JP2561708B2 - 新規な組織プラスミノーゲン活性化因子 - Google Patents

新規な組織プラスミノーゲン活性化因子

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Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 この発明は、新規な組織プラスミノーゲン活性化因子
に関するものである。詳細には、プラスミノーゲンを、
血栓のフイブリン網目構造を崩壊させて可溶性生成物を
生ぜしめるプラスミンへ転換させる強い活性をもち、血
栓溶解剤として有用な、新規な組織プラスミノーゲン活
性化因子、それのアミノ酸配列をコードするDNA、それ
の製造法およびそれを含有する医薬組成物に関するもの
である。
従来の技術およびこの発明が解決しようとする問題点 天然のヒト「組織プラスミノーゲン活性化因子」（以
下「ｔ−PA」という）の全アミノ酸配列および構造なら
びにヒトメラノーマ細胞（Bowes）に由来するそれをコ
ードするDNA配列は、組換えDNA技術によって既に明らか
にされている［Nature 301,214（1983）参照］。
しかしならが、天然ｔ−PAのアミノ酸配列を大腸菌で
発現させて得られた天然ｔ−PAはリホールディングが困
難で、従って、培養大腸菌細胞からは活性なｔ−PAは極
めて少量しか回収できない。
発明の構成および効果 この発明の発明者らは、種々研究の結果、たとえ、組
換大腸菌細胞から得たものであってもよくリホールディ
ングされる活性なｔ−PAを与え、天然ｔ−PAよりも長い
半減期を呈し、さらに血栓溶解活性も優れた新規ｔ−PA
を創製することに成功した。
この発明の新規ｔ−PAは、その一次構造としての次の
アミノ酸配列（Ｉ）によって表わすことができ （式中、ＲはSer−または であり、 Ｘは−Lys−、−Ile−または結合手であり、 Ｙは−TyrSerGlnProGlnPheArgIle−、−TyrSerGlnProGl
nPheAspIle−、−TyrSerGlnProIleProArgSer− または−ThrLeuArgProArgPheLysIle− である） なお、この明細書において、ｔ−PAのアミノ酸配列の
番号付けは、特に断わり書きのない限り、Neture 301,2
17（1983）に記載されている天然のｔ−PAの番号付けに
従う。例えばAsn184は天然のｔ−PAのアミノ酸配列にお
ける第184番目にアミノ酸であるアスパラギンを意味す
る。
この明細書においては、便宜上この発明の新ｔ−PAに
ついて次のコード名を使用する。
TTktPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがSer−であ
り、Ｘが−Lys−であり、Ｙが −TyrSerGlnProGlnPheArgIle−であるｔ−PAを意味す
る。
TTitPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがSer−であ
り、Ｘが−Ile−であり、Ｙが −TyrSerGlnProGlnPheArgIle−であるｔ−PAを意味す
る。
TQitPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが天然ｔ−PAの
Cys92からSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Ile
−であり、Ｙが −TyrSerGlnProGlnPheArgIle−であるｔ−PAを意味す
る。
TQktPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが天然tPAのC92
からSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Lys−で
あり、Ｙが −TyrSerGlnProGlnPheArgIle−であるｔ−PAを意味す
る。
STTktPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがSer−であ
り、Ｘが−Lys−であり、Ｙが −TyrSerGlnProGlnPheAspIle−であるｔ−PAを意味す
る。
STQktPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが天然tPAのCys
92からSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Lys−
であり、Ｙが −TyrSerGlnProGlnPheAspIle−であるｔ−PAを意味す
る。
STQitPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、Ｒが天然tPAのCys
92からSer174−までからなる残基であり、Ｘが−Ile−
であり、Ｙが −TyrSerGlnProGlnPheAspIle−であるｔ−PAを意味す
る。
thTTtPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがSer−であ
り、Ｘが結合手であり、Ｙが −TyrSerGlnProIleProArgSer−であるｔ−PAを意味す
る。
uTTtPA 上記アミノ酸配列（Ｉ）において、ＲがSer−であ
り、Ｘが−Lys−であり、Ｙが −ThrLeuArgProGrgPheLysIle−であるｔ−PAを意味す
る。
天然のｔ−PAは、単一のジスルフイド結合で結合され
るＨおよびＬ鎖の２鎖形態にプラスミンによって転換さ
れるところの単鎖セリンプロテアーゼである。軽鎖
（Ｌ）はプロテアーゼドメインであり、従ってこの酸素
の活性部位を含んでいる。重鎖（Ｈ）はフインガードメ
イン（Ｆ）（フイブロネクチン対して相同性をもつ）、
成長因子ドメイン（Ｅ）（表皮成長因子と相同性）およ
び３つのジスルフイド結合をもつ２つのクリングル（す
なわちクリングル１およびクリングル２ドメイン;K1お
よびK2）を有する。従って、天然のｔ−PAは５つの機能
性ドメインＦ、Ｅ、K1、K2およびＬからなる［ヨーロッ
パ特許出願公開公報第0196920号およびProc.Natl.Acad.
Sci.USA 83,4670（1986）参照］。
それゆえ、この発明は、 （１）フインガードメインおよび成長因子ドメインを欠
く、グリコシル化されていないｔ−PAおよび （２）フインガードメインおよび成長因子ドメインを欠
き、ヒトおよび動物起源の他の蛋白質を本質的に含まな
いｔ−PA をも提供するものであることを理解されたい。
上に定義したｔ−PAは、天然ｔ−PAのＨ鎖のクリング
ル１およびクリングル２ドメインおよびＬ鎖からなるｔ
−PAならびに該ｔ−PAのアミノ酸配列の欠失または置換
によって調製されたｔ−PA（たとえば、天然ｔ−PAのＨ
鎖のクリングル２ドメインとＬ鎖とからなるｔ−PA、Ly
s277がIle277で置換されており、および／またはArg275
がGly275、Glu275、Asp275等で置換されている上に例示
したｔ−PA）を包含する。
この発明の新規ｔ−PAは、組換えDNA技術およびポリ
ペプチド合成によって製造される。
すなわち、この発明の新規なｔ−PAは、該新規ｔ−PA
のアミノ酸配列をコードするDNAを含んでいる発現ベク
ターで形質転換した宿主細胞を培地に培養し、培養物か
ら該新規ｔ−PAを採取することによって製造できる。
上記製造法の詳細を以下に説明する。
宿主細胞は、微生物［細菌（たとえば、大腸菌（Esch
erichia coli）、枯草菌（Bacillus subtilis）、
等）、酵母（たとえばパン酵母菌（Saccharomyces cere
visiae）、等］、培養ヒト細胞および培養動物細胞（た
とえばCHO細胞、L929細胞、等）および培養植物細胞を
包含しうる。微生物の好ましい例は細菌、とくにエシエ
リヒア属に属する菌株（たとえばＥ．coli HB101 ATCC
33694,Ｅ．coli HB101−16 FERM BP−1872,Ｅ．coli 29
4 ATCC 31446,Ｅ．coli X 1776 ATCC 31537,等）パン酵
母、動物細胞（例えばマウスL929細胞、チャイニーズ・
ハムスター・オバリー（CHO）細胞等）などが含まれ
る。
細菌、特に大腸菌を宿主細胞として用いる場合には、
発現ベクターは、通常、少なくともプロモーター・オペ
レーター領域、開始コドン、新規ｔ−PAのアミノ酸配列
をコードするDNA、終止コドン、ターミネーター領域お
よび自己複製可能ユニットから構成されるのが通常であ
り、酵母や動物細胞を宿主細胞として用いる場合には、
発現ベクターは少なくともプロモーター領域、開始コド
ン、シグナル・ペプチドおよび新規ｔ−PAのアミノ酸配
列をコードするDNAならびに終止コドンから構成される
のが好ましく、さらにエンハンサー配列、天然ｔ−PAの
５′−および３′−非コード領域、スプライシング・ジ
ャンクション、ポリアデニル化部位および自己複製可能
単位を挿入することもできる。
プロモーター・オペレーター領域は、プロモーター、
オペレーターおよびシヤイン−ダルガーノ（SD）配列
（たとえばAAGG、等）からなり、プロモーター・オペレ
ーター領域の例としては、慣用のプロモーター・オペレ
ーター領域（たとえば、ラクトースオペロン、PL−プロ
モーター、trp−プロモーター、等）が挙げられ、哺乳
動物細胞における新規ｔ−PAの発現のためのプロモータ
ー領域としては、HTLV−プロモーター、SV40初期および
後期プロモーター、LTR−プロモーター、マウス・メタ
ロチオネインＩ（MMT）−プロモーターおよびワクシニ
ア−プロモーター等が挙げられる。
好ましい開始コドンはメチオニンコドン（ATG）が挙
げられる。
シグナル・ペプチドをコードするDNAとしてはｔ−PA
をコードするDNAが挙げられる。
新規ｔ−PAまたはシグナル・ペプチドのアミノ酸配列
をコードするDNAは、たとえば、DNA合成装置を用いての
部分または全DNA合成あるいは形質転換体［たとえば
Ｅ．coli LE 392λ＋（pTPA21），Ｅ．coli JA 221（pT
PA25）ATCC 39808,Ｅ．coli JA 221（pTPA102）（Lys 2
77→Ile）ATCC 39811Ｅ．coli JM 109（p51H）FERM P−
9774,Ｅ．coli JM 109（pN53）FERM P−9775、Ｅ．coli
DH−１（pST112）FERM BP−1966等］から得られるベク
ター［たとえば、pTPA21、pTPA25、pTPA102（Lys 277→
Ile）、p51H、pST112等］に挿入された天然または変異
ｔ−PAをコードする完全なDNA配列またはゲノムの常法
による処理（たとえば、制限酵素による消化、細菌アル
カリホスフアターゼによる脱燐酸、T4DNAリガーゼを用
いたライゲーション）によって調製することができる。
終止コドンとしては慣用されている終止コドン（たと
えばTAG、TGA、等）が挙げられる。
ターミネーター領域としては、天然または合成のター
ミネーター（例えば、合成fdファージターミネーター、
等）が挙げられる。
自己複製可能ユニットとしては、それに属する全DNA
を宿主細胞中で自己複製しうるDNA配列で、天然のプラ
スミド、人工的に修飾したプラスミド（たとえば、天然
プラスミドから調製したDNA断片）および合成プラスミ
ドが挙げられる。このプラスミドの好ましい例として
は、大腸菌を宿主細胞とする場合に例えばプラスミドpB
R322またはその人工修飾体（pBR322の適当な制限酵素処
理によって得られたDNA断片）が挙げられ、動物細胞を
宿主細胞とする場合に例えばプラスミド、pRSVneo ATCC
37198、プラスミドpSV2dhfr ATCC37145、プラスミドpdB
PV−MMTneo ATCC37224、プラスミドpSV2neo ATCC37149
が挙げられる。
エンハンサー配列としては、例えばSV40のエンハンサ
ー配列が挙げられる。
ポリアデニル化部位としては、例えばSV40のポリアデ
ニル化部位が挙げられる。
スプライシング・ジャンクションとしては、例えばSV
40のスプライシング・ジャンクションが挙げられる。
プロモーター−オペレーター領域、開始コドン、新規
ｔ−PAのアミノ酸配列をコードするDNA、終止コドンお
よびターミネーター領域は、適当な自己複製可能ユニッ
ト（プラスミド）と共に、連続的に環状に、所望により
適当なDNA断片（例えば、リンカー、他の制限部位、
等）を用いて、常法（例えば、制限酵素による消化、T4
ポリヌクレチドキナーゼを用いた燐酸化、T4DNAリガー
ゼを用いたライゲーション）により連結して、発現ベク
ターを調製でき、哺乳動物細胞を宿主として用いる場合
には、エンハンサー配列、プロモーター領域、天然ｔ−
PAの５′−非コード領域、開始コドン、シグナル・ペプ
チドおよび新規ｔ−PAのアミノ酸配列をコードするDN
A、終止コドン、３′−非コード領域、スプライシング
・ジャンクションおよびポリアデニル化部位を上記慣用
の手法で適当な自己複製可能ユニットに連続的にかつ環
状に連結して発現ベクターを調製してもよい。
その発現ベクターを宿主細胞に導入する。導入は常法
（たとえば、形質転換、マイクロインジエクション、
等）によって実施でき、形質転換体が得られる。
この発明の製法における新規ｔ−PAの製造のために
は、このようにして得た発現ベクター含有形質転換体を
培地に培養する。
培地は、炭素源（たとえば、グルコース、グリセリ
ン、マンニトール、フルクトース、ラクトース、等）お
よび無機または有機の窒素源（たとえば、硫酸アンモニ
ウム、塩化アンモニウム、カゼイン加水分解物、酵母エ
キス、ポリペプトン、バクトトリプトン、牛肉エキス、
等）を含有する。所望により、他の成分［たとえば、無
機塩類（たとえば、重燐酸ナトリウムまたはカリウム、
燐酸水素二カリウム、塩化マグネシウム、硫酸マグネシ
ウム、塩化カルシウム）、ビタミン類（たとえば、ビタ
ミンB1）、抗生物質（たとえば、アンピシリン）、等］
を培地に加えてもよい。
形質転換体の培養は、一般に、pH5.5〜8.5（好ましく
はpH7〜7.5）、18〜40℃（好ましくは25〜38℃）で、５
〜50時間にわたって実施すればよい。
大腸菌のような細菌を宿主細胞として用いる場合に
は、製造された新規ｔ−PAは、通常、培養形質転換体細
胞中に存在するので、細胞を濾過または遠心分離によっ
て集め、細胞壁および／または細胞膜を常法（たとえ
ば、超音波および／またはリゾチームによる処理、等）
により破壊して、デブリスとする。このデブリスから、
新規ｔ−PAを、天然または合成の蛋白質の精製、単離に
一般的に用いられている通りの常法［たとえば、適当な
溶媒（たとえば、8M尿素水溶液、6Mグアニジウム塩水溶
液、等）による蛋白質の溶解、透析、ゲル濾過、カラム
クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー、
等］により精製、単離でき、動物細胞を宿主細胞として
用いる場合には、製造された新規ｔ−PAは通常、培養液
中に存在するので、培養濾液（上澄液）を濾過または遠
心により培養物から得て、これから上述したような常法
により精製することができる。
このようにして製造した新規ｔ−PAのリホールディン
グのためには、新規ｔ−PAのグアニジンまたは尿素溶液
を、還元型グルタチオン（GSH）および酸化型グルタチ
オン（GSSG）の存在下に、半透膜の内側および外側のグ
ルタチオン濃度を同じにして、４〜40℃で２〜60時間透
析することからなる透析法を採用するのが好ましい。こ
の方法では、グルタチオン濃度は2mM以上であることが
好ましく、還元型グルタチオンと酸化型グルタチオンの
比率は10:1とするのが好ましい。なお、この方法では、
両グルタチオンをシステインおよびシスチンで置き換え
ることができる。これらの方法は、組換えDNA技術によ
り製造された、天然ｔ−PAを含む全てのｔ−PAのリホー
ルディグのために好ましく使用できる。
この発明の新規ｔ−PAは、血管疾患（たとえば、心筋
梗塞、卒中、心臓発作、肺塞栓症、深部静脈血栓症、末
梢動脈閉塞、等）の治療のための血栓溶解剤として有用
である。この発明の新規ｔ−PAは、医薬として許容しう
る担体と混合して、注入剤のごとき医薬製剤の形で、ヒ
トを含めた哺乳動物に非経口的に投与できる。
医薬として許容できる担体は、ペプチドまたは蛋白質
（たとえば、血清アルブミン、等）を含有する医薬組成
物の調製に慣用されている種々の有機または無機の担体
材料を包含しうる。
この発明の新規ｔ−PAの投与量は、疾患の種類、患者
の体重および／または年令、さらに投与経路の種類のご
とき種々の因子に応じて変動するが、この発明の新規ｔ
−PAの最適投与量は、通常、注射または注入の場合は0.
1〜10mg/kg/日の中から選択される。
上記の一日量は、数時間ごとに分割して患者に与えて
もよい。
（オリゴヌクレオチド）のモノ（またはジ、またはト
リ）マーは、たとえば広瀬の方法［蛋白質核酸酵素25,2
55（1980）参照］により調製でき、カップリングは、た
とえばセルロースまたはポリスチレンポリマー上で燐酸
トリエステル法［ヌクレイック・アシッズ・リサーチ
（Nucleic Acids Research）９,1691（1981），同誌10,
1755（1982）参照］によって実施できる。
以下の実施例はこの発明をさらに詳細に説明するため
のものであって、それらに限定されるものではない。
実施例中、使用した酵素（たとえば、制限酵素、細菌
アルカリホスファターゼ、T4DNAリガーゼ等）は全て市
販のものであり、それら酵素の使用条件は、たとえば市
販の酵素に添付されている説明書を参照すれば、当業者
にとっては自明のところである。
実施例１（オリゴヌクレオチドの合金） 下記オリゴヌクレオチド類を、上記のごとく常法によ
り、調製した。
１）pHVBB用： HP10;AG−CTT−CAG−GAT HP7 ;ATC−GAA−GGT−AGA−TCT−Ｇ HP11;C−GAT−ATC−CTG−Ａ HP9 ;GA−TCC−AGA−TCT−ACC−TT ２）pTQiPAΔtrpおよびpTQkPAΔtrp用： HP23;C−GAT−AAA−AT HP24;G−TGT−TAT−GAG HP25;ACA−CAT−TTT−AT HP26;GTC−CTC−ATA TQitPAまたはTQktPAのCya1は、ネイチャー（Nature）
301,214（1983）に報告されている天然ｔ−PAのCys92に
対応している。
３）pTTkPAΔtrpおよびpTTiPAΔtrp用： HP31;C−GAT−AAA−ATG−TC HP32;TC−AGA−CAT−TTT−AT TTktPAまたはTTitPAのSer1は、ネイチャー301,241（1
983）に報告されている天然ｔ−PAのSer174に対応して
いる。
実施例２（プラスミドpHVBBの構築およびクローニン
グ） （第１図に図示） オリゴデオキシリボヌクレオチドHP7およびHP11（各
0.2ナノモル 実施例１−（１）参照）を、ライゲーシ
ョン緩衝液（1mM ATP, 50mM トリス−HCl（pH7.6）,10m
M MgCl2,20mMジオチスレイトール,1mMスペルミジン,50
μg/mlウシ血清アルブミン）20μ中で、T4ポリヌクレ
オチドキナーゼ（宝酒造）2.5単位を用いて、37℃で１
時間燐酸化した。熱による酵素不活性化ののち、反応混
合物に他のオリゴデオキシリボヌクレオチドHP10および
HP9（各0.4ナノモル）、20mM ATP 1μおよびT4 DNAリ
ガーゼ（宝酒造）900単位を加えた。得られた混合物を1
5℃で30分間加温して、粗製の27dpDNA断片を得た。
他方、pCLaHtrp3t（α−hANPのための発現ベクター、
その調製法は、例えばヨーロッパ特許出願公開公報第02
06769号に記載されている）をBamH IおよびHind IIIに
より消化した。生じた4137bp DNA断片を0.8％アガロー
スゲル電気泳動により単離し、T4 DNAリガーゼの存在下
に、前記27bp DNA断片に連結した。ライゲーション混合
物を用いてＥ．coli DH−１［マニアティス（Maniati
s）,T.ほか，モレキュラークローニング（Molecular Cl
oning），ページ505（1982），コールドスプリングハー
バーラボラトリー（ニューヨーク）参照］を形質転換し
た。アンピシリン耐性形質転換体の一つから、所望のプ
ラスミドpHVBB（4164bp）を単離し、制限酵素（Bgl II,
EcoR V,Pst I,Hrnd IIIおよびBamH I）消化によって特
性を確認した。
実施例３（プラスミドpCLiPAxtrpの構築およびクローニ
ング） （第２図に図示） pHVBBをBgl IIにより消化した。生じた4164bp線状DNA
を、200mMトリス−HCl（pH8.0）中で、細菌アルカリホ
スファターゼ（宝酒造）とともに37℃で１時間加温し
て、該DNAの両５′末端を脱燐酸した。生じたDNAを５％
ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE）により単離し
た。
他方、pTHA102（Lys277→Ile）［変異ｔ−PA（Lys277
→Ile）のための発現ベクター、これを含有する形質転
換体はＥ. coliJA221（pTPA102）（Lys277→Ile）ATCC
39811］をBgl IIにより消化し、1974bpのDNA断片（その
DNA配列は第３図に示されている）を単離した。この断
片を、T4 DNAリガーゼの存在下に416bp DNA断片に連結
した。Ｅ. coli MM294 ATCC 33625を形質転換後、ペプ
チドCLa遺伝子の下流に時計の針の回転方向に1974bpの
ｔ−PA遺伝子が挿入された所望のプラスミドpCLiPAxtrp
（6138 bp）を担持するアンピリシン抵抗性形質転換体
を得た。pCLiPAxtrpを、制限エンドヌクレアーゼ（Pvu
II,EcoR IおよびBgl II）消化により特性決定した。
実施例４（プラスミドpCLiPAΔxtrpの構築およびクロー
ニング） （第４図に図示） pCLiPAxtrpをBamH IおよびSac Iにより消化し、生じ
た5388bpのDNA断片を単離した。他方、pCLiPAxtrpをSau
3AIおよびSac Iで消化した。生じた389pbのDNA断片を、
T4 DNAリガーゼの存在下に、5388bpのDNA断片に連結し
た。ライゲーション混合物を用いてＥ. coli DH−１を
形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換体の一つか
ら、所望のプラスミドpCLiPAΔxtrp（5777bp）を単離
し、制限エンドヌクレアーゼ（Cla I、EcoR I、xho I、
Nar IおよびSec I）消化により特性決定した。
実施例５（プラスミドpTQiPAΔtrpの構築およびクロー
ニング） （第５図に図示） 上記のpTPA102（Lys277→Ile）をAva IIおよびBbe I
（４ヌクレオチド長の単鎖粘着末端を生じるNar Iのイ
ソシゾマー）で消化し、生じた50bpの、天然ｔ−PAのAs
p95−Ale111をコードするDNA断片を単離した。他方、HP
23、HP24、HP25およびHP26（実施例１参照）からT4ポリ
ヌクレオチドキナーゼおよびT4 DNAリガーゼを用いて19
bpの合成Cle I−Ava II DNA断片を調製した。これを、T
4 DNAリガーゼを用いて、50bp DNA断片に連結して、69b
pのCla I−Bbe I DNA断片を構築した。
pCLiPAΔxtrpを、Bbe Iによる部分消化によって線状
化した。生じた5777bpのDNA断片をCla Iで消化し、514b
pのDNA断片を単離した。これを、T4 DNAリガーゼの存在
下に、69bpのCla I−Bbe I DNA断片に連結した。ライゲ
ーション混合物を用いてＥ. coli DH−１を形質転換し
た。アンピシリン抵抗性形質転換体の一つから、所望の
プラスミドpTQiPAΔtrp（5218 bp）を得て、これを制限
エンドヌクレアーゼ消化によって特性決定した。
Ｅ. coli HB101−16［HB101（recA+,supE+htpR16（a
m）,tetr）FERM BP−1872をpTQiPAΔtrpにより形質転換
して、形質転換体Ｅ. coli HB101−16（pTQiPAΔtrp）
を得た。
実施例６（プラスミドpTA9004の構築およびクローニン
グ） （第６図に図示） pCLiPAΔxtrpをDde IおよびEcoR Iにより消化し、天
然ｔ−PAのGlu175−Trp204をコードする91bpのDNA断片
を単離した。得られたDNAを、T4ポリヌクレオチドキナ
ーゼおよびT4 DNAリガーゼを用いて、オリゴデオキシリ
ボヌクレオチドHB31およびHB32（実施例１−（３）参
照）に連結した。生じた103bpのCla I−EcoR I DNA断片
を、T4 DNAリガーゼの存在下に、pCLiPAΔxtrpの4397bp
Cla I−EcoR I断片に連結した。ライゲーション混合物
を用いて、Ｅ．coli DH−１を形質転換した。アンピシ
リン抵抗性形質転換体の一つから、所望のプラスミドpT
A9004（450bp）を得た。
実施例７（プラスミドpTTkPAΔtrpの構築およびクロー
ニング） （第７図に図式） pTA9004をEcoR Iで消化し、生じたDNA断片（4500bp）
を細菌アルカリホスファターゼを用いて脱燐酸した。他
方、天然ｔ−PAをコードする完全なcDNA配列および３′
−非コード領域の一部を含むプラスミドpTPA21をEcoR I
で消化し、天然ｔ−PAのAsn205−Lys361をコードする47
2bpのDNA断片（そのDNA配列は第８図に示されている）
を単離した。得られたDNA断片を、T4 DNAリガーゼの存
在下に、脱燐酸した450bpのEcoR I DNA断片に連結し
た。ライゲーション混合物を用いてＥ．coli DH−１を
形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換体の一つか
ら、所望のプラスミドpTTkPAΔtrp（4972bp）を単離し
た。Ｅ．coli HB101−16をpTTkPAΔtrpで形質転換し
て、形質転換体Ｅ．coli HB101−16（pTTkPAΔtrp）を
得た。
実施例８（プラスミドpTTkPAΔtrpの構築およびクロー
ニング） （第９図に図示） pTA9004をEcoR Iにより消化し、得られたDNAを細菌ア
ルカリホスファターゼを用いて脱燐酸した。他方、上述
のpTPA102（Lys277→Ile）をEcoR Iで消化し、変異ｔ−
PA（Lys277→Ile）のAsn205−Lys361をコードする472bp
のDNA断片を単離した。得られたDNA断片を、T4 DNAリガ
ーゼの存在下に、脱燐酸した4500bpのEcoR I DNA断片に
連結した。ライゲーション混合物を用いてＥ．coli DH
−１形質転換した。アンピシリン抵抗性形質転換体の一
つから、所望のプラスミドpTTiPAΔtrp（4972bp）を単
離した。Ｅ．coli HB101−16をpTTiPAΔtrpで形質転換
して、形質転換体Ｅ．coli HB101−16（pTTiPAΔtrp）
を得た。
実施例９（発現および単離） Ｅ．coli HB101−16（pTTiPAΔtrp）の単一コロニー
を、試験管中のバクトトリプトン10g、酵母エキスの5
g、NaCl5g、アンピシリン50μg/mlを滅菌LA培地（pH7.
4）5ml中へ接種し、振とう条件下に37℃で８時間加温し
た。培養物を、フラスコ中の新鮮な滅菌LA培地100mlに
加え、振とう条件下に37℃で15時間加温した。得られた
培養物の一部（20ml）を、25μg/mlのアンピシリンを含
有する滅菌M9CA培地400mlに加え、37℃で加温した。培
養物のA600がおよそ0.6に達したとき、培養物にβ−イ
ンドールアクリル酸を最終濃度10μg/mlとなるように添
加した。得られたブロスを37℃で３時間加温し、４℃、
8,900×ｇで10分間遠心分離した。集めた細胞を、5mM E
DTA含有10mMトリス−HCl（pH8.0）100mlに懸濁し、４℃
で50mgのリゾチームで１時間処理した。得られた混合物
をバイオトロン（Biotron）ブレンダーによりホモジナ
イズし、４℃、8,900×ｇで30分間遠心分離した。ペレ
ットを50％グリセロール水溶液100mlで洗い、8M尿素含
有10mMトリス−HCl（pH8.0）800mlに溶解した。この尿
素溶液に、GSH（興人）480mgおよびGSSG（興人）96mgを
加えた。生じた混合物を、20mM酢酸、40mMアンモニア、
2mM GSHおよび0.2mM GSSGを含有する緩衝液（pH9.5）16
に対して２回、４℃で15時間透析した。混合物を遠心
分離後、上澄液を、次のフィブリンプレートアッセイに
よって検定した。フィブリンプレートアッセイ（FPA）
は、アストルプーミュラーツ法［Astrup T.とＭllert
z S.,アーカイヴズ・オブ・バイオケミストリ・アンド
・バイオフィジックス（Arch.Biochem.Biophys.）40 34
6−351（1952）］に従い、これを僅かに変法して実施し
た。100mM燐酸緩衝液（pH7.2）中の1.2％ヒトプラスミ
ノーゲン・リッチ・フィブリノーゲン（ミドリ十字）溶
液5mlを同じ緩衝液中のトロンビン（持田、50単位）溶
液5mlと混合し、室温で１時間放置することにより、フ
ィブリンプレートを調整した。検体溶液またはヒト天然
ｔ−PA（WHO標準品）（各10μ）を37℃で18時間イン
キュベートした。ヒト天然ｔ−PAを標準として、試料の
活性を溶解帯域の面積から計算した。アッセイの結果、
TTkPAを含有する上澄液のｔ−PA活性は、2.3×105IU
（天然ｔ−PAの）／であった。
実施例10（発現および単離） Ｅ・coli HB101−16（pTTiPAΔtrp）の単一コロニー
を、実施例９に記載したのと実質的に同様にして培養
し、得られた培養物からTTitPAを単離した。得られたTT
itPA含有上澄液のｔ−PA活性は2.0×104IU（天然ｔ−PA
の）／であった。
実施例11（発現および単離） Ｅ・coli HB101−16（pTQiPAΔtrp）の単一コロニー
を、実施例９に記載したのと実質的に同様にして培養
し、得られた培養物からTQitPAを単離した。得られたTQ
itPA含有上澄み液のｔ−PA活性は2.0×104IU（天然ｔ−
PAの）／であった。
実施例12（TTktPAの精製） 全ての操作を冷室（４−６℃）で行った。プラスミノ
ーゲン活性化因子、リホールディグされた上澄液中のTT
ktPA、を次のようにして単離、精製した。
第一工程では、実施例９に記載した方法と同様にして
得た培養物20リットルから調製した上澄液［全TTktPA活
性:3.4×106IU（天然ｔ−PA（WHO）の）］を、1M NaCl
および0.01％（v/v）トウィーン（Tween）80を含有する
0.05Mトリス−HCl（pH8.0）により平衡化したベンズア
ミジン・セファロース・カラム［1.6cm×3cm;文献：ラ
ス・ホルムバーグ（Las Holmberg）ら、BBA,445,215−2
22（1976）記載のカルボジイミド法によってｐ−アミノ
ベンズアミジンを共役結合によりCHセファロース4B（フ
ァルマシア）に結合させた］にかけ、同じ緩衝液で洗浄
した。プラスミノーゲン活性化因子を、1Mアルギニンお
よび0.01％（v/v）のトウィーン80を含有する0.05Mトリ
ス−HCl（pH8.0）で溶出した。
次の工程では、プールした活性画分を、0.1Mトリス−
HCl（pH8.0）で平衡化したIgG結合セファロース（FTP11
63）カラム（1.6cm×3cm）［モノクローナル抗ｔ−PA抗
体:FTP1163（カイズ・ツトムら、トロンボーシス・リサ
ーチ（Thrombosis Research,40,91−99（1985）を、メ
ーカーの指示に従って、CNBr活性化セファロース4Bに結
合させた］にかけた。カラムを、1M NaCl、0.01％（v/
v）トウィーン80およびアプロチニン（10KIU/ml、シグ
マ）を含有する0.1Mトリス−HCl（pH8.0）で洗浄した。
溶出は、0.5M NaCl、0.01％トウィーン80およびアプロ
チニン（10KIU/ml）を含有する0.1Mグリシン−HCl（pH
2.5）を用いて行った。
最後の工程では、IgGセファロース（FTP 1163）カラ
ムから得てプールした活性画分を、1.6M KSCNおよび0.0
1％（v/v）トウィーン80を含有する0.01M燐酸緩衝液（p
H7.4）１リットルに対して透析した。透析した溶液を、
固体ポリエチレングリコール20,000に対する透析によっ
て約2mlに濃縮した。得られた濃縮物を、1.6M KSCNおよ
び0.01％（v/v）トウィーン80を含有する0.01M燐酸緩衝
液（pH7.4）中、セファクリルS200HR（ファルマシア、
1.6cm×90cm）でゲル濾過した。プールした活性画分
を、固体ポリエチレングリコール20,000に対する透析に
よって約10mlに濃縮し、濃縮物をついで、0.15M NaClお
よび0.01％（v/v）トウィーン80を含有する0.1M重炭酸
アンモニウムに対して透析し、精製TTktPA（3.4mg,7.35
×105IU（天然ｔ−PA（WHO）の）/mg蛋白質）を含有す
る透析物を得た。
精製したTTktPAは次の特性を有する： （ｉ）SDS PAGE分析 ラエムリの方法［U.K.Laemmli,ネイチャー（Nature）
（ロンドン）227,680−685（1970）］に従って、15％ポ
リアクリルアミドゲルを調製した。このゲルを銀染色し
た［ペーリング（H.M.Poehling）ら、エレクトロフォレ
シス（Electrophoresis），２,141（1981）］。
このようにして精製されたTTktPAは、SDS−PAGEに際
して、還元条件下では35kドルトンのところに単一のバ
ンドとして、非還元的条件下では32kドルトンのところ
に単一バンドとして、それぞれ泳動する。一方、プラス
ミンセファロース［パー・ウォリン（Per Wallin）ら、
BBA,719,318−328（1982）］と共に加温した試料は、還
元剤の存在下では30kドルトン（プロテアーゼドメイ
ン）および13.5kドルトン（クリングルドメイン）のと
ころに２つのバンドを生じ、還元剤不在下では32kドル
トンのとこに単一のバンドを与えた。
（ii）HPLC 精製TTktPAを（4.6mm×75mm）ウルトラポアRPSCカラ
ム（ベックマン、米国）にかけた。溶出は、0.1％（v/
v）トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルの線状勾配（1
0−60％（v/v））を用い、流速1.0ml/分で30分間にわた
って行った。
この系では、TTktPAは、アセトニトリル濃度およそ3
6.5％（v/v）で単一の主要種として溶出された。
（iii）Ｎ末端配列分析 精製一本鎖TTktPAを還元し、カルボキシメチル化し、
HPLC（ウルトラポアRPSC）カラムで脱塩し、スピード・
ヴァク（Speed Vac）濃縮装置（サヴァント（Savan
t））で濃縮し、370A型気相シーケンサー（アプライド
バイオシステム）を用いて分析した。TTktPAのＮ末端ア
ミノ酸配列は次の通りであった。
SerGluGlyAsn− 実施例13（プラスミドpTQkPAΔtrpの構築およびクロー
ニング） （第10図に図示） プラスミドpTQiPAΔtrpをEcoR Iで消化した。反応混
合物を細菌アルカリホスファターゼを用いて脱燐酸し、
生じた4744bp DNA断片を単離した。他方、プラスミドpT
PA21をEcoR Iで消化し、生じた472bpのDNA断片を単離し
た。この472bp DNA断片を、T4DNAリガーゼの存在下に、
4744bp DNA断片に連結し、ライゲーション混合物を用い
てＥ．coli DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗
性の形質転換体の一つから、所望のプラスミドpTQkPAΔ
trpを単離し、制限マッピングにより特性決定をした。
Ｅ．coli HB101−16をプラスミドpTQkPAΔtrpで形質転
換して、形質転換株Ｅ．coli HB101−16（pTQkPAΔtr
p）を得た。
実施例14（オリゴヌクレオチドの合成） 上記した通りの常法により、下記オリゴヌクレオチド
を調製した。
１）pSTTktrpおよびpSTQktrp用のリンケージ配列： ２）pSTQitrp用のリンケージ配列 ３）pthTTtrp用のリンケージ配列 ４）puTTtrp用のリンケージ配列 アミノ酸上方の番号は、ペニカ（Pennica）ら［ネイ
チャー301,214−221（1983）］の報告している天然ｔ−
PAでの位置を示している。
実施例15（プラスミドpMH9003の構築およびクローニン
グ） （第11図に図示） プラスミドpTA9004をEcoR IおよびStu Iで消化し、生
じた4329bp DNA断片を単離した。このDNA断片を、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼおよびT4 DNAリガーゼを用い
て、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドSK1およびSK2
に連結した。反応混合物をEcoR Iで処理して、EcoR I消
化粘着末端を再構築し、生じたEcoR I−Dde I DNA断片
（4367bp）を、T4 DNAリガーゼの存在下に、プラスミド
pCLiPAΔxtrpから得た天然ｔ−PAのAsn205−Leu266をコ
ードする184bpのEcoR I−Dde I DNA断片に連結した。ラ
イゲーション混合物を用いてＥ．coli DH−１を形質転
換した。アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つから、
所望のプラスミドpMH9003を単離し、制限エンドヌクレ
アーゼ消化によって特性決定した。
実施例16（プラスミドpSTTktrpの構築およびクローニン
グ） （第12図に図示） プラスミドpMH9003をStu Iで消化し、生じたDNA断片
（4551 bp）をコウシ腸ホスファターゼ（ファルマシアA
B）により脱燐酸した。他方、プラスミドpCLiPAΔxtrp
をStu Iで消化し、生じた、天然ｔ−PAのGly279−Ala
419をコードする419bpのDNA断片を単離した。得られたD
NA断片を、T4 DNAリガーゼの存在下に、4551bpのStu I
DNA断片に連結した。ライゲーション混合物を用いて
Ｅ．coli DH−１を形質転換した。アンピシリン抵抗性
形質転換株の一つから、所望のプラスミドpSTTktrpを単
離し、制限エンドヌクレアーゼ消化により特性決定し
た。Ｅ．coli HB101−16をプラスミドpSTTktrpで形質転
換して、形質転換株Ｅ．coli HB101−16（pSTTktrp）を
得た。
実施例17（プラスミドpZYの構築およびクローニング） （第13図に図示） プラスミドpTQiPAΔtrpをEcoR IおよびStu Iで消化
し、生じた4575bpのDNA断片を単離した。このDNA断片
を、T4ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4 DNAリガーゼ
を用いて、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドHP56お
よびHP57に連結した。反応混合物をEcoR Iで処理して、
EcoR I消化粘着末端を再構築し、生じたEcoR I−Dde I
DNA断片（4613bp）を、T4 DNAリガーゼの存在下に、プ
ラスミドpCLiPAΔxtrpから調製した、天然ｔ−PAのAsn
205−Leu266をコードする184 bpのEcoR I−Dde I DNA断
片に連結した。
ライゲーション混合物を用いてＥ．coli DH−１を形
質転換した。アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つか
ら、所望のプラスミドpZYを単離し、制限マッピングに
より特性決定した。
実施例18（プラスミドpSTQitrpの構築およびクローニン
グ） （第14図に図示） プラスミドpZYをStu Iで消化し、生じたDNA断片（479
7bp）をコウシ腸ホスファターゼにより脱燐酸した。他
方、プラスミドpCLiPAΔxtrpをStu Iで消化し、生じ
た、天然ｔ−PAのGly279−Ala419をコードする419bpのD
NA断片を単離した。419bpのDNA断片を、T4 DNAリガーゼ
の存在下に、4797bpのDNA断片に連結した。このライゲ
ーション混合物を用いてＥ．coli DH−１を形質転換し
た。アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望の
プラスミドpSTQitrpを単離し、制限マッピングにより特
性決定した。Ｅ．coli HB101−16をプラスミドpSTQitrp
で形質転換して、形質転換株Ｅ．coli HB101−16（pSTQ
itrp）を得た。
実施例19（プラスミドpSTQktrpの構築およびクローニン
グ） （第15図に図示） プラスミドpSTTktrpをCla IおよびEcoR Vで消化し、
生じた4656 bp DNA断片を単離した。他方、プラスミドp
STQitrpをCla およびEcoR Vで消化し、STQitPAのCys1−
Asp184をコードする560 bpのDNA断片を単離した。得ら
れたDNA断片を、T4 DNAリガーゼの存在下に、4656bpのD
NA断片に連結した。このライゲーション混合物を用い
て、Ｅ．coli DH−１を形質転換した。
アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つから、所望の
プラスミドpSTQktrpを単離し、制限マッピングにより特
性決定した。Ｅ．coli HB101−16をpSTQktrpで形質転換
して、形質転換株HB101−16（pSTQktrp）を得た。
実施例20（プラスミドpMH9006の構築およびクローニン
グ） （第16図に図示） プラスミドpTA9004をStu IおよびEcoR Iで消化し、生
じた4329 bpのDNA断片を単離した。このDNA断片を、T4
ポリヌクレオチドキナーゼおよびT4 DNAリガーゼを用い
て、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドHP60およびHP
61に連結した。このライゲーション混合物をEcoR Iで処
理して、EcoR I消化粘着末端を再生し、生じたEcoR I−
Dde I DNA断片（4364bp）を、プラスミドbCLiPAΔxtrp
から調製した、天然ｔ−PAのAsn205−Leu266をコードす
る184bpのEcoR I−Dde I DNA断片に連結した。このライ
ゲーション混合物を用いてＥ．coli DH−１を形質転換
した。アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望
のプラスミドpMH9006を単離し、制限マッピングにより
特性決定した。
実施例21（pthTTtrpの構築およびクローニング） （第17図に図示） プラスミドpTA9006をStu Iで消化し、生じた線状化DN
A断片（4548bp）をコウシ腸ホスファターゼにより脱燐
酸した。他方、プラスミドpCLiPAΔxtrpをStu Iで消化
し、天然ｔ−PAのGly279−Ala419をコードする419bpのD
NA断片を単離した。得られたDNA断片を、T4 DNAリガー
ゼの存在下に、4548bpのDNAを断片に連結した。ライゲ
ーション混合物を用いてＥ．coli DH−１を形質転換し
た。
アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望のプ
ラスミドptTTtrpを単離し、制限マッピングによって特
性決定した。Ｅ．coli HB101−16をプラスミドpthTTtrp
で形質転換し、形質転換株Ｅ．coli HB101−16（pthTTt
rp）を得た。
実施例22（プラスミドpMH9007の構築およびクローニン
グ） （第18図に図示） プラスミドpMH9003をEcoR IおよびEcoR Vで消化し、4
340 bp DNA断片を単離した。得られたDNA断片を、T4ポ
リヌクレオチドキナーゼおよびT4 DNAリガーゼを用い
て、合成オリゴデオキシリボヌクレオチドHP58およびHP
59に連結した。ライゲーション混合物をEcoR Iで処理し
て、EcoR I消化粘着末端を再生させた。
得られたDNA断片（4367bp）を、T4 DNAリガーゼの存
在下に、プラスミドpCLiPAΔxtrpから得た184 bpのEcoR
i−Dde I DNA断片と連結した。ライゲーション混合物を
用いてＥ．coli DH−１を形質転換した。
アンピシリン抵抗性の形質転換株の一つから、所望の
プラスミドpMH9007を単離し、制限マッピングにより特
性決定した。
実施例23（プラスミドpuTTtrpの構築およびクローニン
グ） （第19図に図示） プラスミドpTA9007をStu Iで消化し、生じた線状化DN
A断片（4551bp）をコウシ腸ホスファターゼにより脱燐
酸した。他方、プラスミドpCLiPAΔxtrpをStu Iで消化
し、生じた419 bpの断片を単離した。419 bp DNA断片
を、T4 DNAリガーゼの存在下に、4551 bp DNA断片と結
合した。このライゲーション混合物を用いてＥ．coli D
H−１を形質転換した。
アンピシリン抵抗性形質転換株の一つから、所望のプ
ラスミドpuTTtrpを単離し、制限マッピングにより特性
決定した。Ｅ．coli HB101−16をプラスミドpuTTtrpで
形質転換して、形質転換株Ｅ．coli HB101−16（puTTtr
p）を得た。
実施例24（発現および単離） Ｅ．coli HB101−16（pTQkPAΔtrp）を、実施例９に
記載したのと実質的に同様にして、培養し、得られた培
養物からTQktPAを単離した。得られたTQktPA含有上澄液
のｔ−PA活性は、天然ｔ−PAとして7.7×104IU/であ
った。
実施例25（発現および単離） 新規ｔ−PA類発現のため、Ｅ．coli HB101−16（pSTT
ktrp）、Ｅ．coli HB101−16（pSTQktrp）、Ｅ．coli H
B101−16（pSTQitrp）、Ｅ．coli HB101−16（pthTTtr
p）およびＥ．coli HB101−16（puTTtrp）を用いた。こ
れらの細菌の培養は、実施例９に記載したのと実質的に
同様にして行った。得られた培養物（200ml）から得た
細胞ペレットを10mM燐酸緩衝食塩水（pH8.0）20mlに懸
濁し、４℃で１分間超音波処理した。15,000rpm、４℃
で20分間遠心分離したのち、得られたペレットをトリト
ン（Triton）×−100溶液（0.5％トリトン×100、８％
シュークロース、50mM EDTA、10mMトリス−HCl、pH8.
0）20mlに懸濁し、４℃で１分間超音波処理した。懸濁
液を15,000rpmで20分間遠心分離した。得られたペレッ
トを、50％グリセロール水溶液20mlおよび氷冷エタノー
ル20mlで順次洗浄し、8M尿素、20mM酢酸、40mM水酸化ア
ンモニウム、0.4mMシステインおよび0.04mMシスチンを
含有する8M尿素溶液（pH9.5）20mlに、超音波処理によ
り溶解した。
15,000rpmで20分間遠心分離後、上澄液を8M尿素溶液
でA280＝0.1（280nmでの吸光度）まで希釈した。得られ
た溶液を、20mM酢酸、40mM水酸化アンモニウム、0.4mM
システインおよび0.04mMシスチンを含有する水溶液（pH
9.5）の10倍量に対して室温で15時間透析した。上記操
作において、新規ｔ−PA、すなわちSTTktPA、STQktPA、
STQitPA、thTTtPAまたはuTTtPAを含有する各透析物をそ
れぞれＥ．coli HB101−16（pSTTktrp）、Ｅ．coli HB1
01−16（pSTQktrp）、Ｅ．coli HB101−16（pSTQitr
p）、Ｅ．coli HB101−16（pthTTtrp）またはＥ．coli
HB101−16（puTTtrp）の培養物から得た。得られた透析
物の各々をそれぞれ、実施例９に記載のフィプリンプレ
ートアッセイに付した。結果を次表に示す。
実施例26（新規tPA類の分子量測定） 上記の実施例で生産された新規ｔ−PAの分子量を、マ
ーカー蛋白質（94,000, 67,000, 45,000, 30,000, 14,4
00ドルトン）を用いたSDS−PAGE分析によって測定し
た。
結果を次表に示す。
実施例27（DNAシークエンスの同定） 発現ベクターは二本鎖DNAに適用されるジデオキシリ
ボヌクレオチド鎖ターミネーション法［スミス（Smit
h）,A.J.H.メソッド・オブ・エンザイモロジー（Meth.E
nzym.）第65巻第560〜580頁（1980年）］による部分DNA
配列決定に続く制限マッピングにより特性決定ならびに
同定が行なわれた。
プラスミドpTTkPAΔtrp［２μg,10mMトリス・HCl（pH
7.4−1mM EDTA 16μ中）、2mM EDTA（２μ）および
2N NaOH（２μ）で５分間室温で処理した。得られた
混合物に5M酢酸アンモニア（８μ）およびEtOH（100
μ）を加えた。混合物を−80℃で30分間冷却し、12,0
00rpmで５分間遠心分離した。上澄液を除去した後沈澱
を水冷70％エタノール水で洗浄し、減圧乾燥して変性プ
ラスミドを得た。
プラスミドを40mMトリス・HCl（pH7.5）−20mM MgCl2
−50mM NaCl中合成オリゴデオキシリボヌクレオチド・
プライマー（５′−ATATTCTGAAATGAGCTGT トリプトファ
ン・プロモーターの−55〜−37位に相当5ng）と65℃で1
5分間アニールし、次いで30分間を要して室温まで徐々
に冷却した。配列決定反応はT7ポリメラーゼ（シークエ
ナーゼ（Sequenase）、米国Biochemical Corp.）および
−35S−dATP（Amersham）を用いて、Tabor,S.およびRic
hardson,C.C.の方法［Proc.Natl.Acod.Sci.U.S.A.84,47
67−4771（1987）］に従って行なった。決定した配列
（プライマー、すなわちトリプトファン・プロモーター
中の35塩基およびTTktPAのＮ末端コード配列115塩基か
らなる約150塩基）は期待された配列と一致した。
pTQkPAΔtrpのDNA配列決定も上記と同様な方法で行な
われた。
pSTTkPAtrp、pthTTtrpおよびpuTTtrpのDNA配列決定も
合成デオキシオリゴヌクレオチド（５′−CTCCGGGCGACC
TCCTGTG、天然tPAのHis297−Gly302に対応するDNA配列
に相補的である）を用いた以外は上記と同様にして行な
った。
実施例28（アミノ酸配列の同定） 実施例25で得たSTTktPAを含む透析物から実施例12に
記載された精製法と同様にして精製されたSTTktPAを8M
尿素−50mMトリス・HCl（pH8.0）−1.5％ β−トルカ
プトエタノールに溶解し、Cys残基のSH基のカルボキシ
メチル化のためにモノヨード酢酸で処理した。得られた
カルボキシメチル化されたSTTktPAはCOSMOSIL 5C4−300
（4.6mmφ×50mm,NaKarai Tesque）を用いる調整用HPLC
により精製され、気相シークエンサー470A（Applied Bi
osystem Inc）により配列決定された。その結果、STTkt
PAのＮ−末端配列はSer−Glu−Gly−Asn−Ser−Asp−Cy
s−Tyr−Phe−Gly−Asn−Gly−Ser−Ala−Tyrであり、
期待された配列と一致した。
実施例29（pST118の構築とクローニング） （第20図に図示） プラスミドpST112［それを含有する形質転換体である
Ｅ．coli DH−1 FERM BP−1966から単離でき、pST112に
おける天然ｔ−PAのcDNA配列は第21図に示されている］
をBamH IとSal Iで消化した。
大きいDNA断片を単離し、DNAポリメラーゼＩ（クレノ
ウ断片）で平滑末端とする。得られるDNA断片をT4DNAリ
ガーゼで自己ライゲートし、ライゲーション混合物で
Ｅ．coli HB101を形質転換した。
アンピシリン抵抗性形質転換体の一つから、目的のプ
ラスミドpST118を得てマッピングにより特性決定をし
た。
実施例30（pmTQk112の構築とクローニング） （第22図および第23図に図示） プラスミドpST118をBgl IIおよびBbe Iで消化した。
大きいDNA断片を単離し、Arg-1Ser1Cys92Tys Gluをコー
ドする合成Bgl II−Ava II DNA断片［５′−GATCTTGCTA
CGAG and 5′−GTCCTCGTAGCAA,各オリゴマーはT4ポリヌ
クレオチド・キナーゼ（宝酒造）によりリン酸化した］
とpST118から得られた天然ｔ−PAのAsp95−Gly110をコ
ードするAva II−Bbe I DNA断片とをT4DNAリガーゼ（宝
酒造）により結合した。
ライゲーション混合物を用いてE.coli DH−１を形質
転換し、アンピシリン抵抗性形質転換体の一つから目的
とするプラスミドpmTQk118を単離し、制限マッピングに
より特性決定をした。
他方、プラスミドpST112をBgl IIとXma Iで消化し、
大きいDNA断片を単離し、これとpmTQk118から得たArg-1
−Val507をコードする1253 bp Bgl II−Xma I DNA断片
をT4DNAリガーゼの存在下にライゲートし、補乳動物細
胞におけるmTQktPAの発現ベクターであるpmTQk112を得
た。
実施例31（pmTTKの構築とクローニング） （第24図、第25図および第26図に図示） pTTkPAΔtrpをCle IとEcoR Iで完全に消化し、得られ
た大きいDNA断片を単離し、これとBgl II制限酵素部位
を含むCla I−Dde I合成DNA断片（５′−CGATAAAATGGGT
CCTAGATCおよび５′−TCAGATCTAGGACCCATTTTAT、各DNA
はT4ポリヌクレオチドキナーゼによりリン酸化された）
とpTTkPAΔtrpから得られたGlu175−Trp204をコードす
るDde I−EcoR I DNA断片とをT4DNAリガーゼにより結合
してプラスミドpHS9006を得る。
pTTkPAΔtrpをEcoR I（部分消化）とApa Iで消化して
781bp DNA断片を単離し、pHS9006から得られた4.1kbpの
EcoR I−Apa I DNA断片とライゲートし、Arg-1とSer174
−Pro527をコードするプラスミドpHS3020を得た。
プラスミド3020をBgl IIおよびSma Iで消化し、Arg-1
とSer174−Pro508をコードする小さいDNA断片を単離
し、pmTQk112から得たBgl II−Sma Iの大きいDNA断片と
ライゲートしてTTktPAの動物細胞のための発現ベクター
であるpmTTKを得た。
実施例32（pmSTTkの構築とクローニング） プラスミドpHS9006をEcoR Iで消化し、大きいDNA断片
を単離し、コウシ腸ホスファターゼ（ファルマシア）で
脱リン酸化し、pSSTkΔtrpから得たAsn205−Lys361をコ
ードする472bp EcoR I DNA断片にライゲートしてプラス
ミドpMH3025を得る。プラスミドpMH3025をBgl IIおよび
Sma Iで消化し、小さいDNA断片を単離し、pmTQk112から
得られたBgl II−Sma Iの大きいDNA断片とライゲートし
て動物細胞におけるSTTktPAの発現ベクターであるプラ
スミドpmSTTkを得た。
実施例33（発現） Ｌ−929形質転換体の構築 A.細胞の調製 Ｌ−929細胞系がこの実施例で用いられるが、Ｌ−929
細胞はATCC＃CCL−１として入手できる。この細胞をカ
ナマイシンと10％（v/v）牛胎児血清を含むDMEM中37℃
で５％CO2条件下で維持した。この細胞を形質転換の前
日10cmのペトリ皿につき５×105細胞数の細胞濃度でプ
レートした。培地は形質転換３時間前に交換した。２つ
の10cmペトリ皿を各形質転換に用いた。
B.DNA溶液の調製 プラスミドDNAを用いてゴーマン（Gorman）法［DNA C
loning II,143（1985）,IRLpress］と同様にしてリン酸
カルシウム技術によりＬ−929細胞を形質転換した。
発現プラスミド（pmTQk112,pmTTkまたはpmSTTk）30μ
ｇとプラスミドpSV2neo ATCC No.37149 3μｇを2M CaCl
2（186μ）と水（1.3ml）に加えた。DNA溶液（1.5m
l）を２×HBS（1.63％塩化ナトリウム、1.19％Hepes,0.
04％Na2HPO4,pH7.12）（1.5ml）に滴下した。混合物を
細胞に接触させる前に室温で30分間放置した。
C.細胞のトランスフェクション DNA溶液（0.6ml）を徐々に撹拌しながらＬ−929細胞
の10cmペトリ皿に加え、37℃でCO2気流中18時間加温し
た。10％FCSを含む完全な新鮮成育培地を次に加え、細
胞をCO2気流中37℃で24時間加温した。細胞をトリプシ
ン処理し、300μg/mlのジェネティシン（geneticin,G41
8）および10％FCSを含むDMEMからなる選択培地中で1:10
のサブカルチュアをした。ホスホトランスフェラーゼ
（neo′遺伝子産物）を発現する細胞が選択培地中で生
存し、コロニーを形成することができる。培地を３−４
日ごとに交換し、コロニーを12−14日後に単離した。G4
18抵抗性コロニーを小シリンダー中おだやかなトリプシ
ン処理により採取し、培養塊になるまで増殖させ、変異
ｔ−PAの選択のための試験をした。細胞を直径1.7cmの3
mlの培地を入れたマルチ・ウエル・プレート皿中で３×
105細胞数になるまで増殖させた。培地を除去し、PBSで
洗浄した。細胞を0.04mM ZnSO4,1mM酪酸ナトリウム、２
％FCSを含む、DMEMからなる誘導培養培地（1ml）中で培
養し、培地中の変異ｔ−PAの活性をS2251を用いる間接
吸光分析法［Trombosis Research 31,427（1983）］に
より確認した。
寄託のためにＥ．coli DH−１はプラスミドpmTQk11
2、pmTTkまたはpmSTTkを用いて常法により形質転換され
た。
上記実施例で得られた下記微生物は工業技術院微生物
工業技術研究所にそれぞれブダペスト条約に基づく国際
寄託されており、下記の寄託番号がそれぞれ付されてい
る。
【図面の簡単な説明】
第１図は、プラスミドpHVBBの構築およびクローニング
を示す。 第２図は、プラスミドpCLiPAxtrpの構築およびクローニ
ングを示す。 第３図は、Bgl II DNA断片（1974 bp）のDNA配列を示
す。 第４図は、プラスミドpCLiPAΔxtrpの構築およびクロー
ニングを示す。 第５図は、プラスミドpTQiPAΔtrpの構築およびクロー
ニングを示す。 第６図は、プラスミドpTA9004の構築およびクローニン
グを示す。 第７図は、プラスミドpTTkPAΔtrpの構築およびクロー
ニングを示す。 第８図は、EcoR I DNA断片（472 bp）のDNA配列を示
す。 第９図は、pTTiPAΔtrpの構築およびクローニングを示
す。 第10図は、プラスミドpTQkPAΔtrpの構築およびクロー
ニングを示す。 第11図は、プラスミドpMH9003の構築およびクローニン
グを示す。 第12図は、プラスミドpSTTktrpの構築およびクローニン
グを示す。 第13図は、プラスミドpZYの構築およびクローニングを
示す。 第14図は、プラスミドpSTQitrpの構築およびクローニン
グを示す。 第15図は、プラスミドpSTQktrpの構築およびクローニン
グを示す。 第16図は、プラスミドpMH9006の構築およびクローニン
グを示す。 第17図は、プラスミドpthTTtrpの構築およびクローニン
グを示す。 第18図は、プラスミドpMH9007の構築およびクローニン
グを示す。 第19図は、プラスミドpuTTtrpの構築およびクローニン
グを示す。 第20図は、プラスミドpST118の構築とクローニングを示
す。 第21図は、pST112における天然ｔ−PAのcDNA配列を示
す。 第22図は、プラスミドpmTQk118の構築とクローニングを
示す。 第23図は、プラスミドpmTQk112の構築とクローニングを
示す。 第24図は、プラスミドpHS9006の構築とクローニングを
示す。 第25図は、プラスミドpHS3020の構築とクローニングを
示す。 第26図は、プラスミドpmTTkの構築とクローニングを示
す。 第27図は、プラスミドpMH3025の構築とクローニングを
示す。 第28図は、プラスミドpmSTTkの構築とクローニングを示
す。 第29図は、pTTkPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。 第30図は、pTTiPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。 第31図は、pTQkPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。 第32図は、pTQiPAΔtrpのコード領域のDNA配列を示す。 第33図は、pSTTktrpのコード領域のDNA配列を示す。 第34図は、pSTQktrpのコード領域のDNA配列を示す。 第35図は、pSTQitrpのコード領域のDNA配列を示す。 第36図は、puTTtrpのコード領域のDNA配列を示す。 第37図は、pthTTtrpのコード領域のDNA配列を示す。 第38図は、pmTQk112のコード領域のDNA配列を示す。 第39図は、pmTTkのコード領域のDNA配列を示す。 第40図は、pmSTTkのコード領域のDNA配列を示す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き 審判番号 平6−16390 合議体 審判長 石田 吉信 審判官 田中 久直 審判官 鈴木 恵理子 (56)参考文献 Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ．83（1986）Ｐ．4670−4674

Claims (6)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】天然ｔ−PAのＨ鎖のクリングル２ドメイン
    とＬ鎖からなり、天然ｔ−PAの275番目のアルギニンが
    他のアミノ酸で置換されたグリコシル化されていないｔ
    −PA。
  2. 【請求項２】天然ｔ−PAの275番目のアミノ酸以外は天
    然ｔ−PAの174番目のセリンから527番目のプロリンまで
    のアミノ酸配列と同一のアミノ酸配列を有する請求項１
    記載のｔ−PA。
  3. 【請求項３】天然ｔ−PAの275番目のアルギニンがアス
    パラギン酸で置換されている請求項１また２項記載のｔ
    −PA。
  4. 【請求項４】請求項１、２または３記載のｔ−PAをコー
    ドするDNA。
  5. 【請求項５】請求項４記載のｔ−PAをコードするDNAを
    含む発現ベクターにより形質転換された大腸菌を培地に
    培養し、得られる培養物より、請求項１、２または３記
    載のｔ−PAを採取することを特徴とするｔ−PAの製造
    法。
  6. 【請求項６】請求項１、２または３記載のｔ−PAを含有
    する血栓溶解剤。
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