連結
した。ライゲーション混合物を用いて E. coliDH−１を
形質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つ
から、所望のプラスミドpMH9003を単離し、制限エンド
ヌクレアーゼ消化によって特性決定した。
【００３５】実施例16（プラスミドpSTTktrpの構築およ
びクローニング） （第12図に図示）プラスミドpMH9003をStuＩで消化し、
生じたDNA断片（4551 bp）をコウシ腸ホスファターゼ
(ファルマシアAB)により脱燐酸した。他方、プラスミド
pCLiPAΔxtrpをStuＩで消化し、生じた、天然t-PAのGly
279−Ala419をコードする419 bpのDNA断片を単離した。
得られたDNA断片を、T4DNAリガーゼの存在下に、4551bp
のStuＩDNA断片に連結した。ライゲーション混合物を用
いてE. coli DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗
性形質転換株の一つから、所望のプラスミドpSTTktrpを
単離し、制限エンドヌクレアーゼ消化により特性決定し
た。E. coli HB101−16をプラスミドpSTTktrpで形質転
換して、形質転換株E. coli HB101−16（pSTTktrp）を
得た。
【００３６】実施例17（プラスミドpZYの構築およびク
ローニング） （第13図に図示）プラスミドpTQiPAΔtrpをEcoRIおよび
StuＩで消化し、生じた4575bpのDNA断片を単離した。こ
のDNA断片を、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4DNA
リガーゼを用いて、合成オリゴデオキシリボヌクレオチ
ドHP56およびHP57と連結した。反応混合物をEcoRIで処
理して、EcoRI消化粘着末端を再構築し、生じたEcoRI−
DdeＩDNA断片（4613 bp）を、T4DNAリガーゼの存在下
に、プラスミドpCLiPAΔxtrpから調製した、天然t-PAの
Asn205−Leu266をコードする184 bpのEcoRI−DdeＩDNA
断片に連結した。ライゲーション混合物を用いてE. col
i DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転
換株の一つから、所望のプラスミドpZYを単離し、制限
マッピングにより特性決定した。
【００３７】実施例18（プラスミドpSTQitrpの構築およ
びクローニング） （第14図に図示）プラスミドpZYをStuＩで消化し、生じ
たDNA断片（4797bp）をコウシ腸ホスファターゼによ り
脱燐酸した。他方、プラスミドpCLiPAΔxtrpをStuＩで
消化し、生じた、天然t-PAのGly279−Ala419をコードす
る419bpのDNA断片を単離した。419bpのDNA断片を、T4DN
Aリガーゼの存在下に、4797bpのDNA断片に連結した。こ
のライゲーション混合物を用いてE. coli DH−１を形質
転換した。アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、
所望のプラスミドpSTQitrpを単離し、制限マッピングに
より特性決定した。E. coli HB101−16をプラスミドpST
Qitrpで形質転換して、形質転換株E. coli HB101−16
（pSTQitrp）を得た。
【００３８】実施例19（プラスミドpSTQktrpの構築およ
びクローニング） （第15図に図示）プラスミドpSTTktrpをClaＩおよびEco
RVで消化し、生じた4656 bp DNA断片を単離した。他
方、プラスミドpSTQitrpをClaＩおよびEcoRVで消化し、
STQitPAのCys1 −Asp184をコードする560 bpのDNA断片
を単離した。得られたDNA断片を、T4DNAリガーゼの存在
下に、4656bpのDNA断片に連結した。このライゲーショ
ン混合物を用いて、E.coli DH−１を形質転換した。ア
ンピシリン抵抗性の形質転換株の一つから、所望のプラ
スミドpSTQktrpを単離し、制限マッピングにより特性決
定した。E. coli HB101−16をpSTQktrpで形質転換し
て、形質転換株HB101−16（pSTQktrp）を得た。
【００３９】実施例20(プラスミドpMH9006の構築および
クローニング) （第16図に図示）プラスミドpTA9004をStuＩおよびEcoR
Iで消化し、生じた4329bpのDNA断片を単離した。このDN
A断片を、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4DNAリガ
ーゼを用いて、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドHP
60およびHP61に連結した。このライゲーション混合物を
EcoRIで処理して、EcoRI消化粘着末端を再生し、生じた
EcoRI−DdeＩDNA断片(4364bp)を、プラスミドpCLiPAΔx
trpから調製した、天然t-PAのAsn205−Leu266をコード
する184bpのEcoRI−DdeＩ DNA断片に連結した。このラ
イゲーション混合物を用いてE. coli DH−１を形質転換
した。アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望
のプラスミドpMH9006を単離し、制限マッピングによっ
て特性決定した。
【００４０】実施例21（pthTTtrpの構築およびクローニ
ング） （第17図に図示）プラスミドpMH9006をStuＩで消化し、
生じた線状化DNA断片（4548bp）をコウシ腸ホスファタ
ーゼにより脱燐酸した。他方、プラスミドpCLiPAΔxtrp
をStuＩで消化し、天然t-PAのGly279−Ala419をコード
する419bpのDNA断片を単離した。得られたDNA断片を、T
4 DNAリガーゼの存在下に、4548 bp のDNAを断片に連結
した。ライゲーション混合物を用いてE. coli DH−１を
形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換株の一つか
ら、所望のプラスミドpthTTtrpを単離し、制限マッピン
グによって特性決定した。E. coli HB101−16をプラス
ミドpthTTtrpで形質転換し、形質転換株E.coli HB101−
16（pthTTtrp）を得た。
【００４１】実施例22(プラスミドpMH9007の構築および
クローニング) （第18図に図示）プラスミドpMH9003をEcoRIおよびEcoR
Vで消化し、4340 bp のDNA断片を単離した。得られたDN
A断片を、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4DNAリガ
ーゼを用いて、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドHP
58およびHP59と連結した。ライゲーション混合物をEcoR
Iで処理してEcoRI消化粘着末端を再生させた。得られた
DNA断片（4367 bp）を、T4DNAリガーゼの存在下に、プ
ラスミドpCLiPAΔxtrpから得た184 bpのEcoRi−DdeＩ D
NA断片と連結した。ライゲーション混合物を用いてE. c
oli DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性の形質
転換株の一つから、所望のプラスミドpMH9007を単離
し、制限マッピングによって特性決定した。
【００４２】実施例23（プラスミドpuTTtrpの構築およ
びクローニング） （第19図に図示）プラスミドpMH9007をStuＩで消化し、
生じた線状化DNA断片（4551bp）をコウシ腸ホスファタ
ーゼにより脱燐酸した。他方、プラスミドpCLiPAΔxtrp
をStuＩで消化し、生じた419 bpの断片を単離した。419
bp DNA断片を、T4DNAリガーゼの存在下に、4551 bp DN
A断片と結合した。このライゲーション混合物を用いて
E. coli DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性形
質転換株の一つから、所望のプラスミドｐuTTtrpを単離
し、制限マッピングにより特性決定した。E. coli HB10
1−16をプラスミドpuTTtrpにより形質転換して、形質転
換株E. coli HB101−16（puTTtrp）を得た。
【００４３】実施例24（発現および単離） E. coli HB101−16（pTQkPAΔtrp）を、実施例９に記載
したのと実質的に同様にして、培養し、得られた培養物
からTQktPAを単離した。得られたTQktPA含有上澄液のt-
PA活性は、天然t-PAとして7.7×104 IU／ｌであった。
【００４４】実施例25（発現および単離） 新規t-PA類発現のため、E. coli HB101−16(pSTTktr
p)、E. coli HB101−16（pSTQktrp）、E. coli HB101−
16（pSTQitrp）、E. coliHB101−16（pthTTtrp）および
E. coli HB101−16（puTTtrp）を用いた。これらの細菌
の培養は、実施例９に記載したのと実質的に同様にして
行った。得られた培養物（200ml）から得た細胞ペレッ
トを10mM燐酸緩衝食塩水(pH8.0)20mlに懸濁し、４℃で
１分間超音波処理した。15,000rpm、４℃で20分間遠心
分離したのち、得られたペレットをトリトン（Triton）
×−100溶液（0.5％トリトン×−100、８％シュークロ
ース、50mMEDTA、10mMトリス−HCl、pH8.0）20mlに懸濁
し、４℃で１分間超音波処理した。懸濁液を15,000rpm
で20分間遠心分離した。得られたペレットを、50％グリ
セロール水溶液20mlおよび氷冷エタノール20mlで順次洗
浄し、８Ｍ尿素、20mM酢酸、40mM水酸化アンモニウム、
0.4mMシステインおよび0.04mMシスチンを含有する８Ｍ
尿素溶液(pH9.5)20mlに、超音波処理により溶解した。1
5,000rpmで20分間遠心分離後、上澄液を８Ｍ尿素溶液で
Ａ280＝0.1（280nmでの吸光度）まで希釈した。得られ
た溶液を、20mM酢酸、40mM水酸化アンモニウム、0.4mM
システインおよび0.04mMシスチンを含有する水溶液（pH
9.5）の10倍量に対して室温で15時間透析した。上記操
作において、新規t-PA、すなわちSTTktPA、STQktPA、ST
QitPA、thTTtPAまたはuTTtPAを含有する各透析物をそれ
ぞれE. coli HB101−16（pSTTktrp）、E. coli HB101−
16（pSTQktrp）、E. coli HB101−16（pSTQitrp）、E.
coli HB101−16（pthTTtrp）またはE. coli HB101−16
（puTTtrp）の培養物から得た。得られた透析物の各々
をそれぞれ、実施例９に記載のフイブリンプレートアッ
セイに付した。結果を次表に示す。
【表１】 *)uTTtPAはプロウロキナーゼのような酵素前駆体である
のかもしれない。それはフイブリンプレートアッセイで
は不活性であったが、酵素免疫アッセイで分析したとこ
ろでは、培養液１ｌ当り29μgの割合で生産された。
【００４５】実施例26（新規tPA類の分子量測定） 上記の実施例で生産された新規t-PAの分子量を、マーカ
ー蛋白質（94,000, 67,000, 45,000, 30,000, 14,400ド
ルトン）を用いたSDS−PAGE分析によって測定した。結
果を次表に示す。
【表２】
【００４６】実施例27（DNAシークエンスの同定） 発現ベクターは二本鎖DNAに適用されるジデオキシリボ
ヌクレオチド鎖ターミネーション法［スミス（Smith）,
A. J. H, メソッド・オブ・エンザイモロジー（Meth.
Enzym.）第65巻第560〜580頁（1980年）］による部分DN
A配列決定に続く制限マッピングにより特性決定ならび
に同定が行なわれた。プラスミドpTTkPAΔtrp［２μg,
10mMトリス・HCl（pH7.4）−１mMEDTA 16μl中）、２mM
EDTA(２μl)および２N NaOH（２μl）で５分間室温で処
理した。得られた混合物に５Ｍ酢酸アンモニア（８μ
l）およびEtOH（100μl）を加えた。混合物を-80℃で30
分間冷却し、12,000rpmで５分間遠心分離した。上澄液
を除去した後沈澱を氷冷70％エタノール水で洗浄し、減
圧乾燥して変性プラスミドを得た。プラスミドを40mMト
リス・HCl（pH7.5）−20mMMgCl2−50mM NaCl中合成オリ
ゴデオキシリボヌクレオチド・プライマー（５′−ATAT
TCTGAAATGAGCTGT トリプトファン・プロモーターの-55
〜-37位に相当５ng）と65℃で15分間アニールし、次い
で30分間を要して室温まで徐々に冷却した。配列決定反
応はT7ポリメラーゼ（シークエナーゼ（Sequenase）、
米国Biochemical Corp.）および−35S-dATP（Amersha
m）を用いて、Tabor,S.およびRichardson, C.C. の方法
［Proc. Natl. Acod.Sci. U.S.A. 84, 4767-4771 (198
7)］に従って行なった。決定した配列（プライマー、す
なわちトリプトファン・プロモーター中の35塩基および
TTktPAのＮ末端コード配列115塩基からなる約150塩基）
は期待された配列と一致した。pTQkPAΔtrpのDNA配列決
定も上記と同様な方法で行なわれた。pSTTkPAtrp、pthT
TtrpおよびpuTTtrpのDNA配列決定も合成デオキシオリゴ
ヌクレオチド（５′−CTCCGGGCGACCTCCTGTG、天然tPAの
His297−Gly302に対応するDNA配列に相補的である）を
用いた以外は上記と同様にして行なった。
【００４７】実施例28（アミノ酸配列の同定） 実施例25で得たSTTktPAを含む透析物から実施例12に記
載された精製法と同様にして精製されたSTTktPAを８Ｍ
尿素-50mMトリス・HCl（pH8.0）−1.5％ β−メルカプ
トエタノールに溶解し、Cys残基のSH基のカルボキシメ
チル化のためにモノヨード酢酸で処理した。得られたカ
ルボキシメチル化されたSTTktPAはCOSMOSIL ５Ｃ4−300
（4.6mmφ×50mm, NaKarai Tesque）を用いる調整用HPL
Cにより精製され、気相シークエンサー470Ａ（Applied
Biosystem Inc）により配列決定された。その結果、STT
ktPAのＮ−末端配列はSer-Glu-Gly-Asn-Ser-Asp-Cys-Ty
r-Phe-Gly-Asn-Gly-Ser-Ala-Tyr であり、期待された配
列と一致した。
【００４８】実施例29（pST118の構築とクローニング） （第20図に図示）プラスミドpST112［それを含有する形
質転換体であるE. coli DH−１ FERM BP−l966から単離
でき、pST112における天然t-PAのcDNA配列は第21図に示
されている］をBamHIとSalＩで消化した。大きいDNA断
片を単離し、DNAポリメラーゼＩ（クレノウ断片）で平
滑末端とする。得られるDNA断片をT4DNAリガーゼで自己
ライゲートし、ライゲーション混合物でE. coli HB101
を形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換体の一つ
から、目的のプラスミドpST118を得てマッピングにより
特性決定をした。
【００４９】 実施例30（pmTQk112の構築とクローニング） （第22図および第23図に図示）プラスミドpST118をBgl
ＩＩおよびBbeＩで消化した。大きいDNA断片を単離し、
Arg-1 Ser1 Cys92 Tyr Glu をコードする合成BglＩＩ−
AvaＩＩ DNA断片[５’−GATCTTGCTACGAG and ５’−GTC
CTCGTAGCAA,各オリゴマーはＴ４ポリヌクレオチド・キ
ナーゼ（宝酒造）によりリン酸化した］とpST118から得
られた天然t-PAのAsp95−Gly110をコードするAvaＩＩ−
BbeＩ DNA断片とをT4DNAリガーゼ（宝酒造）により結合
した。ライゲーション混合物を用いて E. coli DH-１を
形質転換し、アンピシリン抵抗性形質転換体の一つから
目的とするプラスミドpmTQk118を単離し、制限マッピン
グにより特性決定をした。他方、プラスミドpST112をBg
lＩＩとXmaＩで消化し、大きいDNA断片を単離し、これ
とpmTQk118から得たArg-1−Val507をコードする1253 bp
BglＩＩ−XmaＩDNA断片をT4DNAリガーゼの存在下にラ
イゲートし、補乳動物細胞におけるmTQktPAの発現ベク
ターであるpmTQk112を得た。
【００５０】実施例31（pmTTKの構築とクローニング） （第24図、第25図および第26図に図示）pTTkPAΔtrpをC
laＩとEcoRIで完全に消化し、得られた大きいDNA断片を
単離し、これとBglＩＩ制限酵素部位を含むClaＩ−Dde
Ｉ合成DNA断片（５′−CGATAAAATGGGTCCTAGATC および
５′−TCAGATCTAGGACCCATTTTAT、各DNAはＴ４ポリヌク
レオチドキナーゼによりリン酸化された）とpTTkPAΔtr
pから得られた Glu175−Trp204をコードするDdeＩ−Eco
RI DNA断片とをT4DNAリガーゼにより結合してプラスミ
ドpHS9006を得る。pTTkPAΔtrpをEcoRI（部分消化）とA
paＩで消化して781bp DNA断片を単離し、pHS9006から得
られた4.1kbpのEcoRI−ApaＩ DNA断片とライゲートし、
Arg-1 とSer174−Pro527をコードするプラスミドpHS302
0を得た。プラスミド3020をBglＩＩおよびSmaＩで消化
し、Arg-1とSer174−Pro508をコードする小さいDNA断片
を単離し、pmTQk112から得たBglＩＩ−SmaＩの大きいDN
A断片とライゲートしてTTktPAの動物細胞のための発現
ベクターであるpmTTKを得た。
【００５１】実施例32（pmSTTkの構築とクローニング） プラスミドpHS9006をEcoRIで消化し、大きいDNA断片を
単離し、コウシ腸ホスファターゼ(ファルマシア)で脱リ
ン酸化し、pSTTkΔtrpから得たAsn205−Lys361をコード
する 472bp EcoRI DNA断片にライゲートしてプラスミド
pMH3025を得る。プラスミドpMH3025をBglＩＩおよびSma
Ｉで消化し、小さいDNA断片を単離し、pmTQk112から得
られたBglＩＩ−SmaＩの大きいDNA断片とライゲートし
て動物細胞におけるSTTktPAの発現ベクターであるプラ
スミドpmSTTkを得た。
【００５２】実施例33（発現） Ｌ−929形質転換体の構築 A. 細胞の調製 Ｌ−929細胞系がこの実施例で用いられるが、Ｌ−929細
胞はATCC#CCL−１として入手できる。この細胞をカナマ
イシンと10％（v/v）牛胎児血清を含むDMEM中37℃で５
％CO2 条件下で維持した。この細胞を形質転換の前日10
cmのペトリ皿につき５×105 細胞数の細胞濃度でプレー
トした。培地は形質転換３時間前に交換した。２つの10
cmペトリ皿を各形質転換に用いた。 B. DNA溶液の調製 プラスミドDNAを用いてゴーマン（Gorman）法［DNA Clo
ningＩＩ, 143 (1985), IRLpress］と同様にしてリン酸
カルシウム技術によりＬ−929細胞を形質転換した。発
現プラスミド(pmTQk112,pmTTkまたはpmSTTk)30μgとプ
ラスミドpSV2neo ATCC No.37149 ３μgを２M CaCl2（18
6μl）と水（1.3ml）に加えた。DNA溶液（1.5ml）を２
×HBS（1.63％塩化ナトリウム、1.19％Hepes, 0.04％Na
2HPO4, pH7.12）（1.5ml）に滴下した。混合物を細胞に
接触させる前に室温で30分間放置した。 C. 細胞のトランスフェクション DNA溶液(0.6ml)を徐々に撹拌しながらＬ−929細胞の10c
mペトリ皿に加え、37℃でCO2 気流中18時間加温した。1
0％FCSを含む完全な新鮮成育培地を次に加え、細胞をCO
2 気流中37℃で24時間加温した。細胞をトリプシン処理
し、300μg／mlのジェネティシン（geneticin, G418）
および10％FCSを含むDMEMからなる選択培地中で１：10
のサブカルチュアをした。ホスホトランスフェラーゼ
（neor遺伝子産物）を発現する細胞が選択培地中で生存
し、コロニーを形成することができる。培地を３−４日
ごとに交換し、コロニーを12−14日後に単離した。Ｇ41
8抵抗性コロニーを小シリンダー中おだやかなトリプシ
ン処理により採取し、培養塊になるまで増殖させ、変異
t-PAの選択のための試験をした。細胞を直径1.7cmの３m
lの培地を入れたマルチ・ウエル・プレート皿中で３×1
05 細胞数になるまで増殖させた。培地を除去し、PBSで
洗浄した。細胞を 0.04mM ZnSO4, １mM酪酸ナトリウ
ム、２％FCSを含む、DMEMからなる誘導培養培地（１m
l）中で培養し、培地中の変異t-PAの活性をＳ2251を用
いる間接吸光分析法［Trombosis Research 31, 427 (19
83)］により確認した。寄託のためにE. coli DH−１は
プラスミドpmTQk112、pmTTk またはpmSTTkを用いて常法
により形質転換された。
【００５３】上記実施例で得られた下記微生物は工業技
術院微生物工業技術研究所にそれぞれブダペスト条約に
基づく国際寄託されており、下記の寄託番号がそれぞれ
付されている。
【表３】
【表４】
【図面の簡単な説明】
【図１】、プラスミドpHVBBの構築およびクローニング
を示す。
【図２】、プラスミドpCLiPAxtrpの構築およびクローニ
ングを示す。
【図３】、BglＩＩ DNA断片（1974 bp）の前半部のDNA
配列を示す。
【図４】、BglＩＩ DNA断片（1974 bp）の中央部のDNA
配列を示す。
【図５】、BglＩＩ DNA断片（1974 bp）の後半部のDNA
配列を示す。
【図６】、プラスミドpCLiPAΔxtrpの構築およびクロー
ニングを示す。
【図７】、プラスミドpTQiPAΔtrpの構築およびクロー
ニングを示す。
【図８】、プラスミドpTA9004の構築およびクローニン
グを示す。
【図９】、プラスミドpTTkPAΔtrpの構築およびクロー
ニングを示す。
【図10】、EcoRI DNA断片（472 bp）のDNA配列を示す。
【図11】、pTTiPAΔtrpの構築およびクローニングを示
す。
【図12】、プラスミドpTQkPAΔtrpの構築およびクロー
ニングを示す。
【図13】、プラスミドpMH9003の構築およびクローニン
グを示す。
【図14】、プラスミドpSTTktrpの構築およびクローニン
グを示す。
【図15】、プラスミドpZYの構築およびクローニングを
示す。
【図16】、プラスミドpSTQitrpの構築およびクローニン
グを示す。
【図17】、プラスミドpSTQktrpの構築およびクローニン
グを示す。
【図18】、プラスミドpMH9006の構築およびクローニン
グを示す。
【図19】、プラスミドpthTTtrpの構築およびクローニン
グを示す。
【図20】、プラスミドpMH9007の構築およびクローニン
グを示す。
【図21】、プラスミドpuTTtrpの構築およびクローニン
グを示す。
【図22】、プラスミドpST118の構築とクローニングを示
す。
【図23】、pST112における天然t-PAのcDNA配列の前半部
を示す。
【図24】、pST112における天然t-PAのcDNA配列の後半部
を示す。
【図25】、プラスミドpmTQk118の構築とクローニングを
示す。
【図26】、プラスミドpmTQk112の構築とクローニングを
示す。
【図27】、プラスミドpHS9006の構築とクローニングを
示す。
【図28】、プラスミドpHS3020の構築とクローニングを
示す。
【図29】、プラスミドpmTTkの構築とクローニングを示
す。
【図30】、プラスミドpMH3025の構築とクローニングを
示す。
【図31】、プラスミドpmSTTkの構築とクローニングを示
す。
【図32】、pTTkPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図33】、pTTiPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図34】、pTQkPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図35】、pTQiPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図36】、pSTTktrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図37】、pSTQktrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図38】、pSTQitrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図39】、puTTtrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図40】、pthTTtrpのコード領域のDNA配列を示す。
【図41】、pmTQk112のコード領域のDNA配列を示す。
【図42】、pmTTkのコード領域のDNA配列を示す。
【図43】、pmSTTkのコード領域のDNA配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/64 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 小林 正和 大阪府池田市鉢塚１−５−２

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 一次構造としての下記アミノ酸配列
    （Ｉ）： 【化１】 （式中、ＲはSer−または 【化２】 であり、Ｘは−Lys−、−Ile−または結合手であり、Ｙ
    は−TyrSerGlnProGlnPheArgIle−，−TyrSerGlnProGlnP
    heAspIle−，−TyrSerGlnProIleProArgSer−または−Th
    rLeuArgProArgPheLysIle−．である。ただし、ＲがSer
    −であり、ＸがLys−であり、Ｙが−TyrSerGlnProGlnPh
    eAspIle−である場合を除く。）で示され、グルコシル
    化されていない組織プラスミノーゲン活性化因子。
  2. 【請求項２】 請求項１で定義したアミノ酸配列をコー
    ドするＤＮＡ。
  3. 【請求項３】 請求項１で定義した含有する発現ベクタ
    ー。
  4. 【請求項４】 請求項１で定義したアミノ酸配列（Ｉ）
    にコードするＤＮＡを含む発現ベクターにより形質転換
    された大腸菌を培地に培養し、得られる培養物より請求
    項１記載の組織プラスミノーゲン活性化因子を採取する
    ことを特徴とする組織プラスミノーゲン活性化因子の製
    造法。
  5. 【請求項５】 請求項１記載の組織プラスミノーゲン活
    性化因子を含有する血栓溶解剤。
JP6257008A 1987-08-03 1994-10-21 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子 Expired - Fee Related JP2570633B2 (ja)

Applications Claiming Priority (6)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB878718298A GB8718298D0 (en) 1987-08-03 1987-08-03 Tissue plasminogen activator
GB878725052A GB8725052D0 (en) 1987-10-26 1987-10-26 Tissue plasminogen activator
GB8718298 1987-11-13
GB8726683 1987-11-13
GB8725052 1987-11-13
GB878726683A GB8726683D0 (en) 1987-11-13 1987-11-13 Tissue plasminogen activator

Related Parent Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63192320A Division JP2561708B2 (ja) 1987-08-03 1988-08-01 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

Related Child Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8003853A Division JP2606620B2 (ja) 1987-08-03 1996-01-12 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPH07163346A true JPH07163346A (ja) 1995-06-27
JP2570633B2 JP2570633B2 (ja) 1997-01-08

Family

ID=27263535

Family Applications (3)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63192320A Expired - Fee Related JP2561708B2 (ja) 1987-08-03 1988-08-01 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子
JP6257008A Expired - Fee Related JP2570633B2 (ja) 1987-08-03 1994-10-21 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子
JP8003853A Expired - Lifetime JP2606620B2 (ja) 1987-08-03 1996-01-12 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP63192320A Expired - Fee Related JP2561708B2 (ja) 1987-08-03 1988-08-01 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

Family Applications After (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP8003853A Expired - Lifetime JP2606620B2 (ja) 1987-08-03 1996-01-12 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

Country Status (11)

Country Link
US (2) US5648250A (ja)
EP (1) EP0302456B1 (ja)
JP (3) JP2561708B2 (ja)
KR (1) KR970001237B1 (ja)
AT (1) ATE108206T1 (ja)
AU (1) AU623340B2 (ja)
CA (1) CA1341458C (ja)
DE (1) DE3850531T2 (ja)
DK (1) DK174413B1 (ja)
ES (1) ES2056082T3 (ja)
IL (1) IL87276A (ja)

Families Citing this family (22)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL87276A (en) * 1987-08-03 1995-07-31 Fujisawa Pharmaceutical Co Analog of a tissue plasminogen activator containing the Pringle 2 and protease regions only, DNA encoding it, processes for its preparation, and pharmaceutical preparations containing it
IL88247A0 (en) * 1987-11-06 1989-06-30 Genentech Inc Novel human tissue-type plasminogen activator variant
US5094953A (en) * 1988-03-21 1992-03-10 Genentech, Inc. Human tissue plasminogen activator variants
US5262170A (en) * 1988-09-02 1993-11-16 Genentech, Inc. Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells
US5676947A (en) * 1989-02-07 1997-10-14 Boehringer Manneheim Gmbh Method for treating thromboembolic conditions using thrombolytically active proteins
DE3903581A1 (de) * 1989-02-07 1990-08-16 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogenaktivator-derivat
DE3923339A1 (de) * 1989-05-31 1990-12-06 Boehringer Mannheim Gmbh Gewebs-plasminogen-aktivator-derivat
US5242688A (en) * 1990-12-24 1993-09-07 Eli Lilly And Company Method of treating thromboembolic disorders by administration of diglycosylated t-pa variants
GB9204439D0 (en) 1992-02-27 1992-04-15 Fujisawa Pharmaceutical Co A new cephalosporin c acylase
DE4440892A1 (de) * 1994-11-17 1996-05-23 Gruenenthal Gmbh Proteine mit fibrinolytischen und gerinnungshemmenden Eigenschaften
DE19937219A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Ionenaustauscherchromatographie
DE19937218A1 (de) * 1999-08-06 2001-02-08 Aventis Behring Gmbh Verfahren zur Reindarstellung der den Blutgerinnungsfaktor VII aktivierenden Protease, ihres Proenzyms oder eines Gemisches beider Proteine mittels Affinitätschromatographie
US6821755B2 (en) * 2000-07-27 2004-11-23 Boehringer Ingelheim International Gmbh Preparation of a recombinant protein in a prokaryotic host cell
GB0027779D0 (en) * 2000-11-14 2000-12-27 Boehringer Ingelheim Int Methods for large scale production of recombinant dna-derived tpa or k2s molecules
US7087412B2 (en) 2000-11-14 2006-08-08 Boehringer Ingelheim International Gmbh Methods for large scale protein production in prokaryotes
US6955910B2 (en) 2000-11-14 2005-10-18 Boehringer Ingelheim International Gmbh Method for large scale production of recombinant DNA-derived TPA or K2S molecules
GB0029001D0 (en) * 2000-11-28 2001-01-10 Isis Innovation Assay
DE10153601A1 (de) * 2001-11-02 2003-05-22 Paion Gmbh DSPA zur Behandlung von Schlaganfall
US20080057050A1 (en) * 2003-05-02 2008-03-06 Paion Deutschland Gmbh Intravenous injection of plasminogen non-neurotoxic activators for treating cerebral stroke
TWI482628B (zh) * 2007-10-18 2015-05-01 Lundbeck & Co As H 新穎之血栓溶解病患次群
KR100855024B1 (ko) 2008-04-30 2008-08-28 가톨릭대학교 산학협력단 크링글 도메인 １ 및 ２ 로 이루어진 비-글리코실화 재조합단백질
EP2289542A1 (en) * 2009-08-31 2011-03-02 PAION Deutschland GmbH Treatment of neurological or neurodegenerative disorders

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL68561A (en) * 1982-05-05 1991-01-31 Genentech Inc Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof
EP0125254A1 (en) * 1982-10-28 1984-11-21 Beecham Group Plc Enzyme derivatives and their use in the treatment of thrombosis
US4753879A (en) * 1984-08-27 1988-06-28 Biogen N.V. Modified tissue plasminogen activators
US4577584A (en) * 1984-12-24 1986-03-25 Shih Nan C Bell lock (II)
EP0201153A3 (en) * 1985-02-09 1987-10-07 Beecham Group Plc Modified enzyme and process for its preparation
GB8508717D0 (en) * 1985-04-03 1985-05-09 Beecham Group Plc Composition
GR861037B (en) * 1985-04-22 1986-07-16 Genentech Inc Novel human tissue plasminogen activator mutants
DK43387A (da) * 1986-01-29 1987-07-30 Beecham Group Plc Fibrinolytisk enzym
AU7090887A (en) * 1986-04-02 1987-10-08 Beecham Group Plc Plasminogen activators modified in first kringle domain
GB2200640B (en) * 1987-01-30 1991-07-10 American Home Prod Des-epidermal growth factor plasminogen activators
IL87276A (en) * 1987-08-03 1995-07-31 Fujisawa Pharmaceutical Co Analog of a tissue plasminogen activator containing the Pringle 2 and protease regions only, DNA encoding it, processes for its preparation, and pharmaceutical preparations containing it

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PROC.NATI.ACAD.SCI=1986US *

Also Published As

Publication number Publication date
ES2056082T3 (es) 1994-10-01
US5840533A (en) 1998-11-24
JP2606620B2 (ja) 1997-05-07
DK174413B1 (da) 2003-02-17
JPH08228773A (ja) 1996-09-10
JP2570633B2 (ja) 1997-01-08
EP0302456A1 (en) 1989-02-08
KR970001237B1 (ko) 1997-02-04
JP2561708B2 (ja) 1996-12-11
KR890003952A (ko) 1989-04-19
IL87276A0 (en) 1988-12-30
JPH01104167A (ja) 1989-04-21
DK431988A (da) 1989-02-04
DE3850531D1 (de) 1994-08-11
CA1341458C (en) 2004-10-12
DE3850531T2 (de) 1994-11-24
AU623340B2 (en) 1992-05-14
AU2036188A (en) 1989-02-09
US5648250A (en) 1997-07-15
EP0302456B1 (en) 1994-07-06
IL87276A (en) 1995-07-31
ATE108206T1 (de) 1994-07-15
DK431988D0 (da) 1988-08-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2606620B2 (ja) 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子
US5342775A (en) Plasminogen activator
US5147643A (en) DNA sequences encoding human t-PA substituted at position 275 or at positions 275 and 277 and pharmaceutical compositions
JP2584192B2 (ja) ヒトウロキナーゼを発現する組換え発現ベクター及び形質転換細胞
JPH0698002B2 (ja) ヒトプロティンｃ活性の発現ベクター
EP0200451A1 (en) Protease resistant urokinase composition, its production and use
JPH07147984A (ja) ポリクリングルプラスミノーゲン活性化因子をコードする遺伝子およびそれを含有するベクター
DK175938B1 (da) Plasminogenaktivator-varianter, DNA-sekvenser, vektorer, celler og cellekulturer, der omfatter DNA-sekvenser, der koder for sådanne varianter, samt sammensætninger til behandling af karsygdom eller -tilstand, der omfatter en sådan variant
US20050202040A1 (en) Methods for large scale productions of recombinant DNA-derived tPA or K2S molecules
US7070958B2 (en) Methods of making pro-urokinase mutants
EP0241210B1 (en) Modified enzyme
FI114102B (fi) Menetelmä trombiinin vaikutuksesta pilkkoutuvan plasminogeenianalogin valmistamiseksi
IE913070A1 (en) Novel compounds
AU637781B2 (en) New tissue plasminogen activator
JP3061199B2 (ja) エリトリナ・カッフラ型インヒビターの突然変異体及びセリンプロテアーゼを精製するための前記突然変異体の利用
GB2246133A (en) Amidated human pro-urokinase enzymes and their precursors
AU3064989A (en) Modified gene sequences encoding modified tpa and products therefrom
CA2262751A1 (en) Plasminogen activator capable of being activated by thrombin
AU624869B2 (en) Production of human prourokinase
CA2185436C (en) Use of a recombinant inhibitor from erythrina caffra for purifying serine proteases
NZ526280A (en) Methods for large scale production of recombinant DNA-derived tPA or K2S molecules
JPH0361484A (ja) 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子
IE861054L (en) Protease resistant single-chain urokinase
JPH0361482A (ja) 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

Legal Events

Date Code Title Description
LAPS Cancellation because of no payment of annual fees