JPH02186986A

JPH02186986A - 新規なポリペプチド、その製造及び用途

Info

Publication number: JPH02186986A
Application number: JP1180675A
Authority: JP
Inventors: Markus Dr Mueller-Neumann; マルクス・ミユラー‐ノイマン; Martin Dr Schmidt; マルチン・シユミツト; Margarete Dr Schwarz; マルガレーテ・シユヴアルツ; Verena Baldinger; フエレナ・バルデインガー; Thomas Dr Doerper; トーマス・デルパー; Karl-Hermann Dr Strube; カール‐ヘルマン・ストルーベ
Original assignee: BASF SE
Current assignee: BASF SE
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1989-07-14
Publication date: 1990-07-23
Also published as: DE3823805A1; WO1990000603A1; EP0350692A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、プラスミノーゲン活性化物質活性を有する新
規なポリペプチド、その製法及び病気の処置におけるそ
の用途に関する。

ヒト成熟組織プラスミノーゲン活性化物質（ｔＰＡ）は
、５２７個のアミノ酸及び６８　Ｎ）の分子量を有する
ポリペプチドである（　Ｐｅｎｎ１Ｃａｅｔ、　ａｌ、
　１９８３　＊　Ｎａｔｕｒｅ　３０１＋　２１４〜２
２１及びＮｙ　ｅｔ　ａｌ、　１９８４　＋　Ｐｒｏｃ
、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ　ｓｉ　、　５３５５〜５３５９　）　（第１ａ
〜Ｉｃ図参照）。

この分子は数個の明瞭な領域いわゆるドメインを有し、
種々の機能はこれらの領域に帰属する。

Ｎ−末端は、フィブロネクチンと同族のフィンガー領域
により形成される。これには数種の生長因子と類似性を
有する領域が続く。これに続い【２個のループドメイン
がある。１本鎖分子を２本鎖に開裂することのできる開
裂部位の後に、プロテアーゼドメインが続き、これは活
性中心を含有し、そして他のセリンプロテアーゼと同族
性を有する。

組織プラスミノーゲン活性化物質は、これを興味深い分
子にする数種の性質を有する。ｔＰＡはフィブリンに対
して高い親和性を有し、プラスミノーゲン活性化はフィ
ブリン依存性であり；プロテアーゼとしてｔＰＡはプラ
スミノーゲンを開裂してプラスミンを生成し、これは次
いでフィブリンを分解して分解生成物にする。ｔＰＡは
プラスミノーゲン活性化物質の阻害物質により阻害する
ことができる。さらにｔｐＡは比較的短い半減期を有し
；この分子は肝臓中で急速に分解される。

これらの因子は、生体内でｔＰＡが血餅においてプラス
ミノーゲンを特異的に活性化してプラスミンとなし、そ
してフィブリンの分解により血管中の流れの回復をもた
らす作用をする。従ってｔＰＡはフィブリン溶解療法に
おいて例えば心筋梗塞後に使用することができる。

本発明者らは、一般式％式％（式中ｊＰＡｌ、５２４はヒト成熟組織プラスミノーゲ
ン活性化物質のアミノ酸１〜５２４であり、Ｂは下記の
アミノ酸配列　　ＬＥ　ＰＷ −ＬＥＮＰＤＱＡＤＳＤ（）ＤＣ）ＲＣ）ＤＡＣＤＤＩ
ＤＮＤＧＩＰＤＥＤＮＣＰ（）−ＬＥＴＲＷＶＳＭＫＫ
ＴＴＭＫ −ＰＷ（）ＥＣＣＣ）ＲＣＬＰＳ −ＬＥＫＲＬＥＶＤＩＤＩＫＩＲ３ −ＬＥＧＩＣ）ＡＶＬＫＶＬＴＴＧＬＰＡＬＩＳＷＩＫ
ＲＫＲＱＱＧ−ＬＥＨＨＬＧ（）ＡＫＱＡＲＤＶ　又は
−ＰＷＲＧＤＴＰＫＰＱＳＨＮＤＧＤＦＢＥＩＰＥＥＹ
ＬＱを意味する）で表わされるポリペプチド、−ならび
にＢのＮ−及び／又はＣ−末端において６個までのアミ
ノ酸により短縮又は延長された配列を有するその他感性
の変異体又は誘導体が、改善された性質を有することを
見出した。

このように新規なポリペプチドは、ｔＰＡのＣ−末端に
おいて修飾されている。

本発明はさらに、この成熟ポリペプチドのためにコード
化するＤＮＡ配列、ならびにこのＤＮＡ配列を有するベ
クターに関する。

新規なポリペプチドは遺伝子工学により既知の方法によ
って製造することができる。ここに記載する構成のため
の出発点は、ｔＰＡのコード化配列及びさらに５′−及
び６′−非翻訳領域を含有するＣＤＮＡクローン（以下
ｐＵｃｔＰＡと呼ばれる）である。この成熟ポリペプチ
ドは、リーダー及びプロ配列の後でＳｅｒ　（１）で始
まり、Ｐｒｏ（５２７）の後で終る。

ｐ’ＵｃｔｐＡは次のようにして分離される。ヒト子宮
組織からｍＦｔＮＡを分離し、２本鎖ｃ　ＤＮＡ中に転
写する。このｃＤＮＡを市場で入手できるクローニング
ベクターｐＵＣ９中に挿入したのち、ｃＤＮＡライブラ
リーを作成する。これに用いられる方法は、例えばＭａ
ｎｉａｔｉｓ　ｅｔ　ａｌ、、　ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣ
ｌｏｎｉｎｇに記載されている。放射性標識したオリゴ
ヌクレオチド試料を用いるこの種の遺伝子パンクのスク
リーニングは、これまで広く用いられかつ文献に記載さ
れた方法である。この方法を用いて、コード化領域及び
隣接領域を含有するｃＤＮＡクローンを分離することが
できる。

ｐＵｃｔＰＡのＤＮＡ配列の断片は、制限酵素を用いて
容易に得られる。これらの断片は、場合により化学合成
されたオリゴヌクレオチド、アダプター又は遺伝子断片
と結合して、新規なポリペプチドのためにコード化する
ＤＮＡ配列をクローニングするために利用できる。この
遺伝子断片又は合成りＮＡ配列を、クローニングベクタ
ー例えば市販のプラスミドｐＢＲ５２２、ｐＵＣ８又は
９、ｐＵＣ１Ｂ又は１９、Ｍ１５ｍｐ１８又はＭ　１３
　ｍＰ１９に組込むことは、既知の手段で行われる。

遺伝子又は遺伝子断片は、好適な化学的に合成された、
あるいは細菌、ファージ、真核細胞又はそのウィルスか
ら分離され、そして蛋白質の発現を可能にするコントロ
ール領域を備えることもできる。こうして得られる雑種
プラスミドの好適な宿主細胞中への形質転換又はトラン
スフェクションは、同様に既知であり、文献に詳細に記
載されている。雑種プラスミドには、培地へのポリペプ
チドの分泌を可能にする対応するシグナル配列を備える
こともできる。哺乳動物細胞中で発現させる場合は、発
現すべき遺伝子、この場合は突然変異ｔＰＡ　−ＣＤＮ
Ａを、マウス−メタロチオネイン−プロモーター又は５
Ｖ４０−プロモーターの制御下に置く。この発現のため
には、メチオニン開始コドン及びｔＰＡ遺伝子のリーダ
ー配列／プロ配列の存在が必要である。

次いでこのベクターの複写をエピゾームとして又はゲノ
ム中に組込んで含有するクローンを分離する。例えばウ
シ乳頭腫ウィルスを基礎とする外来遺伝子を組込み、そ
して発現することが特に有利である。細菌細胞中での複
製及び抗生物質耐性のためにコード化する原核配列を結
合すると、いわゆる「シャトル」ベクターを構成するこ
とが可能である。プラスミドの構成及び増幅は、まず細
菌細胞中で行われ、次いで真核細胞例えばマウス−フィ
ブロプラスト細胞系０１２７中への転写が行われる。他
の細胞系例えば酵母、昆虫細胞及びその他の哺乳動物細
胞例えばＣＨＯ−Ｌ−及び２９３−細胞も発現のために
使用できることは当然である。

この真核発現系は、その産生物を効果的にかつ多（の場
合天然の形で分泌することができる利点を有する。さら
にこの系は、その産生物の翻訳後修飾を行うことができ
る。従って組織プラスミノーゲン活性化物質は、真核細
胞中で発現させると、アミノ酸１１７．１８４及び４４
８（ＡＳｎ）上になおグリコシド側鎖を含有する。

細菌はグリコシド糖側鎖を合成することができない。細
菌中に発現された真核蛋白質の多くは、例えばｔＰＡ及
び本発明によりそれから誘導されるポリペプチドも、変
性された封入体として細胞中に生成し、蛋白質化学によ
り再生しなければならない。さらに細菌は多くの場合、
イニシエーターアミノ酸であるメチオニンを出来あがっ
た蛋白質から脱離させることができない。この困難は、
分泌系の使用により回避できる。

しかし遺伝子コードの変性により、他のＤＮＡ配列、例
えば異なるＤＮＡ配列を有する化学的に合成された遺伝
子を、新規なポリペプチドの発現のために利用すること
も可能である。

新規なポリペプチドの精製は、公知方法によるアフイニ
テイ及びイオン交換クロマトグラフィによって、培地か
らこれを分離することにより行われる。

本発明により得られるポリペプチドは、高められた凝血
特異性、より長い半減期、阻害物質との減少した結合及
び／又はより大きい蛋白質溶解活性を有し、従って血栓
溶１７．のために用いることができる。その際この蛋白
質はヒト組織プラスミノーゲン活性化物質よりも改善さ
れた性質を示す。

従って本発明はまた、少なくとも１才重の新規なポリペ
プチドを、場合により製剤上容認される賦形剤又は結合
剤中に含有する医薬に関する。

この医薬は新規な蛋白質を、他のフィブリン溶解物質例
えばプロウロキナーゼ、ウロキナーゼもしくはストレプ
トキナーゼ又はこれらの誘導体、ならびに他の製剤用蛋
白質例えばスーパーオキシドジスムターゼと組合せて含
有することができる。本発明の他の態様を下記の例に詳
細に記載する。遺伝子工学的方法については、例えばＭ
ａｎｉａｔｉｓらによるハンドブック、Ｍｏｌｅｃｕｌ
ａｒＣＩＯｎｌｎｇ　＋　Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｌｎｇ　Ｈ
ａｒｂｏｒ　Ｌａ１ＤＯｒａｔＯｒｙ＋１９８２が参照
される。

例１ヒト組織プラスミノーゲン活性化物質のためのｃ　ＤＮ
Ａクローンの分離：ｔＰＡを産生ずるヒト子宮組織３０ｆｉを、グアニジニ
ウムチオイソシアネート６Ｍ、＜えん酸ナトリウム５　
ｍＭ　（ｐＨ７，０）、２−メルカプトエタノール０．
１Ｍ及びサルコシル０６５％中でウルトラーツラツクス
内で均質化した。粗大な細胞破片をツルバルー５８３４
−攪拌器（ＤｕＰｏｎｔ　）中で３００　Ｏｒｐｍで遠
心分離した。　ｓ、　７　ＭのＣｓＣｌクツションによ
り２０℃及び３５０００　ｒｐｓで５Ｗ４０−ローター
（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ　）中で１
夜遠心することによりＲＮＡを分離した。次いでポ１．
Ｉ　Ａ　−含有ＲＮＡ分画を、オリゴ（ｄＴ）−セルロ
ース上のアフイニテイクロマトグラフにより分離した。

ＡＭＶ逆転写酵素及びスターターとしてのオリゴ（ｄＴ
）１２−１８を用いて、ポ＋＋７　Ａ　−ＲＮＡを１本鎖ｃＤＮＡ中に転写した。第
２の鎖の合成を、大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＬを用いて
行った。酵素Ｔ４−ＤＮＡＩＪガーゼを用いて、２本領
ｃＤＮＡ　Ｋ　Ｓａｌ　Ｉ　！Ｊンカーを結合した。市
販のプラスミドｐＵＣ９を制限酵素Ｓａｌ　Ｉで線状化
した。これら２本のＤＮＡを互いに連結し、こうして得
られた雑種を用いて、大腸菌株ＨＢ　１０１のＣａＣｌ
２処理されたコンピテントな細胞を形質転換した。アン
ピシリン１００μｍ７／ｍｌを含有するＬＢ板上に細胞
を塗り広げ、３７℃で１夜保温した。

コロニーをニトロセルロースフィルター上ニ移し、レプ
リカを塗り、ＮａＯＨＯ，５Ｎ／ＮａＣＩＬ　１．５Ｍ
で溶解し、そして変性ＤＮＡを８０°Ｃで２時間加熱す
ることによりフィルター上に強固に結合させた。このフ
ィルターを６　Ｘ　５ＥＴ−緩衝液（１ｘ　ＳＥＴ　＝
ＮａＣ１Ｏ，１５Ｍ、トリス／　ＨＣＩ　（ｐＨ７，４
）　１５ｍＭ５ＥＤＴ／１ｍＭ）、ｏ、　ｉ％ＳＤＳ及
び５　ｘ　Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液（１００Ｘ　Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ　＝　５０１ｎｔにつきＦｉｃｏｌｌ　１　ｉ
　、ポリビニルピロリドン１ｇ、ＢＳＡ　１　ｇ）の中
で、６８°Ｃで４時間予備雑種形成した。ＤＮＡ合成装
置を用いて、それぞれｔＰＡ−ＤＮＡの１７個の塩基を
包含する３個のオリゴヌクレオチドプローブを製造した
。これらのものは下記の配列から成る。

５’　ＴＧＣＡＧＡＴＣＡＣＴＴＧＧＴＡＡ　５’５’
　ＣＣＡＧ（）ＣＣＣＡＧＴＧＣＣＴＧＧ　３’５’　
ＴＣＣＡ（）ＴＣＣＧＯＣＡＧＣＴＧＣ３’これらのプ
ローブを５１−末端においてγ−３２Ｐ　−Ａ’Ｉ’Ｐ
で標識した。次いでこれらのものを予備雑種形成したフ
ィルターと一緒に、６　Ｘ　ＳＥＴ、　０．１％ＳＤＳ
　、　５　Ｘ　Ｄｅｎｈ６ｒｄｔ及び１０％デキストラ
ン硫酸を含有する溶液中で、軽微に揺動しながら４２℃
で１夜保温した。次いでフィルターを６　Ｘ　５ＥＴ１
０．１％ＳＤＳ中で４２°Ｃで数回洗浄１．、乾燥し、
Ｘ線フィルムに照射した。スクリーニングの際に放射性
応答を与えたクローンを分離し、さらに培養した。１個
のクローン（以下ｐＵＣｔＰＡと呼ばれる）は、コード
化領域並びに５′−及び６′−非コード化領域を有する
約２．１　ｋｂの大きさの挿入を含有していた（第２図
）。ｐＵＣｔＰＡのプラスミドＤＮＡは、細菌培養物の
りゾチーム消化及び５ＤＳ−アルカリ処理並びにこれに
続（ＣｓＣ１勾配遠心分離により調製した。

例２ｔＰＡ−ＤＮＡ中へのオリゴヌクレオチドの挿入：出発
点はプラスミドｐＵＣｔＰＡであった。これをＢｓｔ　
Ｅ■及びＨｉｎｄ　ｍで予備切断した（第６図）。

続いてアルカリ性ホスファターゼを用いる処理を行った
。

ＤＮＡ自動合成装置を用いて、下記のオリゴヌクレオチ
ドを製造して精製した。

ＭＮ　　２９　５’　−ＧＴＴＡＣＣＡＡＣＴＡＣＣＴ
ＡＧＡＣＴＧ（）ＡＴＴＣＧＴＧＡＣＡＡＣＣＴＣＧＡ
ｆｌＴＧＡＧＴＣＧＡＣＡ−３’ＭＮ　　３０　５’　
−ＡＧＣＴＴＯＴＣＧＡＣＴＣＡＣＴＣＯＡＧＧＴＴＣ
）ＴＣＡＣ（）ＡＡＴＣＣＡ（）ＴＣＴＡＧＧＴＡＧＴ
Ｔ（）−３’ＭＮ　　６１　５’　−ＧＴＴＡＣＣＡＡ
ＣＴＡＣＣ’１ＧＡＣＴＧＧＡＴＴＣＧＴＧＡＣＡ＊Ｃ
ＣＣＡＴＧＧＴＣ）Ａ、ＧＴＣＣ）ＡＣＡ−３’ＭＮ　
６２　５’　−ＡＧ、ＣＴＴ（’）ＴＣＧＡＣＴＣＡＣ
ＣＡＴＧＣ）ＧＴＴＧＴＣＡＣ［）ＡＡＴＣＣＡ、ＧＴ
ＣＴＡＧＧＴＡＧＴＴＧ−３’これらのオリゴヌクレオ
チドを、アニーリング反応により互いに雑種化し、同時
にポリヌクレオチドキナーゼを用いる処理によりホスホ
リル化した。

製造されたオリゴヌクレオチド５０　ｎ、ｉ７を、次い
で線状化したベクターＤＮＡ　４００　ｎ９に連結した
。続いてこの混合物を用いて、アンピシリン含有培地上
でプラスミドの存在について選択されたコンピテントな
ＨＢ　ｔ　０１細胞を形質転換した。１夜培養物２　ｍ
ｌから、いわゆる「ミニ溶解物」として少量のプラスミ
ドＤＮＡを遊離させ、制限酵素を用いて下記の切断を行
った。

ＭＮ２９／６０による構成の場合：ＢａｍＨＩ　＋　Ｘｈｏｌ　　（混合物１）、ＦＣＯＲ
Ｉ　＋　Ｘｈｏｌ　　（混合物２）又はＨａｅｌｌ　　
＋　ＳｍａＩ　　（混合物６）ＭＮ　？＋　１　／　３
２による構成の場合：ＢａｍＨＩ　＋　Ｎｃｏｌ　　（
混合物１）、ＥｃｏＲ（＋　Ｎｃｏｌ　　（混合物２）
又はＨａｅｌｌ　　＋　Ｓｍａｌ　　（混合物３）得ら
れた断片をゲル電気泳動により分離した。

正しい単一のオリゴヌクレオチド挿入の存在は、出発Ｄ
ＮＡと比較して部分的に変化した断片の大きさにより明
らかであり、こうして配向を確認することもできた。最
終的な調査は、ＤＮＡ配列、オリゴヌクレオチド挿入及
び隣接領域の分析である（ザンガーらのＰｒｏｃ、　Ｎ
ａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、７４（１９７７）、５４６３〜６７による）。

正しい単一の挿入を有する候補者の大量のプラスミドＤ
ＮＡが、当該０１夜培養物１１の消化により得られた。

このＤＮＡ　（ＭＮ２９／３　ｏを有スる「ｐＵｃｔＰ
Ａ−ＣＴＸ　ｊならびにＭＮ３１／ろ２を有する（−ｐ
ＵｃｔＰＡ−ＣＴＮ　Ｊ　）をＣｓＣ１勾配により２回
精製し、ＴＥ緩衝液に対して広範囲に透析した。

例６ａｔＰＡ−ＤＮＡ中へのオリゴヌクレオチドの挿入：出発
点はプラスミドｐＵＣｔＰＡ−ＣＴＸであった。

これを制限酵素ＸｈｏＪにより切断した（第４図）。

次いでアルカリ性ホスファターゼを用いる処理を行った
。

上、４Ｎ３３　５’−ＴＣＧＡＧＡＡＣＣＣＴＧＡＴＣ
ＡＧＧＣＣＧＡＣＡＧＣＧＡＴＧＧＧＧＡＣＧＧＣＡＧ
ＡＧＧＣＧＡＣＧＣＣＴ（）ＣＧＡＴＧＡＣＡＴＣ（）
Ａ−３’ＭＮ３４　５’−ＣＧＴＣＧＣＣＴＣＴＧＣＣ
ＧＴＣＣＣＣＡＴＣ（）ＣＴ（）ＴＣＧＧＣＣＴＧＡＴ
ｃＡＧＧＧＴＴｃ−３’ ＭＮ３５　５’−ＣＡＡＣＣ）ＡＴ（）ＧＧＡＴＣＣＣ
ＡＣ）ＡＣＧＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣＣＴＣ−３′ ＭＮ３６　５’−ＴＣＧＡＧＡＧＧＡＣＡＡＴＴＧＴＣ
ＣＴＣＣ）ＴＣＴＧＣ）ＧＡＴＣＣＣＡＴＣＧＴＴＧＴ
ＣＧＡＴＧＴＣＡＴＣＧＣＡ（）Ｇ−３’これらのオリ
ゴヌクレオチドを、アニーリング反応により相互に雑種
化し、同時にポリヌクレオチドキナーゼを用いる処理に
よりホスホリル化した。

製造されたオリゴヌクレオチド１００　ｎｇを、次いで
ベクターＤＮＡ　４００　ｎｇに連結した。続いてこの
混合物を用いて、アンピシリン含有培地上でプラスミド
の存在について選択されたコンピテントなＨＢ１０１細
胞を形質転換した。１夜培養物２ｍｅから「ミニ溶解物
」として少量のプラスミドＤＮＡを遊離させ、下記の制
限酵素系により切断した。

１）　　ＢａｍＨＩ２）　　　　ＢａｍＨｌ　　　＋　　Ｈａｅ■３）Ｂｓ
ｔＥＩＩ　　　＋　　Ｈａｅｌｌ得られた断片をゲル電
気泳動により分離した。

正しい単一のオリゴヌクレオチド挿入の存在は、出発Ｄ
ＮＡと比較して部分的に変化した断片の大きさにより明
らかであり、こうして配向を確認することもできた。最
終的な調査は、例２と同様のＤＮＡ配列の分析である。

それぞれ正しい単一の挿入を有する候補者の大量のプラ
スミドＤＮＡが、当該法の１夜培養物１１の消化により
得られた。このＤＮＡ　（ｒ　ｐＵＣｔＰＡ−ＣＴ−Ｔ
　Ｊ　）を、ＣｓＣ１勾配上で２回精製し、ＴＥ緩衝液
に対して広範囲に透析した。

例３ｂｔＰＡ−ＤＮＡ中八、へオリゴヌクレオチドの挿入：呂
発点はプラスミドｐＵＣｔＰＡ−ＣＴＸであった。

これを制限酵素Ｘｈｏ　ｌ及びＨｉｎｄ　Ｉ［［により
予備切断し、約４．５ｋｂの塩基をゲル電気泳動により
分離した（第４図）。

ＭＮ４２　５’−ＴＣＧＡ（）ＡＣＣＡＧＡＴＧＧＧＴ
ＧＡＧＣＡＴＧＡＡＧＡＡＡＡＣＣＡＣＡＡＴ（）ＡＡ
ＧＴＣ）ＡＧＴＣＧＡＣＡ−３’ＭＮ４３　５’−Ａ（
）ＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡＣＴＴＣＡＴＴＧＴＧＧＴ
ＴＴＴＣＴＴＣＡＴ（）ＣＴＣＡＣＣＣＡＴＣＴＧＣ）
ＴＣ−３’ＭＮ４７　５’−ＴＣＧＡＧＡＡＡＣ（）Ａ
ＣＴＧＧＡ（）ＧＴＣ）ＧＡＣＡＴＴＧＡＴＡＴＴＡＡ
（）ＡＴＣＣＧＡＴＣＴＴＧＡＧＴＣ（）ＡＣＧＧＡＴ
ＣＣＡ−３’ＭＮ４８　５’−ＡＧＣＴＴＧ（）ＡＴＣ
ＣＧＴＣＣ）ＡＣＴＣＡＡＧＡＴＣＧＧＡＴＣＴＴＡＡ
ＴＡＴＣＡＡＴＧＴＣＣＡＣＣＴＣＣＡ（）ＴＣＧＴＴ
ＴＣ−３’ＭＮ６０　５’−ＴＣＧＡＧＧＧＡＡＴＴＯ
（）ＡＧＣＡ（）ＴＡＣＴＧＡＡＧＧＴＡＴＴＡＡＣＣ
ＡＣＡＧＧＡＴＴ（）ＣＣＣＧＣＣＣＴＣＡＴＡＡＧＴ
ＴＧＧＡ−３’ＭＮ６１　５’−ＣＡＡＴＣＣＴＧＴＧ
Ｃ）ＴＴＡＡＴＡＣＣＴＴＣＡＧＴＡＣＴＧＣＴＣＣＡ
ＡＴＴＣＣＣ−３’ ＭＮ６２　５’−ＴＴＡＡＡＣＧＴＡＡＣ）ＡＧＧＣＡ
ＡＣＡＧＧＧＴＴＧＡＧＴＣ（）ＡＣＧＧＡＴＣＣＡ−
３’ ＭＮ６Ａ　　５’−ＡＧＣＴＴＧＧＡＴＣＣＧＴＣＧＡ
ＣＴＣＡＡＣＣＣＴＧＴＴＧＣＣＴＣＴＴＡＣＣ）ＴＴ
ＴＡＡＴＣＣＡＡＣＴＴＡＴＧＡＧＧＧＣＧ、ＧＧ−３
’ＭＮ６４　５’−ＴＣＧＡＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧ（）
ＧＧＧＧＡＣ）ＣＣＡＡＡＣＡＧＣ）ＣＴＣＧＡＧＡＣ
ＧＴＴＴＧＡＧＴＣＧＡＣＧＧＡＴＣＣＡ−３’ＭＮ６
５５’−Ａ（）ＣＴＴＧ（）ＡＴＣＣＧＴＣＧ△ＣＴＣ
’ＡＡＡＣ’ＧＴＣ’ＴＣＧＡ（）ＣＣＴＧＴＴ’ｒＧ
ＧＣＴＣＣＣＣＣＣＡＡｃ）ＴＧＧＴＧＣ−３’オリゴ
ヌクレオチドＭＮ４２＋４５（混合物ａ）、ＭＮ４７＋
４８（混合物ｂ）、ＭＮ６０−Ｌ−６３（混合物Ｃ）及
びＭＮ６４＋６５（混合物ｄ）を、それぞれアニーリン
グ反応により相互に雑種化した。

製造されたホスホリル化されていないオリゴヌクレオチ
ド各２００　ｎ、９を、次いでベクターＤＮＡ各１００
　ｎ、９に連結した。続いてこの混合物を用いて、アン
ピシリン含有培地上でプラスミドの存在について選択さ
れたコンピテントなＨＢ１０１細胞を形質転換した。１
夜培養物２ｍｌから「ミニ溶解物」として少量のプラス
ミドＤＮＡを遊離させ、下記の制限酵素により切断した
。

混合物ａ　：　５ａｃｌ　＋　ＨｌｎｄＩ［Ｉ混合物ｂ
　：　１）　５ａｃｌ　＋　ＨｉｎｄｌＩ［２）Ｂａｍ
ＨＩ混合物ｃ　：　１）　ＢａｍＨＩ２）Ｓｃａｌ３）ＳａｃＩ　　＋　　Ｓａｌ［混合物ａ　：　１）　ＢａｍＨＩ２）Ｂｇｌｌ得られた断片をゲル電気泳動により分離した。

それぞれ正しい単一の挿入を有する候補者の大量のプラ
スミドＤＮＡが、当該株の１夜培養物１１の消化により
得られた。このＤＮＡ［：ｌ”　ｐｕＣｔＰＡ−ＣＴＦ
ｇ」（ａＪ、　　ｒ　ｐＵＣｔＰＡ−ＣＴａＦ　Ｊ　（
ｂ）、「ｐＵｃｔＰＡ−ＣＴＭ　Ｊ　（ｃ）、ｒ　ｐＵ
ＣｔＰＡ−ＣＴｇ２Ｆ　Ｊ　（ｄ）　）　　を、ＣｓＣ
１勾配上で２回精製し、ＴＥ緩衝液に対して広範囲に透
析した。

例３ｃｔＰＡ−ＤＮＡ　中へのオリゴヌクレオチドの挿入：出
発点はプラスミドｐＵＣｔＰＡ−ＣＴＮであった。

これを制限酵素Ｘｈｏｌ及びＨｉｎｄｌｎにより切断し
た（第４図）。

ＭＮ４０　５’−ＣＡＴＣ）（）Ｃ）Ｃ）ＣＧＡ、ＧＴ
ＧＣＴＧＴ（）ＧＣＡＣ）ＡＴＧＣＣＴ（）ＣＣＣＡＣ
）ＣＴＧＡＧＴＣＧＡＣＡ−３’ ＭＮ４１　５’−Ａ（）ＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＡ（）
ＣＴＧ［）（）ＣＡ（）ＯＣＡ、ＴＣＴ（）ＣＣＡＣＡ
ＧＣＡＣＴＣＧＣＣＣ−３’ ＭＮ７８　５’−ＣＡＴＧＧＡＧＡＧＧＣＧＡＣＡＣＣ
ＣＣ（）ＡＡＡＣ’ＣＧＣＡＣ）ＴＣＴＣＡＣＡＡＣＧ
ＡＣＧＧＣＧＡＣＴＴＣＧＡＡＧＡＡＡＴＣ−，５’Ｍ
Ｎ７９　５’ＣＣ（）ＴＣＧＴＴＧＴＧＡＧＡＣＴＧＣ
ＧＧＴＴＴＣＧＧＧＧＴＧＴＣＧＣＣＴＣＴＣ−３’ ＭＮ８０　５’−ＣＣＧＧＡＡ（）ＡＡＴＡＣＣＴ（）
ＣＡＧＴＡＡＴＣ）ＡＴＣＴＡＧＡＣ）ＴＣＧＡＣＡ−
３’ ＭＮ８１　５’−ＡＣ）ＣＴＴＧＴＣＧＡＣＴＣＴＡ（
）ＡＴＣＡＴＴＡＣＴＧＣＡＧ（）ＴＡＴ’Ｉ”ＣＴＴ
ＣＣＧＧ（）ＡＴＴＴＣＴＴＣ’Ｃ）ＡＡＧＴＣＧＣ−
３’オリゴヌクレオチドＭＮ４０＋４１（混合物ａ）及
びＭＮ　７８〜８１（混合物ｂ）を、それぞれアニーリ
ング反応により相互に雑種化した。

製造されたホスホリル化されていないオリゴヌクレオチ
ド１５０　ｎ、９を、次いでベクターＤＮＡ４００　ｎ
ｇに連結した。続いてこの混合物を用いて、アンピシリ
ン含有培地上でプラスミドの存在について選択されたコ
ンピテントなＨＢ１０１細胞を形質転換した。１夜培養
物２　ｍｌから「ミニ溶解物」として少量のプラスミド
ＤＮＡを遊離させ、下記の制限酵素により切断した。

混合物ａ　：　５ａｃｆ　＋　ＨｉｎｄＩ［Ｉ混合物ｂ
　：　１）　５ａｃｌ　＋　Ｈｉｎｃｉｌｌ１２）　５
ａｃｌ　＋　Ｈａｅ［３）ＰｓｔＩ得られた断片をゲル電気泳動により分離した。

それぞれ正しい単一の挿入を有する候補者の大量のプラ
スミドＤＮＡが当該株の１夜培養物１１の消化により得
られた。このＤＮＡ　（：　「ｐＵＣｔＰＡ−ＣＴＶ　
Ｊ仏）、Ｉ　ｐｔＪｃｔｐＡ−ＣＴＨＪ　（ｂ）　］を
、ＣｓＣ１勾配上で２回精製し、ＴＥ緩衝液に対して広
範囲に透析した。

例４修飾されたｔｐＡ−ＤＮＡを発現するためのベクターの
構成：サルウィルスＳＶ４０のＤＮＡを制限酵素ＢａｍＨＩ及
びＢｃｌＩにより切断し、ゲル電気泳動により０、２４
　ｋｂの断片を調製した（第５図）。これらの末端を、
４種のデオキシヌクレオチドトリホスフェートｄＡＴＰ
　、　ｄＣＴＰ　、　ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰの存在下に
ＤＮＡポリメラーゼエのＫｌｅｎｏｗ断片で充填した。

続いてＸｈｏｌｌｊンカーを連結した。

これと平行して、市販のベクターｐＵＣ１８を酵素Ｓｍ
ａ　Ｉにより線状化した。次いで同様にＸｈＯＩ’！ン
カーを連結した。このベクター（１’−ｐＵｏ　１８Ｘ
ｈｏ　Ｊ　）のＤＮＡをＸｈｏ　ｌにより線状化し、ア
ルカリ性ホスファターゼを用いて処理し、０、２４　ｋ
ｂのＸｈｏｌ−ＳＶ４０断片（前記参照）に連結した。

このものはｐｓｖｐＡである。ｐＳＶｐＡ−ＤＮＡをＸ
ｈｏ）により予備切断し、前記のようにしてＫｌｅｎｏ
ｗ−ポリメラーゼと共に前記の４種のｄＮＴＰの存在下
に保温した。０．２４　ｋｂの断片をゲル電気泳動によ
り分離した。同時に、ＣＬ２８Ｘ及びｐＢ２−２　（Ｒ
ｅｄｄｙら著ＤＮＡ６　（１９８７）　４６１〜７２に
よる）の連結により生成した真核発現ベクターＣＬ　２
８　Ｘｈｏ　ＢＰＶを、制限酵素Ｘｂａ　Ｉにより部分
的に切断し、すなわち生成する分子が両方のＸｂａ　Ｉ
−認識配列の一方だけにおいて切断され、従って線状に
なるように、時間的に制限して保温した（第６図）。次
いでこの混合物を、前記のようにしてＫｌｅｎｏｗ−ポ
リメラーゼ及びｄＮＴＰと反応させた。これらの線状分
子を続いてゲル電気泳動により分離した。

次いで線状ｐＣＬ　２８　Ｘｈｏ　ＢＰＶ断片とＳＶ　
４０からの前処理された０、　２４　ｋｂの断片との連
結を行つた。形質転換及びミニ溶解物のスクリーニング
ののち、Ｘｈｏ１部位から３′の方向に約０．１５　ｋ
ｂに位置する前のＸｂａ　１部位にＳＶ４０断片を含有
するクローンを分離した。このＤＮＡ（ｒ　ｐｃＬ２８ＸｈＯＢＰＶ−８ＶｐｏｌＹ　Ａ　Ｊ
　　）は、「早い」遺伝子のＳＶ４０転写停止点を含有
していた。

ｐｃＬ２８ＸｈｏＢＰＶ−８Ｖ　ｐｏｌｙ　Ａのプラス
ミドＤＮＡを制限酵素ｘｈｏＩにより線状化し、アルカ
リ性ホスファターゼを用いて処理した。同時にｐＵＣｔ
ＰＡ−ＣＴＸ、　−ＣＴＮ、　−ＣＴＴ、　−ＣＴＦｇ
ｌ−ＣＴａＦ、　−ＣＴＭ。

−ＣＴｇ２Ｆ、　−ＣＴＶ又は−ＣＴＨ（例２及び３か
ら−）を酵素Ｓａｌ　Ｉにより切断し、約１．８　ｋｂ
の大きさの挿入を調製した（第７図）。両方の断片をＴ
４リガーゼにより相互に結合された。形質転換及びミニ
溶解ののち、変異したｔＰＡ−ＤＮＡを単一にかつ正し
い配向で含有するクローンを分離した。

これらはｐＣＬ２８ＢＰＶ−ｔＰＡ−ＣＴＸ、　　−Ｃ
ＴＮ、　　−ＣＴＴ。

−ＣＴＦｇ、　−ＣＴａＦ　、−ＣＴＭ、−ＣＴ、ｇ２
Ｆ１−ＣＴＶ又は−ＣＴＨである。

例５トランスフェクション及び細胞系の確立：０１２７１細
胞（Ｊ、　Ｖｉｒｏｌ、　２６　（１９７８）　２９２
；細胞系及び雑種細胞のＡＴＣＣカタログ、第５版１９
８５年１４２頁）を、ＢＰＶ発現プラスミドを用いて燐
酸カルシウム共沈法によりトランスフェクションを行っ
た（　Ｖｉｒｏｌｏｇｙ　５２　（１９７３）４５６　
、　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、■；　Ｄ、　Ｍ
、　（）ｌｏｖｅｒＩＲＬ　Ｐｒｅｓｓ編１９８５年１
４３頁以下及び２１６頁）。５Ｘ１０５個の０１２７１
細胞を、６０真詐のペトリー皿に入れたＤＭｚ　（ダル
ベツコの変性イーグル培地）＋１０％ＦＣ８（ウシ胎児
血清）中に接種した。翌日に培地を、Ｈｅｐｅｓ　２５
　ｍＭ　＋　ＦＣ３１０％を含有するＭｍａ　（変性イ
ーグル培地）と交換した。ＣｓＣ１で精製したプラスミ
ドＤＮＡ１０μｇを用いて燐酸Ｃａ共沈を形成し、これ
を０１２７１細胞上に注意深く置いた。この細胞を６７
℃；Ｃｏ２７％で４時間培養した。続いてグリセリン−
ショック処理により、トランスフェクション効率をかな
り高めた。このために沈殿を置いてから４時間後に、細
胞から培地を除去した。この細胞を、６０朋ペトリ皿に
つきそれぞれ２罰の１５％グリセリン／　ＨＢＳ　（Ｄ
ＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ。

１１、　ｐ１５２）と共に６分間室温で培養した。グリ
セリン／　ＨＢＳ溶液を除去し、芝生様細胞を３　ｍｌ
のＤＭＥＭ　＋　１０　％　Ｆｅ２で洗浄した。この細
胞をＤＭＥＭ　＋１０％ＦＯ８と共に６７℃；　Ｃｏ、
　７％で培養した。毎週３回ＤＭＦＭ　＋　１０％ＦＣ
３を除去して新しい培地と交換した。２〜６週間ののち
、ＢＰＶゲノムを含有するトランスフェクションした細
胞が、形質転換細胞いわゆるＦｏｃｉの収集として認め
られた。前記のｔＰＡ変異体を発現するＦｏｃｉを、カ
ゼイン寒天積層（後記参照）により培養した。３７℃；
　Ｃｏ２７％で２〜６時間培養したのち、溶菌帯域が濁
ったカゼイン寒天中で、ｔＰＡ発現細胞が存在する点と
して認められた。カゼイン寒天を除去したのち、これら
の点に存在する細胞をクローニングシリンダー法により
分離した（　ＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｖｏｌ、■、　
ｐ２２０）。

より大量の細胞をスピナーフラスコ中で生産した。この
ために１１容のスピナーフラスコに、サイトデツクス■
の６ｇ／ｌ及び２Ｘ１０”個の細胞を１０００　ｍｌの
ＤＭ服＋１０％ＦＣ８の容量で接種した。マイクロキャ
リアー培養法は、ゝＭｉｃｒｏｃａｒｒｉｅｒ　ｃｅｌ
ｌ　ｃｕｌｔｕｒｅ　；　ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｃ
ｌ　ｍｅｔｈｏｄｓ　’　（ファルマシア・７アイ７−
））ミカルズ）に記載されている。合流に達したのち（
約１．５Ｘ１０’細胞／ｍｌ）、この細胞を血清不含Ｄ
Ｍ腹中で保存した。

前記の寒天積層試験には、下記の溶液が必要であった。

積層寒天１）　　Ｈ２Ｏ中の８％スキムミルク溶液を１００°Ｃ
で３０分間煮沸したのち、６７℃の水浴中で冷却する。

２）　ＰＢＳ中の低融点寒天の２％溶液をオートクレー
ブで処理したのち、３７℃の水浴中で冷却する。次いで
２倍濃度のＤＭＦＪＪを１：１の比で添加する。

３）プラスミノーゲ７０．６４　ｍ９をＨ２Ｏ１ｍｌに
溶解する。１６ｍｔの溶液２）、４　ｍｌの溶液１）及
びＱ、　４　ｍｌのプラスミノーゲンを一緒にピペット
で加えることにより、積層寒天を製造した。

これを混合ののち３７℃の水浴中で保存する。

この試験を行うために、６０罷ペトリ皿中の細胞を血清
不含培地で２回洗浄する。次いで積層寒天を２ｍｌずつ
ペトリ皿中にピペットで添加する。寒天を冷却して凝固
させるために、ペトリ皿を室温で放置する。次いで培養
器中でＣＯ□７％を添加して６７℃で２〜３時間培養し
、そして溶菌帯域の大きさと数を調べる。

例６新規なポリペプチドの分離例５により得られた血清不含の細胞培養上澄液から、滅
菌渥過及び０．０１％のツイーン８０の添加ののち、エ
リスリナ−トリプシン−阻害物質−セファロース（ＥＴ
Ｉ−セファロース、１ｃｍ　ｘ　３　ｃｍ　）上でのア
フイニテイクロマトグラフイにより、ｔＰＡ変異体を分
離し、続いてリジン−セファロースクロマトグラフィに
より精製した。ＥＴＩ−アフイニテイマトリックスを製
造するため、ＣＮＢｒで活性化したセファロース４Ｂの
１ｍｌにつき５■のＥＴＩを結合した。操作法の詳細な
記載については、製造業者（ファルマシア）の指示が参
照される。このゲル材料を、細胞培養上澄液を負荷する
前に燐酸Ｎａ　２０　ｍＭ、　ＮａＣ１０，１５Ｍ、ツ
イーン８０の０．０１％（ｐＨ７）により平衡化した。

負荷したのち、非特異的に結合した材料を除去するため
に、このゲル材料を同じ緩衝液で処理した。特異的に結
合した変異体の脱着は、グリシン０．１Ｍ、アルギニン
ＨＣｌ０．ＩＭ、ツイーン８０の０．ｃ１１％（ｐＨ３
，０）を用いる溶離により行った。溶離液を一緒にし、
０．１Ｍ苛性ソーダ溶液でｐＨ７，０にした。

次いで変異体の精製をリジン−セファロースクロマトグ
ラフィにより行った。これは市販のゲルマトリックス（
ファルマシア）を用いて行い、次のように操作した。ゲ
ル材料を燐酸Ｎａ２０　ｍＭ、　ＮａＣ１２５０ｍＭ、
ツイーン８０の０．０１％（ｐＨ７，０）により平衡化
した。負荷の前にＥＴＩ−セファロースの有効分画を、
リジン−セファロースカラムの平衡化緩衝液で１：５（
ｖ／ｖ）に希釈した。非結合材料を燐酸Ｎａ　２０ｍＭ
、ツイーン８０００．０１％（ｐＨ６，５）で洗浄除去
したのち、変異体の溶離を燐酸Ｎａ２０ｍＭ、アルギニ
ン０．４Ｍ、ツイーン８０００．０１％（ｐＨ６，５）
を用いて行った。有効分画を燐酸Ｎａ２０ｍＭ１アルギ
ニン０．　Ｉ　Ｍ、　ＮａＣｌ　０．１５Ｍ、ツイーン
８０の０．０１％（ｐＨ５，０）に対して透析すること
により、変異体の精製を完結した。

例７オリゴ糖部分の特性決定：例６により得られた変異体５〜１０μｇを、５ＤＳ−ゲ
ル電気泳動により分別し、次いでニトロセルロース膜上
に移した。ツイーン２ｏの０゜１％（ｐＨ７，４）を含
有するＰＢＳ緩衝液（燐酸塩２ｍＭ、ＮａＣ１１５０ｍ
Ｍ、ｐＨ７，４）で飽和したのち、パーオキシダーゼに
結合したグリフオニア自シンプリシフォリア（Ｇｒｉｆ
ｆｏｎｉａ　Ｓｉｍｐｌｉ−ｃｉｆｏｌｉａ　）からの
レクチンと共に２時間培養した。結合しなかった材料を
ＴＢＳ緩衝液（トリス１０　ｍＭｌＮａＣｌ　１５０ｍ
Ｍ％ｐＨ７，４）により除去したのち、ニトロセルロー
スをトリス１０ｍＭ。

ＮａＣ１１５０ｍＭ、　Ｈ２Ｏ２０，０２％及び４−ク
ロル−１−す７トール０．５ダ／　ｍｌ中で５〜１０分
間培養した。蛋白質バンドが５分以内に青色に着色する
ことにより、陽性反応を見えるようにした。次いでニト
ロセルロース膜を水中に移すことにより、反応を停止し
た。

オリゴ糖残基はα−結合したガラクトース残基を含有し
、これは第８図に示すように、β−結合したサブ末端ガ
ラクトース残基と結合している。その際α−ガラクトー
ス残基は、好ましくはガラクトース６′（糖残基の番号
については第８図参照）に位置する。他のサブ末端ガラ
クトース残基は、シアリン酸又は他のα−結合ガラクト
ース残基により置換されている。

例８チャンドラ−・ループにおける生体内血栓溶解作用の決
定：ポリエチレン製チューブ（長さ２７．５　ｆ？７７１、
内径４朋）中で、くえん酸塩処理した全血２ｍｌを放射
活性１２５Ｉ−フィブリノーゲンと混合した。

このくえん酸塩面を０．２５　ｍｏｌ　／　１ＣａＣ］
４溶液２００　ｌｔｌの添加により再び石灰処理した。

回転ドラム中でこの環を２３°の傾斜角及び３７℃の温
度で回転した。

３０分後に血栓を分離し、秤量し、そして放射性含量を
測定した（目標：　９００００〜１ｌ１００００ｃｐ／
塊）。

ポリエチレン製チューブ中に自己の（えん酸塩血漿’ｌ
　ｍｌ及びそれぞれ標識された血栓を加えた。次いでこ
のチューブに被験物質又は対照溶液（ベヒクル）をピペ
ットで加えた。被験物質又はベヒクルの投与前（０分一
対照）ならびに投与後６０分、６０分及び１８０分に、
血漿２００μｌを採り、その放射性含量を測定した。

すべての実験中に回転ドラムを１２ｒｐｌで回転した。

１８０分後に、血栓の放射性及び残留重量を測定した。

血栓溶解は、０分及び３時間の時点までの重量ならびに
放射活性の差として計算され、次式による％として表わ
される。

挿入するための工程図、第５図、第６図及び第７図は、
変異したｔＰＡ−ＤＮＡを発現するためのベクターを製
造するための工程図であり、第８図は本発明の新規ポリ
ペプチドにおけるオリゴ糖部分の結合状態を示す。

′１゛。

前記の例により製造されたｔＰＡ変・異体は、この実験
において未変性ｔＰＡよりも良好な血栓溶解作用を示し
た。

【図面の簡単な説明】

Claims

【特許請求の範囲】１、一般式ｔＰＡ＿１＿〜＿５＿２＿４−Ｂ（式中ｔＰＡ＿１＿〜＿５＿２＿４はヒト成熟組織プラ
スミノーゲン活性化物質のアミノ酸１〜５２４であり、
Ｂは下記のアミノ酸配列【遺伝子配列が有ります】又は【遺伝子配列が有ります】を意味する）で表わされるポリペプチド、並びにＢのＮ
−及び／又はＣ−末端において６個までのアミノ酸によ
り短縮又は延長された配列を有するその他感性の変異体
又は誘導体。２、第１請求項に記載のポリペプチドのためにコード化
するＤＮＡ配列。３、第１請求項に記載のポリペプチドのためにコード化
する遺伝子配列を有するベクター。