KR0148575B1 - 효소원 또는 피브린 특이성을 갖는 조직 플라스미노겐 활성제 - Google Patents

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Description

효소원 또는 피브린 특이성을 갖는 조직 플라스미노겐 활성제

본 발명은 특정 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA) 효소원, 이 효소원(zymogen)의 제조 방법, 이들 효소원을 제약적으로 응용하는 방법 및 제약 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 t-PA의 프로테아제 도메인 내에 치환된 아미노산을 함유하는 변형된 구조를 갖는 변이체에 관한 것으로서, 이 변형은 그의 단일 사슬형에 있어서는 비교적 불활성이나 피브린의 존재 하에서 그의 이중 사슬형으로 전환될 경우 야생형 t-PA보다 더 활성이 크고(크거나) 피브린(또는 혈병) 특이성인 변이체 효소원을 제공한다.

플라스미노겐 활성제는 효소원 플라스미노겐을 활성화시켜 피브린을 포함한 여러가지 단백질들을 분해하는 (Arg 561-Val 562에서의 절단에 의하여) 세린 프로테아제 플라스민을 생성시킨다. 연구된 플라스미노겐 활성제로서 세균성 단백질인 스트렙토키나아제, 신장 등에서 합성되고 뇨에서 최초로 추출된 효소인 유로키나아제 및 혈관벽의 안을 이루는 세포에 의해 생성된 인체 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA)등이 있다.

이들 각 플라스미노겐 활성제의 작용 기작은 다르다. 즉, 스트렙토키나 아제는 플라스미노겐 또는 플라스민과 복합체를 형성하여 플라스미노겐 활성화 작용을 나타내고, 유로키나아제는 플라스미노겐을 직접 절단하며, t-PA, 피브린, 및 플라스미노겐 모두가 상호 작용하여 최대 활성을 나타낸다.

t-PA는 부분적으로는 그의 높은 피브린 특이성 및 생체 내에서 혈병을 용해시키는 강력한 능력으로 인하여 심근 경색증과 같은 혈관계 질병에 뛰어난 효과를 나타내는 특별히 중요하고 유력한 신규 약제로서 동정되고 기재되어 왔다.

t-PA의 존재는 다수의 과학 집단에 의한 많은 연구를 촉진하였으나, 천연원으로부터 실질적으로 순수한 단리물로서 처음으로 동정되고 필요한 생체 플라스미노겐 활성화제 활성에 대해 시험된 것은 콜렌(Collen) 등에 의해서이다(1988년 6월 21일 미합중국 특허 제4,752,603호 참조). 또한, 라즈켄 등(Rijken), J. Biol. Chem., 제256권: 7035페이지(1981) 참고.

이어서, t-PA는 독특한 환경 중에서 대량의 t-PA를 생성하는 재조합 DNA 기술을 사용한 성공적인 연구에 기초하여 기초 DNA 서열 및 추정되는 아미노산 서열에 의해 완전히 동정되고 특성화되었다. 이 연구는 페니카(Pennica) 등의, Nature, 제301권; 214페이지(1983년) 및 1988년 8월 23일자 미합중국 특허 제4,766,075호에 보고되었다.

이러한 개시에 기초하여, 현재 t-PA분자는 트립신, 키모트립신, 플라스미노겐, 프로트롬빈, 피브로넥틴 및 표피 성장 인자(EGF)와 같은 여러가지의 다른 단백질에서 동정된 상동성이거나 또는 그렇지 않으면 유사한 구조와 관련하여 정의된 5개의 도메인을 함유하는 것이 확실하다. 이들 도메인은 t-PA의 아미노산 서열의 N-말단으로부터 출발하여, 1) 1번 내지 약 44번 아미노산을 함유한 것으로서 다양하게 정의되어 온 핑거 영역(F), 2) 그의 EGF와의 상동성에 기초하여 약 45번 아미노산에서 91번 아미노산에 이르는 것으로 다양하게 정의되어 온 성장 인자 영역(G), 3) 약 92번 아미노산에서 약 173번 아미노산에 이르는 것으로 다양하게 정의되어 온 크링글 1(K1), 4) 약 180번 아미노산에서 약 261번 아미노산에 이르는 것으로서 다양하게 정의되어 온 크링글 2 (K2), 및 5) 약 264번 아미노산에서 이 분자의 c 말단에 이르는 것으로 일반적으로 정의되어 온 소위 세린 프로테아제 도메인(P)으로 구성되어 있다. 일반적으로 서로 인접하거나 또는 짧은 링커 영역에 의해 분리되는 이들 영역은 t-PA의 추정상의 성숙 형태의 1번 내지 527 아미노산의 전체 아미노산 서열을 설명한다.

각각의 도메인은 특정의 특이한 생물학적으로 중요한 특성에 기여하는 것으로서 다양하게 기재되어 왔다. 핑거 도메인은 적어도 피브린에 대한 높은 결합 친화성에 대한 주요 서열을 함유한 것으로 특성화되었다. (이 활성은 t-PA가 피브린-풍부 혈전의 부위에서 혈병 분해에 대하여 높은 친화성을 나타내는데에 중요한 것으로 여겨진다) 이처럼 성장 인자 유사 영역은 세포 표면 결합 활성과 관계된다. 또한 크링글 2 영역은 피브린 결합 및 피브린의 t-PA 활성을 자극시키는 능력과 밀접한 연관이 있다. 세린 프로테아제 도메인은 플라스미노겐을 효소적으로 절단하여 플라스민을 생성하는데 관여한다.

혈병 용해제로서 천연 t-PA와 관련된 충분한 잇점에도 불구하고, 천연 단백질은 모든 환경 하에서 최적의 t-PA 활성을 적절하게 나타내는 것으로는 여겨지지 않는다. 따라서, t-PA의 특이성을 증대시키기 위해 여러가지 변이체들이 제안되거나 고안하였다. 이들 변이체들 중 어떤 것은 보다 긴 반감기 또는 늦은 정화율을 가진 제제가 바람직한 상황 즉, 경색 환자의 심각한 정맥 혈전중의 치료 및 이어지는 재관류에 있어서, 또는 단일 사슬 시약이 바람직한 상황에 있어서 천연 t-PA의 사용에서와 같은 결점을 나타낸다.

예를 들면, 핑거 도메인의 상당 부분 또는 모든 핑거 도메인을 제거하여, 생성물의 전체 클리어런스(clearance) 속도에 있어서 감소가 있으나 실질적으로 피브린 결합 특성이 감소된 분자를 초래한다 - 1989년 1월 12일자 국제 특허 공개 WO 89/00197호 참조.

유럽 특허 공보 제199,574호에는 단백질 가수분해 절단 부위인 275, 276 및 277 위치의 아미노산들이 치환된 변이체들이 기재되어 있다. 275 위치에서 아르기닌 이외의 아미노산을 갖는 t-PA 변이체로서 선택적으로 특성화된 이들 변이체들은 단일사슬 또는 이중사슬 형태 중 어느 하나로 존재할 수 있는 천연 t-PA와는 달리, 이들이 275번 위치에서 프로테아제 절단에 대해 내성이어서 생체 내에서 이중사슬 형태로 대사적으로 전환되지 않다는 점에서 프로테아제-내성 이중사슬 t-PA 변이체라고 한다. 이 형태는 이들이 피브린 결합 및 피브린 자극이 이중사슬 t-PA에 비해 증가되는 한편 보다 안정하다는 점에서 생물학적 및 상업적으로 특히 잇점을 갖는 것으로 생각된다. 더욱이, 피브린과 상호작용할 수 있는 한 도메인과 유로키나아제의 프로테아제 도메인으로 되는 플라스미노겐 활성제와 더불어, 유로키나아제를 변형시켜 이중사슬 유로키나아제가 형성되기 어렵게 한 실시태양이 기재되었다(1988년 7월 14일 공개된 WO 88/05081호 참조).

t-PA의 프로테아제 절단 부위의 변형에 관한 추가의 특허 문헌으로서는, 예를 들면, EPO 특허 제241,209호; 1986년 11뭘 12일 공개된 EP 제201,153호; 1987년 8월 19일 공개된 EP 제233,013호, 1988년 11월 23일 공개된 EP 제292,009호; 1988년 12월 7일 공개된 EP 293,936호 및 1988년 12월 7일 공개된 EP 제293,934호 및 WO 제88/10119호 등이 있다.

117-119, 184-186 및 448-450 위치에서 글리코실화된 변이체들은 탄수화물의 몰%를 줄임에 따라 높은 특이 활성을 나타냈다. 1987년 7월 1일 공개된 EPO 공보 제227,462호 참조. 이 특허 명세서는 또한 피브린/피브린 분해 생성물의 분석법의 이용에 관하여 기재하고 있으며 t-PA의 272-280번 위치를 분자를 변형시키거나 또는 C-말단으로부터 25번째 아미노산까지를 결실시켜도 좋음을 교시하고 있다. 또, DNA 변형에 의해 N-글리코실화 부위가 선택적으로 제거되었으나 잔여 0-결합 탄수화물을 함유하는 Asn119, Ala186 및 Asn450을 갖는 t-PA 변이체들은 생체내 분해 분석(lysis assay)에 있어서 색소종 t-PA보다 약 2배 강력한 것으로 나타났다. 1987년 6월 10일 공개된 EPO공고 제225,286호 참조.

t-PA의 449 위치에서 아르기닌을 제외한 임의의 아미노산으로 대체하여 글리코실화 부위를 변형시킨 것 뿐만 아니라 Arg275의 변형 또는 -3 내지 91 영역의 결실 역시 기재되었다. 1987년 8월 13일 공개된 WO 제87/04722호 참조. t-PA의 448 위치에서 아미노산 치환이 글리코실화를 방지하는데 바람직한 것으로서 교시되었다. 1988년 12월 28일 공개된 EPO 공보 제297,066호 참조. 448-450 위치의 변형 및 N-말단의 1-82 아미노산의 결실의 조합이 1989년 1월 12일 공개된 WO 제89/00191호에 의해 개시되었다. 추가로, 유로키나아제를 Asp302-Ser303-Thr304의 영역에서 변형시켜 글리코실화를 방지하였다. 1989년 1월 18일 공개된 EPO 공보 제299,706호 참조.

그러나, 글리코실화 부위의 변형, 및 특히 117번 아미노산에서의 변형은 추가로 변형된 순환성 반감기 형태 및/또는 피브린 결합 특성을 초래할 수도 있는 변화된 용해도 특성을 갖는 분자를 항상 초래하는 것으로 보인다. 1987년 9월 23일에 공개된 EPO 특허 공보 제238,304호 참조.

t-PA의 성장 인자 도메인을 결실시킬 경우, 생성된 변이체는 반 존네벨트 등 [A.J. Van Zonneveld et al., Thrombos. Haemostas., 54(1) (1985)]에 의해 보고된 바와 같이 여전히 활성이며 피브린에 결합된다. 또한 성장 인자 도메인에 있어서 여러가지 결실이 특허 명세서에 기재되었다. EPO 공보 제241,209호 (des-51-87), EPO 공보 제241,208(des-51-87 및 des-51-173), PCT 제87/04722호 (N-말단 1-91의 모두 또는 일부의 결실), EPO 공보 제231,624호 (성장 인자 도메인 전부의 결실), 및 EPO 공보 제242,836호 및 일본 특허 출원 공개 제62-269688호 (성장 인자 도메인의 일부 또는 전부가 결실됨) 참조.

t-PA는 크링글 1 도메인의 영역 및 성장 인자 도메인에서 모두 변형되어 증가된 순환성 반감기를 초래할 수 있음이 나타났다. 1987년 10월 14일 공개된 EPO 특허 공보 제241,208호 참조. 아미노산 51 및 87 사이의 이들을 포함한 영역을 t-PA로 부터 결실시켜 혈장으로 부터 낮은 정화율을 갖는 변이체를 초래하였다. 브라운 등의 (Brown et at.), J. Biol. Chem., 제263권 : 1599-1602페이지 (1988년) 참조. 또한, t-PA는 생물학적 부작용이 없이 특정 아미노산 잔기의 결실 또는 1개 이상의 아미노산의 다른 아미노산으로 치환에 의해 성숙한 천연 t-PA 의 67 내지 69번 아미노산의 영역을 변형시킬 수 있다. 1987년 10월 7일 공개된 EPO 특허 공보 제240,334호 참조.

273-527번 아미노산을 포괄하는 t-PA의 부위를 사용한 t-PA/유로키나아제의 하이브리드 역시 기재되었다 1988년 11월 9일 공개된 EPO 제290,118호 참조.

d296-302 t-PA, R304S t-PA, 및 R304E t-PA와 같은 프로테아제 도메인이 변형된 인체 t-PA의 세르핀-내성 변이체들이 메디슨 등 (Madison et al.)의 Nature, 제339권 : 721-724페이지 (1989)에 기재되었다. 또한 동일한 잡지에 있어서 다그머 링게(Dagmar Rinse)에 의한 동반 논문을 참조 바람.

플라스미노겐 및 활성제 이것의 제2세대 유도체에 관한 일반적인 고찰을 헤리스(Harris), Protein Engineering, 제1권: 449-458페이지 (1987년)에서 발견할 수 있다. t-PA의 변이체에 관한 기타의 고찰은 파네코에크 등(Pannekoek et al., Fibrinololysis, 제2권; 123-132페이지 (1988) 및 로스 등 (Ross et at.), Annual Reports in Medicinal Chemistry, 23권, 제12장 (1988년) 등에 기재되었다.

상기 문헌들은 보다 새롭고, 여러가지 관점에서, 보다 우수한 t-PA를 용이하게 얻을 수 있는 증거를 제공하긴 하나, 응해되어야만 하는 응혈 부위에 도달하였을 때만 활성화되는 t-PA분자에 대해서는 현재까지 기재된 바 없다. 현재까지 t-PA분자는 단일사슬형이거나 이중사슬형인 경우에도 피브린 및(또는) 혈장 단백질 또는 전혈 존재 하에 활성화된다. 피브린 존재 하에 그의 단일사슬형에서 잘려서 이중사슬형으로 완전히 활성화되는데 필요로 하는 효소원성 t-PA를 갖는 것이 바람직하다. 이와 같은 변이체 분자는 과다 출혈과 같은 부작용이 거의 없는 것으로 보이며 또한 피브리노겐이 적은 특성을 가지므로, 유착체 형성의 예방 뿐 아니라 심장맥관 질병 및 혈관의 혈전 교합으로부터 유발되는 기타 증상의 치료에 있어서도 의학적으로 중요한 새로운 별법을 제공한다.

또한, 야생형 t-PA에 비해, 피브리노겐 자극(또는 혈장 자극)작용보다는 더 높은 피브린 자극(또는 혈병 자극) 작용을 갖는 t-PA 분자, 다시 말하면 피브린(또는 혈병) 특이성인 t-PA 분자를 제공하여, 혈병 부위에서만 작용하고 전신에서 작용하지 않는 것이 바람직하다.

따라서, 본 발명의 목적은 치료 및 제약 특성이 개선된 효소원 및(또는) 피브린 특이성 t-PA 분자를 제공함에 있다.

또다른 목적은, 응혈 부위에서만 활성이며 또한 기타 다른 약제에 비해 더욱 유용한 응혈용해제를 사용할 수 있는 증상의 치료를 제공하는 것이다.

이들 및 기타의 목적은 당업계에 통상의 숙련된 자들에게는 명백할 것이다.

이들 목적은 플라스민에 의한 절단시 조직 플라스미노겐 활성제(t-PA)의 효소 활성형으로 전환가능한 t-PA 효소원을 제공함으로써 성취된다. 다른 일면으로는, 본 발명은 야생형 t-PA와 비교해볼 때 t-PA의 프로테아제 영역 내 부위(들)에서 변형 아미노산을 갖는 t-PA 변이체를 제공하며, 이러한 변형은 대응하는 야생형 t-PA에 비해 변이체 효소원을 부여한다.

보다 구체적인 바람직한 실시 태양에서는, t-PA가 인체 t-PA이고, 예컨대 대응하는 야생형 t-PA의 305번 위치의 페닐알라닌에 대해 히스티딘으로의 치환과 같이 변형이 305 부위에서 일어난다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 효소원 및 상기 변이체를 암호화하는 DNA 서열, 형질전환 숙주 세포에서 DNA 서열을 발현할 수 있는 복제 가능한 발현 벡터, 및 이들 벡터로 형질전환시킨 미생물 및 세포 배양체에 관한 것이다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 하기 (a) 및 (b)로 이루어진 방법을 제공한다.

(a) 아미노산 변이를 t-PA의 프로테아제 도메인으로 도입시키는 단계,

(b) 이와 같이 하여 얻은 t-PA 변이체임을 특징으로 하는 효소원을 선별하는 단계.

다른 일면으로, 본 발명은 효소원 활성, 피브린 특이성, 또는 혈장 응집 특이성 중 1개 이상의 생물학적 활성을 가지며, 또한 야생형 t-PA에 대해 프로테아제 도메인에 아미노산 변형이 있고, 이 변형이 상기 생물학적 활성에 관계되나 단, 270-280, 448-450 및 502-527 영역에서의 변이는 제외된 것이 특징인 인체 t-PA 변이체를 제공한다. 바람직하기로는, 상기 변이체는 변형이 치환에 의한 것이다.

다른 일면으로, 본 발명은 (a) 아미노산 변이를 조직 플라스미노겐 활성제 (t-PA)의 프로테아제 도메인으로 도입시키는 단계, (b) 이와 같이 제조된 t-PA 변이체 중, 효소원 활성, 피브린 특이성, 또는 혈장 응집 특이성 중 1 이상의 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 것을 선별하는 단계로 이루어진 방법을 제공한다.

또다른 실시태양에서, 본 발명은 상기 변이체를 암호화하는 DNA 서열 및 복제가능한 벡터 및 이들로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 제약상 허용되는 담체와 혼합시킨 치료 유효량의 효소원 또는 본 발명의 변이체로 이루어진 혈관계 질병 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한 제약상 허용되는 담체와 혼합시킨 치료 유효량의 효소원 또는 본 발명의 변이체로 이루어진 피브린 침착, 유착체 형성 또는 재형성을 방지하는 조성물도 포함된다.

다른 실시태양에서, 본 발명은 적합한 상기 조성물 치료 유효량을 포유류에게 투여하는 것으로 되는 포유류의 혈관계 질병의 치료법을 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 적합한 상기 조성물 유효량을 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 부위에 투여하는 것으로 되는 피브린 침착, 유착 형성, 또는 유착 재형성을 방지하기 위한 포유류 치료법을 제공한다.

본 발명의 제1 일면은 그 자체로 성공적인 특정 연구에 기초한다. 이들 연구들은 특정 t-PA 분자들이 플라스민에 의해 분해되는 피브리노겐 단편과 같이, t-PA 활성 자극제 존재 하에서 효소원이므로, 통상 혈장에서는 피브리노겐 활성이 없다가 혈병 부위에서 플라스민에 근접하게 되면 활성화될 수 있음을 입증하는 것 들이다. 그러므로, 상기 효소원은 특정하게 국소 혈병 치료의 필요에 따라 활성화된다. 본 발명의 효소원은 피브리노겐이 거의 없는 것으로 예측되며, 비 효소원인 그 상대물보다 높은 투여량에서 일반적으로 유용하기 때문에, 용혈이 보다 빠르고 보다 많은 용혈을 초래한다.

본 발명의 제2 일면은 보다 피브린(또는 혈장 응고) 특이성이므로 응고 부위에서 변형되지 않은 t-PA보다 더 우선적으로 작용하는 t-PA 분자를 얻는 것이다.

제1도는 5개 도메인의 위치, 이황화 가교 및 분자가 이사슬형 분자로 잘리는 활성 부위를 나타내는 t-PA의 1차 구조를 나타낸다.

제2도 및 제3도는 pCISt-PA를 제조하는 적합한 방법과 함께 그의 주요 제한 효소 절단 부위도 표시되어 있다.

제4도는 p7-1H을 제조하는 적합한 방법과 함께, 그의 주요 제한 효소 절단 부위도 표시되어 있다.

제5도는 t-PA 농도 10ng/ml에서 주된 단일사슬형 F305H(폐쇄 삼각형), 이중사슬형 F305H(이중선을 갖는 폐쇄 원), 단일사슬형 야생형 t-PA(폐쇄 사각형), 이중사슬형 야생형 t-PA(폐쇄 다이아몬드형), 및 단일사슬형과 이중사슬형 야생형 t-PA의 혼합물(개방 삼각형)과 피브린의 결합을 나타낸다.

제6도 내지 제9도는 플라스민 분해 피브리노겐 존재하에 주된 단일사슬 야생형 t-PA(제6도), 이중사슬 야생형 t-PA(제7도), 주된 단일사슬형 F305H t-PA(제8도), 이중사슬형 F305 t-PA(제9도)에 의한 플라스미노겐의 플라스민으로의 전환 역학을 나타낸 그래프이다. 4각형, 선 및 원은 분석 완충액 중의 여러가지 농도의 플라스미노겐 및 t-PA를 나타낸다.

본 명세서에서 사용한 바와 같이, 인체 조직 플라스미노겐 활성제, 인체 t-PA 및 t-PA라는 용어는 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시킬 수 있는 프로테아제 도메인으로 이루어진 2개의 기능 영역과, 피브린 결합에 관련되는 것으로 여겨지는 N-말단 영역을 갖는 사람의 외인성(조직형) 플라스미노겐 활성제를 나타낸다. 그러므로 이러한 3종의 용어는 전체 서열의 일부로서 이러한 기능성 도메인을 함유한 폴리펩티드를 나타낸다. t-PA는 예컨대, 재조합 세포 배양계에 의해, 프로테아제 부분 및 t-PA 부위로 이루어진 생활성(bioactive) 형태, 또는 그렇지 않으면 천연의 t-PA원 형태로 적합하게 제조된다. 천연의 대립형질 변이체가 존재하며 또한 이들은 전체 서열 중의 아미노산 차이에 의해 입증되는 바와 같이 개별적으로 발생한다.

본 명세서에서 사용된 바와 같이, 야생형 t-PA라는 용어는 미합중국 특허 제4,766,075호에 보고된 cDNA에 의해 암호화되는 t-PA를 의미한다. 이와 같이, 암호화된 t-PA는 293 또는 294 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포를 포함해서, 임의의 천연 원 또는 재조합 발현계로 부터 얻은 t-PA분자가 적합하다.

프로테아제 도메인이라는 용어는, 성숙형의 야생형 t-PA의 아미노산 264에서 아미노산 527까지를 포함한 영역을 나타낸다.

t-PA를 나타내는데 사용된 효소원, 효소원성 및 효소원 활성이라는 용어는 하기의 정의 중 1개 또는 2개 모두를 충족시켜야 한다. 그 첫번째로, 이들 용어는 플라스민 존재하에서와 마찬가지로 플라스민 분해 피브리노겐 존재 하에서 t-PA가 단일사슬형에서 이중사슬형(효소적으로 활성임)으로 잘려서 하기 분석 조건하에서 그의 효소 활성을 증가되는 것을 의미한다.

플라스미노겐 단편 존재하에, 본 발명에서 정의한 바와 같이 t-PA(효소원)의 단일사슬형은 하기 분석법으로 측정했을 때 야생형 이중사슬 t-PA 보다는 덜 활성이며, 또한 단일 사슬형에서 이중 사슬형으로 완전한 전환을 초래하는 농도의 플라스민에 노출되어 활성화 될 때에는 효소적으로 보다 활성인 형태로 전환된다. 일반적으로, 단일사슬형의 활성은 대응하는 이중사슬형 활성의 50% 미만, 바람직하게는 20% 미만, 더욱 바람직하게는 10% 미만이며, 이중사슬형으로 잘리게 되면 야생형 이중사슬 형태의 활성의 약 20 내지 약 100%까지도 증가되며, 바람직하게는 적어도 50% 이상이 증가된다.

변이체의 효소 활성은 하기 실시예 I의 분석법에 따라, 피브리노겐 단편 존재 하에서 크로모겐성 플라스민 기질 S-2251을 사용하여 플라스미노겐이 플라스민으로 전환되는 역학을 결정함으로써 분석한다.

효소원의 제1정의에 있어서, 효소원은 상기 조건 하에서 플라스민 생성에 있어서, 현저한 지연을 보이는 것으로, 따라서 A4O5 있어서의 증가에서는 시간에 대해 그래픽했을 때 시간이 지남에 따라 선형인 역학 관계를 나타낸다. 시간 역학에 관하여는 W. 니우벤후이젠, M. 포스쿠일렌, D.트라아스, B. 회게-데 노벨, J.H.페르하이옌의 Fibrinogen-Structural Variants and Interactions, A. 헨쉔, B. 헤젤, J. 맥도나우, T. 살덴 편집 (1985), 제331-342페이지에 기재되었다. 어떠한 한 이론에 한정되는 것은 아니나, 이러한 효과는, 단일사슬형에서 이중사슬형으로의 플라스민 촉매 전환에 의해 t-PA효소원의 활성화로 유도되는 것에 기인하는 것으로 생각된다. 이것은 효소원 t-PA의 야생형 단일사슬 t-PA, 야생형 이중사슬 t-PA 및 이중사슬형에 대한 분석 초기로부터 관찰된 선형 역학과는 대비된다.

제2 정의인 또다른 정의로는, 효소원은 구체적으로, 효소 활성 분석에서 야생형 재조합 t-PA(rt-PA) 보다는 단일사슬형과 이중사슬형 사이의 활성의 차가 더 큰 t-PA 분자를 의미한다. 효소원의 활성차는 야생형 rt-PA의 것보다 적어도 약 1.5배인 것이 바람직하다. 이러한 활성차는 야생형 rt-PA에 대하여 단일사슬형의 활성을 이중사슬형의 것보다 현격히 감소시키거나, 또는 야생형 rt-PA에 대해 이중사슬형의 활성을 단일사슬형의 것보다 현격히 증가시키거나, 또는 상기 효과를 조합함으로서 얻을 수 있다. 야생형 t-PA의 효소원 특성은 로스칼조(Loscalzo)의 J. Clin. Invest., 제82호, 제1391-1397페이지(1988년) 및 랜비 등 (Ranby et al.)의 Thrombosis Research, 제27호, 제175-183페이지 (1982년)에 기재되어 있다.

피브린 특이성이라는 용어는 단일사슬형 또는 이중사슬형의 S-2251 분석에서 피브리노겐 의존성 특이 활성에 대한 피브린 의존성 특이 활성의 비가 야생형 rt-PA 보다 더 높은, 바람직하게는 적어도 1.5배를 나타내는 변이체의 활성을 의미한다.

혈병 특이성이라는 용어는 단일사슬형 또는 이중사슬형의 S-2251 분석에서 혈장 의존성 특이 활성에 대한 혈병 의존성 특이 활성의 비가 야생형 rt-PA 보다 더 높은, 바람직하게는 적어도 1.5배를 나타내는 변이체의 활성을 의미한다.

일시적 발현계라는 용어는 일시적으로, 다시 말하면 안정하지 않은 방식으로 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 발현하는 t-PA 변이체 암호화 벡터로 감염시킨 세포를 함유하는 세포 배양체를 의미한다. 이러한 세포들은 일시적 발현이 가능한 것으로 보인다.

본 발명의 변이체에 대해서는 t-PA의 1차 구조를 설명하는 제1도를 참조하기 바란다.

제1도에서, 환에 표시된 글자는 아미노산을 나타내는 1문자 아미노산 기호이고, 사슬 사이의 연결선은 디술피드 가교를 나타내며, 개방 환은 글리코실화 부위를 나타내며, F, GF, K1, K2 및 SP는 각각 핑거, 성장 인자, 크링글 1, 크링글 2 및 세린 프로테아제 도메인을 나타낸다.

본 명세서에 기재된 t-PA 변이체를 간단히 나타내기 위하여, 숫자들은 성숙 t-PA의 추정된 아미노산 서열을 따라 위치한 아미노산 잔기(위치)를 나타내는 것이다(유럽 특허 공개 제93,619호). 아미노산 표시는 하기와 같이 아미노산의 일분자 알파벳을 사용하였다.

본 발명의 치환 변이체를 나타내는 방법은 글자 뒤에 숫자를, 그 뒤에 다시 글자를 써서 나타낸다. 첫번째 (가장 왼쪽의) 글자는 야생형 성숙 t-PA의 아미노산을 나타낸다. 숫자는 아미노산 치환이 일어나는 아미노산 위치를 의미하고, 두번째 (오른쪽) 글자는 야생형 아미노산을 치환하는데 사용된 아미노산을 나타낸다. 삽입 변이체를 나타내는 것은 문자 i 다음에 삽입이 시작되기 전 야생형 성숙 t-PA에서의 잔기 부위를 나타내는 숫자에 이어 이 숫자가 포함된 삽입을 나타내는 1개 이상의 아미노산 대문자가 이어진다. 결실 변이체의 표시는 문자 d 다음에, 결실의 시작 부위의 숫자 내지 결실 종료 부위의 숫자로 이어지며, 이러한 위치는 야생형 성숙 t-PA에 근거한다. 다중 돌연 변이는 이들을 해독하기 편리한 방법으로 쉼표를 찍어 분리시킨다.

명명법의 예는 다음과 같다. 즉, 야생형 t-PA의 305 위치의 페닐알라닌이 히스티딘 잔기로 치환된 치환 변이체는 F305H로 표시한다. 296-299 위치의 KHRR 이 AAAA로 연속치환된 치환 변이체는 K296A, H297A, R298A, R299A로 표시한다. 시스테인 및 발린이 야생형 t-PA의 305 위치 다음에 삽입되는 삽입 변이체는 i305CV로 나타낸다. 300에서 305 위치의 아미노산이 야생형 성숙 t-PA에서 결실되는 결실 변이는 d300-305로 나타낸다. 't-PA'는 각 변이체 다음에 표기한다.

본 발명의 바람직한 효소원 군은 야생형 t-PA의 305 위치 주변에서 치환, 결실 또는 삽입이 일어난 것들이다. 이들 변이체는 대응하는 야생형 t-PA의 305 위치에서 페닐알라닌 이외의 아미노산을 갖는 것을 포함한다. 보다 바람직하게는, 이러한 변이체들은 305 위치에서 수소 결합의 수소 공여체로서 작용할 수 있거나 또는 작용하는 측쇄를 갖는 아미노산을 갖는 것으로, 예컨대 히드록실기 또는 질소 원자를 함유하는 측쇄를 갖는 것이다. 더욱 바람직하게는, 이러한 아미노산은 아르기닌, 리신, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘이며, 가장 바람직한 것은 히스티딘이다. 이러한 유형의 효소원 삽입 변이체로 바람직한 것은 304 또는 305 위치의 아미노산 뒤에 히드록실기 또는 질소 원자를 함유하는 측쇄와 같이, 수소 결합의 수소 공여체로 작용할 수 있거나 작용하는 측쇄를 갖는 아미노산, 예컨대, 아르기닌, 리신, 티로신, 아스파라긴, 글루타민 및 히스티딘, 가장 바람직하게는 히스티딘과 같은 아미노산이 1개 이상, 바람직하게는 1개가 삽입된 것들이다. 바람직한 효소원 결실 변이체로는 야생형 t-PA의 297-305에서 누락이 일어난 것으로, d297 t-PA, d298 t-PA 등을 포함해서, d297-299 t-PA 또는 d297, d305 t-PA와 같은 혼합 형태도 포함된다.

상기 효소원 변이의 구체적인 실례는 다음과 같다.

및 T252R 또는 그의 N184S 유사체 또는 그 혼합물 또는 그의 조합.

(프로테아제 도메인의 변화 이외의 변화는 하기에 더 설명한다).

이중에서도 보다 바람직한 효소원 변이체들은 하기와 같다.

보다 바람직한 효소원의 제1군의 변이체는 F305H t-PA; F305T t-PA: F305N t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; dl-44, F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA이고, 가장 바람직한 것은 F305H t-PA이다.

선택적으로 피브린 (또는 혈병) 특이성이거나 또는 추가로 이러한 특이성을 갖는 변이체군 뿐아니라, 본 명세서의 효소원의 또다른 바람직한 군은 하전된 아미노산 측쇄를 갖는 것으로 동정된 프로테아제 도메인의 작은 영역에서 1종 이상의 변이를 갖는 변이체로서, 이들 영역 및 이들 영역에 근접한 부위는 t-PA의 여러가지 활성에 영향을 미치는 기타 물질과 t-PA 사이의 상호 작용과 관련될 수 있다.

이러한 방법에 의해 활성을 시험하기 위해 동정된 영역은 대응하는 야생형 t-PA의 267, 283-287, 296-299, 303-304, 322, 326-327, 331-332, 339-342, 347-351, 353-356, 360-362, 364-366, 369-371, 378-383, 387-392, 400-405, 408, 410, 416-418, 426-430, 432-434, 440, 445-449, 449-453, 460-462, 471- 472, 477, 487-489, 505-506, 513, 519-523 및 523-526이다.

이들 영역 중 1개 이상 또는 이들의 서브유니트들을 변형시켜 목적하는 생물학적 특성(들)이 얻어졌는가를 결정한다.

상기 하전된 잔기 (Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)는 컨닝햄(Cunningham) 및 웰스(Wells), Science, 244:1081-1085 (1989)에 기재된 알라닌 스캐닝(Scanning) 돌연변이 유발과 같은 공지된 기술을 사용하여 적합하게 동정되며, 중성 또는 음전하의 아미노산으로 대체시킴으로써 세포의 내부 또는 외부의 수용성 환경과 상기 아미노산의 상호 작용에 영향을 미친다.

상기 제2의 바람직한 효소원 및 피브린 특이성 분자 중에 존재하는 것으로 밝혀진 돌연변이체는 대응하는 야생형 t-PA의 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-247+429-430, 432-434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 및(또는) 477 위치에 대체된 아미노산이 존재하는 것들이며 여기서 +는 표시된 위치에서만 대체를 나타내고 -는 표시된 모든 위치에서의 대체를 나타낸다.

알라닌 스캐닝(Scanning) 돌연변이 유발에 있어서, 분자에 반대 전하를 부여하기 보다는 야생형 t-PA의 대응하는 아미노산의 전하를 중성화하는 것으로 아미노산을 대체하는 것이 바람직하다. 임의의 소수성, 필수적으로는 비하전 또는 반대로 하전된 아미노산을 사용할 수 있으며, 예로서, 알라닌, 글리신, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 발린, 류신, 이소류신, 페닐알라닌 또는 티로신이 바람직하다. 이들 중 발린, 류신 및 이소류신과 같은 좀 더 큰 아미노산들보다는 알라닌, 세린 및 트레오닌과 같은 작은 아미노산들이 바람직하다. 아스파르트산 또는 글루탐산과 같은 하전된 아미노산은 덜 바람직하다.

더욱 바람직한 대체용 아미노산으로는 알라닌, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 글루타민, 페닐알라닌 또는 티로신이 있고, 더욱 바람직하기로는 알라닌, 세린 또는 트레오닌이 있다. 알라닌은 베타 탄소 상의 측쇄를 제거시키므로 야생형 t-PA 분자의 주 사슬 배치를 덜 변형시키기 때문에 본 목적에 가장 바람직한 아미노산이다. 또한, 알라닌은 가리워진 위치와 노출된 위치 모두에서 자주 발견된다. Creighton, T.E., in The Proteins (eds. W.H. Freeman Co., N.Y.); Chothia, C. (1970) J. Mol. Biol., 150:1)참조).

효소원 또는 피브린(또는 혈장 응고체) 특이성 변형체 중에서 이러한 후자의 분류에 속하는 효소원 또는 피브린 (또는 혈병) 특이성 변이체로는 변이체 D365A t-PA, R462L t-PA, A473S t-PA, d296-304 t-PA, d296-302 t-PA, R298E t-PA, R299E t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA, d296-299 t-PA 및 K296E, R298E, R299E t-PA를 제외한 t-PA의 프로테아제 도메인 내에서의 변형을 포함하는 것들이 바람직하다.

더욱 구체적으로는, 이들은 대응하는 야생형 t-PA의 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 331, 332, 339, 342, 347, 348, 349, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 416, 417, 418, 426, 427, 429, 430, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 또는 477 또는 이 치환체들의 조합인 위치에서 1개 또는 2개 이상의 치환체를 갖는 것들이다.

프로테아제 도메인 변이체는 대응하는 야생형 t-PA의 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432+434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 및 477의 위치에서 치환체를 갖는 것이 더욱 바람직하며 여기에서 +는 이들 사이의 위치가 아닌 단지 지정된 위치에서의 변형을 나타내고, -는 이들 사이의 부위를 포함하여 지정된 모든 위치에서의 변형을 나타낸다.

효소원 또는 피브린 (또는 혈병) 특이성 변이체 중에서 후자의 분류에 속하는 프로테아제 도메인 변이체는 R267A t-PA, D283,H287A t-PA, K296A, H297A,R298A,R299A t-PA, E303A, R304A t-PA, H331A,H332A t-PA, R339A,R342A t-PA, E347A,E348A,E349A,K351A t-PA, D364A,D365A,D366A t-PA, E408A t-PA, E410A t-PA, K416A,H417A,E418A t-PA, E426A,R427A,K429A,E430A t-PA, H432A, R434A t-PA, R440A t-PA, H445A,R449A t-PA, R449A,D453A t-PA, D460A,R462A t-PA 및 D477A t-PA이 더욱 바람직하다.

이들 중, 가장 바람직한 치환은 야생형 t-PA의 296-299의 위치에 존재하는 각각의 잔기 대신에 알라닌 잔기로 치환된 즉 K296A,H297A,R298A,R299A t-PA 이다.

효소원 또는 피브린 특이 활성을 나타낼 수 있는 바람직한 삽입 변이체는 296, 297, 298 및/또는 299 위치의 아미노산 이후에 1개 또는 2 이상의 아미노산을 삽입시킨 변이체이다. 또한, 이러한 목적을 위하여 티로신, 아스파라긴, 리신, 아르기닌 또는 글루타민 중의 하나를 삽입한 프로테아제 도메인 변이체가 바람직하다.

천연 t-PA 분자의 프로테아제 도메인(아미노산 서열 264-527)내에서 1개 이상의 아미노산 변형 (결실, 치환 또는 삽입, 치환이 바람직함)을 가진 다른 변이체는 하기 제공되는 1개 또는 그 이상의 선별 시험을 이용하여 야생형 t-PA와는 동일한 효소원 성질을 나타내는 것으로 알려진다.

본 발명의 t-PA 변이체는 효소원 및/또는 피브린 (또는 혈병) 특이성을 나타내기 위하여 1개 그 이상의 프로테아제 도메인 부위에서 천연 서열로부터 변형시킨 것 이외에도 또한 분자의 특정한 성질을 개선시키기 위하여 천연 서열의 다른 영역에서 임의로 잔기를 치환, 결실 또는 삽입시킨 것을 함유하는데, 이러한 변화는 이중사슬형의 t-PA를 단일사슬 형태로 절단시키는 것을 방해하거나 또는 다른 식으로 본 발명의 프로테아제 도메인 내에서의 변형에 의해 분자에 부여되는 목적하는 생물학적 성질을 변경시키지 않아야한다. 이러한 기타 도메인들에서의 바람직한 변형은 제1의 형태의 가장 바람직한 효소원 변이체의 목록들로 상기 제공된바 있다.

예를 들면, 본 발명의 변이체는 핑거(finger) 도메인, 성장 인자 도메인 및/ 또는 크링글 1(kringle) 도메인의 적어도 한부분이 적절하게 결여되고 또는 184번 아미노산 주변의 글리코실화 부위에서 가능한 글리코실화능이 결여되고, 크링글 1 또는 2의 추정되는 리신 결합 부위에서 변형 아미노산을 적절하게 포함한다.

따라서, t-PA의 피브린 결합은 t-PA의 크링글 2 도메인의 추정되는 리간드 결합 포켓(pocket)의 반대편 모서리 상에서 양 또는 음전하를 가진 아미노산 잔기의 적절한 치환에 의해 변형시킬 수 있는데, 보존되거나 증가되는 것이 가장 바람직하다. 본 발명의 변이체는 일반적으로 하기 상세히 설명되는 부위 특이성 돌연변이 또는 삭제(削除)/연결 기술로 제조한다.

이러한 변이체의 구체적 예로는, 제1 내지 제44의 아미노산이 결여된 분자(d1-44로 표시함) 및 제184의 위치에 아스파르트산을 함유한 분자(N184D로 표시 함)가 있다. 제1 내지 제44의 아미노산이 결여된 변이체는 WO 제89/00197호에 더욱 상세히 기재되어 있다.

상기 모든 변이체는 이러한 변형이 본 발명에 기술된 효소원 및/또는 피브린 (또는 혈병) 특이성에 대한 기준을 만족시키는한, 분자 내의 다양한 다른 영역이 임의로 변형된 것이다. 그러한 변형은 예를 들면, 다음을 포함한다.

1. 예를 들면, 약 92-179번 아미노산 결실인 크링클 1 변형

2. 크링글 2 변형, 예를 들면 약 174-261의 아미노산 결실이거나, 약 205-215의 아미노산 부위에서의 결실, 특히 210-213의 아미노산 부위에서의 결실 및/또는

3. 약 244-255의 아미노산, 특히 제252의 아미노산 또는 그것의 위치 및/또는

4. 약 233-242의 아미노산, 특히 제236-제238의 아미노산, 및/또는

5. 184의 아미노산과 같은 공지의 글리코실화 위치 및/또는

6. 성장 인자 도메인 내에서의 글리코실화. 간략하게, t-PA분자는 성장 인자도 메인, 바람직하게는 67의 위치에 있는 티로신이 아스파라진 잔기로 대체된 제67-제69 부위 내에 N- 또는 O-연결 글리코실화되어 t-PA 분자의 반감기를 변경시킨다.

이러한 변형 중 많은 것들은 천연 t-PA에 비교할 때에 정화율 및 피브린 결합을 뚜렷하게 변경시킬 수 있다. 당업계의 숙련자들은 적절한 분석에 의해 특정 상황에서 요구되는 각각의 변이체의 최적의 성질을 결정할 수 있을 것이다.

상기 서열 변형에 영향을 미치는 천연의 분자내의 적절한 아미노산을 변환시키거나 또는 삽입시키는 변형은 부위 특이성 돌연변이 또는 관련 단백질을 암호화하는 DNA 내로 적절한 서열을 결찰(ligaticn)시키는 것과 같은 하기한 바와 같은 당업계의 공지 기술로 이루어진다.

본 발명에 의한 t-PA 변이체의 제조는 앞서 제조된 단백질의 변이체 또는 비 변이체를 암호화하는 DNA의 부위 특이성 돌연변이에 의해 얻어진다. 부위 특이성 돌연변이는 목적하는 돌연변이의 DNA 서열을 암호화할 뿐만 아니라 충분한 크기의 프라이머 서열 및 횡단되는 연결부의 양면에 안정된 복합체를 형성시키도록 하는 서열의 복합성을 제공하는 충분한 수의 인접 뉴클레오티드를 암호화하는 특정 올리고뉴클레오티드 서열을 사용함으로써 제조된다. 전형적으로 변형되는 서열의 연결부의 양편 위에 약 5 내지 약 10개의 잔기를 가진 바람직하기로는 길이가 약 20 내지 25뉴클레오티드인 프라이머가 바람직하다. 일반적으로, 부위 특이성 돌연변이의 기법은 [안델만(Adelman) 등, DNA, 제2호, 제183페이지, (1983년)]와 같은 문헌에 예시된 바와 같이 당업계에 공지되어 있다.

쉽게 이해되는 바와 같이, 부위 특이성 돌연변이 기술도 전형적으로 단일 사슬 및 이중 사슬 형태로 모두 존재하는 파아지 벡터를 사용한다. 부위 특이성 돌연변이에 유용한 전형적인 벡터는 [메싱(Messing)등, Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, 에이. 왈톤(A. Walton) 편집, Elsevier, 암스테르담 소재 (1981년)]에 기재되어 있는 것과 같은 M13 파아지와 같은 벡터를 포함한다. 이러한 파아지는 상업상 구입이 용이하고, 그들의 용도는 당업계에 숙련된 자들에게는 일반적으로 공지되어 있다. 별법으로, 단일 사슬 DNA를 얻기 위하여 단일 사슬 파아지의 복제 원점을 함유하는 플라스미드 벡터 [Veira 등, Meth. Enzymol. 153:3(1987) 참조]를 사용할 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 부위 특이성 돌연변이는 그것의 서열 내에 관련된 t-PA를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 단일 사슬의 운반체를 우선 얻으므로서 수행된다. 목적 돌연변이 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 프라이머는 예를 들면, [크레아(Crea)등, Proc. Natl. Acad. Sci (USA). 제75호, 제5765페이지 (1978년)]에 기재되어 있는 방법과 같이 일반적으로 합성하여 제조한다. 이어서, 이러한 프라이머를 단일 사슬의 t-PA 서열 함유 벡터에 어닐링시키고 대장균 폴리머라제 I 클레나우 단편과 같은 DNA 중합 효소로 처리하여 돌연변이 함유 사슬의 합성을 완성시킨다. 이와 같이하여, 한 사슬의 천연 비 돌연변이 서열을 암호화하는 한 사슬 및 목적하는 돌연변이를 함유하는 제2 사슬로 된 이형 복합체를 형성한다. 이어서 이 이형 복합체 벡터를 사용하여 JM101 세포와 같은 적절한 세포를 형질 전환시키고³²p-표지화 돌연변이 유발 프라이머로 되는 방사능 탐침에의 혼성화를 통하여 돌연변이시킨 서열의 배열을 가진 재조합 벡터를 함유하는 클론을 선별한다.

이러한 클론을 선별한 후에, 돌연변이 t-PA 부위를 잘라내어, t-PA 제조에 적절한 벡터인 통상적으로 적절한 진핵 숙주의 형질전환에 사용되는 일반적인 형태의 발현 벡터 내에 위치시킬 수 있다. 본 발명에서는 장기간 안정한 t-PA 생산자의 제조를 위하여 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포 또는 293 [그라함(Graham) 등, J. Gen. Virol, 제36호, 젠59페이지(1977년)]을 바람직하게 사용하였다. 그러나, 특히 실험 목적을 위하여 단지 효소의 일시적인 생성이 요구되는 경우에 다수의 다른 세포 형태가 적절하게 사용되는 것이 공지된 것과 같이 본 발명은 CHO에 의한 생성에 제한되지 않는다. 예를 들면, 분석 목적을 위한 t-PA 변이체의 제조를 위한 용이한 시스템을 제공하는 293 세포를 사용하는 일시적인 시스템은 다음에 기재한다.

t-PA를 암호화하는 DNA 서열 중에 돌연변이를 일으키는 또 다른 방법은 t-PA를 암호화하는 DNA를 적절한 위치에서 제한 효소를 사용하여 분해시켜서 절단하고, 적절하게 절단된 DNA를 회수하고, 목적하는 아미노산 및 평활 말단(또는 폴리 링커를 사용하는 대신에 t-PA 암호화 DNA를 절단하는데 사용한 제한 효소를 사용하여 합성 올리고뉴클레오티드를 절단시켜 접착성 말단을 생성함)을 갖는 폴리링커와 같은 측면 영역을 암호화하는 올리고뉴클레오티드를 합성하고, 합성 DNA를 t-PA를 암호화하는 구조 유전자의 잔여부와 연결시키는 것을 포함한다.

차이니즈 햄스터 난소(CHO) 중의 발현이 궁극적으로 t-PA 제조에 바람직하다 하더라도, 본 발명의 벡터 및 방법은 광범위한 진핵 생물의 숙주 세포에 사용하는 것도 적합하다.

일반적으로, 물론, 원핵 세포가 발명에 유용한 DNA 서열의 최초의 클로닝 및 벡터를 설계하는데 바람직하다. 예를 들면, 대장군 K12 군주 294 (ATCC No. 31,446) 및 대장균 균주 W3110 (ATCC No. 27,325)가 특히 유용하다. 다른 적합한 미생물 균주는 대장균 B 및 대장균 X1776 (ATCC No. 31,537)과 같은 대장균 균주이다. 물론, 이러한 예는 제한적이라기 보다는 예시적이다.

또한, 원핵 세포도 발현에 유용하다. 바실루스 섭틸리스(Bacillus subtilts)와 같은 바실루스들(Bacilli) 및 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium) 또는 세라치아 마르세산스(Serratia marcesans) 및 다양한 녹농균 종과 같은 장내균류 뿐만 아니라 상기 언급한 균주는 유용한 발현 숙주 세포의 예들이다.

일반적으로, 숙주 세포 중에서 복제 가능한 것들로부터 유래한 복제단위 및 조절 서열을 함유하는 플라스미드 벡터는 이러한 숙주 세포와 관련된 숙주 중에서 사용한다. 벡터는 통상적으로 형질전판 세포로부터 표현형 선별을 제공할 수 있는 표식(marker) 서열 뿐만 아니라 복제 부위를 가지고 있다. 예를 들면, 대장균은 통상적으로 대장균 종으로부터 유래된 플라스미드인 pBR322를 사용하여 형질 전환시킨다 [볼리바(Bolivar) 등, Gene, 제2호, 제95페이지 (1977년) 참조]. pBR322는 앰피실린 및 테트라사이클린 내성 유전자를 함유하여 형질 전환시킨 세포를 동정하는데 용이한 수단을 제공한다. pBR322 플라스미드 또는 다른 미생물 플라스미드 또는 파아지는 또한 미생물 자체의 단백질의 발현을 위하여 미생물에 의하여 사용될 수 있는 프라이머를 함유하여야만 하거나 함유하도록 변형시켜야만 한다.

재조합 DNA제조에 가장 일반적으로 사용하는 프로모터는 β-락타마제 (페니실리나제) 및 락토오스 프로모터 시스템[창(Chang)등, Nature, 제375호, 제615페이지 (1978년), 이타쿠라(Itakura)등, Science, 제198호, 제1056페이지 (1977년), 고에델(Goeddel)등, Nature, 제281호, 제544페이지 (1979년)참조] 및 트립토판(trp) 프로모터 시스템 [고에델 등, Nucl, Acids Res, 제8호, 제4057페이지(1980년), 유럽 특허 출원 공개 제36,776호 참조] 및 알칼린 포스파타제 시스템 등이다. 이러한 것들을 가장 일반적으로 사용하는 반면에, 다른 미생물의 프로모터들이 발견되고 사용되어 왔으며, 그들의 뉴클레오티드 서열에 관한 세부 사항은 숙련자가 그들을 기능적으로 플라스미드 벡터에 연결시킬 수 있도록 발표되었다[시벤리스트 등 Cell, 제20호, 제269페이지 (1980년) 참조].

원핵 세포 이외에도, 효모와 같은 진핵 미생물도 본 발명에서 적합하게 사용된다. 다수의 다른 종류가 일반적으로 사용 가능하지만 진핵 미생물 중에서 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae) 또는 일반적인 빵 효모를 가장 일반적으로 사용한다. 예를 들면, 사카로마이세스 내에서의 발현을 위해서는 플라스미드 YRp7을 통상적으로 사용한다 [스틴취콤브(Stinchcomb)등, Nature, 제282호, 제39페이지 (1979년), 킹스만(Kingsman)등, Gene, 제7호, 제141페이지 (1979년), 트셈페르(Tschemper)등, Gene, 제10호, 제157페이지 (1980년)참조]. 이 플라스미드는 트립프토판 존재하에서 성장할 수 있는 능력이 결여된 돌연변이 된 효모(예, ATTC No. 44,076 또는 PEP4-1)[존스(Jones), Genetics, 제85호, 제12페이지 (1977년)]를 위한 선별 마커를 제공하는 trp1 유전자를 이미 함유한다. 또한, 효모 숙주 세포 게놈의 특성으로서 trp1 손상의 존재는 트립프토판의 부재 하에 성장함으로써 형질 전환을 판별하는데 효과적인 여건을 제공한다.

효모 벡터 내에서의 적절한 프로모터 서열은 3-포스포글리세레이트 키나아제의 프로모터 [히츠만(Hitzeman)등, J. Biol, Chem, 제255호, 제2073페이지 (1970년)] 또는 에놀라제, 글레세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카르복실라제, 포스포프락토 키나아제, 글루코오스-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오스포스 페이트 이소머라제, 포스포글루코오스 이소머라제 및 글루코키나아제와 같은 다른 당분해 효소[헤스(Hess)등, J. Adv. Enzymo Reg. 제7호, 제149페이지 (1968년) 및 홀랜드(Holland)등, Biochemistry 제17호, 제4900페이지 (1978년)참조]의 프로모터 유전자를 포함한다. 적합한 발현 플라스미드의 제조에 있어서, 이러한 유전자와 관련된 종결 서열을 또한 mRNA 폴리아데닐화 및 종결을 제공하도록 발현될 원하는 서열의 3' 말단의 목적하는 발현 벡터 내로 연결한다. 성장 조건에 의하여 전사를 조절할 수 있는 부가적인 장점을 갖는 다른 프로모터는 알코올 디히드로게나제 2, 이소시토크롬 C, 산 포스파타제, 질소 대사와 관련된 분해 효소 및 상기 글리세르알데히드-3-포스페이트 디히드로게나제 및 말토오스 및 갈락토오스 사용에 관련된 효소의 프로모터 등이다. 효모 내 복제 가능한 프로모터, 복제원점 및 종결 서열을 함유하는 모든 종류의 플라스미드 벡터가 적합하다.

미생물 이외에도, 다세포 생물로부터 유래된 세포의 배양체를 또한 숙주로서 사용할 수 있다. 원칙적으로, 이러한 세포 배양체는 척추 동물 또는 무척추 동물 배양체가 모두 사용될 수 있다. 그러나, 척추 동물 세포에 관심이 가장 크고, 척추 동물 세포의 증식(조직 배양)은 최근에는 통상적인 방법이 되었다 [Tissue Culture, Academic Press, 크루제(Kruse) 및 패터슨(Patterson) 편집 (1973년)참조]. 그러한 유용한 숙주 세포주로는 VERO 및 Hela 세포주, CHO 세포주 및 W138, BHK, COS-7, 293 및 MDCK 세포주가 있다. 이러한 세포에 대한 발현 벡터는 통상적으로(필요에 따라서) 복제원점, 필요한 리보좀 결합 부위와 연결된 발현하고자 하는 유전자 앞에 위치하는 프로모터, RNA 스플라이싱 부위, 폴리아데닐화 부위 및 전사 종결 서열을 함유한다.

포유류 세포에서의 사용을 위하여, 발현 벡터 상의 조절 기능은 가끔 바이러스로부터 제공된다. 예를 들면, 통상적으로 사용되는 프로모터는 폴리오마(polyoma), 아데노바이러스 2 및 가장 자주 사용되는 시미안 바이러스 40 (SV 40)으로부터 유래된다. SV4O 바이러스의 초기 및 후기 프로모터는 둘 다 SV40 바이러스의 복제원점을 함유하는 단편으로서 바이러스로 부터 용이하게 얻어지기 때문에 특히 유용하다[피어스(Fiers)등, Nature, 제273페이지, 제113호, (1978년)]. 바이러스 복제원점에 위치한 Hind III 부위로부터 Bgl I 부위를 향하여 펼쳐진 약 250bP 서열을 함유하기만 한다면 더 작거나 또는 더 큰 SV40 단편도 또한 적합하게 사용할 수 있다. 또한, 숙주 세포 내에서 복제되기만 한다면 목적하는 유전자 서열과 정상적으로 관련된 프로모터 또는 조절 서열을 사용하는 것이 가능하며, 종종 바람직하다.

복제원점은 전형적으로 SV 40 또는 다른 바이러스 (예, 폴리오마, 아데노, VSV, 및 BPV) 원으로부터 유래할 수 있는 외인성 원점을 포함하는 벡터의 제조 또는 숙주 세포 염색체의 복제 기작에 의하여 제공된다.

만족할 만한 양의 인체 t-PA가 세포 배양에 의하여 생산된다. 그러나, 제2의 암호화 서열을 사용한 조절은 더 나아가서 생성 농도를 향상시키도록 한다. 제2의 암호 서열은 메토트렉세이트(MTX)와 같은 외부적 조절 변수 인자에 의하여 영향을 받아서 MTX 농도의 조절에 의해 발현을 조절할 수 있는 디히드로폴레이트 리덕타제(DHFR)로 되어 있다.

변이체 t-PA 및 DHFR 단백질 모두를 암호화하는 DNA 서열로 되어 있는 본 발명의 벡터를 사용한 형질 감염용의 바람직한 숙주 세포의 선택에 있어서, 사용되는 DHFR 단백질의 형태를 고려하는 것이 적절하다. 야생형 DHFR 단백질을 사용할 경우, DHFR이 결핍되어 히포크산틴, 글리신 및 티미딘이 결여된 선택 배지에서 성공적인 형질 감염을 위한 마커로서 DHFR 암호 서열을 사용하도록 하는 숙주 세포를 선택하는 것이 바람직하다. 이러한 경우에 있어서의 적절한 숙주 세포는 DHFR 활성이 결여된 CHO 세포계로서 [우르라우브(Urlaub) 및 카신(Chasin), Proc Natl, Acad. Sci(USA) 제77호, 제4216페이지 (1980년)]에 기재된 방법으로 제조하고 증식시킨다.

한편, MTX에 대한 낮는 결합 친화성을 가진 DHFR 단백질을 조절 서열로서 사용한다면, DHFR-결핍 세포를 사용하는 것은 불필요하다. 돌연 변이체 DHFR이 MTX에 내성이 있기 때문에, 숙주 세포 그 자체가 MTX 만감성이라면 MTX 함유 배지를 선별 수단으로서 사용할 수 있다. MTX를 흡수할 수 있는 대부분의 진핵 세포는 MTX에 민감한 것이다. 그러한 유용한 세포계의 한 종류로는 CHO계인 CHO-K1(ATCC No. CCL 61)가 있다.

포유류 세포를 숙주 세포로서 사용한다면, 형질 감염은 일반적으로 [그라함(Graham) 및 반 데르 에브(Vander Eb), Virology, 제52호, 제546페이지, (1978년)]에 기재된 방법과 같이 인산 칼슘 침전 방법으로 수행한다. 그러나, 핵 주입(nuclear injection), 전기 천공법(electroporation) 또는 원형질체 융합을 또한 적합하게 사용한다. 효모를 숙주로서 사용한다면, 형질감염은 일반적으로[히넨(Hinnen), Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 제75호, 제1929페이지-제1933페이지 (1978년)]에 기재된 것과 같이 폴리에틸렌 글리콜을 사용하여 수행할 수 있다.

실제적인 세포벽을 함유한 원핵 세포를 사용한다면, 형질 감염을 위한 바람직한 방법은 [코헨(Cohen)등, Proc. Natl. Acad. Sci(USA) 제69호, 제2110페이지]에 의해 기재된 것과 같이 칼슘을 사용하는 칼슘 처리법이나 또는 보다 최근에는 전기 천공 방법이 더욱 바람직하다.

목적하는 암호화 및 조절 서열을 함유하는 적합한 벡터의 제조는 표준 결찰(ligation) 기법을 사용한다. 단리 플라스미드 또는 DNA 단편을 절단시키고, 재단하고 재연결시켜 목적 플라스미드를 형성하기에 바람직한 형태로 결찰된다.

절단은 적합한 완충액 내에서 제한 효소(또는 효소)를 사용하여 처리함으로서 수행한다. 플라스미드 또는 DNA 단편 약 1㎍을 약 20㎕의 완충 용액 중에 용해시킨 1 단위의 효소로 절단한다(특별한 제한 효소에 대한 적절한 완충액 및 기질의 양은 제조업자에 의하여 명시된다). 37℃에서 약 1시간 동안 배양시키는 것으로 충분하다. 배양 후에, 단백질은 페놀 및 클로로포름 추출로 제거하고, 핵산을 에탄올 침전으로 수용성 부분으로부터 회수시킨다.

비접착성 말단이 요구된다면, DNA 폴리머라제 I (클레나우)의 클레나우 단편 10 단위로 15℃에서 15분 동안 처리하여, 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올 침전시켜서 제조할 수 있다.

절단 단편의 크기별 분리는 [고에델등, Nucleic Acids Res., 제8호, 제4057페이지 (1980년)]에 기재된 방법과 같이 6% 폴리아크릴아미드 겔을 사용하여 수행한다.

결찰시에는 정확한 결찰을 위하여 적절하게 말단 재단시킨 요구되는 성분 거의 동물의 양을 DNA 0.5㎍ 당 T4 DNA 리가아제 10 단위를 사용하여 처리한다(절단된 벡터를 성분으로 사용한다면 세균의 알칼리성 포스파타아제로 전처리하여 절단된 벡터의 재결합을 방지한다.).

상기한 바와 같이, t-PA 변이체는 특정 돌연변이의 방법에 의해 바람직하게 생성된다. 본 발명의 실시에 유용한 변이체는 목적하는 돌연변이 DNA 서열 이외에 트랜스버젼(transversion)되는 돌연변이의 양면에 안정한 이중사슬을 형성시키기 위한 충분한 길이의 서열 및 서열 복합성을 제공할 수 있는 충분한 수의 인접 뉴클레오티드를 암호화하는 특정 올리고뉴클레오티드를 통하여 가장 쉽게 형성된다.

제조된 플라스미드의 정확한 서열을 확인하기 위한 분석을 위해, 결찰 혼합물을 사용하여 대장균 K12 균주 294(ATCC 31,446) 또는 기타 적합한 대장균 숙주를 형질전환시킨 후 성공적인 형질전환체들을 적절한 앰피실린 또는 테트라싸이클린 내성에 의해 선별하였다. 형질전환체로부터 플라스미드를 정제한 후 제한 효소 지도 작성법 및/또는 메씽 등[Messing et al., Nucleic Acid Res., 9:309 (1981)]의 방법 또는 맥삼 등[Maxam et al., Methods in Enzymology, 65:499 (1980)]의 방법에 의한 DNA 서열화에 의해 분석하였다.

DNA의 포유류 세포 숙주내로의 삽입 및 배지 중에서 안정한 형질전환체를 선별한 후, DHFR-단백질-암호화 서열의 증폭은 숙주 세포를 DHFR 활성의 경쟁적 저해제인 20,000-500,000nm 농도의 MTX의 존재 하에서 배양함으로서 행한다. 유효 농도의 범위는 물론 절대적으로 DHFR 유전자 및 단백질의 성질 및 숙주의 특성에 의존한다. 일반적으로 한정된 상하의 한계를 명확하게 확정할 수는 없다. 기타 폴산 동족체 또는 DHFR을 억제하는 기타 화합물을 적합한 농도로 사용하였다. 그러나 MTX 그 자체는 편리하고, 쉽게 입수할 수 있으며 효과적이다.

실시예를 간략하게 하기 위해서, 특정의 자주 인용되는 방법은 단축 어구로 나타내었다.

플라스미드는 소문자 P에 이은 문자 숫자식으로 나타냈다. 본 발명의 출발 플라스미드는 상업적으로 입수 가능하여 비제한적으로 일반인에게 입수가능 하거나 발표된 방법에 의하여 상기 입수 가능한 플라스미드로 부터 제조할 수 있다. 또한, 기타의 동등한 플라스미드는 당업계에 공지되었으며 통상의 지식을 가진자 들에게는 명백할 것이다.

DNA의 절단은 DNA의 특정 부위에서만 작용하는 효소로 DNA를 촉매적으로 절단하는 것을 의미한다. 이들 효소들은 제한효소라 하며 이들 각각에 대하여 특정한 부위를 제한 부위라 한다. 본 발명에서 사용된 여러가지 제한 효소들은 상업적으로 입수 가능하며 효소 공급자에 의해 설정된 바와 같은 이들의 반응 조건, 보조인자 및 기타의 조건을 사용하였다. 제한 효소는 일반적으로 약어로 표시되는데 이는 각각의 제한 효소가 처음으로 얻어진 미생물을 나타내는 대문자에 이은 기타의 문자 및 이어서 특정 효소를 표시하는 숫자로 표시되어 있다. 일반적으로, 플라스미드 또는 DNA 단편 약 1㎍은 약 20㎕의 완충액 중의 효소 약 2 단위와 함께 사용된다. 특정 제한효소에 대한 적절한 완충액 및 기질의 양은 제조업자에 의해 특성화되어 있다. 통상 37℃에서 1시간 동안의 인큐베이션 시간이 사용되나 공급자의 지침에 의해 다를 수도 있다. 인큐베이션 후, 페놀 및 클로로포름으로 추출하여 단백질을 제거한 후, 절단된 핵산을 에탄올 침전에 의해 수용성 분획물로 부터 회수한다. 제한 효소로의 절단후, 간혹 말단 5' 인산염을 세균의 알칼리성 인산효소로 가수분해하여 DNA 단편의 두 제한효소 절단된 말단이 고리화(circularizing)되거나 또는 폐쇄 루우푸를 형성하여 제한 부위에 다른 DNA 삽입이 불가능해지는 것을 방지한다. 단리 언급하지 않을 경우, 플라스미드의 절단에 이어 5' 말단의 탈인산화는 행하지 않는다. 탈인산화에 대한 방법 및 시약은 통상적인 것이다 (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloaing pp. 133-134 참조).

제한 절단물로부터의 주어진 DNA 단편의 회수 또는 단리는 전기 영동에 의한 폴리아크릴아미드 또는 아가로오스 겔 상에서 절단물의 분리, 그의 이동성을 공지된 분자량의 마커 DNA의 이동성과의 비교에 의한 목적 단편의 동정, 목적 단편을 함유한 겔 부분의 분리 및 DNA로 부터 겔의 분리를 의미한다. 이 방법은 일반적으로 공지되어 있다. 예컨대, 로운 등 (R. Lawn et al., 1981, Nucleic Acids Res, 2:6103-6114) 및 고에델 등 (D. Goeddel et al., 1980. Nucleic Acids Res. 8:4057) 참조 바람.

써어던(southern) 분석은 절단물 또는 DNA 함유 조성물 중의 DNA 서열의 존재를 알려진 표지된 올리고뉴클레오티드 또는 DNA 단편에 대한 혼성화에 의해 확인하는 방법이다. 본 발명의 목적을 위하여, 달리 기재하지 않는 한, 써어던 분석은 서어던 (E. Southern, 1975, J. Mol. Biol. 98: 503-157)의 방법에 의한 1% 아가로오스 상에서 절단물의 분리, 변성 및 니트로셀룰로오스로의 전달 및 마니아티스등 (T. Maniatis et al., 1978, Cell 15 : 687-701)이 기재한 바와 같은 혼성화를 의미한다.

형질전환은 DNA가 염색체 외 요소 또는 염색체의 삽입체 중 하나로서 복제 되도록 DNA를 생물체에 도입시키는 것을 의미한다. 달리 기재되지 않는 한, 본 발명의 대장군의 형질전환에 사용된 방법은 만델 등(Mandel at al., 1970, J. Mol. Biol. 53:154)의 CaCl₂방법이다.

결찰(ligation)은 두 이중 가닥 핵산 단편 사이의 이인산 에스테르 결합을 형성시키는 과정이다 (T. Maniatis et al., Id., p. 146 참조), 달리 기재하지 않는 한, 결찰(ligation)은 공지의 완충액 및 조건에서 거의 등몰량의 결합할 DNA 단편 0.5㎍당 T4 DNA 리가아제 (리가아제) 10 단위를 사용하여 행할 수 있다.

형질전환체로부터의 DNA의 제조는 미생물 배양체로부터 플라스미드 DNA를 단리하는 것을 의미한다. 달리 기재하지 않는 한, 매니아티스 등 (Maniatis et al., Id., p. 90)의 알칼린/SDS 법을 사용한다.

올리고뉴클레오티드는 공지의 방법에 의해 화학적으로 합성시킨 후 이어서 폴리아크릴아미드 겔 상에서 정제한 짧은 길이의 단일 또는 2중 가닥 폴리뉴클레오티드를 의미한다.

c. 제약 조성물

본 발명에 의한 화합물은, 제약상 유용한 조성물을 제조하기 위한 공지의 방법에 의하여 제제화될 수 있으므로, 본 발명의 t-PA 제품을 제약상 허용되는 담체 비히클과 혼합시킨다. 인체 단백질 (예, 인체 혈청 알부민)을 포함한 적절한 담체 비히클 및 이들의 제제물이 이. 더블유. 마틴 (E.W. Marting)에 의한 Remington's Rharmaceutical Sciences (16판, 1980, Mack Publishing Co., Olso등 편집)에 기재되어 있다. 이러한 조성물들은, 전형적으로 본 발명의 변이체 유효량 예컨대 약 0.5 내지 약 5mg/ml과 함께 숙주에 대해서 효과적으로 투여하기에 적합한 제약상 허용되는 조성물을 제조하기 위한 적당량의 비히클을 함유할 것이다. 본 발명의 t-PA 변이체는 심장 맥관 질병으로 고통을 받고 있는 환자에게 비경구적으로 또는 혈관에 유효 형태로 전달하는 것을 보장하는 기타의 방법에 의해 투여할 수 있다.

본 발명의 실시태양에 이용된 변이체 t-PA 생성물의 임상 투여에 특히 적합한 조성물은, 예컨대, 살균수 또는 동결건조 단백질과 같은 살균 수화성 분말을 포함한다. 더욱이 제형에 있어서, 일반적으로 적절한 양의 제약상 허용되는 염을 제형이 등장성이 되는데 충분량으로 함유하는 것이 바람직하다. 아르기닌 염기와 같은 pH 조절제 및 인산 역시 적절한 pH, 일반적으로 5.5 내지 7.5를 유지하기 위해 충분량 함유시킨다. 또한, 수용성 제제의 저장 수명 또는 안정성을 개선시키기 위하여, 추가로 글리세롤과 같은 시약을 함유시키는 것이 바람직하다. 이러한 방식으로, 변이체 t-PA 제형은 비경구 투여, 및 특히 정맥내 투여에 적합하게 제공된다.

본 발명의 제약 조성물의 투여량 및 바람직한 약물 농도는 요망하는 특정 용도에 따라 다르다. 예컨대, 심한 정맥성 혈전중 또는 말초 혈관 질병의 치료에 있어서, 약 0.05 내지 약 0.2mg/kg 정도의 범위의 거환제 투여량은 통상 연속 투여에 적합하며 거의 일정한 혈압을 유지하기 위해서는 약 0.1 내지 약 0.2mg/kg 정도이며, 바람직하기로는 3㎍/ml의 정도일 것이다.

그러나, 일반적으로 기초 질환(예, 색전증, 폐색증)의 임계 성질로 인하여 주입 용량이 유용하지 않은 구급 의약 치료제와 함께 사용하기 위해서는 약 0.3mg/kg 정도의 정맥내 거환제과 같은 어느 정도 더 많은 초기 복용량을 제공하는 것이 바람직하다.

예컨대, 본 발명의 t-PA 변이체는 적합하게는 심장맥관 질환이나 증세로 고통을 겪는 환자에게 비경구 투여된다. 복용량 및 복용율은 기타 심장맥관 또는 혈전붕괴제의 임상 연구에 사용되고 있는 양과 동일하거나 또는 그 이상, 예컨대, 심근 협착증, 폐동맥색전증 등으로 부터 고통을 겪는 환자에 체중 1kg당 약 1-2mg을 1.5 내지 12시간에 걸쳐서 정맥내 또는 동맥내 투여할 수 있다. 본 발명의 변이체는 야생형 t-PA 보다 적은 부작용을 가지며 더욱 신속하고 완전한 혈병 분해를 일으키므로 더욱 높은 투여량도 허용된다.

적합한 투여형의 일례로서, t-PA 50mg, 아르기닌, 인산 및 폴리소르베이트 80을 함유한 바이알을 주사용 멸균수 50ml로 희석하여 적합한 부피의 0.9% 염화나트륨 주사액과 혼합시킨다.

본 발명의 t-PA는 또한 피브린 침착 또는 유착체 형성 또는 재형성을 방해하는데 유용하다. 이 용도의 한 실시예는 1989년 1월 12일 공개된 PCT WO 제89/00049호에 기재되어 있다. 일반적으로, 이러한 치료는 치료학상 유효량의 t-PA 변이체로 되는 조성물을 피브린 침착 또는 유착체 형성 부위에서 약 3일 내지 2주 동안 계속적으로 방출되는 조금씩만 용해되는 형태로 잠재적인 피브린 침착 또는 유착 형성 부위에 국소 투여하는 것을 포함한다. 통상적으로, t-PA 변이체는 수술, 감염, 외상 또는 염증 후 피브린 침착 또는 유착체의 형성을 예방하는데 충분한 투여량으로 투여된다. 전형적으로 이 양은 겔 1g당 0.02mg 내지 25mg이고, 바람직한 양은 겔 1g당 0.20mg 내지 약 겔 1g당 2.5mg이며 가장 바람직하기로는 겔 1g당 0.25mg 내지 약 겔 1g 당 1.0mg이다.

t-PA를 통상적으로 유착체 형성을 방지하기 위해 제형화시키는 부형제는 잠재적인 유착체의 형성 부위에 효소를 위치시키기 위한 반고상, 점장제의 제약상의 불활성 담체이다. 이러한 담체로는 긴 사슬 탄화수소 또는 식물유 및 포화 및 불포화 지방산 글리세리드와 혼합물 또는 개질 포화 및 불포화 지방산 글리세리드의 혼합물로 구성된 왁스를 들 수 있다. 반고상 부형제의 예로는 글리세롤, 긴 사슬 탄화 수소, 생분해성 폴리머 또는 리포좀과 같은 석유 젤리 또는 반합성 글리세리드, 폴리히드록시 용매를 들 수 있다.

다음의 실시예들은 본 발명의 실시예에 관하여 현재까지 알려진 최선의 태양을 설명하는 것이나 본 발명은 이들에 한정되지는 않는다.

A. 본 발명의 재조합 t-PA 변이체의 생성을 위한 발현 벡터의 제조 방법 및 이용방법.

1. 플라스미드 p7-1H의 제조

a) 플라스미드 pCISt-PA

플라스미드 pCISt-PA는 다음과 같이 제조하였다. 개략적으로, 사이토메갈로바이러스 인핸서(enhancer) 및 프로모터(promoter), 사이토메갈로바이러스 스플라이스(splice) 공여부위(donor site) 및 인트론, Ig 가변 영역 스플라이스 수용 부위(acceptor site), t-PA를 암호화하는 cDNA(Pennies 등의 Nature, 제301호, 제214페이지 (1983년)) 및 헤파타이티스(hepatitis) 표면 항원, 폴리아데닐화 및 전사 종결 부위를 함유한 벡터 pCIHt-PA를 먼저 제조하였다.

사이토메갈로바이러스 인핸서 [Boshart 등의 Cell, 제41호, 제520페이지 (1985)] 및 프로모터 [Thomsen 등의 Proc, Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 제81호, 제659페이지 (1984년)], 사이토메갈로바이러스 스플라이스 공여 부위 및 인트론 부분 [sternberg 등의 J. of virol, 제49호, 제190페이지 (1984년)], Ig 가변 영역 인트론 및 스플라이스 수용 부위, cDNA 암호화 인자 VIII 및 SV4O 폴리아데닐화 부위를 함유한 벡터 pF8CIS를 제조하였다. 상기 제조를 삼단계로 나누어 다음에 상세히 기재하였다.

1. 최종 벡터의 앰피실린 내성 마커 및 복제 원점은 플라스미드 pML [Lusky 등의 Nature, 제293호, 제79페이지 (1981년)참고]의 변이체인 출발 플라스미드 pUC13 pML로부터 얻었다. pUC13pML은 pUC 13 [(Veira등의 Gene, 제19호, 제259페이지 (1982년) 참조]의 폴리 링커를 pML의 EcoRI 및 Hind III 부위에 옮김으로써 제조하였다. 두번째 출발 플라스미드 pUC8CMV는 CMV 인핸서, 프로모터 및 스플라이스 공여 서열의 공급원이었다. pUC8CMV는 CMV 인핸서, 프로모터 및 스플라이스 공여 서열을 포함한 뉴클레이티드 1 내지 732를 pUC8의 평활 말단화한 Pst I 및 SphI 부위에 삽입시켜 제조하였다(상기 Veira 등, 참조). 합성 Bam HI-Hind III 링커 (뉴잉글랜드 바이오랩스사로부터 구입함)를 점착성 BamHI 말단에 결찰시켜 Hind III 부위를 생성시켰다. 이 결찰에 이어서 HindIII-Hinc II 절단을 수행하였다. 이 절단에 의해 CMV 인핸서, 포로모터 및 스플라이스 공여 부위를 함유하는 약 800bp의 단편을 얻었다. 겔 단리 후 상기 800 bp 단편을 pUC13 pML의 2900 bp 단편에 결찰시켰다. pF8CIS 제조에 필요한 단편을 상기 중 간체 플라스미드를 Sal I 및 Hind III로 절단시킴으로써 얻었다. 이 생성된 3123 bp 단편은 앰피실린 내성 마커, pUC13 pML로부터의 복제 원점, 인핸서, 프로 모터 및 스플라이스 공여 부위를 비롯한 CMV에 대한 조절 서열을 함유하였다.

2. Ig 가변 영역 인트론 및 스플라이스 수용 서열은 합성 올리고머를 사용하여 제조하였다. Ig G 인트론 및 스플라이스 수용 부위를 함유한 하기 서열을 갖는 99량체 및 30량체를 화학적으로 합성하였다(Bothwell 등의 Cell, 제24호, 제625페이지 (1981년) 참조)

DNA 폴리머라제 I (클레나우 단편)로 합성 단편을 필링인(filling in)하여 이중 가닥 단편을 생성시켰다 (Wartell 등의 Gene, 제9호, 제307페이지 (1980년)참조), 이어서 이것을 PstI 및 Hand III로 이중 절단을 행하였다. 이 합성 링커를 pUC13(Veira등, 상기함)의 Pst I 및 Hing 부위에 클로닝시켰다. pUCIg. 10으로 명명한 합성 올리고뉴클레오티드를 함유한 클론을 PstI로 절단하였다. PstI-ClaI 링커를 사용하여 ClaI 부위를 상기 단편에 첨가시켰다. Hind III로 절단시킨 후, Ig 인트론 및 Ig 가변 영역 스플라이스 수용 부위를 함유하는 118 bp 단편을 겔 단리하였다.

3. 벡타 제조의 제3단계에서 헤파타이티스 표면 항원 3' 말단을 SV40의 초기 영역의 플리아데닐화 부위와 전사 종결 부위로 대체시켰다. SV40 서열을 함유하는 벡터 PUC.SV40을 베이라(Veira)등에 의한 상기 기재된 방법으로 pUC8의 BamHI 자리에 삽입시켰다. 이어서 pUC.SV40을 EcoRI 및 HpaI으로 절단하였다. SV40 폴리아데닐화 부위만을 함유하는 143 bp 단편을 이 절단물로부터 겔 단리시켰다. 추가의 2개의 단편을 겔 단리시킨 후 pSVE. 8c1D (EPO 공보 제160,457호)을 절단하였다. EcoRI 및 Cla I 절단으로 생성된 4.8 Kb 단편은 SV40-DHFR 전사단위, pML의 복제 원점 및 앰피실린 내성 마커를 함유한다. ClaI 및 Hpa I로 절단한 후 얻은 7.5 Kb 단편은 인자 VIII의 cDNA를 함유한다. 3부분을 결찰시켜서 pSVE. 8c24D를 얻었다. 이 중간체 플라스미드를 ClaI 및 Sal I으로 절단하여 SV40 폴릴아데닐화 및 전사 종결 부위 및 이어서 SV40 DHFR 전사 단위 및 인자 VIII에 대한 cDNA를 함유하는 9611-bp단편을 얻었다.

pF8CIS를 얻기 위해서 다음의 최종-3부분 즉 (a) 복제의 기점, 앰피실린 내성 마커, 및 CMV 인핸서, 프로모터 및 스플라이스 공여 부위를 함유하는 3123 bp Sal I-Hind III 단편, (b) Ig 인트론 및 스플라이스 수용 부위를 함유하는 118-bp Hind III-claI 단편 및 (c) 인자 VIII에 대한 cDNA, SV40 폴리아데실화 부위 및 SV40 DHFR 전사 단위를 함유하는 9611-bp Cla-SalI 단편을 결찰시켰다.

이어서, 중간체 플라스미드 pCla t-PA 및 플라스미드 pF8CIS (상기)로부터 플라스미드 pCIHt-PA의 제조에 착수하였다.

먼저 t-PA cDNA를 pML에 클로닝시켜서 유전자의 5' 말단에 ClaI 자리를 제공하였다. 이와 같이 하기 위해서 pSVpa-DHFR (다른 명칭으로서는 pETPER임. 상기함)로부터의 3238-bp Hind III 단편을 pML의 Hind III 부위에 삽입시켰다. (Lusky 등, 상기함). 균총들로부터 ClaI 자리에 근접위치한 cDNA의 5' 말단을 가지는 클론을 선별하였다. 중간체 플라스미드를 pCLAt-PA로 명명하였다. t-PA cDNA 및 연결되는 3'-폴리아데닐화 부위를 2870 bp의 ClaI-KpnI 단편으로서 단리하였다. 이 단편을 pF8CIS의 5146 bp 단편에 결찰시켰다. 5' 조절부위, SV40-DHFR 전사 단위, 앰피실린 내성 유전자 및 pML로 부터의 복제 원점을 제공하는 CIS 벡터의 ClaI-Kpn I 단편을 제2도에 나타냈다.

t-PA의 발현은 자체로서 일반적으로 당업계에 공지되었으며, 상기한 방법에 따라 CHO 또는 293 세포를 pCIHt-PA로 형질 감염시킴으로써 얻었다. 형질 감염시킨 293 세포로부터의 배지를 분석한 결과는 pCIHt-PA는 t-PA 420mg/ml를 생성하였음을 나타냈다.

사이토메갈로바이러스 인핸서 및 프로모터, 사이토메갈로바이러스 스플라이스 공여 부위 및 인트론, Ig 가변 영역 스플라이스 수용 부위, t-PA 코딩 cDNA, 및 pSV40 폴리아데닐화 서열을 함유하는 벡터 pCISt-PA를 다음과 같은 방법을 사용하여 최종적으로 제조하였다.

이러한 제조를 위한 출발 벡터는 pCIHt-DA 및 pF8CIS (상기함)였다. 후자인 벡터는 pCIHt-PA와 동일한 5' 조절 부위를 가졌으나 인자 VIII의 cDNA 및 SV40 폴리아데닐화 부위를 함유한다. Sac II는 t-PA cDNA의 3'을 절단하기 위해 사용하였다. 생성된 3' 돌출부(overhang)는 T₄폴리머라제로써 평활화시켰다. 이어서 pCIHt-PA를 ClaI으로 절단하였다. 이 부위는 CMV 인트론 서열 및 Ig 가변 영역 인트론 사이를 분리하는 키메라성 인트론을 분리한다. 2870-bp 단편을 ClaI 처리하여 겔 단리시켰다. SV40 폴리아데닐화 부위, DHFR, 전사 조절, 세균의 복제 원점, 및 amp^r유전자 이외에 CMV 인핸서, 프로모터 및 스플라이스 공여 부여를 pF8CIS로부터 단리하였다. 이 요소들은 2525 bp Sal-Bam HI 단편 및 HpaI-Sal 및 3113 bp 단편으로서 단리하였다. KpnI (평활)-ClaI 단편, HpaI-Sal 단편 및 Sal 내지 BamHI 단편 3부분을 결찰시켜 pCISt-PA를 얻었으며, 이 pCISt-PA는 상기한 바와 같이 플라스미드 pCISt-PA를 발현시켰던 CHO 및 293 세포 모두에서 각각 t-PA 55 및 3000 mg/ml를 생성시켰다(제3도 참조).

(b) p7-1H의 최종 제조

플라스미드 pCISt-PA를 Spe I로 절단한후, E. Coli DNA 폴리머라제 I 거대 단편 (크레나우) 및 데옥시리보뉴클레오시드 트리포스페이트로 처리하여 평활 말단을 생성하였다. 생성된 선형 단편을 T₄DNA 리가아제를 사용하여 단일 사슬 DNA 파아지 f1으로부터와 사슬 원점을 함유하는 0.45 kb-RsaI/Aha III 단편에 결찰하였다. (진더 (Zinder)등의 Microbial. Rev. 제49호 제101페이지 (1985)년 참조). 결찰 생성물을 pCISt-PA 단편의 SpeI 자리에 가능한 양 방향으로 삽입된 f1 복제 원점과 함께 단리시켰다. t-PA 유전자의 앤티-센스 가닥 (anti-sense strand)을 헬퍼 파아지의 존재 하에서 비리온에 팩킹시킨 것과 같은 방향의 상기의 복제 기점을 함유하는 플라스미드를 선택하여 p7-1H로 명명하였다. 제4도에 나타냈다.

2. 발현 플라스미드의 돌연변이 생성

(a) 주형 제조

플라스미드 p7-1H를 CaCl 매개 형질전환을 통해서 대장균(E. Coli) 균주 JM 101 (ATCC 제33,876호)내에 도입시켰다. 이들 세포를 헬퍼 바이러스 M 13 K 07로 감염시키고, 단일 가단 p7-1H DNA를 베이라(Veira) 등의 Meth, Enzymcol. 제153호, 제3페이지 (1987)에 기재된 방법으로 제조하였다. 간단히 말하자면 2YT 액체 배지(broth) 중의 형질 전환 세포의 포화 배양액 0.3 ml에 M13 K07 10⁹-10¹⁰pfu를 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 15분 동안 배양시켰다. 카르베닐실린(carbenicillin) 50㎍/ml를 함유하는 신선한 2YT 액체 배지 1.5ml를 첨가하고, 이 배양물을 37℃에서 16시간 동안 부드럽게 진탕시켰다. 세포를 펠릿화시킨 후 파아지 및 팩킹된 플라스미드 DNA를 수착하고, 단일 가닥 DNA를 앤더스(Anderson)의 Nucl. Acids. Res. 제9호, 제3015페이지 (1981년)에 기재된 방법으로 제조하였다.

(b) 시험관 내 부위 특이적 돌연변이 유발.

p7-1H상의 돌연변이 생성은 돌연변이 phe 305 → his 305의 돌연변이를 플라그 혼성화가 아닌 콜로니 혼성화에 의해 동정한 것을 제외하고는 필수적으로 졸러(zoller)등의 Meth. Enzymol. 제100호, 제468페이지 (1983)에 기재된 바와 같이 올리고데옥시리보뉴클레오티드 5'-CGGAGAGCGGCACC TGTGCGGGG-3'를 사용하여 행하였다. 돌연변이는 디데옥시뉴클레오티드 사슬 종결법 [Sanger 등의 Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A). 제74권, 제5463호 (1977)페이지 참조]을 사용하여 단일 가닥 플라스미드 DNA 상에서 직접 DNA 서열분석에 의해 확인하였다.

3. 발현 및 정제

(a) 플라스미드 제조

형질전환 세포를 50㎍/ml 카르베니실릴을 함유한 50 ml LB 액체 배지 중에서 포화 상태까지 배양시켰다. 세포를 원심분리하여 펠릿화시키고, 50mM 클루코오스, 10mM EDTA, 25mH Tris-HCl (pH8.0) 용액 40m1 중에 재현탁시켰다. 이 현탁액에 1% 소듐 도데실 설페이트, 0.07 M NaOH의 용액 60ml를 첨가하고, 이 혼합물은 25℃에서 2분 동안 배양시킨 후, 0℃에서 10분동안 배양시켰다. 이 배양액에 4M 아세트산, 3M 아세트산나트륨의 용액 52m1를 첨가하고, 이 혼합물을 0℃에서 30분 동안 배양시켰다. 이어서 이 배양액을 11,500 rpm에서 20분 동안 원심분리시키고, 상층액을 100% 냉 에탄올 2부피배와 혼합시킨 후 생성되는 침전물을 원심분리에 의해 수확하였다. 플라스미드 DNA 및 RNA를 함유하는 펠릿을 건조시키고, 100mM Tris (pH 8.0), 10mM ETDA, 1㎍/ml RNase A 용액 중에 재용해시켰다. 얻어진 용액을 원심분리로써 청징(淸澄)시킨 후, 에티듐 브로미드를 0.5 mg/ml 되도록 첨가하고 동량의 CsCl을 첨가하였다. 이어서 DNA를 18℃에서 55,000 rpm으로 베크만 VTI 65 로터 (Beckman UT165 rotor)를 사용하여 16시간 동안 원심분리시켰다. DNA 밴드를 측면 펀칭에 의해 수확하고, n-부탄올로 추출하여 에티듐 브로미드를 제거한 후, H₂O로 희석하고, 에탄올로 침전시켰다. DNA를 최종 농도 1mg/ml가 되도록 10mM Tris (pH 8.0), 1mM EDTA 용액에 재용해시켰다.

(b) 형질감염 및 발현

293 세포를 충분히 배양시켰다. t-PA 플라스미드 DNA 돌연변이체 10㎍을 VA RNA 유전자를 암호화하는 DNA [Thimmappaya 등의 Cell, 제31호, 제543페이지 (1982)참조] 1㎍과 혼합하고 1mM Tris-HCl, 0.1 mM EDTA, 0,227 CaCl2 용액 500㎕에 용해시켰다. 이 용액에 50mH HEPES (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5mM NaPO₄용액 500㎕를 (보르텍싱시키면서 방울로)첨가하고, 침전물이 형성되도록 25℃에서 10분동안 정치하였다. 이어서 현탁된 침전물을 상기 세포 (100mM 플레이트 중에서)에 첨가하고, 4시간동안 인큐베이터 중에서 배양시켰다. 이어서 배지를 진공 흡수시켜 분리시키고 인산염 완충액 염수(PBS)중의 20% 글리세롤 2ml를 30초 동안 첨가하였다. 이 세포를 혈청 부재(不在) 배지 5ml로 2회 세척한 후, 이어서 신선한 배지를 첨가하고, 세포를 5일동안 배양하였다.

t-PA 변이체를 발현하는 안정한 CHO 세포주를 생성하기 위해서 t-PA 암호화 서열 전부를 함유하는 1.4 Kb Bgl II/ApaI 단편 (Bgl II 부위는 t-PA 암호화 DNA의 전체길이 중의 -1 내지 1 코돈에 걸쳐 있으며, ApaI 부위는 t-PA 암호화 DNA 전체길이 중 465 내지 466 코돈에 걸쳐있음)을 벡터 pPADHFR-6 (EPO 특허 공보 제93,619호에 기재됨)로부터의 6.0-Kb Bgl II/-ApaI 단편에 결찰시켰다. 생성된 플라스미드를 CHO 세포에 도입시키고, 메토트렉세이트-함유 배지 중에서 선별하는 방법에 의해 암호화 서열을 증폭시킴으로써 t-PA 변이체의 과발현(over-express)을 유도시켰다.

(c) 정제

항-t-PA 염소 다중 클론 A6 항체 (공지된 표준 방법에 따라 제조)가 커플링된 조절된 유리 구슬의 컬럼(1ml 베드 용적)에 조건을 맞춘 배지를 통과시킴으로써 t-PA 생성물을 정제하였다. 배지를 로딩(loading)하기 전에 컬럼을 PBS로 평형화시키고, 로딩(loading) 후에는 컬럼을 0.1 M Tirs-HCl(pH7.5), 1M NaCl로 평형화시켰다. t-PA를 0.1M 아세트산, 0.15 M NaCl, 0.02 M 아르기닌, 0.01% Tween 80 (pH 2.0)으로 용출시키고, 분획물을 즉시 트리스-염기로 중화시켰다. 분획물을 합하기 전에 0.01% Tween 80으로 조정하였다. 환원성 SDS 겔 상에서 전개시 t-PA 단일 사슬이 주종(80%)을 이루었다.

B. 생물학적 분석

1. t-PA정량

단백질 농도는 야생형 t-PA (EPO 특허 공보 제93,619호, 상기함)에 대해 표준화된 ELISA법에 의해 통상적으로 결정하였다. 단백질의 순도 및 균질성은 램믈리 (Laemnli)의 Nature, 제227호, 제680페이지 (1970)에 기재된 완충계를 사용하여 소듐 도데실 설페이트의 존재 하에서 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동법 (PAGE-SDS)에 의해 분석하였다. 전형적으로는 7 내지 17% 농도 구배의 겔을 사용하였으며, 단백질은 모리세이(Morrissey)의 Anal. Biochem. 제117호, 제307페이지 (1981)에 기재된 은 염색 기술(Silver-Staining Technique)로서 가시화시켰다. 상기와 같이 제조한 t-PA 변이체는 이 방법에 의해 순수하고 균질함이 밝혀졌다.

2. S-2251 분석방법.

혈병 용해 및 S-2251 분석 결과는 여러 독립적인 관찰 (혈병 용해, 2회 측정, S-2251, 3회 측정)의 평균값을 보여준다.

t-PA의 플라스미노겐을 활성화시키는 능력은 t-PA 및 플라스미노겐을 예비 배양시키고, 이어서 플라스민 특이성 기질 H-D-발릴-H-류실-H-리신-파라니트로아닐리드 (S-2251)을 첨가함으로써 시험관 내 분석에 의해 측정하였다. 이 반응의 최대 속도는 반응의 자극제로서 작용하는 피브린(피브리노겐) 또는 피브린(피브리노겐) 단편의 존재 하에서 관찰하였다.

플라스민 특이성 기질 S-2251은 플라스미노겐을 활성화시키는 시료의 능력을 측정하기 위해 2단계 분석 방법으로 사용하였다. 피브리노겐은 시료를 0.05M Tris-HCl, 0.12M NaCl, 0.01% Tween 80 (pH 7.4) 용액 0.12ml 중의 20mg/m1 피브리노겐 용액 0.02 ml와 함께 배양시킴으로써 자극제로서 사용할 수 있다.

0.05M Tris 및 0.12M NaCl 완충액 (pH 8)중의 2.0mg/ml Glu-플라스미노겐 용액 (상업적으로 구입가능) 0.03ml를 첨가하였다. 37℃에서 10분 둔 후에 0.037M Tris, 0.086 M NaCl, 0.007% Tween 80 (pH 7.4) 용액 중의 0.86mM S-2251 0.35ml를 첨가하였다. 이 혼합물을 5분 동안 배양시키고, 이어서 이 반응을 50% 빙아세트산 0.1ml를 첨가시킴으로써 정지시켰다. 405nm에서의 흡광도를 측정하였다. 활성은 기질 존재 하에서 분 당 ng당 흡광도의 변화로써 나타냈다.

이 결과는 피브리노겐과 반응시킨 F305H 변이체가 야생형 특이 활성의 78% 활성을 가지며, 이것은 A405 증가 전에의 지체기에 기인할 수 있다는 것이다.

3. 혈병 용해

야생형 및 F305H t-PA의 플라스미노겐의 포화 농도 존재 하에서 피브린을 용해시키는 능력은 카를슨(carlsen)등의 Anal. Biochem. 제168호, 제428-435페이지 (1988)에 기재된 방법에 따라 분석하였다. 시험관 내에서 혈병 용해 분석에 의해 소형 원심분리 분석기를 사용하여 터비디메트리로써 t-PA들의 활성을 측정하였다. 트롬빈 및 t-PA 시험 시료의 혼합물은 피브리노겐 및 플라스미노겐의 혼합물 중에 원심분리시켜서 혈병 형성을 개시시키고, 이어서 혈병 용해를 시켰다. 얻어진 흡수량 대 시간의 프로파일을 분석하여 분석 종점을 결정하였다. t-PA 변이체의 활성은 rt-PA (EPO공개 제93,619호 상기함)의 표준 곡선에 비교하였다. 분석 전체를 통해서 사용된 완충액은 0.01% (v/v) Tween 80 및 0.01% (w/v) 소듐 아지드를 함유하는 0.06M 인산나트륨 (pH 7.4)이었다. 인체 트롬빈은 33 단위/ml의 농도였다. 피브리노겐 (혈병될 수 있는 단백질 2.0mg/ml)은 습윤 얼음 상에서 냉각시켜 피브로넥틴을 침전시키고, 이어서 중력 여과시켰다. Glu-플라스미노겐은 1mg/ml 농도였다. 분석기 챔버 온도는 37℃로 설정하였다 로딩량은 표준 곡선에 대한 시료로서 약 62.5ng/ml 내지 1.0 ㎍/ml 농도의 rt-PA 20 ㎕ 또는 표준 곡선 범위 내에서 용해를 유발하는 농도의 변이체 rt-PA 20 ㎕를 분산시키기 위해 설정하였다. 트롬빈 20㎕를 제2의 시약으로서, 피브리노겐; 플라스미노겐 50:1 (v/v) 혼합물 200㎕를 제1의 시약으로 사용하였다. 흡광도/시간 프로그램은 5분 배양하여, 340 nm 여과기를 사용하여 90초 간격으로 측정하는 것을 사용하였다.

상기 분석 결과, F305H 변이체가 정상의 야생형 t-PA의 약 46%의 혈병 용해 활성을 가졌다.

4. 피브린 결합

피브린 결합 방법으로 리즈켄(Rijken)등의 J. Biol. Chem. 제257호, 제2920페이지 (1982)에 기재된 방법의 변형된 방법을 사용하였다. 시험할 t-PA 시료를 0.05M Tris (pH 7.4), 0.12 M NaCl, 0.01% Tween 80, 1mg/ml 인체 혈청 알부민 및 다양한 농도(0, 0.05, 0.1, 0.25 및 0.5 mg/ml)의 플라스미노겐 부재 피브린을 함유한 용액에 첨가하였다. 반응 혼합물의 최종 부피는 1ml 였으며, t-PA 농도는 각각의 시료에서 10ng/ml였다. 이 시료를 37℃에서 5분 동안 배양시키고, 이어서 트롬빈 1단위를 첨가하였다. 이어서, 샘플을 37℃에서 1시간 동안 배양시켰다. 이 혈병을 원심분리에 의해 제거시키고, 상층액 중에 비결합된 잔류 t-PA의 양을 ELISA법에 의해 결정하였다.

그 결과, 단일 사슬 F305H t-PA (닫힌 삼각형)가 사용된 분석 조건하에서 피브린, 단일 사슬 야생형 t-PA (닫힌 사각형) 및 단일 사슬 및 이중사슬의 야생형 t-PA (열린 삼각형)의 혼합물에 현저하게 결합한 것으로 나타났다(제5도 참조). 또한 이중 사슬 F305H t-PA (닫힌 원)이 피브린 및 적어도 이중 사슬 야생형 t-PA (닫힌 다이아몬드)와 결합한다.

5. S-2251에 의한 효소원 역학

(a) 피브리노겐의 제조

인체 피브리노겐(칼바이오켐사 제품)을 리신-세파로오스 컬럼에 가하고 용출액을 회수하여 플라스미노겐을 제거하였다. 얻어진 피브리노겐을 모아서 실온에서 철야로 플라스민-세파로오스로 처리함으로써 분해시켰다. 얻어진 혈병 능력은 7%였다. 이어서 농도를 1.51 mg/ml로 조정하였다.

(b) 공정

야생형 t-PA 및 F305H t-PA에 의해 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 역학은 피브리노겐 존재 하에서 염색체 유래의 플라스민 기질 S-2251을 사용하여 결정하였다. 야생형 및 F305H t-PA 분자는 주로 단일 사슬 형태 (상기와 같이 정제에 의해 얻음) 및 뭉친 이중 사슬 형태 (37℃에서 1시간 동안 플라스민-세파로오스와 함께 주로 단일 사슬 형태를 배양시켜서 얻음) 모두를 사용하였다.

상기와 같이 제조한 플라스민-분해 피브리노겐 단편 1.2 μM 존재 하에서 0.12M NaCl, 0.05M Tris, 0.01% Tween 80 (pH 7.4)의 용액 중의 t-PA 2.3 내지 9.0 nM 및 플라스미노겐 0.08 내지 0.89 μM의 농도에서 반응을 수행하였다. 플라스미노겐, 피브리노겐 및 완충액을 실온에서 3시간 동안 전 배양시켰다. S-2251을 최종농도 0.9 mM이 되게 첨가하고, 이 샘플을 37℃에서 약 5분 동안 가온시켰다. 시발점에서 t-PA 시료를 첨가하고, 각각의 시료의 흡광도를 37℃에서 10분 동안 30초 간격으로 측정하였다.

결과는 제6 및 7도 (각각 단일 사슬 및 이중 사슬의 야생형 t-PA임) 및 제8 및 9도 (각각 단일 사슬 및 이중 사슬의 F305H t-PA임)에 나타냈다. 도면에서 세로 좌표는 405 nm에서의 흡광도이며 가로 좌표는 흡수되는 시간(분)의 제곱이다. 검은 원형은 0.09 μM의 플라스미노겐 (및 15.7nM 야생형 이중 사슬 t-PA, 10.8nM F305H 이중 사슬 t-PA, 16.1nM 야생형 단일 사슬 t-PA, 및 17.2 nM F305H 단일 사슬 t-PA)이며, 검은 삼각형은 0.11 μM의 플라스미노겐 (및 11.8nM 야생형 이중 사슬 t-PA, 8.1 nM F305N 이중 사슬 t- PA, 12.1 nM 야생형 단일 사슬 t-PA, 12.9 nM F305H 단일 사슬 t-PA)이며, 검은 사각형은 0.16μM의 플라스미노겐 (및 9.8 nM 야생형 이중 사슬 t-PA, 6.7nM F305H 이중 사슬 t-PA, 10.1nM 야생형 단일 사슬 t-PA, 10.8 nM F305M 단일 사슬 t-PA)이며, 흰 원은 0.22μM의 플라스미노겐 (및 7.9nM 야생형 이중 사슬 t-PA, 5.4 nM F305H 이중 사슬 t-PA, 8.1 nM 야생형 단일 사슬 t-PA, 8.6 nM F305H 단일 사슬 t-PA)이며, 흰 삼각형은 0.44μM의 플라스미노겐 (및 3.9 nM 야생형 이중 사슬 t-PA, 2.7 nM F305H 이중 사슬 t-PA, 4.0nM 야생형 단일 사슬 t-PA, 4.3 nM F305H 단일 사슬 t-PA)이며, 흰 사각형은 0.9μM의 플라스미노겐 (및 3.9nM 야생형 이중 사슬 t-PA, 2.7 nM F305H 이중 사슬 t-PA, 4.0 nM 야생형 단일 사슬 t-PA, 4.3 nM F305H 단일 사슬 t-PA)이다.

그래프는 주성분 단일 사슬 F305H 변이체만 투여될 때, 흡광도는 반응 초기의 지체기 및 이후의 활성의 증가를 나타낸다. 이중 사슬 F305H 변이체는 이러한 지체기를 나타내지 않지만 단일 또는 이중 사슬 야생형 t-PA와 유사한 역학 특성을 나타낸다. 이러한 양상은 야생형 t-PA에서는 관찰되지 않는 F305H 변이체의 효소원 특성을 나타낸다.

[실시예 2]

커닝햄 및 웰즈(Cunningham and Wells)의 상기 알라닌 스캐닝 돌연변이 유발(ALA-Scan)과 같은 공지된 방법을 본 실시예 중에서 분석한 t-PA 변이체의 생성에 사용하였다. 이 방법은 하전된 아미노산 곁사슬을 함유하는 t-PA 프로테아제 도메인의 소 표면 영역의 동정을 포함한다. 어느 한 이론에 제한됨이 없이 하전 덩어리를 함유하거나 또는 이웃하는 영역 중의 1개 또는 2개 모두는 t-PA 분자와 이것의 기질 및 이것의 활성을 조절할 수 있는 다양한 다른 화합물과의 상호작용에 관련된다. 각각의 영역 중에서 하전된 아미노산 (즉, Arg, Asp, His, Lys, 및 Glu)을 알라닌으로 치환(돌연변이체 분자 당 한 부분)시켜 t-PA 분자의 전체 활성에 있어서 특정 영역의 중요성을 조사하였다. 이 결과는 다음과 같다.

1. pRK7-t-PA의 제조

t-PA 돌연변이체의 생성을 위한 벡터로서 플라스미드 pRK7을 사용하였다. pRK7은 폴리링커 영역 중의 ClaI 및 Hind III 사이에서 엔도뉴클레아제 제한 부위의 순서가 역방향인 것을 제외하고는 pRK5[1989년 3월 15일 공개된 유럽 특허 공보 제307,247호 참조]와 동일하다. t-PA cDNA [Pennica등의 Nature, 제301호, 제214페이지(1983년)참조]는 제한 엔도뉴클레아제 Hind III (이것은 5' ATG 출발 코돈의 49 염기쌍을 절단함) 및 제한 엔도뉴클레아제 BalI (이것은 TGA 정지 코돈의 276 염기쌍 하류를 절단함)으로 절단함으로써 벡터 중에 삽입시켜 제조하였다. 이 cDNA를 표준 결찰 방법 (Maniatis 등의 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory사, New York 주 소재, 1982년)를 사용하여 Hind III 및 Sma I으로 미리 절단한 pRK7 중에 결찰시켰다. 이 제조물은 pRK7-t-PA로 명명하였다.

2. pRK7-t-PA의 부위 특이적 돌연변이 유발

t-PA cDNA의 부위 특이적 돌연변이 유발은 Amersham Corporation사 (카타로그 번호 제RPN 1253호)로 부터 구입한 키트(kit)를 사용하여 테일러(Taylor) 등의 Nucl. Acids. Res. 제13호 제8765페이지(1985년)에 기재된 방법으로써 수행하였다. 원하는 돌연변이체를 생성시키기 위해서는 원하는 아미노산 치환체를 암호화하는 서열의 올리고뉴클레오티드를 합성하여 프라이머로 사용하였다. 이러한 올리고뉴클레오티드를 표준 공정 [viera 등의 Meth. Enz. 제143호, 제3페이지 (1987년)참조]에 의해 제조된 단일 가닥 pRK7-t-PA에 어닐링(anneal)시켰다.

3종의 데옥시리보뉴클레오티드, 즉 데옥시리보아데노신(dATP), 데옥시리보구아노신(dGTP), 및 데옥시리보티미딘(dTTP)의 혼합물을 상기 키트의 제조자로부터 키트 중에 제공된 dCTP(aS)라 불리우는 변형된 티오-데옥시리보시토신과 혼합하고, 올리고뉴클레오티드로 어닐링된 단일 사슬 pRK7-t-PA에 첨가하였다.

이 혼합물에 DNA 폴리머라제를 첨가함에 따라 돌연변이 염기를 제외하고 pRK7-t-PA와 동일한 DNA 가닥이 생성되었다. 또한 새로운 DNA의 가닥은 dCTP 대신에 제한 엔도뉴클레아제 절단으로부터 DNA 가닥을 보호하는 역할을 하는 dCTP(aS)를 함유하였다. 이중 사슬 이형 복합체의 주형 사슬을 적절한 재한 효소로 닉(nick)을 형성시킨 후, 주형 가닥을 Exo III 뉴클레아제로 돌연변이성 올리고머를 함유하는 영역을 지나기까지 절단하였다. 이 반응을 정지시켜 부분적으로만 단일 가닥인 분자를 생성시켰다. 이어서 완전한 이중 가닥 DNA 동형복합체 분자를 모두 4개의 데옥시리보뉴클레오티드 트리포스페이트, ATP 및 DNA 리가제의 존재 하에서 DNA 폴리머라제에 의해 형성시켰다.

ALA-스캐닝 돌연변이법을 사용하여 pRK7-t-PA 분자를 생성하기 위한 프라이머로서 사용하기 위해 다음의 올리고뉴클레티드들을 제조하였다.

3. 세균 형질전환 및 DNA 제조

상기 방법을 사용하여 제조한 돌연변이체 t-PA 구조물을 수용성 세포(competent cell)의 제조 및 형질전환을 위한 표준 CaCl₂방법(Maniatis 등, 상기함)을 사용하여 대장균 숙주 균주 MM 294 ton A 중에 형질전환시켰다. Tn 10 트랜스포손(transposon)을 ton A 유전자 중에 삽입시키고 부정확하게 절출(切出) 시킴으로써 MM 294 tonA (이것은 T1 파아지에 내성임)을 제조하였다. 이어서 이 유전자를 트랜스포손 삽입 돌연변이 생성법을 사용하여 대장균 숙주 MM294 (ATCC 31,446) 중에 삽입시켰다. [Kleckner 등의 J. Mol, Biol. 제116호, 제125-159페이지 (1977년)참조].

DNA는 Mamiatis 등의 상기의 표준 소규모 제조 방법을 사용하여 세균 형질전환체의 개별적인 콜로니로부터 추출하였다. 이 플라스미드를 세파크릴 CL6B 스핀 컬럼(Sephacryl CL6B spin column) 상에 통과시킴으로써 더욱 정제한 후, 서열화 및 제한 엔도뉴클레아제 절단 및 아가로스 겔 전기영동에 의해 분석하였다.

K296A, H297A, R298A, R299A 돌연변이체를 암호화하는 플라스미드를 함유하는 상기 형질전환체 중의 1종을 pTPA33-2로 명명하고, 1989년 7월 18일에 Americal Type Culture Collection에 기탁을 하고 기탁번호 ATCC 제68,059호를 부여 받았다.

4. 인체 배 신장 293 세포의 형질감염(소규모)

293 세포를 6웰 플레이트 중의 70% 군집 정도로 성장시켰다. 돌연변이 t-PA 플라스미드 DNA 2.5㎍을 1mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, 0.227M CaCl₂용액 150㎕ 중에 용해시켰다. 이 용액에 50 mM HEPES 완충액 (pH 7.35), 280 mM NaCl, 1.5 mM NaPO4의 용액 150㎕를 (보르텍싱시키면서 방울로) 첨가하고, 25℃에서 10분 동안 방치시켜 침전되게 하였다. 이 현탁 침전물을 6웰 플레이트 중의 각각의 웰 중의 세포에 첨가하고, 인큐베이터 중에서 4시간 동안 안착하게 하였다. 이어서 이 배지를 흡수 제거시키고, PBS 중의 20% 글리세롤 1ml를 30초 동안 첨가하였다. 이 세포를 2회 즉, 먼저 혈청 부재(不在) 배지 3ml, 이어서 1ml로 세척하였다. 이어서 신선한 배지 3ml를 첨가하고, 이 세포를 5일 동안 배양시켰다. 이어서 이 배지를 회수하여 분석하였다.

단일 사슬 t-PA를 얻을 때, 플라스미노겐이 고갈된 혈청을 세포의 성장기 동안에 사용한 것을 제외하고는 상기와 같은 방법을 사용하였다.

5. 인체 배 신장 293 세포의 형질감염 (대규모)

K296A, H297A, R298A, R299A 변이체를 상당량 제조하기 위한 대규모 정제를 위한 형질 전환 방법으로서 오수벨(Ausubel) 등의 Current Protocols in Molecular Biology (Wiley Interscience사, 1988)에 기재된 방법을 다음과 같이 약간 변형하여 사용하였다: 인체 배 신장 293 세포의 현탁액을 세포 배양 배지 중에서 배양하고, 펠릿화하여 농축시켰다. 이 펠릿은 밀리리터 당 세포수 약 108의 농도로 재현탁시키고, 필요에 따라서, 이 세포를 혈청 부재(不在) 배지로 세척하였다. DNA-덱스트란 용액을 세포액 500ml 당 DNA 약 250㎍ 농도로 첨가하고, 이 혼합물을 37℃에서 최대로 90분 동안 온화하게 교반시키면서 배양시켰다. DMSO를 최종 농도가 10%되도록 첨가하고, 약 2분 후에 신선한 배지를 첨가하여 밀리리터 당 세포수 약 10⁶개가 되도록 희석시켰다. 이어서 세포를 최대로 7일 동안 배양시킨 후, 상층액을 회수하였다.

이 돌연변이체의 정제는 상층액을 항-t-PA 염소 다중클론 A6 항체가 커플링된 유리 구슬의 컬럼에 통과시킴으로써 행하였다. 컬럼은 PBS로 미리 조건을 맞추었다. 상층액을 로딩한 후, 컬럼을 Tris-염수 완충액 [0.1M Tris-HCl (pH 7.5) 및 1M NaCl]으로 평형화시켰다. 이어서 t-PA 변이체를 0.1M 아세트산, 0.15M NaCl, 0.02M 아르기닌 및 0.01% Tween 용액으로 용출시켰다. 분획물을 즉시 Tris 염기로 중화시키고, Tween 80 농도를 0.01%로 조정하였다.

6. 생물학적 분석방법

A. t-PA 정량

세포 배양체 상층액 중에 존재하는 t-PA 양은 야생형 t-PA에 대해 제조한 다중클론 항체를 사용한 ELSA 방법으로써 측정하였다.

B. S-2288 분석 방법

S-2288 분석 방법을 사용하여 단일 및 이중 사슬 형태의 돌연변이체의 단백질 분해 활성을 측정하였다. 이 분석법은 t-PA 단백질 분해 활성에 대한 직접 분석법이며, t-PA는 소형 펩티드와 파라니트로아닐리드 발색단 사이의 결합을 절단한다.

표준 곡선 시료는 세포 배양 배지로 야생형 rt-PA를 희석시킴으로써 제조하였다. 표준 곡선 시료 및 rt-PA 돌연변이체 시료를 미세적량 플레이트의 웰에 첨가하였다. 이 분석법을 사용하여 이중 사슬 rt-PA의 활성을 측정할 경우, 인체 플라스민과 함께 배양시키는 공정이 상기 방법 중에 포함된다. 인체 플라스민(KabiVitrum)을 최종 농도 0.13 CU (카제인 단위)/ml가 되도록 첨가하였다 이 시료를 실온에서 90분 동안 배양시켰다. 단일 사슬 형태의 시료를 분석하기 위해서 플라스민 용액을 PBS로 대체시키고, 90분 동안의 배양 단계를 생략하였다.

플라스민 활성을 억제하기 위하여 아프로티닌[Sigma사 제품, 약 14TIU (트립신 억제제 단위)/mg]을 최종농도가 72㎍/ml 되도록 첨가하였고, 이 시료를 실온에서 15분 동안 배양하였다. S-2288의 2.16mM 용액을 0.1M Tris, 0.106 mM NaCl, 0.02% 소듐 아지드(pH 8.4)의 용액으로 1.45mM 용액으로 희석시키고, 이 용액 100㎕를 미세적량 플레이트 (각각의 웰의 최종 부피가 200㎕임)의 각각의 웰에 첨가하였다. 발색을 405nm에서 모니터하였다. 각각의 표준 시료 및 시험 시료에 대한 흡광도 대 시간 곡선을 결정하였다. 표준 곡선은 rt-PA 표준 시료에 대한 rt-PA 농도의 함수로서 흡광도 대 시간 곡선의 기울기를 도표로 나타냄으로써 작도하였다. 돌연변이체의 상대적인 활성 농도를 표준 곡선으로 부터 결정하였다. 각각의 돌연변이체의 활성 농도는 rt-PA ELISA에서 얻은 돌연변이체에 대한 농도로써 나누었으며, 특정 활성은 야생형 t-PA의 값을 1.0로 보고 상대값으로 나타내었다.

상기 데이타는 2개의 분석치의 평균이며, 표 1에서 야생형 rt-PA에 대한 상대적 활성으로 나타냈다. 이 결과는 나타낸 모든 돌연변이체에서 야생형 rt-PA에 상대적으로 이중 사슬 형태가 단일 사슬 형태보다 더욱 활성(적어도 1.5배, 최대로는 거의 60배)이라는 것을 나타내며, 이는 이러한 돌연변이체의 각각이 이 분석방법에서 상당한 효소원이란 것을 나타낸다.

C. S-2251 분석방법

이 분석 방법은 t-PA 활성에 대한 간접 분석법이다. 이 분석에서 플라스미노겐은 t-PA의 작용에 의해 플라스민으로 전환되며, 플라스민은 S-2251 기질을 절단하여 파라니트로아닐리드 발색단을 방출한다. 이 발색단의 생성은 시간별로 측정하였다.

1. 피브린-자극 S-2251 분석 방법

표준 곡선 시료는 상기 S-2288 분석법에 기재된 바와 같이 제조하였다. 이중 사슬 형태로 분석한 시료를 플라스민-세파로오스와 함께 배양시켰다. 플라스민-세파로오스는 인체 플라스민(KabiVitrum) 약 20.8 CU를 시아노겐 브로미드 활성화 세파로오스(Pharmacia사 제품) 1ml에 커플링시킴으로써 제조하였다. 플라스민-세파로오스(5% 슬러리의 50㎕)를 진탕시키면서 실온에서 90분 동안 샘플 150㎕와 함께 배양시켰다. 배양 후 수지를 원심분리에 의해 제거하고, 시료 10㎕를 미세 적정량 플레이트의 웰에 첨가하였다.

단일 사슬 형태로 분석한 시료를 제조하기 위해, 수지 대신에 세포 배양 배지 50㎕를 첨가하고, 배양 단계를 생략하였다. 인체 트롬빈 (42 단위/ml 용액의 10㎕)을 각각의 웰에 첨가하였다. 각각의 웰 중에서의 반응은 인체 글루-플라스미노겐 (5.3 μM)의 28 ㎕, 플라스미노겐 부재(不在) 인체 피브리노겐(10 μM) 10㎕, 3mM S-2251 (KabiVitrum)의 30 ㎕ 및 PBS의 62 ㎕로 되는 칵테일 (130 ㎕)을 첨가시킴으로써 시작되었다. 발색은 405nm에서 측정하고, 429nm의 참고 파장에서의 흡광도를 각각의 시점으로부터 감하였다. 흡광도 대 시간 제곱 곡선의 기울기는 각각의 표준 및 돌연변이체 시료에 대해 측정하였다. 표준 곡선은 rt-PA 표준에 대한 rt-PA 농도의 함수로서 흡광도 대 시간 제곱 곡선의 기울기를 그래프로 나타냄으로써 작도하였다. 돌연변이체에 대한 상대적인 비활성의 결정은 S-2288 분석법에 기재된 바와 같이 행하였다.

2. 피브리노겐 자극 S-2251분석법

이 분석 방법은 PBS를 트롬빈으로 대체시킨 것을 제외하고는 피브린 자극 S-2251 분석 방법에 기재된 바와 같이 행하였다.

3. 혈장 혈병 S-2251 분석

표준 곡선 시료 제조 및 플라스민-세파로오스를 사용하여 단일 사슬 rt-PA를 이중 사슬 rt-PA로의 전환은 피브린-자극 S-2251 분석 방법에 기재된 바와 같이 행하였다. 인체 트롬빈(31 ㎍/ml 용액의 10 ㎕)을 미세적량 플레이트의 각각의 웰에 첨가하였다. 표준 및 돌연변이체 시료(40 ㎕)을 플레이트에 첨가하고, 시트르산 덱스트로오스 인체 혈장 90㎕ 및 9.1 mM S-2251 (KabiVitrum) 10㎕의 혼합물 100 ㎕를 첨가시킴으로써 반응을 개시하였다. 발색을 405nm에서 측정하고, 492nm의 참고 파장에서의 흡광도를 각각의 시점에서 감하였다. 데이타의 분석은 피브린-자극 S-2251 분석법에 기재된 바와 같이 행하였다.

4. 혈장 S-2251 분석 방법

이 분석 방법은 PBS를 트롬빈으로 대체시킨 것을 제외하고는 혈장 혈병 S-2251 분석법에 기재된 바와 같이 행하였다.

피브린 의존 및 혈장 혈병 의존 분석법을 사용하여 돌연변이체의 효소원으로서의 질에 대해 분석하였으며, 야생형에 비교한 결과를 표 2 및 3에 각각 나타냈다. 단일 사슬 형태의 돌연변이체의 값은 2회 측정값의 평균값이다. 이중 사슬 형태의 돌연변이체의 값은 4회의 측정값의 평균값이다.

상기 각각이 분석에 대한 각각의 돌연변이체가 효소원성을 나타내는 것을 나타내는 표 1-3 중의 데이타 요약은 다음의 표 4에 나타낸다.

표 4에 기재된 효소원 t-PA 변이체는 단일 사슬 및 이중 사슬 형태 모두의 S-2251 피브린 특이성 분석법 및(또는) S-2251 혈장 혈병 특성 분석법으로 분석하였다. 단일사슬 및 이중사슬 t-PA 변이체에 대한 결과는 각각 다음의 표 5 및 6에 나타냈다.

표 5 및 6 중의 데이타 요약은 다음과 같다. 표 4로 부터의 효소 rt-PA 변이체 각각은 역시 야생형 t-PA에 상대적인 피브린 및(또는) 플라스마 혈병 특이성임을 보여준다. X는 S-2251 분석법으로 측정한 바와 같이 피브리노겐에 대한 피브린의 비 또는 혈장에 대한 혈장 혈병의 비율이 다음의 표 5 및 6에 나타낸 바와 같이 1.5임을 나타낸다.

피브린 및(또는) 혈장 혈병 특이성을 나타내는 rt-PA 변이체와 상기에서 특정화된 효소원성의 범주를 만족하는 변이체 사이에 놀랄만한 상호관계가 있다. 또한 2개의 rt-PA 변이체는 피브린 특이성을 나타내는 것으로 밝혀졌지만 야생형 rt-PA에 상대적인 효소원은 아니었다. 표 8는 피브린 특이성 및 혈장 혈병 특이성 변이체에 대한 S-2251 분석 데이타를 나타냈다.

다음의 배양물은 미합중국 메릴렌드주 로크빌 파크로운 드라이브 12301에 주소를 둔 American Type Culture Colletion에 기탁되었다.

이 기탁은 특허 절차를 위한 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약의 규정 및 조약하의 법령에 근거하여 행하였다. 이 조약은 기탁일로부터 30년 동안 생균 배양물을 유지토록 하고 있다. 이 미생물은 부다페스트 조약하에서 ATCC에 의해 이용할 수 있으며, 이 사실은 Genentech, Inc. 사와 ATCC기관 사이의 동의에 의한 것이며, 미합중국 특허 또는 모든 미합중국 또는 외국 특허 출원의 공개에 관해서 일반 대중은 이 배양물을 영구적이고 비제한적으로도 이용할 수 있으며, 무엇보다도 우선적으로, 35 USC 122 및 상기에 관한 특허청장의 규칙 (37 CFR 1.14, 구체적으로는 참고번호 886 0G 638을 포함함)에 따른 미합중국 특허청장에 의해 결정된 사람에게 이 미생물을 이용할 수 있게 해준다.

기탁된 배양물이 죽거나, 분실되거나 또는 적합한 조건하에서 배양시킬 때 살아남지 못할 경우 본 특허 출원의 기탁자는 동일한 배양물의 생균종으로 통지를 받을 때에 즉각적으로 재기탁 할 것에 동의하였다. 기탁된 균주의 가용성은 특허법에 따라 모든 정부의 권한 하에서 부여된 권리에 반하여 본 발명의 실시 허가로서 해석될 수 없다.

Claims (17)

1. (i) 야생형 재조합 조직 플라스미노겐 활성제 (rt-PA)보다 더 큰 단일 사슬형과 이중 사슬형 사이의 활성 차, (ii) S-2251 분석에서 야생형 rt-PA보다 더 높은 피브리노겐 의존 특이 활성에 대한 피브린 의존 특이 활성의 비율, 및 (iii) S-2251 분석에서 야생형 rt-PA보다 더 높은 혈장 의존 특이 활성에 대한 혈병 의존 특이 활성의 비율 중 1가지 이상의 생물학적 활성을 나타낼 수 있는, (1) 305 위치의 아미노산이 히스티딘으로 치환된 야생형 인체 조직 플라스미노겐 활성제 (t-PA) 변이체, (2) 296, 297, 298 또는 299 위치의 아미노산이 치환된 t-PA 변이체, 및 (3) 267; 283, 287; 303, 304; 331, 332; 339, 342; 347, 348, 349, 351; 364, 365, 366; 408; 410; 416, 417, 418; 426, 427, 429, 430; 432, 434; 440; 445, 449; 449, 453; 460, 462; 477; 487, 489; 505, 506; 513; 519, 522, 523; 및 523, 526 위치 중 임의의 위치의 아미노산이 알라닌으로 치환된 t-PA 변이체 (여기서, 아미노산 위치를 나타내는 번호는 제1도의 번호에 대응하는 것임)로 이루어지는 군 중에서 선택되는 인체 조직 플라스미노겐 활성제 (t-PA) 변이체.
2. 제1항에 있어서, K296A, H297A, R298A, R299A t-PA인 변이체.
3. 제1항에 있어서, 296, 297, 298 및 299 위치의 각 아미노산이 알라닌으로 치환된 것인 변이체.
4. (a) 조직 플라스미노겐 활성제 (t-PA)의 프로테아제 도메인의 305 위치의 아미노산에 히스티딘을 도입하거나, 296, 297, 298 또는 299 위치의 아미노산에 천연 아미노산 잔기 이외의 다른 아미노산을 도입하거나, 또는 267; 283, 287; 303, 304; 331, 332; 339, 342; 347, 348, 349, 351; 364, 365, 366; 408; 410; 416, 417, 418; 426, 427, 429, 430; 432, 434; 440; 445, 449; 449, 453; 460, 462; 477; 487, 489; 505, 506; 513; 519, 522, 523; 및 523, 526 위치 중 임의의 위치의 아미노산에 알라닌을 도입하고 (여기서, 아미노산 위치를 나타내는 번호는 제1도의 번호에 대응하는 것임).

   (b) 얻어진 변이체 중에서, (i) 야생형 재조합 t-PA(rt-PA) 더 큰 단일 사슬형과 이중 사슬형 사이의 활성 차, (ii) S-2251 분석에서 야생형 rt-PA보다 더 높은 피브리노겐 의존 특이 활성에 대한 피브린 의존 특이 활성의 비율, 및 (iii) S-2251 분석에서 야생형 rt-PA보다 더 높은 혈장-의존 특이 활성에 대한 혈병-의존 특이 활성의 비율 중 1가지 이상의 생물학적 활성을 나타낼 수 있는 t-PA 변이체를 선별하는 것을 포함하는, 특정 생물학적 활성을 가진 조직 플라스미노겐 활성제 변이체의 동정 방법.
5. 제4항에 있어서, 선별된 t-PA 변이체가 일시적 발현계에서 생산되는 것인 방법.
6. 제1항의 변이체를 암호하는 DNA 분자.
7. 제6항에 있어서, K296A, H297A, R298A, R299A t-PA 변이체를 암호하는 것인 DNA분자.
8. 형질 전환체 숙주 세포 내에서 제6항의 DNA 서열을 발현시킬 수 있는 복제 가능한 발현 벡터.
9. 제8항에 있어서, 형질 전환체 숙주 세포가 진핵 세포인 복제 가능한 발현 벡터.
10. 제8항에 있어서, 형질 전환체 숙주 세포가 원핵 세포인 복제 가능한 발현 벡터.
11. 제8항의 벡터로 형질 전환된 숙주 세포.
12. 제11항에 있어서, 진핵 세포인 숙주 세포.
13. 제11항에 있어서, 효모 세포인 세포.
14. 제11항에 있어서, 포유류 세포인 세포.
15. 제11항에 있어서, 변이체를 암호화하는 DNA 서열을 일시적으로 발현시킬 수 있는 것인 숙주 세포.
16. 제약학상 허용되는 담체와 치료적 유효량의 제1항의 변이체를 함유하는 혈관계 질환 치료용 조성물.
17. 제약학상 허용되는 담체와 치료적 유효량의 제1항의 변이체를 함유하는 피브린 침착 또는 유착 형성 또는 재형성 방지용 조성물.