JPH0213374A - 新規な蛋白質、その製法及び用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、プラスミノーゲン活性化物質活性を有する新
規な蛋白質、その製法及び病気の処置におけるその用途
に関する。

ヒト成熟組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔｐＡ）は
、５２７個のアミノ酸及び６８　ｋＤの分子量を有する
ポリペプチドである（　Ｐｅｎｎ１ｃａｅｔ　ａｌ、　
１９８Ｌ　Ｎａｔｕｒｅ　３０１．２１４〜２２１及び
Ｎｙ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４．　Ｐｒｏｃ、　Ｎａｔ
ｌ、Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　８１，５３５５〜ｓ３ｓ；＋　）（第１ａ〜１
ｆ図参照）。

この分子は数個の明瞭な領域いわゆるドメインを有し、
種々の機能はこれらの領域に帰属する。Ｎ−末端は、フ
ィブロネクチンと同族のフィンガー領域により形成され
る。これには数種の生長因子と類似性を有す、る領域が
続（。これに続いて２個のループドメインがある。１本
鎖分子を２本鎖に開裂することのできる開裂部位の後に
、プロテアーゼドメインが続き、これは活性中心を含有
し、そして他のセリンプロテアーゼと同族性を有する。

組織プラスミノーゲン活性化物質は、これを興味深い分
子にする数種の性質を有する。ｔＰＡはフィブリンに対
して高い親和性を有し、プラスミノーゲン活性化はフィ
ブリン依存性であり；プロテアーゼとしてｔＰＡはプラ
スミノーゲンを開裂してプラスミンを生成し、これは次
いでフィブリンを分解して分解生成物にする。ｔＰＡは
プラスミノーゲン活性化物質の阻害物質により阻害する
ことができる。さらにｔＰＡは比較的短い半減期を有し
、この分子は肝臓中で急速に分解される。

これらの因子の効果は、生体内でｔＰＡが血餅において
プラスミノーゲンを特異的に活性化してプラスミンとな
し、そしてフィブリンの分解により血管中の流れの回復
をもたらすことである。従ってｔＰＡはフィブリン溶解
療法において例えば心筋梗塞後に使用することができる
。

本発明者らは、一般式 ％式％ （式中ｔＰＡ、〜１□１及びｔＰＡ、、２〜２？はそれ
ぞれヒト成熟組織プラスミノーゲン活性化物質のアミノ
酸１〜１１１及び１１２〜５２７であり、Ａは水素原子
、又は下記 Ｓｅｒ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａ
ｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−８ｅｒ−Ｐｒｏ−Ａｌａ−８ｅ
ｒ−３ｅｒ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ　。

Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｖａｌ−Ｖａｌ−Ｇ
ｌｕ−Ａｒｇ−Ｈｉｓ−Ｇｉｎ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｇｌ
ｙ又は Ｓｅｒ−Ｇｌｙ−Ｈｉｓ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａ
ｓｐ−Ｌｙｓ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌ
ｙ　。

又は、下記 ｐｒ□−Ｔｒｐ−８ｅｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ−Ｔｈｒ−８
ｅｒ−Ｃｙｓ−８ｅｒ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−Ｃｙｓ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　。

Ａｓｎ−Ｐｒｏ−Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ−３
ｓｒ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｇｌ
ｙ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−１１ｅ
−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ａｓｐ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ−Ｐｒｏ
−Ａｓｐ７Ｃ）ｌｕ−Ａｓｐ−Ａｓｎ−Ｃｙｓ−Ｐｒｏ
−Ｇｌｙ−Ａｌａ又は Ｃｙｓ−Ａｓｐ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ−
Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｌａ　、又は 直接結合を意味し、ただしＡが水素原子であるときは、
Ｘは直接結合でないものとする）で表わされる蛋白質、
ならびにＡ及び／又はＸのＮ−及び／又はＣ−末端にお
いて１〜６個のアミノ酸により短縮又は鷺長された配列
を有するその他感性の変異体又は誘導体が、改善された
性質を有することを見出した。

このように新規な蛋白質は、Ｎ−末端において及び／又
はループ領域内で修飾されている。

本発明はさらに、この成熟蛋白質をコード化するＤＮＡ
配列、ならびＫこのＤＮＡ配列を有するベクターに関す
る。

新規な蛋白質は遺伝子工学により既知の方法によって製
造することができる。ここに記載する構成のための出発
点は、ｔＰＡのコード化配列及びさらに５′−及び６′
−非翻訳領域を含有するｃ　ＤＮＡクローン（以下ｐＵ
ＣｔＰＡと呼ばれる）である。成熟蛋白質は、リーダー
及びプロ配列の後で５ｅｒ（１）で始まり、Ｐｒｏ　（
５２７）で終る。

ｐＵＣｔＰＡは次のようにして分離される。ヒト子宮組
織からｍＲＮＡを分離し、２本鎖ＣＤＮＡ中に転写する
。このｃＤＮＡを市場で入手できるクローニングベクタ
ーｐＵＣ９中に挿入したのち、　ｃＤＮＡライブラリー
を作成する。これに用いられる方法は、例えばＭａｎｉ
ａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、　、　Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒＣ１
ｏｎｉ邸に記載されている。放射性標識したオリゴヌク
レオチド試料を用いるこの種の遺伝子バンクのスクリー
ニングは、これまで広く用いられかつ文献に記載された
方法である。この方法を用いて、コード化領域及び隣接
領域を含有するｃ　ＤＮＡクローンを分離することがで
きる。

ｐＵＣｔＰＡのＤＮＡ配列の断片は、制限酵素を用いて
容易に得られる。これらの断片は、場合により化学合成
されたオリゴヌクレオチド、アダプター又は遺伝子断片
と結合して、新規なポリペプチドのためにコード化する
ＤＮＡ配列をクローニングするために利用できる。この
遺伝子断片又は合成りＮＡ配列には、クローニングベク
ター、既知の手段で行われる。遺伝子又は遺伝子断片は
、好適な化学的に合成された、あるいは細菌、７アージ
、真核細胞又はそのウィルスから分離され、そして蛋白
質の発現を可能にするコントロール領域を備えることも
できる。こうして得られる雑種プラスミドの好適な宿主
細胞中への形質転換又はトランスフェクションは、同様
に既知であり、文献に詳細に記載されている。雑種プラ
スミドには、培地への蛋白質の分泌を可能にする対応す
るシグナル配列を備えることもできる。哺乳動物細胞中
で発現させる場合は、発現すべき遺伝子、この場合は突
然変異したｔＰＡ　−ｃＤＮＡを、マクス−メタロチオ
ネイン−フロモーター又は５Ｖ４０−プロモーターの制
御下に置く。この発現のためには、メチオニン開始コド
ン及びｔＰＡ遺伝子のリーダー配列／プロ配列の存在が
必要である。次いでこのベクターの複写をエピゾームと
して又はゲノム中に組込んで含有するクローンを分離す
る。例えばウシ乳頭腫ウィルスを基礎とする外来遺伝子
を組込み、そして発現することが特に有利である。

細菌細胞中での複製及び抗生物質耐性のためにコード化
する原核配列を結合すると、いわゆる「シャトル」ベク
ターを構成することが可能セある。プラスミドの構成及
び増幅は、まず細菌細胞中で行われ、次いで真核細胞例
えばマウス−フィブロプラスト細胞系Ｃ１２７中への転
写が行われる。他の細胞系例えば酵母、昆虫細胞及びそ
の他の噴孔動物細胞例えばＣＨＯ−１Ｌ−及び２９３−
細胞も発現のために使用できることは当然である。

この真核発現系は、その産生物を効果的にかつ多（の場
合天然の形で分泌することができる利点を有する。さら
にこの系は、その産生物の翻訳後修飾を行うことができ
る。従って組織プラスミノーゲン活性化物質は、真核細
胞中で発現させると、アミノ酸１１７．１８４及び４４
８（Ａｓｎ）上になおオリゴ糖側鎖を含有する。新規な
ポリペプチドはｔＰＡ１１２〜５２７残基中の相当する
部位において同様にグリコジル化されている。

グリコジル基の精密構造は、用いられた発現系の性質に
依存する差異を有しうる。

細菌はオリゴ糖側鎖を合成することができない。細菌中
で発現された真核蛋白質の多くは、例えばｔＰＡ及び本
発明によりそれから誘導される蛋白質も、変性された封
入体として細胞中に生成し、蛋白質化学により再生しな
ければならない。さらに細胞は多くの場合、イニシェー
ターアミノ酸であるメチオニンを出来あがった蛋白質か
ら脱離させることができない。この困難は、分泌系の使
用により回避できる。

しかし遺伝子コードの変性により、他のＤＮＡ配列、異
なるＤＮＡ配列を有する例えば化学的に合成された遺伝
子を、新規なポリペプチドの発現のために利用すること
も可能である。

新規なポリペプチドの精製は、公知方法によるアフィニ
ティ及びイオン交換クロマトグラフィによって、培地か
らこれを分離することにより行われる。

本発明により得られる蛋白質は、高められた凝血特異性
、より長い半減期、阻害物質との減少した結合及び／又
はより大きい蛋白質溶解活性を有し、従って血栓溶解の
ために用いることができる。その際この蛋白質はヒト組
織プラスミノーゲン活性化物質よりも改善された性質を
示す。

従って本発明は、少な（とも１種の新規な蛋白質を、場
合により製剤上容認される賦形剤又は結合剤中に含有す
る医薬に関する。この医薬は新規な蛋白質を、他のフィ
ブリン溶解物質例えばプロウロキナーゼ、ウロキナーゼ
もしくはストレプトキナーゼ又はこれらの誘導体、並び
に他の製剤用蛋白質例えばスーパーオキシドジスムター
ゼと組合せて含有することができる。

本発明の他の態様を下記の例に詳細に記載する。遺伝子
工学的方法については、例えばＭａｎｉａｔｉｓらによ
るハンドブック、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　
、　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　ＬａｂＯ
ｒａｔＯｒ’／　＊１９８２が参照される。

例１ ヒト組織プラスミノーゲン活性化物質のためのｃＤＮＡ
クローンの分離： ｔＰＡ産生ヒト子宮組織５０９を、グアニジニウムチオ
シアネート６Ｍ、＜えん酸ナトリウム５　ｍＭ　（ｐＨ
７，０）、２−メルカプトエタノール０．１Ｍ及びサル
コシル０．５％中でウルトラーツラツクス内で均質化し
た。粗大な細胞破片を３００　Ｏｒｐｍで遠心分離した
。５．７ＭのＣｓＣｌクツションにより４５０００ｒ−
で１夜遠心することによりＲＮＡを分離した。次いでポ
リＡ−含有ＲＮＡ分画を、オリゴ（ａＴ）−セルロース
上のア２イニテイクロマトグラフにより分離した。

ＡＭＶ逆転写酵素及びスターターとしてのオリゴ（ｄＴ
）　１２−１８を用いて、ポリＡ　−ＲＮＡを１本鎖ｃ
ＤＮＡ中に転写した。第２の鎖の合成を、大腸菌ＤＮＡ
ポリメラーゼＩを用いて行った。酵素Ｔ４−ＤＮＡリガ
ーゼを用いて、２本鎖ｃＤＮＡ　（Ｃ５ａｌＩリンカ−
を結合した。市販のプラスミドｐｕｃ９を制限酵素Ｓａ
ｌ　Ｉで線状化した。これら２本のＤＮＡを一緒に連結
し、゛こうして得られた雑種を用いて、大腸菌株ＨＢ１
０１のＣａＣｌ２処理されたコンピテントな細胞を形質
転換した。アンピシリン１００μｇ／ｍｌを含有するＬ
Ｂ板上に細胞を塗り広げ、３７℃で１夜保温した。コロ
ニーをニトロセルロースフィルター上に移し、レプリカ
を塗り、ＮａＯＨＯ，５Ｎ／ＮａＣ１ｆ、　５　Ｍで溶
解し、そして変性ＤＮＡを８０℃で２時間加熱すること
によりフィルター上に強固に結合させた。このフィルタ
ーを６　Ｘ　５ＥＴ−緩衝液（１Ｘ　５ＥＴ＝ＮａＣ１
０，１５Ｍ、　　）リス／ＨＣＩ（ｐＨ７，４）　１５
ｍＭ。

ＥＤＴＡ　１　ｍＭ　）、０．１％ＳＤＳ及び５　ｘ　
Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ　
＝　５０　ｍｌにつきＦｉｃｏｌｌ　Ｉ１１ポリビニル
ピロリドン１ｇ、ＢＳＡ　１　ｇ　）の中で、６８℃で
４時間予備線種形成した。ＤＮＡ合成装置を用いて、そ
れぞれｔＰＡの１７個の塩基を包含する６個のオリゴヌ
クレオチドグローブを製造した。これらのものは下記の
配列から成る。

５’　ＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ　３’５’
　ＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧ　５’５’　Ｔ
ＣＣＡＧＴＣＣＧＧＣＡＧＣＴＧＣ３’これらのグロー
ブを５′−末端においてγ−”Ｐ　−ＡＴＰで標識し、
予備雑種形成したフィルターと一緒に、６ＸＳＥＴ、０
．１％ＳＤＳ　、　５　ＸＤｅｎｈａｒａｔ及び１０％
デキストラン硫酸を含有する溶液中で、軽微に揺動しな
がら４２℃で１夜保温した。次いでフィルターを６　ｘ
　ＳＥＴ　７０．１％８Ｄ８中で４２℃で数回洗浄し、
乾燥し、Ｘ線フィルムに照射した。スクリーニングの際
に放射性応答を与えたクローンを分離し、さらに培養し
た。１個のクローン（以下ｐＵＣｔＰＡ　　と呼ばれる
）は、コード化領域並びに５′−及び５′−非コード化
領域を有する約２．１ｋｂの大きさの挿入を含有してい
た（第２図）。ｐＵＣｔＰＡのプラスミドＤＮＡは、細
菌培養物のリゾチーム消化及び５ＤＳ−アルカリ処理並
びにこれに続＜　Ｃ３ＣＩ勾配遠心分離により調製した
。

例２ ｔＰＡ−ＤＮＡ　中へのオリゴヌクレオチドの挿入：ａ
）出発点はプラスミドｐＵＣｔＰＡであった。これをＢ
ｇＩ　Ｉｔで予備切断した。続いてアルカリ性ホスファ
ターゼを用いる処理を行った。

ＤＮＡ自動合成装置を用いて、下記のオリゴヌクレオチ
ドを製造して精製した。

ＭＤ　６３５’　−ＧＡＴＣＴＴＡＣＧＣＴＧＴＣＡＣ
ＣＧＧＣＣＧＴＧＧＴＧＡＣＴＣＴＣＣＴＧＣＴＡＧＣ
ＴＣＡＡＡＧＣＣＴＡ−３’ＭＤ　６４５’　−ＧＡＴ
ＣＴＡＧＧＣＴＴＴＧＡＧＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＧＴ
ＣＡＣＣＡＣＧＧＣＣ（）ＧＴＧＡＣＡＧＣＧＴＡＡ−
３’これらのオリゴヌクレオチドを、アニーリング反応
により互いに雑種化し、同時にポリヌクレオチドキナー
ゼを用いる処理によりホスホリル化した。

製造されたオリゴヌクレオチド３０　ｎｇを、次いで線
状化したＤＮＡ　ｔ　２　’ＯｎＪ９に連結した。

続いてこの混合物を用いて、アンピシリン含有培地上で
プラスミドの存在について選択されたコンピテントなＨ
Ｂ１０１細胞を形質転換した。１夜培養物２　ｍｌから
、いわゆる「ミニ溶解物」として少量のプラスミドＤＮ
Ａを遊離させ、制限酵素Ｓａｃ　Ｉ＋　Ｘｍａｌｌｌ　
（混合物１）、Ｈａｅｌｌ（混合物２）又はＸｍａｌｌ
ｌ　＋　Ｈｉｎｄ　ｍ　（混合物３）を用いて切断した
。得られた断片をゲル電気泳動により分離した。正しい
単一のオリゴヌクレオチドの存在は、出発ＤＮＡと比較
して部分的に変化した断片の大きさにより明らかであり
、こうして配向を確認することもできた。最終的な調査
は’、　ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチドの挿入及び隣
接領域の分析である（ザンガーらのＰｒｏｃ、Ｎａｔｌ
、　Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ７４（１９７７）、５４６６〜６７による）。

正しい単一の挿入を有・する候補者の大量のプラスミド
ＤＮＡが、当該の１夜培養物１詔の消化により得られた
。このＤＮＡ　（「ｐＵＣｔＰＡ　Ｊ　）をＣｓＣ１勾
配により２回精製し、ＴＥ緩衝液に対して広範囲に透析
した。

ｂ）　　ｐＵＣｔＰＡをＢｇｌ　ＩＩにより予備切断し
た（第３図）。ＤＮＡ自動合成装置を用いて、下記のオ
リゴヌクレオチドを製造して精製した。

ＭＮ　５１　：　５’−ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＣＡＡＧＧ
ＧＴＴＧＴＧＧＡＡＡＧＡＣＡＴＣＡＡＴＣＴＧＣＣＧ
−３’ ＭＮ　５２：　５’−ＧＡＴＣＣＧＧＣＡＧＡＴＴＧＡ
ＴＧＴＣＴＴＴＣＣＡＣＡＡＣＣＣＴＴＧＧＧＣＣＡ−
５’ ＭＮ　５５　：　５’−ＧＡＴＣＴＧＧＴＣＡＣＣＧＡ
ＣＣＣＣＴＴＧＡＣＡＡＧＡＡＧＡ（）ＡＧＡＡＧＡＧ
Ｇ−５’ ＭＮ　５４　：　５’−ＧＡＴＣＣＣＴＣＴＴＣＴＣＴ
ＣＴＴＣＴＴＧＴＣＡＡＧＧＧＧＴＣＧＧＴＧＡＣＣＡ
−３’ ５′−末端においてホスホリル化されていないオリゴヌ
クレオチドを、アニーリング反応により相互に雑種化し
た。

製造されたオリゴヌクレオチド各１００ｎｐを、次いで
線状化したＤＮＡ　２００　ｎｇと連結した。その後の
操作はａ）に記載の操作と同様であり、ただし「ミニ溶
解物」の切断を下記の酵素を用いて行った。

ＭＮ　５１１５２の混合物（’ｐｕｃｔｐＡ１Ｆｇαつ
：Ｂｇｌ　ｌ−８ｔｙ　ＩＭＮ　５５１５４の混合物（
’　ｐＵＣｔＰＡ−Ｆｇβつ：Ｂｓ　ｉ、Ｅ　［−Ｅｃ
　ｏＲ１例３ ｔＰＡ−ＤＮＡ中へのオリゴヌクレオチドの挿入：出発
点はプラスミドｐＵＣｔＰＡであった。これを制限酵素
ＢａｍＨＩ及びＨｉｎｄｌｌｌにより予備切断し、２．
１ｋｂの塩基をゲル電気泳動により分離し、これをさら
にＨａｅｌ［により切断した（第４図）。次いでアルカ
リ性ホスファターゼを用いる処理を行った。

ＤＮＡ自動合成装置を用いて、下記のオリゴヌクレオチ
ドを製造して精製した。

ＭＮ　１３５’−ＣＣＣＡＴＧＧＡＧＣＧＡｆｌＴＧＧ
ＡＣＣＴＣＣＴＧＣＡＧＣＡＣＣＴＣＣＴＧＣＧＧＣＡ
ＡＣＧＧＣＧＣ−３’ＭＮ　１４５’−ＣＧＴＴＧＣＣ
ＧＣＡＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＴＣＣＡＣ
ＴＣＧＣＴＣＣＡＴＧＧＧＧＣＧＣ−５’ＭＮ　１５５
’−ＣＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣＡＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧ
ＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＣＡＧＡＧＧＣＧＡＣＧＣＣＴＧ
ＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣＧＡ−３’ＭＮ　１６５’−ＣＧ
ＴＣＧＣＣＴＣＴＧＣＣＧＴＣＣＣＣＡＴＣＧＣＴＧＴ
ＣＧＧＣＣＴＧＡＴＣＡ（）ＧＧＴＴＧＧＣＧＣ−３’
ＭＮ　１７５′−ＣＡＡＣＧＡＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＧ
ＡＣＧＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＣＴＧＧＣＧＣ−３’ ＭＮ　１８５’−ＣＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＣＴＣＧ
ＴＣＴＧＧＧＡＴＣＣＣＡＴＣＧＴＴＧＴＣＧＡＴＧＴ
ＣＡＴＣＧＣＡＧＧ−５’ＭＮ　１９５’−ＡＴＧＣＧ
ＡＣＣＣＴＧＧＣＴＡＣＡＴＣＧ［）ＣＡＧＣＡＧＡＧ
ＧＣＧＣ−５’ＭＮ　２０５’−ＣＴＣＴＧＣＴＧＣＣ
ＧＡＴＧＴＡＧＣＣＡＧＧＧＴＣＧＣＡＴＣ）ＣＧＣ−
５’オリゴヌクレオチドＭＮ１３＋１４（混合物ａ）、
ＭＮ１５〜１８（混合物ｂ）及びＭＮｊ９＋２０（混合
物Ｃ）を、それぞれアニーリング反応により相互に雑種
化し、同時にポリヌクレオチドキナーゼを用いる処理に
よりホスホリル化した。

製造されたオリゴヌクレオチド１４０ｎｇ（ａ）、１６
０ｎｇ（ｂ）又は１００　ｎｌ　（ｃ）を、次いで線状
化したＤＮＡ　２００　ｎｇ（ａ）、４００ｎｇ（ｂ及
びＣ）に連結した。続いてこの混合物を用いて、アンピ
シリン含有培地上でプラスミドの存在について選択され
たコンピテントなＨＢ１０１細胞を形質転換した。１夜
培養物２ｒｎｌから「ミニ溶解物」として少量のプラス
ミドＤＮＡを遊離させ、下記の制限酵素により切断した
。

混合物ａ　：　１）　Ｐｓｔｌ ２）　Ｂｇｌ■＋Ｎｅｏ　１ 混合物ｂ　：　１）　ＢａｍＨＩ ２）　ＥｃｏＲｌ　＋　Ｂｇｌ■ ３）　ＥｃｏＲＩ　＋　ＢａｍＨ１ 混合物ｃ　：　１）　５ｐｈｌ＋　ＢａｍＨ■２）　Ｐ
ｓｔｌ 得られた断片をゲル電気泳動により分離した。

正しい単一のオリゴヌクレオチドの挿入は、出発ＤＮＡ
と比較して部分的に変化した断片の大きさにより明らか
であり、こうして配向を確認することもできた。最終的
な調査は、例２と同様のＤＮＡ配列の分析である。それ
ぞれ正しい単一の挿入を有する候補者の大量のプラスミ
ドＤＮＡが、当該味の１夜培養物１ぷの消化により得ら
れた。このＤＮＡ　（［ｐＵＣｔＰＡ−Ｃ（ａ）、−Ｔ
（ｂｌ、−Ｌ（ｃ月）を、ＣｓＣ１勾配上で２回精製し
、ＴＥ緩衝・液に対して広範囲に透析しｔこ。

例４ 修飾されたｔＰＡ−ＤＮＡを発現するためのベクターの
構成： サルウィルスｅＶ　４０のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨ１
及びＢｃｌ　Ｉにより切断し、ゲル電気泳動により０、
２４　ｋｂの断片を調製した（第５図）。これらの末端
を、４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートｄＡ
ＴＰ％ｄＣＴＰ、　　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在下に
ＤＮＡポリメラーゼ■のＫｌｅｎｏｗ断片で充填した。

続いてＸｈｏｌｌＪンカーを連結した。

これと平行して、市販のベクターｐＵＣ１８を酵素Ｓｍ
ａ　Ｉにより線状化した。次いで同様にｘｈｏｌリンカ
−を連結した。このベクター（「Ｉ）ＵＣ１８ＸｈｏＪ
　）のＤＮＡをＸｈｏ　ｌにより線状化し、アルカリ性
ホスファターゼを用いて処理し、０、２４　ｋｂのＸｈ
ｏ　ｌ−８Ｖ　４０断片（前記参照）に連結した。この
ものはｐＳＶｐＡである。ｐｓＶｐＡ−ＤＮＡをＸｈｏ
　ｔにより予備切断し、前記のようにしてＫｌｅｎｏｖ
ｒ−ポリメラーゼと共に前記の４種のｄＮＴＰの存在下
に保温した。０．２４　ｋｂの断片をゲル電気泳動によ
り分離した。同時に、ＣＬ２８ｘ及びｐＢ？２　（Ｒｅ
ｄｄｙら著ＤＮＡ　６（ｔ９８７）４６ｔ〜７２による
）の連結により生成した真核発現ベクターＣＬ　２８　
Ｘｈｏ　ＢＰＶを、制限酵素Ｘｂａｌにより部分的に切
断し、すなわち生成する分子が両方のｘｂａｌ−認識配
列の一方だけにおいて切断され、従って線状になるよう
に、時間的に制限して保温した（第６図）。次いでこの
混合物を、前記のようにしてＫｌｅｎｏｗ−ポリメラー
ゼ及びｄＮＴＰと反応させた。これらの線状分子を続い
てゲル電気泳動により分離した。

次いで線状ｐＣＬ　２８　Ｘｈｏ　ＢＰＶ断片とＳＶ４
０からの前処理された０、　２４　ｋｂの断片との連結
を行った。形質転換及びミニ溶解物のスクリーニングの
のち、Ｘｈｏ　１部位から６′の方向に約０．１５ｋｂ
に位置する前のＸｂａ　［部位にＳＶ　４０断片を含有
するクローンを分離した。このＤＮＡ （ｒ　ｐｃｒ、、ｚａ　ＸｈｏＢＰＶ−８Ｖｐｏｌｙ　
Ａ　Ｊ　）は、「早い」遺伝子のＳＶ４０転写停止点を
含有していた。

りＣＬ　２８　）；ｈｏ　ＢＰＶ　−８Ｖ　ｐｏ　ｌｙ
　ＡのプラスミドＤＮＡを制限酵素Ｘｈｏ　Ｉにより線
状化し、アルカリ性ホスファターゼを用いて処理した。

同時にｐＵｃｔＰＡ−Ｆ、−Ｆｇα、−Ｆｇβ、−Ｃ１
−Ｔ又は−Ｌ（例２及び３から）を酵素５ａｉｌにより
切断し、約λ１　ｋｂの大きさの挿入を調製した（第７
図）。

両方の断片なＴ４リガーゼにより相互に結合させた。形
質転換及びミニ溶解ののち、変異したｔＰＡ−ＤＮＡを
単一にかつ正しい配向で含有するクローンを分離した。

これらはｐＣＬ　２８ＢＰＶ−ｉｐＡ−Ｆ。

−Ｆｇα、−Ｆｇβ、−Ｃ，−で又は−Ｌである。

例５ トランスフェクション及び細胞系の確立：Ｃ１２７１細
胞（Ｊ、Ｖｉｒｏｌ、２６（１９７８）２９Ｌ細胞系及
び雑種細胞のＡＴＣＣカタログ、第５版１９８５年１４
２頁）を、ＢＰＶ発現プラスミドを用いて燐酸カルシウ
ム共沈法によりトランスフェクションを行った（　Ｖｉ
ｒｏｌｏｇｙ　５２（１９７３）４５６　、　ＤＮＡ　
Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、　Ｕ　；　Ｄ、　Ｍ、　Ｇｌ
ｏｖｅｒＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ編１９８５年１４３頁以下
及び２１６頁）。

５Ｘ１０’個の０１２７［細胞を、６０１１ｍのペトリ
皿に入れたりＭＥＭ　（ダルベツコの変性イーグル培地
）＋１０％ＦＣ８（ウシ胎児血清）中に接種した。

翌日に培地を、Ｈｅｐｅｓ　２５　ｍＭ　＋　Ｆｅ２１
０％を含有するＭＥＭ　（変性イーグル培地）と交換し
た。

ＣｓＣ１で精製したプラスミドＤＮＡ　１０μｓを用い
て燐酸Ｃａ共沈を形成し、これを０１２７１細胞上に注
意深く置いた。この細胞を３７°ｃ　；　ｃｏ、　ｙ％
で４時間培養した。続いてグリセリン−ショック処理に
より、トランスフェクション効率をかなり高めた。この
ために沈殿を置いてから４時間後に、細胞から培地を除
去した。この細胞を、６０ｍＩベトリ皿につきそれぞれ
２ｍ７！０１５％グリセリン／　ＨＢＳ　（ＤＮＡ　Ｃ
ｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、　ＩＩ　、　ｐ　１５２　）と
共に６分間室温で培養した。グリセリン／ＨＢ　Ｓ溶液
を除去し、芝生様細胞を５　ｍｌのＤＭＩＩＣＭ　＋　
１０％ＦＣＳテ洗浄シタ。コノ細胞なりＭＥＭ　＋　１
０　％　Ｆｅ２と共に６７°Ｃ；Ｃｏ！７％で培養した
。毎週６回ＤＭＥＭ　＋１０％ＦＣ８を除去して新しい
培地と交換した。２〜３週間ののち、ＢＰＶゲノムを含
有するトランスフェクションした細胞が、形質転換細胞
いわゆるＦｏｃｉの収集として認められた。

前記のｔＰＡ変異体を発現するＦｏｃ　ｉを、カゼイン
寒天積層（後記参照）により培養した。６７℃；　ＣＯ
□７％で２〜３時間培養したのち、溶菌帯域が濁ったカ
ゼイン寒天中で、ｔＰＡ発現細胞が存在する点として認
められた。カゼイン寒天を除去したのち、これらの点に
存在する細胞をクローニングシリンダー法により分離し
た（　ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、■、ｐ２２０）
。より天童の細胞をスピナーフラスコ中で生産した。こ
のために１！容のスピナーフラスコに、サイトデツクス
６ｊ９／Ａ及び２Ｘ１０”個の細胞を１０００＋＋ｔ／
のＤＶＥＭ＋１０％ＦＣ８の容量で接種した。マイクロ
キャリアー培養法は、’Ｍｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ　ｃ
ｅｌｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　；ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ　ａ
ｎｄ　ｍｅｔｈｏｄｓ’　（ファルマシア中ファイン・
ケミカルズ）に記載されている。合流に達したのち（約
ｔｓｘ１ｏ’細胞／ｍｅ）、この細胞を血清不含ＤＭＥ
Ｍ中で保存した。

前記の寒天積層試験には、下記の溶液が必要であった。

積層寒天 １）　　Ｈ２Ｏ中の８％スキムミルク溶ｉヲ１００℃で
６０分間煮沸したのち、３７℃の水浴中で冷却する。

２）　　ＰＢＳ中の低融点寒天の２％溶液をオートクレ
ーブで処理したのち、３７℃の水浴中で冷却する。次い
で２倍濃度のＤｌｔ４ＥＭを１：１の比で添加する。

３）プラスミノーゲン０．６４■をＨ，０１ｍｌに溶解
する。１６ｍ１の溶液２）、４ｒｎｌノ溶液１）及び０
．４　ｍｌのプラスミノーゲンを一緒に滴定することに
より、積層寒天を製造した。これを混合ののち３７℃の
水浴中で保存する。

この試験を行うために、６０ｍペトリ皿中の細胞を血清
不含媒地で２回洗浄する。次いで積層寒天を’ｌ　ｍｌ
ずつペトリ皿中にピペットで添加する。寒天を冷却して
凝固させるために、ベトリ皿を室温で放置する。次いで
培養器中で００２７％を添加して３７℃で２〜３時間培
養し、モして溶菌帯域の大きさと数を調べる。

例６ 新規なポリペプチドの分離 例５により得られた血清不含の細胞培養上澄液から、滅
菌ヂ過及び０．０１％のツイーン８０の添加ののち、エ
リスリナ−トリプシン−阻害物質−セファロース（ＥＴ
Ｉ−セファロース、１ｃｍ　ｘ　５　ｃｍ　）上でのア
フイニテイクロマトグラフイにより、ｔＰＡ変異体を分
離し、続いてリジン−セファロースクロマトグラフィに
より精製した。ＥＴＩ−アフイニテイマトリックスを製
造するため、ＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂの
１ｍｌにつき５ｍｇのＥＴＩを結合した。操作法の詳細
な記載については、製造業者（ファルマシア：の指示が
参照される。このゲル材料を、細胞培養上澄液を負荷す
る前に燐酸Ｎａ２０ｍＭ％ＮａＣ１０，１５Ｍ、ツイー
ン８０の０．０１％（ｐＨ７）により平衡化した。負荷
したのち、非特異的に結合した材料を除去するために、
このゲル材料を同じ緩衝液で処理した。特異的に結合し
た変異体の脱着は、グリシン０．１Ｍ、アルギニンＨＣ
ｌ０、１　Ｍ　、ライ−７８０の０゜０１％（ｐＨ３，
０）を用いる溶離により行った。溶離液を一緒にし、０
．１Ｍ−苛性ソーダ溶液でｐＨ７，０にした。

次いで変異体の精製をリジン−セファロースクロマトグ
ラフィにより行った。これは市販のゲルマトリックス（
ファルマシア）を用いて行い、次のように操作した。ゲ
ルマトリックスを燐酸Ｎａ　２０ｍＭ、　ＮａＣ１２５
０ｍＭ、ツイーン８０の０．０１％（ｐＨ７，０）によ
り平衡化した。負荷の前にＥＴＩ−セファロースの有効
分画を、リジン−セファロースカラムの平衡化緩衝液で
１：５（ｖ／ｖ）に希釈した。非結合材料を燐酸Ｎａ：
　２０ｍＭ、ツイーン８０の０，０１％（ｐＨ６゜５）
で洗浄除去したのち、変異体の溶離を燐酸Ｎａ　２０龜
、アルギニン０．４　Ｍ　、ツイーン８０の０．０１％
（ｐＨ６，５）を用いて行った。有効分画を燐酸Ｎａ　
２０　ｍ）Ｊ　、アルギニン０．１Ｍ、　ＮａＣ１Ｏ，
１５Ｍ。

ライ−７０，０１％（ｐＨ５，０）に対して透析するこ
とにより、変異体の精製を完結した。

例７ オリゴ糖部分の特性決定： 例６により得られた変異体５〜ｊＱａｌを、５Ｄ８−ゲ
ル電気泳動により分別し、次いでニドｏセｆｉｖロース
膜上に移した。ツイーン２０００゜１％（ｐＨ７，４）
を含有するＰＢＳ緩衝液（燐酸塩２　ｍＭ、　ＮａＣ１
１５０ｍＭ、　ｐＨ７，４）で飽和したのち、パーオキ
シダーゼに結合したグリ７オニアーシンプリシ７オリア
（Ｇｒｉｆｆｏｎｉａ　Ｓｉｍｐｌｉｃｉ−ｆｏｌｉａ
　）からのレクチンと共に２時間培養した。

結合しなかった材料をＴＢＳ緩衝液（トリス１０ｍＭ、
　ＮａＣ１１５０ｍＭ、　ｐＨ７，４）により除去した
のち、ニトロセルロースをトリス１０＋ｎｌＪ％ＮａＣ
１１５０ｍＭ、　Ｈ２０！０．０２％及び４−クロル−
１−ナフトール０．５　ｍ９７　ｍｌ中で５〜１０分間
培養した。蛋白質バンドが５分以内に青色に着色するこ
とにより、陽性反応を見えるようにした。次いでニトロ
セルロース膜を水中に移すこと洸より、反応を停止した
。

オリゴ糖残基はα−結合したガラクトース残基を含有し
、これは第８図に示すように、β−結合したサブ末端ガ
ラクトース残基と結晶している。その際α−ガラクトー
ス残基は、好ましくはガラクトース６′（糖残基の番号
については第８図参照）に位置する。他のサブ末端ガラ
クトース残基は、シアリン酸又は他のα−結合ガラクト
ース残基により置換されている。

例８ チャンドラ−・ループにおける生体内血栓溶解作用の決
定： ポリエチレン製チューブ（長さ２１５　ｃｍ１内径４朋
）中で、くえん酸塩処理した全血２　ｍｌを放射活性３
２！１　　フイブリノーゲ／と混合した。

このくえん酸塩面を０．２５ｍｏｌ／７　ＣａＣ］４溶
液２００μｌの添加により再び石灰処理した。回転ドラ
ム中でこの環を２３°の傾斜角及び６７℃の温度で回転
した。

３０分後に血栓を分離し、秤量し、そして放射性含量を
測定した（目標：　９００００〜１ｌ１００００ｃｐ　
／塊）。

ポリエチレン製チューブ中に自動対数くえん酸塩血漿’
ｌ　ｍｌ及びそれぞれ標識された血栓を加えた。次いで
このチューブに被験物質又は対照溶液（ベヒクル）をピ
ペットで加えた。被験物質又はベヒクルの投与前（０分
一対照）ならびに投与後３０分、６０分及び１８０分に
、血漿２０μｊを採り、その放射性含量を測定した。す
べての実験中に回転ドラムを１２ｒｐｌで回転した。

１８０分後に、血栓の放射性及び残留重量を測定した。

血栓溶解は、０分及び３時間の時点までの重量ならびに
放射活性の差として計算され、次式による％として表わ
される。

↓゛０ 前記の例により製造されたｔＰＡ変異体は、この実験に
おいて未変性ｔＰＡよりも良好な血栓溶解作用を示した
。

図面の簡単な説明 第１ａ〜１ｆ図は、ヒト成熟組織プラスミノーゲン活性
化物質（ｔＰＡ）のアミノ酸配列を示し、第２図はｔＰ
ＡのためのｃＤＮＡを示し、第３図及び第４図はｔＰＡ
−ＤＮＡ中にオリゴヌクレオチドを挿入するための工程
図、第５図、第６図及び第７図は、変異したｔＰＡ−Ｄ
ＮＡを発現するためのベクターを製造するための工程図
であり、第８図は本発明の新規蛋白質におけるオリゴ糖
部分の結合状態を示す。

出願人　　ビーニーニスエフ・アクチェンゲゼルシャフ
ト代理人　弁理士　高　　橋　　淳　　−１−−−−−
−−＋伜＋＋―−−＋・−−−＋−−−−＋彎−ｅ？−
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ｓｐＴｒｐＨｅ＾ｒｑＡｓｐＡｓｎｌｅｔ　−ａ：　　
　　ＡｒｑＰｒｏεｎｄ− ＦＩＧ、４ ＨｉｎｄｉｌＩ　　　ｐＬｌｃ　　　　ＢａｍＨＥ　　
ＢａｍＨＩ　　　ｔＰＡ　　　　Ｈｉｎｄ］ｎＦＩ３．
５ ＦＩ３．６ Ｂａｍ　Ｈｌ Ｆ旧、７ Ｇａｌ　　　＝がラクトース Ｍａｎ　　　”マンノ−人 ＧＩｃＮＡｃ　＝、たｔ−ア辷＋ルり゛′ルコ°ナミ／
Ｆｕｅ　　　”７コース Ｓｉａ　　　＝’５／ア１ノン改良 ＡＳ１１　　　・ヱス八’７キ゛／

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 Ａ−ｔＰＡ＿１＿〜＿１＿１＿１−Ｘ−ｔＰＡ＿１＿１
   ＿２＿〜＿５＿２＿７（式中ｔＰＡ＿１＿〜＿１＿１＿
   １及びｔＰＡ＿１＿１＿２＿〜＿５＿２＿７はそれぞれ
   ヒト成熟組織プラスミノーゲン活性化物質のアミノ酸１
   〜１１１及び１１２〜５２７であり、Ａは水素原子、又
   は下記 【アミノ酸配列があります】 ｘは下記 【アミノ酸配列があります】又は 【アミノ酸配列があります】又は 直接結合を意味し、ただしＡが水素原子であるときは、
   Ｘは直接結合でないものとする）で表わされる蛋白質、
   ならびにＡ及び／又はＸのＮ−及び／又はＣ−末端にお
   いて１〜６個のアミノ酸により短縮又は延長された配列
   を有するその他感性の変異体又は誘導体。 ２、グリコシル化された形である、第１請求項に記載の
   蛋白質。 ３、オリゴ糖側鎖の一部が末端α−ガラクトース基を有
   することを特徴とする、第２請求項に記載の蛋白質。 ４、第１請求項に記載の蛋白質のためにコード化するＤ
   ＮＡ配列。