JPH05508771A - Ancrod類似蛋白質、その製造及び使用 - Google Patents
Ancrod類似蛋白質、その製造及び使用Info
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- JPH05508771A JPH05508771A JP91512191A JP51219191A JPH05508771A JP H05508771 A JPH05508771 A JP H05508771A JP 91512191 A JP91512191 A JP 91512191A JP 51219191 A JP51219191 A JP 51219191A JP H05508771 A JPH05508771 A JP H05508771A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
ANCROD類似蛋白質、その製造及び使用本発明はフィブリノアン分解特性を
有する新規の蛋白質、いわゆるフィブリノゲナーゼ、その製造及び病気の予防及
び治療のためのその使用に関する。
従来、マレー産のマムシ(^gkistrodon rhodostoma)の
毒から、抗凝固剤特性を有するフィブリノゲナー分解酵素だけを得ることができ
た(Biochem、 J、 131.799.1973)。この蛋白質は、文
献中には、アルビン(^rvin) 、アルウィン(^rvin)又はアンクロ
ト(^ncrod)と称されている。
この蛋白質の使用可能性は限られている。それというのも、^ncrod−中和
抗体の形成に帰因していると思われる耐性徴候が6〜8週間後に現われつるから
である。突発的に出血性の合併症も起こる。
ところでフィブリノアン分解特性を有する他の蛋白質が見つかり、純粋に製造さ
れた。
本発明の目的物は、配列表に挙げたアミノ酸配列1.2.3.4及び5を有する
グリコジル化された、部分的グリコジル化された又はグリコジル化されていない
ポリペプチド(ここでXaa及びXabは天然α−アミノ酸の残基である)並び
にアミノ酸位置の95%よりも多い割合の挙げられた配列と同じであるその対立
遺伝子変異体である。
アミノ酸基Xaaは、Asn、G1n5Ser。
Thr、GlySAspSGlu、LyslArg又はPro、しかし有利にA
sn、G1n1Ser及びThr及び殊にAsn及びGInである。XabはP
he、Tyr、Leu、I le、Ala、Val、Thr又はSetが有利で
ある。
本発明は、更に、前記の蛋白質についてコードするDNA−配列並びにこのDN
A−配列を含有するベクターに関する。有利なりNA−配列は、配列表の配列N
o、6〜9に示されている。
本発明による蛋白質は公知方法により遺伝子工学的に製造されつる。
すなわちマレー産のマムシ(Agkistrodonrhodostoaa)の
腺組織からmRNAを分離し、かっ二本鎖cDNAに翻訳することができる。商
業的に得られるクローニングベクター、例えばス gtlOへのこのcDNAの
挿入により、c D N A−ライブラリィが設定される。その際使用される方
法は、例えばマニアチス(i[aniatis)等のモレキュラール・クローニ
ング(Molecular Cloning) 、CS HPress、 (1
932。
)に記載されている。また、放射性標識化されたオリゴヌクレオチドプローブ又
は放射性標識されたDNA−フラグメントでのこのような遺伝子列のスクリーニ
ングも薯々使用されかつ記載された方法である。この方法により、オリゴヌクレ
オチドプローブに対する又は放射性標識されたDNA−7ラグメントに対する相
同を有するcDNA−クローンを分離し、かつ特徴付けすることができる。この
方法は、D N A CloningVol I 、I RL Press、1
985に記載されている。
このように特徴付けられたcDNAは制限酵素を用いて容易に得られる。その際
生じるフラグメントを、場合により化学的に合成されたオリゴヌクレオチド、ア
ダプター又は遺伝子フラグメントと連結させて、蛋白質についてコードする配列
をクローン化するために使用することができる。クローニングベクター、例えば
市場で慣用のプラスミドM 13 ■p又はpkk−223−3中への遺伝子フ
ラグメントもしくは合成りNA−配列の挿入は、公知方法で行なわれる。また遺
伝子又は遺伝子フラグメントは、適当な化学的に合成された又は細菌、ファージ
、真核生物細胞又はそのウィルスから単離された、蛋白質の発現を可能にする制
御領域を備えられ得る。
こうして得られるバイブリドプラスミドでの適当な宿主生体の形質転換もしくは
トランスフェクションは同様に公知であり、詳細に記載されている(II、 W
igler等、Ce1l 16 (1979) 777−785 :F、 L。
Graham and A、 J、 van der Eb、 Virolog
y 52 (1973)456−467)。このバイブリドプラスミドは、媒体
中へのポリペプチドの分泌を許す相応するシグナル配列を備えることも可能であ
る。
哺乳動物細胞での発現の際に、表現すべき遺伝子(この場合には、配列表中に記
載されたフィブリノゲナーゼの1つについてコードするcDNA)をマウス−メ
タロチオネイン−又はウィルスの5v40−プロモーターの制御下に置くベクタ
ーを使用することができる(J、 Parge Martin、 Gene、3
7 (1985) 139−144)。メチオニン−出発コドンの存在及び相応
する蛋白質のための遺伝子のリーダー−/プロ配列の存在がこの発現のためには
必要である。次いでこのベクターのコピーをエビソームとして又はゲノム中に組
みこんで有するクローンを単離する。牛乳頭腫−ウィルスを基礎とする異種遺伝
子の組込み及び表現が特に有利である。細菌細胞中での複製及び抗生物質−耐性
に関してコードする原核生物配列と関連して、“シャトル″−ベクターの構築が
可能である。プラスミドの構築及び増殖は先ず細菌細胞中で行なわれ:引続き真
核細胞、例えばマウス−繊維芽セルラインc127への変換が行なわれる。
他の細胞系、例えば酵母及び他のma、昆虫細胞並びに動物及びヒトの細胞、例
えばCHO−1COS。
L−及び293細胞を、適当な表現ベクターと関連させてクローン化されたcD
NAの表現のために使用することも可能である。
この真核生物表現系は、それらがその生産物を有効にかつ大抵自然の形で分泌す
ることができるという利点を有する。更にこれらは、その生産物を翻訳後に変性
する能力を有する。
こうして、記載のフィブリノゲナーゼは真核細胞中での発現時には、なおグリコ
シド側鎖を有する。この側鎖は細菌中に生産されたポリペプチドでは欠けている
。このグリコシド側鎖は、相応するグリコシダーゼを用いる酵素的にも完全に又
は部分的に除去され得る。細菌中に発現した大抵の真核蛋白質は、細胞中で変性
された封入体として生じ、かつ蛋白質化学的に再生されるはずである。更に細菌
は薯々、イニシェークーアミノ酸メチオニンを完成蛋白質から分離することはで
きない。分泌系の使用によって、この困難は回避され得る(Donald 01
iver、 Ann、 RevoMicrobiol、39、 1985 、
615−48 ; John Ghrayeb等、TheEMBOJourna
l 3,1984.2437−2442)。
しかし遺伝暗号の縮重に基づき、他のDNA−配列、例えば異なるDNA−配列
を有する化学的に合成された遺伝子を、記載のフィブリノゲナーゼの発現のため
に使用することも可能である。クローン化された遺伝子を用いて突然変異生成の
確立された方法により類似の作用を有するこのフィブリノゲナーゼの変異体を得
ることができる。
得られるポリペプチドの精製は、培地からクロマトグラフィー法、例えばアルギ
ニン−セファ0−ス、”y /(+7 :/−ヤ、ア。−ユ(Heparin
−Se。58.。5o■)又はイオン交換体物質でのアフィニティークロマトグ
ラフィーにより、公知の方法で行なう(文献:“Guideto Protei
n Purification” 、 Murray、P、Deutscher
[ed]、^cade+*ic Press 1990 )。
フィブリノゲナーゼの精製は同様にマムシー−ヤ770−X(Can^−8ep
harose■)、Q−ヤ■
ファロース(Q −5epharose )、 S−セファロース(S −5e
pharose■)の使用下に、適当なりロフトグラフィー法とクロマトフォー
カス化(Chromato−focussferung)との組合せにより、例
5に記載したように、精製され得る純精製のためには、特にHPLC−法が使用
される。
また本発明の目的は、場合により製薬学的に認容性の賦形剤又は結合剤中に本発
明により製造した蛋白質を含有する薬剤である。この薬剤は本発明により製造し
た蛋白質と他の薬物学的に有効な治療剤、例えば血栓溶解剤(tPA、ストレプ
トキナーゼ)、ヒルジン又はトロンボキサン受容体−アントゴニストと組合せて
含有してもよい。
本発明の他の実施態様を例中に詳しく記載する。
更に遺伝子工学的方法については、例えばマニアチス(1laniatis)等
の研究書、“モレキュラール・クローニング(Molecular Cloni
ng)’ 、 :2−ルドースブ、リング・ハーバ−・ラボラトリ−(Cold
Spring HarborLaboratory) 、1982又は”DN
Aクローニング(cloning) ” I−m巻、IRIブレス(Press
) 19.85−87、発4行者り、、M、グローバー(Glover)を参照
すべきである。
本発明によるポリペプチドは、糸球体腎炎、心筋梗塞、非−虚血性の卒中発作、
末梢動脈血、流騰害(竺呵アテローム性動脈硬化症閉塞、血栓血管炎閉塞、糖尿
病細管異常及びレイノー病)、不安定な狭心症、深夜静脈血栓症及び他の血栓症
、血栓溶解治療後の再血栓形成、動脈又は静脈の血管形成、の移着におけるよう
な血管外科手術後の再血栓形成の治療のために、並びに体外循環における血栓症
の回避のために好適である。
例エ
マレー産のマムシ(Agkistrodon rhodostoma)からのフ
ィブリノゲナーゼのためのcDNAクローンの単離
アゲキストロトン・ロドストマ(AgkistrodonRhodostoma
) 114の5才蛇の毒腺組織1gを、6Mグアニジニウムチオシアネート、5
mMクエン酸ナトリウム(p、H7,o) 、0.1M2−メルカプトエタノー
ル中で、ウルトラートラックス(ULTRA−TURRAX■)中の0.5%サ
ルコシル(S・・・・5yl) 中で溶解させた。粗製溶解物を300 Orp
mで遠心分離にかけた。RNAを45000 rp、mで一夜5 、7 M C
s、CI=クッションを通す遠心分離によって分離した。引続゛きポリA0−含
有RNA−フラグメントをオリゴ(dT)−七、ルロースでのアフィニティーク
ロ÷トゲラフイーにより分離した。
酵素AMV−逆トランスクリブターゼ及びスターターとしてのオリゴ(dT)1
2−18を用いて、ポリA ”−RN Aを一本鎖のc’ D N Aに換えた
。2本目のバーゼを用いて次の配列を有するEcoRIア夛ブタ−を付加させた
:5’AATT CCATGG ATG’CATGC3’。市場で得られるファ
ージベクターλgtlo(第1a図、第1b図)を制限酵素EcoRIで線状化
した。双方のDNAを相互に連結させ、□かつ市場で得られる伝染性ファージの
ための包装エキストラクトを用いて包装した。組換ファージを、E、coliC
600■f1と共にNZYDT−平板培地上に被着させかつ一晩37℃で培養し
た。こうして得られるcDNA−ライブラリーは、2X106の独立クローンを
有した。相応する慣例法のcDNA−ライブラリーの増幅後に、500000フ
アージをC600Hfl細胞と共に被着させた。このファージをニトロセルロー
ス−フィルター上に移し、0.5N NaOH/1.5MNaCLで溶菌しく
Iysfert) 、かつ変性したDNAを80℃で2時間ベーキングすること
によってフィルターにしっかりと結合させた。このフィルターを6XSET−緩
衝液(1xSET=0.15M NaC1,15mMトリス/HCI、p)(7
,4,1mM EDTA)、0.1%SDS及び5×デン”−) (Denha
rdt’s)溶液(100Xデンハート=フイコール1g、ポリビニルピロリド
ン1g、BSAlg(50■!当り))中で4時間、68℃で予備ハイブリダイ
ゼーションさせた。
Ancrod−蛋白質についてコードするN1ck−翻訳cDNA(第2図)と
ハイブリダイゼーションさせた。
フィルターを、2XSET、0.1%SDS、30%ホルムアミド、5Xデンハ
ート及び10%テキストランスルフェートを含有する溶液中で、−晩42℃で軽
い振盪下で培養した。次いでそれを2XSET10.1%SDS中で42℃で数
回洗浄し、乾燥させ、かつレントゲンフィルムにさらした。′スクリーニング時
に放射性の応答をしたクローンを単離し、かつ相応するファージ−DNAを得る
ために更に培養したファージ−DNAは、55℃で1時間プロテアーゼK(ad
80μy/ml)と共に精製されたファージを培養しかつ引続いてフェノール/
クロロホルムを抽出することによって調製した。エタノール3容量(−20℃)
の添加後に、ファージ−DNAが沈殿し、滅菌注射針で70%のエタノール中に
移し、洗浄しかつ短時間沈降させた。ペレットを空気中で短時間乾燥させた後に
TE−緩衝液中に懸濁させた。
精製されたファージ−DNAを前記のようにニトロセルロースフィルター上に移
し、再生させ、再中和し、ベーキングしかつ予備ハイブリダイゼーションさせた
。次いで厳密な条件下で、AllCr0d−コードされたCDNAに対して相同
である放射性標識化されたオリゴヌクレオチド試料とハイブリダイゼーションさ
せた=5’GTCTACGAT TAT CGT GACTGG GTCAA3
’
フィルターを、2XSET、SDS O,1%、ホルムアミド30%、5Xデン
ハート及びデキストランスルフェート10%を含有する溶液中で、−晩42℃で
軽い振盪下で培養した。次いでそれを60℃で2XSET10.1%SDS中で
数回洗浄し、乾燥させかつレントゲンフィルムにさらした。
この条件下でハイブリダイゼーションしなかったDNAを更に分析するために一
本鎖ファージMB中でサブクローン化した。
例2
Ancrodについてコードする一本鎖DNAの製造出発点は、Ancrod−
特異性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしなかった例1に記載の
ファージ−DNAであった。それらを各々個々に調製的に制限酵素EcoRIで
切断した。cDNA−挿入体を含有するEcoRI−フ”ラグメントを電気泳動
的にゲルから溶離させた。このフラグメントの各30ngを4℃で12時間、E
coRI切断された、商業的に得られるクローニングベクターM13mp18又
はM13■p19(第3図)100ngと12時間連結させた。連結バッチの容
量は10μlでありだ。連結は、5分間80℃に加熱することによって終了した
。
各連結バッチの1/10容量をコンピテントな5R101細胞100μlの形質
転換のために使用した。
形質転換の終了後に、形質転換バッチに0.2M IPTG−溶液60ul及び
XGa1 (20m11/ 寓l) 120μlを添加した。このバッチをNZ
VDT−上面寒天培地で5RIOI細胞(ODaoo= 1 ) 200 ul
を有するNZYDT−寒天平板培地上に被着させた。培地NZYDTは商業的に
得られる(G I BCO−BRL)。
cDNA−挿入体を含有するクローンはプラークが青色呈色をしないことに基づ
いて同定され得る。DNA−配列分析により(Sanger等、Proc、 N
atl、 Acad。
Sci、USA 74.1977.5463−67)このcDNA−挿入体のD
NA−配列は解明された(配列表、配列No、6〜9)。
例3
真核細胞中のAncrodの表現のためのベクターの構築サルウィルス(^ff
envirus) S V 40のDNAを制限酵素BamHI及びB cl
Iで切断し、かつ0.24kb−フラグメントをゲル電気泳動的に調製した(第
4図)。末端を4つのデスオキシヌクレオチドトリホスフェートdATP、dC
TP、dGTP及びdTTPの存在でクレノフーフラグメントで補充した。引続
きXhoI−リンカ−を連結した。
平行して、商業的に得られるベクターpUc18を酵素Sll+aIで線状化し
た。次いで同様にX ho I−リンカ−を取り込んだ。このベクターじpUc
18Xho”)のDNAをXholで線状化し、アルカリ性ホスファターゼで処
理しかつ0.24kb XholI−8V40−フラグメント(前記参照)と連
結させた。pSVpAが生じた。
pSVpA−DNAをam的1.: X ho I テ分解すセカつ前記のよう
にクレノフーポリメラーゼと共に4つのdNTPsの存在で培養した。0.24
kb−7ラグメントをゲル−分離した。
同時に、CL28X及びpB2−2のリデーションによって生じた( Redd
y等、DNA6.1987.461−72により)真核生物−表現ベクターCL
28XhoBPVを、部分的に制限酵素X ba Iで切断した、すなわち、2
つのX ha I−識別配列の一方でのみ分離されている、要するに線状化され
ている分子が生じるように時間的に制限して培養した(第5図)。次いでバッチ
を記載のようにクレノフーポリメラーゼ及びdNTPsと反応させた。線状分子
を引続きゲル電気泳動により分離した。
次いで線状のpCL28XhoBPV−フラグメントと、SV40からの予備処
理した0、24kb−フラグメントとのリデーションを行なった。形質転換及び
ミニリゼート(Minilysaten)のスクリーニング後に、X ho I
一部位の約0.15kB3’一方向にある、前のX ba I一部位に5V40
−フラグメントを有するクローンを単離した;このDNA (”I)CL28X
hoBPV−SVポポリA”)は“前の“遺伝子の5V40−転写停止信号を有
した。
1)CL28XhoBPV−3VポリAのプラスミド−DNAを制限酵素Xho
lで線状化し、かつアルカリ性ホスファターゼで処理した。同時に、^ncro
d〜特異性のオリゴヌクレオチドとハイブリダイゼーションしなかフた例2に記
載のcDNA−挿入体に、T4リガーゼを用いてXho−リンカ−を与えた。両
フラグメントはT4−リガーゼにより相互に結合された。形質転換及びミニリゼ
ートの分析後に、cDNA−挿入体を単一でかつ正しい配向で含有するクローン
を分離した:pCL28BPV−フィブロゲナーゼI −rV。
例4
セルラインのトランスフェクション及び確立C127I細胞(J、 Virol
、26 (1978) 292 : A T CCcatalogue of
cell 1ines andhybridomas 5th edition
、 1985. pl 42)をBPV−表現プラスミドと燐酸カルシウム−共
沈降方法(ViroLogV 52 (1973) 、 S、4’56. DN
Acloning; Volume ft、ed、D、M、Glover I
RLPress、(1985) 143頁以降及び213頁)によりトランスフ
ェクションした。
5x10’Cl27I−細胞を60xmペトリ皿中のD M E M (Dul
beccos’ s Modified Eagles Iledium)+1
0%FC8(胎生子牛血清)中に接種した。次の日に、CsC1−精製プラスミ
ドDNAl0−l5gと共に25 nil Hepes + 10%FC3を有
するM E M (ModifiedEagles Medium)に変えられ
た培地はCa−ホスフェート−共沈殿体を形成し、これを慎重にC127I−線
温保持した。引続くグリセリン−ショック−処理により、トランスフェクション
の効率は著しく高められた。このために沈殿をのせてから4時間後に培地を細胞
から取り除いた。細胞を15%グリセリン/HBS(p N A clonin
g Vol、 n 、152頁)各2mlと共に60mmベトリシャーレ中で3
分間室温で恒温保持した。グリセリン/ HB S−溶液を除去し、かつ細胞芝
(ZeNrasen)をDMEM+l Q%FC33mfで洗浄した。細胞をD
MEM+10%FC5と共に37℃ニア%C02で恒温保持した。週3回、DM
EM+10%FC5を除去し、かつ新しいものに□代えた。2−3週間後に、形
質転換された細胞の集落、いわゆるフォーカス(Fact)として、BPV−ゲ
ノムを有するトランスフェクトされた細胞が確認された。
記載のフォーカスのサブクローニング後に、個々のサブクローンの培地上澄みを
公知方法によりフィブリノゲナー分解活性に関して検査した。
生産のためにセルラインを集合達成後に血清不含のDMEM−培地中に保持した
。新規のフィブリノゲナーゼをそうして得られた血清不含の細胞培養上澄みから
・慣用の蛋白質−化学的方法により精製し、かつ薬物学的及び蛋白質化学的分析
に使用することができる。
例5
マムシ(^gkistrodan rhodosto*a)からのフィブリノア
ン分解酵素(配列表、配列No、5)の単離及び精製
マムシの粗製前(乾燥物質)55019を20mMNa2HPO420m1.0
.01%トウィーン(TWeen■)80.500mM NaC1、pH7,0
緩衝液(=緩衝液A)中に入れた。
a) マドレックス・レッド・八−セファロース(Matrex RedA−5
epharase■)TO2oql−f5フィー:クロマトグラフィーカラム(
φ2.5ctm、I=5.1(Fa、^−1con) 25 mlを充填した。
カラムを緩衝液A100 mlで平衡させ、かつ引続き溶解粗製前を負荷した。
カラムを緩衝液A 45 mlで後洗浄しく流量=120 ml/ h ) 、
かつ引続き、20mM Na2HPO4,2M NaCL 0.01%トウィー
ン、p H7,0よりなる緩衝液B 85 mlを用いて溶離させた。UV−活
性画分(280n會)を集めた。
流出液を透析管中(Visking寸法8.32/32)で20mM Na2H
PO4,2,51,0,01%トウィーン■80.pH7,0緩衝液(=緩衝液
C)に対して2回順次に2hずつ透析させた。透析された管の伝導性(i、約2
.2+sS/cm(4℃)であツタ。
b) アルギニン−セファ0−ス(Arginin−3epharose■)T
O9ov)グう、イー2クロマトグラフイーカラム(φ=2.5c■、I=10
c+e) 1.:、ア1、ユ、−ヤ770− X■(Pa、Pharsacia
)を充填し、かつ緩衝液0200mjで平衡させた。
マドレックス・レッド・A−セファロース■の透析流出液(容量的140 mA
)を流量120■j/hでカラ 、ム上に加えた。
カラムの通過液(約180 mA)を集めかつ更に加工した。特に、アルギニン
塩での溶離によって得られうるAncrodが、カラムに結合して残留した。
■ ■
)にゲルマテリアルP B E 94 (Fa、 Pharmaciaを負荷し
た。
、pH2,0緩衝液(=緩衝液E)の後に25分間以内で直線的に流量1 ml
/分で行なった。この時間後にカラムにもう13分間緩衝液Eを通した。この際
に溶離するUV−活性画分(280nm)を集めた。蛋白質測定(方法:参照、
Anal、 Biochem、153 、 267−271)により約0.04
H/mlを含有する蛋白質溶液約1露lを得た。
d) 精製フィブリノゲナーゼVの特徴付けdi) 5DS−ゲル電気泳動
標準蛋白質と比べて、蛋白質溶液は主帯域(約70〜90%)を〜42000ダ
ルトンで示した。
d2) N−末端配列決定
精製蛋白質溶液のN−末端配列を測定した(比較、配列記録、配列No、5)。
d3) フィブリノゲナーゼ−検定
フィブリノゲナーゼ−活性の測定のために、試験すべき酵素のフィブリノアンを
DesAA−フィブリノアンに変換した。
この反応は、測光的に追跡された混濁増加と共に進行した。
活性。定量は、^。crod−ユタ、ダート(Arvin■)3000 U/m
qでの検定により行なわれた。
精製された酵素のフィブリノゲナーゼ−活性は約500 U/箇9であった。
配列表
配列ム 1:234個のアミン讃よシなるアミノ酸配列Mal Ila GAY
GAY hsp GLu Cys Asn 工1・ 八sn Glu His
Arg Ph@ Lsu Val5 !O15
^1a Lau TYr Asp Bar Thr Thr Arq Ajn
Pha Lau Cym にly Guy Va1L*uII@ Hls Pr
o Glu Trp Val Xis ’rhr 入1a Lys Hls C
ya Asn Lys Lyg 5s■
Mat val Leu Tyr XAu Gly Lys )flsg Ly
re Gin Sar Val Lyg Phs Asp `sp
50 55 6G
Glu Gin Glu Arg Phs Pro Lys Glu Lys
Hls Pha IlaArg Cys Asn LysPro Arg ’r
hr kxq Trp Gly Glu As1p 工1@ Met Leu
工1a Arg Lau Asn L凾■
Pro Val Xaa Asn Sir Glu Hlss Hls Ala
Pro Leu Sar Lau Pro 5ar Gl■
too 105 110
Amn Lytx Tyr Hls Asp Val Lau Pro Asp
Glu Pro Arq Cys Ala Asn 工1■
1コ0 135 1JO
Asn Lau Tyr Xaa Tyr Thr Val cys Arg
Gly Val Ph@Pro Arg Ile Gay145 ヱ50 15
5 160
Lyg LYS Bar Lys 11* IJu CYll Ala Gly
Asp IJu Gin Gly )Xq II、eu 入Tp
Sar Cys His Cys Asp Ser Gly Gly Pro
Lau Xis Cys 5ar Glu Glu Ph1180 185 n
。
His Gly工1@ Van Tyr Arq Gly Pro Agn P
ro Cys Ala Gin Pro Asp LysPro Ala La
u Tyr Thr ASn Ile Ph@! Asp Hls Lau H
ls Trp Xis Lau 5e■
配列表
配列42:236個0アミノ瀧よシなるアミノ酸配列Val Val Gly
Gly ASEp viu Cys Al!n Ila ASn Glu Hl
s krq Pha Lau A撃■
Lau Val Tyr IlaThr Bar Gly Ph@Lsu Cy
s Gly Gly Thr Lau Xab H1sPro Glu Trp
Val val Sar Ala Ala Hls Cys 入1a Arg
Gly Glu 工Re Gluコ5 40 .45
Val Phe Pha Gly Val Hls 5*r Lau Lys
Asp X1* Arq Thr Asn Lys AspVal Gin L
ys Arg Val 入1a Lys Glu Mat Pha Phe C
ys Lseu Bar Sat Ly■
Pro Val Xaa Agn Sar Thr His Ila 入1a
Pro l1se Ser Lau Pro Sar 5@■
1oo 105 1ヱ0
Pro Pro Sur Val Gly Sar Val Cys Arg
Val M@t Gly Trp Gly Val ThrThr Sar P
ro Xaa Gly Thr Xab Pro Bar Val Pro H
ls Cys Ala Asn Ila130 135 工40
人an X1@ Lau Asp ’ryr Xab Val cys Arg
Ala Ala Arg Pro Lys tau PrB
人1a Lys 5*r krq Thr Leu (’ys Ala Gly
工1e Lsu Glu Gly Gly Lys S@■
人1a Cys Asp Gly Asp Sar Gly Gly Pro
Lau Asn Cys Asn Gly Glu l1aIB0 185 1
90
G1.n Gly Ila Val 5er Trp Gly Gly Ast
n X1* Cys Ala Gin Pro Arg L凾■
Pro Ala Hls TYr Xab Lys Val Ala A!!P
Tyr Thr Asp Trp X1a Lys 5e■
配列表
配列163:256個のアミノ酸よ)なるアミノ酸配列Mal 工1m Gly
Gly Ala Glu Cys 入sn Val Asn Glu )Ii
s Arg Phs Leu Va■
Ala Lsu Tyr As5p Xaa L@u ’rhr Gly Th
r Lau Gin Cys Gly Gly Thr L≠■
20 25 コO
Mat val Ila Tyr Leu Gly Met His Xaa
Lys Sar Val Asn Asn Asp AspG:tn Gin
入rg 入rg S@r 入1a I、ys Glu Lys Tyr Pha
Pha Ssr Cys Ssr L凾■
65 70 75 8゜
5@r Xis 入1a Ala Trp Glu Lys Asp 工l@
Mat Leu 工1e krq Leu 入sp 5er85 90 g5
Pro Pro Thr Val Gly 5sr Val Cyg 入1q
Val Mat Gly Trp Gly Ala ヱ1eThr S@r P
ro Lys Glu Thr Tyr Pro Glu Val Pro H
ls Cys Thr Asp l1e1コ0 1コ5 140
Asn Lau Lsu Xaa Tyr Ser Glu Cys Hls
Gly Asp Phe Pro Arg Leu Arg人1a Thr S
ar Arg 工is Leu Cys Ala Gly Val Leu G
in Gly Gly Ila Asn195 エフ0 175
Thr Cys )hsn H4s^sp 5@r Gly Gly Pro
Lau工1e Cym Asp Glu Gin Phe:t80 L85 1
90
Gin Gly IIs Val Sar Trp Gly Pro %r P
ro CY!I Ala Gin Pro Arg AsnAla 入1a I
la Tyr Thr Lys Val Pha Asn Tyr L@a V
al Trp Val Trp 5er配列表
に列扁Δ:234個のアミノ酸よシなるアミノ酸配列Val Val Gly
Gly Agn Glu Cym ktxn工1e Agn Glu Hls
Arg Phe Leu ValSar Asn S@r Glu Hls 工
1・ 入1m Pro Lau Sir I、mu Pro S@r 5ar
Pro PrB
1oo 105 110
Tyr Arg Thr Leu Cys 入1m Gly IIs Val
Gin Gly Gly Lys Asp Thr CysMat Tyr J
vsp S@r GIY GIY Pro f、mu 11* Cygs As
n cxu Gin Val Gin fIY
1!10 185 190
配列表
配列45:25個のアミノ酸よシなるアミン階列配列表
配列No、6:配列No、lに書かれたアミノ酸配列に相応する1096個のヌ
クレオチドよりなるヌクレオチド配列
劃に重鎮
トポロジイー:直線状
配列の引@:mRNAへのc DNA
起j[: ^gkistrodon rhodastama配列No、lに記載
された蛋白質についてコードする領域は塩基144で始まりかつ塩基841で停
止する。
配列表
配列No、7:配列No、2に書かれたアミノ酸配列に相応する1333個のヌ
クレオチドよりなるヌクレオチド配列
鎖型:二本鎖
トポロジイー、直線状
配列の種類:mRNAへのcDNA
起源:^gkistrodon rhodostoma配列No、2に記載され
た蛋白質についてコードする領域は塩基231で始まりかつ塩基935で停止す
る。
配列表
配列No、F3:配列No、3に書かれたアミノ酸配列に相応する988個のヌ
クレオチドよりなるヌクレオチド配列
鎖型:二本鎖
トポロジイー:直線状
配列の種類: mRNAへのc DNA起源:^gkistrodon rho
dostoma配列N013に記載された蛋白質についてコードする領域は塩基
197で始まりかつ塩基904で停止する。
配列表
配列No、9:配列No、4に書かれたアミノ酸配列に相応する957個のヌク
レオチドよりなるヌクレオチド配列
鏡型:二重鎮
トポロジイー二直線状
配列の種類:mRNAへのcDNA
起源:^gkistrodon rhodostoma配列No、4に記載され
た蛋白質についてコードする領域は塩基210で始まりかつ塩基911で停止す
る。
Abb、 1 a
Abb、 11)
Abb、 4
Abb、 5
要 約 書
配列表中に記載のアミノ酸配列を有するグリコジル化された、部分的グリコジル
化された又はグリコジル化されていないポリペプチドが記載されており、その中
の10個までのアミノ酸基は他の天然アミノ酸の基と交換されていてよい。この
ペプチドは病気の治療に好適である。
国際調査鶴失
ぃl*++wlle。a+ Asde*++mm、PcT/EP 9+1013
61国際調査報告
Claims (10)
- 1.配列表に記載のアミノ酸配列1、2、3、4及び5(この際Xaa及びXa bは天然のα−アミノ酸の基である)を有するグリコシル化された、部分的にグ リコシル化された又はグリコシル化されていないポリペプチド並びに記載の配列 と、95%よりも多いアミノ酸位置で同じであるその対立遺伝子変異体。
- 2.請求項1に記載のポリペプチドについてコードする、DNA−配列。
- 3.請求項2に記載のDNA−配列を有する組換え体DNA−分子。
- 4.適当な宿主系での表現が可能である、表現−制御−配列と機能的に結びつい ている、請求項2に記載のDNA−配列を含有する請求項3に記載の組換え体D NA−分子。
- 5.表現−制御配列は、E.coli−プロモーター系、E.coliバクテリ オファージのプロモーター系、酵母−又は菌類−表現−制御配列又は他の真核生 物表現−生物配列である、請求項4に記載の組換え体DNA−分子。
- 6.請求項3、4又は5に記載の少なくとも1個の組換え体DNA−分子を有す る、宿主生物。
- 7.細菌、酵母、菌類、動物性又はヒトの細胞である、請求項6による宿主生物 。
- 8.適当な宿主生物中で、請求項1に記載のペプチド配列についてコードするD NA−配列を表現させることを特徴とする、請求項1に記載のポリペプチドの遺 伝子工学的製法。
- 9.病気の予防及び治療での使用のための請求項1に記載のポリペプチド。
- 10.血栓塞栓症及び糸球体腎炎の治療及び予防のための薬剤の製造のための請 求項1に記載のポリペプチドの使用。
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JPH08116980A (ja) * | 1994-10-11 | 1996-05-14 | Mogam Biotechnol Res Inst | 新規スロンビン類似蛋白質分解酵素をコードする遺伝子 |
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