NO310778B1 - Fremgangsmåte for fremstilling av vevsplasminogen-aktivator med zymogeniske eller fibrinspesifikke egenskaper - Google Patents
Fremgangsmåte for fremstilling av vevsplasminogen-aktivator med zymogeniske eller fibrinspesifikke egenskaper Download PDFInfo
- Publication number
- NO310778B1 NO310778B1 NO19910811A NO910811A NO310778B1 NO 310778 B1 NO310778 B1 NO 310778B1 NO 19910811 A NO19910811 A NO 19910811A NO 910811 A NO910811 A NO 910811A NO 310778 B1 NO310778 B1 NO 310778B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- amino acid
- type
- variant
- wild
- host cell
- Prior art date
Links
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 title claims abstract description 503
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 title claims abstract description 502
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 title claims abstract description 501
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 title claims abstract description 61
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 61
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 title claims abstract description 61
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 title claims abstract description 60
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 82
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 title abstract description 23
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title description 9
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 94
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 claims abstract description 25
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 claims abstract description 24
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 239000004365 Protease Substances 0.000 claims abstract description 24
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 16
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 107
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 97
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 84
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 65
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 46
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 43
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 37
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 36
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 claims description 23
- 108010031891 KHRR 296-299 AAAA T103N Proteins 0.000 claims description 21
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 20
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 20
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 19
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 16
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 16
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 14
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 13
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 13
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 11
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 11
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 10
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 10
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 10
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 9
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 claims description 9
- 125000003295 alanine group Chemical group N[C@@H](C)C(=O)* 0.000 claims description 9
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 235000008729 phenylalanine Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 9
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N phenylalanine group Chemical group N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 9
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 claims description 9
- 235000002374 tyrosine Nutrition 0.000 claims description 9
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 9
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 8
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 8
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 claims description 8
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 8
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 8
- 101000801481 Homo sapiens Tissue-type plasminogen activator Proteins 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 7
- 102000047823 human PLAT Human genes 0.000 claims description 7
- 235000008521 threonine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 6
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 6
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 5
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 5
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 5
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 5
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 5
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 5
- 102220566256 Acid-sensing ion channel 3_Y67N_mutation Human genes 0.000 claims description 4
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 4
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 4
- 235000014705 isoleucine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 235000005772 leucine Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 4
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 claims description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 3
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 claims description 2
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000001878 Bakers yeast glycan Substances 0.000 claims 1
- 125000000837 carbohydrate group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 abstract description 26
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 abstract description 26
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract description 14
- 230000008021 deposition Effects 0.000 abstract description 5
- 230000004075 alteration Effects 0.000 abstract description 3
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 abstract description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 abstract 1
- 102100037486 Reverse transcriptase/ribonuclease H Human genes 0.000 abstract 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 43
- 102000013566 Plasminogen Human genes 0.000 description 29
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 28
- 108010051456 Plasminogen Proteins 0.000 description 27
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 26
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 25
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 22
- 108010088842 Fibrinolysin Proteins 0.000 description 21
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 20
- 241000829100 Macaca mulatta polyomavirus 1 Species 0.000 description 18
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 17
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 17
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 16
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 16
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 16
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 15
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 15
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 15
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 15
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 14
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 14
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 13
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 12
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 12
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 12
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 12
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 11
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 11
- 108020005067 RNA Splice Sites Proteins 0.000 description 10
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 10
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 10
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 10
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 10
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 10
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 9
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 9
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 8
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 7
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 7
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 7
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 7
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 7
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 239000000047 product Substances 0.000 description 7
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 7
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 6
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 6
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 6
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 6
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 5
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 5
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 5
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 5
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 5
- 238000012867 alanine scanning Methods 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 5
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 5
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 5
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 5
- 235000012434 pretzels Nutrition 0.000 description 5
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 5
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 4
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 4
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 4
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 4
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 4
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 4
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 4
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091027305 Heteroduplex Proteins 0.000 description 3
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 3
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 3
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 3
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N diazepam Chemical compound N=1CC(=O)N(C)C2=CC=C(Cl)C=C2C=1C1=CC=CC=C1 AAOVKJBEBIDNHE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 3
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 229960003766 thrombin (human) Drugs 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 3-phospho-D-glyceric acid Chemical compound OC(=O)[C@H](O)COP(O)(O)=O OSJPPGNTCRNQQC-UWTATZPHSA-N 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 2
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 description 2
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 description 2
- 102000005731 Glucose-6-phosphate isomerase Human genes 0.000 description 2
- 108010070600 Glucose-6-phosphate isomerase Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 206010061216 Infarction Diseases 0.000 description 2
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001460678 Napo <wasp> Species 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 2
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 2
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000012223 aqueous fraction Substances 0.000 description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 2
- 229960003669 carbenicillin Drugs 0.000 description 2
- FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N carbenicillin Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)C(C(O)=O)C1=CC=CC=C1 FPPNZSSZRUTDAP-UWFZAAFLSA-N 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 2
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 2
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 2
- 239000010432 diamond Substances 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 2
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 2
- 125000000487 histidyl group Chemical class [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 2
- 229940106780 human fibrinogen Drugs 0.000 description 2
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 2
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007574 infarction Effects 0.000 description 2
- -1 isocytochrome C Proteins 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 2
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 229940099990 ogen Drugs 0.000 description 2
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 2
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 2
- 150000004671 saturated fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 2
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 2
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 2
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 2
- 235000021122 unsaturated fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 1-prop-2-ynoxypropan-2-ol Chemical compound CC(O)COCC#C GZCWLCBFPRFLKL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 100676-05-9 Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OCC1C(O)C(O)C(O)C(OC2C(OC(O)C(O)C2O)CO)O1 OWEGMIWEEQEYGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;(2r,3s,4r,5r)-2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O IJRKANNOPXMZSG-SSPAHAAFSA-N 0.000 description 1
- 102000013563 Acid Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108010051457 Acid Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 101710187573 Alcohol dehydrogenase 2 Proteins 0.000 description 1
- 101710133776 Alcohol dehydrogenase class-3 Proteins 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 1
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 1
- 108010077805 Bacterial Proteins Proteins 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 1
- 101800004419 Cleaved form Proteins 0.000 description 1
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 1
- 230000008836 DNA modification Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 208000005189 Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101100390711 Escherichia coli (strain K12) fhuA gene Proteins 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 241001524679 Escherichia virus M13 Species 0.000 description 1
- 108010058861 Fibrin Fibrinogen Degradation Products Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000030595 Glucokinase Human genes 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000005548 Hexokinase Human genes 0.000 description 1
- 108700040460 Hexokinases Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N Maltose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)OC(O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-PICCSMPSSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 108010087702 Penicillinase Proteins 0.000 description 1
- 208000018262 Peripheral vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 102000001105 Phosphofructokinases Human genes 0.000 description 1
- 108010069341 Phosphofructokinases Proteins 0.000 description 1
- 102000012288 Phosphopyruvate Hydratase Human genes 0.000 description 1
- 108010022181 Phosphopyruvate Hydratase Proteins 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 1
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 1
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 1
- 208000010378 Pulmonary Embolism Diseases 0.000 description 1
- 108010011939 Pyruvate Decarboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102000013009 Pyruvate Kinase Human genes 0.000 description 1
- 108020005115 Pyruvate Kinase Proteins 0.000 description 1
- 108020005091 Replication Origin Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 102000008847 Serpin Human genes 0.000 description 1
- 108050000761 Serpin Proteins 0.000 description 1
- 241000607720 Serratia Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 102000005924 Triose-Phosphate Isomerase Human genes 0.000 description 1
- 108700015934 Triose-phosphate isomerases Proteins 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 101710162629 Trypsin inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 229940122618 Trypsin inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 108091034131 VA RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 239000002269 analeptic agent Substances 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940045687 antimetabolites folic acid analogs Drugs 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 239000013011 aqueous formulation Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N beta-maltose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QUYVBRFLSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920002988 biodegradable polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000004621 biodegradable polymer Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 238000010504 bond cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical group NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000015861 cell surface binding Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 229960001231 choline Drugs 0.000 description 1
- OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N choline Chemical compound C[N+](C)(C)CCO OEYIOHPDSNJKLS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000035602 clotting Effects 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 239000005549 deoxyribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000006334 disulfide bridging Effects 0.000 description 1
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000000208 fibrin degradation product Substances 0.000 description 1
- 230000020764 fibrinolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003527 fibrinolytic agent Substances 0.000 description 1
- 230000003480 fibrinolytic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002224 folic acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002414 glycolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- 230000005484 gravity Effects 0.000 description 1
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000009629 microbiological culture Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 229950009506 penicillinase Drugs 0.000 description 1
- 235000019271 petrolatum Nutrition 0.000 description 1
- 239000008177 pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 229960004838 phosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 238000013492 plasmid preparation Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 1
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000010410 reperfusion Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000009738 saturating Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008354 sodium chloride injection Substances 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000009424 thromboembolic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000103 thrombolytic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 125000002264 triphosphate group Chemical class [H]OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])OP(=O)(O[H])O* 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101150108727 trpl gene Proteins 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000004879 turbidimetry Methods 0.000 description 1
- 125000001493 tyrosinyl group Chemical group [H]OC1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 239000012178 vegetable wax Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
- A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Vascular Medicine (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Hematology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Transition And Organic Metals Composition Catalysts For Addition Polymerization (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
- Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)
Abstract
Vevsplaemlnogen-aktivator (t-PA) zymogener og varianter, inkludert en flbrinolytisk aktiv variant av t-PA som har en amino6yreendring 1 et sete Innenfor proteasedomenen til t-PAanunenlignet med tilsvarende villtype t-PA, idet endringen gjør varianten zymogenisk i nærvær av plasmin-degradert fibrinogen, og/eller flbrln (eller plasmakoagel) spesifikk, sammenlignet med tilsvarende villtype t-PA blir fremstilt. DNA-sekvenser som koder for zymogenene og variantene, samt ekspresjonsvektorer som Inkorporerer DNA-sekvensene, og vertsceller transformert med ekspresjonsvektorene, kan bli fremstilt. Zymogener og varianter kan bli anvendt i et farmasøytisk preparat for å behandle en karsykdom eller tilstand eller for å forhindre fibrinavleiring eller adhesjonsdannelse i pattedyr.
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av spesielle vevsplasminogen-aktivator (t-PA) zymogener. Oppfinnelsen vedrører i tillegg varianter med en modifisert struktur som omfatter substituerte aminosyrer innenfor proteasedomenen til t-PA, der modifikasjonen gjør varianten zymogenisk, dvs. relativt inaktiv i dets en-kjede form, men aktiv når omdannet til dets to-kjede form i nærvær av fibrin, og/eller mer fibrin (eller plasmakoagel) spesifikk enn vill-type (wt) t-PA.
Plasminogenaktivatorer er enzymer som aktiverer zymogen-plasminogen for dannelse av serinproteinase-plasmin (ved spaltning ved Arg561 - Val562) som degraderer forskjellige proteiner, inkludert fibrin. Blant plasminogenaktivatorer som er studert er streptokinase, et bakterielt protein, urokinase, et enzym syntetisert i nyren og andre steder og som opprinnelig er ekstrahert fra urin, og human vevsplasminogen-aktivator (t-PA), et enzym produsert av cellene som kler veggene til blodårer.
Virkningsmekanismen til hver av disse plasminogenaktivatorene er forskjellige: Streptokinase danner et kompleks med plasminogen eller plasmin, for dannelse av plasminogen-aktiverende aktivitet, urokinase spalter plasminogen direkte, og t-PA, fibrin og plasminogen reagerer for dannelse av maksimal aktivitet.
t-PA er blitt identifisert og beskrevet som et spesielt viktig og potent nytt biologisk, farmasøytisk middel som har vist ekstraordinære resultater ved behandling av vaskulære sykdommer, så som hjerteinfarkt, grunnet delvis dets høye fibrinspesifisitet og potente evne til å oppløse blodkoagler in vivo.
Til tross for at eksistensen av t-PA aktiverte flere forskere ved flere vitenskapelige grupper, ble det først identifisert som et vesentlig rent isolat fra en naturlig kilde, og testet for nødvendig plasminogenaktivator-aktivitet in vivo, av Coilen et al., US-PS nr. 4.752.603 utstedt 21. Juni 1988. Se også Rijken et al., J. Biol. Chem., 256: 7035 (1981).
Deretter ble t-PA fullstendig identifisert og karakterisert ved underliggende DNA-sekvens og avledet aminosyresekvens basert på vellykket arbeid under anvendelse av rekombinant DNA-teknologi som resulterer i store mengder t-PA i et bestemt miljø. Dette arbeidet ble rapportert av Pennica et al., Nature, 301: 214 (1983)) og i US-PS nr. 4.766.075, utstedt 23. august 1988.
Basert på disse beskrivelsene ser det ut som om t-PA-molekylet inneholder fem domener som er blitt definert med referanse til homologe- eller lignende strukturer identifisert i forskjellige andre proteiner så som trypsin, chymotrypsin, plasminogen, protrombin, fibronektin og epidermal vekstfaktor (EGF). Disse domenene er blitt betegnet, begynnende ved N-terminus til aminosyresekvensen til t-PA, som 1) fingerregionen (F) som varierende er blitt definert å omfatte aminosyrene 1 til omtrent 44, 2) vekst-faktorregionen (G) som er blitt definert som å rekke fra omtrent aminosyrene 45 til 91 (basert på homologi med EGF), 3) kringle en (Kl) som er blitt definert å rekke fra omtrent aminosyre 92 til omtrent aminosyre 173, 4) kringle to (K2) som er blitt definert å rekke fra omtrent aminosyre 180 til omtrent aminosyre 261, og 5) den såkalte serinprotease-domenen (P) som generelt er blitt definert å rekke fra omtrent aminosyre 264 til, den C-terminale enden av molekylet. Disse domenene, som er beliggende generelt ved siden av hverandre, eller er separert av korte "1inker"-regioner, utgjør hele aminosyresekvensen fra 1 til 527 aminosyrer av den antatte modne formen til t-PA.
Hver domene er blitt beskrevet varierende for å bidra med visse spesifikke, biologiske signifikante egenskaper. Fingerdomenen er blitt karakterisert å inneholde en sekvens for i hvert fall stor viktighet for høy bindingsaf f initet til fibrin. (Denne aktiviteten antas å være viktig for den høye spesifisiteten som t-PA utviser med hensyn på koagellysering ved lokuset til en fibrin-rik trombe). Den vekstfaktor-lignende regionen er likeledes blitt assosiert med celleover-flatebindende aktivitet. Kringle 2-regionen er også blitt sterkt knyttet til fibrin-binding og med evnen som fibrin har til å stimulere aktiviteten til t-PA. Serinprotease-domenen er ansvarlig for den enzymatiske spaltningen av plasminogen for å produsere plasmin.
Til tross for fordelene knyttet til naturlig t-PA som et koagel-oppløsende middel, antas det ikke at det naturlige proteinet nødvendigvis representerer det optimale t-PA-middelet under alle tilfellene. Derfor er flere varianter blitt foreslått eller angitt for å forsterke de spesifikke egenskapene til t-PA. Noen av disse variantene utviser ulemper knyttet til anvendelsen av naturlig t-PA i situa-sjoner hvor et middel med en lengre halveringstid eller saktere klaringshastighet ville være foretrukket, f.eks. ved behandling av dypvene-trombose og etter reperfusjon av en pasient med infarkt, eller hvor et enkeltkjede-middel er foretrukket.
Fjerning av en vesentlig del eller hele fingerdomenen resulterer for eksempel i et molekyl med vesentlig reduserte fibrinbindingskaraktertrekk, det er derimot en reduksjon i den helhetlige fjerningshastigheten av den resulterende andelen, se V/0 89/00197 publisert 12. januar 1989.
Varianter er beskrevet i EPO Pat. publikasjonsnr. 199.574 som har aminosyresubstitusjoner ved de proteolytiske spaltnings-setene ved posisjonene 275, 276 og 277. Disse variantene, kjennetegnet fortrinnsvis som t-PA-varianter med en aminosyre forskjellig fra arginin i posisjon 275, blir betegnet som protease-resistente enkjedede t-PA-varianter i det, ulikt naturlig t-PA, som kan eksistere i enten en enkjede- eller tokjede-form, er resistente overfor proteasespaltning i posisjon 275 og blir derfor ikke omdannet metabolsk in vivo til en tokjede-form. Denne formen antas å ha visse fordeler biologisk og kommersiell på grunn av at den er mer stabil når fibrinbinding og fibrinstimulering blir øket relativt til tokjede-t-PA. Videre er plasminogenaktivatorer beskrevet å omfatte en domene som kan reagere med fibrin og proteasedomenen til urokinase, der en utførelsesform er urokinase endret slik at den er mindre mottakelig for dannelse av tokjede-urokinase. Se WO 88/05081 publisert 14. juli 1988.
For ytterligere patentlitteratur vedrørende modifikasjon av proteasespaltningssetet til t-PA, se for eksempel EPO Pat. nr. 241.209; EP 201.153 publisert 12. november 1986; EP 233.013 publisert 19. august 1987; EP 292.009 publisert 23. november 1988; EP 293.936 publisert 7. desember 1988; og EP 293.934 publisert 7. desember 1988; og WO 88/10119.
Glykosyleringsmutanter ved 117-119, 184-186 og 448-450 utviser høyere spesifikk aktivitet når molprosent karbohydrat var redusert. Se EPO-Publ. nr. 227.462 publisert 1. juli 1987. Denne patentsøknaden beskriver i tillegg anvendelse av en analyse av fibrin/fibrin-degraderingsprodukter og beskriver at man også kan modifisere t-PA-molekylet i posisjonene 272-280 eller deletere opp til 25 aminosyrer fra C-terminus. t-PA-mutantene med Asnll9, Alal86 og Asn450, som har N-glykosyleringsseter selektivt fjernet ved DNA-modifikasjon, men som inneholder gjenværende 0-bundet karbohydrat, ble funnet å være omtrent to ganger så potent som melanom t-PA i en in vitro-lysisanalyse. Se EPO-publ. nr. 225.286 publisert 10. juni 1987.
Erstatning av aminosyren ved 449 til t-PA med en hvilken som helst aminosyre unntatt arginin for å modifisere glykosyleringssetet, samt modifikasjon av Arg275 eller delesjon av
-3 til 91 regionen, blir også beskrevet. Se WO 87/04722 publisert 13. august 1987. En aminosyre-substitusjon i
posisjon 448 i t-PA er beskrevet som ønskelig for å fjerne glykosylering. Se EPO Publ. nr. 297.066 publisert 28. desember 1988. Kombinasjonen av modifikasjoner i posisjonene 448-450 og delesjon av N-terminale 1-82 aminosyrer er beskrevet i WO 89/00191 publisert 12. januar 1989. I tillegg er urokinase blitt modifisert i regionen Asp302-Ser303-Thr304 for å forhindre glykosylering. Se EPO Publ. nr. 299.706 publisert 18. januar 1989. Endring av glykosyleringssetene, og spesielt den ved aminosyre 117, ser ut til å resultere i et molekyl som har oppnådd karaktertrekk ved oppløselighet som i tillegg kan resultere i et endret sirkulerende halveringstidsmønster og/eller karaktertrekk ved fibrin-binding. Se EPO Pat. Publ. nr. 238.304, publisert 23. september 1987.
Når vekstfaktordomenen til t-PA er deletert er den resulterende varianten enda aktiv og bindes til fibrin, som rapportert av A.J. van Zonneveld et al., Thrombos. Haemostas., 54 (1) 4 (1985). Forskjellige delesjoner i vekstfaktordomenen er også blitt rapportert i patentlittera-turen. Se EPO Publ. nr. 241.209 (des-51-87), EPO Publ. nr. 241.208 (des-51-87 og des-51-173), PCT 87/04722 (delesjon av hele eller en del av N-terminal 1-91), EPO Publ. nr. 231.624 (hele vekstfaktordomenen deletert) og EPO Publ. nr. 242.836 og Japansk Pat. Søknad Kokai nr. 62-269688 (en del eller hele vekstfaktordomenen deletert).
Det er videre blitt vist at t-PA kan bli modifisert både i regionen til den første kringledomenen og i vekstfaktor-domenen, som resulterer i øket sirkulatorisk halveringstid. Se EPO Pat. Publ. nr. 241.208 publisert 14. oktober 1987. Regionen mellom aminosyrene 51 og 87, inkludert, kan bli deletert fra t-PA for å tilveiebringe en variant som fjernes saktere fra plasma. Browne et al., J. Biol. Chem., 263: 1599-1602 (1988). t-PA kan også bli modifisert, uten negative biologiske virkninger, i regionen til aminosyrene 67 til 69 av moden, nativ t-PA, ved delesjon av visse aminosyreresidier eller erstatning av en eller flere aminosyrer med forskjellige aminosyrer. Se EPO Pat. Publ. nr. 240.334 publisert 7. oktober 1987.
En hybrid av t-PA/urokinase ved anvendelse av regionen til t-PA omfattende aminosyrene 273-527 er også beskrevet. Se EPO 290.118 publisert 9. november 1988.
Serpin-resistente mutanter av human t-PA med endringer i proteasedomenen, inkludert d296-302 t-PA, R304S t-PA og R304E t-PA, er beskrevet i Madison et al., Nature, 339; 721-724
(1989); se også artikkelen til Dagmar Ringe i samme utgave.
En generell oversikt av plasminogenaktivatorer og andre-generasjons derivater derav finnes i Harris, Protein Engi-neering, 1: 449-458 (1987). Andre oversikter angående t—PA-varianter omfatter Pannekoek et al., Fibrinolysis, 2: 123-132 (1988) og Ross et al., i "Annual Reports in IWediciua! Chemistry", vol. 23, kapittel 12 (1988).
Overnevnte beskrivelser tilveiebringer antydninger om at nyere og, i forskjellige henseende bedre, t-PA-midler eksisterer, men det er for tiden ingen t-PA-molekyler som er beskrevet som bare blir aktivert når de når stedet hvor koagelen skal bli oppløst. t-PA-molekylene som eksisterer er aktive i nærvær av fibrin og/eller plasmaproteiner eller fullblod, enten de er i enkjede- eller tokjede-form. Det ville være ønskelig å ha en zymogen t-PA som i nærvær av fibrin krever klipping av dets enkjede-form til dets tokjede-form for å bli fullstendig aktiv. Slike variantmolekyler vil sannsynligvis utvise færre bivirkninger, så som mindre blødning, og ha dårlige fibrinogen-egenskaper, som dermed tilveiebringer til den medisinske vitenskapen viktige nye alternativer ved behandling av hjerte-karsykdommer og flere andre medisinske tilstander som oppstår ved tromboemboli-tilstopninger av blodårer, samt ved forhindring av dannelsen av adhesjoner.
Det ville også være ønskelig å tilveiebringe et t-PA-molekyl som, relativt til villtype t-PA, har en høyere fibrin-stimulert (eller en plasmakoagel-stimulert) aktivitet enn fibrinogen-stimulert (eller plasma-stimulert) aktivitet, dvs. er fibrin (eller plasmakoagel) spesifikk, slik at det bare vil virke på koagelstedet og ikke systemisk.
Det er dermed en hensikt ifølge foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av zymogeniske og/eller fibrinspesifikke t-PA-molekyler som utviser viktige terapeutiske og farmasøytiske karaktertrekk.
Hensikten blir oppnådd ved forutsetning av en vevsplasminogen-aktivator (t-PA) zymogen med evne til omdanning til den enzymatiske aktive formen av t-PA ved spaltning av plasmin. I et annet henseende tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av en t-PA-variant som har en am inc-syre-endring på et sted eller steder innenfor proteasedomenen til t-PA sammenlignet med den tilsvarende villtype t-PA, idet endringen gjør varianten zymogenisk sammenlignet med tilsvarende villtype t-PA.
I en spesielt foretrukket utførelsesform er t-PA human t-PA og endringen er i regionen 305, inklusivt, som en substitusjon av histidin for fenylalanin i posisjon 305 til tilsvarende villtype t-PA.
I en annen utførelsesform vedrører foreliggende oppfinnelse en DNA-sekvens kodende for zymogenet og varianten beskrevet ovenfor, replikerbare ekspresjonsvektorer med evne til å uttrykke DNA-sekvensen i en trasformert vertscelle, og mikroorganismer og cellekulturer transformert med vektoren.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en fremgangsmåte for fremstilling av en vevsplasminogenaktivator (t-PA) variant som i en analyse av enzymatisk aktivitet utviser en større differensiell aktivitet mellom en-kjedeformen og to-kjedeformen enn vill-type rekombinant t-PA ved spesifikke aminosyresubstitusjoner, innskudd eller delesjoner i proteasedomenet, kjennetegnet ved at den omfatter: 1) å transformere en rekombinant vertscelle med rekombinant ekspresjonsvektor inneholdende nukleinsyre som koder for en t-PA-variant som har a) en aminosyre som er en annen enn fenylalanin substituert i aminosyreposisjon 305; eller b) en aminosyre satt inn etter én eller begge aminosyreposisjonenene 304 og 305; eller c) én eller flere aminosyrer deletert i aminosyreposisjonene 297 til 305, av vill-type human t-PA; idet nummereringen av aminosyreposisjonene korresponderer til den i figur 1;
2) dyrke vertcellen; og
3) gjenvinne t-PA-varianten fra vertcellen, hvori eventuelt t-PA-varianten fremstilt mangler for minst en del av fingérdomenet til det korresponderende vill-type t-PA, og den eventuelt også mangler aminosyrene 92-179 av korresponderende vill-type t-PA.
Oppfinnelsen omfatter også en fremgangsmåte for fremstilling av human vevsplasminogenaktivator, kjennetegnet ved at den har evne til å utvise en eller flere følgende aktiviteter: En stor differensiell aktivitet mellom en-kjede formen og to-kjede formen enn vill-type rekombinant t-PA, et høyere forhold mellom fibrinravhengig spesifikk aktivitet og fibrinogen-avhengig spesifikk aktivitet i en S-2251 analyse enn vill-type rt-PA, eller et høyere forhold mellom plasma-koagulerings-avhengig spesifikk aktivitet og plasma-avhengig spesifikk aktivitet i en S-2251 analyse enn vill-type rt-PA, kjenntegnet ved at den inneholder minst en aminosyresubstitu-sjon i dets proteasedomene sammenlignet med tilsvarende vill-type t-PA (fra aminosyre 264 til aminosyre 527), hvor substitusjonen er ansvarlig for nevnte biologiske aktivitet, forutsatt at variantene d296-302 t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA og A473S t-PA er ekskludert og nevnte substitusjon eks-kluderer substitusjoner utelukkende i regionene 270-280, 448-450 og 502-527, og substitusjonene i regionene 411 til 416, 416 til 423 eller 423 til 430; i det nummereringen av aminosyreposisjonene tilsvarer den i figur 1, og eventuelt mangler t-PA-varianten som fremstilles minst en del av finger domenet fra tilsvarende vill-type t-PA og den mangler eventuelt aminosyrene 92-179 av tilsvarende vill-type t-PA, hvis prosess omfatter: 1) å transformere en rekombinant vertscelle med nukleinsyre som koder for t-PA-variant;
2) dyrke vertcellsen; og
3) gjenvinne t-PA-variant fra vertcellen.
Omfattet av oppfinnelsen er også et DNA-molekyl kjennetegnet ved at det koder for varianter som tidligere nevnt.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også replikerbar ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den omfatter DNA-sekvensen som tidligere nevnt, og har evne til å uttrykke denne DNA-sekvensen i en transformantvertcelle.
Videre omfatter oppfinnelsen replikerbar ekspresjonsvektor kjennetegnet ved at den har evne til å uttrykke DNA-sekvensen som tidligere nevnt i en transformantvertcelle.
Videre omfatter oppfinnelsen en vertcelle kjennetegnet ved at den er transformert med vektoren som tidligere nevnt. Omfattet er også en eukaryot vertcelle kjennetegnet ved at den er transformert med vektoren som tidligere nevnt, og er istand til å uttrykke det gitte genet.
Foreliggende oppfinnelse omfatter vertceller kjennetegnet ved at de er transformert med vektoren som tidligere nevnt. Omfattet er også prokaryote vertceller kjennetegnet ved at de er transformert med vektoren som tidligere nevnt, og er istand til å uttrykke det gitte genet.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også en E. coli vertcelle kjennetegnet ved at den er transformert med vektoren som tidligere nevnt, og er istand til å uttrykke det gitte genet.
Foreliggende oppfinnelse er basert, inter alia, på spesifikk, vellykket forskning som demonstrerer at visse t-PA-molekyler er zymogener i nærvær av en stimulator av t-PA-aktivitet, så som plasmid-degraderte fibrinogenfragmenter, og som dermed kan få deres fibrinolytiske aktivitet inaktivert når generelt i plasma og aktivert når i nærheten av plasmin ved koagelstedet. Zymogenet blir dermed aktivert på grunn av krav for spesifikk lokalisert koagelterapi. Zymogenene heri ventes å være fibrinogen-sparsommelige og er generelt nyttige i høyere doser enn deres ikke-zymogeniske motparter, resulterende i hurtigere koagellysering og lysering av flere koageler.
Aspektet av foreliggende oppfinnelse er videre å tilveiebringe en fremgangsmåte for fremstilling av et t-PA-molekyl som er mer fibrin (eller plasmakoagel )-spesifikt slik at det vil virke mer foretrukket ved setet av koagelen enn umodifi-sert t-PA. Figur 1 angir den primære strukturen til t-PA som viser beliggenheten av de fem domenene, disulfid-brodanningen og aktiveringssetet hvor molekylet blir spaltet til et tokjede-molekyl. Figurene 2 og 3 er skjematiske representasjoner av en egnet fremgangsmåte for fremstilling av pCISt-PA, sammen med en beskrivelse av visse betydningsfulle restriksjonsseter. Figur 4 er en skjematisk representasjon av en egnet fremgangsmåte for fremstilling av p7-lH, sammen med en beskrivelse av visse vesentlige restriksjonsseter. Figur 5 viser fibrinbinding av hovedsakelig enkjede F305H (lukkede trekanter), tokjede F305H (lukkede sirkler med doble linjer), enkjede villtype t-PA (lukkede firkanter), tokjede villtype t-PA (lukkede diamanter) og en blanding av enkjede-og tokjede villtype t-PA (åpne trekanter), ved en t-PA-konsentrasjon på 10 ng/ml.
Figurene 6-9 viser plot av kinetikken ved omdanning av plasminogen til plasmin i nærvær av plasmid-degradert fibrinogen ved hovedsakelig enkjede villtype t-PA (Figur 6), tokjede villtype t-PA (Figur 7), hovedsakelig enkjede F305E t-PA (Figur 8) og tokjede F305 H t-PA (Figur 9). Firkantene, linjene og sirklene representerer forskjellige konsentrasjoner av plasminogen og t-PA i analysebufferen.
Heri betyr betegnelsene "human vevsplasminogen-aktivator", "human t-PA" og "t-PA" human ekstrinsisk (vevstype)-plasminogenaktivator med to funksjonelle regioner bestående av en proteasedomene som kan omdanne plasminogen til plasmin og en N-terminal region som antas å være ansvarlig for fibrin-binding. Disse tre betegnelsene omfatter derfor polypeptider inneholdende disse funksjonelle domenene som en del av hele sekvensen. t-PA blir fortrinnsvis produsert, f.eks. av rekombinante cellekultursystemer, i bioaktive former omfattende proteasedelen og deler av t-PA som ellers er native overfor t-PA-kilden. Det er å bemerke at naturlige alleliske variasjoner eksisterer og oppstår fra individ til individ, og blir demonstrert ved aminosyreforskjeller i den totale sekvensen.
Betegnelsen "villtype t-PA" betegner t-PA kodet av cDNA rapportert av US-PS nr. 4.766.075. t-PA kodet på denne måten er fortrinnsvis et t-PA-molekyl fra en hvilken som helst nativ kilde eller et hvilket som helst rekombinant ekspresjonssystem, omfattende 293 eller 294 celler, kinesisk hamsterovarieceller osv.
Betegnelsen "proteasedomene" betegner heri regionen til den modne formen av villtype t-PA fra aminosyre 264 til aminosyre 527.
Betegnelsene "zymogen", "zymogenisk" og "zymogenisk aktivitet" anvendt heri for å beskrive t-PA må oppfylle enten en eller begge definisjonene angitt nedenfor. I den første definisjonen angir disse betegnelsene at i nærvær av plasmin-degradert fibrinogen krever t-PA spaltning av dets enkjede-form til tokjede ("enzymatisk aktiv")-form som oppstår i nærvær av plasmin, for å øke dets enzymatiske aktivitet, som definert nedenfor, under analysebetingelsene beskrevet nedenfor.
I nærvær av fibrinogen-fragmenter er enkjede-formen til t-PA (zymogen) som definert heri mindre aktiv, ifølge måling ved analysen beskrevet nedenfor, enn villtype tokjede t-PA og blir omdannet til den mer enzymatisk aktive formen når aktivert ved utsetting for et nivå av plasmin som tilveiebringer fullstendig omdanning av enkeltkjede-formen til dobbeltkjede-formen. Generelt blir aktiviteten til enkjede-formen redusert til 50$ eller mindre av aktiviteten til den tilsvarende tokjede-formen, fortrinnsvis til 20$ eller mindre, og mer foretrukket til mindre enn 10$ av aktiviteten; og, ved spaltning til tokjede-formen blir aktiviteten øket til fra omtrent 20 til over 100$, fortrinnsvis til minst 50$, av aktiviteten til villtype tokjede-formen.
Varianten blir analysert for enzymatisk aktivitet ved bestemmelse av kinetikken til omdanning av plasminogen til plasmin ved anvendelse av kromogenisk plasminsubstrat S—2251 i nærvær av f ibrinogenfragmenter, ved anvendelse av analysen beskrevet i Eksempel I nedenfor.
Med hensyn til den første definisjonen av et zymogen heri, et zymogen som under overnevnte betingelser utviser et bestemt lag i plasminproduksjonen, og dermed i økning av A405, når plottet vs. tid<2>, men utviser lineær kinetikk med økende tid. En beskrivelse av tid<2->kinetikk finnes i Nieuwenhuizen, W., Voskuilen, M. , Tråas, D. , Hoegee-de Nobel, B., Verheijen, J.H. i "Fibrinogen—Structural Variants and Interactions", red. A. Henschen, B. Hessel, J. McDonagh, T. Saldeen (1985), sidene 331-342. Uten å være begrenset til noen teori er denne virkningen antageligvis forårsaket av den plasmin-katalyserte omdanningen av enkjede- til tokjede-formen som dermed fører til aktivering av t-PA-zymogenet. Dette står i kontrast til observasjonen om lineær kinetikk fra begynnelsen av analysen for villtype enkjede t-PA, villtype tokjede t-PA og tokjede-formen av zymogenisk t-PA.
I den andre, alternative definisjonen betegner et "zymogen" spesifikt til et t-PA-molekyl som i en analyse av enzymatisk aktivitet utviser en høy forskjellig aktivitet mellom enkjede-formen og tokjede-formen enn villtype rekombinant t-PA (rt-PA). Den forskjellige aktiviteten til zymogen er fortrinnsvis minst omtrent 1,5 ganger den til villtype rt—PA. Denne aktiviteten kan bli oppnådd ved å senke aktiviteten til enkjede-formen i høyere grad enn den til tokjede-formen relativt til villtype rt-PA; økning av aktiviteten til tokjede-formen i høyere grad enn den til enkjede-formen relativt til villtype rt-PA; eller en hvilken som helst kombinasjon av hendelsene beskrevet ovenfor som tilveiebringer den ønskede virkningen. Den zymogene karakteren til villtype t-PA er beskrevet i Loscalzo, J. Clin. Invest., 82: 1391-1397 (1988) og Ranby et al., Thrombosis Research, 27: 175-183 (1982).
Uttrykket "fibrinspesifisitet" betegner aktiviteten til en mutant som utviser et høyere forhold mellom fibrin-avhengig spesifikk aktivitet til fibrinogen-avhengig spesifikk aktivitet i en S-2251-analyse (i enten enkjede- eller tokjede-formen) enn villtype rt-PA, og fortrinnsvis et forhold på minst 1,5.
Uttrykket "plasmakoagel-spesifisitet" refererer til aktiviteten til en mutant som utviser et høyere forhold mellom plasmakoagel-avhengig spesifikk aktivitet og plasma-avhengig spesifikk aktivitet i en S-2251-analyse (i enten enkjede-eller tokjede-formen) enn villtype rt-PA, og fortrinnsvis et forhold på minst 1,5.
Anvendt heri betegner "transient ekspresjonssystem" en cellekultur inneholdende celler transfektert med en t-PA-variantkodende vektor som uttrykker DNA-sekvensen kodende for varianten på en transient måte, dvs. på en måte som ikke behøver å være stabil. Slike celler blir betegnet "evne til transient ekspresjon".
For diskusjon av variantene heri blir det referert til Figur 1, som illustrerer den primære strukturen til t-PA. I Figur 1 er bokstavene i sirklene enkeltbokstav aminosyrekoder, koblingslinjene mellom kjedene angir disulfid-brodannelse, åpne sirkler angir glykosyleringsseter og betegnelsene F, GF, Kl, K2 og SP angir henholdsvis finger, vekstfaktor, kringle 1, kringle 2 og serinprotease-domenene.
For å forkorte betegnelsene av t-PA variantene beskrevet heri er det å bemerke at tallene betegner aminosyreresidiet/ posisjonen langs aminosyresekvensene til antatt moden t-PA (EPO-Publ. nr. 93.619). Aminosyreidentifikasjonen anvender enkeltbokstavalfabetet til aminosyrene, dvs.
Betegnelsen for en substitusjonsvariant heri består av en bokstav etterfulgt av et tall etterfulgt av en bokstav. Den første (venstre) bokstaven angir aminosyren i villtype, moden t-PA. Tallet refererer til aminosyreposisjonen hvor amino-syresubstitusjonen er utført, og den andre (høyre) bokstaven angir aminosyre som blir anvendt for å erstatte villtype-aminosyren. Betegnelsen for en innskuddsvariant består av bokstaven i etterfulgt av et tall som betegner posisjonen til resten i villtype, moden t-PA foran der hvor innskuddet begynner, etterfulgt av en eller flere store bokstaver som angir innskuddet som skal bli utført. Betegnelsen for en delesjonsvariant består av bokstaven d etterfulgt av et tall på startposisjonen til deleksjonen til tallet til slutt-posisjonen av delesjonen, der posisjonene er basert på villtype, moden t-PA. Multiple mutasjoner er separert av et komma i betegnelsen for å lette avlesning av disse.
Eksempler på nomenklaturen er som følger: en substitusjonsvariant hvor fenylalanin i posisjon 305 til villtype t-PA er erstattet med et histidin-residie er betegnet F305H. En substitusjonsvariant med multiple substitusjoner ved på-følgende posisjoner 296-299 til AAAA for KHRR er betegnet K296A, H297A, R298A, R299A. En innskuddsvariant hvor cystein og valin er skutt inn etter posisjon 305 til villtype t-PA er betegnet i305CV. En delesjonsvariant hvor aminosyrene i posisjonene 300 til 305 er deletert fra villtype, moden t—PA er betegnet d300-305. Betegnelsen 't-PA' følger etter hver mutant.
En foretrukket klasse zymogener heri er de som har en substitusjon, delesjon eller innskudd i eller rundt posisjon 305 til villtype t-PA. Disse variantene omfatter de med en aminosyre forskjellig fra fenylalanin i posisjon 305 i tilsvarende villtype t-PA. Slike varianter er fortrinnsvis de med en aminosyre i posisjon 305 med en sidekjede som kan virke som eller som virker som en donor av hydrogenbinding, en som inneholder en hydroksylgruppe eller nitrogenatom. Slike aminosyrer er fortrinnsvis arginin, lysin, tyrosin, asparagin, glutamin og histidin, fortrinnsvis histidin. Foretrukne innskuddsbare zymogene varianter av denne typen omfatter de med en eller flere, fortrinnsvis en, aminosyre skutt inn etter aminosyren i posisjon 304 eller 305, så som aminosyrene beskrevet ovenfor, dvs. de med en sidekjede som kan virke eller som virker som en donor av hydrogenbinding, så som en som inneholder en hydroksylgruppe eller et nitrogenatom, f.eks. arginin, lysin, tyrosin, asparagin, glutamin og histidin, mest foretrukket histidin. Foretrukne delesjonszymogeniske varianter omfatter de med delesjoner i regionen 297 til 305, til villtype t-PA, inkludert d297 t-PA, d298 t-PA, osv. og kombinasjoner derav, så som d297-299 t—PA eller d297,d305 t-PA.
Spesielle utførelsesformer av overnevnte zymogenvarianter omfatter: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; i304T t-PA; i304N t-PA; 1304K t-PA; i304R t-PA; i304Q t-PA; i304HH t-PA; i305H t-PA; i305T t-PA; i305N t-PA; i305K t-PA; i305R t-PA; 13050 t-PA; i304H,i305H t-PA; i305HH t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d303 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297-304 t-PA; d297-305 t-PA; d300-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA; d300-304 t-PA; d300-305 t-PA; d304-305 t-PA; d297,d300 t-PA; d297,d305 t-PA; dl-44,N184D,F305H t-PA; dl-44,F305H t-PA; dl-44 ,1210R ,G211A ,K212R ,V213R ,F305H t-PA; dl-44,I210R.G211A, K212R,V213K,F305H t-PA; dl-44,V213K,F305H t-PA; dl-44,T252R,F305H t-PA; dl-44.V213K.T252R,F305H t-PA; dl-44 , I210K , F305H t-PA; dl-44,I210R,G211H,K212Q,V213K,F305H t-PA; I210R,G211H,K212Q,V213K,F305H t-PA; I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; dl-44.N184D,I210R.G211A, K212R,V213R,T252R,F305H t-PA; N184D,I210R,G211A,K212R,V213R, T252R.F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; d92-179,I210R.G211A, K212R,V213R,F305H t-PA; d92-179,N184D,I210R.G211A.K212R, V213R,T252R,F305H t-PA; d92-179,I210R,G211A.K212R,V213R, T252R.F305H t-PA; Y67N.F305H t-PA; dl-44,Y67N,F305H t-PA; og T252R eller N184S analogene derav eller kombinasjoner derav.
(Forandringer forskjellige fra de i proteasedomenen er beskrevet ytterligere nedenfor).
Ut fra disse er foretrukne zymogenvarianter F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; dl-44,F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA; dl-44,N184D,F305H t-PA; dl-44,I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; dl-44,I210R,G211A,K212R,V213K,F305H t-PA; I210R,G211A,K212R,V213R,F305H t-PA; d92-179,I210R,G211A, K212R.V213R.F305H t-PA; d92-179,N184D,I210R,G211A.K212R, V213R,F305H t-PA; d92-179,N184D,I210R,G211A,K212R,V213R, T252R.F305H t-PA; dl-44.N184D,I210R,G211AfK212R,V213R, T252R.F305H t-PA; og N184D,I210R,G211A,K212R,V213R.T252R, F305H t-PA.
Mer foretrukne varianter av den første klassen av zymogener er F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; dl-44,F305H t-PA; d92-179,F305H t-PA og mest foretrukket er F305H t-PA.
En annen foretrukket klasse av zymogener heri, samt en klasse av varianter som alternativt eller i tillegg kan være fibrin (eller plasmakoagel) spesifikk, er varianter med en eller flere endringer i små regioner av proteasedomenen identifisert å ha ladede aminosyresidekjeder, der regionene og/eller regionene ved siden av kan være ansvarlige for interaksjonen av t-PA med andre forbindelser som kan påvirke de forskjellige aktivitetene.
Regionene identifisert for testing for aktivitet ved denne fremgangsmåten er i residietallene 267, 283-287, 296-299, 303-304, 322, 326-327, 331-332, 339-342, 347-351, 353-356, 360-362, 364-366, 369-371, 378-383, 387-392, 400-405, 408, 410, 416-418, 426-430, 432-434, 440, 445-449, 449-453, 460-462, 471-472, 477, 487-489, 505-506, 513, 519-523 og 523-526 til tilsvarende villtype t-PA. En eller flere av disse regionene, eller subenhetene derav, er endret for å bestemme om den ønskede biologiske egenskapen eller egenskapene vil bli oppnådd. De ladede residiene (Arg, Asp, His, Lys og Glu) blir fortrinnsvis identifiserte ved anvendelse av en teknikk kjent som alanin-scanning-mutagenese, beskrevet i Cunningham og Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989), og erstattet med en naturlig- eller negativt ladet aminosyre for å påvirke interaksjonen av aminosyrene med det omgivende vandige miljøet i eller utenfor cellen.
Mutanter funnet å være i denne andre foretrukne klassen av zymogener og fibrinspesifikke molekyler er de hvori de erstattede aminosyrene er i posisjonene 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432-434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 og/eller 477 av tilsvarende villtype t-PA, hvor "+" angir erstatninger bare i posisjonene som er angitt, og "—" angir erstatninger ved alle angitte posisjoner.
For alanin-scanningsmutagenese er det foretrukket at en aminosyre blir substituert som vil nøytralisere ladningen til tilsvarende aminosyre i villtype t-PA, istedenfor å tilveiebringe en motsatt ladning på molekylet. En hvilken som helst hydrofob, vesentlig uladet eller motsatt ladet aminosyre kan bli anvendt, inkludert, som foretrukket, alanin, glysin, serin, treonin, asparagin, glutamin, valin, leucin, isoleucin, fenylalanin eller tyrosin. Blant disse er små aminosyrer, så som alanin, serin og treonin foretrukket i forhold til større aminosyrer så som valin, leucin og isoleucin. Ladede aminosyrer så som asparaginsyre eller glutaminsyre er midre foretrukne.
Aminosyren anvendt for erstatning er mer foretrukket enten alanin, serin, treonin, asparagin, glutamin, fenylalanin eller tyrosin, og enda mer foretrukket er alanin, serin eller treonin. Alanin er den mest foretrukne aminosyren på grunn av at den eliminerer sidekjeden forbi beta-karbonet og det er mindre sannsynlig at den endrer hovedkjede-konformasjonen av villtype t-PA-molekylet. Alanin finnes videre ofte i både begravede og utsatte posisjoner (Creighton, T.E., i "The Proteins" (red. W.H. Freeman & Co., N.Y.); Chothia, C. (1976) J. Mol. Biol., 150: 1).
Foretrukne varianter av sistnevnte klasse zymogener eller fibrin (eller plasmakoagel) spesifikke varianter er de som inkluderer modifikasjoner innenfor proteasedomenen til t-PA med unntagelse av variantene D365A t-PA, R462L t-PA, A473S t-PA, d296-304 t-PA, d296-302 t-PA, R298E t-PA, R299E t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA, d296-299 t-PA og K296E,R298E.R299E t-PA.
De er spesifikt slike som har en eller flere substitusjoner i posisjon(ere) 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 331, 332, 339, 342, 347, 348, 349, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 416, 417, 418, 426, 427, 429, 430, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 eller 477, eller kombinasjoner derav, av tilsvarende villtype t-PA.
Proteasedomene-variantene har fortrinnsvis substitusjoner i posisjon(ene) 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416-418, 426-427+429-430, 432+434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 og 477 av tilsvarende villtype t-PA, der "+" angir endringer bare ved angitte posisjoner, ikke posisjoner imellom, og "-" angir endringer i alle angitte posisjoner inkludert de imellom.
Ytterligere mer foretrukne er proteasedomene-variantene til sistnevnte klasse av zymogener eller fibrin (eller plasmakoagel) spesifikke varianter er R267A t-PA, D283A,H287A t-PA, K296A,H297A,R298A,R299A t-PA, E303A.R304A t-PA, H331A,H332A t-PA, R339A.R342A t-PA, E347A,E348A,E349A.K351A t-PA, D364A,D365A,D366A t-PA, E408A t-PA, E410A t-PA, K416A.H417A, E418A t-PA, E426A,R427A,K429A,E430A t-PA, H432A.R434A t-PA, R440A t-PA, H445A,R449A t-PA, R449A.D453A t-PA, D460A,R462A t-PA og D477A t-PA.
Av disse er den mest foretrukne substitusjonen et alanin-residie istedenfor hver av de eksisterende residiene ved 296-299 til villtype t-PA, dvs. K296A.H297A,R298A,R299A t-PA.
Foretrukne innskuddsvarianter som kan utvise zymogenisk-eller fibrin-spesifikk aktivitet er de hvori en eller flere aminosyrer er skutt inn etter aminosyrene i posisjonene 296, 297, 298 og/eller 299. Også foretrukket for dette formål er de proteasedomene-variantene med et innskudd bestående av enten tyrosin, asparagin, lysin, arginin eller glutamin.
Andre varianter med en eller flere aminosyre-endringer (delesjoner, substitusjoner eller innskudd, men fortrinnsvis substitusjoner) innenfor proteasedomenen (aminosyrene 264-527) til det native t-PA-molekylet er identifiserbare som utviser zymogeniske egenskaper sammenlignet ved villtype t—PA, ved anvendelse av en eller flere av screeningstestene tilveiebragt nedenfor.
t-PA-variantene heri, i tillegg til å være endret i forhold til den native sekvensen ved et eller flere proteasedomene-seter for å utvise zymogenisk og/eller fibrin (eller plasmakoagel) spesifikke egenskaper, inneholder også eventuelt substitusjoner, delesjoner eller innskudd av residier i andre regioner av den native sekvensen for å forbedre visse egenskaper av molekylet, forutsatt at forandringer ikke blir utført som forhindrer spaltning av enkjede-formen av t-PA til tokjede-formen eller på annen måte endrer en ønsket biologisk egenskap påført molekylet ved endringen(e) i proteasedomenen ifølge foreliggende oppfinnelse. Foretrukne endringer i disse andre domener er tilveiebragt ovenfor i listene av de mest foretrukne zymogenvariantene av den første typen.
Variantene heri mangler for eksempel fortrinnsvis minst en del av fingerdomenen, vekstfaktordomenen og/eller kringle 1 domenen, og/eller mangler glykosyleringspotensiale ved glykosyleringssetet rundt aminosyre 184, og inneholder fortrinnsvis aminosyremodifikasjoner i det antatte lysin-bindingssetet til kringle 1 eller 2.
I tillegg kan fibrinbinding av t-PA bli modulert, fortrinnsvis gjenopprettet eller øket, ved hensiktsmessige substitusjoner av positivt eller negativt ladede aminosyreresidier i den motsatte kanten av den antatte ligandbindingslommen til kringle 2-domenen til t-PA. Variantene heri blir generelt dannet ved seterettet mutagenese eller ved uttak/ligeringsteknikker beskrevet ytterligere nedenfor.
Spesifikke eksempler på slike varianter omfatter et molekyl som mangler aminosyrene 1 til 44 (betegnet dl-44) og et molekyl. som har asparagJnsyre i posisjon 184 (betegnet N184D). Varianter som mangler aminosyrene 1 til 44 er ytterligere beskrevet i WO 89/00197, supra.
Alle overnevnte varianter er eventuelt modifisert i forskjellige andre regioner av molekylet, dersom slike modifikasjoner ennå tilfredsstiller kriteriene uttrykt heri for zymogeniske- og/eller fibrin (eller plasmakoagel) spesifikke karaktertrekk. Slike modifikasjoner omfatter for eksempel: 1. Kringle 1 modifikasjoner, for eksempel delesjon av omtrent
92 til 179, og/eller
2. Kringle 2 modifikasjoner, for eksempel delesjon av omtrent 174-261 eller modifikasjon i regionen av aminosyrene omtrent 205-215, spesielt 210-213, og/eller 3. Aminosyrene omtrent 244-255, spesielt 252 eller dets sete, og/eller
4. Aminosyrene omtrent 233-242, spesielt 236-238, og/eller
5. Kjente glykosyleringsseter så som aminosyre 184, og/eller 6. Glykosylering innenfor vekstfaktor-domenen. t-PA-molekylet er N- eller O-bundet glykosylert innenfor vekstfaktor-domenen, fortrinnsvis i posisjon 67-69, der tyrosin i posisjon 67 er erstattet med et asparaginresidie, for å endre halveringstiden til t-PA-molekylet.
Mange av disse modifikasjonene kan betraktelig endre klaringshastighetene og fibrinbindingen relativt til nativt t-PA. Fagmannen vil kunne bestemme ved den hensiktsmessige analysen hva de optimale egenskapene til hver variant er som er ønsket i et bestemt tilfelle.
Modifikasjon for å forandre eller sette inn hensiktsmessig(e) aminosyre(r) 1 det native molekylet for å oppnå overnevnte sekvensvariasjoner blir oppnådd ved hvilke som helst av metodene kjent innenfor fagområdet, så som f.eks. seterettet mutagenese eller ligering av hensiktsmessig sekvens inn i DNA kodende for det relevante proteinet, som beskrevet nedenfor.
Preparering av t-PA-varianter i henhold til dette blir fortrinnsvis oppnådd ved seterettet mutagenese av DNA som koder for en tidligere preparert variant eller en ikke-variant versjon av proteinet. Sete-spesifikk mutagenese muliggjør produksjon av t-PA-varianter gjennom anvendelse av spesifikke oligonukleotid-sekvenser som koder for DNA-sekvensen til den ønskede mutasjonen, samt et tilstrekkelig antall ved siden av liggende nukleotider for å tilveiebringe en primersekvens med tilstrekkelig størrelse og sekvenskompleksitet for å danne en stabil dupleks på begge sidene av grensen som blir overskredet. Vanligvis er en primer på omtrent 20 til 25 nukleotider i lengde foretrukket, der omtrent 5 til 10 residier på begge sider av grensen til sekvensen er endret. Generelt er teknikken omfattende sete-spesifikk mutagenese velkjent innenfor fagområdet og er eksemplifisert ved publikasjoner så som Adelman et al., DNA, 2: 183 (1983).
Sete-spesifikk mutageneseteknikken anvender vanligvis en fagvektor som eksisterer i både en enkelttrådet- og dobbelttrådet form. Vanlige vektorer som er nyttige i seterettet mutagenese omfatter vektorer så som M13-fag, for eksempel, som beskrevet av Messing et al., Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, redaktør A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981). Denne fagen er kommersielt tilgjengelig og anvendelse derav er generelt velkjent for fagfolk. Alternativt kan plasmidvektorer som inneholder replikasjonsorigo fra en enkelttrådet fag (Veira et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)) bli anvendt for å oppnå enkelttrådet DNA.
Generelt blir seterettet mutagenese i henhold til dette utført ved først å tilveiebringe en enkelttrådet vektor som omfatter innenfor sekvensen derav en DNA-sekvens som koder for relevant t-PA. En oligonukleotidprimer inneholdende den ønskede muterte sekvensen blir fremstilt, vanligvis syntetisk, for eksempel ved metoden til Crea et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 75: 5765 (1978). Denne primeren blir deretter sammensmeltet med enkelttrådet t-PA-sekvensinne-holdende vektor, og utsatt for DNA-polymeriserende enzymer så som E. coli polymerase I Klenow-fragment, for å fullføre syntesen av den mutasjons-bærende tråden. En heterodupleks blir dermed dannet hvori, en tråd koder for den opprinnelige ikke-muterte sekvensen og den andre tråden bærer den ønskede mutasjonen. Denne heterodupleks-vektoren blir deretter anvendt for å transformere hensiktsmessige celler så som JMlOl-celler og kloner blir selektert, via hybridisasjon til en radioaktiv probe bestående av <32>P-merket mutagenese-primer, som omfatter rekombinante vektorer som bærer det muterte sekvensarrangementet.
Etter at en slik klon er selektert, kan den muterte t-PA-regionen bli fjernet og plassert i en hensiktsmessig vektor for t-PA-produksjon, vanligvis en ekspresjonsvektor av den typen som vanligvis blir anvendt for transformasjon av en hensiktsmessig eukaryot vert. Kinesisk hamsterovarie (CHO)-celler eller 293 (humane nyreceller beskrevet av Graham et al., J. Gen. Virol., 36: 59 (1977)) foretrukket for fremstilling av langvarige stabile t—PA-produsenter. Nedenfor er for eksempel et transient system som anvender 293 celler som tilveiebringer et hensiktsmessig system for produksjon av t—PA-varianter for analytiske hensikter beskrevet.
En annen fremgangsmåte for dannelse av mutasjoner i DNA-sekvensen kodende for t-PA omfatter spaltning av DNA kodende for t-PA ved hensiktsmessig posisjon ved spaltning med restriksjonsenzymer, isolering av riktig spaltet DNA, syntetisering av et oligonukleotid kodende for den ønskede aminosyren og flankerende regioner så som polylinkere med butte ender (eller, istedenfor anvendelse av polylinkere, spaltning av det syntetiske oligonukleotidet med restriksjonsenzymer også anvendt for å spalte t-PA-kodende DNA, for dannelse av kohesive termini), og ligering av det syntetiske DNA inn i det som er gjenværende av det t-PA-kodende struk-turelle genet.
Til tross for at kinesisk hamsterovarie (CHO) ekspresjon er foretrukket for t-PA-produksjon er vektorene og fremgangs-måtene beskrevet heri egnede for anvendelse i vertsceller i en mengde eukaryote organismer.
Generelt er selvfølgelig prokaryote foretrukket for innledende kloning av DNA-sekvenser og konstruering av vektorer som er nyttige i oppfinnelsen. For eksempel er E. coli K12 stamme 294 (ATCC Nr. 31.446) og E. coli-stamme W3110 (ATCC Nr. 27.325) spesielt nyttige. Andre egnede mikrobielle stammer omfatter E. coli-stammene så som E. coli B og E. coli X1776 (ATCC Nr. 31.537). Disse eksemplene er selvfølgelig illustrerende og ikke begrensende.
Prokaryoter er også nyttige for ekspresjon. Overnevnte stammer, samt bacilli så som Bacillus subtilis, og andre enterobacteriaceae så som f.eks. Salmonella typhimurium eller Serratia marcesans og forskjellige Pseudomonas-arter er for eksempel nyttige verter for ekspresjon.
Generelt blir plasmidvektorer inneholdende replikon og kontrollsekvenser som er avledet fra arter kompatible med vertscellen anvendt i sammenheng med disse vertene. Vektoren bærer vanligvis et replikasjonssete, samt markeringssekvenser som kan tilveiebringe fenotypisk seleksjon i transformerte celler. For eksempel blir E. coli vanligvis transformert ved anvendelse av pBR322, et plasmid avledet fra en E. coli-art (se f.eks. Bolivar et al., Gene, 2: 95 (1977)). pBR322 inneholder gener for ampicillin•- og tetracyklin-resistens og tilveiebringer derfor enkle midler for identifisering av transformerte celler. pBR322-plasmidet, eller annet mikro-bielt plasmid eller fag, må også inneholde, eller bli modifisert til å inneholde, promotere som kan bli anvendt av mikrobielle organismer for ekspresjon av dets egne proteiner.
Promotere som vanligvis blir anvendt i rekombiant DNA-konstruksjon omfatter p<->laktamase (penicillinase) og laktose-promotersystemer (Chang et al., Nature, 375: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977); Goeddel et al., Nature, 281: 544 (1979)). og et tryptofan (trp) promotersystem (Goeddel et al., Nucl Acids Res., 8: 4057 (1980); EPO Appl. Publ. Nr. 36.776) og alkaliske fosfatasesystemer. Disse er de mest vanlig anvendte, men andre mikrobielle promotere er blitt oppdaget og anvendt, og detaljer vedrørende deres nukleotidsekvenser er blitt publisert, og dette gjør at fagfolk kan ligere dem funksjonelt med plasmidvektorer (se f.eks. Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)).
I tillegg til prokaryoter er også eukaryote mikrober, så som gjær, anvendbare heri. Saccharomyces cerevisiae, eller vanlig bakergjær, er den mest anvendte blant eukaryote mikroorganismer, til tross for at et antall andre stammer er tilgjengelige. For eksempel blir, for ekspresjon i Saccharomyces, plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., Nature, 282: 39
(1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemper et al., Gene, 10: 157 (1980)) vanligvis anvendt. Dette plasmidet inneholder allerede trpl-genet som tilveiebringer en selek-sjonsmarkør for en mutant gjærstamme som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC Nr. 44.076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85: 12 (1977)). Tilstedeværelse av trpl-lesjon som en karakteristikk på cellegenomet til gjærverten tilveiebringer dermed et effektivt miljø for deteksjon av transformasjon ved vekst i fravær av tryptofan.
Egnede promotersekvenser i gjærvektorer omfatter promoterne for 3-fosfoglyserat-klnase (Hitzeman et. al., J. Biol. Chem., 255: 2073 (1980)) eller andre glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 (1978)), så som enolase, glyser-aldehyd-3-fosfatdehydrogenase, heksokinase, pyruvatdekar-boksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfatisomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukoseisomerase og glukokinase. Ved kontruksjon av egnede ekspresjonsplasmider blir termineringssekvensene tilhørende disse genene også ligert inn i ekspresjonsvektoren 3' for sekvensen som ønskes å bli uttrykt for å tilveiebringe polyadenylering av mRNA og terminering. Andre promotere som har den ytterligere fordelen av at transkripsjonen er kontrollert av vekstbetingelsene er promoterregionen for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer knyttet til nitrogenmetabolisme og overnevnte glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase, og enzymer ansvarlige for maltose- og galaktose-anvendelse. En hvilken som helst plasmidvektor inneholdende gjær-kompatibel promoter, replikasjonsorigo og termineringssekvenser er egnet.
I tillegg til mikroorganismer kan kulturer av celler avledet fra flercellede organismer også bli anvendt som verter. I prinsippet kan en hvilken som helst av en slik cellekultur anvendes, enten den er fra vertebrat- eller invertebrat kultur. Det har derimot vært størst interesse i vertebrat-celler, og propagering av vertebrat-celler i kultur (vevs-kultur) er blitt en rutinemessig prosedyre i de senere årene ("Tissue Culture", Academic Press, Kruse og Patterson, red.
(1973)). Eksempler på slike nyttige vertscellelinjer er VERO-og HeLa-celler, CHO-cellelinjer og W138, BHK, COS-7, 293 og MDCK-cellelinjer. Ekspresjonsvektorer for slike celler omfatter vanligvis (om nødvendig) et replikasjonsorigo, en promoter beliggende foran genet som skal bli uttrykt, sammen med nødvendige ribosombindingsseter, RNA-spleiseseter, polyadenyleringsseter og transkripsjonene terminator-sekvenser.
For anvendelse i pattedyrceller blir kontrollfunksjonene på ekspresjonsvektorene ofte tilveiebragt av viralt materiale. For eksempel er vanlige anvente promotere avledet fra polyoma, Adenovirus2 og som oftest Simian Virus 40 (SV40). Tidlig- og sen-promoterne til SV40-virus er spesielt nyttige på grunn av at begge er lett oppnåelige fra viruset som et fragment som også inneholder SV40 viral replikasjonsorigo (Fiers et al., Nature, 273: 113 (1978)). Mindre eller større SV40-f ragmenter kan også bli anvendt, forutsatt at den omtrentlige 250-bp sekvensen som rekker fra Hindlll-setet mot Bgll-setet beliggende i viral replikasjonsorigo er innbefattet. Det er videre også mulig, og ofte ønskelig, å anvende promoter eller kontrollsekvenser som vanligvis er assosiert med den ønskede gensekvensen, forutsatt at slike kontrollsekvenser er kompatible med vertscellesystemene.
Et replikasjonsorigo er vanligvis tilveiebragt enten ved konstruksjon av vektoren slik at den innbefatter et eksogent origo, som kan bli avledet fra SV40 eller annen viral (f.eks. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) kilde, eller ved vertscelle kromosomal replikasjonsmekanisme. Dersom vektoren er integrert inn i vertscellekromosomet er sistnevnte ofte tilstrekkelig.
Tilfredsstillende mengder humant t-PA blir produsert av cellekulturene, men forbedringer, omfattende anvendelse av en sekundær kodende sekvens, øker produksjonsnivåene ytterligere. Sekundær kodende sekvens omfatter dihydrofolat-reduktase (DHFR) som oppnås ved en ytre kontrollert para-meter, så som metotreksat (MTX), som dermed muliggjør kontroll av ekspresjon ved kontroll av MTX-konsentrasjonen.
Ved seleksjon av en foretrukket vertscelle for transfeksjon av vektorene ifølge oppfinnelsen som omfatter DNA-sekvenser kodende både for variant t-PA og DHFR-protein, er det hensiktsmessig å betrakte hvilken type DHFR-protein som blir anvendt. Dersom villtype DHFR-protein blir anvendt, er det foretrukket å velge en vertscelle som mangler DHFR, og dermed muliggjør anvendelse av DHFR kodende sekvens som en markør for vellykket transfeksjon i selektivt medium som mangler hypoksantin, glysin og tymidin. En hensiktsmessig vertscelle er i dette tilfelle CHO-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet, preparert og propagert, som beskrevet av Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 77: 4216 (1980).
Dersom DHFR-proteinet med lav bindingsaffinitet for MTX derimot blir anvendt som kontrollerende sekvens, er det ikke nødvendig å anvende DHFR-manglende celler. På grunn av at mutant DHFR er resistent overfor MTX kan MTX-inneholdende medium bli anvendt som et middel for seleksjon, forutsatt at vertscellene selv er MTX-følsomme. De fleste eukaryote cellene som kan absorbere MTX ser ut til å være følsomme overfor MTX. En slik nyttig cellelinje er en CHO-linje, CH0-Kl (ATCC Nr. CCL 61).
Dersom pattedyrceller blir anvendt som vertsceller blir transfeksjonen vanligvis utført ved kalsiumfosfat-presipita-sjonsmetoden som beskrevet av Graham og Van der Eb, Virology, 52: 546 (1978). Andre fremgangsmåter for innføring av DNA inn i celler så som nukleær injeksjon, elektroporasjon eller protoplastfusjon kan også bli anvendt.
Dersom gjær blir anvendt som vert blir transfeksjon vanligvis oppnådd ved anvendelse av polyetylenglykol, som beskrevet av Hinnen, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 75: 1929-1933 (1978).
Dersom prokaryote celler eller celler som inneholder vesentlig cellevegg-konstruksjoner blir anvendt er den foretrukne fremgangsmåten for transfeksjon kalsiumbehandling ved anvendelse av kalsium som beskrevet av Cohen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 69: 2110 (1972), eller elektro-poras jon.
Konstruksjon av egnede vektorer inneholdende ønskede kodende-og kontrollsekvenser anvender standard ligeringsteknikker. Isolerte plasmider eller DNA-fragmenter blir spaltet, skreddersydd og religert i den formen som er ønsket for å danne plasmidene som er nødvendige.
Spaltning blir utført ved behandling med restriksjonsenzym (eller enzymer) i egnet buffer. Generelt blir omtrent 1 pg plasmid eller DNA-fragmenter anvendt med omtrent 1 enhet enzym i omtrent 20 pl bufferoppløsning. (Hensiktsmessige buffere og substratmengder for bestemte restriksjonsenzymer er spesifisert av forhandlerene). Inkubasjonstider på omtrent en time ved 37 "C kan anvendes. Etter inkubasjon blir proteinet fjernet ved ekstraksjon med fenol og kloroform, og nukleinsyren blir isolert fra den vandige fraksjonen ved presipitasjon med etanol.
Dersom butte ender er nødvendige kan preparatet bli behandlet i 15 minutter ved 15°C med 10 enheter Klenow-fragment av DNA-polymerase I (Klenow), fenol-kloroform-ekstrahert og etanol-presipitert.
Størrelsesseparasjon av spaltede fragmenter blir utført ved anvendelse av 6 prosent polyakrylamidgel beskrevet av Goeddel et al., Nucleic Acids Res., 8: 4057 (1980).
For ligering blir omtrent ekvimolare mengder av ønskede komponenter skreddersydd i endene for å tilveiebringe korrekt paring, og behandlet med omtrent 10 enheter T4 DNA-ligase pr. 0,5 jig DNA. (Når spaltede vektorer blir anvendt som komponenter kan det være nyttig å forhindre religering av den spaltede vektoren ved forbehandling med bakteriell alkalisk fosfatase).
Som beskrevet ovenfor blir t-PA-varianter fortrinnsvis produsert ved hjelp av spesifikk mutasjon. Varianter som er nyttige ved utførelse av foreliggende oppfinnelse blir lettest dannet gjennom anvendelse av spesifikke oligonukleo-tidsekvenser som koder for DNA-sekvensen til den ønskede mutasjonen, samt et tilstrekkelig antall nærliggende nukleotider, for å tilveiebringe en sekvens med tilstrekkelig størrelse og sekvenskompleksitet for dannelsen av en stabil dupleks på begge sider av mutasjonen som er innbefattet.
For analyse for å bekrefte riktige sekvenser i konstruerte plasmider blir ligeringsblandingene vanligvis anvendt for å transformere E. coli K12 stamme 294 (ATCC 31.446) eller andre egnede E. coli-stammer, og vellykkede transformanter selektert ved ampicillin- eller tetracyklin-resistens når dette er hensiktsmessig. Plasmider fra transformantene blir preparert og analysert ved restriksjonskartlegging og/eller DNA-sekvensering ved hjelp av fremgangsmåten til Messing et al., Nucleic Acids Res., 9: 309 (1981) eller ved hjelp av fremgangsmåten til Maxam et al., Methods of Enzymology, 65: 499
(1980).
Etter innføring av DNA inn i pattedyrcelleverten og seleksjon i medium for stabile transformanter, blir amplifikasjon av
DHFR-protein-kodende sekvenser oppnådd ved dyrking av vertscellekulturer i nærvær av omtrent 20.000-500.000 nM konsentrasjoner MTX, en konkurrerende inhibitor til DHFR-aktivitet. Det effektive konsentrasjonsområdet er selv-følgelig meget avhengig av naturen til DHFR-genet og proteinet og karaktertrekkene til verten. Generelt definerte øvre og nedre grenser kan derimot ikke bli bestemt. Egnede konsentrasjoner av andre folinsyreanaloger eller andre forbindelser som inhiberer DHFR kan også bli anvendt. MTX er i seg selv derimot hensiktsmessig, lett tilgjengelig og effektiv.
For å forenkle eksemplene vil visse fremgangsmåter som gjentas ofte bli referert til med forkortelser.
"Plasmider" er betegnet med p etterfulgt av en en alfa-numerisk betegnelse. Utgangsplasmidene heri er kommersielt tilgjengelige, er tilgjengelige for publikum eller kan bli konstruert fra slike tilgjengelige plasmider i henhold til publiserte prosedyrer. I tillegg er andre ekvivalente plasmider kjent innenfor fagområdet og er innlysende for fagfolk.
"Spaltning" av DNA betegner katalytisk spaltning av DNA med et enzym som bare virker på spesielle steder i DNA. Slike enzymer blir betegnet restriksjonsenzymer, og setene som er spesifikke for hver av disse er betegnet et restriksjonssete. De forskjellige restriksjonsenzymene anvendt heri er kommersielt tilgjengelige og reaksjonsbetingelser, kofaktorer og andre krav bestemt av enzymforhandlerne ble anvendt. Restriksjonsenzymene blir vanligvis angitt med forkortelser sammensatt av en stor bokstav etterfulgt av andre bokstaver som representerer mikroorganismen hvorfra hvert restriksjonsenzym opprinnelig var oppnådd og deretter et tall som betegner det bestemte enzymet. Generelt blir omtrent 1 pg plasmid eller DNA-fragment anvendt med omtrent 2 enheter enzym i omtrent 20 pl bufferoppløsning. Hensiktsmessige
buffere og substratmengder for bestemte restriksjonsenzymer er spesifisert av forhandlerne. Inkubasjonstider på omtrent 1 time ved 37° C blir vanligvis anvendt, men kan variere i henhold til forhandlerens instruksjoner. Etter inkubasjon blir protein fjernet ved ekstraksjon med fenol og kloroform, og spaltet nukleinsyre blir isolert fra den vandige fraksjonen ved presipitasjon med etanol. Spaltning med et restriksjonsenzym blir sjelden etterfulgt av bakteriell alkalinsk fosfatasehydrolyse av terminale 5'-fosfater for å forhindre at to restriksjonsspaltede ender av et DNA-fragment "sirkulariserer", eller dannelse av en lukket løkke som ville forhindre innskudd av et annet DNA-fragment ved restrik-sjonssetet. Dersom ikke annet er angitt er spaltning av plasmider ikke etterfulgt av 5'-terminal defosforylering. Prosedyrer og reagenser for defosforylering er konvensjonelle (T. Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, sidene 133-134 ).
"Raffinering" eller "isolasjon" av et gitt DNA-fragment fra en restriksjonsspaltning innbefatter separasjon av spalt-ningsproduktet på polyakrylamid eller agarosegel ved elektro-forese, identifikasjon av fragmentet av interesse ved sammenligning av dets mobilitet i forhold til den til markør DNA-fragmentene med kjent molekylvekt, fjerning av gelbiten inneholdende det ønskede fragmentet og separasjon av gelen fra DNA. Denne prosedyren er generelt kjent. Se for eksempel R. Lawn et al., 1981, Nucleic Acids Res. 9:6103-6114 og D. Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res. 8:4057.
"Southern-analyse" er en fremgangsmåte hvorved tilstedeværelse av DNA-sekvenser i et spaltningsprodukt eller DNA-inneholdende sammensetning blir bekreftet ved hybridisasjon til et kjent, merket oligonukleotid eller DNA-fragment. Southern-analyse innbefatter heri separasjon av spaltnings-produktene på 1 prosent agarose, denaturering og overføring til nitrocellulose ved fremgangsmåten til E. Southern, 1975,
J. Mol. Biol., 98: 503-507 og hybridisasjon som beskrevet av T. Maniatis et al., 1978, Cell 15: 687-701.
"Transformasjon" betyr innføring av DNA inn i en organisme slik at DNA er replikerbart, enten som et ekstrakromosomalt element eller kromosomal integrant. Dersom ikke annet er angitt er fremgangsmåten anvendt heri for transformasjon av E. coli CaCl2~fremgangsmåten til Mandel et al., 1970, J. Mol. Biol. 53: 154.
"Ligering" refererer til fremgangsmåten omfattende dannelse av fosfodiester-bindinger mellom to dobbelttrådede nuklein-syrefragmenter (T. Maniatis et al., Id., s. 146). Dersom ikke annet er angitt kan ligeringen bli oppnådd ved anvendelse av kjente buffere og betingelser med 10 enheter T4 DNA-ligase ("ligase") pr. 0,5 pg omtrentlig ekvimolare mengder av DNA-fragmentene som skal bli ligert.
"Preparering" av DNA fra transformanter innbefatter isolering av plasmid-DNA fra mikrobiell kultur. Dersom intet annet er tilveiebragt kan den alkaliske/SDS-fremgangsmåten til Maniatis et al., Id., s. 90, bli anvendt.
"Oligonukleotider" er polydeoksynukleotider med kort lengde som er enkelt- eller dobbelttrådede og som blir kjemisk syntetisert ved kjente fremgangsmåter og deretter renset på polyakrylamidgeler.
C. Farmasøytiske sammensetninger
Forbindelsene kan bli formulert ifølge kjente fremgangsmåter for å fremstille farmasøytisk nyttige sammensetninger, der t-PA-produktet herav blir kombinert sammenblandet med en farmasøytisk akseptabel bærer. Egnede bærere og formuleringer derav, samt andre humane proteiner, f.eks. humant serumalbumin, er for eksempel beskrevet i Remington's Pharmaceuti-cals Sciences, 16. utgave, 1980, Mack Publishing Co., utgitt av Oslo et al. Slike sammensetninger vil vanligvis inneholde en effektiv mengde av varianten heri, for eksempel fra omtrent 0,5 til omtrent 5 mg/ml, sammen med en egnet mengde bærer for å fremstille farmasøytisk akseptable sammensetninger egnede for effektiv administrasjon til verten, t-PA-varianten heri kan bli administrert parenteralt til individer som lider av hjerte-kar-sykdommer og tilstander, eller ved andre fremgangsmåter som forsikrer levering til blodstrømmen i en effektiv form.
Sammensetninger som er spesielt godt egnede for klinisk administrasjon av variant t-PA-produkter anvendt ved ut-førelse av foreliggende oppfinnelse omfatter for eksempel sterile vandige oppløsninger, eller sterile hydrerbare pulvere så som lyofilisert protein. Det er generelt ønskelig å innbefatte videre i formuleringen en hensiktsmessig mengde av et farmasøytisk akseptabelt salt, generelt i en mengde som er tilstrekkelig for å gjøre formuleringen isotonisk. En pH-regulator så som argininbase og fosforsyre, bl jr også vanligvis innbefattet i tilstrekkelige mengder for å oppnå hensiktsmessig pH, vanligvis fra 5,5 til 7,5. For forbedring av lagringen eller stabiliteten til vandige formuleringer kan det også være ønskelig å innbefatte ytterligere midler så som glyserol. På denne måten blir variant t-PA-formuleringer gjort hensiktsmessige for parenteral administrasjon og, spesielt, intravenøs administrasjon.
Doseringer og ønskede medikamentkonsentrasjoner til de farmasøytiske sammensetningene kan variere avhengig av den bestemte anvendelsen. For eksempel ved behandling av dyp venetrombose eller perifer vaskulær sykdom vil "bolus"-doser, i størrelsesorden på omtrent 0,05 til omtrent 0,2 mg/kg, vanligvis være foretrukne med påfølgende administrasjoner, i størrelsesorden på omtrent 0,1 til omtrent 0,2 mg/kg, gitt for å opprettholde et omtrent konstant blodnivå, fortrinnsvis i størrelsesorden omtrent 3 jig/ml.
For anvendelse i sammenheng med akutt-medisinske gjenstander hvor infusjonsevne generelt ikke er tilgjengelig og forårsaket av den generelt kritiske naturen til den underliggende sykdommen (f.eks. emboli, infarkt), vil det generelt være ønskelig å tilveiebringe noe større innledende doser, så som en intravenøs bolus i størrelsesorden på omtrent 0,3 mg/kg.
t-PA-varianten derav kan for eksempel administreres parenteralt til individer som lider av hjerte-kar-sykdommer eller tilstander. Doserings- og dosehastigheten kan være parallell med eller høyere enn den som blir anvendt i kliniske under-søkelser av andre hjerte-kar, trombolytiske midler, f.eks. omtrent 1-2 mg/kg kroppsvekt som en intravenøs eller intra-arteriell dose over 1,5 til 12 timer i humane pasienter som lider av hjerteinfarkt, lungeemboli osv. Høyere doser kan bli tolerert på grunn av at variantene heri har lavere bivirkninger enn villtype t-PA, og som fører til hurtigere og mer fullstendig blcdpropplysering.
Som et eksempel på en hensiktsmessig doseringsform blir en beholder inneholdende 50 mg t-PA, arginin, fosforsyre og polysorbat 80 rekonstituert med 50 ml sterilt vann for injeksjon og blandet med et egnet volum 0,9 prosent natrium-kloridinjeksjon.
t-PA-variantene heri er også nyttige for å forhindre fibrinavleiring eller adhesjonsdannelse eller redannelse. En utførelsesform av denne anvendelsen er beskrevet i PCT WO 89/00049 publisert 12. januar 1989. Slik behandling omfatter generelt topisk administrasjon av en sammensetning til et sted med potensiell fibrin eller adhesjonsdannelse hvori sammensetningen omfatter en terapeutisk effektiv mengde av t-PA-varianten i en lite oppløselig form som blir konti-nuerlig frigjort ved det stedet i en tidsperiode på omtrent fra tre dager til to uker. t-PA-varianten blir vanligvis administrert i en dose som er tilstrekkelig for å forhindre f ibrin-avleiring eller dannelse av adhesjoner etter kirurgi,
infeksjon, trauma eller betennelse. Denne mengden er vanligvis fra 0,02 mg/g gel til 25 mg/g gel, eller fra 0,20 mg/g gel til omtrent 2,5 mg/g gel, eller fra 0,25 mg/g til omtrent 1,0 mg/g gel.
Bæreren hvori t-PA vanligvis er formulert for forhindring av adhesjonsdannelse i en semifast, klebrig farmasøytisk inert bærer for plassering av enzymet på stedet for potensiell adhesjonsdannelse. En slik bærer innbefatter langkjede-hydrokarboner eller grønnsaksoljer og voks bestående av blandinger av mettede og umettede fettsyreglyserider eller blandinger av modifisert mettede og umettede fettsyreglyserider. Eksempler innbefatter semifaste bærere så som petroleumsgele eller semisyntetiske glyserider, polyhydroksy-oppløsningsmidler så som glyserol, langkjedede hydrokarboner, bionedbrytbare polymerer eller liposomer.
Følgende eksempler skal illustrere den beste måten for å utføre oppfinnelsen, men skal ikke begrenses til disse.
Eksempel I
A. Fremstilling og anvendelse av ekspres. ionsvektor for
rekombinant produksjon av t- PA- varianter herav
1. Konstruksjon av plasmid p7-lH
a) Plasmid pCISt-PA
Plasmid pCISt-PA ble fremstilt som beskrevet nedenfor. For
rekapitulering, vektor pCIHt-PA inneholdende cytomegalovirus-enhancer og promoter, cytomegalovirus-spleisedonorsetet og intron, Ig-variabelregion-spleiseakseptorsete, cDNA-kodende t-PA (Pennica et al., Nature, 301: 214 (1983)) og hepatitt-overflateantigenpolyadenylering og transkripsjonstermineringssete ble konstruert først: Vektor pF8CIS inneholdende cytomegalovirus-enhancer (Boshart et al., Cell, 41: 520 (1985 )) og promoter (Thomsen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 81: 659 (1984)), cytomegalo-
virus-spleisedonorsetet og en del av et intron (Sternberg et al., J. of Virol., 49: 190 (1984)), lg variabel regionintron og spleiseakseptorsete, cDNA-kodende faktor VIII og SV40-polyadenyleringssetet ble konstruert. De tre delene av konstruksjonen er beskrevet nedenfor.
1. Ampicillin-resistensmarkør og replikasjonsorigo til den endelige vektoren var avledet fra utgangsplasmid pUC13pML, en variant av plasmid pML (Lusky et al., Nature, 293: 79
(1981)). pUC13pML ble konstruert ved overføring av polylinker pUC13 (Veira et al., Gene, 19: 259 (1982 )) til EcoRI- og Hindlll-setene til pML. Et annet plasmid pUC8CMV anvendt som utgangspunkt var kilden for CMV-enhancer, promoter og spleisedonorsekvens. pUC8CMV ble konstruert ved innskudd av nukleotidene 1 til og med 732 for CMV-enhancer, promoter og spleisedonorsekvens inn i de butte Pstl- og Sphl-setene til pUC8 - Veira et al., supra. Syntetiske BamHI-Hindlll-linkere (kommersielt tilgjengelige fra New England Biolabs) ble ligert til den kohesive BamHI-enden, for dannelse av et Hindlll-sete. Etter den ligeringen ble en Hindlll-HincII spaltning utført. Denne spaltningen tilveiebragte et fragment på omtrent 800 bp som inneholdt CMV-enhancer, promoter og spleisedonorsete. Etter gelisolering ble dette 800 bp-fragmentet ligert til et 2.900 bp styppe av pUC13pML. Fragmentet nødvendig for konstruksjon av pF8CIS ble oppnådd ved spaltning av overnevnte intermediate plasmid med Sali og og Hindlll. Dette 3.123 bp-stykke inneholdt resistensmarkør for ampicillin, replikasjonsorigo fra pUC13pML og kontrollsekvenser for CMV, inkludert enhancer, promoter og spleisedonorsete .
2. Ig-variable regionintron og spleiseakseptor-sekvens ble konstruert ved anvendelse av en syntetisk oligomer. En 99-mer og en 30-mer ble syntetisert kjemisk med følgende sekvens for IgG-intronet og spleiseakseptorsete (Bothwell et al., Cell, 24: 625 (1981)):
DNA polymerase I (Klenow-f ragment) fylt i det syntetiske stykket og dannet et dobbelttrådet fragment (Wartell et al., Gene, 9: 307 (1980)). Dette ble etterfulgt av en dobbelt-spaltning av Pstl og Hindlll. Denne syntetiske linkeren ble klonet inn i pUC13 (Veira et al., supra) ved Pstl- og Hindlll-setene. Klonen som inneholdt det syntetiske oligonukleotidet, merket pUCIg.10, ble spaltet med Pstl. Et Clal-sete ble tilsatt til dette fragmentet ved anvendelse av en Pst-Clal-linker. Etter spaltning med Hindlll ble et 118 bp stykke inneholdende en del av Ig-intronet og Ig-variabel regionspleiseakseptor gelisolert. 3. Den tredje delen av konstruksjonsskjemaet erstattet hepatittoverflate-antigen 3'-enden med polyadenyleringssetet og transkripsjonstermineringssete til SV40 tidlig region. En vektor, pUC.SV40, inneholdende SV40-sekvenser ble skutt inn i pUC8 ved BamHI-setet beskrevet i Veira et al., supra. pUC.SV40 ble deretter spaltet med EcoRI og Hpal. Et 143 bp fragment inneholdende bare SV40 polyadenyleringssetet ble gelisolert fra denne spaltningen. To ytterligere fragmenter ble gelisolert etter spaltning av pSVE.8clD (EPO Publ. Nr. 160.457). 4,8 kb fragmentet dannet ved EcoRI- og Clal-spaltningen inneholder SV40-DHFR transkripsjonsenheten, replika-sjonsorigoet til pML og ampicillinresistensmarkøren. 7,5 kb fragmentet produsert etter spaltning med Clal og Hpal inneholder cDNA for Faktor VIII. En tredel ligering tilveiebringer pSVE.8c24D. Dette intermediatplasmidet ble spaltet med Clal og Sali for å tilveiebringe et 9.611 bp fragment inneholdende cDNA for Faktor VIII med SV40 polyadenylering og transkripsjonstermineringsseter etterfulgt av SV40 DHFR transkripsjonsenheten. Den endelige tredel-ligeringen for tilveiebringing av pF8CIS anvendte: a) 3.123 bp Sall-Hindlll fragmentet inneholdende replikasjonsorigo, ampicillin-resistensmarkør og CMV-enhancer, promoter og spleisedonor; b) 118 bp Hindlll-Clal fragment inneholdende Ig-intron og spleiseakseptor; og c) et 9.611 bp Clal-Sall fragment inneholdende cDNA for Faktor VIII, SV40-polyadenyleringssete og SV40 DHFR-tran-skripsjonsenhet.
Deretter ble fullføringen av kontruksjon av plasmid pCIHt-PA fra intermediatplasmid pCla t-PA og plasmid pF8CIS (ovenfor) utført: t-PA cDNA ble først klonet inn i pML for å tilveiebringe et Clal-sete ved 5'-enden av dette genet. For å utføre dette ble et 3.238 bp HindIII-fragment fra pSVpa-DHFR (ellers betegnet som pETPFR, supra) skutt inn i HindiII-setet til pML (Lusky et al., supra). Kolonier ble screenet for kloner som har 5'-enden av cDNA ved siden av Clal-setet. Intermediatplasmidet ble merket pCLAt-PA. Et t-PA cDNA etterfulgt av 3'-poly-adenyleringsregionene ble isolert som et Clal-Kpnl-fragment på 2.870 bp. Dette fragmentet ble ligert til 5.146 bp fragmentet til pF8CIS. Dette Clal-Kpnl-fragmentet til CIS-vektoren tilveiebrakte 5'-kontrollregionen, en SV40-DHFR-transkripsjonell enhet, ampicillin-resistensgenet og origo-regionen fra pML. Se Figur 2.
Ekspresjonsnivåene til t-PA ble oppnådd ved transfektering av CH0- eller 293-celler med pCIHt-PA, i henhold til fremgangsmåter som er generelt kjente og beskrevet ovenfor. Media fra transfekterte 293-celler ble for eksempel analysert og demonstrerer at pCIHt-PA produserte 420 ng/ml p-PA.
Vektor pCISt-PA inneholdende cytomegalovirus-enhancer og promoter, cytomegalovirus-spleisedonorsete og intron, lg variabel regionspleiseakseptorsete, cDNA kodende for t—PA og pSV40 polyadenyleringssekvensen ble til slutt konstruert som følger: Utgangsvektorene for denne konstruksjonen var pCIHt-PA og pF8CIS (supra). Sistnevnte vektor har samme 5'-kontroller som pCIHt-PA, men har innbefattet cDNA for Faktor VIII og SV40 polyadenyleringssete. SacII ble anvendt for å spalte 3' av t—PA cDNA. Det resulterende 3'-overhenget ble gjort butt med T4-polymerase. pCIHt-PA ble deretter spaltet med Clal. Dette setet separerer det chimeriske intronet med spaltning mellom CMV-intronsekvenser og lg variable regionintron. Et 2.870 bp fragment ble gelisolert fra Clal-behandlingen. SV40 polyadenyleringssetet, DHFR, transkripsjonskontroll, bakteriell replikaorigo og amp<r->genet, samt CMV-enhancer og promoter og spleisedonor ble isolert fra pF8CIS. Disse elementene ble isolert inn i fragmentene som et 2.525 bp Sal-BamHI fragment og et Hpal-Sal og 3.113 bp fragment. En tredel ligering av Kpnl (butt)-Clal fragment med Hpal-Sal fragment og Sal til BamHI fragment tilveiebringer pCISt-PA, som ble uttrykt i både CHO- og 293-celler som diskutert ovenfor for plasmid pCIHt-PA, med tilveiebringing av 55 og 3.000 ng/ml t-PA. Se
Figur 3.
b) Endelig konstruksjon av p7-lH
Plasmid pCISt-PA ble spaltet med Spel, deretter behandlet med
E.coli DNA polymerase I stort fragment (Klenow) og deoksy-ribonukleosid-trifosfater for å danne butte ender. Det resulterende lineære fragmentet ble ligert, ved anvendelse av T4 DNA-ligase, til 0,45 kb Rsal/Ahalll fragmentet inneholdende + trådorigo fra enkelttrådet DNA-fag, fl, som beskrevet i Zinder et al., Microbiol. Rev., 49: 101 (1985). Ligeringsproduktene ble isolert med fl-origo skutt inn i begge mulige orienteringer ved Spel-setet til pCISt-PA fragmentet. Et plasmid inneholdende dette origo, i en slik orientering at antisens-tråden til t-PA genet ble pakket til virus i nærvær av hjelperfag, ble valgt og betegnet p7-lH. Se
Figur 4.
2. Mutagenese av ekspresjonsplasmid
a) Templatpreparering
Plasmid p7-lH ble ført inn i E. coli stamme JM101 (ATCC Nr.
33.876) via CaClg-formidlet transformasjon. Disse cellene ble deretter infektert med hjelpervirus M13K07 og enkelttrådet p7—1H DNA ble preparert som beskrevet av Veira et al., Meth. Enzymol. , 153: 3 (1987). Til 0,3 ml av en mettet kultur transformerte celler i 2YT-medium ble det tilsatt 10<9->10<10 >pfu M13K07 og blandingen ble inkubert i 15 min ved 37° C. 1,5 ml frisk 2YT-medium, inneholdende 50 ug/ml karbenicillin, ble tilsatt og kulturen ble forsiktig rystet i 16 timer ved 37 °C. Etter at cellene var pellettert ble fag og pakket plasmid DNA høstet, og enkelttrådet DNA ble preparert som beskrevet av Anderson, Nucl. Acids. Res., 9: 3015 (1981).
b) Seterettet in vitro-mutagenese
Mutagenese på p7-lH ble utført ved anvendelse av oligodeoksy-ribonukleotid, 5'-CGGAGAGCGGCACCTGTGCGGGG-3', vesentlig som beskrevet av Zoller et al., Meth. Enzymol., 100: 468 (1983), med unntagelse av at mutanten, med mutasjonen phe305 > his305, ble identifisert ved kolonihybridisasjon istedenfor plakkhybridisasjon. Mutasjoner ble verifisert ved DNA-sekvensering direkte på enkelttrådet plasmid-DNA ved anvendelse av dideoksynukleotid-kjedetermineringsmetoden (Sanger et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) 74: 5463 (1977)).
3. Ekspresjon og rensing
a) Plasmidpreparering
Transformerte celler ble dyrket til metning i 500 ml LB-medium inneholdende 50 jjg/ml karbenicillin. Cellene ble pellettert ved sentrifugering og resuspendert i 40 ml 50 mM glukose, 10 mM EDTA, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0). Til denne suspensjonen ble det tilsatt 60 ml 1% natriumdodecylsulfat, 0,07 M NaOH og blandingen ble inkubert i 2 min. ved 25°C, deretter i 10. min. ved 0°C. Til dette ble 52 ml 4 M eddiksyre, 3 M natriumacetat tilsatt og blandingen ble inkubert i 30 min. ved 0°C. Dette ble deretter sentrifugert ved 11.500 rpm i 20 min., supernatanten blandet med to volumer 100$ kald etanol og det resulterende presipitatet høstet ved sentrifugering. Pelletten, inneholdende plasmid-DNA og RNA, ble tørket og på ny løst opp i 100 mM Tris (pH 8,0), 10 mM EDTA, 1 pg/ml RNase A. Etter at den resulterende oppløsningen ble gjort klar ved sentrifugering ble den justert til 0,5 mg/ml i etidiumbromid og lik vekt CsCl ble tilsatt. DNA ble sentrifugert i en Beckman VT165-rotor i 16 timer ved 55.000 rpm ved 18°C. DNA-båndet ble høstet ved punktering av siden, ekstrahert med n-butanol for å fjerne etidiumbromid, fortynnet med H2O og presipitert med etanol. DNA ble på nytt løst opp i 10 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, til en final konsentrasjon på 1 mg/ml.
b) Transfeksjon og ekspresjon
293 celler ble dyrket til de løp sammen. Ti pg t-PA plasmid-DNA mutant ble blandet med 1 pg DNA kodende for VA RNA-genet (Thimmappaya et al., Cell, 31: 543 (1982)) og løst opp i 500 pl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2. Dråpevis med blanding ble det til dette tilsatt 500 pl 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaP04 og presipitatet ble dannet i 10 min. ved 25° C. Det suspenderte presipitatet ble deretter tilsatt til cellene (i 100 mM skål) og latt stå i fire timer i inkubatoren. Mediet ble deretter suget av og 2 ml 20$ glyserol i fosfatbufferet saltvann (PBS) ble tilsatt i 30 sekunder. Cellene ble vasket to ganger med 5 ml serumfritt medium, deretter ble friskt medium tilsatt og cellene ble inkubert i fem dager.
For dannelse av stabile CHO-cellelinjer som uttrykker t-PA varianten kan 1,4 kb Bglll/Apal fragmentet inneholdende hele t-PA kodende sekvenser (Bglll-setet dekker kodonene -1 til 1 av full-lengde t-PA-kodende DNA og Apal-setet dekker kodonene 465 til 466 av full-lengde t-PA-kodende DNA) bli ligert til 6,0 kb Bglll/Apal fragmentet fra vektor pPADHFR-6 (beskrevet i EPO Pat. Publ. Nr. 93.619). Det resulterende plasmidet blir deretter ført inn i CHO-celler og indusert til å overuttrykke t-PA variantene ved amplifisering av den kodende sekvensen ved hjelp av seleksjon i metotreksat-inneholdende medium.
c) Rensing
Rensing av t-PA produktet ble oppnådd ved å sende det
kondisjonerte mediet over en kolonne (1 ml sjiktvolum) med kontrollerte glasskuler hvorpå anti-t-PA geitepolyklonalt A6-antistoff (fremstilt ifølge standard fremgangsmåter som i seg selv er kjente) var blitt koblet. Før mediet ble applisert ble kolonnen ekvilibrert med PBS og, etter applisering, ble kolonnen ekvilibrert med 0,1 M Tris-HCl (pH 7,5), 1 M NaCl. t-PA ble eluert med 0,1 M eddiksyre, 0,15 M NaCl, 0,02 M arginin, 0,01% Tween 80 (pH 2,0), og fraksjoner ble øyeblikkelig nøytralisert med Tris-base. Fraksjonene ble justert til 0,01$ Tween 80 før sammenslåing. t-PA ble funnet på en reduserende SDS-gel å være hovedsakelig (80%) enkeltkjedet.
B. Biologiske analyser
1. t-PA kvantitering
Proteinkonsentrasjonene ble rutinemessig bestemt ved ELISA standardisert til nativsekvens t-PA (Se EPO Pat. Publ. Nr. 93.619, supra). Proteinrenhet og homogenitet ble analysert ved polyakrylamid-gelelektroforese i nærvær av natriumdodecylsulfat (PAGE-SDS) med buffersystemet til Laemmli, Nature, 227: 680 (1970). Vanligvis ble 7 til 17% gradient-geler anvendt og proteinene ble visualisert med sølvfargings-teknikken til Morrissey, Anal. Biochem., 117: 307 (1981). t-PA varianten fremstilt, som beskrevet ovenfor ble funnet å være ren og homogen ifølge denne fremgangsmåten.
2. S-2251 analyse
Resultater for klotlysering og S-2251 analyser viser gjennomsnitt av flere uavhengige observasjoner (klotlysering, to bestemmelser; S-2251, tre bestemmelser).
Evnen som t-PA har til å aktivere plasminogen kan bli målt i en in vitro-analyse ved preinkubering av t-PA og plasminogen og deretter tilsetning av det plasmin-spesifikke substratet H-D-valyl-H-leucyl-H-lysin-paranitroanilid (S-2251). Maksi-malhastigheten til denne reaksjonen blir observert i nærvær av fibrin(ogen) eller fragmenter av fibrin(ogen) som virker som stimulatorer ifølge reaksjonen.
Det plasmin-spesifikke substratet S-2251 ble anvendt i en totrinns-analyse for å måle evnen som prøven har til å aktivere plasminogen. Fibrinogen kan bli anvendt som et stimuleringsmiddel ved inkubering av prøven med 0,02 ml av en 20 mg/ml fibrinogen-oppløsning i et totalt volum på 0,12 ml 0,05 M Tris-HCl, 0,12 M NaCl, 0,01% Tween 80, pH 7,4.
Glu-plasminogenoppløsning (kommersielt tilgjengelig), 0,03 ml av en 2,0 mg/ml oppløsning i 0,05 M Tris, 0,12 M NaCl buffer, pH 8, ble deretter tilsatt. Etter ti minutter ved 37° C ble 0,35 ml 0,86 mM S-2251 i 0,037 M Tris, 0,086 NaCl, 0,007% Tween 80, pH 7,4 tilsatt. Denne blandingen ble inkubert i fem minutter, deretter ble reaksjonen stoppet ved tilsetning av 0,1 ml 50% iseddiksyre. Absorbans ved 405 nm ble målt. Aktiviteten ble uttrykt som forandring i absorbans pr. nanogram pr. minutt i nærvær av substrat.
Resultatene viser at F305H-varianten, med fibrinogen, har 78% av villtype spesifikk aktivitet, som kan være forårsaket av forsinkelsen før A405-økningen.
3. Lysering av koagel
Villtype og F305H t-PA ble analysert for deres evne til å lysere fibrin i nærvær av mettende konsentrasjoner plasminogen, ifølge fremgangsmåten til Carlsen et al., Anal. Biochem., 168: 428-435 (1988). In vitro-koagel (blodpropp) lyseringsanalyse måler aktiviteten til t-PA ved turbidimetri ved anvendelse av en mikrosentrifugal analyseringsinnretning. En blanding av trombin og t-PA testprøver blir sentrifugert til en blanding av fibrinogen og plasminogen for å initiere koageldanneIse og påfølgende oppløsning av koagel. Den resulterende profilen til absorbans mot tid blir analysert for å bestemme sluttpunktet til analysen. Aktivitetene til t—PA-variantene ble sammenlignet med en standardkurve til rt-PA (EPO Publ. Nr. 93.619, supra). Bufferen som ble anvendt i analysen utgjorde 0,06 M natriumfosfat, pH 7,4, inneholdende 0,01% (v/v) Tween 80 og 0,01% (v/v) natriumazid. Human trombin var i en konsentrasjon på 33 enheter/ml. Fibrinogen (ved 2,0 mg/ml koagulerbart protein) ble avkjølt på våt is for å presipitere fibronektin og deretter tyngde-kraftfiltrert. Glu-plasminogen var i en konsentrasjon på 1 mg/ml. Analyseromtemperaturen blir innstilt på 37°C. Appli-sereren blir innstilt for å avgi 20 pl rt-PA (omtrent 62,5 ng/ml til 1,0 jjg/ml) som prøve for standardkurven, eller 20 pl variant rt-PA i en konsentrasjon som forårsaker lysering innenfor området av standardkurven. Tyve pl trombin ble anvendt som sekundært reagens og 200 pl av en 50:1 (v/v) fibrinogen: plasminogen-blanding som primær reagens. Absorbansen/tidsprogrammet ble anvendt med en fem minutters inkubasjonstid, 340 nm filter og 90 intervallavlesninger.
Resultatene viser at F305H-varianten, ved anvendelse av denne analysen, er omtrent 46% av koagel-lyseringsaktiviteten i forhold til normal villtype t-PA.
4. Fibrinbinding
Fremgangsmåten for fibrinbinding er en modifikasjon av fremgangsmåten beskrevet av Rijken et al., J. Biol. Chem., 257: 2920 (1982). t-PA prøven som skal bli testet blir tilsatt til en oppløsning inneholdende 0,05 M Tris (pH 7,4), 0,12 M NaCl, 0,01% Tween 80, 1 mg/ml humant serumalbumin, og forskjellige konsentrasjoner plasminogen-fritt fibrin (0, 0,05, 0,1, 0,25 og 0,5 mg/ml). Det finale volumet til reak-sjonsblandingen var 1 ml og t-PA konsentrasjonen var 10 ng/ml av hver prøve. Prøvene ble inkubert ved 37 "C i 5 min., etterfulgt av tilsetning av 1 enhet trombin. Prøvene ble deretter inkubert i en time ved 37°C. Koagelen ble fjernet ved sentrifugering og mengden t-PA som forble ubundet i supernatanten ble bestemt ved ELISA.
Resultatene (Figur 5) viser at enkeltkjede F305H t-PA (lukkede triangler) hovedsakelig bindes til fibrin under analysebetingelsene som ble anvendt nesten like godt som enkjede villtype t-PA (lukkede firkanter) og blandingen av enkjede- og tokjede- villtype t-PA (åpne triangler). Tokjede F305H t-PA (lukkede sirkler) binder også fibrin minst like godt som tokjede villtype t-PA (lukkede diamanter).
5. Zymogenisk kinetikk ved S-2251
a) Preparering av fibrinogen
Human fibrinogen (Calbiochem) ble gjort plasminogenfritt ved
applisering på en lysin-Sepharosekolonne og oppsamling av gjennomstrømningsmaterialet. Den resulterende fibrinogen-blandingen ble degradert ved behandling med plasmin-Sepharose ved romtemperatur over natt. Den resulterende koagulerbar-heten var 7%. Konsentrasjonen ble deretter justert til 1,51 mg/ml.
b) Fremgangsmåte
Kinetikken til omdanning av plasminogen til plasmin ved
villtype t-PA og F305H t-PA ble bestemt ved anvendelse av kromogent plasminsubstrat S-2251 i nærvær av fibrinogen. Villtype og F305H t-PA molekyler ble begge anvendt i den hovedsakelige enkjede-formen (oppnådd ved rensing som tidligere beskrevet) og i tokjede, spaltet form (oppnådd ved inkubasjon av hovedsakelig enkjede-formen med plasmin-Sepharose i en time ved 37°C).
I nærvær av 1,2 jjM plasmin-degraderte fibrinogen-fragmenter fremstilt som beskrevet ovenfor ble reaksjonene utført ved plasminogen-konsentras joner fra 0,08 til 0,89 pM og t-PA-konsentrasjoner på 2,3 til 9,0 nM i 0,12 M NaCl, 0,05 M Tris, 0,01% Tween 80, pH 7,4. Plasminogen, fibrinogen og buffer ble preinkubert i tre timer ved romtemperatur. S-2251 ble tilsatt for en final konsentrasjon på 0,9 mM og prøvene ble oppvarmet til 37° C i omtrent 5 minutter. Ved tiden null ble t-PA prøvene tilsatt og absorbansen til hver prøve ble avlest i intervaller på 30 sekunder i ti minutter ved 37°C.
Resultatene er vist i Figurene 6 og 7 (for villtype, enkjede-og tokjede t-PA) og i Figurene 8 og 9 (for F305H, henholdsvis enkjede- og tokjede t-PA). I figurene er ordinaten absorbans ved 405 nm og abscissen er kvadraten av antall minutter hvorpå absorbansene ble tatt. De lukkede sirklene representerer 0,09 jjM plasminogen (og 15,7 nM villtype tokjede t-PA, 10,8 nM F305H tokjede t-PA, 16,1 nM villtype enkjede t-PA og 17,2 nM F305H enkjede t-PA), lukkede triangler representerer 0,11 pM plasminogen (og 11,8 nM villtype tokjede t-PA, 8,1 nM F305H tokjede t-PA, 12,1 nM villtype enkjede t-PA, 12,9 nM F305H enkjede t-PA), lukkede firkanter representerer 0,16 >iM plasminogen (og 9,8 nM villtype tokjede t-PA, 6,7 nM F305H tokjede t-PA, 10,1 nM villtype enkjede t-PA, 10,8 nM F305H enkjede t-PA), åpne sirkler representerer 0,22 pM plasminogen (og 7,9 nM villtype tokjede t-PA, 5,4 nM F305H tokjede t-PA, 8,1 nM villtype enkjede t-PA, 8,6 nM F305H enkjede t-PA), åpne triangler representerer 0,44 uM plasminogen (og 3,9 nM villtype tokjede t-PA, 2,7 nM F305H tokjede t-PA, 4,0 nM villtype enkjede t-PA, 4,3 nM F305H enkjede t-PA), og åpne firkanter representerer 0,9 pM plasminogen (og 3,9 nM villtype tokjede t-PA, 2,7 nM F305H tokjede t-PA, 4,0 nM villtype enkjede t-PA, 4,3 nM F305H enkjede t-PA).
De grafiske fremstillingene viser at bare med hovedsakelig enkjede F305H varianten utviser absorbansen en uttalt forsinkelse ved tidlige tidspunkter i reaksjonene, og en økning i aktivitet deretter. Tokjede F305H varianten utviser ikke denne forsinkelsen, men har derimot kinetikk-egenskaper som ligner en- eller tokjede villtype t-PA. Denne adferden demonstrerer den zymogene naturen til F305H varianten som ikke er observert med villtype t-PA.
Eksempel II
En strategi kjent som alanin-scanning mutagenese (ALA-scan), beskrevet i Cunningham og Wells, supra, ble anvendt for fremstilling av t-PA-varianter evaluert i dette eksemplet. Denne fremgangsmåten innbefatter identifikasjon av små overflateregioner av t-PA proteasedomenen som inneholder ladede aminosyrekjeder. Uten å være begrenset til en teori antas det at disse regionene enten inneholder grupper av ladning, eller ved siden av liggende regioner, eller begge, som er ansvarlige for interaksjonen av t-PA-molekylet med dets substrat og forskjellige andre forbindelser som kan modulere dets aktivitet. Ladede aminosyrer i hver region (dvs. Arg, Asp, His, Lys og Glu) ble erstattet (en region pr. mutant molekyl) med alanin for å vurdere viktigheten av den spesielle regionen i forhold til den helhetlige aktiviteten til t-PA-molekylet. Resultatene er angitt nedenfor.
1. Konstruksjon av pRK7-t-PA
Plasmid pRK7 ble anvendt som vektor for dannelse av t-PA-mutanter. pRK7 er identisk med pRK5 (EP Publ. Nr. 307.247 publisert 15. mars 1989), med unntagelse av at rekkefølgen av endonuklease-restriksjonssetene i polylinkerregionen mellom Clal og Hindlll er reversert. t-PA cDNA (Pennica et al., Nature, 301: 214 (1983)) ble fremstilt for innskudd inn i vektoren ved spaltning med restriksjons-endonuklease Hindlll (som spalter 49 basepar 5' for ATG-startkodonet) og restriksjons-endonuklease Ball (som spalter 276 basepar nedstrøms for TGA-stoppkodonet). Dette cDNA ble ligert inn i pRK7 på forhånd spaltet med Hindlll og Smal ved anvendelse av standard ligeringsmetodologi (Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, 1982). Denne konstruksjonen ble betegnet pRK7-t-PA.
2. Seterettet mutagenese av pRK7-t-PA
Seterettet mutagenese av t-PA cDNA ble utført ved fremgangsmåten til Taylor et al., Nucl. Acids. Res., 13: 8765 (1985) ved anvendelse av et kit kjøpt fra Amersham Corporation
(katalognummer RPN 1253). For dannelse av ønskede mutanter ble oligonukleotider av sekvenser kodende for ønskede amlnosyresubstltusjoner syntetisert og anvendt som primere. Disse oligonukleotidene ble smeltet sammen til enkelttrådet pRK7-t-PA som var blitt fremstilt ved standard prosedyrer (Viera et al., Meth. Enz., 143: 3 (1987)).
En blanding av tre deoksyribonukleotider, deoksyriboadenosin (dATP), deoksyriboguanosin (dGTP) og deoksyribotymidin (dTTP), ble kombinert med et modifisert tio-deoksyribocytosin betegnet dCTP(aS) tilveiebragt i kittet fra forhandleren av kittet, og tilsatt til enkelttrådet pRK7-t-PA som oligonukleotidet ble sammensmeltet til.
Ved tilsetning av DNA-polymerase til denne blandingen ble en DNA-tråd identisk med pRK7-t-PA med unntagelse av muterte baser dannet. Denne nye DNA-tråden inneholdt i tillegg dCTF(aS) istedenfor dCTP, som beskyttet den fra restriksjons-endonukleasespaltning. Etter at templattråden til den dobbelttrådede heterodupleksen ble nikket med et hensiktsmessig restriksjonsenzym, ble templattråden spaltet med ExoIII-nuklease forbi regionen som inneholdt den mutagene oligomeren. Reaksjonen ble deretter stoppet for å tilveiebringe et molekyl som bare delvis var enkelttrådet. Et fullstendig dobbelttrådet DNA-homodupleksmolekyl ble deretter dannet ved DNA-polymerase i nærvær av alle fire deoksyribo-nukleotid-trifosfåtene, ATP og DNA-ligase.
Følgende oligonukleotider ble fremstilt for anvendelse som primere for dannelse av pRK7-t-PA molekyler ved anvendelse av ALA-scan metodologien beskrevet ovenfor:
3. Bakteriell transformasjon og DNA-preparering
Mutante t-PA-konstruksjoner som ble dannet ved anvendelse av protokollen ovenfor ble transformert inn i E. coli verts-stamme MM294tonA ved anvendelse av standard CaC^-prosedyren
(Maniatis et al., supra) for fremstilling og transformasjon av kompetente celler. MM294tonA (som er resistent overfor Tl-fag) ble fremstilt ved innskudd og påfølgende unøyaktige uttak av en TnlO-transposon inn i tonA-genet. Dette genet ble deretter skutt inn, ved anvendelse av transposon-innskudds-mutagenese (Kleckner et al., J. Mol. Biol., 116: 125-159
(1977)), inn i E. coli vert MM294 (ATCC 31.446).
DNA ble ekstrahert fra individuelle kolonier av bakterielle transformanter ved anvendelse av standard miniprep-prosedyren til Maniatis et al., supra. Plasmidene ble videre renset ved passering gjennom en Sephacryl CL6B-spinkolonne, og deretter analysert ved sekvensering og ved restriksjonsendonuklease-spaltning og agarosegelelektroforese.
En av disse transformantene inneholdende plasmidet kodende for K296A,H297A,R298A,R299A mutant, og betegnet pTPA33-2, ble deponert til American Type Culture Collection 18. juli 1989 som ATCC Nr. 68.059. 4. Transfeksjon av humane embryonyre 293 celler (liten skala) 293 celler ble dyrket til 70% sammenløp i 6-brønn-plater. 2,5 pg t-PA plasmid DNA-mutant ble løst opp i 150 pl 1 mM Tris-HCl, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2. Til dette (dråpevis med røring) ble 150 pl 50 mM HEPES-buffer (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaP04 tilsatt og presipitatet ble dannet i ti min. ved 25" C. Det suspenderte presipitatet ble deretter tilsatt til cellene i de individuelle brønnene i en 6-brønn-plate og latt stå i fire timer i inkubatoren. Mediet ble deretter suget av og 1 ml 20% glyserol i PBS ble tilsatt i 30 sekunder. Cellene ble vasket to ganger, først med 3 ml, deretter med 1 ml, serumfritt medium. Deretter ble 3 ml friskt medium tilsatt og cellene inkubert i fem dager. Mediet ble deretter samlet og analysert.
Når enkeltkjedet t-PA var påkrevet, ble prosedyren som beskrevet ovenfor gjentatt med unntagelse av at plasminogen-fritt serum ble anvendt i løpet av vekstfasen til cellene.
5. Transfeksjon av humane embryoniske nyre 293-celler (stor skala
For storskala-rensing av K296A,H297A,R298A.R299A variant, nyttig for produksjon i signifikante mengder, ble trans-feksjonsfremgangsmåten som ble anvendt oppnådd fra "Current Protocols in Molecular Biology", Ausubel et al., red. (Wiley Interscience, 1988) og modifisert noe som som følger: En suspensjon av humane embryoniske nyre 293-celler ble dyrket i et cellekulturmedium og konsentrert ved pellettering. Pelletten ble resuspendert til en konsentrasjon på omtrent 10<8->celler pr. milliliter og cellene ble vasket etter behov i serumfritt medium. DNA-dekstranoppløsningen ble tilsatt i en konsentrasjon på omtrent 250 pg DNA pr. 500 ml celler, og denne blandingen ble inkubert med forsiktig røring ved 37°C i opp til 90 minutter. DMSO ble tilsatt til en final konsentrasjon på ti prosent og, etter omtrent to minutter, ble friskt medium tilsatt for å fortynne cellene til omtrent 10^ pr. milliliter. Cellene ble deretter inkubert i opp til syv dager og supernatanten ble deretter samlet.
Rensing av denne mutanten ble oppnådd ved å sende supernatanten over en kolonne glasskuler koblet til anti-t-PA geitepolyklonalt A6-antistoff. Kolonnen var blitt for-behandlet med PBS. Etter at supernatanten var applisert ble kolonnen ekvilibrert med en Tris-saltvannsbuffer (0,1 M Tris-HC1 (pH 7,5) og IM NaCl).. t-PA-varianten ble deretter eluert med 0,1M eddiksyre, 0,15 M NaCl, 0,02 M arginin og 0,01% Tween 80. Fraksjoner ble øyeblikkelig nøytralisert med Tris-base og justert til 0,01% Tween 80.
6. Biologiske analyser
A. t-PA-kvantitering
Mengden av t-PA tilstede i cellekultur-supernatantene ble bestemt ved ELISA-prosedyren ved anvendelse av polyklonale antistoffer fremstilt mot villtype t-PA.
B. S-2288-analyse
S-2288-analysen ble anvendt for å måle den proteolytiske aktiviteten til mutantene i både en- og tokjede-formene. Denne analysen er en direkte analyse for t-PA proteolytisk aktivitet; t-PA spalter bindingen mellom det lille peptidet og paranitroanilid-kromoforen.
Standardkurveprøver ble fremstilt ved fortynning av villtype rt-PA med cellekulturmedium. Standardkurveprøver og rt-PA mutantprøver ble tilsatt til brønnene av en mikrotiterplate. Dersom analysen ble anvendt for å måle aktiviteten av tokjede rt-PA, ble et inkubasjonstrinn med humant plasmin innbefattet i prosedyren. Humant plasmin (KabiVitrum) ble tilsatt til en final konsentrasjon på 0,13 CU (casein-enheter)/ml. Prøvene ble inkubert i 90 minutter ved romtemperatur. For analysering av prøvene i enkeltkjede-form ble plasmidoppløsningen erstattet med PBS og 90 minutt-inkubasjonen ble utelatt.
Aprotinin (Sigma, omtrent 14 TIU (trypsin-inhibitorenhet)/mg) ble tilsatt til en final konsentrasjon på 72 pg/ml for å inhibere plasminaktiviteten, og prøvene ble inkubert ved romtemperatur i 15 minutter. En 2,16 mM oppløsning av S-2288 ble fortynnet til 1,45 mM med 0,1 M Tris, 0,106 mM NaCl, 0,02% natriumazid, pH 8,4, og 100 pl av denne oppløsningen ble tilsatt til hver brønn av mikrotiterplaten (finalt volum i hver brønn var 200 pl). Fargeutviklingen ble registrert ved 405 nm. Stigning for absorbans mot tidskurve for hver standard og prøve ble bestemt. En standardkurve ble preparert ved plotting av stigningen til absorbans mot tidskurve som en funksjon av rt-PA-konsentrasjon for rt-PA-standardene. Relativ aktivitetskonsentrasjon til mutantene ble deretter bestemt fra standardkurven. Aktivitetskonsentrasjonen til hver mutant ble delt med konsentrasjonen for mutanten oppnådd i rt-PA ELISA, og resulterende spesifikke aktiviteter ble uttrykt relativt til villtype t-PA, som ble tildelt en verdi på 1,0.
Dataene er gjennomsnitt av to analyser og er representert som aktivitet relativt til villtype rt-PA i Tabell I. Resultatene viser at for alle mutanter som er tilstede er tokjede-formen mer aktiv (minst 1,5 ganger, opp til nesten 60 ganger) enn enkjede-formen, relativt til villtype rt-PA, som angir at hver av disse mutantene kan bli betraktet som zymogen i denne analysen.
C. S-2251-analyse
Denne analysen er en indirekte analyse for t-PA-aktivitet. I denne analysen blir plasminogen omdannet til plasmin ved virkningen av t-PA, og plasmin spalter S-2251 substratet for å frigjøre paranitroanilid-kromofor. Produksjon av denne kromoforen blir deretter målt over tid.
1. Fibrin-stimulert S-2251-analyse
Standardkurveprøver ble preparert som beskrevet for S-2288-analysen. Prøver som ble analysert i tokjede-formen ble inkubert med plasmin-Sepharose. Plasmin-Sepharose ble preparert ved kobling av omtrent 20,8 CU humant plasmin
(KabiVitrum) til 1 ral cyanogenbromid-aktivert Sepharose (Pharmacia). Plasmin-Sepharose (50 pl av en 5% oppslemming) ble inkubert med rysting i 90 min. ved romtemperatur med 150 pl prøve. Etter inkubasjon ble harpiksen fjernet ved sentrifugering og 10 pl av prøven ble tilsatt til brønnene av en mikrotiterplate.
For prøver analysert i enkjede-form ble 50 pl cellekulturmedium tilsatt istedenfor harpiks, og inkubasjonstrinnet ble utelatt. Humant trombin (10 pl av en 42 enhet/ml-oppløsning) ble tilsatt til hver brønn. Reaksjonen i hver brønn ble begynt ved tilsetning av en cocktail (130 pl) bestående av 28 pl human Glu-plasminogen (5,3 pM); 10 pl plasminogen-fritt humant fibrinogen (10 pM); 30 pl 3 mM S-2251 (KabiVitrum); og 62 pl PBS. Fargeutvikling ble registrert ved 405 nm og absorbansen ved ref eransebølgelengden på 492 nm ble sub-trahert fra hvert tidspunkt. Stigningen til absorbans mot tid i annen potenskurve ble bestemt for hver standard og mutant - prøve. En standardkurve ble dannet ved plotting av stigningen til absorbans mot tid i annen potenskurve som en funksjon av rt-PA-konsentrasjonen for rt-PA-standarder. Bestemmelse av relativ spesifikk aktitivitet for mutantene var som beskrevet i S-2288-analysen.
2. Fibrinogen-stimulert S-2251-analyse
Denne analysen ble utført som beskrevet for fibrin-stimulert S-2251-analyse med unntagelse av at PBS ble erstattet med trombin.
3. Plasmakoagel S-2251-analyse
Standardkurveprøve-preparering og omdanning av enkjede rt—PA til tokjede rt-PA ved anvendelse av plasmin-Sepharose var som beskrevet for fibrin-stimulert S-2251-analysen. Human trombin (10 pl av en 31 pg/ml oppløsning) ble tilsatt til hver brønn av mikrotiterplaten. Standard og mutante prøver (40 pl) ble tilsatt til platen og reaksjonen ble begynt ved tilsetning av 100 pl av en blanding av 90 pl syresitratdekstrose humant plasma og 10 ul 9,1 mM S-2251 (KaviVitrum). Fargeutvikllng ble registrert ved 405 nm og absorbansen ved referansebølge-lengden 492 nm ble trukket fra hvert tidspunkt. Analysen av dataene var som beskrevet for fibrin-stimulert S-2251-analysen.
4. Plasma S-2251-analyse
Denne analysen ble utført som beskrevet for plasmakoagel S—2251-analysen med unntagelse av at PBS ble erstattet med trombin.
Mutanter ble analysert for zymogene kvaliteter ved anvendelse av de fibrin-avhengige og plasmakoagel-avhengige analysene, og resultatene, relativt til villtypen, er vist i Tabellene II og III. Verdier for mutanter i enkeltkjede-form er gjennomsnitt av to bestemmelser. Verdiene for mutantene i tokjede-formen er gjennomsnitt av fire bestemmelser.
En oppsummering av data i Tabellene I-III, som angir for hvilken analyse hver mutant utviser zymogenisitet, er vist nedenfor i Tabell IV:
Zymogene t-PA-varianter angitt i Tabell IV ble analysert i S-2251 fibrinspesifisitetsanalyse og/eller S-2251 plasmakoagel-spesifisitetsanalyse i både enkjede- og tokjede-formene. Resultatene for enkjede- og tokjede t-PA-variantene er vist henholdsvis i Tabellene V og VI.
En oppsummering av data i Tabellene V og VI er vist nedenfor. Det fremgår at hver av de zymogene rt-PA-variantene fra Tabell IV også er fibrin- og/eller plasmakoagel-spesifikke relativt til villtype t-PA. X angir et forhold mellom fibrin og fibrinogen eller plasmakoagel og plasma på >1,5 målt i S—2251-analysen og angitt i Tabellene V og VI.
Det var en slående korrelasjon mellom de variantene av rt-PA som utviser fibrin og/eller plasmakoagel-spesifisitet og de som oppfyller kriteriene for zymogenisitet spesifisert ovenfor. I tillegg ble to varianter av rt-PA funnet å utvise f ibrinspesifisitet, men var ikke zymogeniske relativt til villtype rt-PA. Tabell VIII viser S-2251-analysedata for fibrinspesifikke og plasmakoagel-spesif ikke varianter. Deponeringen ble utført under forutsetningene av Budapest-avtalen ifølge "International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations therunder (Budapest Treaty)". Dette forsikrer opprettholdelse av en levedyktig kultur i 30 år fra deponeringsdato. Organismen vil bli gjort tilgjengelig av ATCC ifølge Budapest-avtalen, og ifølge avtale mellom Genentec, Inc. og ATCC, som forsikrer permanent og uhemmet tilgjengelighet av avkom av kulturen til det offentlige ved utstedelse av US-PS eller ved offentliggjøring av US- eller utenlandske patentsøknader, og forsikrer tilgjengelighet av avkom til en bestemt av US-Commissioner of Patents and Trademarks å være godkjent ifølge 35 USC §122 og Commissioner's rules (inkludert 37 CFR §1.14 med spesiell referanse til 886 OG 638).
Søkeren av foreliggende oppfinnelse er enig i at dersom kulturen ved deponering skulle dø eller gå tapt eller bli ødelagt når dyrket under egnede betingelser, vil den øyeblikkelig bli erstattet med en levedyktig form av samme kultur når dette er nødvendig. Tilgjengelighet av den deponerte stammen skal ikke anses å være en lisens til å utføre oppfinnelsen i strid med rettighetene tildelt ifølge autoriteten til en regjering ifølge dennes patentregler.
Claims (45)
1.
Fremgangsmåte for fremstilling av en vevsplasminogenaktivator (t-PA) variant som i en analyse av enzymatisk aktivitet utviser en større differensiell aktivitet mellom en-kjedeformen og to-kjedeformen enn vill-type rekombinant t-PA ved spesifikke aminosyresubstitusjoner, innskudd eller delesjoner i proteasedomenet, karakterisert ved at den omfatter: 1) å transformere en rekombinant vertscelle med rekombinant ekspresjonsvektor inneholdende nukleinsyre som koder for en t-PA-variant som har a) en aminosyre som er en annen enn fenylalanin substituert i aminosyreposisjon 305; eller b) en aminosyre satt inn etter én eller begge aminosyreposisjonenene 304 og 305; eller c) én eller flere aminosyrer deletert i aminosyreposisjonene 297 til 305, av vill-type human t-PA; idet nummereringen av aminosyreposisjonene korresponderer til den i figur 1; 2) dyrke vertcellen; og 3) gjenvinne t-PA-varianten fra vertcellen, hvori eventuelt t-PA-varianten fremstilt mangler for minst en del av fingerdomenet til det korresponderende vill-type t-PA, og den eventuelt også mangler aminosyrene 92-179 av korresponderende vill-type t-PA.
2.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at aminosyren som er substituert eller innskutt har en sidekjede som kan virke eller virke som en hydrogen bindingsdonor.
3.
Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at aminosyren er histidin, tyrosin, asparagin, lysin, arginin eller glutamin.
4.
Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at aminosyren er histidin.
5.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at delesjonen er i posisjon 297, 300, 304 eller 305.
6.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at t-PA-varianter velges fra gruppen bestående av F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; i304H t-PA; i304T t-PA; i304N t-PA; 1304K t-PA; i304R t-PA; i304Q t-PA; i304HH t-PA; i305H t-PA; i305T t-PA; i 305N t-PA; i 305K t-PA; i305R t-PA; i305Q t-PA; i304H, i305H t-PA; i305HH t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d303 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297-304 t-PA; d297-305 t-PA; d300-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA; d300-304 t-PA; d300-305t t-PA; d304-305 t-PA; d297, d300 t-PA; d297, d305 t-PA; dl-44, N184D, F305H; dl-44, F305H t-PA;dl-44, 1210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl-44, 1210R, G211A, K212R, V213K, F305H t-PA, dl-44, V213K, F305H t-PA; dl-44, T252R, F305H t-PA; dl-44, V213K, T252R, F305H t-PA; dl-44, 1210K, F305H t-PA; dl-44, 1210R, G211H, K212Q, V213K, F305H t-PA; I210R; G211H, K212Q, V213K, F305H t-PA; 1210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179, F305Ht-PA; d92-179, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305Ht-PA; d92-179, I210R, G211A, K212R,
V213R, T252R, F305H t-PA; Y67N, F305H t-PA; og dl-44, Y67N, F305H t-PA.
7.
Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at t-PA-varianter blir valgt fra gruppen bestående av F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F3050 t-PA; 1304H t-PA; dl-44, F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; dl-44, N184D, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213K, F305H t-PA; I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, F305E t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; og N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA.
8.
Fremgangsmåte for fremstilling av human vevsplasminogenaktivator, karakterisert ved at den har evne til å utvise en eller flere følgende aktiviteter: En stor differensiell aktivitet mellom en-kjede formen og to-kjede formen enn vill-type rekombinant t-PA, et høyere forhold mellom fibrin-avhengig spesifikk aktivitet og fibrinogen-avhengig spesifikk aktivitet i en S-2251 analyse enn vill-type rt-PA, eller et høyere forhold mellom plasma-koagulerings-avhengig spesifikk aktivitet og plasma-avhengig spesifikk aktivitet i en S-2251 analyse enn vill-type rt-PA, kjenntegnet ved at den inneholder minst en aminosyresubstitu-sjon i dets proteasedomene sammenlignet med tilsvarende vill-type t-PA (fra aminosyre 264 til aminosyre 527), hvor substitusjonen er ansvarlig for nevnte biologiske aktivitet, forutsatt at variantene d296-302 t-PA, R304E t-PA, R304S t-PA og A473S t-PA er ekskludert og nevnte substitusjon eks-kluderer substitusjoner utelukkende i regionene 270-280, 448-450 og 502-527, og substitusjonene i regionene 411 til 416, 416 til 423 eller 423 til 430; i det nummereringen av aminosyreposisjonene tilsvarer den i figur 1, og eventuelt mangler t-PA-varianten som fremstilles minst en del av finger domenet fra tilsvarende vill-type t-PA og den mangler eventuelt aminosyrene 92-179 av tilsvarende vill-type t-PA, hvis prosess omfatter: 1) å transformere en rekombinant vertscelle med nukleinsyre som koder for t-PA-variant; 2) dyrke vertcellsen; og 3) gjenvinne t-PA-variant fra vertcellen.
9.
Fremgangsmåte ifølge krav 8, karakterisert ved at substitusjonen innbefatter erstatning av Arg, Asp, His, Glu eller Lys med en nøytral eller negativt ladet aminosyre.
10.
Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at aminosyren anvendt for erstatning er alanin, lysin, serin, treonin, asparagin, glutamin, valin, leucin, isoleucin, fenylalanin eller tyrosin.
11.
Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at aminosyren som blir anvendt for erstatning er alanin, serin, treonin, asparagin, glutamin, valin, leucin, isoleucin, fenylalanin eller tyrosin.
12.
Fremgangsmåte ifølge krav 9, karakterisert ved at aminosyren anvendt for erstatning er alanin, serin eller treonin.
13.
Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at substitusjonen er i posisjon 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 331, 332, 339, 342, 347, 348, 249, 351, 364, 365, 366, 408, 410, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 eller 472 eller kombinasjoner derav, av tilsvarende vill-type t-PÅ.
14.
Fremgangsmåte ifølge krav 13, karakterisert ved at substitusjonen er i posisjonen (ene) 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 264-366, 408, 410, 432+434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 eller 477 av tilsvarende villtype t-PA, hvor "+" indikerer endringer bare i de angitte posisjonene, og "-" indikerer endringer i alle angitte posisjoner.
15 .
Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den er R267A t-PA, D283A, H287A t-PA, K296A, H297A, R298A, R299A t-PA, E303A, R304A t-PA, H331A, E332A t-PA, R339A, R342A t-PA, E347A, E348A, E349A, K351A t-PA, D364A, D365A, D366A t-PA, E408 t-PA, E410A t-PA, H432A, R434A t-PA, R440A t-PA, H445A, R449A t-PA, R449A, D453A t-PA, D460A, R462A t-PA eller D477A t-PA.
16.
Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den har en substitusjon ved hvilke som helst av aminosyreposisjonene 296-299.
17.
Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at den har alanin substituert ved hvilke som helst av aminosyresubstitusjonene 296-299.
18.
Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at alanin er substituert ved hver av aminosyreposisjonene 296-299.
19.
Fremgangsmåte Ifølge krav 12, karakterisert ved at substitusjonen er ved posisjonene 416-418 eller 426-427+429-430 av tilsvarende villtype t-PA, hvor "+" indikerer endringer bare ved angitte posisjoner, og "-" indikerer endringer i alle posisjonene.
20.
Fremgangsmåte ifølge krav 19, karakterisert ved at den er K416A, H417A, E418A t-PA eller E426A, E427A, K429A, E430A t-PA.
21.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 8-20, karakterisert ved at den har en aminosyre-substitusjon, innskudd eller delesjon i en posisjon 117-119,
184-186 eller 448-450 av tilsvarende vill-type human t-PA.
22.
Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at den mangler funksjonell karbohydratstruktur ved aminosyre 184.
23.
Fremgangsmåte ifølge et hvilket som helst av kravene 8 til 22, karakterisert ved at den er glykosylert innenfor vekstfaktordomenen til tilsvarende vill-type t-PA.
24.
Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den inneholder asparagin i posisjon 67 til tilsvarende vill-type t-PA.
25.
Fremgangsmåte for plasminogen-aktivator (t-PA) variant ifølge krav 8, karakterisert ved at alanin er substituert ved hver av posisjonene 296-299.
26.
DNA molekyl, karakterisert ved at det koder for varianten ifølge krav 1.
27.
DNA molekyl, karakterisert ved at det koder for varianten ifølge krav 8.
28.
DNA molekyl ifølge krav 27, karakterisert ved at varianten har alanin substituert med hver av posisjonene 296-299.
29.
DNA molekyl ifølge krav 27, karakterisert ved at det koder for t-PA, D283A, H287A t-AP, K296A, H297A, R298A, R299A t-PA, E303A, R304A t-PA, H331A, H332A t-PA, R339A, R342A t-PA, E347A, E348A, E349A, K351A t-PA, D364A, D365A, D366A t-PA, E408A t-PA, E410-A t-PA, K416A, H417A, E418A t-pa, E426A, R427A, K429A, E430A t-PA, H432-AR434A t-PA, R440A t-PA, H445A, R449A t-PA, R449A, D453A t-PA, D453A t-PA, D460A, R426A t-PA eller D477A t-PA.
30.
Replikerbar ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter DNA-sekvensen ifølge krav 26 og har evne til å uttrykke DNA sekvensen ifølge krav 26 i en transformantvertscelle.
31.
Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 30, k a r a k-terisert ved at transformantvertscellen er eukaryotisk.
32.
Replikerbar ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den har evne til å uttrykke DNA sekvensen ifølge krav 27 i en transformant vertscelle.
33.
Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 32, karakterisert ved at transformantvertscellen er prokaryotisk.
34.
Replikerbar ekspresjonsvektor ifølge krav 32, karakterisert ved at varianten har alanin substituert ved hver av posisjonene 296-299.
35.
Vektor ifølge krav 34, karakterisert ved at den er pTPA33-2 tilgjengelig fra deponeringsnummer ATCC 68.059.
36.
Vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 30.
37.
Eukaryot vertscelle, karakterisert ved at den er transformert med vektoren ifølge krav 31 og er i stand til å uttrykke det gitte genet.
38.
Celler ifølge krav 37, karakterisert ved at de er gjærceller.
39.
Celler ifølge krav 37, karakterisert ved at de er pattedyrceller.
40.
Vertsceller, karakterisert ved at de er transformert med vektoren ifølge krav 32.
41.
Vertsceller ifølge krav 40, karakterisert ved at de er eukaryote celler.
42.
Vertsceller ifølge krav 41, karakterisert ved at de har evne til transient ekspresjon av DNA sekvensen kodende for varianten.
43.
Prokaryote vertsceller, karakterisert ved at de er transformert med vektoren ifølge krav 33, og er i stand til å uttrykke det gitte genet.
44.
Vertsceller ifølge krav 40, karakterisert ved at varianten har alanin substituert ved hver av posisjonene 296-299.
45. E. coli vertscelle, karakterisert ved at de er transformert med vektoren ifølge krav 35 og er i stand til å uttrykke det gitte genet.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US24085688A | 1988-09-02 | 1988-09-02 | |
US07/384,608 US5108901A (en) | 1988-09-02 | 1989-07-24 | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
PCT/US1989/003755 WO1990002798A1 (en) | 1988-09-02 | 1989-08-29 | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
Publications (3)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
NO910811D0 NO910811D0 (no) | 1991-02-28 |
NO910811L NO910811L (no) | 1991-02-28 |
NO310778B1 true NO310778B1 (no) | 2001-08-27 |
Family
ID=26933781
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
NO19910811A NO310778B1 (no) | 1988-09-02 | 1991-02-28 | Fremgangsmåte for fremstilling av vevsplasminogen-aktivator med zymogeniske eller fibrinspesifikke egenskaper |
Country Status (18)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5108901A (no) |
EP (1) | EP0457758B1 (no) |
JP (1) | JP2794028B2 (no) |
KR (1) | KR0148575B1 (no) |
AT (1) | ATE124452T1 (no) |
AU (1) | AU626323B2 (no) |
CA (1) | CA1341484C (no) |
DE (1) | DE68923298T2 (no) |
DK (1) | DK175958B1 (no) |
ES (1) | ES2018729A6 (no) |
FI (1) | FI109359B (no) |
HK (1) | HK1007334A1 (no) |
HU (1) | HU213922B (no) |
IE (1) | IE67508B1 (no) |
IL (1) | IL91306A (no) |
NO (1) | NO310778B1 (no) |
NZ (1) | NZ230509A (no) |
WO (1) | WO1990002798A1 (no) |
Families Citing this family (32)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5756093A (en) * | 1985-04-22 | 1998-05-26 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator variants |
US5736134A (en) * | 1985-04-22 | 1998-04-07 | Genentech, In.C | Tissue plasminogen activator variants |
GB8815135D0 (en) * | 1988-06-24 | 1988-08-03 | British Bio Technology | Proteins & nucleic acids |
DK395288D0 (da) * | 1988-07-15 | 1988-07-15 | Novo Industri As | Proteiner |
US5156969A (en) * | 1988-09-02 | 1992-10-20 | Genentech Inc. | Tissue plasminogen activator variant with deletion of amino acids 466-470 having fibrin specific properties |
US5262170A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-16 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells |
US5714145A (en) * | 1988-09-02 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
US5304482A (en) * | 1989-03-06 | 1994-04-19 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Serine protease mutants of the chymotrypsin superfamily resistant to inhibition by their cognate inhibitors |
US5550042A (en) * | 1989-03-06 | 1996-08-27 | The Board Of Regents Of The University Of Texas System | Serine protease mutants of the chymotrypsin superfamily resistant to inhibition by their cognate inhibitors and genes encoding the same and serine protease inhibitor mutants and genes encoding the same |
EP1029921B1 (en) * | 1989-03-06 | 2002-10-23 | The Board of Regents of The University of Texas System | Serpin resistant t-PA; mutants; genes |
US5866413A (en) * | 1989-03-06 | 1999-02-02 | Board Of Regents Of The University Of Texas System | Pai-1 mutants |
ATE155816T1 (de) * | 1992-06-03 | 1997-08-15 | Genentech Inc | Varianten des gewebeplasminogenaktivators mit verbesserter therapeutischer wirkung |
US5472692A (en) * | 1993-07-02 | 1995-12-05 | New England Deaconess Hospital Corporation | Pro-urokinase mutants |
US5877016A (en) | 1994-03-18 | 1999-03-02 | Genentech, Inc. | Human trk receptors and neurotrophic factor inhibitors |
US5656427A (en) * | 1994-08-29 | 1997-08-12 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid hybridization assay probes, helper probes and amplification oligonucleotides targeted to Mycoplasma pneumoniae nucleic acid |
US5759775A (en) | 1994-10-27 | 1998-06-02 | Genetech, Inc. | Methods for detecting nucleic acids encoding AL--1 neurotrophic factor |
ZA966663B (en) | 1995-08-17 | 1998-02-06 | Genentech Inc | Traf Inhibitors. |
US6610296B2 (en) | 1995-10-26 | 2003-08-26 | Genentech, Inc. | Methods of enhancing cognitive function using an AL-1 neurotrophic factor immunoadhesin |
US6706504B1 (en) | 1996-11-12 | 2004-03-16 | The Scripps Research Institute | Tissue type plasminogen activator (t-PA) variants: compositions and methods of use |
WO1998021320A2 (en) * | 1996-11-12 | 1998-05-22 | The Scripps Research Institute | TISSUE TYPE PLASMINOGEN ACTIVATOR (t-PA) VARIANTS: COMPOSITIONS AND METHODS OF USE |
US20030113271A1 (en) * | 1997-01-29 | 2003-06-19 | University Technology Corporation | Formulations for pulmonary delivery |
JP3394540B2 (ja) | 1997-01-31 | 2003-04-07 | ジェネンテク・インコーポレイテッド | O−フコシルトランスフェラーゼ |
US20040241645A1 (en) * | 1997-01-31 | 2004-12-02 | Genentech, Inc. | O-fucosyltransferase |
WO1999009184A1 (de) * | 1997-08-13 | 1999-02-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Plasminogenaktivator mit verbesserter zymogenität und verminderter fibrinbindung |
WO1999009185A1 (de) * | 1997-08-13 | 1999-02-25 | Roche Diagnostics Gmbh | Plasminogenaktivator mit verbesserter zymogenität |
KR100408844B1 (ko) * | 2000-07-29 | 2003-12-06 | 한국산업기술평가원 | 동물세포 발현벡터 |
US20060104969A1 (en) * | 2004-08-16 | 2006-05-18 | Massachusetts Institute Of Technology | Compositions and methods for enhancing structural and functional nervous system reorganization and recovery |
JP2009533458A (ja) * | 2006-04-14 | 2009-09-17 | マサチューセッツ インスティテュート オブ テクノロジー | 神経系の可塑性を媒介する分子経路の同定および変調 |
EP2056852A4 (en) * | 2006-07-27 | 2010-01-13 | Centocor Ortho Biotech Inc | BMP-7 VARIANTS COMPOSITIONS, METHODS AND USES |
WO2015023830A1 (en) | 2013-08-14 | 2015-02-19 | Stc.Unm | Treatment and prevention of stroke and other neurological disorders |
CA2966332C (en) | 2014-11-03 | 2024-04-16 | Thrombolytic Science, Llc | Methods and compositions for safe and effective thrombolysis |
WO2018232305A1 (en) | 2017-06-16 | 2018-12-20 | Thrombolytic Science, Llc | Methods and compositions for thrombolysis |
Family Cites Families (22)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1984001960A1 (en) * | 1982-11-11 | 1984-05-24 | Beecham Group Plc | Pharmaceutically active compounds |
EP0112122B1 (en) * | 1982-12-14 | 1991-08-28 | South African Inventions Development Corporation | Plasminogen activator |
US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
EP0201153A3 (en) * | 1985-02-09 | 1987-10-07 | Beecham Group Plc | Modified enzyme and process for its preparation |
ATE68825T1 (de) * | 1985-04-22 | 1991-11-15 | Genentech Inc | Plasminogenaktivator-mutante des menschlichen gewebes, verfahren und zwischenprodukte dafuer und diese mutante verwendende zusammensetzungen. |
GB8528321D0 (en) * | 1985-11-18 | 1985-12-24 | Ciba Geigy Ag | Modified fibrinolytic agents |
ZA869626B (en) * | 1985-12-23 | 1987-10-28 | Chiron Corp | Peptide plasminogen activators |
DK43387A (da) * | 1986-01-29 | 1987-07-30 | Beecham Group Plc | Fibrinolytisk enzym |
EP0293394B2 (en) * | 1986-01-31 | 2003-10-29 | Genetics Institute, LLC | Novel thrombolytic proteins |
IE81073B1 (en) * | 1986-03-18 | 2000-01-12 | Genentech Inc | Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation |
PT84589B (en) * | 1986-04-02 | 1989-05-09 | Beecham Group Plc | Process for preparing a fibrinolytic enzyme |
DK345087A (da) * | 1986-07-11 | 1988-01-12 | Novo Industri As | Modificeret vaevsplasminogenaktivator |
WO1988005081A2 (en) * | 1986-12-30 | 1988-07-14 | Cetus Corporation | Novel plasminogen activator |
GB8705377D0 (en) * | 1987-03-07 | 1987-04-08 | Beecham Group Plc | Compounds |
NO882226L (no) * | 1987-05-22 | 1988-11-23 | Zymogenetics Inc | Fibrinolytiske proteiner. |
ZA883958B (en) * | 1987-06-04 | 1989-07-26 | Zymogenetics Inc | Mutant t-pa with ringle replacement |
FI101306B (fi) * | 1987-06-04 | 1998-05-29 | Zymogenetics Inc | Menetelmä kudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin analogien, joissa on muokatut kasvutekijädomeenit, valmistamiseksi |
SE8702562L (sv) * | 1987-06-18 | 1988-12-19 | Kabigen Ab | Nya fibrinolytiska enzymer |
HUT51901A (en) * | 1987-06-22 | 1990-06-28 | Genetics Inst | Process for production of new trombolitic ensimes |
EP0394261A4 (en) * | 1987-07-06 | 1991-09-11 | Genetics Institute, Inc. | Novel thrombolytic proteins |
AU1893988A (en) * | 1987-07-13 | 1989-01-19 | Collaborative Research Inc. | Nonglycosylated plasminogen activator and method of preparation |
DK395288D0 (da) * | 1988-07-15 | 1988-07-15 | Novo Industri As | Proteiner |
-
1989
- 1989-07-24 US US07/384,608 patent/US5108901A/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-14 IL IL9130689A patent/IL91306A/xx active IP Right Grant
- 1989-08-17 IE IE265089A patent/IE67508B1/en not_active IP Right Cessation
- 1989-08-29 AT AT89909997T patent/ATE124452T1/de not_active IP Right Cessation
- 1989-08-29 WO PCT/US1989/003755 patent/WO1990002798A1/en active IP Right Grant
- 1989-08-29 KR KR1019900700927A patent/KR0148575B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1989-08-29 EP EP89909997A patent/EP0457758B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 JP JP1509288A patent/JP2794028B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 DE DE68923298T patent/DE68923298T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1989-08-29 AU AU41946/89A patent/AU626323B2/en not_active Expired
- 1989-08-29 HU HU896005A patent/HU213922B/hu unknown
- 1989-08-31 NZ NZ230509A patent/NZ230509A/en unknown
- 1989-09-01 ES ES8903004A patent/ES2018729A6/es not_active Expired - Fee Related
- 1989-09-01 CA CA000610241A patent/CA1341484C/en not_active Expired - Lifetime
-
1991
- 1991-02-28 NO NO19910811A patent/NO310778B1/no not_active IP Right Cessation
- 1991-03-01 FI FI911049A patent/FI109359B/fi active
- 1991-03-01 DK DK199100369A patent/DK175958B1/da not_active IP Right Cessation
-
1998
- 1998-06-25 HK HK98106560A patent/HK1007334A1/xx not_active IP Right Cessation
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HU213922B (en) | 1997-11-28 |
NZ230509A (en) | 1991-06-25 |
WO1990002798A1 (en) | 1990-03-22 |
HUT58812A (en) | 1992-03-30 |
NO910811D0 (no) | 1991-02-28 |
JPH04500157A (ja) | 1992-01-16 |
DE68923298T2 (de) | 1996-01-11 |
KR0148575B1 (ko) | 1998-10-15 |
FI911049A0 (fi) | 1991-03-01 |
AU626323B2 (en) | 1992-07-30 |
HK1007334A1 (en) | 1999-04-09 |
IE67508B1 (en) | 1996-04-03 |
HU896005D0 (en) | 1991-07-29 |
EP0457758B1 (en) | 1995-06-28 |
DE68923298D1 (de) | 1995-08-03 |
KR900702019A (ko) | 1990-12-05 |
DK36991D0 (da) | 1991-03-01 |
NO910811L (no) | 1991-02-28 |
ES2018729A6 (es) | 1991-05-01 |
JP2794028B2 (ja) | 1998-09-03 |
FI109359B (fi) | 2002-07-15 |
EP0457758A1 (en) | 1991-11-27 |
US5108901A (en) | 1992-04-28 |
AU4194689A (en) | 1990-04-02 |
IL91306A (en) | 1997-08-14 |
CA1341484C (en) | 2005-05-24 |
ATE124452T1 (de) | 1995-07-15 |
IE892650L (en) | 1990-03-02 |
DK175958B1 (da) | 2005-08-29 |
DK36991A (da) | 1991-05-02 |
IL91306A0 (en) | 1990-03-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
NO310778B1 (no) | Fremgangsmåte for fremstilling av vevsplasminogen-aktivator med zymogeniske eller fibrinspesifikke egenskaper | |
US5770426A (en) | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties | |
DK174236B1 (da) | Fremgangsmåde til fremstilling af et protein som har human vævsplasminogenaktivatorfunktion, fremgangsmåde til fremstilling af et farmaceutisk præparat indeholdende proteinet, DNA-isolat, som koder for proteinet, rekombinante klonings- og ...... | |
IL89500A (en) | Human tissue plasminogen activator variants methods for their production and pharmaceutical compositions and preparations containing them | |
US5246850A (en) | DNA molecules encoding human tissue plasminogen activator variants with decreased clearance, vectors, and host cells | |
DK175938B1 (da) | Plasminogenaktivator-varianter, DNA-sekvenser, vektorer, celler og cellekulturer, der omfatter DNA-sekvenser, der koder for sådanne varianter, samt sammensætninger til behandling af karsygdom eller -tilstand, der omfatter en sådan variant | |
US5258180A (en) | Tissue plasminogen activator having fibrin specific properties and deletion of amino acids 466-970, compositions and methods of treatment | |
US5714145A (en) | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties | |
EP0517756B1 (en) | Tissue plaminogen activator having fibrin specific properties | |
EP0542869B1 (en) | Tissue plasminogen activator variants with decreased clearance | |
JP3696617B2 (ja) | フィブリン特異性が改善されたt‐PA置換変異体 | |
EP0563280B1 (en) | Tissue plasminogen activator substitution variant | |
HU210541A9 (hu) | Zimogén- vagy fibrin-specifikus tulajdonságú, a 296-299 aminosav-tartományban helyettesített szöveti plazminogén aktivátor, ezt kódoló DNS-molekulák, vektorok és gazdasejtek | |
HU210529A9 (hu) | Zimogén vagy fibrinspecifikus tulajdonságokkal rendelkező szöveti plazminogén aktivátor Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontra vonatkozik. |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MK1K | Patent expired |