JPH05508771A - Ａｎｃｒｏｄ類似蛋白質、その製造及び使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ＡＮＣＲＯＤ類似蛋白質、その製造及び使用本発明はフィブリノアン分解特性を 有する新規の蛋白質、いわゆるフィブリノゲナーゼ、その製造及び病気の予防及 び治療のためのその使用に関する。

従来、マレー産のマムシ（＾ｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）の 毒から、抗凝固剤特性を有するフィブリノゲナー分解酵素だけを得ることができ た（Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｊ、　１３１．７９９．１９７３）。この蛋白質は、文 献中には、アルビン（＾ｒｖｉｎ）　、アルウィン（＾ｒｖｉｎ）又はアンクロ ト（＾ｎｃｒｏｄ）と称されている。

この蛋白質の使用可能性は限られている。それというのも、＾ｎｃｒｏｄ−中和 抗体の形成に帰因していると思われる耐性徴候が６〜８週間後に現われつるから である。突発的に出血性の合併症も起こる。

ところでフィブリノアン分解特性を有する他の蛋白質が見つかり、純粋に製造さ れた。

本発明の目的物は、配列表に挙げたアミノ酸配列１．２．３．４及び５を有する グリコジル化された、部分的グリコジル化された又はグリコジル化されていない ポリペプチド（ここでＸａａ及びＸａｂは天然α−アミノ酸の残基である）並び にアミノ酸位置の９５％よりも多い割合の挙げられた配列と同じであるその対立 遺伝子変異体である。

アミノ酸基Ｘａａは、Ａｓｎ、Ｇ１ｎ５Ｓｅｒ。

Ｔｈｒ、ＧｌｙＳＡｓｐＳＧｌｕ、ＬｙｓｌＡｒｇ又はＰｒｏ、しかし有利にＡ ｓｎ、Ｇ１ｎ１Ｓｅｒ及びＴｈｒ及び殊にＡｓｎ及びＧＩｎである。ＸａｂはＰ ｈｅ、Ｔｙｒ、Ｌｅｕ、Ｉ　ｌｅ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｔｈｒ又はＳｅｔが有利で ある。

本発明は、更に、前記の蛋白質についてコードするＤＮＡ−配列並びにこのＤＮ Ａ−配列を含有するベクターに関する。有利なりＮＡ−配列は、配列表の配列Ｎ ｏ、６〜９に示されている。

本発明による蛋白質は公知方法により遺伝子工学的に製造されつる。

すなわちマレー産のマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎｒｈｏｄｏｓｔｏａａ）の 腺組織からｍＲＮＡを分離し、かっ二本鎖ｃＤＮＡに翻訳することができる。商 業的に得られるクローニングベクター、例えばス　ｇｔｌＯへのこのｃＤＮＡの 挿入により、ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ−ライブラリィが設定される。その際使用される方 法は、例えばマニアチス（ｉ［ａｎｉａｔｉｓ）等のモレキュラール・クローニ ング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）　、ＣＳ　ＨＰｒｅｓｓ、　（１ ９３２。

）に記載されている。また、放射性標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ又 は放射性標識されたＤＮＡ−フラグメントでのこのような遺伝子列のスクリーニ ングも薯々使用されかつ記載された方法である。この方法により、オリゴヌクレ オチドプローブに対する又は放射性標識されたＤＮＡ−７ラグメントに対する相 同を有するｃＤＮＡ−クローンを分離し、かつ特徴付けすることができる。この 方法は、Ｄ　Ｎ　Ａ　ＣｌｏｎｉｎｇＶｏｌ　Ｉ　、Ｉ　ＲＬ　Ｐｒｅｓｓ、１ ９８５に記載されている。

このように特徴付けられたｃＤＮＡは制限酵素を用いて容易に得られる。その際 生じるフラグメントを、場合により化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、ア ダプター又は遺伝子フラグメントと連結させて、蛋白質についてコードする配列 をクローン化するために使用することができる。クローニングベクター、例えば 市場で慣用のプラスミドＭ　１３　■ｐ又はｐｋｋ−２２３−３中への遺伝子フ ラグメントもしくは合成りＮＡ−配列の挿入は、公知方法で行なわれる。また遺 伝子又は遺伝子フラグメントは、適当な化学的に合成された又は細菌、ファージ 、真核生物細胞又はそのウィルスから単離された、蛋白質の発現を可能にする制 御領域を備えられ得る。

こうして得られるバイブリドプラスミドでの適当な宿主生体の形質転換もしくは トランスフェクションは同様に公知であり、詳細に記載されている（ＩＩ、　Ｗ ｉｇｌｅｒ等、Ｃｅ１ｌ　１６　（１９７９）　７７７−７８５　：Ｆ、　Ｌ。

Ｇｒａｈａｍ　ａｎｄ　Ａ、　Ｊ、　ｖａｎ　ｄｅｒ　Ｅｂ、　Ｖｉｒｏｌｏｇ ｙ　５２　（１９７３）４５６−４６７）。このバイブリドプラスミドは、媒体 中へのポリペプチドの分泌を許す相応するシグナル配列を備えることも可能であ る。

哺乳動物細胞での発現の際に、表現すべき遺伝子（この場合には、配列表中に記 載されたフィブリノゲナーゼの１つについてコードするｃＤＮＡ）をマウス−メ タロチオネイン−又はウィルスの５ｖ４０−プロモーターの制御下に置くベクタ ーを使用することができる（Ｊ、　Ｐａｒｇｅ　Ｍａｒｔｉｎ、　Ｇｅｎｅ、３ ７　（１９８５）　１３９−１４４）。メチオニン−出発コドンの存在及び相応 する蛋白質のための遺伝子のリーダー−／プロ配列の存在がこの発現のためには 必要である。次いでこのベクターのコピーをエビソームとして又はゲノム中に組 みこんで有するクローンを単離する。牛乳頭腫−ウィルスを基礎とする異種遺伝 子の組込み及び表現が特に有利である。細菌細胞中での複製及び抗生物質−耐性 に関してコードする原核生物配列と関連して、“シャトル″−ベクターの構築が 可能である。プラスミドの構築及び増殖は先ず細菌細胞中で行なわれ：引続き真 核細胞、例えばマウス−繊維芽セルラインｃ１２７への変換が行なわれる。

他の細胞系、例えば酵母及び他のｍａ、昆虫細胞並びに動物及びヒトの細胞、例 えばＣＨＯ−１ＣＯＳ。

Ｌ−及び２９３細胞を、適当な表現ベクターと関連させてクローン化されたｃＤ ＮＡの表現のために使用することも可能である。

この真核生物表現系は、それらがその生産物を有効にかつ大抵自然の形で分泌す ることができるという利点を有する。更にこれらは、その生産物を翻訳後に変性 する能力を有する。

こうして、記載のフィブリノゲナーゼは真核細胞中での発現時には、なおグリコ シド側鎖を有する。この側鎖は細菌中に生産されたポリペプチドでは欠けている 。このグリコシド側鎖は、相応するグリコシダーゼを用いる酵素的にも完全に又 は部分的に除去され得る。細菌中に発現した大抵の真核蛋白質は、細胞中で変性 された封入体として生じ、かつ蛋白質化学的に再生されるはずである。更に細菌 は薯々、イニシェークーアミノ酸メチオニンを完成蛋白質から分離することはで きない。分泌系の使用によって、この困難は回避され得る（Ｄｏｎａｌｄ　０１ ｉｖｅｒ、　Ａｎｎ、　ＲｅｖｏＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、３９、　１９８５　、　 ６１５−４８　；　Ｊｏｈｎ　Ｇｈｒａｙｅｂ等、ＴｈｅＥＭＢＯＪｏｕｒｎａ ｌ　３，１９８４．２４３７−２４４２）。

しかし遺伝暗号の縮重に基づき、他のＤＮＡ−配列、例えば異なるＤＮＡ−配列 を有する化学的に合成された遺伝子を、記載のフィブリノゲナーゼの発現のため に使用することも可能である。クローン化された遺伝子を用いて突然変異生成の 確立された方法により類似の作用を有するこのフィブリノゲナーゼの変異体を得 ることができる。

得られるポリペプチドの精製は、培地からクロマトグラフィー法、例えばアルギ ニン−セファ０−ス、”ｙ　／（＋７　：／−ヤ、ア。−ユ（Ｈｅｐａｒｉｎ　 −Ｓｅ。５８．。５ｏ■）又はイオン交換体物質でのアフィニティークロマトグ ラフィーにより、公知の方法で行なう（文献：“Ｇｕｉｄｅｔｏ　Ｐｒｏｔｅｉ ｎ　Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ”　、　Ｍｕｒｒａｙ、Ｐ、Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ ［ｅｄ］、＾ｃａｄｅ＋＊ｉｃ　Ｐｒｅｓｓ　１９９０　）。

フィブリノゲナーゼの精製は同様にマムシー−ヤ７７０−Ｘ（Ｃａｎ＾−８ｅｐ ｈａｒｏｓｅ■）、Ｑ−ヤ■ ファロース（Ｑ　−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　）、　Ｓ−セファロース（Ｓ　−５ｅ ｐｈａｒｏｓｅ■）の使用下に、適当なりロフトグラフィー法とクロマトフォー カス化（Ｃｈｒｏｍａｔｏ−ｆｏｃｕｓｓｆｅｒｕｎｇ）との組合せにより、例 ５に記載したように、精製され得る純精製のためには、特にＨＰＬＣ−法が使用 される。

また本発明の目的は、場合により製薬学的に認容性の賦形剤又は結合剤中に本発 明により製造した蛋白質を含有する薬剤である。この薬剤は本発明により製造し た蛋白質と他の薬物学的に有効な治療剤、例えば血栓溶解剤（ｔＰＡ、ストレプ トキナーゼ）、ヒルジン又はトロンボキサン受容体−アントゴニストと組合せて 含有してもよい。

本発明の他の実施態様を例中に詳しく記載する。

更に遺伝子工学的方法については、例えばマニアチス（１ｌａｎｉａｔｉｓ）等 の研究書、“モレキュラール・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉ ｎｇ）’　、　：２−ルドースブ、リング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ 　Ｓｐｒｉｎｇ　ＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ）　、１９８２又は”ＤＮ Ａクローニング（ｃｌｏｎｉｎｇ）　”　Ｉ−ｍ巻、ＩＲＩブレス（Ｐｒｅｓｓ ）　１９．８５−８７、発４行者り、、Ｍ、グローバー（Ｇｌｏｖｅｒ）を参照 すべきである。

本発明によるポリペプチドは、糸球体腎炎、心筋梗塞、非−虚血性の卒中発作、 末梢動脈血、流騰害（竺呵アテローム性動脈硬化症閉塞、血栓血管炎閉塞、糖尿 病細管異常及びレイノー病）、不安定な狭心症、深夜静脈血栓症及び他の血栓症 、血栓溶解治療後の再血栓形成、動脈又は静脈の血管形成、の移着におけるよう な血管外科手術後の再血栓形成の治療のために、並びに体外循環における血栓症 の回避のために好適である。

例エ マレー産のマムシ（Ａｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ）からのフ ィブリノゲナーゼのためのｃＤＮＡクローンの単離 アゲキストロトン・ロドストマ（ＡｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎＲｈｏｄｏｓｔｏｍａ ）　１１４の５才蛇の毒腺組織１ｇを、６Ｍグアニジニウムチオシアネート、５ ｍＭクエン酸ナトリウム（ｐ、Ｈ７，ｏ）　、０．１Ｍ２−メルカプトエタノー ル中で、ウルトラートラックス（ＵＬＴＲＡ−ＴＵＲＲＡＸ■）中の０．５％サ ルコシル（Ｓ・・・・５ｙｌ）　中で溶解させた。粗製溶解物を３００　Ｏｒｐ ｍで遠心分離にかけた。ＲＮＡを４５０００　ｒｐ、ｍで一夜５　、７　Ｍ　Ｃ ｓ、ＣＩ＝クッションを通す遠心分離によって分離した。引続゛きポリＡ０−含 有ＲＮＡ−フラグメントをオリゴ（ｄＴ）−七、ルロースでのアフィニティーク ロ÷トゲラフイーにより分離した。

酵素ＡＭＶ−逆トランスクリブターゼ及びスターターとしてのオリゴ（ｄＴ）１ ２−１８を用いて、ポリＡ　”−ＲＮ　Ａを一本鎖のｃ’　Ｄ　Ｎ　Ａに換えた 。２本目のバーゼを用いて次の配列を有するＥｃｏＲＩア夛ブタ−を付加させた ：５’ＡＡＴＴ　ＣＣＡＴＧＧ　ＡＴＧ’ＣＡＴＧＣ３’。市場で得られるファ ージベクターλｇｔｌｏ（第１ａ図、第１ｂ図）を制限酵素ＥｃｏＲＩで線状化 した。双方のＤＮＡを相互に連結させ、□かつ市場で得られる伝染性ファージの ための包装エキストラクトを用いて包装した。組換ファージを、Ｅ、ｃｏｌｉＣ ６００■ｆ１と共にＮＺＹＤＴ−平板培地上に被着させかつ一晩３７℃で培養し た。こうして得られるｃＤＮＡ−ライブラリーは、２Ｘ１０６の独立クローンを 有した。相応する慣例法のｃＤＮＡ−ライブラリーの増幅後に、５０００００フ アージをＣ６００Ｈｆｌ細胞と共に被着させた。このファージをニトロセルロー ス−フィルター上に移し、０．５Ｎ　ＮａＯＨ／１．５ＭＮａＣＬで溶菌しく　 Ｉｙｓｆｅｒｔ）　、かつ変性したＤＮＡを８０℃で２時間ベーキングすること によってフィルターにしっかりと結合させた。このフィルターを６ＸＳＥＴ−緩 衝液（１ｘＳＥＴ＝０．１５Ｍ　ＮａＣ１，１５ｍＭトリス／ＨＣＩ、ｐ）（７ ，４，１ｍＭ　ＥＤＴＡ）、０．１％ＳＤＳ及び５×デン”−）　（Ｄｅｎｈａ ｒｄｔ’ｓ）溶液（１００Ｘデンハート＝フイコール１ｇ、ポリビニルピロリド ン１ｇ、ＢＳＡｌｇ（５０■！当り））中で４時間、６８℃で予備ハイブリダイ ゼーションさせた。

Ａｎｃｒｏｄ−蛋白質についてコードするＮ１ｃｋ−翻訳ｃＤＮＡ（第２図）と ハイブリダイゼーションさせた。

フィルターを、２ＸＳＥＴ、０．１％ＳＤＳ、３０％ホルムアミド、５Ｘデンハ ート及び１０％テキストランスルフェートを含有する溶液中で、−晩４２℃で軽 い振盪下で培養した。次いでそれを２ＸＳＥＴ１０．１％ＳＤＳ中で４２℃で数 回洗浄し、乾燥させ、かつレントゲンフィルムにさらした。′スクリーニング時 に放射性の応答をしたクローンを単離し、かつ相応するファージ−ＤＮＡを得る ために更に培養したファージ−ＤＮＡは、５５℃で１時間プロテアーゼＫ（ａｄ ８０μｙ／ｍｌ）と共に精製されたファージを培養しかつ引続いてフェノール／ クロロホルムを抽出することによって調製した。エタノール３容量（−２０℃） の添加後に、ファージ−ＤＮＡが沈殿し、滅菌注射針で７０％のエタノール中に 移し、洗浄しかつ短時間沈降させた。ペレットを空気中で短時間乾燥させた後に ＴＥ−緩衝液中に懸濁させた。

精製されたファージ−ＤＮＡを前記のようにニトロセルロースフィルター上に移 し、再生させ、再中和し、ベーキングしかつ予備ハイブリダイゼーションさせた 。次いで厳密な条件下で、ＡｌｌＣｒ０ｄ−コードされたＣＤＮＡに対して相同 である放射性標識化されたオリゴヌクレオチド試料とハイブリダイゼーションさ せた＝５’ＧＴＣＴＡＣＧＡＴ　ＴＡＴ　ＣＧＴ　ＧＡＣＴＧＧ　ＧＴＣＡＡ３ ’ フィルターを、２ＸＳＥＴ、ＳＤＳ　Ｏ，１％、ホルムアミド３０％、５Ｘデン ハート及びデキストランスルフェート１０％を含有する溶液中で、−晩４２℃で 軽い振盪下で培養した。次いでそれを６０℃で２ＸＳＥＴ１０．１％ＳＤＳ中で 数回洗浄し、乾燥させかつレントゲンフィルムにさらした。

この条件下でハイブリダイゼーションしなかったＤＮＡを更に分析するために一 本鎖ファージＭＢ中でサブクローン化した。

例２ Ａｎｃｒｏｄについてコードする一本鎖ＤＮＡの製造出発点は、Ａｎｃｒｏｄ− 特異性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしなかった例１に記載の ファージ−ＤＮＡであった。それらを各々個々に調製的に制限酵素ＥｃｏＲＩで 切断した。ｃＤＮＡ−挿入体を含有するＥｃｏＲＩ−フ”ラグメントを電気泳動 的にゲルから溶離させた。このフラグメントの各３０ｎｇを４℃で１２時間、Ｅ ｃｏＲＩ切断された、商業的に得られるクローニングベクターＭ１３ｍｐ１８又 はＭ１３■ｐ１９（第３図）１００ｎｇと１２時間連結させた。連結バッチの容 量は１０μｌでありだ。連結は、５分間８０℃に加熱することによって終了した 。

各連結バッチの１／１０容量をコンピテントな５Ｒ１０１細胞１００μｌの形質 転換のために使用した。

形質転換の終了後に、形質転換バッチに０．２Ｍ　ＩＰＴＧ−溶液６０ｕｌ及び ＸＧａ１　（２０ｍ１１／　寓ｌ）　１２０μｌを添加した。このバッチをＮＺ ＶＤＴ−上面寒天培地で５ＲＩＯＩ細胞（ＯＤａｏｏ＝　１　）　２００　ｕｌ を有するＮＺＹＤＴ−寒天平板培地上に被着させた。培地ＮＺＹＤＴは商業的に 得られる（Ｇ　Ｉ　ＢＣＯ−ＢＲＬ）。

ｃＤＮＡ−挿入体を含有するクローンはプラークが青色呈色をしないことに基づ いて同定され得る。ＤＮＡ−配列分析により（Ｓａｎｇｅｒ等、Ｐｒｏｃ、　Ｎ ａｔｌ、　Ａｃａｄ。

Ｓｃｉ、ＵＳＡ　７４．１９７７．５４６３−６７）このｃＤＮＡ−挿入体のＤ ＮＡ−配列は解明された（配列表、配列Ｎｏ、６〜９）。

例３ 真核細胞中のＡｎｃｒｏｄの表現のためのベクターの構築サルウィルス（＾ｆｆ ｅｎｖｉｒｕｓ）　Ｓ　Ｖ　４０のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及びＢ　ｃｌ　 Ｉで切断し、かつ０．２４ｋｂ−フラグメントをゲル電気泳動的に調製した（第 ４図）。末端を４つのデスオキシヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ、ｄＣ ＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在でクレノフーフラグメントで補充した。引続 きＸｈｏＩ−リンカ−を連結した。

平行して、商業的に得られるベクターｐＵｃ１８を酵素Ｓｌｌ＋ａＩで線状化し た。次いで同様にＸ　ｈｏ　Ｉ−リンカ−を取り込んだ。このベクターじｐＵｃ １８Ｘｈｏ”）のＤＮＡをＸｈｏｌで線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処 理しかつ０．２４ｋｂ　ＸｈｏｌＩ−８Ｖ４０−フラグメント（前記参照）と連 結させた。ｐＳＶｐＡが生じた。

ｐＳＶｐＡ−ＤＮＡをａｍ的１．：　Ｘ　ｈｏ　Ｉ　テ分解すセカつ前記のよう にクレノフーポリメラーゼと共に４つのｄＮＴＰｓの存在で培養した。０．２４ ｋｂ−７ラグメントをゲル−分離した。

同時に、ＣＬ２８Ｘ及びｐＢ２−２のリデーションによって生じた（　Ｒｅｄｄ ｙ等、ＤＮＡ６．１９８７．４６１−７２により）真核生物−表現ベクターＣＬ ２８ＸｈｏＢＰＶを、部分的に制限酵素Ｘ　ｂａ　Ｉで切断した、すなわち、２ つのＸ　ｈａ　Ｉ−識別配列の一方でのみ分離されている、要するに線状化され ている分子が生じるように時間的に制限して培養した（第５図）。次いでバッチ を記載のようにクレノフーポリメラーゼ及びｄＮＴＰｓと反応させた。線状分子 を引続きゲル電気泳動により分離した。

次いで線状のｐＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ−フラグメントと、ＳＶ４０からの予備処 理した０、２４ｋｂ−フラグメントとのリデーションを行なった。形質転換及び ミニリゼート（Ｍｉｎｉｌｙｓａｔｅｎ）のスクリーニング後に、Ｘ　ｈｏ　Ｉ 一部位の約０．１５ｋＢ３’一方向にある、前のＸ　ｂａ　Ｉ一部位に５Ｖ４０ −フラグメントを有するクローンを単離した；このＤＮＡ　（”Ｉ）ＣＬ２８Ｘ ｈｏＢＰＶ−ＳＶポポリＡ”）は“前の“遺伝子の５Ｖ４０−転写停止信号を有 した。

１）ＣＬ２８ＸｈｏＢＰＶ−３ＶポリＡのプラスミド−ＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ ｌで線状化し、かつアルカリ性ホスファターゼで処理した。同時に、＾ｎｃｒｏ ｄ〜特異性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしなかフた例２に記 載のｃＤＮＡ−挿入体に、Ｔ４リガーゼを用いてＸｈｏ−リンカ−を与えた。両 フラグメントはＴ４−リガーゼにより相互に結合された。形質転換及びミニリゼ ートの分析後に、ｃＤＮＡ−挿入体を単一でかつ正しい配向で含有するクローン を分離した：ｐＣＬ２８ＢＰＶ−フィブロゲナーゼＩ　−ｒＶ。

例４ セルラインのトランスフェクション及び確立Ｃ１２７Ｉ細胞（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ 、２６　（１９７８）　２９２　：　Ａ　Ｔ　ＣＣｃａｔａｌｏｇｕｅ　ｏｆ　 ｃｅｌｌ　１ｉｎｅｓ　ａｎｄｈｙｂｒｉｄｏｍａｓ　５ｔｈ　ｅｄｉｔｉｏｎ 、　１９８５．　ｐｌ　４２）をＢＰＶ−表現プラスミドと燐酸カルシウム−共 沈降方法（ＶｉｒｏＬｏｇＶ　５２　（１９７３）　、　Ｓ、４’５６．　ＤＮ Ａｃｌｏｎｉｎｇ；　Ｖｏｌｕｍｅ　ｆｔ、ｅｄ、Ｄ、Ｍ、Ｇｌｏｖｅｒ　Ｉ　 ＲＬＰｒｅｓｓ、（１９８５）　１４３頁以降及び２１３頁）によりトランスフ ェクションした。

５ｘ１０’Ｃｌ２７Ｉ−細胞を６０ｘｍペトリ皿中のＤ　Ｍ　Ｅ　Ｍ　（Ｄｕｌ ｂｅｃｃｏｓ’　ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｅｄ　Ｅａｇｌｅｓ　Ｉｌｅｄｉｕｍ）＋１ ０％ＦＣ８（胎生子牛血清）中に接種した。次の日に、ＣｓＣ１−精製プラスミ ドＤＮＡｌ０−ｌ５ｇと共に２５　ｎｉｌ　Ｈｅｐｅｓ　＋　１０％ＦＣ３を有 するＭ　Ｅ　Ｍ　（ＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅｓ　Ｍｅｄｉｕｍ）に変えられ た培地はＣａ−ホスフェート−共沈殿体を形成し、これを慎重にＣ１２７Ｉ−線 温保持した。引続くグリセリン−ショック−処理により、トランスフェクション の効率は著しく高められた。このために沈殿をのせてから４時間後に培地を細胞 から取り除いた。細胞を１５％グリセリン／ＨＢＳ（ｐ　Ｎ　Ａ　ｃｌｏｎｉｎ ｇ　Ｖｏｌ、　ｎ　、１５２頁）各２ｍｌと共に６０ｍｍベトリシャーレ中で３ 分間室温で恒温保持した。グリセリン／　ＨＢ　Ｓ−溶液を除去し、かつ細胞芝 （ＺｅＮｒａｓｅｎ）をＤＭＥＭ＋ｌ　Ｑ％ＦＣ３３ｍｆで洗浄した。細胞をＤ ＭＥＭ＋１０％ＦＣ５と共に３７℃ニア％Ｃ０２で恒温保持した。週３回、ＤＭ ＥＭ＋１０％ＦＣ５を除去し、かつ新しいものに□代えた。２−３週間後に、形 質転換された細胞の集落、いわゆるフォーカス（Ｆａｃｔ）として、ＢＰＶ−ゲ ノムを有するトランスフェクトされた細胞が確認された。

記載のフォーカスのサブクローニング後に、個々のサブクローンの培地上澄みを 公知方法によりフィブリノゲナー分解活性に関して検査した。

生産のためにセルラインを集合達成後に血清不含のＤＭＥＭ−培地中に保持した 。新規のフィブリノゲナーゼをそうして得られた血清不含の細胞培養上澄みから ・慣用の蛋白質−化学的方法により精製し、かつ薬物学的及び蛋白質化学的分析 に使用することができる。

例５ マムシ（＾ｇｋｉｓｔｒｏｄａｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｏ＊ａ）からのフィブリノア ン分解酵素（配列表、配列Ｎｏ、５）の単離及び精製 マムシの粗製前（乾燥物質）５５０１９を２０ｍＭＮａ２ＨＰＯ４２０ｍ１．０ ．０１％トウィーン（ＴＷｅｅｎ■）８０．５００ｍＭ　ＮａＣ１、ｐＨ７，０ 緩衝液（＝緩衝液Ａ）中に入れた。

ａ）　マドレックス・レッド・八−セファロース（Ｍａｔｒｅｘ　ＲｅｄＡ−５ ｅｐｈａｒａｓｅ■）ＴＯ２ｏｑｌ−ｆ５フィー：クロマトグラフィーカラム（ φ２．５ｃｔｍ、Ｉ＝５．１（Ｆａ、＾−１ｃｏｎ）　２５　ｍｌを充填した。

カラムを緩衝液Ａ１００　ｍｌで平衡させ、かつ引続き溶解粗製前を負荷した。

カラムを緩衝液Ａ　４５　ｍｌで後洗浄しく流量＝１２０　ｍｌ／　ｈ　）　、 かつ引続き、２０ｍＭ　Ｎａ２ＨＰＯ４，２Ｍ　ＮａＣＬ　０．０１％トウィー ン、ｐ　Ｈ７，０よりなる緩衝液Ｂ　８５　ｍｌを用いて溶離させた。ＵＶ−活 性画分（２８０ｎ會）を集めた。

流出液を透析管中（Ｖｉｓｋｉｎｇ寸法８．３２／３２）で２０ｍＭ　Ｎａ２Ｈ ＰＯ４，２，５１，０，０１％トウィーン■８０．ｐＨ７，０緩衝液（＝緩衝液 Ｃ）に対して２回順次に２ｈずつ透析させた。透析された管の伝導性（ｉ、約２ ．２＋ｓＳ／ｃｍ（４℃）であツタ。

ｂ）　アルギニン−セファ０−ス（Ａｒｇｉｎｉｎ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ■）Ｔ Ｏ９ｏｖ）グう、イー２クロマトグラフイーカラム（φ＝２．５ｃ■、Ｉ＝１０ ｃ＋ｅ）　１．：、ア１、ユ、−ヤ７７０−　Ｘ■（Ｐａ、Ｐｈａｒｓａｃｉａ ）を充填し、かつ緩衝液０２００ｍｊで平衡させた。

マドレックス・レッド・Ａ−セファロース■の透析流出液（容量的１４０　ｍＡ ）を流量１２０■ｊ／ｈでカラ　、ム上に加えた。

カラムの通過液（約１８０　ｍＡ）を集めかつ更に加工した。特に、アルギニン 塩での溶離によって得られうるＡｎｃｒｏｄが、カラムに結合して残留した。

■　■ ）にゲルマテリアルＰ　Ｂ　Ｅ　９４　（Ｆａ、　Ｐｈａｒｍａｃｉａを負荷し た。

、ｐＨ２，０緩衝液（＝緩衝液Ｅ）の後に２５分間以内で直線的に流量１　ｍｌ ／分で行なった。この時間後にカラムにもう１３分間緩衝液Ｅを通した。この際 に溶離するＵＶ−活性画分（２８０ｎｍ）を集めた。蛋白質測定（方法：参照、 Ａｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、１５３　、　２６７−２７１）により約０．０４ Ｈ／ｍｌを含有する蛋白質溶液約１露ｌを得た。

ｄ）　精製フィブリノゲナーゼＶの特徴付けｄｉ）　５ＤＳ−ゲル電気泳動 標準蛋白質と比べて、蛋白質溶液は主帯域（約７０〜９０％）を〜４２０００ダ ルトンで示した。

ｄ２）　Ｎ−末端配列決定 精製蛋白質溶液のＮ−末端配列を測定した（比較、配列記録、配列Ｎｏ、５）。

ｄ３）　フィブリノゲナーゼ−検定 フィブリノゲナーゼ−活性の測定のために、試験すべき酵素のフィブリノアンを ＤｅｓＡＡ−フィブリノアンに変換した。

この反応は、測光的に追跡された混濁増加と共に進行した。

活性。定量は、＾。ｃｒｏｄ−ユタ、ダート（Ａｒｖｉｎ■）３０００　Ｕ／ｍ ｑでの検定により行なわれた。

精製された酵素のフィブリノゲナーゼ−活性は約５００　Ｕ／箇９であった。

配列表 配列ム　１：２３４個のアミン讃よシなるアミノ酸配列Ｍａｌ　Ｉｌａ　ＧＡＹ 　ＧＡＹ　ｈｓｐ　ＧＬｕ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　工１・　八ｓｎ　Ｇｌｕ　Ｈｉｓ 　Ａｒｇ　Ｐｈ＠　Ｌｓｕ　Ｖａｌ５　！Ｏ１５ ＾１ａ　Ｌａｕ　ＴＹｒ　Ａｓｐ　Ｂａｒ　Ｔｈｒ　Ｔｈｒ　Ａｒｑ　Ａｊｎ　 Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ｃｙｍ　にｌｙ　Ｇｕｙ　Ｖａ１Ｌ＊ｕＩＩ＠　Ｈｌｓ　Ｐｒ ｏ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｘｉｓ　’ｒｈｒ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ｈｌｓ　Ｃ ｙａ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　Ｌｙｇ　５ｓ■ Ｍａｔ　ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｔｙｒ　ＸＡｕ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　）ｆｌｓｇ　Ｌｙ ｒｅ　Ｇｉｎ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｌｙｇ　Ｐｈｓ　Ａｓｐ　`ｓｐ ５０　５５　６Ｇ Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｕ　Ａｒｇ　Ｐｈｓ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　 Ｈｌｓ　Ｐｈａ　ＩｌａＡｒｇ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　ＬｙｓＰｒｏ　Ａｒｇ　’ｒ ｈｒ　ｋｘｑ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　Ａｓ１ｐ　工１＠　Ｍｅｔ　Ｌｅｕ　 工１ａ　Ａｒｇ　Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｌ凾■ Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ａｓｎ　Ｓｉｒ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓｓ　Ｈｌｓ　Ａｌａ 　Ｐｒｏ　Ｌｅｕ　Ｓａｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　５ａｒ　Ｇｌ■ ｔｏｏ　１０５　１１０ Ａｍｎ　Ｌｙｔｘ　Ｔｙｒ　Ｈｌｓ　Ａｓｐ　Ｖａｌ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ 　Ｇｌｕ　Ｐｒｏ　Ａｒｑ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　工１■ １コ０　１３５　１ＪＯ Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｔｙｒ　Ｘａａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　ｃｙｓ　Ａｒｇ　 Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｐｈ＠Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｉｌｅ　Ｇａｙ１４５　ヱ５０　１５ ５　１６０ Ｌｙｇ　ＬＹＳ　Ｂａｒ　Ｌｙｓ　１１＊　ＩＪｕ　ＣＹｌｌ　Ａｌａ　Ｇｌｙ Ａｓｐ　ＩＪｕ　Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　）Ｘｑ　ＩＩ、ｅｕ　入Tｐ Ｓａｒ　Ｃｙｓ　Ｈｉｓ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｓｅｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｌａｕ　Ｘｉｓ　Ｃｙｓ　５ａｒ　Ｇｌｕ　Ｇｌｕ　Ｐｈ１１８０　１８５　ｎ 。

Ｈｉｓ　Ｇｌｙ工１＠　Ｖａｎ　Ｔｙｒ　Ａｒｑ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　Ａｇｎ　Ｐ ｒｏ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｓｐ　ＬｙｓＰｒｏ　Ａｌａ　Ｌａ ｕ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　ＡＳｎ　Ｉｌｅ　Ｐｈ＠！　Ａｓｐ　Ｈｌｓ　Ｌａｕ　Ｈ ｌｓ　Ｔｒｐ　Ｘｉｓ　Ｌａｕ　５ｅ■ 配列表 配列４２：２３６個０アミノ瀧よシなるアミノ酸配列Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　ＡＳＥｐ　ｖｉｕ　Ｃｙｓ　Ａｌ！ｎ　Ｉｌａ　ＡＳｎ　Ｇｌｕ　Ｈｌ ｓ　ｋｒｑ　Ｐｈａ　Ｌａｕ　Ａ撃■ Ｌａｕ　Ｖａｌ　Ｔｙｒ　ＩｌａＴｈｒ　Ｂａｒ　Ｇｌｙ　Ｐｈ＠Ｌｓｕ　Ｃｙ ｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌａｕ　Ｘａｂ　Ｈ１ｓＰｒｏ　Ｇｌｕ　Ｔｒｐ 　Ｖａｌ　ｖａｌ　Ｓａｒ　Ａｌａ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　Ｃｙｓ　入１ａ　Ａｒｇ 　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　工Ｒｅ　Ｇｌｕコ５　４０　．４５ Ｖａｌ　Ｐｈｅ　Ｐｈａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｈｌｓ　５＊ｒ　Ｌａｕ　Ｌｙｓ　 Ａｓｐ　Ｘ１＊　Ａｒｑ　Ｔｈｒ　Ａｓｎ　Ｌｙｓ　ＡｓｐＶａｌ　Ｇｉｎ　Ｌ ｙｓ　Ａｒｇ　Ｖａｌ　入１ａ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｍａｔ　Ｐｈａ　Ｐｈｅ　Ｃ ｙｓ　Ｌｓｅｕ　Ｂａｒ　Ｓａｔ　Ｌｙ■ Ｐｒｏ　Ｖａｌ　Ｘａａ　Ａｇｎ　Ｓａｒ　Ｔｈｒ　Ｈｉｓ　Ｉｌａ　入１ａ　 Ｐｒｏ　ｌ１ｓｅ　Ｓｅｒ　Ｌａｕ　Ｐｒｏ　Ｓａｒ　５＠■ １ｏｏ　１０５　１ヱ０ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｓｕｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ｃｙｓ　Ａｒｇ　 Ｖａｌ　Ｍ＠ｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　ＴｈｒＴｈｒ　Ｓａｒ　Ｐ ｒｏ　Ｘａａ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｘａｂ　Ｐｒｏ　Ｂａｒ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｈ ｌｓ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ａｓｎ　Ｉｌａ１３０　１３５　工４０ 人ａｎ　Ｘ１＠　Ｌａｕ　Ａｓｐ　’ｒｙｒ　Ｘａｂ　Ｖａｌ　ｃｙｓ　Ａｒｇ 　Ａｌａ　Ａｌａ　Ａｒｇ　Ｐｒｏ　Ｌｙｓ　ｔａｕ　ＰｒB 人１ａ　Ｌｙｓ　５＊ｒ　ｋｒｑ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　（’ｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ 　工１ｅ　Ｌｓｕ　Ｇｌｕ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ｓ＠■ 人１ａ　Ｃｙｓ　Ａｓｐ　Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｓａｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｌａｕ　Ａｓｎ　Ｃｙｓ　Ａｓｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｕ　ｌ１ａＩＢ０　１８５　１ ９０ Ｇ１．ｎ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ｖａｌ　５ｅｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ａｓｔ ｎ　Ｘ１＊　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌ凾■ Ｐｒｏ　Ａｌａ　Ｈｌｓ　ＴＹｒ　Ｘａｂ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ａｌａ　Ａ！！Ｐ 　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　Ｔｒｐ　Ｘ１ａ　Ｌｙｓ　５ｅ■ 配列表 配列１６３：２５６個のアミノ酸よ）なるアミノ酸配列Ｍａｌ　工１ｍ　Ｇｌｙ 　Ｇｌｙ　Ａｌａ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　入ｓｎ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ｇｌｕ　）Ｉｉ ｓ　Ａｒｇ　Ｐｈｓ　Ｌｅｕ　Ｖａ■ Ａｌａ　Ｌｓｕ　Ｔｙｒ　Ａｓ５ｐ　Ｘａａ　Ｌ＠ｕ　’ｒｈｒ　Ｇｌｙ　Ｔｈ ｒ　Ｌａｕ　Ｇｉｎ　Ｃｙｓ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｔｈｒ　Ｌ≠■ ２０　２５　コＯ Ｍａｔ　ｖａｌ　Ｉｌａ　Ｔｙｒ　Ｌｅｕ　Ｇｌｙ　Ｍｅｔ　Ｈｉｓ　Ｘａａ　 Ｌｙｓ　Ｓａｒ　Ｖａｌ　Ａｓｎ　Ａｓｎ　Ａｓｐ　ＡｓｐＧ：ｔｎ　Ｇｉｎ　 入ｒｇ　入ｒｇ　Ｓ＠ｒ　入１ａ　Ｉ、ｙｓ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ｔｙｒ　Ｐｈａ 　Ｐｈａ　Ｓｓｒ　Ｃｙｓ　Ｓｓｒ　Ｌ凾■ ６５　７０　７５　８゜ ５＠ｒ　Ｘｉｓ　入１ａ　Ａｌａ　Ｔｒｐ　Ｇｌｕ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　工ｌ＠　 Ｍａｔ　Ｌｅｕ　工１ｅ　ｋｒｑ　Ｌｅｕ　入ｓｐ　５ｅｒ８５　９０　ｇ５ Ｐｒｏ　Ｐｒｏ　Ｔｈｒ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　５ｓｒ　Ｖａｌ　Ｃｙｇ　入１ｑ　 Ｖａｌ　Ｍａｔ　Ｇｌｙ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ａｌａ　ヱ１ｅＴｈｒ　Ｓ＠ｒ　Ｐ ｒｏ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　Ｔｈｒ　Ｔｙｒ　Ｐｒｏ　Ｇｌｕ　Ｖａｌ　Ｐｒｏ　Ｈ ｌｓ　Ｃｙｓ　Ｔｈｒ　Ａｓｐ　ｌ１ｅ１コ０　１コ５　１４０ Ａｓｎ　Ｌａｕ　Ｌｓｕ　Ｘａａ　Ｔｙｒ　Ｓｅｒ　Ｇｌｕ　Ｃｙｓ　Ｈｌｓ　 Ｇｌｙ　Ａｓｐ　Ｐｈｅ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　Ｌｅｕ　Ａｒｇ人１ａ　Ｔｈｒ　Ｓ ａｒ　Ａｒｇ　工ｉｓ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　Ａｌａ　Ｇｌｙ　Ｖａｌ　Ｌｅｕ　Ｇ ｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｉｌａ　Ａｓｎ１９５　エフ０　１７５ Ｔｈｒ　Ｃｙｓ　）ｈｓｎ　Ｈ４ｓ＾ｓｐ　５＠ｒ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　 Ｌａｕ工１ｅ　Ｃｙｍ　Ａｓｐ　Ｇｌｕ　Ｇｉｎ　Ｐｈｅ：ｔ８０　Ｌ８５　１ ９０ Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　Ｓａｒ　Ｔｒｐ　Ｇｌｙ　Ｐｒｏ　％ｒ　Ｐ ｒｏ　ＣＹ！Ｉ　Ａｌａ　Ｇｉｎ　Ｐｒｏ　Ａｒｇ　ＡｓｎＡｌａ　入１ａ　Ｉ ｌａ　Ｔｙｒ　Ｔｈｒ　Ｌｙｓ　Ｖａｌ　Ｐｈａ　Ａｓｎ　Ｔｙｒ　Ｌ＠ａ　Ｖ ａｌ　Ｔｒｐ　Ｖａｌ　Ｔｒｐ　５ｅｒ配列表 に列扁Δ：２３４個のアミノ酸よシなるアミノ酸配列Ｖａｌ　Ｖａｌ　Ｇｌｙ　 Ｇｌｙ　Ａｇｎ　Ｇｌｕ　Ｃｙｍ　ｋｔｘｎ工１ｅ　Ａｇｎ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　 Ａｒｇ　Ｐｈｅ　Ｌｅｕ　ＶａｌＳａｒ　Ａｓｎ　Ｓ＠ｒ　Ｇｌｕ　Ｈｌｓ　工 １・　入１ｍ　Ｐｒｏ　Ｌａｕ　Ｓｉｒ　Ｉ、ｍｕ　Ｐｒｏ　Ｓ＠ｒ　５ａｒ　 Ｐｒｏ　ＰｒB １ｏｏ　１０５　１１０ Ｔｙｒ　Ａｒｇ　Ｔｈｒ　Ｌｅｕ　Ｃｙｓ　入１ｍ　Ｇｌｙ　ＩＩｓ　Ｖａｌ　 Ｇｉｎ　Ｇｌｙ　Ｇｌｙ　Ｌｙｓ　Ａｓｐ　Ｔｈｒ　ＣｙｓＭａｔ　Ｔｙｒ　Ｊ ｖｓｐ　Ｓ＠ｒ　ＧＩＹ　ＧＩＹ　Ｐｒｏ　ｆ、ｍｕ　１１＊　Ｃｙｇｓ　Ａｓ ｎ　ｃｘｕ　Ｇｉｎ　Ｖａｌ　Ｇｉｎ　fＩＹ １！１０　１８５　１９０ 配列表 配列４５：２５個のアミノ酸よシなるアミン階列配列表 配列Ｎｏ、６：配列Ｎｏ、ｌに書かれたアミノ酸配列に相応する１０９６個のヌ クレオチドよりなるヌクレオチド配列 劃に重鎮 トポロジイー：直線状 配列の引＠：ｍＲＮＡへのｃ　ＤＮＡ 起ｊ［：　＾ｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄａｓｔａｍａ配列Ｎｏ、ｌに記載 された蛋白質についてコードする領域は塩基１４４で始まりかつ塩基８４１で停 止する。

配列表 配列Ｎｏ、７：配列Ｎｏ、２に書かれたアミノ酸配列に相応する１３３３個のヌ クレオチドよりなるヌクレオチド配列 鎖型：二本鎖 トポロジイー、直線状 配列の種類：ｍＲＮＡへのｃＤＮＡ 起源：＾ｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ配列Ｎｏ、２に記載され た蛋白質についてコードする領域は塩基２３１で始まりかつ塩基９３５で停止す る。

配列表 配列Ｎｏ、Ｆ３：配列Ｎｏ、３に書かれたアミノ酸配列に相応する９８８個のヌ クレオチドよりなるヌクレオチド配列 鎖型：二本鎖 トポロジイー：直線状 配列の種類：　ｍＲＮＡへのｃ　ＤＮＡ起源：＾ｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏ ｄｏｓｔｏｍａ配列Ｎ０１３に記載された蛋白質についてコードする領域は塩基 １９７で始まりかつ塩基９０４で停止する。

配列表 配列Ｎｏ、９：配列Ｎｏ、４に書かれたアミノ酸配列に相応する９５７個のヌク レオチドよりなるヌクレオチド配列 鏡型：二重鎮 トポロジイー二直線状 配列の種類：ｍＲＮＡへのｃＤＮＡ 起源：＾ｇｋｉｓｔｒｏｄｏｎ　ｒｈｏｄｏｓｔｏｍａ配列Ｎｏ、４に記載され た蛋白質についてコードする領域は塩基２１０で始まりかつ塩基９１１で停止す る。

Ａｂｂ、　１　ａ Ａｂｂ、　１１） Ａｂｂ、　４ Ａｂｂ、　５ 要　約　書 配列表中に記載のアミノ酸配列を有するグリコジル化された、部分的グリコジル 化された又はグリコジル化されていないポリペプチドが記載されており、その中 の１０個までのアミノ酸基は他の天然アミノ酸の基と交換されていてよい。この ペプチドは病気の治療に好適である。

国際調査鶴失 ぃｌ＊＋＋ｗｌｌｅ。ａ＋　Ａｓｄｅ＊＋＋ｍｍ、ＰｃＴ／ＥＰ　９＋１０１３ ６１国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．配列表に記載のアミノ酸配列１、２、３、４及び５（この際Ｘａａ及びＸａ ｂは天然のα−アミノ酸の基である）を有するグリコシル化された、部分的にグ リコシル化された又はグリコシル化されていないポリペプチド並びに記載の配列 と、９５％よりも多いアミノ酸位置で同じであるその対立遺伝子変異体。
2. ２．請求項１に記載のポリペプチドについてコードする、ＤＮＡ−配列。
3. ３．請求項２に記載のＤＮＡ−配列を有する組換え体ＤＮＡ−分子。
4. ４．適当な宿主系での表現が可能である、表現−制御−配列と機能的に結びつい ている、請求項２に記載のＤＮＡ−配列を含有する請求項３に記載の組換え体Ｄ ＮＡ−分子。
5. ５．表現−制御配列は、Ｅ．ｃｏｌｉ−プロモーター系、Ｅ．ｃｏｌｉバクテリ オファージのプロモーター系、酵母−又は菌類−表現−制御配列又は他の真核生 物表現−生物配列である、請求項４に記載の組換え体ＤＮＡ−分子。
6. ６．請求項３、４又は５に記載の少なくとも１個の組換え体ＤＮＡ−分子を有す る、宿主生物。
7. ７．細菌、酵母、菌類、動物性又はヒトの細胞である、請求項６による宿主生物 。
8. ８．適当な宿主生物中で、請求項１に記載のペプチド配列についてコードするＤ ＮＡ−配列を表現させることを特徴とする、請求項１に記載のポリペプチドの遺 伝子工学的製法。
9. ９．病気の予防及び治療での使用のための請求項１に記載のポリペプチド。
10. １０．血栓塞栓症及び糸球体腎炎の治療及び予防のための薬剤の製造のための請 求項１に記載のポリペプチドの使用。