HU210529A9

HU210529A9 - Zimogén vagy fibrinspecifikus tulajdonságokkal rendelkező szöveti plazminogén aktivátor Az átmeneti oltalom az 1-7. igénypontra vonatkozik.

Info

Publication number: HU210529A9
Application number: HU9400024P
Authority: HU
Inventors: William F Bennett; David Botstein; Stephen Anderson; Nicholas F Paoni; Mark J Zoller; Deborah L Higgins
Original assignee: Genentech Inc
Priority date: 1994-09-01
Filing date: 1994-09-01
Publication date: 1995-04-28

Description

A jelen találmány bizonyos szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) zimogénekkel, valamint az ilyen zimogéneket hasznosító gyógyászati célú eljárásokkal és kompozíciókkal foglalkozik. Ezenkívül a találmány tárgyát képezik azok a variánsok is, amelyek módosított szerkezettel rendelkeznek. A módosított szerkezet egyebek mellett magában foglalja a t-PA proteáz doménjében lévő aminosavak helyettesítését. Az ilyen módosítás a variánst zimogénné teszi, azaz viszonylag inaktívvá egyláncú formájában, illetve aktívvá akkor, amikor ez fibrin jelenlétében kétláncú formájává alakul át, és/vagy az eredeti típusú (wild-type; wt) t-PA-nál nagyobb fibrin(vagy plazmarög-) specifitást eredményez.

A plazminogén aktivátorok olyan enzimek, amelyek a zimogén plazminogént (az Arg561-Val562 között hasítva) aktiválják a szerin proteáz plazmin előállítására, amely azután különböző fehérjéket, például fibrint bont le. A tanulmányozott plazminogén aktivátorok között van a sztreptokináz, amely bakteriális fehérje, az urakináz, amely a vese és más szervek által szintetizált enzim és eredetileg a vizeletből izolálták, továbbá a humán szöveti plazminogén aktivátor (t-PA), amely az érfalat borító sejtek által termelt enzim.

Az egyes plazminogén aktivátorok hatásmechanizmusa eltérő. A sztreptokináz a plazminogénnel vagy a plazminnal komplexet képez, így alakítva ki a plazminogénaktiváló hatást; az urokináz közvetlenül hasítja a plazminogént, míg a t-PA, a fibrin és a plazminogén a maximális aktivitás kialakítása érdekében egymással kölcsönhatásban állnak.

A t-PA-ról kimutatták és leírták, hogy különösen fontos és hatásos új biológiai szer, amely rendkívüli eredményeket mutat érbetegségek, például szívizominfarktus kezelésében; ez részben nagy fibrinspecifitásának, részben a vérrögök in vivő feloldására való jelentős képességének az eredménye. Bár a t-PA jelenlétét több tudományos munkacsoport számos vizsgálata sejttette, lényegében tiszta izolátum formában természetes forrásból először az alábbi szakirodalmi helyeken azonosították, illetve írták le az izolátum in vivő plazminogén aktivátor hatását: Colién et al., 4 572 603 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (nyilvánosságra került; 1988.06. 21.); valamint Rijken et al., J. Bioi. Chem., 256:7035 (1981).

Ezt követően a t-PA-t teljes mértékben azonosították, illetve jellemezték DNS-szekvenciája és ebből következtetett aminosav-szekvenciája meghatározásával, amely a rekombináns DNS technikát alkalmazó sikeres munkán alapult; ez ugyanis lehetővé tette nagy menynyiségű t-PA előállítását elkülönült környezetben. Erről a munkáról az alábbi szakirodalmi helyek számolnak be: Pennica et al., Natúré, 301: 214 (1983); valamint a 4 766 075 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás (nyilvánosságra került: 1988.08.23.).

Ezen leírások alapján világosnak látszik, hogy a t-PA molekula öt olyan domént (tartományt) tartalmaz, amelyeket már meghatároztak homológ vagy más módon hasonló különféle fehérjékben, például tripszinben, kimotripszinben, plazminogénben, protrombinban, fibronektinben és epidermális növekedési faktorban (EGF). Ezeket a tanulmányokat - a t-PA aminosav-szekvenciájának N-terminálisától indulva - a következőképpen nevezték el: 1) ujjtartomány (F), amelyet sokféleképpen definiáltak; ez az 1. és a körülbelül 44. hely közötti aminosavakat foglalja magában; 2) a növekedési faktor terület (G), amelyet többféleképpen, definiáltak; ez a 45. és 91. aminosavak közötti területet fogja át (az EGF-fel való homológia alapján); 3) „első horog” (KI), amelyet mint a 92. és a körülbelül 173. aminosav közötti területet határoztak meg; 4) „második horog'¹” amelyet a körülbelül 180. és a körülbelül 261. aminosav közötti területként definiáltak; valamint 5) az úgynevezett szerin proteáz tartomány (P), amelyet általában úgy határoznak meg, hogy az a körülbelül 264. aminosav és a molekula C-terminálisa közötti területet fogja át. Ezek a tartományok, amelyek általában egymás szomszédságában helyezkednek el vagy pedig rövid kapcsoló („linker”) tartományokkal vannak elkülönítve, a t-PA valószínűsített érett formája 1-527. aminosavainak teljes aminosav-szekvenciáját kiadják.

Az egyes tartományokról sokféleképpen leírták, hogyan osztoznak bizonyos speciális, biológiailag fontos tulajdonságokban. Az ujjtartományt az jellemzi, hogy egy olyan szekvenciát tartalmaz, amelynek a fibrinhez való kötődési aktivitás szempontjából lényeges szerepe van. (Erről az aktivitásról úgy vélik, hogy fontos szerepet játszik abban a nagy specifitásban (fajlagosságban), amelyet a t-PA mutat a vérrögoldásban a fibrinben gazdag trombusok színhelyén.) A növekedési faktor terület hasonlóképpen a sejtfelületi kötőaktivitással kapcsolatos. A második horog terület szintén erős kapcsolatban van a fibrinkötéssel és a fibrinnek azzal a képességével, hogy stimulálja a t-PA aktivitását. A szerint proteáz tartomány felelős a plazminogén enzimes hasításáért, amelynek eredményeképpen plazmin keletkezik.

A természetes t-PA-val mint vérrögoldó szerrel együttjáró, korábban talált jelentős előnyök ellenére sem valószínűsíthető, hogy szükségszerűen a természetes protein képviseli az optimális t-PA-szert minden körülmények között. Ennél fogva számos változatot javasoltak és találtak ki, hogy fokozzák a t-PA specifikus tulajdonságait. Ezen variánsok némelyike megszünteti a természetes t-PA alkalmazásával együttjáró hátrányokat olyan helyzetekben, ahol előnyösebb lenne egy hosszabb felezési idejű vagy lassabb kiürülés! sebességű szer, például a mély vénás trombózis kezelésében, az infarktusban szenvedők reperfiíziójában, illetve ahol egy egyláncú szer lenne előnyösebb.

így például az ujjtartomány jelentős részének vagy egészének eltávolítása olyan molekulát eredményez, amely jelentősen csökkent fibrinkötési jellemzőkkel bír, ugyanakkor pedig csökkenés alakul ki a keletkezett egység általános feltisztulási képességében is (WO 89/00 197 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentés, amely 1989. 01.12-én került nyilvánosságra).

A 199 574 számú európai szabadalmi bejelentés olyan variánsokat ír le, amelyek aminosav-helyettesítésekkel bírnak a 275., 276. és 277. helyeknél lévő proteolitikus hasítási helyeknél. Ezekre a variánsokra, amelyek elsősorban úgy jellemezhetők, mint a 275. helynél

HU 210 529 A9 arginintől eltérő aminosavat tartalmazó t-PA variánsokra, amelyek - a természetes t-PA-val ellentétben, amely létezhet egy- vagy kétláncú formában - rezisztens a proteáz hasítására a 275. helyen és ennélfogva nem alakulnak át metabolikusan in vivő kétláncú formába. Erről az egyláncú formáról vélhető, hogy biológiai és ipari-kereskedelmi szempontból bizonyos előnyökkel bír, amennyiben stabilabb, illetve fibrinkötése és fíbrinstimulálása is fokozott a kétláncú t-PA-hoz viszonyítva. Ezenkívül leírtak olyan plazminogén aktivátorokat, amelyek egy fibrinnel kölcsönhatásba lépni képes tartományt tartalmaznak az urokináz proteáz tartományával együtt; ennek egyik formája egy olyan urokináz, amelyet úgy változtattak meg, hogy kevésbé legyen hajlamos a kétláncú urokináz kialakítására (WO 88/05 081 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentés; nyilvánosságra került 1988.07.14-én).

A t-PA proteáz hasítási helyének módosítására vonatkozó további szabadalmi dokumentumok például a következők: 201 153 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1986. 11. 12-én); 233 013 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987. 08. 19-én); 292 009 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1988. 11. 23án); 293 936 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1988. 12. 07-én); 293 934 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1999. 12.07-én); valamint WO 88/10 119 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentés).

A 117-119., 184-186. és a 448-450. tartománynál lévő glikozilezési mutánsok nagyobb fajlagos aktivitást mutatnak, mivel a szénhidrát mólszázalékos értéke csökkent [227 462 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987. 07. 01-én)]. Ez a szabadalmi bejelentés ezenkívül leírja egy fibrin/fibrinbomlástermék vizsgálati eljárás alkalmazását és kitanítást ad arról, hogy a t-PA-t módosíthatjuk a 272-280. helyeken is, vagy kiiktathatunk akár 25 aminosavat is a C-terminálisból. Ezenkívül az Ásni 19, Alal86 és Asn450 aminosavakkal rendelkező t-PA mutánsokról, amelyekből az N-glikozilezési helyek szelektíven el vannak távolítva DNS módosítások segítségével, de amelyek tartalmaznak visszamaradó O-kötésQ szénhidrátokat, kimutatták, hogy egy in vitro lizálási vizsgálatban mintegy kétszer olyan hatékonyak, mint a melanoma t-PA [225 286 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987.06.10-én)].

A glikozilezési hely módosítása céljából korábban már ismertették a t-PA 449. aminosavának bármely arginitől eltérő aminosavval történő helyettesítését. Leírták továbbá az Arg275 módosítását, illetve a -3. és 91. helyek közötti terület kiiktatását is [WO 87/04 722 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987.08. 13-án)]. Leírtak egy aminosav-helyettesítést a t-PA448. helyénél is, amely azért kívánatos, mert kiküszöböli a glikozilezés lehetőségét [297 066 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1988.12.28-án)]. A 448-450. helyeken történő módosításoknak és az N-terminális 1-82. aminosavak kiiktatásának kombinációját ismerteti a WO 89/00 191 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1989.01.12-én). Ezenkívül a glikozilezés megakadályozása érdekében módosították az urokinázt is az Asp302Ser303-Thr304 helyen. A glikozilezési helyekben, főleg a 117. aminosavhelyen történő változások, úgy tűnik, mindig olyan molekulát eredményeznek, amelyek megváltozott oldhatósági jellemzőkkel rendelkeznek, ezek pedig változásokat eredményezhetnek a vérkeringési felezési időben és/vagy a fibrinkötő tulajdonságokban [238 304 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987.09. 23-án)].

Amikor kiiktatják a növekedési faktor tartományt, az így létrejövő variáns még aktív, és kötődik a fíbrinhez, amint erről A. J. van Zonneveld és munkatársai beszámolnak [Thrombos. Haemostas, 54 (1)4 (1985)]. A szabadalmi irodalomban is beszámoltak különböző, a növekedési faktor tartományban végzett kiiktatásokról [241 209 számú európai szabadalmi bejelentés (törölve: 58-87 és 51-173); WO 87/04 722 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentés (az N-terminális 191. egészének vagy egy részének kiiktatása); 231 624 számú európai szabadalmi bejelentés (a teljes növekedési faktor tartomány kiiktatása); 242 836 számú európai szabadalmi bejelentés és 62-269 688 számú japán szabadalmi közzétételi irat (Kokai) (a növekedési faktor tartomány egy része vagy egésze van kiiktatva)].

Kimutatták továbbá, hogy a t-PA-t módosítani lehet mind az első horog tartományban, mind a növekedési faktor tartományban; ez a módosítás megnövekedett vérkeringési felezési időt eredményez [241 208 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987. 10. 14-én)]. Az 51. és 87. aminosavak közötti területet (a határokat is beleértve) ki lehet iktatni a t-PA-ból; ez olyan variánst eredményez, amelynek lassabb a kiürülése a plazmából [Browne et al., J. Bioi. Chem., 263, 1599-1602 (1988)]. A t-PA-t hátrányos biológiai hatások nélkül lehet módosítani az érett, natív t-PA 67-69. aminosavai közötti területen olyan módon, hogy bizonyos aminosavakat kiiktatnak, illetve egy vagy több aminosavat más aminosavakra cserélnek [240 334 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1987. 10. 07-én)].

Leírtak olyan t-PA/urokináz hibridet is, amely a t-PA-nak a 273-527. aminosavait átölelő területét tartalmazza [290 118 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1988. 11.09-én).

A humán t-PA olyan, szerpinrezisztens mutánsait is leírták, amelyeknél a proteáz tartományban van változás; ide tartoznak a d296-302 t-PA, az R304.S t-PA és az R304E tPA [Madison et al., Natúré, 339, 721 724 (1989); valamint az ugyanebben a számban Dagmar Ringe az előbbihez kapcsolódó közleménye].

A plazminogén aktivátorokról és második generációs származékaikról általános áttekintés található az alábbi közleményben: Harris, Protein Engineering, 1, 449-458 (1987). További áttekintések találhatók a t-PA variánsokról a következő szakirodalmi helyeken: Pannekoek et al., Fibrinolysis, 2, 123-132 (1988); valamint Ross et al., Annual Reports in Medicinái Chemistry, Vol. 23, Chapter 12 (1988).

HU 210 529 A9

Bár az előbb felsorolt leírások igazolják azt, hogy újabb - és bizonyos tekintetben jobb - t-PA szerek állnak rendelkezésre, eddig még nem írtak le olyan t-PA molekulákat, amelyek csak akkor aktiválódnak, amikor elérik a feloldandó vérrög helyét. Jelenleg a t-PA molekulák - akár egyláncú, akár kétláncú formában vannak - fibrin és/vagy plazmaproteinek vagy teljes vér jelenlétében is aktívak. Kívánatos lenne, ha rendelkezésre állna egy olyan zimogén tPA, amely ahhoz, hogy a teljes aktivitást elérje, fibrin jelenlétében azt igényelné, hogy az egyláncú formája kétláncú formává kapcsolódjon. Az ilyen variánsmolekulák valószínűleg kevesebb mellékhatást mutatnának (például kisebb vérzést), és fibrinogén-takarékos tulajdonságokkal rendelkeznének, s ezáltal az orvostudománynak jelentős, új alternatívákat nyújtanának a szív- és érrendszeri betegségek és más olyan gyógyászati esetek kezelésében, amelyek a véredények tromboembóliás elzáródásából alakulnak ki, valamint a letapadások kialakulásának megelőzésében.

Szükség volna olyan t-PA molekulára is, amely az eredeti típusú t-PA-hoz viszonyítva nagyobb fibrinstimulált (vagy plazmavérrög-stimulált) aktivitással bír, mint fibrinogénstimulált (vagy plazmastimulált) aktivitással, azaz fibrin- (vagy plazmavérrög-) specifikus, vagyis csak a vérrög helyén működik, nem pedig szisztémásán.

A jelen találmány egyik tárgya olyan zimogén és/vagy fibrinspecifikus t-PA molekulák biztosítása, amelyek javított terápiás és gyógyszerészeti jellemzőkkel rendelkeznek.

A jelen találmány egy másik tárgya azokkal a kezelési körülményekkel foglalkozik, amelyek lehetővé teszik az olyan vérrögoldó szerek alkalmazását, amelyek csak a vérrög helyén aktívak és nagyobb koncentrációkban használhatók, mint más ilyen jellegű szerek.

A fenti szempontok szerinti célkitűzések egy olyan szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) zimogén segítségével valósíthatók meg, amely plazminnal végzett hasításkor képes a t-PA enzimatikusan aktív formájává átalakulni, találmány egy másik megoldása olyan t-PA variánsra vonatkozik, amely az eredeti típusú t-PA-hoz viszonyítva a t-PA protázdoménjén belül egy vagy több helyen olyan aminosav-változáson ment át, amely változás a variánst a megfelelő eredeti típusú tPA-hoz viszonyítva zimogénné teszi.

Az egyik különösen előnyös megoldás értelmében a t-PA humán t-PA, és a változás a 305. körüli területen (beleértve a 305. helyet is) megy végbe; ilyen változás például a megfelelő eredeti típusú t-PA 305. helyén a fenil-alanin kicserélése hisztidinre.

Egy másik megoldás során a találmány olyan DNS szekvenciával foglalkozik, amely a fenti zimogént és ennek variánsait kódolja; foglalkozik továbbá az említett DNS szekvenciát valamely transzformált gazdasejtben expresszálni képes replikálható expresszáló vektorokkal, valamint a nevezett vektorokkal transzformáit mikroorganizmusokkal és sejttenyészetekkel.

A találmány egy további megoldása olyan eljárásra vonatkozik, amelynek során

a) bevezetünk egy aminosav-változatot a t-PA proteázdoménjébe; és

b) az így létrejött t-PA variánst a zimogén jelleg szempontjából vizsgáljuk.

A találmány további tárgya olyan humán szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) variánsra vonatkozik, amely képes az alábbi biológiai tulajdonságok közül egyet vagy többet mutatni: zimogén aktivitás, fibrinspecifitás vagy plazmavérrög-specifitás. Az ilyen variánst az jellemzi, hogy proteázdoménjében a megfelelő eredeti típusú t-PA-val összehasonlítva olyan aminosav-változást tartalmaz, amely változás felelős az említett biológiai aktivitásért, azzal a megkötéssel, hogy az ilyen változások szempontjából ki vannak zárva a 270280., a 448-450. és az 502-527. területek. A variánsban a változás előnyösen helyettesítés.

A találmány egy további szempontja szerinti eljárás során

a) bevezetünk egy aminosav-változást a szöveti plazminogén aktivátor (t-PA) proteázdoménjébe; és

b) az így létrejött t-PA variánsokat arra nézve vizsgáljuk, hogy milyen mértékben mutatnak egy vagy több biológiai aktivitást a következők közül: zimogén aktivitás, fibrinspecifitás vagy plazmavérrög specifitás.

A jelen találmány egy további megoldása a fentebb leírt variánsokat kódoló DNS-szekvenciákra és replikálható vektorokra, valamint az ezen vektorokkal transzformált gazdasejtekre vonatkozik.

A jelen találmány egy még további megoldása egy az érrendszeri állapotok vagy betegségek kezelésére szolgáló kompozícióra irányul, amely készítmény egy jelen találmány szerinti zimogén vagy zimogénvariáns gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazza valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverve. A találmány kiterjed továbbá olyan kompozíciókra is, amelyek a fibrinlerakódás vagy -letapadás kialakulásának vagy újraképződésének megakadályozására szolgálnak. Ez utóbbi kompozíció egy jelen találmány szerinti zimogén vagy zimogénvariáns gyógyászatilag hatékony mennyiségét tartalmazza valamely gyógyászatilag elfogadható hordozóval összekeverve.

Egy ismét további megoldás értelmében a jelen találmány eljárást nyújt az érrendszeri állapotok vagy betegségek kezelésére emlősökben, amely eljárás abból áll, hogy az emlősnek a fentebb ismertetett megfelelő kompozíció hatékony mennyiségét adjuk be.

A jelen találmány továbbá eljárást biztosít emlősök kezelésére annak érdekében, hogy megakadályozzuk a fibrin lerakódását vagy letapadásának kialakulását, illetve újraképződését, amely eljárás abból áll, hogy az emlősben a potenciális fibrinlerakódási vagy -letapadási helyre a fentebb ismertetett megfelelő kompozíció hatékony mennyiségét juttatjuk be.

A jelen találmány szerinti első megoldás többek között azon a különösen sikeres kutatáson alapul, amely bebizonyította, hogy a t-PA aktivitás valamely serkentőjének, például plazminnal degradált fibrinogén fragmentumoknak a jelenlétében bizonyos t-PA molekulák zimogének és így fibrinolitikus aktivitásuk le4

HU 210 529 A9 csökken, amikor általában a plazmában vannak, és aktiválódik, amikor a vérrög helyén a plazmin közelébe kerülnek. így tehát a zimogén úgy aktiválódik, ahogyan ezt a speciálisan lokalizálódott vérrög elleni terápia igényli. A jelen találmány szerinti zimogének esetében tehát várható, hogy a fibrinogént megkímélik és ezért általában nagyobb dózisban alkalmazhatók, mint nemzimogén megfelelőik, ez pedig gyorsabb vérrögoldódást és több vérrög oldódását eredményezi.

A jelen találmány szerinti második megoldás olyan t-PA molekulákra vonatkozik, amelyek fibrinre (vagy plazmavérrögre) nézve nagyobb specifitással rendelkeznek; így előnyösebben hatnak a vérrög helyén, mint a módosítatlan t-PA. Az

1. ábra a t-PA primer szerkezetét ábrázolja, bemutatva az öt tartomány elhelyezkedését, a diszulfidhíd képződés helyét, és azt az aktiválási helyet, ahol a molekula kétláncú molekulává kapcsolódik („csíptetődik”) össze. A

2. és a a pCISt-PA előállítására szolgáló megfelelő el3. ábra járás vázlatos bemutatása, ahol bizonyos jelentős restrikciós helyek leírása is megtalálható. A

4. ábra a p7-lH előállítására szolgáló megfelelő eljárás vázlatos bemutatása, amelyben bizonyos jelentős restrikciós helyek leírása is megtalálható. Az

5. ábra a túlnyomórészt egyláncú F3O5H (fekete háromszögek), a kétláncú F305H (fekete körök kettős vonallal), az egyláncú eredeti típusú tPA (fekete négyzetek), a kétláncú eredeti típusú t-PA (fekete rombuszok), valamint az egyláncú és kétláncú eredeti típusú t-PA keverékének (üres háromszögek) fibrinkötését mutatja be 10 ng/ml t-PA koncentrációnál. A

6-9. ábrák a plazminogén plazminná alakulása kinetikájának függvényei plazminnal degradált fibrinogén jelenlétében a túlnyomórészt egyláncú eredeti típusú t-PA-val (6. ábra), a kétláncú eredeti típusú t-PA-val (7. ábra), a túlnyomórészt egyláncú F305H t-PA-val (8. ábra) és a kétláncú F305H t-PA-val (9. ábra). A négyzetek, vonalak és körök a plazminogén és a t-PA különböző koncentrációit képviselik a vizsgálati pufferben, amelyeket az I. példa végén részletezünk. Ezekben az ábrákban az ordináta a 405 nm-nél mért abszorbancia és az abszcissza azon percek számának a négyzete, amelyeknél az abszorbanciát mérjük.

A. Definíciók

Ahogyan itt használjuk, a „humán szöveti plazminogén aktivátor”, „humán t-PA” és „t-PA” kifejezések olyan humán külsődleges (szöveti típusú) plazminogén aktivátort jelölnek, amelynek két funkcionális területe van, egyrészt egy proteázdomén, amely képes a plazminogént plazminná átalakítani, másrészt egy N-terminális terület, amely feltehetően a fibrinkötésért felelős. Ez a három kifejezés ennélfogva olyan polipeptideket foglal magában, amelyek ezeket a funkcionális tartományokat teljes szekvenciájuk részeként tartalmazzák. A t-PA megfelelően termelhető például rekombináns sejttenyészet-rendszerek segítségével, biológiailag aktív formákban, amelyek tartalmazzák a proteázdomént és a t-PA olyan területeit, amelyek a t-PA forrása szempontjából egyébként natívak. Be lehet látni, hogy egyedről egyedre változó természetes alléi változatok is léteznek, amelyek a teljes szekvenciában egy vagy több aminosav eltérésében mutatkoznak meg.

Ahogyan itt használjuk, az „eredeti típus” olyan t-PA-ra utal, amelyet a 4 766 075 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás által ismertetett cDNS kódol. Az így kódolandó t-PA származhat bármely natív forrásból vagy bármely rekombináns expressziós rendszerből, beleértve a 293 és 294 sejteket, kínai hörcsög petefészeksejteket stb.

Ahogyan itt használjuk, a „proteázdomén” az eredeti típusú t-PA érett formájának arra a tartományára utal, amely a 264. aminosav és az 527. aminosav között található (a határértékeket is beleértve).

A jelen találmány szerinti t-PA leírásánál alkalmazott „zimogén jellegű”, „zimogén” és „zimogén aktivitás” kifejezéseknek meg kell felelniük az alább megadott meghatározások legalább egyikének. Az első meghatározás szerint ezek a kifejezések azt jelentik, hogy plazminnal degradált fibrinogén jelenlétében a t-PA egyláncú formájának kétláncú („enzimesen aktív”) formává kell összekapcsolódnia, amint ez a plazmin jelenlétében történik, annak érdekében, hogy enzimaktivitása növekedjék az alább leírt vizsgálati körülmények között.

Fibrinogén fragmentumok jelenlétében a t-PA (zimogén) egyláncú formája - az alább leírt vizsgálattal mérve - kevésbé aktív, mint az eredeti típusú kétláncú t-PA, és akkor alakul át enzimesen aktívabb formájába, amikor olyan plazminkoncentrációnak kitéve aktiváljuk, amely az egyláncú formának kétláncú formává történő teljes átalakulását idézi elő. Általában az egyláncú forma aktivitása a megfelelő kétláncú forma aktivitásának 50%-ára vagy még kevesebbre, előnyösen 20%-ára vagy még kevesebbre, még előnyösebben 10%-ára vagy még kevesebbre csökken; majd a kétláncú formává összekapcsolódva az aktivitás az eredeti típusú kétláncú forma aktivitásának körülbelül 20-100%-ára, előnyösen legalább 50%ára növekszik.

A variánst enzimes aktivitására nézve olyan módon vizsgáljuk meg, hogy az I. példában leírt vizsgálat felhasználásával, S-2251 kromogén plazmin szubsztrátumot alkalmazva, fibrinogén fragmentumok jelenlétében meghatározzuk a plazminogén plazminná való átalakulásának a kinetikáját.

A zimogén első definíciója szerint a zimogén olyan anyag, amely a fenti körülmények között a plazmintermelésben elkülönült lag fázist mutat, és így az A405ben való növekedésben, továbbá az idő négyzetének (idő²) függvényében ábrázolva, az idő növekedésével lineáris kinetikát mutat. Az idő² kinetika leírása az alábbi szakirodalmi helyen található meg: Nieuwenhu5

HU 210 529 A9 izén, W., Voskuilen, M., Traas, D„ Hoegee-de Nobel,

B. , Verheijen, J. H. , Fibrinogen-Structural Variants and Interactions, eds., A. Henschen, B. Hessel, J. McDonagh, T. Saldeen (1985), 331-342. Anélkül, hogy eljárásunkat valamely elméletre korlátoznánk, ez a hatás valószínűleg az egyláncú formának kétláncú formává történő plazminkatalizált átalakulásának tulajdonítható, amely a t-PA zimogén aktiválásához vezet. Ez ellentétes az eredeti típusú egyláncú t-PA-nál, az eredeti típusú kétláncú t-PA-nál és a zimogén t-PA kétláncú formájánál a vizsgálat kezdetétől megfigyelt lineáris kinetikával.

A második, alternatív definíció szerint a „zimogén” kifejezés olyan t-PA molekulára utal, amely az enzimatikus aktivitás vizsgálatában nagyobb aktivitáskülönbséget mutat az egyláncú és kétláncú forma között, mint az eredeti típusú rekombináns t-PA (rt-PA). A zimogén ilyen jellegű aktivitáskülönbsége előnyösen legalább

1,5-szerese az eredeti típusú t-PA-nál megfigyelt aktivitáskülönbségnek. Ezt az aktivitáskülönbséget úgy kaphatjuk meg, hogy csökkenéskor az eredeti típusú rt-PA-hoz viszonyítva az egyláncú forma aktivitása nagyobb mértékben csökken, mint a kétláncú formáé; ugyanakkor növekedéskor az eredeti típusú rt-PA-hoz viszonyítva a kétláncú forma aktivitása nagyobb mértékben növekszik, mint az egyláncú formáé; vagy az ismertetett hatást eredményező körülmények bármely kombinációjának segítségével. Az eredeti típusú t-PA zimogén jellegét az alábbi szakirodalmi helyek mutatják be : Loscalzo, J. Clin. Invest. , 82 : 1391-1397 (1988) és Ranby et al., Thrombosis Research, 27: 175— 183 (1982).

A „fibrinspecifitás” vagy „fibrinfajlagosság” kifejezés egy mutáns olyan aktivitására utal, amely a fibrinfüggő fajlagos aktivitás és a fibrinogénfüggő fajlagos aktivitás nagyobb hányadosát mutatja az S-2251 vizsgálatban (mind egyláncú, mind kétláncú formában), mint az eredeti típusú rt-PA; ennek az aránynak az értéke előnyösen legalább 1,5.

A„plazmavérrög specifitás” egy mutáns olyan aktivitására utal, amely a plazmavérrög-függő fajlagos aktivitás és a plazmafüggő fajlagos aktivitás nagyobb hányadosát mutatja az S-2251 vizsgálatban (mind egyláncú, mind kétláncú formában), mint az eredeti típusú rt-PA; ennek az aránynak az értéke előnyösen legalább 1,5.

Ahogyan itt használjuk, a „tranziens expresszáló rendszer” olyan sejttenyészetre utal, amely valamely t-PA variánst kódoló vektorral transzfektált sejteket tartalmaz; ez a vektor a variánst kódoló DNS-szekvenciát átmenetileg expresszálja, vagyis olyan módon, amely lehet, hogy nem stabil. Az ilyen sejteket tartjuk „tranziens expresszió”-ra alkalmasnak.

B. Általános módszerek 1. Aminosavszekvencia-variánsok

Abból a célból, hogy a variánsokat könnyebben tudjuk tárgyalni, az 1. ábrára utalunk, amely a t-PA primer szerkezetét mutatja be. Az 1. ábrában a körökben lévő betűk az aminosavak egybetűs kódjai; a láncok közötti összekötő vonalak a diszulfidhidakat jelzik; az üres körök a glikozilezési helyeket szemléltetik, és az F, GF, KI, K2 és SP jelölések - az előbbi sorrendnek megfelelően - az ujj, növekedési faktor, 1. horog,

2. horog és szerin proteáz tartományokat mutatják be.

Az itt bemutatott t-PA variánsok „gyorsírásos” jelölésével kapcsolatban megjegyezzük, hogy a számok az egyes aminosavgyököknek az érett t-PA aminosavszekvenciájában elfoglalt helyére utalnak. (96 619 számú európai szabadalmi bejelentés). Az aminosavak azonosítására az alábbi egybetűs kódokat használjuk:

Asp	D	Aszparagin- sav	Ile	I	Izoleucin
Thr	T	Treonin	Leu	L	Leucin
Ser	S	Szerin	Tyr	Y	Tirozin
Glu	E	Glutaminsav	Phe	F	Fenil-alanin
Pro	P	Prolin	His	H	Hisztidin
Gly	G	Glicin	Lys	K	Lizin
Alá	A	Alanin	Arg	R	Arginin
Cys	C	Cisztein	Tip	W	Triptofán
Val	V	Valin	Gin	Q	Glutamin
Met	M	Metionin	Asn	N	Aszparagin

A leírásban vagy az ábrákban található helyettesítéses variánsoknál a jelölés egy betűből, egy ezt követő számból, majd ismét egy betűből áll. Az első (baloldali) betű az eredeti típusú érett t-PA-ban lévő aminosavat jelöli. A szám az aminosav helyére utal, ahol az aminosav-helyettesítés történik, és a második (jobboldali) betű jelöli azt az aminosavat, amelyet az eredeti típusú aminosav helyettesítésére alkalmazunk. Egy inzertált (beiktatásos) variánsnál a jelölés egy i betűből áll, amelyet egy szám követ; ez az eredeti típusú érett t-PA-ban lévő azon gyök helyét jelzi, amely előtt a beiktatás kezdődik; ezután következik egy vagy több nagybetű, amely jelzi, hogy milyen beiktatás történt. Egy deláciős (kiiktatásos) variánsnál a jelölés egy d betűből áll, amelyet a kiiktatás kiindulási száma követ, majd kötőjellel a kiiktatás befejezési száma; a helyek számozása az eredeti típusú érett t-PA számozásán alapul. A többszörös mutációkat vesszővel választjuk el egymástól a megjelölésben, hogy az olvasást könnyebbé tegyük.

A nómenklatúrát az alábbi példákkal szemléltetjük: egy olyan helyettesítéses variáns, amelyben az eredeti típusú t-PA 305. helyénél a fenil-alanin hisztidingyökkel van helyettesítve, F305H jelölést kap. Egy olyan helyettesítéses variáns, amelyben többszörös helyettesítés található a 269-299. egymást követő helyeken KHAR-ről AAAA-ra, a K296A, H297A, R298A, R299A jelölést kapja. Egy olyan inzertált (beiktatásos) variánst, ahol cisztein és valin van beiktatva az eredeti típusú t-PA 305. helye után, Í305CVnek jelöljük. Egy olyan deléciós (kiiktatásos) variánst, ahol a 300-305. helyeken lévő aminosavak vannak az eredeti típusú érett tPA-ból kiiktatva, d300305-nek jelöljük. A „t-PA” megnevezés minden mutánsmegjelölés után ott szerepel.

HU 210 529 A9

A zimogének egyik előnyös osztályát azok a zimogének képezik, amelyekben a helyettesítések, inzertálások (beiktatások) és deléciók (kiiktatások) az eredeti típusú tPA 305. helyénél vagy a körül történnek. Ezek között a variánsok között találjuk azokat, amelyek a megfelelő eredeti típusú t-PA 305. helyén a fenil-alanintól eltérő aminosavat tartalmaznak. Még előnyösebbek azok a variánsok, amelyek a 305. helyen olyan oldallánccal rendelkeznek, amely hidrogénkötés-donorként működik vagy képes működni; ilyenek például az olyan oldalláncok, amelyek hidroxilcsoportot vagy nitrogénatomot tartalmaznak. Ezek közül különösen előnyösek az olyan aminosavak, mint az arginin, lizin, tirozin, aszparagin, glutamin és a hisztidin. Az ilyen típusú beiktatásos zimogén variánsok közül előnyösek azok, amelyek egy vagy több (előnyösen egy) aminosavat tartalmaznak a 304. vagy a 305. helynél lévő aminosavak után; itt elsősorban azok az aminosavak jönnek szóba, amelyeket fentebb ismertettünk, vagyis azok, amelyek olyan oldallánccal rendelkeznek, amely hidrogénkötésdonorként működik vagy képes működni, például egy hidroxilcsoportot vagy nitrogénatomot tartalmazó oldallánc. Ilyen aminosavak például az arginin, lizin, tirozin, aszparagin, glutamin és a hisztidin, legelőnyösebben a hisztidin. Az előnyös kiiktatásos zimogén variánsok között találjuk azokat, amelyek az eredeti típusú t-A 297. és b305. közötti területében (a határértékeket is beleértve) tartalmaznak kiiktatásokat; ide tartoznak például a d297 tPA, a d298 t-PA stb. és ezek kombinációi, például a d297-299 t-PA vagy a d297, d305 t-PA.

A fentebb jelzett zimogén variánsok előnyös formái között találjuk az alábbiakat: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; Í304 H t-PA; Í304 T t-PA; Í304 N t-PA; Ϊ304 K t-PA; i304 R t-PA; Í304 Q t-PA; Í304 HH t-PA; Ϊ305 H t-PA; Í305 T t-PA; Í305 N t-PA; i305 K t-PA; i305 R t-PA; Í305Q t-PA; i304H,i305H t-PA; Í305HH t-PA; d297 t-PA; d298 t-PA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d303 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297298 t-PA; d297-299 t-PA; Ó297-300 t-PA; d297-301 t-PA; d297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297-304 t-PA; d297-305 t-PA; d300-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300303 t-PA; d300-304 t-PA; d3OO-3O5 t-PA; d304-305 t-PA; d297, d300 t-PA; d297, d305 t-PA; d-144, N184D, F305H t-PA; dl-44, F3O5H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213K, F305H t-PA; dl-44, V213K, F305H t-PA; dl-44, T252R, F305H t-PA; dl44, V213K, T252R, F305H t-PA; dl-44,1210K, F305H t-PA; dl-44,1210R, G211H, K212Q, V213K, F305H t-PA; I210R, G211H, K212Q, V213K, F305H t-PA; I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; d92-179, I21OR, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179,1210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; Y67N, F305H t-PA; dl-44, Y67N, F305H t-PA.

Az előnyös formák között találjuk a fentiek T252R vagy NI B4S analógjait, valamint ezek kombinációit.

(A proteázdoméntól eltérő tartományokban lévő további változásokat a későbbiekben ismertetjük.)

A fentiek közül előnyös zimogénvariánsok az alábbiak: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F3O5R t-PA; F3O5Q t-PA; Í304H t-PA; dl44,F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; dl-44,N184D, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R.V213R, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R, V213K, F305H t-PA; I210R, G211A, K212R,V213R, F305H t-PA; d92-179, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179,N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, F305N t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; valamint N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA;

A zimogének első osztályának különösen előnyös variánsai a következők: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305Q t-PA; Í304H t-PA; dl-44, F305HtPA; d92-179, F305H t-PA; míg a legelőnyösebb az F305H t-PA.

A zimogének egy másik előnyös osztályát, vagyis a variánsoknak egy másik osztályát, amely alternatív módon vagy többletként fibrin- (vagy plazmavérrög-) specifikus lehet, azok a variánsok képezik, amelyek a proteázdomén kis területeiben bírnak egy vagy több változással; ezeket az jellemzi, hogy töltéssel rendelkező aminosav-oldalláncok szerepelnek a változatokban. A nevezett területek és/vagy az ezzel szomszédos területek lehetnek felelősök a t-PA-nak más olyan anyagokkal történő kölcsönhatásáért, amelyek hatással lehetnek a t-PA különféle aktivitásaira.

Azok a területek, amelyeket az ezzel az eljárással végzett aktivitásvizsgálat számára azonosítottunk, a megfelelő eredeti típusú t-PA alábbi gyökeinek helyein vannak: 267, 283-287, 296-299, 303-304, 322, 326327, 331-332, 339-342, 347-351, 353-356, 360-362, 364-366, 369-371, 378-383, 387-392, 400-405, 408, 410, 416-418, 426-430, 432-434,440, 445-449,449453, 460-462, 471-472, 477,487-489, 505-506, 513, 519-523, valamint 523-526.

Ezen területek közül egyet vagy többet, vagy ezen területek alegységeiből egyet vagy többet megváltoztatunk annak érdekében, hogy megállapítsuk, vajon a kívánt biológiai tulajdonságot vagy tulajdonságokat megkapjuk-e. A töltéssel rendelkező gyökök (Arg, Asp, His, Lys és Glu) alaninletapogató (alanine-scanning) mutagenezis technika alkalmazásával megfelelően azonosíthatók [Cunningham and Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)]; ezek a töltéssel rendelkező aminosavak semleges vagy negatívan töltött aminosavakkal helyettesíthetők annak érdekében, hogy befolyásoljuk az aminosavak és a sejten belüli vagy sejten kívüli vizes környezet kölcsönhatását.

A zimogének és fibrinspecifikus molekulák ezen második előnyös osztályában található mutánsok például azok, amelyekben a megfelelő eredeti típusú t-PA alábbi helyein vannak helyettesítve aminosavak: 267,

HU 210 529 A9

283+287,296-299, 303-304, 331-332, 339+342,347349+351, 364-366,408,410,416-418,426-427+429430, 432-434, 440, 445+449, 449+453, 460+462 és/vagy 477. A felsorolásban a „+” jel azt jelenti, hogy helyettesítések csak a megjelölt helyen történnek, közöttük azonban nem, míg a „-” jel azt jelenti, hogy az összes megadott helyen történik helyettesítés.

Az alanin-scanning mutagenezis esetében előnyösebb, ha egy olyan aminosavat helyettesítünk be, amely semlegesíti az eredeti típusú t-PA megfelelő aminosavának töltését, mint ha olyant helyettesítünk be, amely ellenkező töltést ad a molekulának. Bármely hidrofób, lényegében töltéssel nem rendelkező vagy ellenkező töltésű aminosavat alkalmazhatunk, köztük például a következő előnyös aminosavakat: alanin, glicin, szerin, treonin, aszparagin, glutamin, valin, leucin, izoleucin, fenil-alanin vagy tirozin. Ezek közül a kisebb aminosavak, például az alanin, szerin és a treonin előnyösebbek, mint a nagyobb aminosavak, például a valin, leucin és az izoleucin. A töltéssel rendelkező aminosavak, például az aszparaginsav és a glutaminsav kevésbé előnyösek.

A helyettesítésre alkalmazott előnyösebb aminosavak az alanin, szerin, treonin, aszparagin, glutamin, fenil-alanin vagy a tirozin, és ezen belül még előnyösebbek az alanin, szerin és a treonin. Éne a célra azonban a legelőnyösebb aminosav az alanin, mivel ez eliminálja a béta-szénatom mögötti oldalláncot és így kevésbé valószínű, hogy megváltozik az eredeti típusú t-PA molekula főláncának konformációja. Ezenkívül alanin gyakran található mind védett, mind a szabadon álló helyeken [Creighton, T. E., The Proteins ( eds. W.

H. Freeman & Co., N. Y.); Chothia, C., (1976) J. Mól. Bioi., 750; 1].

A zimogének vagy fibrin- (illetve plazmavérrög-) specifikus variánsok ez utóbbi osztályának előnyös variánsai azok, amelyek a t-PA proteázdoménjén belül tartalmaznak módosításokat, az alábbi variánsok kivételével: D365A t-PA; R462L t-PA; A4735 t-PA; d296304 t-PA; d296-302 t-PA; d296-299 t-PA; R298E tPA; R299E t-PA; R304E t-PA; R304S t-PA; d296-299 t-PA; valamint K296E,R298E,R299E t-PA.

Pontosabban meghatározva az előnyös variánsok azok, amelyek egy vagy több helyettesítőt tartalmaznak a megfelelő eredeti típusú t-PA alábbi helyeinél: 267, 283, 287, 296, 297, 298, 299, 303, 304, 311, 332, 339, 342, 347, 348, 349, 351, 364, 365, 366, 408,410, 416, 417, 418, 426, 427, 429, 430, 432, 434, 440, 445, 449, 453, 460, 462 vagy 477, illetve az előbbiek kombinációi.

Még előnyösebbek azok a proteázdomén variánsok, amelyekben a megfelelő eredeti típusú t-PA alábbi helyein vannak helyettesítések: 267, 283+287, 296-299, 303-304, 331-332, 339+342, 347-349+351, 364-366, 408, 410, 416—418, 426-427+429-130; 432+434,440, 445+449,449+453,460+462 és 477. A felsorolásban a „+” jel azt jelenti, hogy helyettesítések csak a megjelölt helyen történnek, és köztük nem, míg a jel azt jelenti, hogy az összes megadott helyen és közöttük is történik helyettesítés.

A zimogének vagy fibrin- (illetve plazmavérrög-) specifikus variánsok ez utóbbi osztályának még ennél is előnyösebb proteádomén variánsai az alábbiak: R267A t-PA; D283A, H287A t-PA; R339A, R342A t-PA; E347A, E348A, E349A, K351A t-PA; D364A, D365A, D366A t-PA; E408A t-PA; E410A t-PA; K416A, H417A, E418A t-PA; E426A, R427A, K429A, E430A t-PP.; H432A, R434A t-PA; R440A t-PA; H445A, R449A t-PA; R449A, D453A t-PA; D460A, R462A t-PA; valamint D477A t-PA.

Ezek közül a legelőnyösebb helyettesítés az, amikor az eredeti típusú t-PA 269-299. helyein meglévő gyökök mindegyike helyébe alaningyököt helyettesítünk, azaz a K296A, H297A, R298A, R299A t-PA.

A zimogén vagy fibrinspecifikus aktivitással rendelkező előnyös inzertálásos (beiktatásos) variánsok azok, amelyekben egy vagy több aminosav van beiktatva a 296., 297., 298 és/vagy a 299. hely után. Erre a célra előnyösek azok a proteázdomén variánsok is, amelyekbe tirozin, aszparagin, lizin, arginin vagy glutamin van inzertálva.

A natív t-PA molekula proteázdoménjén (246-527. aminosavak) belüli egy vagy több aminosav-változással (kiiktatással, helyettesítéssel vagy beiktatással, de előnyösen helyettesítéssel) rendelkező egyéb variánsok úgy azonosíthatók, hogy ezek az alább bemutatott egy vagy több vizsgálatban az eredeti típusú t-PA-hoz viszonyítva zimogén tulajdonságokat mutatnak.

Az itt bemutatott t-PA variánsok - azonkívül, hogy egy vagy több proteázdomén helyen úgy térnek el a natív szekvenciától, amelynek eredményeként zimogén és/vagy fibrin- (illetve plazmavérrög-) specifikus tulajdonságokat mutatnak - adott esetben a natív szekvencia más területeiben is tartalmazhatnak a gyökökben helyettesítéseket, kiiktatásokat vagy beiktatásokat, annak érdekében, hogy a molekula bizonyos tulajdonságai javuljanak, feltéve, hogy a változások nem gátolják a t-PA egyláncú formájának kétláncú formájúvá történő átalakulását, vagy nem idéznek elő változást azokban az előnyös biológiai tulajdonságokban, amelyeket a proteázdomén jelen találmány szerinti változtatásával alakítottunk ki. Az ezekben az egyéb tartományokban előforduló előnyös változásokat a legelőnyösebb első típusú zimogén variánsok korábban ismertetett felsorolásában adjuk meg.

Ilyen variánsok például azok, amelyek elhagyják az ujjtartomány, a növekedési faktor tartomány és/vagy az

1. horog tartomány legalább egy részét, és/vagy megszüntetik a glikozilezési lehetőséget a 184. aminosavat körülvevő glikozilezési helyen, továbbá megfelelő aminosav-módosításokat tartalmaznak az 1. és a 2. horog feltételezett lizinkötő helyében.

Ezenkívül a t-PA fibrinkötését módosítani, legelőnyösebben helyreállítani vagy fokozni lehet pozitív vagy negatív töltésű aminosavak megfelelő helyettesítésével a t-PA 2. horog tartománya feltételezett ligandkötó „zsebének” ellenkező szélein. Ezeket a variánsokat általában helyre irányuló mutagenezissel vagy kimetszési/ligálási technikákkal állítjuk elő; az említett módszerekről a későbbiekben még részletesebb ismertetést adunk.

HU 210 529 A9

Az ilyen variánsokra speciális példa lehet egy olyan molekula, amelyből az 1-44. aminosavak hiányoznak (dl-44 névvel), valamint egy olyan molekula, amely a 184. helyen aszparaginsavat tartalmaz (N184D néven). Az 1—44. aminosavat nélkülöző variánsokokról részletesebben ír a korábban már idézett WO 89/00 197 közzétételi számú PCT szabadalmi bejelentés.

Valamennyi fenti variáns adott esetben módosítható a molekula különböző más területein, ha az ilyen módosítások rendelkeznek az itt megkövetelt zimogén és/vagy fibrin- (illetve plazmavérrög-) specifikus tulajdonságokkal. Ilyen módosítások lehetnek például a következők:

1) 1. horog módosítások, például a körülbelül 92-179. terület kiiktatása; és/vagy

2) 2. horog módosítások, például a körülbelül 174261. helyek kiiktatása, vagy módosítás a körülbelül

205-215. aminosavak, előnyösen a 210-213. aminosavak területében; és/vagy

3) módosítások a körülbelül 244-255. aminosavaknál, elősorban a 252. aminosavnál vagy ennek helyén; és/vagy

4) módosítások a körülbelül 233-242. aminosavaknál, elsősorban a 236-238. aminosavaknál; és/vagy

5) módosítások az ismert glikozilezési helyeken, például a 184. aminosavnál; és/vagy

6) módosítások a glikozilezésben a növekedési faktor tartományon belül.

Ez utóbbi módosításnál röviden ismertetve arról van szó, hogy a t-PA molekula a növekedési faktor tartományon belül, előnyösen a 67-69. helyeknél Nvagy O-glikozilezve van, ahol a 67. helyen lévő tirozin aszparagingyökkel van helyettesítve annak érdekében, hogy a t-PA molekula felezési ideje megváltozzék.

Ezen módosítások többsége a natív t-PA molekulához viszonyítva szignifikánsan megváltoztatja a kiürülési sebességeket és a fibrinkötést. A gyakorló szakember a megfelelő vizsgálati módszerek segítségével képes meghatározni az egyes variánsok azon optimális jellemzőit, amelyek biztosítani tudják egy adott esetben az elvárt tulajdonságokat.

A fenti szekvenciavariációk megvalósítása érdekében a natív molekulában lévő megfelelő aminosav(ak) cseréjére vagy inzertálására vonatkozó változtatásokat bármely a szakterületen ismert módszer segítségével elvégezhetjük, így például helyre irányuló mutagenezissel vagy a megfelelő szekvenciának a szóban forgó proteint kódoló DNS-be történő ligálásával (lásd később).

2. Helyspecifikus mutagenezis

A t-PA variánsok előállítását az itt leírtakkal összhangban egy olyan DNS helyspecifikus mutagenzisével végezzük el, amely a protein egy korábban előállított variánsát vagy a protein nem módosított formáját kódolja. A helyspecifikus mutagenezis olyan módon teszi lehetővé a t-PA variánsok előállítását, hogy egy speciális oligonukleotidszekvenciát alkalmazunk, amely egyrészt a kívánt mutáció DNS-szekvenciáját kódolja, másrészt megfelelő számú olyan, szomszédos nukleotidot tartalmaz, amelyek megfelelő méretű és szekvenciakomplexicitású primer szekvenciát képeznek, annak érdekében, hogy stabil duplex képződjék az átfedő kapcsolódás mindkét oldalán. Jellegzetesen mintegy 20-25 nukleotid hosszúságú primer előnyös, a megváltoztatandó szekvencia kapcsolódásának mindkét oldalán körülbelül 5-10 gyökkel. A helyspecifikus mutagenezis technikája általánosan ismert a szakterületen; ezzel kapcsolatban példákkal illusztrált megoldások találhatók egyebek mellett a következő közleményben: Adelman et al., DNA, 2: 183 (1983).

Amint az jól ismert, a helyspecifikus mutagenezis jellegzetesen olyan fág vektort alkalmaz, amely egyszálú és kétszálú formában is létezik. A helyre irányuló mutagenezisben használatos vektorok között találjuk például az M13 fágot, amelyet mások mellett Messing és munkatársai jellemeztek [Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA, Editor

A. Walton, Elsevier, Amsterdam (1981)]. Ezek a fágok kereskedelmi forgalomból könnyen beszerezhetők és alkalmazásuk a szakember számára jól ismert. Alternatív módon az egyszálú DNS előállításához replikációs eredetű egyszálú fágot [Veira et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987)] tartalmazó plazmidvektorokat is alkalmazhatunk.

A helyspecifikus mutagenezist a jelen találmány céljaira általában úgy végezzük, hogy először olyan egyszálú vektort kapunk, amely szekvenciáján belül magában foglalja a szóban forgó t-PA-t kódoló DNSszekvenciát. Elkészítünk egy, a kívánt mutált szekvenciát hordozó oligonukleotid prímért, mégpedig általában szintetikus úton, például Crea és munkatársai eljárásával [Crea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 75: 5765 (1978)]. Ezt a prímért összeforrasztjuk az egyszálú, t-PA szekvenciát tartalmazó vektorral, és DNS polimerizáló enzimek, például E. coli polimeráz I Klenowfragmentum hatásának tesszük ki annak érdekében, hogy a mutációt hordozó szál szintézisét teljessé tegyük. így olyan heteroduplex képződik, ahol az egyik szál az eredeti, nem mutált szekvenciát kódolja, és a második szál hordozza a kívánt mutációt. Ezt a heteroduplex vektort azután megfelelő sejtek, például JM101 sejtek transzformálására használjuk, és olyan kiónokat választunk ki, amelyek a mutált szekvenciaelrendezést hordozó rekombináns vektorokat foglalják magukban. A kiválasztást hibridizálás segítségével végezzük olyan radioaktív vizsgálómintát alkalmazva, amely ³²P-vel jelzett mutagenezis prímért tartalmaz.

Miután egy ilyen kiónt kiválasztottunk, a mutált t-PA területet eltávolíthatjuk és a t-PA termelés céljára egy megfelelő vektorba, általában olyan típusú expresszáló vektorba vihetjük át, amelyet egy megfelelő eukariőta gazdaszervezet transzformálásához általánosan szoktunk alkalmazni. A jelen találmánnyal kapcsolatban a kínai hörcsög petefészek (CHO) sejtek vagy a 293 sejtek [emberi vesesejtek, amelyeket a következő szakirodalmi helyen ismertetettek: Graham et al., J. Gén. Virol., F36: 59 (1977)] előnyösek hosszú távon stabil t-PA termelő sejtek előállításához. A találmány nem korlátozódik csupán a CHO-val végzett termelésre, mivel ismeretes, hogy számos más típusú sejt is megfelelően alkalmazható, külö9

HU 210 529 A9 nősen ott, ahol csak az enzimvizsgálati célú termelésre van szükség. így például - amint azt későbbiekben részletezzük - a 293 sejteket alkalmazó átmeneti rendszer is kényelmes megoldást jelent a t-PA variánsok analitikai célú termeléséhez.

3. Hasítási/ligálási technika

A másik, a t-PA-t kódoló DNS-szekvenciában előforduló mutációk kialakítására alkalmas eljárás magában foglalja a t-PA-t kódoló DNS-nek a megfelelő pozíciónál restrikciós enzimekkel végzett emésztés útján történő hasítását, a megfelelően hasított DNS kinyerését, a kívánt aminosavat kódoló oligonukleotid és a szegélyező régiók; például letört végű polilinkerek szintézisét (vagy a polilinkerek alkalmazása helyett a szintetikus oligonukleotidnak a t-PA-t kódoló DNS hasításához is alkalmazott restrikciós enzimekkel végzett emésztését, miáltal kohezív (kötődésre képes) végződések alakulnak ki), továbbá a szintetikus DNS-nek a t-PA-t kódoló strukturális gén megmaradt részébe történő ligálását.

4. Gazdasejttenyészetek és vektorok

Bár a kínai hörcsög petefészekben (CHO) történő expresszálás végülis előnyös a t-PA termelésére, az itt leírt vektorok és eljárások felhasználhatók más eukarióta organizmusok mint gazdasejtek széles körében is.

Általában a DNS-szekvenciák kezdeti klónozásánál és a jelen találmány szerinti vektorok megalkotásánál természetesen a prokarióták az előnyösek. Különösen jól használhatók az E. coli K12 294 (ATCC 31 446) és az E. coli W3110 (ATCC 27 325) törzsek. A további alkalmas mikrobiológiai törzsek között találjuk az E. coli B és az E. coli X1776 (ATCC 31 537) törzseket. Ezek a példák természetesen csak illusztrációként szolgálnak, és nem korlátozó jellegűek.

Az expresszálás számára prokarióták is alkalmasak lehetnek. Ilyenek például az előbb említett törzsek, valamint bacillusok, például a Bacillus subtilis, enterobaktériumok, például a Salmonella typhimurium vagy a Serratia marcesans, továbbá különböző Pseudomonas fajok törzsei; ezek mind alkalmas gazdaszervezetek az expresszáláshoz.

Ezekkel a gazdasejtekkel kapcsolatban általában a gazdasejttel kompatibilis speciesből származó, replikon- és kontrollszekvenciát tartalmazó plazmidvektorokat alkalmazunk. A vektor normálisan hordoz egy replikációs helyet, valamint olyan markerszekvenciákat, amelyek a transzformált sejtekben képesek elősegíteni a fenotípusos szelekciót. így például az E. coli-t jellegzetesen pBR322 alkalmazásával transzformáljuk; a ŐBR322 egy E. coli törzsből származó plazmid [Bolivár et al., Gene, 2: 95 (1977)]. A pBR322 ampicillinés tetraciklin-rezisztencia gént tartalmaz, és így alkalmas a transzformált sejtek azonosítására. A pBR322 plazmidnak vagy más, mikrobiológiai eredetű plazmidoknak vagy fágoknak tartalmazniuk kell még (vagy úgy kell módosítani ezeket, hogy tartalmazzanak) promotorokat is, amelyeket a mikrobiológiai szervezet saját proteinjeinek expresszálására alkalmazhat.

A rekombináns DITS technikákban legáltalánosabban használt promotorok között találjuk β-laktamáz (penicillináz) és laktóz promotor rendszereket [Chang et al., Natúré, 375: 615 (1978); Itakura et al., Science, 198: 1056 (1977); Goeddel et al., Natúré, 281: 544 (1979)], valamint a triptofán (trp) promotor rendszert [Goeddel et al., Nucl. Acids Rés., 8: 4057 (1980); 36,776 számú európai szabadalmi bejelentés], továbbá az alkálikus foszfatáz rendszereket. Bár ezek a legyakrabban használt promotorok, más mikrobiológiai eredetű promotorokat is felismertek, illetve alkalmaztak, de ezek nukleotidszekvenciájával kapcsolatos részleteket is közöltek már; azok, akik a szakterületen jártasak, képesek ezeket működőképesen összekapcsolni plazmidvektorokkal [lásd például: Siebenlist et al., Cell, 20: 269 (1980)].

A prokariótákon kívül eukarióta mikroorganizmusok, például élesztők is alkalmazhatók. Az eukarióta mikroorganizmusok közül leggyakrabban a Saccharomyces ceretrisiae-t vagy közönséges sütő-élesztőgombát alkalmazzuk, bár kereskedelmi forrásokból nagyszámú más törzs is hozzáférhető. Például a Saccharomycesben történő expresszáláshoz általánosan alkalmazzák az YRp7 plazmidot [Stinchcomb et al., Natúré, 282: 39 (1979); Kingsman et al., Gene, 7: 141 (1979); Tschemperet al., Gene, 10: 157 (1980)]. Ez a plazmid már tartalmazza a trp Igent, amely szelekciós markerként szolgál olyan mutáns élesztőtörzsek számára, amelyekből hiányzik a triptofánban történő növekedés képessége; ilyen például az ATCC 44 076 és a PEP-4-1 törzs [Jones, Genetics, 85: 12 (1977)]. Atrpl károsodása - mint az élesztő gazdasejt genom jellemzője - azután hatásos körülményeket biztosít a transzformálás létrejöttének kimutatására a triptofán nélküli növekedés segítségével. Az élesztővektorokban megfelelő promóciós szekvenciák között találjuk a 3-foszfoglicerát kináz [Hitzemann et al., J. Bioi. Chem., 255: 2073 (1980)] vagy más glikolitikus enzimek (Hess et al., J. Ad. Enzyme Reg., 7: 149 (1968); Holland et al., Biochemistry, 17: 4900 (1978)], például az enoláz, glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz, hexokináz, piruvát-dekarboxiláz, foszfofruktokináz, glükóz-6-foszfát izomeráz, 3-foszfoglicerát mutáz, piruvát kináz, triózfoszfát izomeráz, foszfoglükóz izomeráz és a glükokináz promotorjait. A megfelelő expressziós plazmidok megalkotásában az ezekkel a génekkel társult terminációs szekvenciákat is ligálunk az expresszáló vektor 3’-oldali szekvenciájához, annak érdekében, hogy az mRNS poliadenilezése és a befejezés végbemehessen. A növekedési körülményekkel szabályozott átírás további előnyeivel rendelkező további promotorok az alábbi enzimek promotorjai: alkohol dehidrogenáz 2, izocitokróm C, savas foszfatáz, a nitrogén metabolizmusával kapcsolatos bontóenzimek, a fentebb említett glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz, valamint a maltóz és a galaktóz hasznosításáért felelős enzimek. Bármely élesztőkompatibilis promotort, replikációs eredetű és terminációs szekvenciát tartalmazó plazmidvektor alkalmazható.

A mikroorganizmusokon kívül többsejtű organiz10

HU 210 529 A9 musokból származó sejtek tenyészetei is alkalmazhatók gazdasejtekként. Elvileg bármely sejttenyészet működőképes, legyen akár gerinces, akár gerinctelen eredetű tenyészet. A gerinces eredetű sejtek azonban a legalkalmasabbak, és a gerinces sejtek tenyészetben való szaporítása (szövettenyésztés) az elmúlt években rutinszerű eljárássá vált [Tissue Culture, Academic Press, Kruse and Patterson, editors (1973)]. Az ilyen alkalmas gazdasejtvonalakra példák lehetnek a VERŐ és a HeLa sejtek, a CHO sejtvonalak, valamint a W138, BHK, COS-7, 293 és MDCK sejtvonalak. Az ilyen sejtek számára megfelelő expresszálóvektorok (ha szükséges) magukban foglalnak egy replikációs origót, egy az expresszálandó gén előtt elhelyezkedő promotort a szükséges riboszómakötőhelyekkel és transzkripció-terminátor szekvenciákkal együtt.

Az emlős sejtekben való alkalmazásnál az expresszáló vektorokban lévő szabályozó funkciókat gyakran víruseredetű anyagok szolgáltatják. így például általánosan alkalmazott promotorok polióma, adenovírus 2 vírusokból, de leggyakrabban az SV40 vírusból (Simian Virus 40) származnak. Az SV40 korai és késői promotorjai főleg azért alkalmasak, mivel mindkettő könnyen kinyerhető a vírusból fragmentumként, amely tartalmazza az SV40 vírus replikációs origót is [Fiers et al., Natúré, 273: 113 (1978)]. Kisebb és nagyobb SV40 fragmentumok egyaránt alkalmazhatók, feltéve, hogy magukban foglalják azt a 205 bP-s szekvenciát, amely a Hindin helytől teljed a,vírus replikációs origójában elhelyezkedő BglI helyig. Ezenkívül lehetséges - és gyakran kívánatos is - olyan promotor vagy kontroll szekvenciákat alkalmazni, amelyek normálisan társulni szoktak a kívánt génszekvenciával, biztosítva azt, hogy ezek a kontroll szekvenciák kompatibilisek legyenek a gazdasejtrendszerekkel.

Replikációs origóként jellegzetesen egy olyan replikációs origó szolgálhat, amelyet egy exogén origót magában foglaló vektor megalkotásánál alkalmazunk; ez származhat SV40-ből vagy más vírus (például polióma-, adeno-, VSV- vagy BPV-vírus) forrásból, vagy származhat a gazdasejt kromoszómális replikációs mechanizmusából. Ha a vektor a gazdasejt kromoszómájába van integrálva, ez utóbbi gyakran elegendő.

Sejttenyészetekkel kielégítő mennyiségű humán tPA termelhető, ugyanakkor az eljárás finomítása - egy másodlagos kódoló szekvenciát alkalmazva - még nagyobb termelési mennyiségek elérését teszi lehetővé. A másodlagos kódoló szekvencia dihidrofolát reduktázt (DHFR) tartalmaz, amelyre külsődleges szabályozó paraméterekkel, például metotrexáttal (MTX) lehet hatni, így az MTX koncentráció szabályozásával lehetővé válik az expresszió kontrollja.

A t-PA variánst és a DHFR proteint egyaránt kódoló DITS-szekvenciákat tartalmazó találmány szerinti vektorokkal végzett transzfektálás számára előnyös gazdaszervezet kiválasztásában célszerű figyelembe venni az alkalmazott DHFR protein típusát. Ha eredeti típusú DHFR-t alkalmaznak, előnyös olyan gazdasejtet választanunk, amely DHFR-ben hiányos, így lehetővé válik a DHFR kódoló szekvencia alkalmazása a sikeres transzfektálás markereként olyan szelektív tápközegben, amely nem tartalmaz hipoxantint, glicint és timidint. Ebben az esetben például megfelelő gazdasejt egy DHFR aktivitás nélküli CHO sejtvonal, amelyet úgy állíthatunk elő és úgy szaporíthatunk, ahogyan azt a következő szakirodalmi helyen korábban leírták: Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 77:4216 (1980).

Másrészt viszont ha az MTX-hez kis kötési aktivitású DHFR proteint alkalmazunk szabályozó szekvenciaként, nem szükséges DHFR-hiányos sejteket alkalmazni. Mivel a mutáns DHFR rezisztens MTX-re, MTX-tartalmú tápközeget alkalmazhatunk a szelekció eszközeként, feltéve, hogy a gazdasejtek maguk MTXérzékenyek. Úgy tűnik, hogy a legtöbb eukarióta sejt, amely képes MTX-et abszorbeálni, érzékeny MTX-re. Az alkalmas sejtvonalak egyike a CHO-K1 (ATCC CCL61) nevű CHO-vonal.

5. Az alkalmazható jellegzetes klónozási és expresszálási módszerek

Ha gazdasejtekként emlős sejteket alkalmazunk, a transzfekciót általában a kalcium-foszfátos precipitálási módszerrel [Graham and Van dér Eb, Virology, 52: 546 (1978)] végezzük. A DNS-nek a sejtekbe való bevezetésére azonban más alkalmas eljárások - például a sejtmagba történő injektálás, elektroporáció vagy protoplasztfúzió - is megfelelően felhasználhatók.

Ha gazdaszervezetként élesztőt alkalmazunk, a transzfekciót általában polietilénglikol felhasználásával hajtjuk végre, amint azt Hinnen ismertette [Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 75: 1929-1933 (1978)].

Ha prokarióta sejteket vagy jelentős sejtfalkonstrukciókat tartalmazó sejteket alkalmazunk, a transzfekció előnyös módszere a kalciumos kezelés, olyan módon alkalmazva a kalciumot, ahogyan ezt a következő szakirodalmi helyen ismertették: Cohen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 69: 210 (1972); valamint az utóbbi időben egyre gyakrabban az elektroporáció.

A kívánt kódoló és kontrollszekvenciákat tartalmazó megfelelő vektorok összeállításához standard ligálási technikákat alkalmazunk. Az izolált plazmidokat vagy DNS fragmentumokat hasítjuk, a végeket illesztjük és újból ligáljuk olyan formában, amilyen a kívánt plazmid kialakulásához szükséges.

A hasítást úgy végezzük, hogy a megfelelő pufferben alkalmazzuk a restrikciós enzim(ek)et. Általában körülbelül 1 gg plazmidot vagy DNS fragmentumot alkalmazunk körülbelül 1 egység enzimmel együtt 20 μΐ pufferoldatban. (A megfelelő puffereket és szubsztrátmennyiségeket az adott restrikciós enzimhez az enzim gyártója minden esetben megadja.) Az inkubációs idő mintegy 1 óra, és az inkubációs hőmérséklet 37 °C. Inkubálás után a proteint fenollal és kloroformmal végzett extrahálással eltávolítjuk, majd pedig a nukleinsavat a vizes frakcióból etanolos kicsapással nyerjük ki.

Ha tompa végek szükségesek, a preparátumot 15 percen keresztül 15 °C hőmérsékleten 10 egység DNS polimeráz I Klenow fragmentummal („Klenow”) kezelhetjük, majd ezt követően fenollal és kloroformmal extrahálunk és etanolos kicsapást végzünk.

HU 210 529 A9

A hasított fragmentumok méret szerinti elkülönítését 6%-os poliakrilamid gélen, a következő szakirodalmi helyen ismertetetteknek megfelelően végezzük: Goeddel et al., Nucleic Acids Rés., 8: 4057 (1980).

A ligálásnál a kívánt komponensek - amelyek végei a korrekt illeszkedés elérése céljából egyenesre vannak kialakítva - mintegy ekvimoláris mennyiségeit 10 egység T4 DNS ligázzal (0,5 g DlVS-re számítva) kezeljük. (Amikor komponensekként hasított vektorokat használunk, hasznos lehet a hasított vektor újraligálásának megakadályozása érdekében egy bakteriális alkálikus foszfatázzal végzett előkezelés alkalmazása).

Amint fentebb tárgyaltuk, a t-PA variánsokat előnyösen specifikus mutációk segítségével állítjuk elő. A jelen találmány gyakorlatában alkalmazott variánsokat a legkönnyebben olyan specifikus oligonukleotid szekvenciák alkalmazásának segítségével képezzük, amelyek a kívánt mutáció DNS-szekvenciáját kódolják, továbbá tartalmaznak még megfelelő számú szomszédos nukleotidot is, amelyek együtt megfelelő méretű és szekvencia-komplexitású szekvenciát képeznek annak érdekében, hogy az átfedő mutáció mindkét oldalán stabil duplex képződjék.

A megalkotott plazmidokban lévő korrekt szekvenciák igazolására végzett elemzéshez a ligálási keveréket jellegzetesen E. coli K12 294 törzs (ATCC 31 446) vagy más alkalmas E. coli törzs transzformálásához használjuk, és a sikeres transzformánsokat az alkalmazott törzstől függően ampicillin- vagy tetraciklin-rezisztencia alapján szelektáljuk. A transzformánsokból plazmidokat állítunk elő, amelyeket restrikciós térképezéssel és/vagy DNS-szekvenciaelemzéssel analizálunk Messing et al. szerint [Nucleic Acids Rés., 9: 309 (1981)) vagy Maxam et al. szerint [Methods in Enzymology, 65: 499 (1980)].

Miután a DNS-t az emlős gazdasejtbe bevezettük és a stabil transzformánsokat megfelelő tápközegen kiválasztottuk, elvégezzük a DHFR proteint kódoló szekvenciák sokszorozását kb 20 000-500 000 pmol/liter MTX koncentráció jelenlétében; az MTX a DHFR aktivitás kompetitív inhibitora. A koncentráció hatékony tartománya természetesen nagymértékben függ a DHFR gén és protein természetétől, valamint a gazdaszervezet jellemzőitől. Általánosságban tehát nem szabhatók meg szigorúan meghatározott alsó és felső intervallumhatárok. Más fólsav analógokat vagy további, DHFR-t gátló vegyületeket is alkalmazhatunk megfelelő koncentrációban. Azonban az MTX önmagában is kényelmes, könnyen hozzáférhető és hatékony.

Abból a célból, hogy a példákat egyszerűsítsük, néhány gyakrabban előforduló eljárásra rövid címszavakkal utalunk.

A „plazmid”-okat egy kis „p” betűvel kezdjük, amelyet betűs és numerikus jelölés követ. A kiindulási plazmidok kereskedelmi forgalomban lévő plazmidok, és minden nehézség nélkül hozzáférhetők, vagy a kereskedelmi forgalomban lévő plazmidokból állíthatók elő publikált eljárások segítségével. Ezenkívül más ekvivalens plazmidok is ismeretesek a szakterületen, illetve a szakember számára.

Valamely DNS „emésztés”-e a DNS olyan enzimmel végzett katalitikus hasítására utal, amely a DNSben csak bizonyos meghatározott helyeknél fejti ki hatását. Az ilyen enzimeket restrikciós enzimeknek nevezzük, és azokat a helyeket, amelyekre ezek fajlagosak, restrikciós helyeknek hívjuk. Az itt használt különböző restrikciós enzimek kereskedelmi forgalomban kaphatók, és az ezzel kapcsolatos reakciókörülményeket, ko-faktorokat és egyéb követelményeket annak megfelelően alkalmazzuk, ahogyan azt a szállító cég előzetesen meghatározta. A restrikciós enzimeket általában olyan rövidítésekkel jelölik, amely egy nagybetűből áll, majd ezt további betűk követik; ezek a betűk azt a mikroorganizmust képviselik, amelyből az adott restrikciós enzimet eredetileg kinyerték. A betűk után az adott enzimet jelölő szám következik. Általában mintegy 1 pg plazmidot vagy DNS fragmentumot alkalmazunk mintegy 2 egység enzimmel együtt mintegy 20 1 pufferoldatban. Az adott enzimekhez megfelelő puffereket és szubsztrátmennyiségeket az enzim gyártója minden esetben megadja. Inkubációs időként körülbelül 1 órát és inkubációs hőmérsékletként általában 37 ’C hőmérsékletet alkalmazunk, de ez a gyártó útmutatásai szerint változhat. Az inkubálás után a proteint fenollal és kloroformmal végzett extrahálással eltávolítjuk és az emésztett nukleinsavat a vizes frakcióból etanollal kicsapjuk. Egy restrikciós enzimmel végzett emésztés után néhány esetben elvégezhető a terminális 5'-foszfátok bakteriális alkálikus foszfatázzal történő hidrolízise, annak érdekében, hogy megakadályozzuk a DNS fragmentum két restrikciós hasított végének „körberendeződésű-ét vagy olyan zárt hurok képződését, amely meggátolj más DNS fragmentum beépülését a restrikciós helynél. Hacsak másképp nem jelezzük, a plazmidok emésztését a jelen leírásban nem követi az 5'-terminális defoszforilezés. A defoszforilezéshez szolgáló eljárások és reagensek a hagyományosan alkalmazottak [T. Maniatis et al., Molecular Cloning, 133-134(1982)].

A DNS egy adott fragmentumának a restrikciós emésztésből történő „kinyerése” vagy „izolálása” azt jelenti, hogy az emésztett anyagot poliakrilamid- vagy agarózgélen elektroforetikusan szétválasztjuk, az érintett fragmentumot ismert molekulatömegö marker DNS fragmnetumok mobilitásával összehasonlítva azonosítjuk, a kívánt fragmentumot tartalmazó géltartományt eltávolítjuk és a gélből kinyerjük a DNS-t. Ez az eljárás a szakterületen általánosan ismert. Lásd például: R. Lawn et al., Nucleic Acids Rés., 9:6103-6114 (1981); valamint D. Goeddel et a., Nucleic Acids Rés., 8: 4057 (1980).

A „Southem-analízis” olyan eljárás, amellyel egy emésztményben vagy DNS-t tartalmazó kompozícióban igazolható a DNS-szekvenciák jelenléte; az eljáráshoz ismert, jelzett oligonukleotidekkel vagy DNS fragmentumokkal végzett hibridizációt alkalmazunk. A jelen leírás céljaira - hacsak másképp nem jelezzük - a Southem-analízis a következő lépéseket jelenti: az emésztmény szétválasztása 1%-os agarózon, denaturálás és átvitel nitro-cellulózra Southern eljárása szerint

HU 210 529 A9 [E. Southern, J. Mól. Bioi., 98: 503-517 (1975)], majd hibridizálás Maniatis módszerével (T. Maniatis et a., Cell, 75:687-701 (1978)].

A „transzformálás” DNS bevezetését jelenti valamely organizmusba úgy, hogy a DNS kromoszómán kívüli elemként vagy a kromoszóma integráns részeként replikálható legyen. Hacsak másképpen nem jelezzük, az E. coli transzformálására itt felhasznált eljárás a Mandel-féle, CaCl₂-ot alkalmazó módszer [Mandel et al., J. Mól. Bioi., 53: 154 (1970)].

A „ligálás” olyan eljárásra vonatkozik, amely foszfodiészter-kötések képződéséhez vezet két kettős szálú nukleinsav-fragmentum között [T. Maniatis, fentebb idézett munka, 146. oldal). Hacsak másképp nem jelezzük, a ligálást ismert pufferek és körülmények alkalmazásával hajtjuk végre 10 egység T4 DNS ligázzal („ligáz”) 0,5 g, körülbelül ekvimoláris mennyiségű ligálandó DNS fragmentumra számítva.

A DNS-nek a transzformánsokból végzett „előállítása” a plazmid DNS mikrobiológiai tenyészetből történő izolálását jelenti. Hacsak másképp nem jelezzük, a Maniatis-féle alkálikus SDS eljárást (korábban idézett munka, 90. oldal) alkalmazzuk.

Az „oligonukleotidok” rövid, egy- vagy kétszálas poli(dezoxi-nukleotidok), amelyeket ismert eljárásokkal kémiai úton szintetizálunk, majd poliakrilamid gélen tisztítunk.

C. Gyógyászati kompozíciók

A jelen találmány szerinti vegyületeket a gyógyászatilag alkalmazandó kompozíciók előállítására szolgáló ismert eljárásokkal formálhatjuk, amelyek szerint a t-PA terméket összekeveréssel kombináljuk valamely gyógyászatilag elfogadható hordozó segédanyaggal. Alkalmas hordozó segédanyagokat - köztük más humán proteineket, például humán szérum albumint is -, és az ezekkel végzett formálást úja le például a következő szakirodalmi forrás: Remington’s Pharmaceutical Sciences [16th ed., 1980, Mack Publishing Co., edited by Oslo et al.]. Az ilyen kompozíciók jellegzetesen az adott variáns hatékony mennyiségét, például körülbelül 0,5 mg/ml és körülbelül 5 mg/ml közötti mennyiségét, továbbá valamely hordozó segédanyag olyan, megfelelő mennyiségét tartalmazzák, amely lehetővé teszi, hogy olyan gyógyászatilag elfogadható készítményt állítsunk elő, amely alkalmas a betegnek történő hatékony beadásra. Az adott t-PA variánst a szív-érrendszeri betegségekben szenvedő vagy ilyen állapotban lévő egyéneknek beadhatjuk például parenterálisan más olyan eljárások segítségével is, amelyek megfelelően biztosítják, hogy a gyógyszer hatékony formában kerüljön a véráramba.

A találmány gyakorlatában alkalmazott variáns tPA termékek klinikai beadása számára különösen jól alkalmazható készítmények magukban foglalják például a steril, vizes oldatokat vagy a steril, hidratálható porokat, amilyen például egy liofilezett protein. Általában kívánatos, hogy a készítmény megfelelő mennyiségben tartalmazzon egy gyógyászatilag elfogadható sót is, mégpedig olyan mennyiségben, ami a készítményt izotóniássá teszi. A készítmények jellegzetesen pH-regulátorokat, például argininbázist és foszforsavat is tartalmaznak olyan mennyiségben, ami lehetővé teszi a megfelelő pH, általában 5,5 és

7,5 közötti pH fenntartását. A vizes készítmények felezési idejének vagy stabilitásának javítása érdekében szükség lehet további szerek, például glicerin alkalmazására is. Ily módon a variáns t-PA készítmények alkalmasak parenterális és különösen intravénás úton történő beadásra.

Ajelen találmány szerinti gyógyászati kompozíciók adagjai és kívánatos hatóanyag-koncentrációi az adott felhasználási módszertől függően változhatnak. így például mélyvénás trombózis vagy perifériás érbetegségek kezelésében tipikusan a „bólusz” adagok előnyösek, körülbelül 0,05 mg/kg és körülbelül 0,2 mg/kg közötti tartományban és több egymás utáni beadásban, annak érdekében, hogy viszonylag állandó vérszint maradjon fenn, előnyösen körülbelül 3 Hg/ml körüli értéken; az első beadást követően a dózis általában a körülbelül 0,1 mg/kg és körülbelül 0,2 mg/kg közötti tartományban van.

Sürgős orvosi segítségnyújtással kapcsolatos esetekben azonban, ahol infúziós lehetőség általában nem áll rendelkezésre, valamint azokban az esetekben, ahol a szóban forgó betegség (embólia, infarktus) kritikus jellegű, valamivel nagyobb kezdeti dózisokra, például körülbelül 0,3 mg/kg mennyiségre van szükség.

A jelen találmány szerinti t-PA variánst megfelelően például parenterális úton adhatjuk be a szív- és érrendszeri betegségekben szenvedő vagy ilyen állapotra hajlamos egyéneknek. Az adagolás mennyisége és az adagolás sebessége azonos lehet azzal vagy magasabb lehet annál, mint amelyet más szív- és érrendszeri trombolitikus szereknél jelenleg klinikai kezeléskor alkalmazunk; például 1-2 mg/testtömeg kg intravénás vagy intraartériás adagok 1,5-12 óránként szívizominfarktusban, tüdőembóliában stb. szenvedő betegeknél. Nagyobb dózisok is tolerálhatók, mivel a jelen találmány szerinti variánsok kevesebb mellékhatást okoznak, mint az eredeti típusú t-PA, ugyanakkor gyorsabb és teljesebb vérröglízist eredményeznek.

A megfelelő dózisformára lehet példa a következő: egy 50 mg t-PA-t, valamint arginint, foszforsavat és poliszorbát 80-at tartalmazó ampulla, az ampulla tartalmát 50 ml injekciós minőségű steril vízzel injektálhatóvá tesszük, majd megfelelő térfogatú injekciós minőségű 0,9%-os nárium-klorid-oldattal összekeverjük.

A jelen találmány szerinti t-PA variánsok alkalmasak a fibrinlerakódás vagy -letapadás kialakulásának vagy újraalakulásának megakadályozására. Az ilyen jellegű alkalmazás egyik formáját írja le a 07/125 319 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentés (a bejelentés napja: 1987. 11. 25.). Az ilyen kezelés általában magában foglalja valamely kompozíció helyi beadását a fibrinlerakódáshoz, vagy a letapadás lehetséges helyére. A kompozíció a t-PA variáns gyógyászatilag hatékony mennyiségét fokozatosan oldódó formában tartalmazza, s így a készítmény folyamatosan bocsátja ki a helyszínen a hatóanyagot mint13

HU 210 529 A9 egy 3 nap és két hét közötti időtartamon át. Jellegzetesen a t-PA variánst olyan dózisban adjuk be, amely elegendő a fibrin lerakódásának vagy a letapadás kialakulásának megakadályozására sebészi műtét, fertőzés, baleset vagy gyulladás után. Ez a mennyiség jellegzetesen 0,02 mg/a gél és 25 mg/g gél között van, az előnyösebb tartomány pedig 0,20 mg/g gél és 2,5 mg/g gél közötti, míg a legelőnyösebb tartomány 0,25 mg/g gél és körülbelül 1,0 mg/g gél közötti értékű.

Az a közeg, amelyben a t-PA-t a letapadás kialakulásának megakadályozása jellegzetesen formáljuk, egy félszilárd, nyálkás, gyógyászatilag közömbös hordozó, amely elősegíti, hogy az enzim a lehetséges letapadást helynél helyezkedjék el. Az ilyen hordozók között találjuk a hosszú szénláncú szénhidrogéneket, vagy azokat a növényi olajokat és viaszokat, amelyek telített és telítetlen zsírsav-gliceridek keverékeiből vagy módosított telített vagy telítetlen zsírsav-gliceridek keverékeiből állnak. Az ilyenekre példák lehetnek az olyan félszilárd hordozók mint a vazelin, vagy a félszintetikus gliceridek, polihidroxi-oldószerek, például a glicerin, hosszú szénláncú szénhidrogének, biológiai úton lebomló polimerek vagy liposzómák.

A következő példák csak a jelen találmány gyakorlatában jelenleg legjobbnak tartott eljárásokat ismertetik, de ezek nem tekinthetők korlátozó jellegűnek.

/. példa

A. A t-PA variánsok rekombináns úton történő előállítására szolgáló expresszáló vektorok előállító- . sa és alkalmazása

1. A p7-lH plazmid felépítése a.) pCISt-PA plazmid

A pCISt-PA plazmid előállítását annak megfelelően végeztük, ahogyan az például a 07/071 506 számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi bejelentésben (abejelentés napja: 1987.07.09.) ismertetésre került.

Először összeállítjuk a citomegalovírus fokozót és promotort, a citomegalovírus összefonódási átadó (splice donor) helyet és intront, az lg változó terület összefonódási befogadó (splice acceptor) helyet, a tPÁ-t kódoló cDNS-t [Pennica et al., Natúré, 301: 214 (1983)] és a hepatitisz felületi antigén poliadenilezési és transzkripciós terminációs helyet tartalmazó pCIStPA vektort.

Megalkotjuk a citomegalovírus fokozót [Boshart et al., Cell, 41: 520 (1985)] és promotort [Thomsen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 81: 659 (1984)], a citomegalovírus összefonódási átadó (splice donor) helyet és egy intron egy részét [Stemberg et al., J. of Virol., 49: 190 (1984)], az lg változó terület intron és összefonódási befogadó (splice acceptor) helyet, a Vin. faktort kódoló cDNS-t és az SV40 poliadenilezó helyet tartalmazó pF8CIS vektort is. Az összeállítás három részét az alábbiakban részletezzük.

1) A végső vektor ampicillin rezisztencia markere és replikációs origója a pUC13pML kiindulási plazmidból származik; ez utóbbi a pML plazmid egy variánsa [Lusky et al., Natúré, 293: 79 (1981)]. A pUC13pML-t úgy alkotjuk meg, hogy a pUC13 polilinkerét [Veria et al., Gene, 19: 259 (1982)] átvisszük a pMLEcoRI és Hind III helyeibe. A pUC8CMV második kiindulási plazmid a CMV fokozó, promotor és összefonódási átadó szekvencia forrása. A pUC8CMV-t úgy alkotjuk meg, hogy az 1-732. nukleotidokat, amelyek a CMV fokozóhoz, promotorhoz és összefonódási átadó szekvenciákhoz tartoznak, beiktatjuk a pUC8 tompa PstI és Sphl helyeibe (Veira et al., lásd fentebb). Szintetikus BamHI-Hindin kapcsolókat (amelyek kereskedelmi forgalomban kaphatók a New England Biolabs-nél) ligálunk a kohezív BamHI véghez, így HindlII helyet alakítunk ki. Ezután a ligálás után HindlIIHincII emésztést hajtunk végre. Ez az emésztés olyan fragmentumot eredményez, amely mintegy 800 bp méretű, és tartalmazza a CMV fokozót, promotort és öszszefonódási átadó helyet. A gélen végzett izolálás után ezt a 800 bp-s fragmentumot a pUC13pML egy 2900 bp-s darabjához ligáljuk. A pF8CIS megalkotásához szükséges fragmentumot úgy kapjuk meg, hogy a fenti intermedier plazmidot Sall-gyel és Hindül-mal emésztjük. Ez a 3123 bp-s darab tartalmazza az ampicillin rezisztencia markért, a pCU13pML-ből származó replikációs origót és a CMV számára szolgáló kontroll szekvenciákat, beleértve a fokozó, promotor és összefonódási helyet.

2) Szintetikus oligomert alkalmazva megalkotjuk az lg változó terület intron és összefonódási befogadó szekvenciát. Egy 99-mert és egy 30-mert szintetizálunk kémiai úton, amelyek az alábbi szekvenciával búnak az IgG intron és összefonódási hely számára [Bothwell etal., Cell, 24: 625 (1981)].

5'-AGTAGCAAGCTTGACGTTGGCAGGCTTGA... 31 GATCTGGCCFTACACTTGAGTGACAATGA...

CATCCACTTTGCCTTTCTCTCCACAGGT...

8 GTCCACTCCCAG-3'

3'-CAGGTGAGGGTGCAGCTTGACGTCGTCGGA-5'

DNS polimeráz I-et (Klenow-fragmentumot) töltünk a szintetikus darabba és kettős szálú fragmentumot képezünk [Wartell et al., Gene, 9: 307 (1980)]. Ezt követi a Páti és Hindül kettős emésztése. Ezt a szintetikus kapcsolót pUC 13-ba (Veira et al., fentebb) klónozzuk a PstI és HindlII helyeknél. A szintetikus oligonukleotidot tartalmazó kiónt, amelyet pUCIg.lO-ként jelölünk, Pstl-gyel emésztjük. Ehhez a firagmentumhozegy Clal helyet adunk egy Pstl-Clal kapcsoló alkalmazásával. HindlII-mal történő emésztés után egy 118 bps darabot izolálunk gélen, amely tartalmazza az lg intron egy részét és az lg változó terület összefonódási akceptorát.

3) A konstrukciós munkamenet harmadik része helyettesíti a hepatitisz felületi antigén 3' véget az SV40 korai terület poliadenilező helyével és transzkripciós terminációs helyével. Egy vektort, az SV40 szekvenciát tartalmazó pUCSV40-et inzertáljuk a BamHI helynél pUCB-ba (Viera et al., fentebb idézett munka). Ezt a pUCSV40-et EcoRI és Hpal segítségével emésztjük.

HU 210 529 A9

Egy 143 bp-s fragmentumot izolálunk gélelektroforézissel ebből az emésztményből, amely csak az SV40 poliadenilező helyet tartalmazza. A pSV40-8ClD (160 457 számú európai szabadalmi bejelentés) emésztését követően két további fragmentumot izolálunk gélről. Az EcoRI és Clal segítségével végzett emésztéssel kialakított 4,8 kb-s fragmentum tartalmazza az SV40DHFR transzkripciós egységet, a pML replikációs origóját és az ampicillin rezisztencia markert. A Clal és Hpal segítségével végzett emésztéssel kialakított

7,5 kb-s fragmentum tartalmazza a Vili. faktor számára szolgáló c-DNS-t. Egy háromrészes ligálás alakítja ki a p SVE.8c24D-t. Ezt az intermedier plazmidot Clal és Sáli segítségével emésztjük, így kapunk meg egy olyan, 9611 bp-s fragmentumot, amely tartalmazza a Vin. faktor cDITS-ét SV40 poliadenilező és transzkripciós terminációs helyekkel, amelyeket az SV40 DHFR transzkripciós egység követ.

Ahhoz a háromrészes ligáláshoz, amely a pF8CIShez vezet, az alábbiakat alkalmazzuk: a) a 3123 bp-s Sáli Hind Hl fragmentumot, amely tartalmazza a replikációs origót, az ampicillin markert és a CMV fokozót, promotort és összefonódási átadót; b) a 118 bp-s HindlH-Clal fragmentumot, amely tartalmazza az lg intront és az összefonódási befogadót; és c) egy 9611 bp-s Clal-Sall fragmentumot, amely tartalmazza a VHI. faktor számára szolgáló cDNS-t, az SV40 poliadenilező helyet és az SV40 DHFR transzkripciós egységet.

Ezután a pCIHt-PA plazmid megalkotásának befejezéséhez a pCla t-PA intermedier plazmidból és a fenti pF8CIS plazmidból az alábbi átalakításokat végezzük el.

A t-PA cDNS-t először pML-be klónozzuk, annak érdekében, hogy Clal helyet alakítsunk ki a gén 5' végénél. Ahhoz, hogy ezt megtegyük, a pSVpaDHFR-ből (más néven pETPFR-ből) egy 3238 bp-s Hindin fragmentumot a pML HindHI helyébe inzertálunk (Lusky et al., fentebb). A telepeket átvizsgáljuk olyan kiónokra, amelyek a Clal helyhez képest juxtapozícióban lévő cDNS 5' véggel rendelkeznek. Az intermedier plazmidot pClat-PA-ként jelöljük. Egy t-PA cDNS-t, amelyet a 3' poliadenilező terület követ, izolálunk 2870 bp-s Clal-KpnI fragmentumként. ACIS vektornak ez a Clal-KpnI fragmentuma szolgáltatja az 5' kontroll területet, egy SV40-DHFR transzkripciós egységet, az ampicillin rezisztencia gént és a pML-ből származó origó területet (lásd a 2. ábrát).

A t-PA expresszáló szintjeit olyan módon kapjuk meg, hogy a pCIHt-PA-val - önmagában ismert és a fentebb már leírt eljárások segítségével - CHO vagy 293 sejteket transzferálunk. A transzfektált 293 sejtekkel kapott tápközeget átvizsgálva megállapítható, hogy a pCIH-t-PA 420 ng/ml t-PA-t termel.

Végül megalkotjuk a pCISt-PA vektort, amely tartalmazza a citomegalovfrus fokozót és promotort, a citomegalovírus összefonódási átadó helyet és intront, az lg változó terület összefonódási befogadó helyet, a t-PA-t kódoló c DNS-t és a pSV40 poliadenilező szekvenciát.

A kiindulási vektorok ehhez a konstrukcióhoz a pCIHt-PA és a pF8CIS (lásd fentebb). Ez utóbbi vektor azonos 5' szabályozókkal rendelkezik, mint a pCIHtPA, de magában foglalja a VIII. faktor számára szolgáló cDNS-t és az SV40 poliadenilező helyet is. A t-PA cDNS 3' hasításához SacH-t alkalmazunk. Az így létrejövő 3' túlnyúlást T4 polimerázzal tompa végűvé teszszük. A pCIHt-PA-t ezután Clal-gyel elhasítjuk. Ez a hely elválasztja a kiméra intront, a CMV intron szekvenciák és az lg változó terület intron között hasítva. A Clal kezelésből egy 2870 bp-s fragmentumot izolálunk gélről. A pF8CIS-ből izoláljuk az SZV40 poliadenilező helyet, a DHFR-t, a transzkripciós szabályozót, a bakteriális replikációs origót és az amprgént, valamint a CMV fokozót, promotort és összefonódási átadót. Ezeket az elemeket fragmentumokban izoláljuk mint 2525 bp-s Sal-BamHI fragmentumot és 3113 bp-s Hpal-Sal fragmentumot. A Kpn I(tompa)-Clal fragmentumnak a Hpal-Sal fragmentummal és sóval BamΗΙ-hoz történő háromrészes ligálása pCISt-PA-t eredményez, amelyet a pCIHtPA plazmid számára a fentiekben tárgyaltaknak megfelelően CHO és 293 sejtekben expresszálunk, s így az előbbi sorrendnek megfelelően 55 és 3000 ng/ml t-PA-t nyerünk. Lásd a 3. ábrát.

b) A p7-lH végső összeállítása

A pCISt-PA plazmidot Spel segítségével emésztjük, majd E. coli DNS polimeráz I nagy fragmentummal (Klenow) és dezoxi-ribonukleozid trifoszfátokkal kezeljük annak érdekében, hogy tompa végeket alakítsunk ki. Az így kapott lineáris fragmentumot - T4 DNS ligáz alkalmazásával - az fi egyszálú DNS fágból származó+szál origót tartalmazó, 0,45 kb-s Rsa I/Aha Hl fragmentumhoz Egáljuk [Zinder et al., Microbiol. Rév., 49: 101 (1985)]). Ligálási termékeket izolálunk, amelyekben megtalálható az inzertált fi origó mindkét lehetséges orientációban a pCISt-PA fragmentum Spal helyénél. Egy plazmidot, amely ezt az origót olyan orientációban tartalmazza, hogy a t-PA gén anti-sense szála virionokba legyen becsomagolva segítő (helper) fág jelenlétében, kiválasztunk és p7-lH-nak nevezzük el (lásd a 4. ábrát).

2. Az expresszáló plazmid mutagenezise a.) A templát előállítása

A p7-lH plazmidot E. coli JM101 (ATCC 33 876) törzsbe vezetjük be CaCl₂-közvetített transzformációval. Ezeket a sejteket azután az M12K07 segítő vírussal infektáljuk, és egyszálú p7-lH DNS-t állítunk elő, amint ezt a következő szakirodalmi helyen leírták: Veira et al., Meth. Enzymol., 153: 3 (1987). Röviden ismertetve: transzformált sejtek 2YT tápközegben lévő telített tenyészetének 0,3 ml-éhez hozzáadunk 1O⁹-1O¹⁰ pfu M13K07-et, és a keveréket 15 percen keresztül 37 °C hőmérsékleten inkubáljuk. 1,5 ml friss, 50 g/ml karbenicillint tartalmazó 2YT tápközeget adunk hozzá és a tenyészetet óvatosan rázatjuk 16 órán keresztül 37 °C hőmérsékleten. Miután a sejteket üledékbe vittük, a fágot és becsomagolt plazmid DNS-t kinyerjük, és egyszálú DNS-t állítunk elő olyan módon, ahogyan ezt Anderson leírta [Nucl. Acids Rés., 9:3015 (1981)].

HU 210 529 A9

b) Helyre irányuló in vitro mutagenezis

A p7-lH-n úgy hajtunk végre mutagenezist, hogy az 5'-CGGAGAGCGGCACCTGTGGGGGG-3' oligo(dezoxi-ribonukleotid)-ot alkalmazzuk lényegében olyan módon, amint azt a korábbiakban ismertették [Zoller et al., Meth. Enzymol., 700: 468 (1983)], azzal az eltéréssel, hogy a phe305-»his305 mutációval bíró mutánst tarfolt (plaque) hibridizálás helyett telephibridizálással azonosítjuk. A mutációkat közvetlenül az egyszálú plazmid DNS-en igazoljuk DNS-szekventálással, a didezoxinukleotid láncterminációs eljárást alkalmazva [Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.), 74: 5463 (1977)].

3. Expresszjálás és tisztítás a) A plazmid előállítása

Transzformált sejteket növesztünk telítésig 500 ml olyan LB tápközegen, amely 50 gg/ml karbenicillint is tartalmaz. A sejteket centrifugálással üledékbe visszük és újra szuszpendáljuk 40 ml olyan oldatban, amely 50 mM glükózt, 10 mM EDTA-t és 25 mM TrisHCl-t (pH 8,0) tartalmaz. Ehhez a szuszpenzióhoz hozzáadunk 60 ml, 1%-os nátrium-dodecilszulfátot és 0,7 M nátrium-hidroxid-oldatot, majd a keveréket 2 percen át inkubáljuk 25 °C hőmérsékleten, s ezt követően 10 percen keresztül 0 °C hőmérsékleten. Ehhez olyan oldatot adunk, amely 4 M ecetsavat és 3 M nátrium-acetátot tartalmaz, és a keveréket 30 percen át 0 °C hőmérsékleten inkubáljuk. Ezt azután 11 500 fordulat/percnél 20 percen át centrifugáljuk, a felülúszót összekeverjük 100%-os hideg etanol kétszeres térfogatnyi mennyiségével, és az így keletkezett csapadékot centrifugálással kinyeqük. Az üledéket, amely a plazmid DNS-t és RNS-t tartalmazza, megszárítjuk és újra oldjuk olyan oldatban, amely 100 mM Tris-t (pH 8,0), 10 mM EDTA-t és 1 gg/ml RN-áz A-t tartalmaz. Miután az így létrejött oldatot centrifugálással derítettük, etidium-bromidot adunk hozzá 0,5 mg/ml koncentráció eléréséig, majd azonos tömegű CaCl₂-ot adunk hozzá. A DNS-t azután Becnan VTI65 rotorban centrifugáljuk 16 órán át 55 000 fordulat/percnél 18 ’C hőmérsékleten. A DNS csíkot oldalról tűvel leszívjuk, majd az etidinium-bromid eltávolítására n-butanollal extraháljuk, vízzel hígítjuk és etanollal kicsapjuk. A DNS-t újra oldjuk 1 mg/ml végső koncentrációra olyan oldatban, amely 10 mM Tris-t (pH 8,0) és 1 mM EDTA-t tartalmaz.

b.) Transzfektálás és expresszálás

293 sejteket növesztünk, amíg konfluenssé válnak. 10 gg t-PA plazmid DNS mutánst összekeverünk 1 gg VA RNS gént [Thimmappaya et al., Cell, 37: 543 (1982)) kódoló DNS-sel, és feloldjuk 500 gl olyan oldatban, amely 1 mM TrisH Cl-t, 0,1 mM EDTA-t és 0,227 M CaCl₂-ot tartalmaz. Ehhez (Vortex berendezés használata közben, cseppenként) hozzáadunk 500 gl olyan oldatot, amely 50 mM HEPES-t (pH 7,35), 280 mM NaCl-ot és 1,5 mM NaPo4-ot tartalmaz, és a csapadékot 10 percen át 25 °C hőmérsékleten hagyjuk kialakulni. A szuszpendált csapadékot ezután hozzáadjuk a sejtekhez (100 mM oldat lemezenként) és 4 órán keresztül hagyjuk leülepedni az inkubátorban. A tápközeget ezután leszívjuk és 2 ml 20%-os glicerint [foszfáttal pufferolt fiziológiás nátrium-klorid-oldatban (PBS)] adunk hozzá 30 másodperc alatt. A sejteket azután kétszer mossuk 5 ml szérummentes tápközegben, majd friss tápközeget adunk hozzá és a sejteket 5 napon át inkubáljuk.

A t-PA variánst expresszáló stabil CHO sejtvonalak kialakítása érdekében a t-PA kódoló szekvenciák legnagyobb részét tartalmazó 1,4 kb-s BglII/Apal fragmentumot (a BglII hely átfogja a teljes hosszúságú t-PA-t kódoló DNS -1 és 1 kodonjai közötti területet, és az Apai hely átfogja a teljes hosszúságú- t-PA-t kódoló DNS 465. és 466. kodonjait) ligálhatjuk a pPADHFR-6 vektorból (amelyet a 93,619 számú európai szabadalmi bejelentés ismertet) származó 6,0 kb-s BglH/Apal fragmentumhoz. Az így létrejövő plazmidot azután CHO sejtekbe vezetjük be és a t-PA variánsok túlexpresszálására indukáljuk olyan módon, hogy a kódoló szekvenciát metotrexátot tartalmazó tápközegekben végzett szelekció segítségével sokszorozzuk.

c.) Tisztítás

A t-PA termék tisztítását úgy végezzük, hogy a kondicionált tápközeget átbocsátjuk szabályozott méretű üveggyöngyöket tartalmazó oszlopon (1 ml ágy térfogat), amely üveggyöngyökhöz előzőleg anti-t-PA kecske poliklonális A6 antitestet (amelyet önmagában ismert eljárásokkal állítunk elő) kötöttünk. Mielőtt a tápközeget felvinnénk, az oszlopot olyan oldattal ekvilibráljuk, amely 0,1 M Tris HCl-t (pH 7,5) és 1 M NaCl-ot tartalmaz. A tPA-t olyan oldattal eluáljuk, amely 0,1 M ecetsavat, 0,15 M NaCl-ot, 0,02 M arginint és 0,01% Tween 80-at tartalmaz (pH 2,0), és a kapott frakciókat Tris-bázissal azonnal semlegesítjük. A frakciókat egyesítésük előtt 0,01% Tween 80 koncentrációra állítjuk be. A redukáló SDS gélen azt találjuk, hogy a t-PA legnagyobbrészt (80%) egyláncú formában van.

B. Biológiai vizsgálatok

1. A t-PA mennyiségi meghatározása

A proteinkoncentrációkat a natív t-PA szekvenciára standardizált ELISA eljárással rutinszerűen határozzuk meg (lásd a korábban idézett, 93 619 számú európai szabadalmi bejelentést). A protein tisztaságát és homogenitását poliakrilamid gélelektroforézissel nátriumdodecil-szulfát jelenlétében (SDS-PAGE) elemezzük, Laemmli-féle pufferrendszerben [Natúré, 227: 680 (1970)]. Jellegzetesen 7-17% gradiensű gélt alkalmazunk, és a proteineket Morrissey ezüstfestési technikájával tesszük láthatóvá [Anal. Biochem., 777: 307 (1981)]. A fentebb leírtak szerint előállított t-PA variánsról megállapítható, hogy az ennek az eljárásnak az alapján tiszta és homogén.

2. S-2251 vizsgálat

A vérröglízis és az S-2251 vizsgálatok eredményei több független megfigyelés átlagait mutatják (vérröglízis: 2 meghatározás; S-2251: 3 meghatározás).

HU 210 529 A9

A t-PA-nak azt a képességét, hogy a plazminogént aktiválja, egy in vitro vizsgálattal mérhetjük olyan módon, hogy a t-PA-t és a plazminogént előinkubáljuk, majd hozzáadjuk a plazminspecifikus H-D-valil-H-leucil-H-lizinpara-nitro-anilid (S—2251) szubsztrátot. Ennek a reakciónak a maximális sebessége olyan fibrin(ogén) vagy fibrin(ogén) fragmentumok jelenlétében figyelhető meg, amelyek a reakció stimulátoraiként hatnak.

A minta plazminogént aktiváló képességének mérése céljából a plazminspecifikus S-2251 szubsztrátot egy kétlépcsős vizsgálatban alkalmazzuk. A fibrinogént úgy használhatjuk stimulátorként, hogy a mintát 0,02 ml, 20 mg/ml koncentrációjú fibrinogénoldattal inkubáljuk 0,12 ml össztérfogatban, az alábbi összetételű oldatban: 0,05 M Tris HC1, 0,12 M NaCl és 0,01% Tween 80 (pH 7,4).

Glu-plazminogén-oldatot (amely kereskedelmi forgalomban kapható) adunk ezután hozzá, mégpedig 0,03 ml-t egy olyan 2,0 mg/ml koncentrációjú oldatból, amely 0,05 M Tris-t és 0,12 M NaCl-t tartalmazó pufferben (pH 8,0) van. A keveréket 10 percen át 37 °C hőmérsékleten tartjuk, majd hozzáadunk 0,35 ml 0,86 mM S-2251 oldatot, amely 0,037 M Tris-t, 0,086 M NaCl-ot és 0,007% Tween 80-at tartalmazó oldatban (pH 7,4) van. Ezt a keveréket 5 percen át inkubáljuk; ezután a reakciót 0,1 ml 50%-os jégecet hozzáadásával leállítjuk. Az abszorbanciát 405 nm-nél méljük. Az aktivitást úgy fejezzük ki mint a szubsztrát jelenlétében történő abszorbanciaváltozást nanogrammonként és percenként.

Az eredmény az, hogy fibrinogénnel az F305H variáns aktivitása az eredeti típusú fajlagos aktivitás körülbelül 78%-ának felel meg; ez valószínűleg az A405 növekedése előtti lag szakasznak tulajdonítható.

3. Vérröglízis

Eredeti típusú és F305H t-PA-t arra nézve vizsgálunk, hogy milyen mértékben képesek lizálni a fibrint plazminogén telített koncentrációinak jelenlétében; a vizsgálatot Carlsten és munkatársai eljárása szerint [Carlsten et al., Anal. Biocem., 168: 428-435 (1988)] végezzük. Az in vitro vérröglízis-vizsgálat a t-PA-k aktivitását turbidimetriás úton méri, egy mikrocentrifugáló analitikai berendezés alkalmazásával. Trombin és t-PA vizsgálati minták keverékét centrifugáljuk fibrinogén és plazminogén keverékébe, annak érdekében, hogy beindítsuk a vérrögképződést és az azt követő vérrögoídódást. Az így kialakuló „abszorbancia az idő függvényében” profilt elemezzük, hogy meghatározzuk a vizsgálat végpontját. A t-PA variánsok aktivitásait összehasonlítjuk az rt-PA standard görbéjével (lásd a 93 619 számú európai szabadalmi bejelentést). A vizsgálat folyamán alkalmazott puffer olyan 0,06 M nátrium-foszfát-puffer (pH 7,4), amely 0,01 térfogat% Tween 80-at és 0,01 vegyes (tömeg/térfogat) nátriumazidot is tartalmaz. A humán trombin 33 egység/ml koncentrációban van jelen. Fibrinogént (2,0 mg/ml alvasztható proteinkoncentráció mellett) jeges vízben lehűtünk annak érdekében, hogy a fibronektint kicsapjuk, majd ezt gravitációs szűréssel kinyerjük. A gluplazminogén 1 mg/ml koncentrációban van jelen. Az analizáló kamra hőmérséklete 37 °C-ra van beállítva. Az adagolóberendezés úgy van beállítva, hogy 20 μΐ rt-PA-t (körülbelül 62,5 ng/ml 1,0 g/ml-re számítva) adagoljon a standard görbéhez, vagy 20 μΐ rt-PA-t adagoljon olyan koncentrációban, amely lízist idéz elő a standard görbe tartományán belül. Másodlagos reagensként 20 μΐ trombint, és elsődleges reagensként 200 μΐ 50:1 térfogatarányú fibrinogén:plazminogén keveréket alkalmazunk. Az abszorbancia/idő programot 5 perces indukálási idővel, 340 nm-es szűrővel és 90-intervallumos leolvasásokkal alkalmazzuk.

Az eredmények azt jelzik, hogy ezt a vizsgálati eljárást alkalmazva az F305H variáns a normál eredeti típusú t-PA vérrögoldó aktivitásának körülbelül 46%ával rendelkezik.

4. Fibrinkötés

A fibrinkötés számára alkalmazott módszer a Rijken és munkatársai által leírt eljárás [Rijken et al., J. Bioi. Chem., 257:2920 (1982)] módosított változata. A vizsgálandó t-PA mintát hozzáadjuk egy olyan oldathoz, amely 0,05 M Tris-t (pH 7,4), 0,12 M NaCl-ot, 0,01% Tween 80-at és 1 mg/ml humán szérum albumint, továbbá különböző (0; 0,05; 0,1; 0,25; valamint 0,5 mg/ml) koncentrációkban plazminogénmentes fibrint tartalmaz. A reakciókeverék végtérfogata 1 ml, és a t-PA koncentráció valamennyi mintában 10 ng/ml. A mintákat 37 °C hőmérsékleten 5 percig inkubáljuk, majd 1 egység trombint adunk hozzájuk. A mintákat ezt követően egy órán keresztül 37 C hőmérsékleten inkubáljuk. A vérrögöket centrifugálással eltávolítjuk és a felülúszóban. kötetlenül maradt t-PA mennyiségét ELISA módszerrel meghatározzuk.

Az eredmények (5. ábra) azt mutatják, hogy a túlnyomórészt egyláncú F305H t-PA (fekete háromszögek) az alkalmazott vizsgálati körülmények között csaknem olyan jól kötődik a fibrinhez, mint az egyláncú eredeti típusú t-PA (fekete négyzetek) és az egyláncú és kétláncú eredeti típusú t-PA keveréke (üres háromszögek). A kétláncú F3O5h t-PA (fekete körök) legalább olyan jól kötődik a fibrinhez, mint a kétláncú eredeti típusú t-PA (fekete rombuszok).

ajAfibrinogén előállítása

Humán fibrinogént (Calbiochem) plazminogénmentessé teszünk olyan módon, hogy a fibrinogént lizin-Sepharose oszlopra visszük fel és az átfolyó anyagot összegyűjtjük. Az így kapott egyesített fibrinogént plazminSepharose-zal szobahőmérsékleten egy éjszakán át végzett kezeléssel elbontjuk. A létrejövő alvadóképesség 7%. A koncentrációt ezután 1,51 mg/ml-re állítjuk be.

b) Eljárás

Meghatározzuk a plazminogén eredeti típusú t-PA és F305H t-PA által plazminná történő átalakításának a kinetikáját; ehhez fibrinogén jelenlétében S-2251 kromogén plazmin szubsztrátot alkalmazunk. Az eredeti típusú t-PA és az F305H t-PA molekulákat túlnyomórészt egyláncú formában (amelyet a fentebb leírt tisztí17

HU 210 529 A9 tással kapunk), illetve kétláncú, „összecsíptetett” formában (amelyet a túlnyomórészt egyláncú forma plazmin-Sepharose-zal 1 órán át 37 °C hőmérsékleten végzett inkubálásával kapunk meg) alkalmazzuk.

1,2 mM plazmindegradált fibrinogén fragmentum jelenlétében (amelyet a fentebb leírtak szerint állítottunk eló) a reakciót 0,08-0,89 mM plazminogénkoncentráció és 2,3-9,0 mM t-PA koncentráció mellett hajtjuk végre, az alábbi összetételű oldatban: 0,12 M NaCl, 0,05 M Trs, 0,01% Tween 80 (pH 7,4). Aplazminogént, a fibrinogént és a puffért három órán át szobahőmérsékleten előinkubáljuk. Az S-2251-et 0,9 μΜ végső koncentrációban adjuk hozzá, és a mintákat 37 °C hőmérsékleten 5 percen át melegítjük. A zéró időpontban hozzáadjuk a t-PA mintákat, és az egyes minták abszorbanciáját 37 °C hőmérsékleten 10 percen át 30 másodperces intervallumokban leolvassuk.

Az eredményeket a 6. és 7. ábra (az eredeti típusú, egyláncú, illetve kétláncú t-PA), valamint a 8. és 9. ábra (az F305H egyláncú, illetve kétláncú t-PA formájában) adjuk meg. Az ábrákban az ordináta a 405 nm-nél mért abszorbancia és az abszcissza azon percek számának négyzete, amelyeknél az abszorbanciákat mérjük. A fekete körök 0,09 μΜ plazminogént (és 15,7 nM eredeti típusú, kétláncú t-PA-t, 10,8 nM F305H kétláncú t-PA-t,

16.1 nM eredeti típusú, egyláncú t-PA-t és 17,2 M F305H egyláncú t-PA-t) jelölnek; a fekete háromszögek 0,11 μΜ plazminogént (és 11,8 nM eredeti típusú, kétláncú t-PA-t,

8.1 nM F305H kétláncú t-PA-t, 12,1 nM eredeti típusú, egyláncú t-PA-t, 12,9 nM F305H egyláncú t-PA-t) képviselnek; a fekete négyzetek 0,16 μΜ plazminogént (és

9.8 nM eredeti típusú, kétláncú t-PA-t, 6,7 nM F305H kétláncú t-PA-t, 10,1 nM eredeti típusú, egyláncú t-PA-t,

10.8 nM F3O5H egyláncú t-PA-t) képviselnek; az üres körök 0,22 μΜ plazminogént (és 7,9 nM eredeti típusú, kétláncú t-PA-t, 5,4 nM F305H kétláncú t-PA-t, 8,1 nM eredet típusú, egyláncú t-PA-t, 8,6 nM F305H egyláncú tPA-t) képviselnek; az üres háromszögek 0,44 μΜ plazminogént (és 3,9 nM eredeti típusú, kétláncú t-PA-t,

2,7 nM F305H kétláncú t-PA-t, 4,0 nM eredeti típusú, egyláncú t-PA-t, 4,3 nM F305H egyláncú t-PA-t) képviselnek; és az üres négyzetek 0,9 μΜ plazminogént (és 3,9 nM eredeti típusú, kétláncú t-PA-t, 2,7 nM F305H kétláncú t-PA-t, 4,0 nM eredeti típusú, egyláncú t-PA-t és

4,3 nM F305H egyláncú t-PA-t) képviselnek.

A görbék azt mutatják, hogy a reakciók kezdeti szakaszában csak a túlnyomórészt egyláncú F305H variáns abszorbanciája mutat kimondott lag fázist, amely később aktivitásnövekedésbe megy át. A kétláncú F305H variáns nem mutatja ezt a lag fázist; úgy tűnik, hogy ez olyan kinetikai tulajdonságokkal rendelkezik, amelyek az egy- vagy kétláncú eredeti típusú t-PA jellemzőihez hasonlítanak. Ez a viselkedés az F305H variáns zimogén jellegét demonstrálja, amely az eredeti típusú t-PA-nél nem figyelhető meg.

IL példa

Az ebben a példában értékelt t-PA variánsok kifejlesztéséhez az alanin-átvizsgáló mutagenezisként (ALAscan) ismert [Cunningham és Wells, fentebb idézett munka) alkalmazzuk. Ez az eljárás magában foglalja a t-PA proteázdomén azon kis felületi területeinek azonosítását, amelyek töltéssel rendelkező aminosav oldalláncokat tartalmaznak. Anélkül, hogy bármely elmélethez mereven ragaszkodnánk, úgy véljük, hogy vagy ezek a töltésgócokat tartalmazó régiók, vagy az ezekkel szomszédos régió, vagy pedig ezek közösen felelősek a t-PA molekula és szubsztrátja vagy a t-PA molekula aktivitását módosítani képes különféle más vegyület közötti kölcsönhatásért. Annak megállapítására, hogy a t-PA molekula teljes aktivitásában egy adott régiónak milyen jelentősége van, a töltéssel rendelkező aminosavakat (azaz az Arg, Asp, His, Lys és Glue aminosavakat) (mutáns molekulánként egy régióban) alaninra cseréljük. Az eredményeket az alábbiakban ismertetjük.

1. A pRK7-t-PA felépítése

A pRK7 plazmidot a t-PA mutánsok kialakítására szolgáló vektorként alkalmazzuk. A pRK7 lényegében a pRKStel [307 247 számú európai szabadalmi bejelentés (nyilvánosságra került 1989. 03. 15-én)] azonos, azzal a különbséggel, hogy a Clal és Hindffl közötti polilinker régióban az endonukleáz restrikciós helyek sorrendje fordított. A t-PA cDNS-t [Pennica et al., Tature, 301: 214 (1983)] a Hindin restrikciós endonukleázzal (amely az ATG startkodon 5' végénél 49 bázispárt hasít) és a Ball restrikciós endonukleázzal (amely a TGA stopkodontól lefelé 276 bázispárt hasít) végzett hasítással előkészítjük a vektorba történő inzertálás számára. A cDNS-t standard ligálási eljárással [Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, New York (1982)] előzetesen már Hindin és Smal segítségével hasított pRK7-be ligáljuk. Ezt a szerkezetet pRK7-t-PP jelzéssel látjuk el.

2. A p RK7-Í-PA helyre irányuló mutagenezise

A t-PA cDNS helyre irányuló mutagenezisét Taylor és munkatársai eljárásával [Nucl. Acids Rés., 13: 8765 (1985)] hajtjuk végre, amelynek során az Amersham Corporation-tól vásárolt készletet (katalógusszám: RPN 1253) alkalmazzuk. A kívánt mutánsok kifejlesztéséhez a kívánt aminosav-helyettesítést kódoló szekvenciák oligonukleotidait szintetizáljuk, majd ezeket az oligonukleotidokat primerekként alkalmazzuk. Az oligonukleotidokat hozzáforrasztjuk az előzőleg standard eljárással [Viera et al., Meth. Enz., 143: 3 (1987)] előállított egyszálú pRK7-t-PA-hoz.

Három dezoxi-ribonukleotid-trifoszfát [dezoxi-riboadenozin-trifoszfát (dATP), dezoxi-riboguanozin-trifoszfát (dGTP) és dezoxi-ribotimidin-trifoszfát (dTTP)] keverékét összekeverjük egy módosított, dCTP(ds)-nek nevezett tio-dezoxi-ribocitozinnal, amely a fentebb hivatkozott készletben megtalálható, és hozzáadjuk az olyan egyszálú pRK7-t-PA-hoz, amelyhez az oligonukleotid hozzá van forrasztva.

Amikor DNS polimerázt adunk ehhez a keverékhez, a mutált bázisok kivételével lényegében a pRK7-tPA-val azonos DNS szál alakul ki. Ezenkívül ez az új DNS szál dCTP helyett dCTP(ds)-t tartalmaz, ami azt a célt szolgálja, hogy megóvja a szálat bizonyos restrik18

HU 210 529 A9 ciós endonukleázok emésztésétől. Miután a kettős szálú heteroduplex templát szálát egy megfelelő restrikciós enzimmel bemetszettük, a templát szálat ΕχοΠΙ nukleázzal emésztjük a mutagén oligomert tartalmazó régió után. A reakciót ezt követően úgy állítjuk le, hogy olyan molekula maradjon meg, amely csak részben egyszálú. Ezután DNS polimerázzal mind a négy dezoxi-ribonukleotid trifoszfát, ATPés DNS ligáz jelenlétében teljesen kettős szálú DNS homoduplex molekulát alakítunk ki.

A fentebb ismertetett ALA-átvizsgáló módszerrel a következő, a pRK7-t-PA molekulák létrehozásához primerként alkalmazott oligonukleotidokat állítjuk elő: 5'-GGCTGTACTGGGCCAGGCCGCA-3' (R2 6 7A) 5'-GGCAGCCTGCCAGGGGGCGGAGGCGATGGCGGCGAAGAG-3' (D283A, H287A)

5'-CCGCTCTCCGGGCGACGCCGCGGCCGCGGCAAAGAT3' (K296A, H297A, R298A, R299A) 5'-GCCCCCGCACAGGAACGCCGCTCCGGGCGA-3' (E303A, R304A)

5'-CTCCTGGAAGCAGGCGGCGGCAGA-3' (H3 2 2A) 5'-GTGGTGGGGCGGAAACGCCGCCTGGAACGA-3' (E326A, R327A)

5'-CAAGATCACCGTCAGGGCGGCGGGCGGAAA-3' (H331 A, H332A)

5'-CTCGCCAGGGACCACCGCGTATGTTGCGCCCAAGAT3' (R339A, R342A)

5'-TTTTTCGACTTCAAATGCCTGCGCCGCCGCGCCAGGGAC-3' (E347A, E348A, E349A, K351A) 5'-CTTATGGACRAATGTATGCTGCGACTGCAAATTTCTG3' (E353A, E355A, K356A)

5'-AGTGTCATCATCGAATGCCGCAGCGACAATGTA-3' (H360A, K361A, E362A)

5'-GTCATTGTCGTAAGTGGCAGCAGCGAATTCCTT-3' (D364A, D365A, D366A) 5'-GTGCAGCAGCGCAATGGCATTGGCGTAAGTGTC-3' (D369A, D371A)

5'-CTCCTGGGCACAGGCGGACGAAGCCGATGCCAGCTGCAG-3' (K378A, D38OA, R383A) 5'-AAGGCACACAGTGGCGACCACGCTGCTCGCCTGGGCACA-3' (E387A, R392A) 5'-ACACTCCGTCCAGGCCGGCAGCTGCAGGGCCGCCGGGGG-3' (D400A, D405A) 5'-GGAGAGCTCACAGGCCGTCCAGTC-3' (E408A) 5'-GTAGCCGGAGAGGGCACACTCCGT-3' (E410A) 5'-AGGAGACAAGGCCGCAGCCGCGCCGTAGCC-3' (K416A, H417A, E418A)

5'-TCTGACATGAGCCGCCGCCAGCGCCGCCGAATAGAA3' (E426A, R427A, K429A, E430A) 5'-GGATGGGTACAGTGCGACAGCAGCCTCCTT-3' (H432A, R434A)

5'-TTGTGATGTGCAGGCGCTGGATGG-3' (R44 0A) 5'-GTCGGTGACTGTTGCGTTAAGTAAAGCTTGTGATGT3' (H445A, R449A)

5'-ACACAGCATGTTGGCGGTGACTGTTGCGTTAAGTAA3' (R449A, D453A)

5'-GGGCCCGCCGCTCGCAGTGGCTCCAGCACA-3' (D460A, R462A)

5'-GCCCTGGCAGGCGGCGGCCAAGTTTGC-3' (H471A, D472A)

5'-GGGGCCTCCCGAAGCGCCCTGGCA-3' {D477A) '-CACCAAAGTCATGGCGCCAGCGTTCAGACA-3' (D487A, R489A)

5'-CAGACCCGGGACAGCCGCCTGTCCACA-3' (K505A, D506A)

5'-GTAGTTGGTAACGGCTGTGTACAC-3' (K513A) 5'-GGGTCGCATGTTGGCAGCAATCCAGGCTAGGTAGTT3' (D519A, R522A, D523A) '-TCCTGGTCACGGTGCCATGTTGGCACGAATCCA-3' (D523A, R526A)

3. Bakteriális transzformálás és DNS előállítás

A kompetens sejtek előállítása és transzformálása érdekében a fenti előírások alkalmazásával kialakított mutáns t-PA konstrukciókat a standard CaCl₂-os eljárást (Manniatis et al., fentebb idézett munka) alkalmazva E. coli MM294tonA gazdatörzsbe transzformáljuk. A TI fágra rezisztens MM294 TonA előállítását egy TnlO transzpozonnak a tonA génbe történő inzertálásával, majd ezt követő nem pontosan végzett kimetszésével állítjuk elő. Ezt követően; a gént transzpozon inzerciós mutagenesis [Kleckner et al., J. Mól. Bioi., 116: 125-159 (1977)] segítségével E. coli MM294 (ATCC 31 446) gazdaszervezetbe inzertáljuk.

A bakteriális transzformánsok egyes telepeiből Maniatis és munkatársai standard miniprep eljárását (lásd a fentebb idézett közleményt) alkalmazva DNS-t vonunk ki. A plazmidokat tovább tisztítjuk Sepharose GL6B gyors oszlopon átbocsátva, majd szekventálással, restrikciós endonukleázos emésztéssel és agaróz gélelektroforézissel analizáljuk.

Ezen transzformánsok egyikét, a K296A, H297A, R298A, R299A mutánst kódoló plazmidot tartalmazó transzformánst, amelyet pTPA33-2 jelzéssel láttunk el, 1989. július 18-án deponáltuk az American Culture Collectionnél, ahol az ATCC 86 059 számot kapta.

4. Humán embrió vese 293 sejtek transzfektálása (kis léptékben)

Hatlyukú lemezeken 293 sejteket növesztünk a teljes konfluencia 70%-áig. 2, 5 gg t-PA plazmid DNS mutánst feloldunk 150 μΐ oldatban, amely 1 mM TrisHCl-t, 0,1 mM EDTA-t és 0,227 M CaCl₂-ot tartalmaz. Vortex berendezés használata közben cseppenként hozzáadunk 150 μΐ olyan oldatot, amely 50 mM HEPES puffért (pH 7,35), 280 mM NaCl-ot és 1,5 mM NaPO₄ot tartalmaz, és a csapadékot 10 percig 25 °C hőmérsékleten állni hagyjuk. A szuszpendált csapadékot ezután hozzáadjuk a hatlyukú lemez egyes üregeiben lévő sejtekhez és 4 órán keresztül inkubátorban ülepedni hagyjuk. A tápközeget ezt követően leszívatjuk és 1 ml 20%-os glicerint (PBS-ben) adunk hozzá 30 másodperc alatt. A sejteket kétszer mossuk, először 3 ml, majd 1 ml szérummentes tápközeggel. Ezután 3 ml friss tápközeget adunk hozzá és a sejteket 5 napon át inkubáljuk. A tápközeget összegyűjtjük és megvizsgáljuk.

Amennyiben egyláncú t-PA-ra van szükség, a fenti eljárást alkalmazzuk, azzal az eltéréssel, hogy a sejtek növekedési fázisában csökkentett plazminogéntartalmú szérumot alkalmazunk.

HU 210 529 A9

5. Humán embrió vese 293 sejtek transzfektálása (nagy léptékben)

A nagy mennyiségek előállításához használatos K296A, H297A, R298A, R299A variás nagyléptékű tisztításához azt a transzfekciós eljárást alkalmazzuk, amely a Current Protocols in Molecular Biology [Ausubel et al., eds. (Wiley Interscience, 1988)] című szakkönyvből megismerhető, ezt azonban valamelyest módosítjuk a következők szerint. Humán embrió 293 sejtek szuszpenzióját növesztjük egy sejttenyésztő tápközegben, és üledékképzéssel betöményítjük. Az üledéket újra szuszpendáljuk körülbelül 10⁸ sejt/milliliter koncentrációra és a sejteket szükség szerint szérummetes tápközeggel mossuk. DNS-dextrán oldatot adunk hozzá 250 g DNS/500 ml sejtkoncentrációban, és ezt a keveréket enyhe mozgatás közben 37 °C hőmérséklet 90 percen keresztül inkubáljuk. DMSO-t adunk hozzá 10% végső koncentrácóig, majd körülbelül 2 perc múlva friss tápközeget adunk hozzá, hogy a sejteket körülbelül 10⁶ sejt/milliliter koncentrációra hígítsuk. A sejteket ezután 7 napon keresztül inkubáljuk, majd a felülúszókat összegyűjtjük.

Ennek a mutánsnak a tisztítását úgy végezzük, hogy a felülúszót átvezetjük egy olyan oszlopon, amelynek töltete anti-t-PA kecske poliklonális A6 antitesttel összekapcsolt üveggyöngyökből áll. Ezt az oszlopot előzetesen PE-sel kondicionáljuk. Miután a felülúszót rávisszük, az oszlopot Tris-konyhasó pufferrel [0,1 M Tris.HCl (pH 7,5) és 1 M NaCl] ekvilibráljuk. A t-PA variánst ezután olyan oldattal eluáljuk, amely 0,1 M ecetsavból, 0,15 M NaCl-ból, 0,02 M argininből és 0,01 Tween 80-ból áll. A frakciókat Tris bázissal semlegesítjük és 0,01 % Tween 80 koncentrációra állítjuk be.

6. Biológiai vizsgálatok

A. A t-PA mennyiségi meghatározása

A sejttenyészet felülúszókban jelenlévő t-PA menynyiségét eredeti típusú t-PA-val szemben készített poliklonális antitestet alkalmazva ELISA eljárással határozzuk meg.

B. S-2288 vizsgálat

Az S-2288 vizsgálatot mind az egyláncú, mind a kétláncú mutánsok proteolitikus aktivitásának mérésére használjuk. Ez a vizsgálat a t-PA proteolitikus aktivitásának közvetlen mérésén alapul; a t-PA elhasítja a kis peptid és a para-nitro-anilid kromofór közötti kötést.

Standard görbe mintákat állítunk elő oly módon, hogy az eredeti típusú rt-PA-t a sejttenyészet tápközeggel hígítjuk. A standard görbe mintákat és az rt-PA mutáns mintákat a mikrotiterlemez lyukaihoz adjuk. Ha vizsgálatot a kétláncú rt-PA aktivitásának mérésére alkalmazzuk, az eljárás egy humán plazminnal végzett inkubálási lépést is magában foglal. Ekkor humán plazmint (Kabi Vitrum) adunk a közegbe 0,13 CU/ml (kazein egység/ml) végső koncentrációban. A mintákat 90 percen át szobahőmérsékleten inkubáljuk. Amikor a mintákat egyláncú formában mérjük, a plazminoldatot PBS-sel helyettesítjük és a 90 perces inkubálást elhagyjuk.

A plazmin aktivitás gátlására a mintákhoz aprotonint [Sigma, körülbelül 14 TIU (tripszin inhibitor egység)/mg] adunk hozzá. A mintákat ezt követően szobahőmérsékleten 15 percig inkubáljuk. S-2288-nak 2,16 mM oldatát 1,45 mM koncentrációra hígítjuk olyan oldattal, amely 0,1 M Tris-t, 0,106 mM NaCl-ot és 0,02% nátrium-azidot tartalmaz (pH 8,4), és az így létrejött oldatból 100 μΐ-t adunk a mikrotiterlemez minden egyes üregébe (az egyes üregekben a végső térfogat 200 μΐ). A szín kifejlődését 405 nm-nél figyeljük meg. Meghatározzuk az abszorbancia-idő függvénygörbe meredekségét az egyes standardoknál és a mintánál. Standard görbét készítünk, függvénybe állítva az abszorbancia idővel szembeni meredekségét az rt-PA koncentrációval, az rt-PA standardok alapján. Ezután a standard görbéből meghatározzuk a mutánsok relatív aktivitás koncentrációját. Az egyes mutánsok aktivitás koncentrációját elosztjuk az rt-PA ELISAval kapott mutánskoncentráció értékkel, és az így kapott fajlagos aktivitást az eredeti típusú t-PA-ra vonatkoztatva fejezzük ki, amely utóbbinak az 1,0 értéket adjuk.

Az I. Táblázatban az adatok két vizsgálat átlagai és az eredeti típusú rt-PA-ra vonatkoztatott relatív aktivitásként kerülnek megadásra. Az eredmények azt mutatják, hogy az eredeti típusú rt-PA-hoz viszonyítva az összes bemutatott mutánsnál a kétláncú forma (legalább 1,5-szer, de egyes esetekben közel 60-szor) aktívabb, mint az egyláncú forma, jelezve, hogy ezen mutánsok mindegyike zimogénnek tekinthető ebben a vizsgálatban.

I. táblázat

Zimogének az S-2288 vizsgálatban

	Relatív aktivitás az eredeti típusú rt-PAhoz viszonyítva [ahol az eredeti típus 1,0; () jelzi a kísérleti hibát]
Mutáció	egyláncú	kétláncú	SZOIZŐ- szám
R267A	0,33 (0,03)	0,85 (0,13)	2,6
D283A, H287A	0,08(0,11)	0,60 (0,23)	7,5
R339A, R342A	0,01 (0,01)	0,52 (0,01)	52
E347A, E348A, E349A, K351A	0,01 (0,01)	0,49(0,18)	49
K416A, H417A, E418A	0,01 (0,01)	0,59 (0,01)	59
E426A, R427A, K429A, E430A	0,01 (0,01)	0,33 (0,04)	33
H432A, R434A	0,08 (0,01)	0,71 (0,08)	8,9
R440A	0,53 (0,03)	0,78 (0,04)	1,5

C. S-2251 vizsgálat

Ez a vizsgálat a t-PA aktivitás közvetett vizsgálata. Ebben a vizsgálatban a plazminogén a t-PA hatására plazminná alakul, a plazmin pedig az S-2251 szubsztrátot úgy hasítja, hogy szabaddá válik a para-nitro-anilid kromofór. Ennek a kromofómak a keletkezését mérjük ezután az idő függvényében.

HU 210 529 A9

1. Fibrinstimulált S-2251 vizsgálat

Az S-2288 vizsgálatnál leírtak szerint standard görbe mintákat készítünk. A kétláncú formában vizsgált mintákat plazmin-Sepharose-zal inkubáljuk. A plazmin Sepharose-t úgy állítjuk elő, hogy mintegy 20,8 CU humán plazmint (Kabi Vitrum) 1 ml, cianogén-bromiddal aktivált Sepharose-hoz (Pharmacia) kapcsolunk. A plazminSepharose-t (5%-os szuszpenzió 50 μΐ-ét) 150 μΐ mintával rázatás közben 90 percen keresztül inkubáljuk szobahőmérsékleten. Az inkubálást követően a gyantát centrifugálással eltávolítjuk és a mintából 10 μΐ-es részleteket adunk egy mikrotiterlemez lyukaiba.

Az egyláncú formában vizsgált mintáknál a gyanta helyett 50 μΐ sejttenyészet tápközeget adunk és az inkubálási lépést elhagyjuk. Az egyes lyukakba humán trombint adunk (42 egység/ml-es oldatból 10 μΐ-t). A reakciót úgy indítjuk be a lyukakban, hogy egy olyan koktélt (130 μΐ) mérünk be, amely koktél összetétele a következő: 28 μΐ humán Glu-plazminogén (5,3 μΜ); 10 μΐ plazminogénmentes humán fibrinogén (10 μΜ); 30 μΐ 3 mM S-2251 (Kabi Vitrum); valamint 62 μΐ PBS. A szín kifejlődését 405 nm-nél követjük, és a 492 nm referencia-hullámhossznál mért abszorbanciát minden időpontnál kivonjuk. Valamennyi standard és mutáns minta esetén meghatározzuk az abszorbancia(idő)² görbe meredekségét. Az rt-PA standardoknál az abszorbancia-(idő)² görbe meredekségét az rt-PA koncentráció függvényében ábrázolva standard görbét készítünk. A mutánsok esetén a relatív fajlagos aktivitás meghatározását az S-2288 vizsgálatnál már ismertetettek szerint végezzük.

2. Fibrinogénstimulált S-2251 vizsgálat

A vizsgálatot ugyanúgy végezzük, mint ahogyan azt a fibrinstimulált S-2251 vizsgálatnál leírtuk, azzal a különbséggel, hogy a trombint PBS helyettesíti.

3. Plazmavérrög S-2251 vizsgálat

A standard görbe minta előállítását és az egyláncú rt-PA átalakítását kétláncú rt-PA-vá plazmin-Sepharose alkalmazásával ugyanúgy végezzük, amint ezt a fibrinnel stimulált S-2251 vizsgálatnál már leírtuk. A mikrotiterlemez egyes lyukaihoz humán trombint adunk (10 μΐ, 31 μg/ml-es oldatból).

A standard és a mutáns mintákat (40 μΐ) hozzáadjuk a lemezhez és a reakciót úgy indítjuk be, hogy 100 μΐes mennyiségben olyan keveréket adunk hozzá, amely keverék 90 μΐ citromsavas, dextrózos humán plazmából és 10 μΐ 9,1 mM S-2251-ból (KabiVitrum) áll. A szín kifejlődését 405 nm-nél mérjük és a 492 nm referencia-hullámhossznál mért abszorbanciát mindegyik időpontnál kivonjuk. Az adatok ilyen jellegű elemzését a fibrinnel stimulált S-2251 vizsgálatnál már leírtuk.

4. Plazma S-2251 vizsgálat

Ezt a vizsgálatot ugyanúgy végezzük, mint ahogyan azt a plazmavérrög S-2251 vizsgálatnál leírtuk, azzal az eltéréssel, hogy a trombint PBS helyettesíti.

A zimogén minőségre nézve a mutánsokat úgy vizsgáljuk, hogy fibrinfüggő és plazmavérrögfüggő vizsgálatokat alkalmazunk. Az eredményeket - az eredeti típushoz viszonyítva - a II., illetve a ΠΙ. Táblázatban mutatjuk be. Az egyláncú formában lévő mutánsok esetén az értékek két meghatározás átlagai. A kétláncú formában lévő mutánsoknál az értékek négy meghatározás átlagai.

II. táblázat

Zimogének a fibrinfüggő S-2251 vizsgálatban

	Relatív aktivitás az eredeti típusú rt-PAhoz viszonyítva [ahol az eredeti típus 1,0; () jelzi a kísérleti hibát]
Mutáció	egyláncú	kétláncú	szorzó- szám
K296A, H297A, R298A, R299A	1,26(0,02)	2,82 (0,32)	2,2
E3O3A, R304A	1,38(0,04)	2,13 (0,29)	1,5
H331A, H332A	1,29(0,04)	2,19 (0,68)	1,7
R339A, R342A	0,38 (0,07)	1,04(0,11)	2,7
K416A, H417A, E418A	0,21 (0,04)	0,96 (0,09)	4,6
E426A, R427A, K429A, E430A	0,14(0)	0,76 (0,07)	5,4
H432A, R434A	0,16(0,08)	0,99 (0,13)	6,2
D460A, R462A	0,68 (0,04)	1,04(0,08)	1,5

III. Táblázat

Zimogének a plazmavérrögfüggő S-2251 vizsgálatban

	Relatív aktivitás az eredeti típusú rt-PAhoz viszonyítva [ahol az eredeti típus 1,0; () jelzi a kísérleti hibát]
Mutáció	egyláncú	kétláncú	szorzó- szám
D283A, H287A	0,53 (0,01)	0,82(0,04)	1,6
K296A, H297A, R298A, R299A	0,42(0)	1,29(0,20)	3,1
E303A, R304A	0,90 (0,03)	1,34(0,10)	1,5
H331A, H332A	1,09(0,09)	1,61 (0,68)	1,5
R339A, R342A	0,19(0,03)	0,79 (0,10)	4,2
E347A, E348A, E349A, K351A	0,38 (0,05)	0,97 (0,10)	2,6
D364A, D365A, D366A	0,88 (0,03)	1,46(0,15)	1,7
K416A, H417A, E418A	0,19(0,05)	0,77 (0,05)	4,1
E426A, R427A, K429A, E430A	0,11 (0,01)	0,66 (0,12)	6
H432A, R434A	0,05 (0,01)	0,38 (0,05)	7,6
H445A, R449A	0,80 (ND)*	1,19(0,11)	1,5
R449A, D453A	0,79 (0,01)	1,22(0,13)	1,5
D460A, R461A	0,21 (0,01)	0,32 (0,02)	1,5
D477A	0,11 (0,02)	0,25 (0,08)	2,3

*ND = nem határoztuk meg

HU 210 529 A9

Az I-ΠΙ. Táblázatokban lévő adatok összefoglalását az alábbi IV. táblázatban adjuk meg; ebből látható, hogy az egyes mutánsok mely vizsgálatban mutatnak zimogenicitást.

IV. Táblázat

	Zimogén
Mutáció	S-2288	Fibrin 2251	Plazma- vérrög 2251
R267A	X
D283A, H287A	X		X
K296A, H297A, R298A, R299A		X	X
E3O3A, R304A		X	X
H331A, H332A		X	X
R339A, R342A	X	X	X
E347A, E348A, E349A, K351A	X		X
D364A, D365A, D366A			X
K416A, H417A,. E418A	X	X	X
E426A, R427A, K429A, E430A	X	X	X

	Zimogén
Mutáció	S-2288	Fibrin 2251	Plazma- vérrög 2251
H432A, R434A	X	X	X
R440A	X
H445A.R449A			X
R449A, D453A			X
D460A, R462A		X	X
D477A			X

AIV. táblázatban felsorolt zimogén t-PA variánsokat S—2251 fibrinfajlagossági és/vagy S-2251 plazmavérrög-specifitási vizsgálatban elemezzük mind az egyláncú, mind a kétláncú formában. Az egyláncú és kétláncú t-PA variánsoknál kapott eredményeket az V, illetve a VI. táblázatban mutatjuk be.

Az V. és a VI. táblázat adatainak összegzését a VII.

táblázat adja meg. Látható, hogy az erédeti típusú tPAhoz viszonyítva a IV. táblázatban szereplő zimogén rt-PA variánsok mindegyike fibrin- és/vagy plazmavér25 rög-specifikus. Ahol X található, ez olyan fibrin/fibrinogén vagy plazmavérrög/plazma hányadost jelent, amelynek értéke az S-2251 vizsgálattal mérve és az V. és VI. táblázat adatai alapján >1,5.

V. táblázat

Az egyláncú rt-PA variánsok fibrin- és plazmavérrögspecifitása (Az aktivitások az eredeti típusú rt-PA-hoz vannak viszonyítva, ahol az eredeti típus 1,0)

	Mutáns	Fg	Fb	Fb/Fg	Pl	PC	PC/P1
Átlag SD	R267A	0,53 (0,00)	0,92 (0,01)	1,74	0,24(0,01)	0,7(0,09)	3,00
Átlag SD	D283A, H287A	0,59 (0,02)	0,78 (0,05)	1,32	0,19(0,07)	0,53 (0,01)	2,76
Átlag SD	K296A, H297A, R298A, R299A	0,29 (0,05)	1,26 (0,02)	4,40	0,14(0,03)	0,42(0,00)	3,00
Átlag SD	H303A, R3O4A	0,68 (0,09)	1,38 (0,09)	2,04	0,35 (0,01)	0,90 (0,03)	2,61
Átlag SD	H331A, H332A	1,19(0,06)	1,29 (0,04)	1,08	1,12(0,13)	1,09 (0,09)	0,97
Átlag SD	R339A, R342A	0,34 (0,00)	0,38 (0,07)	1,12	0,02 (0,03)	0,19(0,03)	9,50
Átlag SD	E347A, E348A, E349A, K351A	0,50 (0,09)	0,87 (0,15)	1,75	0,13 (0,04)	0,38 (0,05)	2,88
Átlag SD	D364A, D365A, D366A	0,66 (0,03)	1,50 (0,04)	2,27	0,28 (0,04)	0,88 (0,03)	3,14
Átlag SD	K416A, H417A, E418A	0,34(0,01)	0,21 (0,04)	0,60	0,10	(0,04)	0,19 (0,05)
Átlag SD	E426A, R427A, K429A, E430A	0,21 (0,01)	0,14(0,00)	0,68	0,07 (0,01)	0,11 (0,01)	1,50
Átlag SD	H432A, R434A	0,16(0,01)	0,16(0,08)	1,00	0,08 (0,01)	0,05 (0,01)	0,60
Átlag SD	R440A	0,62(0,08)	1,02(0,18)	1,64	0,48 (0,04)	0,86(0,10)	1,81
Átlag SD	H445A, R449A	0,52	1,12	2,15	0,24	0,80	3,33
Átlag SD	R449A, D453A	0,58(0,01)	1,16(0,11)	2,00	0,28 (0,01)	0,79 (0,01)	2,87
Átlag SD	D460A, R462A	0,13 (0,03)	0,68 (0,04)	5,19	0,10(0,05)	0,21 (0,01)	2,16
Átlag SD	D477A	0,08 (0,00)	0,09 (0,01)	1,06	0,03 (0,04)	0,11 (0,02)	4,20

Fg = Fibrinogén Fb = Fibrin Pl = Plazma PC = Plazmavérrög SD = Standard deviáció

HU 210 529 A9

VI. táblázat

A kétláncú rt-PA variánsok fibrin- és plazmavérrögspecifitása (Az aktivitások az eredeti típusú rt-PA-hoz vannak viszonyítva, ahol az eredeti típus 1,0)

	Mutáns	Fg	Fb	Fb/Fg	Pl	PC	PC/P1
Átlag SD	R267A	0,85 (0,21)	0,97(0,15)	1,14	0,70(0,08)	0,86(0,11)	1,23
Átlag SD	D283A, H287A	0,77 (0,12)	1,00(0,08)	1,31	0,68(0,14)	0,82 (0,04)	1,19
Átlag SD	K296A, H297A, R298A, R299A	0,31 (0,14)	2,82 (0,32)	9,24	0,24(0,15)	1,29(0,20)	5,50
Átlag SD	E303A, R304A	0,56 (0,23)	2,13(0,29)	3,79	0,26 (0,08)	1,34(0,10)	5,10
Átlag SD	H331A, H332	1,03 (0,86)	2,19 (0,68)	2,12	1,03 (0,67)	1,61 (0,68)	1,56
Átlag SD	R339A, R342A	0,55(0,18)	1,04(0,12)	1,76	0,44(0,11)	0,97(0,10)	3,38
Átlag SD	E347A, E348A, E349A, K351A	0,76 (0,24)	1,33 (0,12)	1,76	0,44 (0,11)	0,97(0,10)	2,20
Átlag SD	D364A, D365A, D366A	0,73(0,17)	1,77 (0,23)	2,44	0,26 (0,12)	1,46(0,15)	5,68
Átlag SD	K416A, H417A, E418A	0,77(0,13)	0,96 (0,09)	1,24	0,42 (0,08)	0,77 (0,05)	1,82
Átlag SD	E426A, R427A, K429A, E430A	0,38 (0,27)	0,76 (0,07)	2,01	0,24 (0,07)	0,66 (0,12)	2,80
Átlag SD	H432A, R434A	0,16(0,05)	0,99(0,13)	6,40	0,16(0,05)	0,38 (0,05)	2,31
Átlag SD	R440A	0,51 (0,11)	0,92(0,10)	1,81	0,51 (0,08)	0,90(0,09)	1,78
Átlag SD	H445A, R449A	0,62(0,16)	1,46 (0,10)	2,36	0,29 (0,09)	1,19(0,11)	4,06
Átlag SD	R449A, D453A	0,74(0,14)	1,50 (0,23)	2,04	0,36(0,12)	1,22(0,13)	3,36
Átlag SD	D460A, R462A	0,18 (0,12)	1,04 (0,08)	5,91	0,12(0,02)	0,32 (0,02)	2,59
Átlag SD	D477A	0,12(0,07)	0,10(0,02)	0,89	0,11 (0,03)	0,25 (0,08)	2,24

VII. táblázat

	Fibrinsepeicifitás	Plazmavérrög-specifitás
Mutáns	Egyláncú	Kétláncú	Egyláncú	Kétláncú
R267A	X		X
D283A, H287A			X
K296A, H297A, R298A, R299A	X	X	X	X
E3O3A, R304A	X	X	X	X
H331A, H332A		X		X
R339A, R342A		X	X	X
E347A, E348A, E349A, K351A	X	X	X	X
D364A, D365A, D366A	X	X	X	X
K416A, H417A, E418A			X	X
E426A, R427A, K429A, E430A		X	X	X
H432A, R434A		X		X
R440A	X	X	X	X
H445A, R449A	X	X	X	X
R449A, D453A	X	X	X	X
D460A, R462A	X	X	X	X
D477A			X	X

HU 210 529 A9

Szoros korreláció van azok között az rt-PA variánsok között, amelyek fibrin- és/vagy plazmavérrögspecifítást mutatnak és azok között, amelyek eleget tesznek a zimogenicitás fentebb meghatározott kritériumának. Ezenkívül két r-tPA variánsról úgy talál- 5 juk, hogy az eredeti típusú rt-PA-hoz viszonyítva ugyan fibrinspecifitást mutat, de mésem zimogén. A

VIII. Táblázat bemutatja a fibrinfajlagos és plazmavérrög-specifíkus variánsokra vonatkozó S—2251 vizsgálati adatokat.

VIII. táblázat

Az rt-PA fibrin- és plazmavérrög-specifikus, nem zimogen variánsai

	Mutáns	Fg egyláncú	Fb egyláncú	Fb/Fg egyláncú	Pl egyláncú	PC egyláncú	PC/PI egyláncú
Átlag SD	E408A	0,35 (0,01)	0,79 (0,06)	2,28	0,19 (0,04)	0,47 (0,01)	2,51
Átlag SD	E410A	0,61 (0,08)	0,90 (0,04)	1,47	0,51 (0,11)	0,74 (0,05)	1,44
	Mutáns	Fg kétláncú	Fb kétláncú	Fb/Fg kétláncú	Pl kétláncú	PC kétláncú	PC/PI kétláncú
Átlag SD	E408A	0,34(0,18)	0,89(0,11)	2,61	0,24 (0,08)	0,64 (0,04)	2,72
Átlag SD	E410A	0,55 (0,13)	0,92(0,13)	1,67	0,48 (0,10)	0,88 (0,08)	1,84

Az anyagok deponálása

Az alábbi törzset deponáltuk az American Type Culture Collectionnél (ATCC; 12 301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland, Amerikai Egyesült Államok):

Törzs	ATCC deponálási szám	A deponálás időpontja
pTPA33-2 E. coli MM294tonA-ban	68.059	1989.07.18.

Ez a deponálás a Budapesti Szerződés előírásai szerint történt (Budapest Treaty on the Recognition of the Deposit of Microorganisms fór the Purpose of Patent Procedure). Ez biztosítja egy élő tenyészet fennmaradását a deponálás dátumától számítva 30 évig. Az organizmust az ATCC a Budapesti Szerződés szabályai szerint bocsátja rendelkezésre és ennek alapján szerződés tárgya a Genentech és az ATCC között, amely szerződés biztosítja a tenyészet leoltott származékainak állandó és korlátlan hozzáférhetőségét a köz számára az idevágó amerikai egyesült államokbeli szaba- 45 dalom megadásától vagy az Amerikai Egyesült Államok vagy más országbeli szabadalmi bejelentés nyilvánosságra jutásától számítva (bármelyik is történik előbb), továbbá biztosítja a tenyészet leoltott származékainak hozzáférhetőségét mindazok számára, akikat er- 50 re az Amerikai Egyesült Államok Szabadalmi és Védjegy Hivatala felhatalmaz az Amerikai Egyesült Államok Szabadalmi törvénye (CFR) 35. pontjának 122.

§-a alapján, valamint az idevonatkozó szabadalmi vozsgálói rendszabályok alapján (CFR 37. pont 1.14, 55 különös tekintettel a 886 OG 638 rendeletre).

A jelen találmány bejelentője vállalja, hogy ha a deponált tenyészet kipusztulna, elveszne vagy elpusztulna annak ellenére, hogy megfelelő körülmények között történt a tenyésztés, akkor azonnal pótolja azt 60 annak igazolásával együtt, hogy az élő tenyészet ugyanaz, mint az eredeti volt. Az a tény viszont, hogy a deponált törzs rendelkezésre áll, senkit sem jogosít fel arra, hogy a találmány szerinti eljárást gyakorlatba vegye, mert ilyen esetben megsérti azokat a jogokat, amelyeket szabadalmi törvénye alapján minden kormány biztosít.

Az előző leírás a területen jártas szakember számára elegendő ismeretet nyújt a találmány gyakorlati megvalósításához. A jelen találmány nem korlátozódik a deponált konstrukcióra; a deponált konstrukció csak a találmány egyik tárgyának illusztrációjára szolgál. Bármely, az előbbivel funkcionálisan ekvivalens megoldás a találmány oltalmi körébe tartozik. Az anyag letétbe helyezése nem jelent semmiféle korlátozást arra nézve, hogy a leírás alapján a találmány bármely további tárgya gyakorlatban megvalósítható; a deponálás a találmány - szabadalmi igénypontok által megszabott - oltalmi körének korlátozását sem jelenti. A szakember számára számos különféle módosításra nyílik lehetőség, amelyek azonban az előző leírás és a mellékelt szabadalmi igénypontok alapján meghatározott oltalmi körbe esnek.

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Humán szöveti plazminogén aktivátor - t-PA -

Claims

SZABADALMI IGÉNYPONTOK

1. Humán szöveti plazminogén aktivátor - t-PA variáns, amely a megfelelő eredeti típusú t-PA 305. helyzetében egy fenil-alanintól eltérő aminosavat tartalmaz behelyettesítve; ahol a variáns a megfelelő eredeti típusú t-PA-hoz viszonyítva zimogén.

2. Az 1. igénypont szerinti variáns, ahol az aminosav egy olyan oldallánccal rendelkezik, amely hidrogénkötés-donorként működik vagy hidrogénkötés-donorként képes működni.

3. A 2. igénypont szerinti variáns, ahol az aminosav hisztidin, tirozin, aszparagin, lizin, arginin vagy glutamin.

HU 210 529 A9

4. A 3. igénypont szerinti variáns, ahol az aminosav hisztidin.

5. A következő csoportbeli humán t-PA variáns egyike: F305H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; Í304H t-PA; Í304T t-PA; Ϊ304Ν t-PA; Í304K t-PA; Í304R t-PA; Í3O4Q t-PA; i304HHt-PA; Í305H t-PA; Ϊ305Τ t-PA; Í305N t-PA; Í305K t-PA; Í305R t-PA; Í305Q t-PA; i304H,i305H t-PA; Í305HH t-PA; d297 t-PA; d298 tPA; d299 t-PA; d300 t-PA; d301 t-PA; d302 t-PA; d303 t-PA; d304 t-PA; d305 t-PA; d297-298 t-PA; d297-299 t-PA; d297-300 t-PA; d297-301 t-PA; 0297-302 t-PA; d297-303 t-PA; d297-304 t-PA; d297-305 t-PA;

d300-301 t-PA; d300-302 t-PA; d300-303 t-PA;

Ő3OO-3O4 t-PA; d300-305 t-PA; d304-305 t-PA;

d297,d300 t-PA;

d297, d305 t-PA; dl-44, N184D, F305H t-PA; dl-44, F305H t-PA;

dl-44,I210R, G211A, K212R,V213R, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211A, K212R.V213K, F305H t-PA; dl-44,V213K, F305H t-PA; dl-44, T252R, F305H t-PA; dl-44, V213K, T252R, F305H t-PA; dl-44, I210K, F305H t-PA; dl-44, I210R, G211H, K212Q.V213K, F3O5H t-PA; I210R, G211H, K212Q, V213K, F305H t-PA;

I21OR, G211A, K212R,V213R, F305H t-PA; dl-44,N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; NI B4D, I210R, G211A, K212R.V213R, T252R, F305H t-PA;

d92-179, F305H t-PA; d92-179,1210R, G211A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; d92-179,1210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; Y67N, F305H t-PA; dl-44, Y67N, F305H t-PA; ahol a variáns a megfelelő eredeti típusú t-PA-hoz viszonyítva zimogén.

6. A következő csoportbeli humán t-PA variáns egyike: F3O5H t-PA; F305T t-PA; F305N t-PA; F305K t-PA; F305R t-PA; F305Q t-PA; Í304 H t-PA; dl44,F305H t-PA; d92-179, F305H t-PA; dl-44,N1B4D,

F305H t-PA;

dl-44, I210R, G211A, K212R, T213R, F305H t-PA; dl-44,1210R, G21A, K212R, V213K, F305H t-PA; I21OR, G21A, K212R, V213R, F305H t-PA; d92-179, I210R, G211A, K212R, V213R, F305H tPA d92-179, N184D, I210R, G211R, K212R, V213R, F305N t-PA; d92-179,N184D, I210R, G21 IA, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; dl-44, N184D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; valamint N184 D, I210R, G211A, K212R, V213R, T252R, F305H t-PA; ahol a variáns a megfelelő eredeti típusú t-PA-hoz viszonyítva zimogén.

7. Humán t-PA variáns, amely az R267A t-PA; D283A, H287A t-PA; R339A, R342A t-PA; E347A, E348A, E349A, K351At-PA; D364A, D365A, D366A t-PA; E408A t-PA; E410A t-PA; K416A, H417A, E41BA t-PA; E426A, R427A, K429A, E430A t-PA; H432A, R434A t-PA; R440A t-PA; H445A, R449A t-PA R449A D453A t-PA; D460A, R462A t-PA vagy a D477A t-PA; ahol a variáns a megfelelő eredeti típusú t-PA-hoz viszonyítva képes a következő biológiai aktivitások közül egyet vagy többet mutatni: zimogén aktivitás, fibrinfajlagosság vagy plazmavérrög-specifitás.

8. Eljárás zimogén tulajdonsággal rendelkező humán szöveti plazminogén aktivátor azonosítására, azzal jellemezve, hogy

a) a megfelelő eredeti t-Pa 305 helyzetébe fenil-alanintól eltérő aminosavat helyettesítünk, és

b) a kapott humán t-Pa variánst zimogén jelleg szempontjából szkrineljük.

9. A 8. igénypont szerinti eljárás azzal jellemezve, hogy a fenil-alanin gyököt hisztidin gyökkel helyettesítjük.

10. Egy az 1. igénypont szerinti variánst kódoló DNS-szekvencia.

11. Egy a 7. igénypont szerinti variánst kódoló DNS-szekvencia.

HU 210 529 A9 Int. Cl.⁶: C 12 N 9/50