FI101306B - Menetelmä kudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin analogien, joissa on muokatut kasvutekijädomeenit, valmistamiseksi - Google Patents

Description

101306

Menetelmä kudostyyppisen plasminogeenlaktivaattorin analogien, joissa on muokatut kasvutekijädomeenit, valmistamiseksi Tämä keksintö kohdistuu fibrinolyyttisiin aineisiin, menetelmiin niiden tuottamiseksi sekä niitä sisältäviin farmaseuttisiin valmisteisiin. Keksintö kohdistuu erityisemmin kudos-tyyppisen plasminogeeniaktivaattorin analogeihin, joissa on muokattu kasvutekij ädomeeni.

Verenvuodon tyrehtyminen (hemostasis) on seurausta lukuisten entsyymien mutkikkaasta yhteisvaikutuksesta. Hyydyttävät tekijät ovat keskenään vuorovaikutuksessa toisiaan kaskadimaisesti seuraavissa aktivointivaiheissa, jotka lopulta johtavat fib-riinihyytymän muodos tiimi seen. Tämän jälkeen tapahtuva fibrii-nihyytymän hajoaminen johtuu fibrinolyyttisestä järjestelmästä, joka käsittää seriiniproteaasina plasmiinin. Plasmiini on fib-riiniä pilkkova proteolyyttinen entsyymi ja se on laajaspektri-nen proteaasi, joka pilkkoo myös tiettyjä hyytymistekijöitä ne täten aktivoiden. Plasmiinin muodostumista sen inaktiivisesta esiasteesta, plasminogeenista, välittää kudostyyppinen plas-minogeeniaktivaattori, joka on fibriinille spesifinen seriini-proteaasi, ja jonka uskotaan olevan plasminogeenin fysiologinen aktivaattori verisuonissa. Urokinaasityyppinen plasminogeeni-aktivaattori (u-PA) on toinen seriiniproteaaseiksi luonnehdittujen plasminogeeniaktivaattoreiden luokkaan kuuluva jäsen, t-PA ja u-PA eroavat toisistaan sekä toiminnallisesti että immu-nologisesti. Mikäli normaali hemostaattinen järjestelmä järkkyy, niin hyytymiä voi muodostua sopimattomina aikoina ja sopimattomissa paikoissa, johtaen sydänlihaksen infarktiin, syvä-laskimoiden tukokseen, keuhkoveritulppaan ja aivohalvaukseen. Näiden tilojen aiheuttamat kudosvauriot voivat johtaa kuolemaan tai vakavaan vammautumiseen.

t-PA kiertää normaalisti yhtenä polypeptidiketjuna, jonka Mr on noin 72 000 daltonia, ja joka muuttuu kaksiketjuiseen muotoon aminohappojen 275 (Arg) ja 276 (Ile) välisen peptidisidok-sen katketessa. t-PA:n raskas ketju (kaksi muunnosta, joiden Mr 2 101306 on joko 40 000 tai 37 000) on peräisin t-PA-molekyylin amino-päätteestä, kun taas kevyt ketju (Mr = 33 000) on peräisin t-PA-molekyylin karboksipäätteestä. Tätä pilkkoutumista katalysoi trypsiini tai plasmiini, ja siihen liittyy aktiivisuuden suureneminen mitattuna synteettisiä substraatteja käyttäen, sekä fibrinolyyttisen aktiivisuuden suureneminen. Yksiketjuinen t-PA muuttuu aktiiviseksi sen sitoutuessa fibriiniin, mikä johtuu luultavasti fibriiniin sitoutumisen indusoimasta konformaation muuttumisesta aktivaattorissa. Pilkkoutumiseen, joka johtaa kaksiketjuiseen muotoon, voi liittyä t-PA:n nopea katoaminen verivirrasta, mutta asiasta on myös julkaistu toista mieltä olevia artikkeleita (katso Wallen et ai., Eur. J._Bi or.hpm. 132: 681-686, 1983), ja katoamismekanismi tunnetaan huonosti.

t-PA-proteiinin mahdollisesta esiasteesta on tehty kaksiulotteinen malli (Ny et ai., Pror. Natl . Ar-.ari- Sri . TTSA fLL: 5355-5359, 1984). Tämän mallin perusteella määritettiin, että raskas ketju sisältää kaksi kolminkertaista disulfidirakennetta, jotka tunnetaan nimellä "kringle". Samanlaisia kringle-rakenteita esiintyy myös protrombiinissa, plasminogeenissa ja urokinaa-sissa, ja niiden uskotaan olevan tärkeitä fibriinin sitoutumisessa (Ny et ai., edellä). Uskotaan, että t-PA:n toisella kringle-rakenteella (K2) on suurempi fibriiniin kohdistuva affiniteetti kuin ensimmäisellä kringle-rakenteella (Kl) (Ichinose, Takio ja Fujikawa, J. Hin. Invpst.. 2£: 163-169, 1986; Verheijen et ai., RMBO J. 5: 3525-3530, 1986).

Tämän lisäksi t-PA:n raskas ketju sisältää "kasvutekijä"domee-nin, joka on kolminkertaisesti disulfidisitoutunut rakenne, ja joka on osittain homologinen orvaskeden kasvutekijän sekä proteiinissa C, tekijässä VII, tekijässä IX ja tekijässä X läsnä v olevien samankaltaisten domeenien kanssa. Luonnollisen t-PA:n kasvutekijädomeeniin kuuluvat arviolta aminohapot 48-90. On todettu, että kasvutekijädomeeni osallistuu t-PA:n nopeaan katoamiseen -in vivn, ja että kasvutekijädomeenin häviämä ei estä tuloksena olevan molekyylin sitoutumista fibriiniin eikä salpaa ·; sen kykyä aktivoida plasminogeeni.

3 101306 t-PA:n raskas ketju sisältää myös "sormi"domeenin, joka on homologinen fibronektiinin sormidomeenin kanssa. Fibronektiinillä on monia erilaisia biologisia aktiivisuuksia, mukaan lukien fibrii-nin sitominen; sen fibriiniä sitova aktiivisuus on saatu yhdistetyksi neljään tai viiteen sen yhdeksästä sormidomeenista.

t-PA:n kevyt ketju sisältää aktiivisen kohdan seriiniproteaasin aktiivisuutta varten (seriiniproteaasidomeeni), joka aktiivinen kohta on erittäin homologinen muiden seriiniproteaasien aktiivisten kohtien kanssa.

t-PA:n esiastemuoto käsittää lisäksi pre-alueen ja sen suhteen alavirran puolella pro-alueen, joita kutsutan yhdessä "pre-pro"-alueeksi. Pre-alue sisältää signaalipeptidin, joka on tärkeä t-PA:n erittymiselle verisuonten endoteelisoluista (Ny et ai., edellä). Oletetaan, että pre-ketju saa aikaan t-PA:n erittymisen endoplasmisen reticulumin onteloon, mikä on välttämätön vaihe solun ulkopuolisessa erittymisessä. Oletetaan, että pro-ketju pilkkoutuu irti t-PA-molekyylistä endoplasmisesta reticu-lumista Golgin laitteeseen kulkeutumisen jälkeen.

t-PA:n käyttö fibrinolyysiä varten eläin- ja ihmiskohteissa on tehnyt selväksi sen, että luonnollisella molekyylillä on useita puutteita. t-PA:n puoliintumisajan in vivn on osoitettu olevan niinkin lyhyt kuin kolme minuuttia ihmisissä (Nilsson et ai.,

Scand__Hapmat.nl . .13.: 49-53, 1984) . Maksa poistaa injektoidun t-PA:n nopeasti, ja 30 minuutin kuluessa suurin osa materiaalista metaboloituu muotoihin, joilla on pieni molekyylipaino. Tämä lyhyt puoliintumisaika voi johtaa siihen, että on välttämätöntä käyttää suuria lääkitseviä annoksia. Luonnollista t-PA:ta annetaan tyypillisesti 30 - 150 mg:n suuruisena annoksena potilasta kohden ja tämän proteiinin niukkaliukoisuus tekee välttämättömäksi pitkän infuusion. Julkaisussa Fuchs et ai., Blnnd £5: 539-544, 1985, päätellään, että maksa poistaa infusoidun t-PA:n pro-teolyyttisestä kohdasta riippumattomalla menetelmällä, ja että infusoitu t-PA ei keräänny elimistöön, toisin sanoen poistomeka-; nismi ei voi saavuttaa kylläistä tilaa. Lisäksi sepelvaltimoiden tukoksien hajottamiseen riittävät t-PA-annokset ovat huomattavasti normaalia fysiologista tasoa suuremmat, ja ne voivat ai 4 101306 heuttaa plasminogeenin aktivoitumista kaikkialla elimistössä, mikä johtaa fibrinogeenin systeemiseen hajoamiseen (Sherry, edellä) ja edelleen vaarallisiin verenvuotoihin.

Lukuisat tutkijat ovat muokanneet t-PA:ta sen kliinisen käyttökelpoisuuden parantamiseksi. Rosa ja Rosa (kansainvälinen patenttihakemus WO 86/01538) muokkasivat t-PA:n asemassa 277 sijaitsevaa Lys-jäännöstä t-PA:n yksiketjuisen muodon stabiloi-miseksi. E. eoli :saa tuotettu Ile (277) t-PA todettiin vähemmän aktiiviseksi yksiketjuisena molekyylinä luonnolliseen t-PA:han verrattuna. Wallen et ai. (edellä) esittivät, että tämä lysii-nijäännös voi saada aikaan yksiketjuisen t-PA:n proteolyyttisen aktiivisuuden. Heyneker ja Vehar (julkaistu brittiläinen patenttihakemus 2 173 804) esittävät aminohappojen korvaamisen t-PA:n pilkkoutumiskohdan ympärillä. t-PA-muunnoksen, joka käsitti Glu-jääännöksen asemassa 275, ominaisaktiivisuus osoitettiin suuremmaksi luonnolliseen t-PA:han verrattuna. Samoin tämä t-PA-muunnos muodosti vähemmän komplekseja t-PA-inhibiittorin kanssa. Samoin julkaisussa osoitettiin, että yksiketjuisen muodon fibriiniin kohdistuva affiniteetti oli suurempi kuin kaksi-ketjuisella muodolla. Robinson (W0 84/01786) käytti entsymaat-tisia menetelmiä hiilihydraattisivuketjujen poistamiseksi t-PA:sta puoliintumisajan pidentämiseksi plasmassa. Julkaisussa Lau et ai., R-i o/T^chnology 5.: 953, 19 87, kuvataan t - PA-muunnos, josta puuttuu hiilihydraatti asemasta 451. Van Zonneveld et ai., (Prnr. NaM . Acad. Soi. TTS A £2: 4670-4674, 1986) ovat julkaisseet t-PA:n muokattuja muotoja, joissa raskaan ketjun osia on hävitetty. Robinson et ai. (EP 207 589 AI) ovat julkaisseet t-PA:n mutanttimuotoja, joissa kasvutekijädomeeni on hävitetty tai sitä on muokattu muulla tavalla. Larsen et ai. (W0 87/04722) ovat julkaisseet t-PA:n kaltaisia proteiineja, jotka käsittävät aminohappojen korvauksia ja/tai häviämiä. Julkaisussa Ehrlich et ai., Fibrinnlysi s 1:75, 1987, kuvataan yhdistelmä- t-PA-molekyyli, josta puuttuvat kringle-domeenit. Näillä t-PA:n muunnosmuodoilla ei saada kuitenkaan ratkaistuksi täysin luonnolliseen proteiiniin liittyviä ongelmia.

5 101306 Näin ollen alalla on edelleenkin olemassa tarve saada aikaan plasminogeenia aktivoiva proteiini, jolla on pitkä puoliintumisaika ja jonka fibriiniin kohdistuva spesifisyys on suuri. Oheinen keksintö tyydyttää tämän tarpeen saamalla aikaan kudos -tyyppisen plasminogeeniaktivaattorin uusia johdannaisia, joissa kasvutekijäalueen rakennetta on muutettu. Ohessa kuvatuilla t-PA-analogeilla on merkittäviä etuja luonnolliseen t-PA:han verrattuna lääkitsevinä fibrinolyyttisinä aineina käytettäessä, koska niitä voidaan käyttää paljon pienempinä annoksina, jolloin vältytään luonnollisen t-PA:n niukkaliukoisuudesta aiheutuvat ongelmat, ja koska näin ollen niitä voidaan antaa mahdollisesti injektoimalla infuusion sijasta. Yhdistelmä-DNA-tekniikkaa käyttämällä käyttöön saadaan näiden proteiinien muuttumaton ja homogeeninen lähde. Näitä proteiineja voidaan käyttää jo olemassa olevien hyytymien hajottamiseen sydänkohtauksen tai aivohalvauksen uhreissa sekä muissa kohteissa, joissa fibriini-matriisien hajottaminen tai niiden muodostumisen tukahduttaminen on lääkinnällisesti toivottavaa.

Lyhyesti esittäen, oheinen keksintö kohdistuu kudostyyppisen plasminogeeniaktivaattorin analogeihin, jotka sisältävät luonnollisen t-PA:n kasvutekijädomeenin, jossa domeenissa vähintään yksi kysteiinijäännös on korvattu toisella aminohapolla. Oheisen keksinnön valittujen suoritusmuotojen mukaisesti tämä kysteiini jäännös on luonnollisen t-PA:n jäännös no. 84 ja mainittu aminohappo on seriini tai alaniini. Erään erityisen edullisen suoritusmuodon mukaisesti tämä kysteiinijäännös on luonnollisen t-PA:n jäännös no. 84 ja aminohappo on seriini.

Keksinnön toinen piirre kohdistuu plasminogeeniaktivaattoriin, • joka käsittää kasvutekijädomeenin, kringle-domeenin sekä se- riiniproteaasidomeenin, mainitun kasvutekijädomeenin sisältäessä olennaisesti peräkkäisten aminohappojen lukuisia korvauksia luonnollisen t-PA:n kasvutekijädomeeniin verrattuna, näiden korvausten johtaessa puoliintumisajan pitenemiseen plasmassa.

Keksinnön oleelliset tunnusmerkit on esitetty oheisissa patenttivaatimuksissa .

6 101306

Oheisen keksinnön tavoitteita varten käsite "lukuisia korvauksia" määritellään neljäksi tai useammaksi korvaukseksi. Näitä olennaisesti peräkkäisten aminohappojen korvauksia voidaan tehdä kasvutekijädomeenin useammassa kuin yhdessä alueessa. Kasvutekijädomeeni voi käsittää proteiinin, kuten tekijän VII, tekijän IX, proteiinin C tai orvaskeden kasvutekijän, amino-happoketjun. Edullisten suoritusmuotojen mukaisesti kasvuteki-jädomeeni käsittää minkä tahansa kuviossa 8 esitetyn kappaleen kasvuteki jädomeeni n ami nohappoketjun.

Ohessa kuvatut t-PA-analogit ja plasminogeeniaktivaattorit voivat sisältää lisäksi vähintään yhden aminohapon korvauksen 13 aminohappojäännöksen sisällä pi 1kkoutumiskohdasta, jonka korvautumisen seurauksena kyky vastustaa plasmiinin aiheuttamaa pilkkoutumista on suurentunut. Lisäksi ohessa kuvatut t-PA-analogi t voivat sisältää sormidomeenin, jonka aminohappoketju valitaan kuviossa 10(A) - (I) esitettyjen ketjujen joukosta.

Oheisen keksinnön muiden piirteiden mukaisesti mainittu analogi tai plasminogeeniaktivaattori sisältää kaksi kringle-rakennet-ta, joista vähintään toisesta puuttuu hiilihydraatti. Tämän lisäksi ohessa kuvatut analogit ja plasminogeeniaktivaattorit voivat sisältää plasminogeenista peräisin olevan kringle-ra-kenteen. Edullisten suoritusmuotojen mukaisesti plasminogeenin kringl e-rakenne on valittu plasminogeenin K1-, K4- ja K5-kring-le-domeenien joukosta. Plasminogeenin kringle-rakenteen lisäksi t-PA-analogit ja plasminogeeniaktivaattorit voivat sisältää edelleen luonnollisen t-PA:n K2-kringle—rakenteen sijoittuneena alavirran puolelle plasminogeenin kringle-rakenteeseen nähden.

Keksinnön toisen samankaltai sen piirteen mukaisesti, ja kuten [ edellä esitetään, t-PA-analogit sisältävät proteiinin C, teki jän VII, tekijän IX ja tekijän X joukosta valitun proteiinin kasvutekijäalueen. Nämä analogit voivat lisäksi sisältää edellä kuvattuja korvauksia ja muita muunnoksia.

Ohessa kuvataan samoin DNA-ketjut, joihin edellä kuvatut t— PA—analogit ja plasminogeeniaktivaattorit ovat koodautuneet, 7 101306 sekä tällaisia DNA—ketjuja sisältävät iImentämisvektorit. Tässä mielessä edullisia ilmentämisvektoreita ovat Zem99—9100 tai Zem99—9200.

Ohessa kuvataan myös isäntäsolut, jotka on trans-fektoi tu tai transformoitu tällaisella ilmentämisvektori1la. Isäntäsolu voi olla E. coli—solu tai nisäkässolu, kuten BHK-solu.

Edelleen, keksinnön eräs muu piirre kohdistuu -farmaseuttisiin valmisteisiin, jotka käsittävät edellä kuvattua t-PA—analogia tai plasminogeeniaktivaattoria sekä -fysiologisesti hyväksyttävää kantajaa tai laimenninta.

Nämä ja keksinnön muut piirteet ovat ilmeisiä seuraavan yksityiskohtaisen kuvauksen ja liitteenä olevien piirrustusten perusteella.

Kuvio 1 esittää pre-pro t-PA:ta koodaavaa ketjua, joka on muodostettu cDNA:sta ja syntetoiduista oligonukleotideistä, sekä koodautuneen proteiinin aminohappoketjua. Rivien yläpuolella olevat numerot tarkoittavat nukleotidiasemia ja rivien alapuolella olevat numerot tarkoittavat aminohappoasemia.

Kuvio 2 esittää vektorin Zem99 muodostamista.

Kuvio 3 esittää vektoreiden Zem219b ja Zem219c muodostamista. Kuvio 4 esittää vektoreiden Zem99-9100 j Zem99-9200 muodostamista.

Kuvio 5 esittää mutantti-DNA-ketjun nukleotidijärjestystä vektorissa Zem99-9100 sekä koodautuneen t-PA-analogin aminohappo-järjestystä. Numerot tarkoittavat aminohappoasemia.

Kuvio 6 esittää mutantti-DNA-ketjun nukleotidi järjestystä vektorissa Zem99-9200 sekä koodautuneen t-PA-analogin aminohappo-järjestystä.

Kuvio 7 esittää vektoreiden ZpL5 ja ZpL7 muodostamista.

Kuvio 8 esittää tiettyjä korvauksia kasvutekijädomeenin ketjussa sekä näitä kimeerisiä domeeneja koodaavien oligonukleo-tidien yhdistelmiä.

Kuvio 9 esittää plasminogeeniaktivaattoreita, joiden aktivoi-tumiskohta on muuttunut, koodaavia DNA—ketjuja käsittävien 8 101306 i1mentämsvektoreiden pMH-sarjan muodostamista.

Kuvio 10(A)-(I) esittää aminohappojärjestystä luonnollisen t-PA:n sormidomeenissa ja yhtäpitävissä sormidomeeneissa.

Kuvio 11 esittää aminohappoketjua ja DNA-ketjua plasminogeenin Kl-domeenin tapauksessa.

Kuvio 12 esittää plasminogeenin Kl-domeenin osia koodaavien kloonien no. 1-3 ja no. 8-5 osittaisia restriktiokarttoja.

Kuvio 13 esittää plasmidin pPKA muodostamista.

Kuvio 14 esittää vektorin, joka sisältää plasminogeenin Kl-domeenia koodaavan ketjun, muodostamista.

Kuvio 15 esittää plasmidin Zem99-2020 muodostamista.

Kuvio 16 esittää plasmidien Zem99—8000 ja Zem99—8100 muodosta-mi sta.

Kuviot 17 ja 18 esittävät edustaviin t-PA-analogeihin liittyviä cDNA-ketjuja ja aminohappoketjuja.

Kuvio 19 esittää tuloksia, jotka saatiin hyytymän hajoamista selvittävissä kokeissa luonnollisella t-PA:lla ja oheisen keksinnön mukaisilla edustavilla t-PA-analogeilla. ( ) tarkoittaa luonnollista t—PA:ta, (----) tarkoittaa analogia no. 9100 ja (-—-) tarkoittaa analogia no. 9200.

Kuvio 20 on käyrä, jossa plasmataso on esitetty ajan -Funktiona luonnollisen t—PA:n ja edustavan t—PA—analogin tapauksessa rotille annettuina. Käytetyt symbolit ovat: O, analogi 9100; , analogi 9200; ja O, luonnollinen t—PA.

Kuvio 21 esittää tuloksia, jotka saatiin selvitettäessä luonnollisen t—PA:n ja kolmen edustavan mutantti—t—PA:n puoliintu— misaikoja plasmassa.

Kuvioissa 22A, B ja C verrataan toisiinsa aminohappojärjestyk-siä erilaisten valittujen proteiinien kasvutekijädomeeneissa. Nämä ketjut on tunnistettu seuraavasti: TPA luonnollinen kudos-tyyppi nen plasminogeeniaktivaattori; Urok urokinaasi; F7 tekijä | VII; F9 tekijä IX, F10 tekijä X; PS proteiini S; PZ proteiini Z; EGF orvaskeden kasvutekijä; TGFa transformoiva kasvutekijä alfa; TGFTr transformoiva kasvutekijä, tyyppi 1 (rotta); C9 kömpiementtitekijä 9; LDLr pienitiheyksisen 1ipoproteiinin vastaanottaja; EGFr EGF-vastaanottaja; PC proteiini C. Muut merkinnät ovat: H ihminen; p sika; M hiiri; B nauta; ja RB kaniini. Tekijöiden VII, IX, X ja proteiinien C, S ja Z tapauk 9 101306 sessa numerot ja isot kirjaimet viittaavat geenieksoneihin. EGF-vastaanottajan ja LDL—vastaanottajan tapauksessa, vastaavasti, numerot ja isot kirjaimet osoittavat erityisen kasvu-tekijädomeenin. Esimerkiksi PC 4h on ihmisen proteiinin C neljännen eksonin kasvutekijädomeeni; LDLrBrb on kasvutekijädo— meeni B kaniinin pieni tiheyksisen 1ipoproteiinin vastaanottajassa. Välejä (-) on sisällytetty ketjuihin homologian maksimoimiseksi proteiinien keskuudessa. Aminohapot on esitetty tavanomaisilla yhden kirjaimen koodeilla.

Seuraavassa esitetään tiettyjen, ohessa käytettyjen käsitteiden määritelmät ennen keksinnön kuvaamista, sen ymmärtämisen helpottamiseksi .

Täydentävä vastin-DNA tai cDNA; DNA-molekyyli tai —ketju, joka on syntetoitu entsymaattisesti mRNA-mal1ineessa läsnäolevista ketjuista, tai tällaisen molekyylin klooni.

DNA-muodostei Joko yksi- tai kaksijuosteinen DNA—molekyyli tai tällaisen molekyylin klooni, jota on muokattu keinotekoisesti siten, että se sisältää DNA-segmenttejä yhdistettynä ja sijoitettuna tavalla, jota ei muuten esiintyisi luonnossa. Plasmidi tai vektori: DNA-muodoste, jonka sisältämä geneettinen informaatio saa aikaan muodosteen repiikoitumisen isäntäsoluun istutettuna. Repiikoituminen voi olla autonomista tai se voidaan saada aikaan isäntägenomiin yhtenäistämällä. Plasmidi sisältää tavallisesti vähintään yhden isäntäsolussa ilmennettävän geeni ketjun sekä tällaista geeni-ilmentymistä helpottavia toimintoja koodaavia ketjuja, kuten promoottorei ta, kopioi tuulisen käynnistymiskohtia ja kopioitumisen päättäjiä. Se voi olla lineaarinen molekyyli tai sulkeutunut, rengasmainen molekyyli. Pre—nro-alue: Aminohappoketju, joka esiintyy tavallisesti tiettyjen proteiinien esiasteiden aminopäätteessä, ja joka tavaili— [ eesti pilkkoutuu ainakin osittain irti proteiinista erittymisen aikana. Pre-pro-alue käsittää osittain ketjuja, jotka ohjaavat proteiinin solussa erittymisreiti 1le, ja se sisältää yleensä alueen, jossa on runsaasti hydrofobisia aminohappoja.

Domeeni: Proteiinimolekyylissä aminohappojen kolmiulotteinen, itsestään kerääntyvä kokonaisuus, joka sisältää tämän proteiinin spesifiselle biologiselle aktiivisuudelle välttämättömiä 101306 ΙΟ rakenne—elementtejä.

Biologinen aktiivisuusi Molekyylin toteuttama toiminto tai toimintojoukko biologisessa yhteydessä (eli elimistössä, solussa tai sen in vitro-jäijitelmässä). Proteiinien biologiset aktiivisuudet voidaan jakaa katalyyttisiin ja vaikuttaviin aktiivisuuksiin. Fibrinolyyttisten aineiden katalyyttiset aktiivisuudet käsittävät usein muiden proteiinien aktivointia esiasteiden spesifisen pilkkoutumisen seurauksena. Sitä vastoin vaikuttavat aktiivisuudet käsittävät biologisesti aktiivisen molekyylin spesifisen sitoutumisen muihin molekyyleihin, kuten fibriiniin, tai soluihin. Vaikuttava aktiivisuus lisää tavallisesti katalyyttistä aktiivisuutta, tai on sille olennaista, fysiologisissa olosuhteissa. Eräissä tapauksissa katalyyttinen ja vaikuttava aktiivisuus voivat sisältyä proteiinin samaan domeeniin. Plasminogeeniaktivaattoreiden tapauksessa biologisen aktiivisuuden tunnusomaisena piirteenä on pro—entsyymin tai plasminogeeni—zymogeenin muuttuminen plasmiiniksi, joka puolestaan hajottaa fibriinimatriiseja. Koska fibriini toimii kofak-torina, kun t-PA aktivoi plasminogeenin, niin yksi ketjuisei 1 a t-PA:lla on suhteellisen vähän aktiivisuutta fibriinin puuttuessa.

Plasminogeeniaktivaattori: Proteiini, joka kykenee muuntamaan proentsyymin, eli plasminogeenin, plasmiiniksi fibriinin läsnä-ol1essa.

Luonnollinen t-PA: Proteiini, jolla on ihmisen melanoomasoluis-ta eristetyn kudostyyppi sen plasminogeeniaktivaattorin rakenne ja biologinen aktiivisuus (katso EP 0041766 A2). Luonnollisella t-PA:11a on melanoomasoluista saadun t-PAsn aminohappoketju tai se voi sisältää tässä ketjussa vähäisiä muunnoksia. Tällaiset muunnokset, joiden syynä on esimerkiksi geneettinen polymorfismi, eivät muuta olennaisesti proteiinin rakennetta tai aktiivisuutta. Luonnollisen t-PA:n biologisen aktiivisuuden tunnusomaisena piirteenä on pro-entsyymin tai zymogeenin, eli plasminogeenin, muuttuminen plasmiiniksi, joka puolestaan hajottaa fibriinimatriiseja. Luonnollista t-PA:ta voidaan eristää soluista, jotka tuottavat sitä luonnollisesti, tai sitä voidaan eristää yhdistelmäsoluista, jotka on transfektoitu tai transformoitu luonnollista t-PA:ta koodaavalla DNA-ketjul1 a. Kuvio 11 101306 1 esittää edustavan luonnollisen t-PA:n aminohappoketjua. t—PA-analoai: Proteiini, jolla on plasminogeeniaktivaattoreiden edellä määritelty tunnusomainen biologinen aktiivisuus, ja joiden tunnusomaisena piirteenä on lisäksi aminohappoketjussa läsnäoleva spesifinen, keinotekoisesti indusoitu mutaatio.

Sitä DNA-ketjua, johon t-PA-analogi on koodautunut, kutsutaan "mutantti—DNA—ketjuksi", ja se on tavallisesti cDNAsna. Käsite "spesifinen, keinotekoisesti indusoitu mutaatio" kattaa häviä-mät, istutteet sekä korvautumiset aminohappoketjussa, jotka on voitu saada aikaan manipuloimalla kloonattua DNA-ketjua. t-PA-analogien biologinen aktiivisuus on tavallisesti muuttunut mitattavassa määrässä luonnollisen t-PA:n aktiivisuudesta. Puoliintumisaika plasmassa: Se ajanjakso, jonka kuluessa 50 V. aineesta poistuu tai inaktivoituu emäimen veri virrassa. t-PA:n tapauksessa puoliintumisaika plasmassa mitataan seuraamalla t—PA:n katoamista koe—eläimen, kuten rotan, verivirrasta käyttäen esimerkiksi entsyymiin kytkettyyn immunosorbenttiin perustuvaa menetelmää (ELISA).

Kuten edellä mainittiin, ihmisen t-PA on 72 000 daltonin proteiini, joka voi esiintyä kaksi ketjuisessa muodossa. Tämä proteiini sisältää lukuisia rakenteel1 isiä domeeneja, jotka myötävaikuttavat toisistaan riippumatta sekä yhdessä proteiinin biologiseen aktiivisuuteen. Yhtä näistä domeeneista kutsutaan "kasvutekijädomeeniksi" (seuraavassa "KT-domeeni") johtuen sen homologiasta orvaskeden kasvutekijän kanssa (OKT). Koko täysin kehittynyt proteiini sisältää 35 kysteiinijäännöstä, joista 34 osallistuu ketjun välisiin tai ketjun sisäisiin di-sulfidisidoksiin (Ny et ai., edellä). Seitsemän näistä kysteii— neistä sijaitsee KT-domeenissa ja ne ovat järjestäytyneet kolmeksi disulfidisidokseksi, seitsemännen kysteiinin jäädessä ilman paria.

Samoin kuten edellä esitettiin, KT-domeeni on syynä tiettyihin rajoituksiin käytettäessä luonnollista t-PA:ta farmaseuttisena aineena. Oheisen keksinnön puitteissa suoritetuista tutkimuksista saadut tiedot osoittavat, että KT-domeeni voi olla osittain syynä t-PA:n nopeaan katoamiseen verivirrasta. Lisäksi 12 101306 vapaan sulfhydryyl iryhmän läsnäolo KT—domeenissa saattaa de-stabiloida proteiinin. Yleensä, liuoksessa olevien proteiinien vapaat sul f hydryyl i ryhmät pyrkivät hapettumaan spontaanisti ja ne voivat myös muodostaa molekyylien välisiä disulfidisi1-toja, mikä johtaa proteiinien kasautumiseen. Mikäli vapaan sul -f hydryyl i ryhmän käsittävää proteiinia käytetään farmaseuttisena aineena, niin nämä vapaiden sulfhydryyliryhmien aiheuttamat muutokset fysiokemial1 isissä ominaisuuksissa voivat muuttaa proteiinin immunogeenisia tai antigeenisiä ominaisuuksia ja näin ollen rajoittaa sen lääkinnällistä käyttökelpoisuutta.

Tämä ilmiö on havaittu interleukiinin-2 tapauksessa (klang et ai-, Science 224; 1431—1433, 1984; sekä Liang et ai., J, Biol. Chem. 261; 334-337, 1986).

Jotta oheisen keksinnön mukaisilla plasminogeeniaktivaattorei1-la olisi sekä fibriiniä sitovaa aktiivisuutta että seriinipro-teaasin aktiivisuutta, ne sisältävät vähintään KT-domeenin, kringle-domeenin sekä seriiniproteaasi-domeenin. Kringle-do-meeni on edullisesti luonnollisen t-PA;n K2-domeeni. Plasminogeeniakti vaattorit voivat myös sisältää muita kringle—domee— neja, kuten jäljempänä yksityiskohtaisesti esitetään. Sormi-domeenin sisällyttäminen saattaa myös olla edullista voimakkaamman, fibriiniin kohdistuvan affiniteetin aikaansaamiseksi. Edullinen sormidomeeni on luonnollisen t—PA:n sormidomeeni.

Oheisen keksinnön puitteissa todettiin, että muuttamalla rakennetta t-PAsn KT—domeenissa tämän proteiinin puoliintumisaika plasmassa saadaan pitenemään. Eräs tällainen muutos käsittää kysteiinijäännöksen poistamisen t-PAsn KT-domeenista. Edullisesti asemassa 84 sijaitseva kysteiinijäännös poistetaan, vaikka myös jokin muu asemissa 51, 56, 62, 73, 75 ja 83 sijaitsevista kysteiinijäännöksistä voidaan poistaa, joko yksinään tai yhdistelmänä. Joka tapauksessa on edullista, ettei tuloksena olevassa molekyylissä ole paritonta molekyyliä edellä esitetyistä syistä. Kysteiinijäännöksiä voidaan poistaa aminohappoja hävittämällä tai korvaamalla, korvaamisen ollessa edullinen menetelmä. Kysteiini voidaan peri aatteessa korvata millä tahansa aminohapolla, vaikkakin seriini ja alaniini ovat edul- 13 101306 lisiä. Erityisen edullinen korvaava aminohappo on seriini.

KT—domeeniketjun muista muokkauksista voidaan mainita usean olennaisesti peräkkäisen aminohapon korvaaminen luonnollisen t-PA:n KT-domeenissa. Aminohappojen korvaaminen tässä alueessa tähtää alueen, Joka liittyy t—PA:n nopeaan katoamiseen plasmasta, muokkaamiseen kasvutekijädomeenissa sijaitsevaa mahdollista vastaanottaja-aluetta tällöin kuitenkaan voimakkaasti muuttamatta. Aminohappojen 62 ja 73 sitoma si 1mukkarakenne tulee ensimmäiseksi kysymykseen sitovana vastaanottaja-alueena johtuen sen vähäisestä homologiasta vastaavien, muissa kasvuteki jädomeenin sisältävissä proteiineissa olevien alueiden kanssa sekä tunnusomaisista piirteistä, joiden perusteella sen voidaan päätellä sijaitsevan proteiinin pinnalla. Korvaavat aminohapot valitaan edullisesti muiden proteiinien kasvutekijä-domeeneissa vastaavissa asemissa esiintyvistä aminohapoista. Kohdistetut muutokset voivat eliminoida vastaanottajan (reseptori) spesi-fisiä vuorovaikutuksia tuhoamatta kuitenkaan niitä ominaisuuksia, joiden avulla domeeni kykenee luomaan OKT-kal-taisen kokonaiskon-formaation, käsittäen kystei iniparien 51 ja 62, 56 ja 73 sekä 75 ja 84 väliset disulti di sidokset. Yleisesti on toivottavaa säilyttää tämän alueen kyky toimia kasvutekijä— domeenina. Tätä tavoitetta silmälläpitäen aminohappojen korvaukset valitaan siten, että vältytään kon-farmaation suurilta muutoksilta, tavoitteen ollessa kuitenkin yhden tai useamman tietyssä asemassa sijaitsevan aminohappojäännöksen kemiallisen luonteen muuttaminen. Toivottavaa saattaa olla esimerkiksi säilyttää kasvutekijädomeenien tiettyjä, hyvin vakiintuneita omi nai suuksi a. Kuten kuviosta 22 nähdään, näihin ominaisuuksiin voi kuulua (a) ketjun Asn-Gly-Gly (NGG) läsnäolo lähellä toista kysteiinijäännöstä t-PA:n kasvutekijädomeenissa; sekä (b) ketjun Cys-X-Cys läsnäolo, kirjaimen X tarkoittaessa mitä tahansa aminohappoa, vastaten kysteiinijäännöksiä neljä ja viisi luonnollisen t-PAin kasvutekijädomeenissa.

Edullisia korvauksia ovat esimerkiksi korvaaminen yhden tai useamman proteiinin, jonka puoliintumisaika plasmassa on suhteellisen pitkä, kuten koagulointiteki joiden VII ja IX, kasvuteki jädomeenista (-domeeneista) peräisin olevilla lukuisilla 14 101306 olennaisesti peräkkäisillä aminohapoilla. Lisäksi useampi kuin yksi alue luonnollisen t—PA:n kasvutekijädomeenissa voidaan korvata edellä kuvatuilla vastaavilla aminohappolohkoi1la. Edelleen, korvaamiseen voidaan käyttää toisesta proteiinista peräisin olevaa täydellistä kasvutekiJädomeenia. Muut korvaukset tehdään suunnittelemalla yhtäpitäviä kasvutekijäketjuja tekijässä VII, tekijässä IX, proteiinissa C, orvaskeden kasvutekijässä sekä muissa, kasvutekijädomeenin sisältävissä proteiineissa läsnäolevien ketjujen perusteella. Kasvutekijädomee-neja esiintyy myös urokinaasissa, tekijässä X, proteiinissa S, proteiinissa Z, pienitiheyksisen 1ipoproteiinin reseptorissa, transformoivassa kasvutekijässä, orvaskeden kasvutekijän reseptorissa, trombomoduliinissa ja trombospondiinissa. Erityisen edullinen tällainen yhtäpitävä ketju on aminohappoketju metioniini-glutaamihappo-glysi ini-asparagi ini-histidi ini-leu-siini-aianiini-asparagiini (MEGNHLAN), jolla korvattiin luonnollisen t-PAsn aminohapot 63—70. Tietyissä edullisissa suoritusmuodoissa kysteiinijäännös, joka vastaa aminohappojäännöstä 83 luonnollisen t-PA:n KT-domeenissa, korvataan myös toisella aminohapolla tuloksena olevan molekyylin stabii1isuuden parantamiseksi. Kysteiini voidaan peri aatteessa korvata millä tahansa aminohapolla, vaikkakin seriini ja alaniini ovat edullisia. Erityisen edullinen korvaava aminohappo on seriini.

Oheisen keksinnön mukaiset t—PA-analogit voivat sisältää myös muita mutaatioita KT-domeenissa esiintyvien muutosten lisäksi. Nämä mutaatiot voivat olla aminohappojen korvauksia, häviämiä tai lisäyksiä. Monia tällaisia mutaatioita on kuvattu, kuten edellä mainittiin. Erityisen edullisiin mutaatioihin kuuluvat sormi- ja/tai Kl-domeenien korvaukset, aminohappojen korvaukset pi 1kkoutumiskohdan (akti voitumiskohdan) läheisyydessä, Kl—do— • meenissa sijaitsevan hiilihydraatin kiinnittymiskohdan poista minen tai K2-domeenissa sijaitsevan hii1ihydraatin kiinnitty-miskohdan muokkaaminen. Tällaiset mutaatiot parantavat t-PA-analogien kliinistä soveltuvuutta. Esimerkiksi, luonnollisen t-PAsn Kl-domeeni voidaan korvata toisesta proteiinista peräisin olevalla kringle-domeeni11 a, jolloin tuloksena olevan analogin spesi-fisyys -fibriinille paranee. Tässä suhteessa sopivia 15 101306 kringle—domeeneja ovat esimerkiksi plasminogeenin K1—, K2—, Κ3—, Κ4— ja Κ5—domeenit, luonnollisen t—PAsn K2-domeeni, pro— trombiinin Kl— ja K2—domeenit sekä tekijän XII kringle—domeeni. Plasminogeenin Kl-domeeni on erityisen edullinen. Akti voitumis-kohdan muokkaukset voivat suurentaa t—PA—analogin spesifisyyttä hyytymän e pienentämällä sen herkkyyttä pilkkoutua proteolyyt— tisesti plasmiinin vaikutuksesta ja/tai tekemällä mahdolliseksi sen pilkkoutumisen trombiinin vaikutuksesta. Hii1ihydraatin kiinnittymiskohtien muokkaukset parantavat proteiinituotteen yhdenmukaisuutta ja pidentävät puoliintumisaikaa plasmassa. Glykosyloituminen voidaan salvata muuttamalla N—kytkeytyneissä glykosylaatiokohdissa (ketju Asn—X-Ser/Thr, missä X on mikä tahansa muu aminohappo) esiintyvät Asn—jäännökset muuksi amino-happojäännökseksi. Erityisen edullista on näiden Asn-jäännösten muuttaminen Gln-jäännöksiksi. Asn voidaan myös muuttaa jäännökseksi Ser tai Thr. Ketjuun voidaan lisäksi aiheuttaa muita muutoksia koodautuneen proteiinin glykosyloitumisen salpaami-seksi. Esimerkiksi proliinijäännös ketjun Asn-X-Ser/Thr toisessa asemassa voi estää glykosylaation (Marshall, Bi ochem.

Soc. Bvmp. 40; 17-26, 1974). Myös muut korvaukset ovat mahdol lisia tässä asemassa. N—kytkeytyneen glykosylaatiokohdan kolmas aminohappo voidaan myös vaihtaa, edullisesti jäännökseksi Ala, Cys, Gly, Asn tai Gin. G1ykosylaatiokohtia voidaan muuttaa toisistaan riippumatta tai yhdistelmänä. Eräässä edullisessa suoritusmuodossa hiilihydraatin lisäys asemaan Asn—117 estetään • korvaamalla se glutamiinijäännöksel1ä.

Oheisen keksinnön mukaisesti on edullista tuottaa näitä uusia proteiineja yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla, käyttäen lähtö-materiaaleina cDNA-klooneja tai perimästä saatuja klooneja. Sopivia DNA-ketjuja voidaan myös syntetoida standardimenetelmiä noudattaen, automaattiset synteesimenetelmät mukaan lukien, tai niitä voidaan saada kaupallisista lähteistä. On edullista käyttää cDNA-klooneja, koska käytettäessä luonnollista t—PA:ta koodaavaa täysipituista cDNAzta 1ähtömateriaalina muokatun t— PAsn tuottamiseen intronit ovat poistuneet, joten luonnollisen t-PA:n kaikki eksonit ovat läsnä ja oikealla tavalla suuntautuneet toistensa suhteen. cDNAsta voidaan myös käyttää mallineena 16 101306 hävitettäessä, muutettaessa tai istutettaessa ketjuja oligo— nukleotidilla ohjattua mutageneesiä käyttäen.

Yhdistelmä-DNA-tekniikan avulla luonnollisen t—PA:n -fibriiniä sitovaa domeenia voidaan parantaa tarkoituksenmukaisesti. Tällaisiin parannuksiin voidaan päästä istuttamalla ylimääräisiä kringle-rakenteita, muokkaamalla kringle-rakenteita, lisäämällä sormidomeeneja tai korvaamalla sormidomeeni. Tämä menettelytapa tarjoaa keinon luonnollisessa t-PA:ssa tai sen kaltaisissa proteiineissa esiintyvien toiminnallisten domeenien optimaalisen yhdistelmän valitsemiseksi, ja näin ollen sen avulla saadaan aikaan fibrinolyyttisiä aineita, joiden biologinen aktiivisuus, ajatellen kykyä sitoa -Fibriiniä sekä seriiniproteaasin aktiivisuuden spesi-fisyyttä, on parantunut.

Aminohappojen korvaukset tai häviämät saadaan aikaan kohta— spesi -f isei lä mutageneesi 1 lä käyttäen kloonattua t—PA-ketjua tai sen osaa mallineena. Tekniikat oiigonukleotidi11ä ohjatun in vitro mutageneesin toteuttamiseksi ovat alalla yleisesti tunnettuja. Edullinen tällainen menetelmä kuvataan julkaisussa Zoller ja Smith, DNA 3: 479-488, 1984.

Aminohappojen korvaaminen toteutetaan edullisesti syntetoimal1 a sopivan pituisia oiigonukleotidejä, edullisesti noin 30 - 50 nukleotidin pituisia oiigonukleotidejä, ja kokoamalla ne toivotun koodaavan ketjun muodostamiseksi. Tämän pituiset oiigonukleotidi t tekevät mahdolliseksi moduuliketjujen suunnittelemisen, jotka moduuliketjut voidaan sitten järjestää lukuisiksi yhdistelmiksi suuren, kokonaisista ketjuista muodostuvan joukon saamiseksi. Tätä yhdistämistä voidaan helpottaa suunnittelemalla oiigonukleotidit siten, että parien muodostamisen jälkeen tuloksena olevan kappaleen päät ovat tylppiä tai täydentävät viereisiä ketjuja koodaavien oiigonukleotidiparien päitä. Selvää on kuitenkin se, että täydellisiä KT-korvauksia voidaan muodostaa täysi pituisi a oiigonukleotidejä käyttäen. Oligonuk-leotideihin liittyy se lisäetu, että ne mahdollistavat kodonin käytön optimoinnin valitun tyyppiselle isäntäsolui 1 e sopivalla tavalla.

17 101306

Vaihtoehtoisesti, KT—korvauksia koodaavia DNA—ketjuja voidaan saada cDNA:sta tai perimästä saaduista klooneista, joihin on koodautunut KT—domeeneja käsittäviä proteiineja. Alalla on kuvattu tekijän IX (Kurachi ja Davie, Proc. Natl. Acad. Sei.USA 79i 6461-6464, 1982; Anson et ai., EHBQ J. 3: 1053-1060, 1984), tekijän VII (Hagen et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:2412— 2416, 1986), proteiinin C (Foster et ai., Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 82: 4673-4677, 1985) ja orvaskeden kasvutekijän (Gray et ai., Nature 303:722-725. 1983) kloonit. Näitä ja muita proteiineja koodaavia sopivia klooneja voidaan saada menetelmillä, jotka ovat tuttuja yhdistelmä—DNA-tekniikan asiantuntijalle.

Tämän jälkeen KT-domeenin korvauksia koodaavat ketjut istutetaan t—PA—ketjussa sopiviin restriktiokohtiin. Eräissä tapauksissa on välttämätöntä käyttää in vitro mutageneesiä ketjujen liittämiseksi yhteen oikealla tavalla.

Mikäli välttämätöntä, mutatoitu ketju liitetään t—PA:ta koodaa-van ketjun loppuosaan, minkä jälkeen täydellinen koodaava ketju istutetaan ilmentämisvektoriin. Mutanttiketjuja voidaan ilmentää lukuisissa isäntäsoluissa, mukaan lukien nisäkässolut, hiiva ja muut sienet sekä bakteerit.

Yhdistelmä-t-PA:n tuottaminen bakteereissa, hiivassa ja nisä-kässoluissa kuvataan esimerkiksi julkaisussa Goeddel et ai., EP 93619 AI, Meyhack ja Hinnen, EP 143 081 A2 sekä Gill, EP 174 835 AI. Menetelmät ni säkässol ujen trans-fektoi mi seksi sekä bakteerien ja sienten transformoi mi seksi vieraalla DNA:11a ovat alalla hyvin tunnettuja. Sopivat ilmentämisvektorit käsittävät promoottorin, joka kykenee ohjaamaan kloonatun DNA—ketjun kopioitumista isäntäsolussa, sekä kopioitumisen toimivan päät-tämiskohdan.

Eräissä tapauksissa on edullista, että ilmentämisvektorit käsittävät edelleen replikaation alkukohdan sekä ketjuja, jotka säätelevät ja/tai parantavat ilmentymistasoja valitusta isäntä-solusta riippuen. Sopivia i1mentämisvektoreita voidaan saada plasmideista, RNA- ja DNA—viruksista tai solun DNA-ketjuista, 18 101306 tai ne voivat sisältää elementtejä kustakin niistä.

Oheisen keksinnön toteuttamiseen edullisia prokarioottisi a isäntiä ovat Escherichia coli-bakteerin kannat, vaikka Baci11 us ja muut suvut ovat myöskin käyttökelpoisia. Tekniikat näiden isäntien trans-formoimiseksi ja niissä kloonautuneiden vieraiden DNA-ketjujen ilmentämiseksi ovat alalla hyvin tunnettuja (katso esim. Maniatis et ai., Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vektorit, joita käytetään vieraan DNAsn ilmentämiseksi bakteeri-isännissä, sisältävät yleensä valikoitavissa olevan merkitsi men, kuten antibiootin vastustuskyvyn tuottavan geenin, sekä isäntäsolussa toimivan promoottorin. Sopivista promoottoreista mainittakoon trp (Nichols ja Yanofsky, Met h. in Enzymology 101; 155, 1983), lac (Casadaban et ai., J, Bact. 145; 971-980, 1980), TAC (Russell et ai., Gene 20; 231-243, 1982) sekä lambda~faagin promoottori-järjestelmät. Bakteereiden transformoimi seksi käyttökelpoisia plasmideja ovat esimerkiksi pBR322 (Bolivat et ai., Gene 2: 95-113, 1977), pUC-plasmidit (Messing, Meth. in EnzvmoloQv 101; 20-78, 1983; sekä Vieira ja Messing, Gene 19: 259-268, 1982), pCQV2 (Queen, J. Mol. AddI. Genet. 2; 1-10, 1983, sekä niiden johdannaiset.

Isäntäsoluina voidaan myös käyttää eukarioottisia mikro-organismeja, kuten hiivaa Saccharomvces cerevisiae. tai säiemäisiä sieniä, Asnerai Uus mukaan lukien. Erityisen edullisia Asoer— ai 11us-1ajeja ovat esimerkiksi A. nidulans. A. nioer. A. orvzae sekä A. terrpus. Tekniikkoja hiivan trans-formoimiseksi on kuvattu esimerkiksi julkaisussa Beggs, Nature 275: 104-108, -1978). Asperni11us-1ajit voidaan transformoida tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi tavalla, joka kuvataan julkaisussa Yelton et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 1740—1747, 1984. Hiivassa käyttökelpoisista i1mentämisvektoreista voidaan mainita YRp7 (Struhl et ai., Proc. Natl. Acart. Sei. USA 76: 1035— 1039, 1979), YEp13 (Broach et ai., Gene 8: 121-133, 1979), pJDB248 ja pJDB219 (Beggs, edellä) sekä niiden johdannaiset. Tällaiset vektorit käsittävät yleensä vaiikoi tavissa olevan merkitsimen, kuten ravinnosta riippuvan merkitsimen TRP1. joka 19 101306 tekee mahdolliseksi isännässä trpl-mutaation käsittävän kannan valitsemisen. Edullisia, hiivan i1mentämisvektoreissa käyttökelpoisia promoottoreita ovat esimerkiksi hiivan glykolyytti-sistä geeneistä peräisin olevat promoottorit (Hitzeman et ai., J. Biol. Chem. 255; 12073—12080, 1980; Alber ja Kawasaki, J.

Mol. Appi. Genet. 1_; 419—434, 1982; Kawasaki, US—patentti julkaisu 4 599 311) tai aikoholidehydrogenaasigeenistä peräisin olevat promoottorit (Young et ai., teoksessa Genetic Engineering of Microorganisms -for Chemicals. Hollaender et ai., toim. , sivu 335, Plenum, New York, 1982; sekä Ammerer, Meth. In Enzv— moloav 101: 192-201, 1983). Transformoidussa hiivassa tuotetun muokatun t—PA—proteiinin puhdistamisen helpottamiseksi sekä oikealla tavalla muodostuneen di sul -f i di sidoksen saamiseksi t— PA:n pre-pro—ketju voidaan korvata erittyvää proteiinia koodaa-vasta hiivageenistä saadulla signaali ketjulla. Erityisen edullinen si gnaal i ket ju on MFotl— geenin pre—pro—alue (Kurjan ja Herskowitz, Cel1 30; 933-943, 1982; sekä Singh, EP 123 544).

Oheista keksintöä toteutettaessa isäntäsoluina voidaan käyttää myös korkeampia eukarioottisia soluja. Edullisia solulinjoja ovat viljellyt nisäkässolut, kuten BHK, CH0, NS-1, SP2/0 ja J558L. Näitä ja muita solulinjoja on helposti saatavana esimerkiksi kantakokoelmasta American Type Culture Collection. Erityisen edullinen tarttuva solulinja on BHK—solulinja tk_tsl3 (Waechter ja Baserga, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79; 1106-1110, 1982), johon viitataan tämän jälkeen käsitteellä "tk-BHK—solut". Nisäkässoluissa käyttökelpoiset ilmentämisvektorit käsittävät promoottorin, joka kykenee ohjaamaan nisäkässoluun istutetun kloonatun geenin kopioitumista. Erityisen edullisista promoottoreista mainittakoon SV40—promoottori (Subramani et ai., Mol - Cel 1 Ci oi . 1_; 854-864, 1981), MT—1— promoottori (Pal — miter et ai., Science 222; 809—814, 1983) sekä hiiren kappa-geenin promoottori (Bergman et ai., Proc. Natl. Acad. Sei.

USA 81: 7041—7045, 1984). Ilmentämisvektorit sisältävät myös kopioitumisen päättäjän, joka sijaitsee alavirran puolella ilmennettävän vektorin istutuskohdasta. Edullinen päättäjä on ihmisen kasvuhormonigeenin (hGH—geenin) päättäjä (DeNoto et ai., Nuc. Acids Res. 9; 3719—3730, 1981). Lisäksi vektorit 20 101306 sisältävät edullisesti erityiseen isäntäsolulinjaan sopivia edi stäjäketjuja.

Mutantti-t—PA:n ilmentämiseksi viljellyissä nisäkässoluissa kloonattuja t-PA—ketjuja sisältävät i1mentämisvektorit istutetaan soluihin käyttäen sopivia trans-fektiotekniikoita, kuten kai sium-fos-faati 1 la toteutettua trans-fektiota (Graham ja Van der Eb, Viroloqy 52; 456—467, 1973; Wigler:in et ai. muunnoksena julkaisusta Proc, Natl. Acad. Sei. USA 77: 3567—3570, 1980; tai muunnoksena, joka kuvataan julkaisussa Loyter et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 79; 422, 1982) tai elektro-poraatiota (Neumann et ai., EMBQ J. 1.: 841—845, 1982). Osa soluista ottaa DNA:n vastaan ja tämä DNA säilyy solun sisällä useita vuorokausia. Pienessä osassa soluista DNA yhtenäistyy isäntäsolun perimään tai DNA säilyy ei-kromosomaalisina tuma-rakenteina. Nämä transfektoituneet solut voidaan tunnistaa trans-f ektoimal 1 a samalla geeni, joka saa aikaan valikoitavissa olevan -fenotyypin (valikoitavissa oleva merkitsin). Edullisia valikoitavissa olevia merkitsimiä ovat esimerkiksi DHFR—geeni, joka tekee solut vastustuskykyisiksi metotreksaati 1 le (ΙΊΤΧ), joka on nukleotidi synteesin inhibiittori; tai bakteeriperäinen neomysiinin vastustuskyvyn geeni, joka saa aikaan lääkeaineen G-418 vastustuskyvyn, joka lääkeaine on proteiinisynteesin inhibiittori. Sen jälkeen, kun isäntäsolut ovat ottanet DNA:n vastaan, ne valikoidaan lääkeaineen avulla sellaisista soluista muodostuvan populaation valikoimiseksi, jotka solut ilmentävät valikoitavissa olevaa merkitsintä riittävän suuressa määrin vastustuskyvyn muodostumiseksi. Valikoitavissa olevat merkit-simet voivat sijaita samassa vektorissa kuin t-PA-analogia koodaava ketju, tai ne voivat sijaita erillisessä vektorissa.

I Metotreksaattiin perustuvaa valikointia käytettäessä i1menty ini st asojen suurentamiseen voidaan käyttää oheismonistamista lisäämällä vi1jelyalustaan MTX:ää suurina pitoisuuksina alustavan valikoinnin hetkellä tai nostamalla vähitellen MTX:n pitoisuutta alustassa, mitä seuraa toistuva kloonaaminen laimentamalla tälle lääkeaineelle vastustuskykyiset solulinjat. Monis-tamiskyvyssä voidaan todeta vaihtelua, ja se liittyy sekä yh 21 101306 dessä transfektoitujen DNA-ketjujen alkuperäiseen konfiguraatioon genomissa (eli kromosomien ulkopuolinen vs. kromosomaa-linen) että itse monistumismekanismiin, jossa DNA:n järjestäytymistä uudestaan voi tapahtua vaihtelevassa määrässä. Tämä huomataan monistamalla edelleen klooneja, jotka aikaisemmin osoitettiin stabiileiksi. Tästä syystä on välttämätöntä kloonata laimentamalla jokaisen monistamisvaiheen jälkeen. Tämän jälkeen DHFR-merkitsintä ilmentävät solut valikoidaan ja seulotaan t-PAsn muodostumisen suhteen. Seulominen voidaan toteuttaa entsyymiin kytkettyyn immunosorbentti in perustuvalla kokeella (ELISA) tai biologiseen aktiivisuuteen perustuvilla kokeilla.

Oheisen keksinnön mukaisten plasminogeeniaktivaattoreiden tuottama fibrinolyyttinen vaikutus vastaa täysin luonnollisen t— PA:n fibrinolyyttistä vaikutusta. Näiden proteiinien etuna luonnolliseen t—PA:han verrattuna on kuitenkin se, että niiden puoliintumisai ka plasmassa voi olla jopa viisi kertaa pitempi kuin luonnollisella t-PA:lla, minkä perusteella voidaan olettaa, että ne ovat parempia lääkitseviä aineita.

Oheisen keksinnön mukaisia plasminogeeniaktivaattoreita voidaan käyttää farmaseuttisina valmisteina verisuonitukosten käsittelemiseksi. Nämä farmaseuttiset valmisteet käsittävät plasmino— geeni aktivaattoria yhdistettynä kantajaan tai laimentimeen, kuten steriiliin veteen tai steriiliin suolaliuokseen, ja ne voivat käsittää myös sopivia täyteaineita ja/tai liuottimia. Tuloksena olevat vesiliuokset voidaan pakata käyttöä varten tai ne voidaan suodattaa aseptisissa olosuhteissa ja lyofili-soida, jolloin tällainen lyofilisoitu valmiste yhdistetään steriiliin vesiliuokseen ennen antamista.

Steriileissä olosuhteissa valmistetaan tyypillisesti vesiliuos, joka sisältää 3 g mannitolia ja 10* yksikköä t-PA-analogia. Tästä liuoksesta pipetoidaan yhden millilitran suuruisia määriä pieniin ampulleihin, jotka tämän jälkeen 1yofi1isoidaan ja suljetaan tiiviisti. Injektointia varten lyofilisoitu materiaali yhdistetään 2 ml:aan steriiliä vettä, joka on saatu tiiviisti suljetusta ampullista. Antaminen tapahtuu edullisesti 22 101306 injektoimalla. Oheisen keksinnön mukaisia proteiineja annetaan tyypillisesti noin 5 - 100 mg:n suuruisina annoksina potilasta kohden, riippuen potilaan painosta ja liuotettavan tukoksen luonteesta. Oheinen keksintö ei rajoitu kuitenkaan edellä esitettyyn alueeseen vaan annosta voidaan vaihdella tilasta riippuen. Sopivan annoksen määrittäminen on ilmeistä alan asiantunti jal le.

Seuraavat esimerkit havainnollistavat keksintöä sitä kuitenkaan millään tavalla rajoittamatta.

Esimerkki 1 Täysipituisen t-PA-kloonin muodostaminen

Emäsjärjestys luonnollisen, ihmisessä esiintyvän t-PA:n cDNA-kloonissa on kuvattu julkaisussa Pennica et ai., Nature 501: 214-221, 1983. Tähän ketjuun ovat koodautuneet 32 - 35 aminohapon pituinen pre-pro-peptidi sekä sen jälkeen 527 - 530 aminohapon pituinen täysin kehittynyt proteiini.

cDNA-klooni, joka käsittää täysin kehittynyttä t—PAsta koodaa— van ketjun, muodostettiin käyttäen lähtömateriaalina Bowes:in melanoomasolulinjasta peräisin olevaa mRNA:ta (Rijken ja Col-len, J- Biol- Chem. 256: 7035-7041, 1981). Tätä cDNA:ta käytet tiin sitten plasmidin pDR1296 muodostamiseen. Plasmidilla — pDR1296 transformoitu Escherichia coli—kanta JMB3 on talletettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection tai1etusnume— roll a 53347.

Koska pre-pro-ketju ei ollut läsnä cDNA-kloonissa pDR1296, se muodostettiin syntetoiduista oiigonukleotideistä ja yhdistettiin sitten cDNA:han. Syntetoituun t-PA pre-pro-ketjuun istutettiin entsyymien Bam HI ja Neo I pi1kkomiskohdat välittömästi 5’-puolelle pre-pro-ketjun ensimmäisestä kodonista (ATG) ja Bgl II- (Sau 3A, Xho II) kohta säilytettiin pre-pro-ketjun 3'-päässä. Luonnossa esiintyvästä pre-pro-ketjusta puuttuu tarkoituksenmukainen restriktiokohta keskustan läheisyydessä; ketju 6GAGCA (joka koodaa aminohappoja -20 ja -19, Gly-Ala) 23 101306 voidaan kuitenkin muuttaa ketjuksi GGCGCC, jolloin aikaan saadaan Nar I—kohta aminohappojärjestystä muuttamatta.

Pre-pro-ketjun muodostamiseksi seuraavat oligonukleotidit syn-tetoitiin käyttäen yhtiön Applied Biosystems DNA—syntetisaat-toria, malli 380-A:

ZC131: 5’GGA TCC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG OTC TGC

TGT GTG3’ ZC132: 5’TGG CGC CAC AGA GCA GCCA GCA CAC AGC AGAG37

ZG133: 5’GGC GCC GTC TTC GTT TCG CCC AGC CAG GAA ATC

CATG3’

ZC134: 5'AGA TCT GGG TCC TCT TCT GAA TCG GGC ATG GAT

TTC CT3’

Puhdistamisen jälkeen oligomeerit ZC131 ja ZC 132 kytkettiin toisiinsa 12 emäsparin pituisen päällekkäisyyden tuottamiseksi (1. kappale). Oligomeerit 133 ja 134 kytketiin toisiinsa samalla tavalla (kappale 2). Oligomeerit sekoitettiin Pol I-puskurissa (Bethesda Research Labs), kuumennettiin 65 *C:n lämpötilaan 5 minuutiksi ja jäähdytettiin hitaasti huoneen lämpötilaan neljäksi tunniksi kytkeytymisen toteuttamiseksi. 10 yksikköä DNA-polymeraasia I lisättiin ja reaktion annettiin edetä kaksi tuntia huoneen lämpötilassa. Seoksia käsiteltiin elektro-foreettisesti 1000 voltilla 2,5 tuntia käyttäen 8 % järjestävää polyakryyliamidi-urea-geeliä reaktiotuotteen jakamiseksi -fraktioihin koon perusteella. Oikean kokoiset kappaleet (joissa polymeraasireaktio on edennyt loppuun saakka) leikattiin irti geelistä ja otettiin talteen.

Kytkemisen jälkeen 1. kappale leikattiin entsyymeillä Bam HI ja Nar I ja kloonattiin entsyymeillä Bam HI ja Nar I leikattuun muodosteeseen pUC8 (Vieira ja Messing, Gene 19; 259-268, 1982; sekä Messing, Meth. in Enzvmoloav 101; 20—77, 1983). 2. kappale kytkettiin uudestaan ja leikattiin entsyymeillä Nar I ja Bgl II ja se kloonettiin Bam HI + Nar t-leikattuun muodosteeseen pUC8. Pesäkkeet seulottiin sopivalla tavalla merkityillä oligo-nukleotideillä. Plasmidien, jotka tunnistettiin positiivisiksi 24 101306 pesäkehybridisaatiol la, emäsjärjestys määritettiin sen varmistamiseksi, että oikea ketju oli kloonautunut.

Tämän jälkeen 1. kappale puhdistettiin asianmukaisesta pCU-kloonista, joka oli pilkottu kahdesti entsyymeillä Bam HI ja Nar I. 2. kappale puhdistettiin Nar I + Xho 11—pi 1kkeestä.

Nämä kaksi kappaletta liitettiin Nar I-kohdasta ja kloonattiin entsyymillä Bam HI leikattuun muodosteeseen pUC8.

Sitten plasmidin pDR1296 t-PA-ketju liitettiin syntetoituun pre-pro-ketjuun seuraavalla tavalla (kuvio 2). Plasmidi pIC19R (Marsh et ai., Gene 52: 481-486, 1984) pilkottiin entsyymeillä Sma I ja Hind III. Tämän jälkeen SV40:n ori-alue kartan asemasta 270 (Pvu II) asemaan 5171 (Hind III ligatoitiin lineaariseksi tehtyyn plasmidiin pIC19R plasmidin Zem67 muodostamiseksi. Sitten tämä plasmidi katkaistiin entsyymillä Bgl II ja päättäjäalue ihmisen kasvuhormonin geenistä (De Noto et ai., Nuc. Acids Res. 9: 3719-3730, 1981) istutettiin Bgl II-Bam HI-kappaleeseen plasmidin Zem 86 tuottamiseksi. Syntetoitu t—PA pre-pro-ketju poistettiin pUC-B-vektorista entsyymeillä Bam HI ja Xho II pilkkomalla. Tämä kappale istutettiin entsyymillä Bgl II pilkottuun plasmidiin Zem86 plasmidin Zem88 tuottamiseksi. Plasmidi pDR1296 pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Bam HI ja t-PA cDNA-kappale eristettiin ja istutettiin Bgl Il-ent-syymillä leikattuun plasmidiin Zem 88. Tuloksena olevasta plas-midista käytetään merkintää *'Zem94".

Tämän jälkeen vektori Zem99, joka käsitti MT-1-promoottorin, täydellistä t-PA:ta koodaavan ketjun sekä hGH-päättäjän, koottiin seuraavalla tavalla (kuvio 2). MT-l-promoottorin käsittävä Κρη I - Bam HI-kappale eristettiin muodosteesta MThGHlll (Pal-miter et ai., Science 222: 809-814, 1983) ja istutettiin plas midiin pUC18 plasmidin Zem93 muodostamiseksi. Plasmidi MThGH112 (Palmiter et ai., edellä) pilkottiin entsyymillä Bgl II ja ligatoitiin uudestaan hGHsta koodaavan ketjun eliminoimiseksi. Sitten MT-l-promoottori ja hGH-päättäjä eristettiin Eco RI-kappaleena ja istutettiin plasmidiin pUC13 plasmidin Zem4 muodostamiseksi. Zem93 tehtiin sitten lineaariseksi entsyymeillä 25 101306

Bam HI ja Sal I pilkkomalla. Zem4 pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Sal I ja h6H—päättäjä puhdistettiin. t-PA pre-pro-ketju poistettiin pUC8-vektorista Bam HI - Xho II-kappaleena. Sitten nämä kolme DNA-kappaletta liitettiin ja plasmidi, jolla oli Zem97sn rakenne (kuvio 2), valikoitiin. Zem97 leikattiin entsyymillä Bgl II ja Xho II t—PA—kappale plasmidista Zem94 istutettiin. Tuloksena oleva vektori on Zem99.

Esimerkki 2

Vektorin Zem219c muodostaminen

Vektori Zem219c muodostettiin kuviossa 3 esitetyllä tavalla. Plasmidi pSV2-DHFR (Subramani et ai., edellä) pilkottiin entsyymillä Cfo I ja kappale, joka sisälsi DHFR cDNA-ketjun sekä 3’-kiinnittyneet SV40-ketjut, eristettiin, korjattiin ja liga-toitiin Bam HI-kytkijoihin. Entsyymillä Bam HI pilkkomisen jälkeen pilkkeestä puhdistettiin arviolta 800 emäsparin kappale, joka sisälsi koko cDNA:n sekä SV40-päättäjäalueen, ja se ligatoitiin Bam Hl-pi1kottuun plasmidiin pUC8. Zem67 (esimerkki 1) pilkottiin entsyymillä Bgl II ja ligatoitiin Bam HI DHFR-5V40-kappaleeseen plasmidin Zeml76 aikaansaamiseksi. Plasmidi Zem93 pilkottiin entsyymillä Sst I ja ligatoitiin uudetsaan plasmidin Zeml06 aikaansaamiseksi, jossa plasmidissa ZemlC>6 MT—1-promoottorin suhteen 5’—puolella sijaitsevasta ketjusta oli saatu eliminoiduksi arviolta 600 emäsparia. Plasmidi Zeml06 pilkottiin entsyymillä Eco Rl ja se ligatoitiin Eco RI-kappa-leeseen, joka sisälsi DHFR—geenin plasmidista Zeml76. Tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää Ztsl3. Plasmidi Ztsl3 pilkottiin entsyymillä Bam HI ja ligatoitiin plasmidista Zem99 peräisin olevaan Bam HI—kappaleeseen, joka sisältää koko t-PAsta koodaavan alueen sekä hGH—päättäjäketjun. Tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää Ztsl5. Ztsl5 pilkottiin osittain entsyymillä Bam HI, korjattiin ja ligatoitiin uudestaan plasmidin Zem219 aikaansaamiseksi, jossa 3’ Bam HI—kohta oli tuhoutunut. Plasmidi Zem219 pilkottiin osittain entsyymillä Xba I, korjattiin ja ligatoitiin uudestaan plasmidin Zem219a aikaansaamiseksi, jossa plasmidissa 3' Xba I-kohta oli tuhoutunut. Plasmidi Zem219a pilkottiin entsyymeillä Bam HI ja — 26 101306

Xba I, vektori ketjut poistettiin puhdistamal1 a t—PA cDNA-ket-juista ja ligatoitiin oiigomeeriseen Bam HI-Xba I-sovittimeen vektorin Zem219b muodostamiseksi. Vektorissa Zem219b SV40—DHFR-ketjun polykytkijäalueessa sijaitseva Xho I-kohta tuhottiin pilkkomalla entsyymillä Xho I, korjaamalla ja ligatoimalla juuri tylpiksi tehdyt päät uudestaan. Tuloksena olevasta plas-midista käytettiin merkintää Zem219c.

Esimerkki 3 Jäännöksen Cys (83) korvaaminen liuodosteen Zem99 käsittämä, t—PA:ta koodaava ketju mutagenoi— ti in siten, että asemaan 83 koodautui seriini (aminohappojen numerot viittaavat kuvion 1 esittämään ketjuun). Zem99 pilkottiin entsyymillä Bam HI ja t-PA:ta koodaavan ketjun sekä hGH-päättäjän käsittävä 2,4 ki1oemäsparin kappale eristettiin.

Tämä kappale liitettiin Bam Hl-pi1kottuun muodosteeseen M13mpl8 (saatu yhtiöstä Pharmacia) ja tuloksena olevalla yhdistelmä— faagilla transfektoitiin E. coli JM103. Toivotun istutteen käsittävästä faagikloonista käytettiin merkintää M13mpl8/Bam-Zem99.

Kohta-spesifistä mutageneesiä varten syntetoitiin oligonukleo-tidi (ketju 5' CT GGT ATC GAT TTC AGA GCT CTT CCC AGC A 3*) ja sitä käytettiin mutageenisena alukkeena. Tämä oligonukleo— ti di yhdistettiin yksijuokseisen klooniin M13mpl8/Bam—Zem99. Mutageneesi toteutettiin tavanomaisten menetelmien mukaisesti ja yksijuosteinen DNA eristettiin järjestyksen määrittämistä varten. Mutagenoidun -faagin repii koituva muoto, josta käytetään merkintää M13-9100RF, pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Hind III. t-PA-ketjun sisältävä 2,3 kiloemäsparin kappale otettiin talteen ja liitettiin entsyymeillä Bgl II ja Hind III pilkottuun muodosteeseen Zem99 (kuvio 4) ja DNA:ta käytettiin E. coli-kannan TB1 transformoimiseen. Plasmidi, joka käsitti toivotulla tavalla muuttuneen ketjun, otettiin talteen ja siitä käytettiin merkintää Zem99-9100. Plasmidin Zem99-9100 mutatoi-tunut t-PA-ketju ja koodautuva aminohappoketju on esitetty kuviossa 5.

27 101306

Plasmideja Zem99-9100 ja pSV2-dhfr (Subrämäni et ai., edellä) käytettiin tk~BHK-solujen trans-fektoimiseen noudattaen menetelmää, joka on kuvattu julkaisussa Loyter, Proc. Natl. Acad.

Sei. USA 79: 422, 1982. Trans-formantit kloonattiin rajoittavaan laimennukseen perustuvalla menetelmällä. Mutanttiproteiini, josta käytetään merkintää 9100, puhdistettiin solujen viljely-alustasta a-f-f ini teetin perusteella.

Plasmidin Zem99-9100 sisältävä E. coli TBl-trans-formantti on talletettu kantakokoelmaan Fermentation Research Institute, Agency o-f Industrial Science and Technology, Ministry o-f International Trade and Industry, Japani (FRI), tailetusnumerol1 a FERM P—9269.

Esimerkki 4 Jäännöksen Cys (84) korvaaminen t-PA DNA-ketju mutagenoitiin seriinin koodautumiseksi amino-happoasemaan 84 kohta-spesi-fisen mutageneesin avulla käyttäen oiigonukleoti diä 5' CCT SGT ATC GAT TTC ACT GCA CTT CCC 3’.

Tämä oiigonukleotidi kytkettiin muodosteeseen M13mpl8/Bam-Zem99 ja mutageneesi toteutettiin käyttäen tavanomaisia menetelmiä. Järjestys yksijuosteisessa mutagenoituneessa -faaagissa määritettiin, ja klooni, jossa järjestys oli muuttunut toivotulla tavalla, valittiin. Repiikoituvassa muodossa oleva DNA valmistettiin (siitä käytetään merkintää "M13-9200RF") ja se pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Hind III. 2,3 kiloemäsparin kappale eristettiin ja liitettiin entsyymeillä Bgl II + Hind III leikattuun muodosteeseen Zem99. Tuloksena olevasta vektorista käytettiin merkintää Zem99—9200 (kuvio 4). Vektorin Zem99-9200 muuttunut, t-PA:ta koodaava ketju ja siihen koodautunut amino-1 happoketju esitetään kuviossa 6.

Muodosteil la Zem99—9200 ja pSV—dh-fr kotrans-fektoitiin tk—BHK— soluja käyttäen Loyter:in menetelmää (edellä). Transformantit kloonattiin rajoittavaan laimennokseen perustuvalla menetelmällä. Mutanttiproteiini (9200) puhdistettiin affiniteetin perusteella.

28 101306

Plasmidin Zem99-9200 sisältävä E. coli RRl-transformantti on talletettu kantakokoelmaan FRI talletusnumerolla FERM P-9274.

Esimerkki 5 t-PA:n kasvutekijädomeenin mutageneesi

Todellisen t-PA KT-domeenin korvaamiseksi vaihtoehtoisilla kasvutekijäketjui11 a luonnollista t-PA-ketjua muokattiin ensin Kpn I-kohdan sijoittamiseksi sormidomeenia ja kasvutekijädo-meenia koodaavien ketjujen väliin. Plasmidi Zem99 pilkottiin entsyymeillä Bam HI ja Eco Rl ja 5’ t-PA-kappale otettiin talteen ja istutettiin entsyymeillä Bam HI + Eco Rl leikattuun muodosteeseen M13mpl8. Faagi—DNA preparoitiin ja 100 mikro-litralla tätä DNA-liuosta infektoi ti in E. coli—kanta RZ1032 100 mikrolitrassa YT—alustaa, johon oli lisätty täydennökseksi 0,1 pg/ml uridiinia. Tätä viljelmää inkuboitiin 37 eC:n lämpötilassa yön yli voimakkaasti ravistellen. Faagin M13 kasvaminen kannassa RZ1032 tuottaa uridiinia sisältäviä faageja, jotka ovat elinkelpoisia kannassa RZ1032 mutta eivät kannassa JH101.

Solut erotettiin linkoamalla ja faagisupernatanttia käytettiin E. coli-kannan RZ1032 intektoimi seksi uudestaan. Tämä toistaminen toteutettiin mahdollisten, kannasta JM101 peräisin olevien ja urasiiliä sisältämättömien faagien laimentamiseksi pois. Solut erotettiin jälleen linkoamalla ja faagit maljattiin kantojen JM101 ja RZ1032 päälle. RZ1032-maljoi 11 a todettiin normaali elinkelpoisuus (osoittava faagi pitoisuutena 10"* -pfu/ml), kun taas JMlOl-soluissa ei todettu lainkaan plakkeja. Tämän jälkeen tuotettiin in vitro täydentävä vastinjuoste, jossa alukkeena käytettiin mutageenista oligonukleotidiä. Uusi, mutaation sisältävä juoste sisälsi tyrni diiniä ja oli näin ollen elinkelpoinen kannassa JM101, toisin kuin villityypin malline.

Mal1ine-DNA:ta valmistettiin PEG-saostamalla faagisupernatanttia, mitä seurasi uuttaminen fenolin ja kloroformin seoksella ja saostaminen etanolilla. Yksi pg tätä mailine-DNA:ta ja 10 pg oligonukleotidiä ZC986 hybridi soiti in keskenään lyhyesti keittämällä, inkuboimalla 65 °C:n lämpötilassa 5 minuuttia, 29 101306 ja palauttamalla sitten lämpötila hitaasti arvoon 4 eC ennenkuin lisättiin 10 μΐ 0,2 M HEPES, pH 7,8, 2 μΐ 100 mM DTT, 1 μΐ IM MgCla, 20 μΐ 2,5 mM kutakin dNTP, 10 μΐ 10 mM ATP, 1 μΐ 2,5 U/μΙ K1enow sekä 2 μΐ 1 U/μΙ Τ* DNA-1igaasia, ja lopullinen tilavuus asetettiin 100 μΐ:ksi vedellä. 37 eC:n lämpötilassa 2 tuntia kestäneen jatkamisen jälkeen DNA transfektoiti in päteviin E. coli JM101 soluihin. Vertailujatkaminen (miinus oligo-nukleotidi) toteutettiin jatkettaessa syntyvän taustan suuruuden selvittämiseksi kontaminoivien RNA— ja DNA—lajien alustues-sa. Trans-fektio ei tuottanut lainkaan plakkeja mutagenoimat— tomalla mallineella, 150 plakkia vertai 1ujatkeel1 a (miinus oiigonukleotidi) ja 300 plakkia mutagenoidulla mallineella.

Maljat seulottiin hybridi soimalla nostetut plakit 3aP-merkityn mutageenisen oiigonukleotidin kanssa ja pesemällä 3M TMAC1-liuoksessa (Wood et ai., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82: 1585-1588, 1985) Tm-5 *C:ssa 30 minuuttia sekä samoin määrittämällä järjestys satunnaisesti valituista plakeista. Tällöin saatiin yksi positiivinen klooni.

Κρη I—kohdan sisältävää mutagenoitunutta Bam HI—Eco Rl—kappaletta mutagenoiti in edelleen Xho I—kohdan istuttamiseksi KT-domeenin 3'—päähän. Malline—DNA preparoitiin Κρη I—kohdan sisältävästä M13—faagikloonista faagisupernatantin PEG—saostuksella, mitä seurasi uuttaminen -fenolin ja kloroformin seoksella ja sao5taminen etanolilla. Yksi pg tätä DNA:ta ja 10 pg oiigonukleotidi ä ZC987 (5’ CAC GTG GCT CGA GTA TCT ATT TC 3’) hybridi soi ti in keskenään. Seosta keitettiin vähän aikaa, sitä inku-boitiin 65 eC:n lämpötilassa 5 minuuttia ja lämpötila laskettiin hitaasti arvoon 4 *C ennenkuin lisättiin 10 μΐ 0,2 M — HEPES, pH 7,8, 2 μΐ 100 mM DTT, 1 μΐ 1 M MgCl», 20 pl 2,5 mM kutakin dNTP, ΙΟ μΐ 10 mM ATP, 2,5 yksikköä DNA—polymeraasia I (Klenow-kappale) ja 2 yksikköä T* DNA-1igaasia, ja lopullinen tilavuus asetettiin 100 μΐ:ksi vedellä. Jatkamisen, joka toteutettiin 37 *C:n lämpötilassa 2 tunnin aikana, jälkeen DNA — transfektoiti in päteviin E. coli JMlOl-soluihin. Maljat seulottiin hybridisoimalla ja sen jälkeen, kun mutageneesissä syntyneen ketjun järjestys oli varmistettu, uutta -f aagi kloonia - 30 101306 (ZpLl) käytettiin mallineen valmistamiseen toista mutageneesiä varten. 01igonukleotidiä ZC988 (5’ CTC AGA GCA TGC AGG GG 3’) käytettiin Sph I-kohdan aikaansaamiseksi ensimmäisen kringle-domeenin 3’-päähän. Mutageneesi varmistettiin ja faagikloonista käytettiin merkintää ZpL2. ZpL2:sta preparoitiin replikoitavassa muodossa oleva DNA ja siitä eristettiin Bam HI - Eco RI-kappale, joka käsitti 5’-osan t-PAsta koodaavasta ketjusta. Tämä kappale ligatoitiin muodosteesta Zem99 saatuun osittaiseen Eco Rl — Xba I 3' t—PA-kappaleeseen sekä entsyymeillä Bam HI + Xba I pilkottuun vektoriin Zem219c (kuvio 7). Tuloksena olevasta muodosteesta käytettiin merkintää ZpL7.

Kasvutekijädomeenin korvaukset muodostettiin taulukossa 1 esitetyillä oiigonukleotidei11ä. Nämä 18 oiigonukleotidiä yhdistettiin erilaisiksi neljän tai kuuden ketjun yhdistelmiksi kuvion 8 mukaisten yhdistelmien muodostamiseksi. 500 ng kutakin oligonukleotidiä inkuboitiin 37 aC:n lämpötilassa 30 minuutin ajan (reaktioseoksen kokonaistilavuus — 30 μΐ) erillisessä putkessa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl3, 150 mM ditiotreitolia, joka sisälsi 10 pCi (0,3 μΜ) 3aP—ATP:tä, sekä 0,5 yksikköä T.* polynukleotidikinaasia. Tiettyjä oligo-nukleotidejä sisältävistä reaktioseoksista otetut 5 μ1:η näytteet sekoitettiin taulukon 8 mukaisiksi yhdistelmiksi (kokonaistilavuus oli 20 μΐ, kun sekoitettiin neljä oiigonukleoti— diä; ja 30 μΐ, kun sekoitettiin kuusi oligonukleotidiä). Seoksiin lisättiin yksi yksikkö T* DNA—ligaasia ja niitä inkuboitiin huoneen lämpötilassa kaksi tuntia. Nämä 1igatoituneet oi igonukl eoti di koosteet käsiteltiin el ektro-foreetti sesti 5 ’/. polyakryyliamidigeeli1lä, joka sisälsi 8 M ureaa. Täysipituisiksi kokoontuneita kappaleita vastaavat vyöhykkeet leikattiin irti, niitä eluoitiin yön yli 0,3 M natriumasetaatissa ja DNA saostettiin etanolilla. 01igonukleotidi koosteet laimennettiin 1-, 10- ja 50-kertaisesti ja ne lisättiin 1igaatioseoksiin yhdessä puhdistetun, entsyymeillä Κρη I ja Xho I leikatun muo— dosteen kanssa. Oikealla tavalla korvautuneet plasmidit tunnistettiin alustavasti Southern:in täpläanalyysilla ja sitten määrittämällä järjestys koko korvautuneessa alueessa. Kuten kuviossa 8 esitetään, kappale A korvaa t—PAsn aminohapot 63- 31 101306 70 ketjulla MEGNHLAN, kappale B korvaa t—PA;n aminohapot 51-84 ihmisen tekijän IX koko kasvutekijädomeeni1la, kappale C korvaa t-PAsn aminohapot 51-60 ihmisen tekijän IX vastaavalla alueella, kappale D korvaa t-PA:n aminohapot 51-60 tekijän IX vastaavalla alueella ja aminohapot 63-70 ketjulla MEGIMHLAN, kappale E korvaa t-PA:n aminohapot 63—70 ihmisen tekijän IX vastaavalla alueella, kappale F korvaa t—PAsn aminohapot 51— 84 ihmisen tekijän VII koko kasvutekijäalueel1 a ja kappale G korvaa t—PA:n aminohapot 63—84 ihmisen tekijän VII vastaavalla alueella. Kappaleissa A, C, D ja E aseman 83 vapaa kysteiini on vaihdettu seriiniksi proteiinin stabii1isuuden parantamiseksi .

Kuviossa 6 esitetään järjestys edustavissa oiigonukleotidi-yhdistel missä sekä järjestys koodautuneissa aminnhappoketjuis-sa. Pareiksi järjestetyt oiigonukleotidit (1351 + 1352, 1353 + 1354, 1355 + 1356, 1357 + 1358, 1359 + 1360, 1361 + 1362, 1363 + 1364, 1457 + 1458 sekä 1459 + 1460) voidaan myös koota muiksi kuin kuvan 8 mukaisiksi yhdistelmiksi.

Taulukko 1 ZC1351 27

CTG TTA AAT CTT GTT CTG AAC CTA GAT GTT TTA ATG GAG GA

ZC1352 27

ATT AAA ACA TCT AGG TTC AGA ACA AGA TTT AAC AGG TAC

ZC1353 27 ACA TGC ATG GAA GGA AAT CAT CTT GCT AAT TTT GTT TGT CAA TGT CCT ZC1354 27

TTG ACA AAC A AA ATT AGC AAG ATG ATT TCC TTC CAT GCA TGT TCC TCC

ZC1355 27

GAA GGA TTT GCT GGA AAA TCT TGT GAA ATT GAT AC

ZC1356 27

TCG AGT ATC AAT TTC ACA AGA TTT TCC AGC AAA TCC TTC AGG ACA

ZC1557 27

CTG TTA AAT CTT GTG AAT CTA ATC CTT GTC TTA ATG GAG GA

ZC1358 27

ATT AAG ACA AGG ATT AGA TTC ACA AGA TTT AAC AGG TAC

32 101306 ZC1359 27 TCT TGT AAA GAT GAT ATT AAT TCA TAT GAA TGT TGG TGT CCT ZC136Q 27

CCA ACA TTC ATA TGA ATT AAT ATC ATC TTT ACA AGA TCC TCC

ZC1361 27

TTT GGA TTT GAA GGA AAA AAT TGT GAA ATT GAT AC

ZC1362 27 TCG AGT ATC AAT TTC ACA ATT TTT TCC TTC AAA TCC AAA AGG ACA ZC1363 27 ACA TGT CAA GCT CTT TAT TTT TCT GAT TTT GTT TGT CAA TGT CCT ZC1364 27 TGG ACA AAC AAA ATC AGA AAA ATA AAG AGC TTG TTG ACA TGT TCC TCC ZC1457

TCG GTA CCT GTT AAA TCT TGT GCT TCT TCT CCT TGT CAA AAT GGA

CCA TCT TGT AAA GAT CAA ATT CAA

ZC145B

AGC CAT GGA CAA TTT AGA ACA CGA AGA AGA GGA ACA GTT TTA CCT

CCT AGA ACA TTT CTA GTT GAA GTT

ZC1459

TCT TAG ATA TGT TTT TGT CTT CCT GCT TTT GAA GGA AGA AAT TGT

GAA ATT GAT ACT CGA GCT

ZC1460

AGA ATG TAT ACA AAA ACA GAA GCA CGA AAA CTT CCT TCT TTA ACA CTT TAA CTA TGA GCT CGA

I1mentämisvektoreiden muodostamiseksi muokattuja t—PA—ketjuja varten vektori ZpL7 pilkottiin entsyymeillä Κρη I ja Xho I ja vektori kappale puhdistettiin geelillä. Vektori-DNA ligatoitiin jokaisen, kasvutekijäalueen korvaavan kappaleen A, B, C, D, E, F, G, H, I, J ja K kanssa. Ligaatioseoksia käytettiin pätevien E. coli HB101-solujen transformoi mi seen. Kloonit poimit-; tiin ja DNA preparoitiin, pilkottiin Eco Rl:11a ja jaettiin fraktioiksi 1 7. agaroosi geel i 11 ä. DNA siirrettiin nitrosellu-loosalle ja sitä tutkittiin käyttäen koettimena sopivaa tt^P-merkittyä oiigonukleotidiä korvautumisten läsnäolon varmistamiseksi. Tuloksena olevat plasmidit, joista käytettiin merkintää ZpL7A, -B, -C, -D, -E, -F, -G, -H, -I, -J ja -K, pilkottiin entsyymeillä Eco Rl ja Bam HI ja t-PA:n 5’-kappaleet kloonat Ί 01306 33 tiin M13—faagivektoreihin Ja järjestys määritettiin lisävarmistusta varten. Sitten plasmidit trans-f ektoi ti i n tk~BHK-soluihin ja erittäin tuottoisien kloonien tapauksessa toteutettiin mittakaavan muuttaminen suuremmaksi proteiinin tuottamiseksi ja sen tunnusomaisten piirteiden selvittämiseksi.

Esimerkki 6 Jäännöksen Cys korvaaminen t-PA-analogeissa, joiden aktivoitu-miskohtia on muutettu

Kohtaspesi-fistä mutageneesiä varten 472 emäsparin Eco RI-kap-pale, joka käsittää t-PA-ketjun emäsparista 802 emäspariin 1274, eristettiin muodosteesta Zem99 ja kloonattiin muodosteen M13mpl8 (repiikoituva muoto) Eco RI-kohtaan. Nämä yhdistelmä--faagit trans-f ektoi ti in E. coli-kantaan JM101 ja vastamerki tyk-sellinen DNA-juoste eristettiin.

Sitten yksijuosteisessa vastamerkityksel1isessä DNA—mal1ineessa toteutettiin kohtaspesifinen mutageneesi käyttäen yhtä taulukon 2 mukaista mutageenistä aluketta sekä muodostetta ZC87 toisena alukkeena. 01igonukleotidit ZC487, 489 ja 620 muuttavat asemassa 274 sijaitsevan Phe-jäännöksen vastaavasti jäännökseksi Glu, Gly, Arg tai Pro. 01igonukleotidit ZC797, 874, 1013 ja 1027 muuttavat asemassa 275 sijaitsevan Arg-jäännöksen vastaavasti jäännökseksi Gly, Leu, Pro tai Asp. 01igonukleotidi 621 sijoittaa Leu-jäännöksen asemassa 277 sijaitsevan Lys-jäännöksen tilalle. 01igonukleotidi 928 muuttaa asemassa 276 sijaitsevan Ile—jäännöksen Pro—jäännökseksi. 01igonukleotidi 875 muuttaa jäännöksen Arg (275) jäännökseksi Leu ja oligonuk-leotidi 927 muuttaa jäännöksen Phe (274) jäännökseksi Pro mu-tantissa, jossa aikaisemmin Lys (277) oli muutettu jäännökseksi Leu. Näin ollen oiigonukleotidejä 875 ja 927 voidaan käyttää kaksoismutaatioiden tuottamiseen. 20 pmoolia -fosforyloitua mutageenistä aluketta ja 20 pmoolia toista aluketta yhdistettiin yhteen pmooliin yksijuosteista mallinetta 10 μΐ:ssa liuosta, joka sisältää 20 mli Tris, pH 7,5, lO mM ligCl2, 50 mli NaCl, 1 mli DTT, ja seosta inkuboitiin 65 eC:n lämpötilassa 10 minuuttia, sitten 5 minuuttia huoneen lämpötilassa ja laitettiin 34 101306 jäihin. Yhdistettyyn DNAshan lisättiin 10 μΐ 20 mM Tris, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM ATP, 10 mM DTT, joka sisältää 1 mM kutakin dNTP, 2,5 yksikköä K1enow—polymeraasia sekä 3,5 yksikköä DNA-ligaasia ja seosta inkuboitiin 3 tuntia 15 °C:n lämpötilassa. Sitten DNA trans-fektoi ti in pätevään E. coli—kantaan JM101 ja solut maljätti in YT—agarille ja niitä inkuboitiin 37 °C:n lämpötilassa. Sitten DNA siirrettiin nitroselluloosalle ja esihybridisoiti in mutageenisen alukkeen kanssa Tm—4 "Csssa 1 tunnin ajan liuoksessa 6x SSC, lOx Denhardt ja ne hybridisoitiin 3aP-merkittyyn mutageeniseen alukkeeseen Tm—4 sC:ssa samassa liuoksessa. Suodattimet pestiin kolmeen kertaan Tm-4 *C:ssa, minkä jälkeen niillä valotettiin röntgensädetilmiä koko yö. Ylimääräisiä pesuvaiheita toteutettiin käyttäen 5 ®C:tta suurempia lisäyksiä, mikäli tarpeen mutanttiplakkien tunnistamiseksi. Järjestys mutatoiduissa istutteissa määritettiin dideoksimenetelmällä.

Taulukko 2 ZC463 5’CCT CAG TTT AAA ATC AAA3' ZC487 5'CAG CTT CAG GCG CGC ATC AAA3' ZC488 5'CAG CCT CAA GGT CGC ATC AAA3’ ZC489 5’CAG CCT CAG AGA CGC ATC AAA3’ ZC620 5’CAG CCT CAG CCT CGC ATC AA3’ ZC621 5’TTT CGC ATC CTC GGA GGG CTC3’ ZC797 5’CTT CAG TTC GGC ATC AAA3’ ZC814 5’G CCT CAG TTC GGC ATC AAA GG3’ ZC874 5’CT CAG TTT CTC ATC AAA GG3’ ZC875 5’CT CAG TTT CTC ATC CTC GG3’ ZC927 5’CAG CCT CAG CCT CGC ATC CT3’ ZC928 5’CAG TTT CGC CCC AAA GGA GG3’ f ZC1013 5’CT CAG TTT CCC ATC AAA GG3’ ZC1027 5’CCT CAG TTT GAC ATC AAA GG3’

Sitten muodostettiin ilmentämisvektorit muutettuja ketjuja varten (kuvio 9). Repiikoi tuvassa muodossa (RF) oleva DNA eristettiin mutagenoituneesta -faagista ja muokatut t-PA-ketjut puhdistettiin Eco RI-kappaleina. Plasmidi Zeml82b pilkottiin 35 101306 entsyymillä Eco Rl, vektori ketjut, jotka sisälsivät t—PAsta koodaavan ketjun 5'— ja 3'-osat, käsiteltiin vasikan ai kalisella fosfataasi1la ja muokatut t—PA—ketjut istutettiin. Tuloksena olevat pla5midit pilkottiin entsyyymei1lä Bam HI ja Xba I ja t—PA—kappaleet istutettiin entsyymeillä Bam HI + Xba I leikattuun plasmidiin pDR3002. Tuloksena olevista vektoreista käytettiin merkintää pMH7 — pMH20 (taulukko 3).

Taulukko 3

Proteiini Aminohappojen 273-279 järjestys

Luonnol. t—PA Gin—Phe—Arg—Ile—Lys—Gly—Gly pMH7 Gln-Gly-Arg—I1e-Lys-Gly-Gly pMH8 Gin—Phe—Arg—Ile—Leu—Gly—Gly pMH9 Gln-Arg—Arg—Ile—Lys—Gly—Gly pMHlO G1n—Pro—Arg—11 e—Lys—G1y—G1y pliH 11 G1 n-Gl u-Arg-11 e-Lys-Gl y-Gl y pMH12 Gin—Phe-Lys-Ile-Lys-Gly—Gly pMH13 G1n-Phe-Gly-I1e—Lys—G1y-Gly pMH14 G1 n-Pro-Arg—11 e-Leu—G1 y—61 y pMH15 G1n-Phe—Leu-I1e-Lys—G1y-Gly pMH16 G1n-Phe-Leu-I1e-Leu—G1y-Gly pMH17 G1n-Phe-Arg-Pro-Lys-Gly-Gly pMH18 G1n—Phe—Pro-I1e-Lys-Gly-Gly pMH19 G1n-Phe-Asp-I1e-Lys-Gly-Gly pMH20 Gln-Phe-Gly-Ile-Leu-Gly-Gly Tämän jälkeen muokatun KT-domeenin ja aktivoitumiskohdan mutaatiot yhdistetään seuraavalla tavalla. Cys (84) mutantti-DNA eristetään muodosteesta Zem99—9200 Bam HI - Sca I-kappaleena ja se liitetään kolmiosaisessa ligaatiossa entsyymeillä Bam HI ja Xba I pilkottuun muodosteeseen Zem219b sekä entsyymeillä Sca I ja Xba I saatuun, muokkautunutta akti voitumiskohtaa koo-daavaan kappaleeseen, joka on saatu muodosteesta pMHlO, pMH13 tai pMH17. Tuloksena olevia i1mentymisvektoreita, joista käytetään merkintää 9200-10, 9200-13 ja 9200—17, käytetään tk—BHK-solujen trans-f ektoi mi seen el ektroporaat iol 1 a. Hyvin tuottavien kloonien tapauksessa mittakaavaa suurennetaan ja proteiini 36 101306 puhdistetaan.

Esimerkki 7

Cys-jäännöksen korvaaminen t-PA-analogissa, Joka sisältää yhtäpitävän sormidomeenin t-PA:n sormidomeenin korvaaminen yhtäpitävällä sormi aiueel1 a johtaa asemissa Arg-27, Lys-49 ja Arg—89 sijaitsevien mahdollisten proteolyyttisten pi 1kkoutumiskohtien eliminoitumiseen. Kahdeksan sormidomeenien korvausketjua muodostettiin fibronek-tiinin ja t-PA:n sormidomeenien analyysin perusteella

Yhtäpitävät sormi ketjut muodostettiin oiigonukleotideistä jäljempänä kuvatulla tavalla, minkä jälkeen ne istutettiin t-PA:ta koodaavaan ketjuun. Tämän istuttamisen helpottamiseksi Κρη I— kohta sijoitettiin alavirran (3') puolelle alueesta, johon on koodautunut villi tyypin sormidomeeni. Tuloksena olevan ketjun pilkkominen entsyymeillä Bgl II ja Κρη I johti villityypin sormidomeenin häviämiseen.

A. Kpn I-kohdan istuttaminen sormidomeenin ja kasvu— tekijädomeenin väliin

Kpn I-kohdan sijoittamiseksi sormidomeenin jälkeen t-PA:ssa mutageneesi toteutettiin oiigonukleotidi 11ä ZC986 (57 TTT GAC AGG TAC CGA GTG GCA 3’). DNA eristettiin -f aagi-M13-kloonista, joka sisälsi 5J Bam HI - Eco RI-kappaleen luonnollisen t-PA:n cDNAssta. 100 μΐ DNA—liuosta käytettiin E. coli-kannan RZ1032 in-fektoimiseen 100 mi krol i trassa YT-alustaa, johon oli lisätty täydennökseksi 0,1 pg/ml uridiinia. Tätä viljelmää inkuboitiin 37 *C:n lämpötilassa voimakkaasti sekoittaen yön yli. M13:n 1 kasvattaminen kannassa RZ1032 tuottaa uridiinia sisältäviä faageja, jotka kykenevät elämään kannassa RZ1032 mutta eivät kannassa JM101.

Solut erotettiin linkoamalla ja -faagisupernatanttia käytettiin E. coli—kannan RZ1032 in-fektoimiseen uudestaan. Tämä toistaminen toteutettiin mahdollisten JM101 kannasta peräisin olevien, 37 101306 urasiiliä sisältämättömien -faagien laimentamiseksi pois. Solut erotettiin Jälleen linkoamalla ja -faagit maljattiin kantojen JM101 ja RZ1032 päälle. RZ1032—maljoilla todettiin normaali elinkelpoisuus (osoittava -faagi pitoisuutena 109 p-fu/ml), kun taas JM101—soluissa ei todettu lainkaan plakkeja. Tämän jälkeen tuotettiin in vitro täydentävä vastinjuoste, jossa alukkeena oli käytetty mutageenista oligonukleotidiä. Tämä uusi, mutaation sisältävä juoste sisälsi tymidiiniä ja oli näin ollen elinkelpoinen kannassa JM101, toisin kuin villityypin malline.

Mal 1 ine—DNA:ta valmistettiin PEG-saostamalla -faagisupernatant-tia, mitä seurasi uuttaminen -fenolin ja kloroformin seoksella sekä saostaminen etanolilla. Yksi pg tätä mal1ine-DNA;ta ja 10 pg oligonukleotidiä ZC9B6 hybridisoiti in keskenään lyhyesti keittämällä, inkuboimalla 65 *C:n lämpötilassa 5 minuuttia ja palauttamalla sitten lämpötila hitaasti arvoon 4 ®C ennenkuin lisättiin 10 pl 0,2 M HEPES pH 7,8, 2 pl 100 mM DTT, 1 pl IM MgCla, 20 pl 2,5 mM kutakin dNTP, 10 pl 10 mM ATP, 1 pl 2,5 ll/pl Klenow sekä 2 pl 1 U/pl T* DNA-1igaasia, ja lopullinen tilavuus asetettiin 100 pl:ksi vedellä. 37 "Csn lämpötilassa 2 tuntia kestäneen jatkamisen jälkeen DNA trans-fektoitiin päteviin JMlOl-soluihin. Vertai 1ujatkaminen (miinus oligonukleo-tidi) toteutettiin jatkettaessa syntyvän taustan suuruuden selvittämiseksi kontaminoivien RNA— ja DNA-1ajien alustuessa. Transfektio ei tuottanut lainkaan plakkeja mutagenoimattomal1 a • ‘ mallineella, 150 plakkia vertai 1 ujat keel 1 a (miinus oi i gonukl eo- tidi) ja 300 plakkia mutagenoidul1 a mallineella.

Maljat seulottiin hybri di soi mal 1 a nostetut plakit =*aP-merki tyn mutageenisen oiigonukleotidin kanssa ja pesemällä 3 M TMAC1-liuoksessa (Wood et ai., Proc. NAtl. Acad. Sei. USA 82; 1585-·_ 1588, 1985) Tm-5 °C:ssa 30 minuuttia sekä samoin selvittämällä järjestys satunnaisesti valituista plakeista. Tällöin saatiin yksi positiivinen klooni.

B. Korvaavien sormidomeenien tuottaminen

Taulukossa 4 ja kuviossa 10 esitetyt yhtäpitävät sormi alueen korvaukset muodostettiin.

38 101306

Taulukko 4

Sormi Koodautunut aminohapooketiu Qliaonukleotidit* t-PA villityyppi: CRDEKTQMIYQQHQSWLRPVLR-SNRVEYCWC—N—SGRAQC Yhtäpitävä 1: (ABC) CFD—NGKSYKIGETWERPYE—GFMLS-CTCLGNGRGEFRC Yhtäpitävä 2: (DEF) CHDEKTGSSYKIGEQWERPYL—SGNRLE-CTCLGNGSGRWQC Yhtäpitävä 3: (ABF) CFD—NGKSYKIGETWERPYE—GFMLS—CTCLGNGSGRWQC Yhtäpitävä 4: (AEC) CFD—NGKSYKIGEQWERPYL—SGNRLE—CTCLGNGRGEFRC Yhtäpitävä 5: (AEF) CFD—NGKSYKIGEQWERPYL-SGNRLE-CTCLGNGSGRWQC Yhtäpitävä 6: (DBF) CHDEKTGSSYKIGETWERPYE—GFMLS—CTCLGNGSGRWQC Yhtäpitävä 7: (DEC) CHDEKTGSSYKIGEQWERPYL-SGNRLE—CTCLGNGRGEFRC Yhtäpitävä B: (DBC) CHDEKTGSSYKIGETWERPYE—GFMLS-CTCLGNGRGEFRC * A = ZC1116/1117 D = ZC1122/1123 B = ZC1118/1119 E = ZC1124/1125 C = ZC1120/1121 F = ZC1126/1127

Taulukko 5 ZC1116 GAT CTT ATC AAG TCA TAT GTT TTG ATA ATG GAA AAT CTT ATA A ZC1117

CTC CAA TTT TAT AAG ATT TTC CAT TAT CAA AAC ATA TGA CTT GAT AA

ZC1118 AAT TGG AGA AAC ATG GGA ACG GCC GTA TGA AGG ATT TAT GCT TTCT ZC1119

CAT GTA CAA GAA AGC ATA AAT CCT TCA TAC GGC CGT TCC CAT GTTT

39 101306 ZC1120

TGT ACA TGC CTA GGA AAT GGC CGC GGA GAA TTT AGA TGT CAT TCG

GTA C

ZC1121 CGA ATG ACA TCT AAA TTC TCC GCG GCC ATT TCC TAG G ZC1122

GAT CTT ATC AAG TCA TAT GTC ATG ATG AAA AAA CAG GCT CGA CTT

ATA A

ZC1123

CTC CAA TTT TAT AAC TCG AGC CTG TTT TTT CAT CAT GAC ATA TGA

CTT GAT AA

ZC1124

AAT TGG AGA ACA ATG GGA ACG GCC GTA TCT TTC TGG AAA TCG ATT

AGA A

ZC1125

CAT GTA CAT TCT AAT CGA TTT CCA GAA AGA TAC GGC CGT TCC CAT

TGT T

ZC1126

TGT ACA TGC CTA GGA AAT GGT TCC GGA AGA TGG CAA TGT CAT TCG

GTA C

ZC1127

CGA ATG ACA TTG CCA TAT TCC GGA ACC ATT TCC TAG G

Nämä kahdeksan yhtäpitävää ketjua muodostettiin esitetyistä oligonukleotideistä. Nämä oiigonukleotidit (taulukko 5) tuotettiin käyttäen yhtiön Applied Biosystems, malli 380A, DNA-synte-tisaattoria. Ensiksi nämä 12 oiigonukleotidiä kinasoitiin ja merkittiin samanaikaisesti siten, että ominaisaktiivisuus oli pieni, τ—*3Ρ ATPsllä inkuboimalla jokaista niistä polynukleo-tidikinaasin kanssa 37 ®C:n lämpötilassa 0,5 tuntia. Sitten esitetyt kahdeksan yhdistelmää (ABC, DEF, ABF, AEC, AEF, DBF, DEC ja DBC) tuotettiin sekoittamalla asianmukaiset oligonukleo— tidit, lisäämällä DNA-ligaasia ja inkuboimalla 37 °C:n lämpötilassa tunnin ajan. Tämän reaktion tuotteet lajiteltiin järjestyksen määrittävällä, 6 7. polyakryyl iamidia ja 8 M ureaa sisältävällä geelillä. Vyöhykkeet, jotka vastasivat täysipitkiä sormidomeeneja koodaavaa DNA:ta, leikattiin irti ja DNA eluoi-tiin 2,5 N ammoniumasetaati11a. DNA seostettiin etanolilla ja 40 101306 suspendoiti in uudestaan veteen pitoisuudeksi 1 pmooli/μΐ.

RF DNA valmistettiin esimerkissä 5A kuvatusta positiivisesta kloonista ja Bam HI — Eco Rl t—PA—kappale puhdistettiin. Plas— midi Zem219a (kuvattu esimerkissä 2) pilkottiin entsyymillä Xba I ja sitten osittain entsyymillä Eco Rl. t—PA:ta koodaavan 3*—alueen sisältävä lOlO emäsparin kappale puhdistettiin. Plas-midi Zem219b (kuvattu esimerkissä 2) pilkottiin entsyymeillä Bam HI ja Xba I ja ligatoitiin 5' t—PA—kappaleeseen (Bam HI-Eco Rl) ja 1010 emäsparin Eco Rl — Xba I—kappaleeseen. Tuloksena oleva vektori, josta käytetään merkintää Zem238, sisältää Κρη I-kohdan sormidomeenin jälkeen. Zem238 pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Κρη I, puhdistettiin geelillä villityypin sormidomeenin poistamiseksi ja ligatoitiin kunkin kahdeksan yhtäpitävän ketjun kanssa ilmentämisvektoreiden 238—Fcon 1 - 238-Fcon 8 aikaansaamiseksi.

C. Cys (84) —korvauksen yhdistäminen yhtäpitävään sormi— domeeni in liuodosteesta ΙΊ13-9200 (esimerkki 4) saatu malline-DNA yhdistetään oiigonukleotidiprimeeriin ZC986, kuten esimerkissä 7A kuvataan. Oikealla tavalla mutatoitunut klooni, joka käsittää sormidomeenin 3”-päähän istutetun Κρη I—kohdan, tunnistetaan ja järjestys selvitetään. Tästä kloonista peräisin oleva RF DNA pilkotaan entsyymeillä Κρη I ja Xba I ja Cys (84) mutantti-DNA ligatoidaan vektori—DNA:hän, joka on saatu entsyymeillä Κρη I ja Xba I pilkotuista plasmideista 238—Fcon 1 — 23B—Fcon 8. Tuloksena olevat vektorit, joista käytetään merkintää 9200— Fcon 1 - 9200—Fcon 8, trans-fektoidaan tk~BHK—soluihin ja mu— tanttiproteiinit puhdistetaan ja niiden tunnusomaiset piirteet selvitetään.

Esimerkki 8

Hiilihydraattien lisäyskohtien muokkaaminen t-PA-analogeissa, jotka käsittävät muutoksia KT-domeenissa

Kudostyyppinen plasminogeeniaktivaattori sisältää neljä mahdollista glykosylointi kohtaa (aminohappoketjua Asn—X—Ser/Thr).

41 101306

Julkaisun Pohl et ai., Biochemi strv 23; 3701-3707, 1984, mukaan kolme näistä kohdista (Asn-117, -184 ja -448) on glykosyloitu-nut Bowes:in melanoomasoluista saadussa t-PA:ssa. Glykosylaatio salpaantuu muutettaessa glykosylointi kohdissa sijaitseva Asn-jäännös muuksi aminohappojäännökseksi. Erityisen edullista on Asn-jäännöksen muuttaminen Gln-jäännökseksi. Muutokset t-PA:ta koodaavassa DNA-ketjussa tehdään kohtaspesi-fisei 1 ä mutagenee-sillä. Nukleotidejä voidaan vaihtaa yksitellen tai yhdistelminä yhden tai useamman glykosylointikohdan muuttamiseksi. Lisäksi mutatoidut ketjut voidaan yhdistää DNA-kappaleisiin, jotka käsittävät t-PA:ta koodaavan ketjun muita häviämiä, istutuksia tai korvauksia useiden mutaatioiden yhdistelmiä käsittävien uusien proteiinien tuottamiseksi.

Kohtaspesi-f inen mutageneesi toteutettiin yksi juosteisissa M13-faagimal1ineissa käyttäen mutageenisia aiukkeitä ZC294, ZC295 ja ZC297 (katso taulukko 6) muutosten aikaansaamiseksi vastaavasti kohdissa Asn—117, —184 ja —448. Sitten muodostettiin yksinkertaisia, kaksinkertaisia tai kolminkertaisia mutaatioita käsittäviä mutantti-t-PA—proteiineja koodaavia DNA-ketjuja korvaamalla t-PAsta koodaava ketju plasmidissa pDR1296. Seuraavat plasmidit muodostettiin: (1) pDRl&Ol, joka käsitti mutaation kohdassa Asn-117; (2) pDR1602, joka käsitti mutaation kohdassa Asn-184; (3) pDR1603, joka käsitti mutaation kohdassa

Asn-448; (4) pDR1604, joka käsitti mutaatiot kohdissa Asn-117 ja -448; (5) pDR1605, joka käsitti mutaatiot kohdissa Asn-184 ja —448; sekä (6) pDR1606, joka käsitti mutaatiot kaikissa kolmessa kohdassa.

Taulukko 6

Aluke Ketju ZC294 5’ACC AAC TGG CAA TGT TGT GCG TTG GCC3’

ZC295 5’TGC TAC TTT GGT CAA GGG TCA GCC3J

ZC297 5’CAA CAT TTA TTG CAA AGA ACA GTC3'

Lisämutageneesiä varten muodostettiin oiigonukleotidialuke <5’ACG GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA3’) jäännösten Gly 42 101306 (183) ja Ser (186) korvaamiseksi vastaavasti jäännöksillä Ser ja Thr. Nämä mutaatiot johtavat K2-domeenin yhdenmukaisempaan glykosyloi tumiseen. Koht asp esi-f i n en mutageneesi toteutettiin yhteen alukkeeseen perustuvalla menetelmällä, käyttäen mallinetta M13mpl8/Bam—Zem99 (esimerkki 3). Yksijuosteinen mutatoi-tunut -faagi — DNA eristettiin ja sen järjestys määritettiin. Kloonista, jossa ketju oli muuttunut toivotulla tavalla, käytettiin merkintää Ml3—6000.

RF DNA eristettiin muodosteesta M13—6000, se pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I, ja arviolta 1,4 ki1oemäsparin kappale eristettiin. Tämä kappale liitettiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I pilkottuun muodosteeseen Zem99 vektorin Zem99—6000 tuottamiseksi. Vektorilla Zem99—6000 transformoitu E. coli RR1 on talletettu kantakokoelmaan Fermentation Research Institute tailetusnumerolla FERM P—9126.

Plasmidista Zem99-9200 saatu Cys (84) —mutantti —DNA pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Nar I. Mutantti-DNA-ketjut eristetään muodosteista pDR1601 ja Zem99-6000 Nar I - Xba I-kappaleina. Plasmidi 9200—1601 muodostetaan ligatoimaila Bgl II — Nar I— kappale muodosteesta Zem99-9200, Nar I - Xba I-kappale muodosteesta pDR1601 sekä Bgl II - Xba I-(vektori)kappale Zem291a. Plasmidi 9200-6000 muodostetaan ligatoimall a Bgl II - Nar I-kappale muodosteesta Zem99—9200, Nar I — Xba I-kappale muodosteesta Zem99-6000 sekä Zem219a-vektorikappale. Näitä plasmideja käytetään tk_BHK-solujen trans-f ektoi mi seen elektroporaatiol la. Mutanttiproteiinit puhdistetaan ja niiden tunnusomaiset piirteet selvitetään.

Plasmidien pDR1601 ja pDR1606 mutantti-t-PA-ketjut eristetään Bam HI - Xba I-kappaleina ja ne istutettiin muodosteeseen Zem 99. Tuloksena olevat ilmentämisvektorit transfektoitiin tk~ BHK—soluihin. Mutanttiproteiinit 1601 ja 1606 eristettiin trans-fektoiduista soluista ja niiden tunnusomaiset piirteet seivi tetti in.

Esimerkissä 5 kuvattujen KT-korvausmutanttien Kl-glykosylointi- 43 101306 kohdassa sijaitsevan Asn—jäännöksen korvaamiseksi malline-DNA preparoitiin -faagista ZpL2 ja mutagenoiti in oiigonukleotidillä ZC14S2 (5’CAA CGC GCT AGA TTG CCA GTT GGT3’ ) . Tuloksena olevasta -faagikloonista käytettiin merkintää ZpL3 (kuvio 7).

Repi i koi tuvassa muodossa oleva DNA preparoitiin -faagista ZpL3 ja t—PA:ta koodaavan ketjun 5’-osan käsittävä Bam HI — Eco RI-kappale eristettiin. Tämä kappale ligatoitiin muodosteesta Zem99 saatuun osittaiseen Eco Rl - Xba I 3’ t-PA-kappaleeseen sekä entsyymeillä Bam HI ja Xba I pilkottuun muodosteeseen Zem219c (kuvio 7). Tuloksena oleva vektori, josta käytetään merkintää ZpL5, pilkottiin entsyymeillä Κρη I ja Xho I ja vek-torikappale puhdistettiin geelillä. Vektori—DNA ligatoitiin esimerkissä 5 kuvattujen kasvutekijän korvauskappaleiden kanssa. Ligaatioseoksilla transformoitiin päteviä E. coli HB101— soluja. Kloonit poimittiin ja KT—domeenien korvaukset varmistettiin hybridisoimalla ja määrittämällä järjestys plasmidien ZpL5A, -B ja -D tapauksessa. ZpL5A transfektoitiin tk—BHK— soluihin ja mittakaavaa suurennettiin hyvin tuottavien kloonien tapauksessa proteiinin tuottamiseksi ja sen tunnusomaisten piirteiden selvittämiseksi.

Esimerkki 9 KT-muokkausten yhdistäminen kringle—domeenin korvaukseen A. Plasminogeenin Asp (96) kringle

Plasmidi pKl käsittää koodaavan ketjun plasminogeenin Kl-do-meenia varten, joiden ketjujen järjestys esitetään kuviossa 11. Se muodostettiin 11 oiigonukleotidistä, joista käytetään merkintää PK1-2, PK1-3, ... PK1-12, ja joiden järjestykset . esitetään taulukossa 7.

Taulukko 7 01igonukleotidi Järjestys

PK1-1 5’GAT CCA CGC GTG CAA CGT GCA AGA CCG GTG ATG GTA

AAA ACT ACC GAG GTA CCA TGT CCA AGA CC3’ 44 101306

PK1-2 5’AAA AAC GGT ATT AGA TGT CAG AAA TGG TCA TCT ACT

AGT CCA CAG CGG CCG CGG TTT TCT3*

PK1-3 5'CCA GCT AGG CAT CCA TCT GAA GGC CTG GAA GAG AAT

TAC TGT AGG AAT CCA GAT AAC GAT3’

PK1-4 5’CCT CAG GGT CCC TGG TGT TAC ACC ACA GAC CCC GAG

AAG AGG TAC GAC TAC TGC GAT ATC GCA TG3' PK1-5 5’CGG TTT TTG GTC TTG G3’ PK1—6 5’GTA GCT GGA GAA AAC CG3' PK1-7 5'CCC TGA GGA TCG TTA TC3' PK1-9 5’CGA TAT CGC AGT AGT CGT ACC TCT TCT C3’ PK1-10 5'GAT CCT CAG GGT CCC TGG TGT TAC ACC ACA3?

PK1-11 5'GAC CCC GAG AAG AGG TAC GAC TAC TCC GAT ATC GCA

TG3’ PK1—12 5'GGG GTC TGT GGT GTA ACA CCA GGG ACC CTG AG3'

Koodaava ketju plasminogeenin Kl—domeenin nukleotidejä 1 — 182 varten muodostettiin oiigonukleotideistä PK1-1 - PK.1-7 seuraavalla tavalla. 100 pmoolia kutakin oligonukleotidiä PK1-1, PK1-2, PK1-3 ja PK1-4 -f os-f oryl oi ti i n niiden S7 päätteestä. Fos-Foryl oi dut oi igonukleot idit sekoitettiin 100 pmooliin kutakin oligonukleotidiä PK1-5, PK1—6 ja PK1-7. Seos saostettiin etanolilla ja sakka suspendoiti in uudestaan veteen ja sitä kuumennettiin 3 minuuttia 90 *C:n lämpötilassa. Sitten liuos jätettiin seisomaan huoneen lämpötilaan 10 minuutiksi, minkä jälkeen se laitettiin jäihin. Jäähdytettyyn seokseen lisättiin 10 μΐ 660 mM Tris HCl-puskuria, pH 7,6, joka sisälsi 6,6 mM ligCls, 10 μΐ 0,1 M ditiotreitol ia, 10 μΐ 5 mM ATPstä ja 1000 yksikköä T* DNA—1igaasia. Tätä seosta inkuboitiin 15 tuntia ; 14 eC:n lämpötilassa. Siihen lisättiin etanolia ja sakka sus- pendoitiin uudestaan 20 pl:aan TE—puskuria (10 mM Tris—Hei, 1 mM EDTA, pH 8,0), minkä jälkeen siihen lisättiin yhtä suuri tlavuus alkalisesti kuormittavaa puskuria (20 mM NaCl, 2 mM EDTA, 80 7. -formamidia, 0,1 % ksyleenisyanolia ja 0,1 7. bromi-fenolisini stä) . Seosta kuumennettiin 3 minuuttia 90 °C:n lämpötilassa ja sitä käsiteltiin el ektro-f or eettisesti tunnin ajan 45 101306 300 volttia käyttäen 6 V. polyakryyliamidigeeli 11 ä, joka sisältää 8,4 M ureaa. Geeli värjättiin etidiumbromidilla ja 250 emäsparin vyöhyke otettiin talteen siirtämällä se elektrofo-reettisesti DEAE-selluloosapaperi1le (Dretzen et ai.. Anal. Biochem. 112: 295-298, 1981). Talteen otettu DNA tehtiin liukoiseksi 100 mikrolitraan TE-puskuria ja tästä kappaleesta käytettiin merkintää PKl-n. PK1—n C—hännitettiin 3”—päätteestä yhdistämällä 10 μΐ PKl-n-1iuosta 2 pl:aan liuosta, joka sisältää 100 mM natriumkakodylaattia ja 25 mM HEPES:tä, pH 7,6, 6,2 pl:aan liuosta, joka sisälsi 1 mM dCTP:tä, 10 yksikköä päättävää deoksinukleotidyyl i -transferääsi a, ja 5 plzaan vettä. Reaktioseosta inkuboitiin 37 eC:n lämpötilassa 10 minuuttia, minkä jälkeen se uutettiin fenolin ja kloroformin seoksella (Is 1) .

Yksi pl 3'-oligo (dG)-hännitettyä plasmidia pUC9 (saatu yhtiöstä Pharmacia) pilkottiin entsyymillä Sma I. Lineaariseksi tehty, hännitetty plasmidi lisättiin C-hännitettyyn muodosteeseen PKl-n. Sitten seos seostettiin etanolilla ja DNA suspendoiti in uudestaan 0,5 pilaan 2M KC1-liuosta ja 9,5 plzaan TE-puskuria, ja seosta inkuboitiin 65 *Czn lämpötilassa lO minuuttia, minkä jälkeen se jäähdytettiin huoneen lämpötilaan. Jäähdytettyyn seokseen lisättiin 5 pl 0,2 M Tris—HC1—puskuria, pH 7,5, joka sisältää 0,1 M MgCl2 ja O,1 M ditiotreitolia, 20 pl 2,5 mM dNTPztä, 10 pl 5 mM ATP:tä, 53 pl vettä, 5 yksikköä DNA—poly— meraasia I (Klenow-kappale) ja 300 yksikköä T.* DNA-ligaasia (lopullinen tilavuus 1O0 pl). Seosta inkuboitiin 14 *C:n lämpötilassa 12 tuntia, minkä jälkeen sitä käytettiin E. coli-kannan JM83 transfektoimiseen.

Transfektoiduissa JM83—soluissa käytettiin koettimena oligo— nukleotidiä PK1—6 noudattaen menetelmää, joka kuvataan julkaisussa Wallace et ai., Nuc. Acids Res. 9z 879-894, 19B1. Järjestys 20 positiivisessa kloonissa määritettiin ja kaksi niistä valittiin, no. 1-3, johon sisältyvät emäsparit 1-170, sekä no. 8-5, johon sisältyvät emäsparit 68—186 (katso kuvio 12).

Kuvioon 13 viitaten, klooni no. 1-3 pilkottiin entsyymeillä 46 101306

Eco Rl ja Fok I, ja Kpn I-kohdan sisältävä 130 emäsparin kappale otettiin talteen. Samoin, klooni no. 8-5 pilkottiin entsyymeillä Fok I ja Hind III ja 90 emäsparin kappale otettiin talteen. Nämä kaksi kappaletta liitettiin entsyymeillä Eco Rl ja Hind III pilkottuun plasmidiin pUC12 ja tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää pPKA. Näin ollen tämä plasmidi sisältää DNA-ketjun, joka vastaa plasminogeenin Kl-ketjun nukleotidejä 1-182.

Loppuosa Kl-ketjusta muodostettiin käyttäen oiigonukleotidejä PK1-9, PK1-10, PKl-ll ja PK1-12. Yksi pikomooli kutakin oligo-nukleotidiä fosforyloitiin 5'-päästä ja yhdistettyihin oligo-nukleotideihin sekoitettiin 40 pg entsyymeillä Bam HI ja SpH I pilkottua muodostetta M13tgl30RF (saatu yhtiöstä Amersham). Tähän seokseen lisättiin 4 μΐ 660 mM Tris HC1-puskuria, pH 7,6, joka sisältää 66 mM MgCl2> sekä 22 jil vettä. Liuosta kuumennettiin kolme minuuttia 90 *C:n lämpötilassa ja sen annettiin jäähtyä huoneen lämpötilaan tunnin ajan. Siihen lisättiin 4 μΐ 0,1 M ditiotreitolia, 4 μΐ 5 mM ATPstä ja 300 yksikköä T* DNA-1igaasia, ja seosta inkuboitiin 12 tuntia 14 *C:n lämpötilassa. Tuloksena oleva faagiklooni, josta käytetään merkintää M13PKB RF (kuvio 14), sisälsi plasminogeenin Kl-ketjun nukleotidit 183-250.

Plasminogeenin täydellistä Kl-ketjua koodaavan ketjun kokoamista havainnol1istetaan kuviossa 6. Plasmidi pPKA pilkottiin entsyymeillä Miu I ja Sau 3AI ja 176 emäsparin kappale otettiin talteen. M13PBK RF pilkottiin entsyymeillä Sau 3AI ja Eco Rl ja 88 emäsparin kappale otettiin talteen. Nämä kappaleet liitettiin entsyymeillä Miu I ja Eco Rl pilkottuun muodosteeseen . M13um20 RF (satu yhtiöstä IBI) ja tuloksena olevasta plasmi dista käytettiin merkintää M13um20—PK1.

Sitten koodaava PKl-ketju istutettiin t-PA cDNAshan karvaamaan t-PA;n Kringle 1-ketju (kuviot 15 ja 16). t-PA-ketju mutage-noitiin ensin Miu I ja Eco RV-kohtien istuttamiseksi. Plasmidi pDR1496 pilkottiin entsyymeillä Sph I ja Xba I ja alfa-tekijän sekä t-PA-ketjut käsittävä 2,1 ki1oemäsparin kappale eristet- 47 101306 ti in. (S.cerevisiae—kanta E8—11C, joka on transformoitu muo-dosteella pDR1496, on tallennettu kantakokoelmaan American Type Culture Collection tailetusnumerolla 20728.) Tämä kappale liitettiin entsyymeillä Sph I Ja Xba I pilkottuun muodosteeseen M13tgl30 (RF) , ja tuloksena olevasta faagista käytettiin merkintää M13tgl30—W. Sitten yksijuosteista faagi—DNA:ta kytkettiin oiigonukleotidi in (5’ 6CA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC 37) ja mutageneesi toteutettiin tavanomaisella tavalla. Mutage-noidusta faagista käytetään merkintää M13tgl30—PKA1. Faagin M13tgl30—PKA yksijuosteista DNA:ta eristettiin ja se mutagenoi— tiin yhteen alukkeeseen perustuvalla menetelmällä käyttäen oiigonukleotidiä, jolla on järjestys 57 CTC AGA GCA TTC CAG GAT ATC GCA GAA CTC 3’. Mutagenoidusta faagista eristettiin yksijuosteista DNA:ta ja sen järjestys määritettiin. Klooni, joka sisältää Miu I-kohdan Kringle lstä koodaavan ketjun 57-päässä ja Eco RV-kohdan 37—päässä, valittiin ja siitä käytettiin merkintää M13tg130-PKA2.

Repi ikoi tuvassa muodossa olevaa DNA:ta eristettiin muodosteesta M13tgl30-PK.A2 ja se pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I.

Miu I— ja Eco RV-kohdan sisältävä kappale otettiin talteen ja se liitettiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I pilkottuun plasmi-diin Zem99, kuten kuviossa 15 esitetään. Tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää Zem99—2020.

Sitten PKl-ketju istutettiin t-PA cDNA:han. M13um20-PK1 RF pilkottiin entsyymeillä Miu I ja Eco RV, minkä jälkeen 336 emäsparin kappale otettiin talteen. Tämä kappale liitettiin entsyymeillä Miu I ja Eco RV pilkottuun muodosteeseen Zem99-2020 Zem99—8000:n tuottamiseksi (kuvio 16). Kuvio 17 esittää t-PA:ta koodaavaa ketjua muodosteessa Zem99-B000 sekä koodautu— nutta aminohappoketjua.

B. Plasminogeenin Asn (96) Kringle

Toinen plasminogeenin K1-ketju, jossa asemaan 96 koodautuu jäännös Asn, muodostettiin (kuvio 16). Zem99—8000 pilkottiin entsyymillä Bam HI ja Bgl II—kohdan sisältävä kappale otettiin talteen. Tämä kappale liitettiin Bam HI:llä leikattuun faagiin 48 101306 M13mpl8 muodosteen MJ3—8000R tuottamiseksi. 01igonukleotidi— aluke (ketju 5’ TTT TTA CCA TTA CCG GTC TT 3’) kiinnitettiin yksijuosteiseen muodosteeseen M13—8000R ja mutageneesi toteutettiin yhteen alukkeeseen perustuvan menetelmän tavanomaisilla toimenpiteillä. Kloonit seulottiin ja järjestys määritettiin ja kaksijuosteista DNA:ta, josta käytettiin merkintää M13— 8000RF, eristettiin positiivisesta kloonista. Tämä -faagi pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I ja t-PA-kappale eristettiin ja ja yhdistettiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I leikattuun muodosteeseen Zem99. Tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää Zem99-8100. Kuvio 18 esittää plasmidissa Zem99-8100 läsnäolevaa, t-PA:ta koodaavaa ketjua sekä koodautunutta amino-happoketjua.

Plasmidit Zem99-8000 ja Zem99-B100 on talletettu (E. coli RRI-trans-f ormantteina) kantakokoelmaan FRI tai 1 etusnumeroi 11 a FERM P—9272 ja FERM P-9315, vastaavasti.

C. KT-muokkausten ja Kl—korvauksen yhdistelmä

Yksijuosteista DNA:ta eristettiin muadosteesta M13—9200 ja se mutagenoitiin käyttäen oiigonukleotidiä 5’ GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC 3’ Miu I-kohdan sijoittamiseksi ketjuun. Muta-genoidusta -faagista käytettiin merkintää M13-92.05PKA1. RF DNA otettiin talteen mutantti-faagista ja se pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Miu I ja 264 emäsparin kappale otettiin talteen. Zem99-8000 pilkottiin entsyymeillä Miu I ja Apa I ja 1126 emäsparin kappale otettiin talteen. Nämä kaksi kappaletta liitettiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I pilkottuun muodosteeseen Zem99, ja tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää Zem99-9280. Näin ollen tähän plasmidiin ovat koodautu-neet aminohappoasemassa 84 Ser—jäännöksen käsittävä mutantti t-PA sekä asemassa 96 Asp-jäännöksen käsittävä plasminogeenin Kl-domeeni.

Sitten muodostettiin toinen vektori, jonka sisältämään mutantti t-PA-ketjuun on koodautunut aminohappoasemassa 84 Sei—jäännöksen käsittävä t-PA-analogi sekä plasminogeenin Kl-domeeni, joka käsittää Asn-jäännöksen asemassa 96. RF DNA muodosteesta 49 101306 M13—92.05PKA1 pilkottiin entsyymeillä Bgl II ja Miu I ja 264 emäsparin kappale otettiin talteen. Zem99-8100 pilkottiin entsyymeillä Miu I ja Apa I ja 1126 emäsparin kappale otettiin talteen. Nämä kaksi kappaletta liitettiin entsyymeillä Bgl II ja Apa I pilkottuun muodosteeseen Zem99 ja tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää Zem99—9281.

Plasmidi Zem99-8000 pilkottiin entsyymeillä Spe I ja Hind III ja kappale, joka sisälsi 3' mutantti t-PA:ta koodaavan ketjun sekä koko hGH-päättäjän, puhdistettiin geelillä. Plasmidi ZpL7 pilkottiin osittain entsyymillä Hind III ja täydellisesti entsyymillä Xho I ja vektori ketjut poistettiin puhdistamalla 3’ t-PAsta koodaavasta ketjusta sekä hGH-päättäjästä. Oligonuk-leotidit ZC1639 ja ZC1640 (taulukko 3) kiinnitettiin toisiinsa ja tuloksena oleva Xho I - Spe I-k.appale (johon on koodautunut plasminogeenin Kl-kringlesn 5’-osa) yhdistettiin 1igaatioreak-tiossa edellä saatuun kahteen puhdistettuun kappaleeseen. Tuloksena olevasta plasmidista käytettiin merkintää 8900. Kimee-risten ketjujen, joihin koodautuneet t-PA-johdannaiset käsittävät KT- ja K1-korvaukset, muodostamiseksi plasmidi 8900 pilkottiin entsyymeillä Bam HI ja Xho I ja KT—alue korvataan Bam HI — Xho I-alueella, joka on eristetty jostakin plasmidista ZpL7A—N.

Esimerkki 10

Proteiinien tunnusomaisten piirteiden selvittäminen

Proteiinit 9100 ja 9200 valmistettiin edellä kuvatulla tavalla ja niiden aktiivisuus ja puoliintumisaika plasmassa määritettiin käyttäen vertailuna luonnollista t-PA:ta, joka oli saatu trans-fektoiduista tk“BHK—soluista.

t-PA-analogien no. 9100 ja no. 9200 hyytymiä hajottava aktiivisuus testattiin käyttäen luonnollista yhdistelmä-t-PA:ta vertailuna. Silkki lanka, jonka pituus oli 3 cm, vietiin Atom-las-kimokatetriin (4Fr 3,5 cm) ja katetri yhdistettiin injektio-ruiskuun. Ihmisen sitraattipitoista verta valmistettiin sekoittamalla verta ja natriumsitraatin 3,8-prosenttista liuosta 50 101306 suhteessa 9:1. Tämä sitraattipitoinen veri <0,5 ml) yhdistettiin ia=I—f ibrinogeeni in (25 μΟϊ 50 pl:ssa -fysiologista suolaliuosta), 50 pl:aan 0,25 M CaCl2 ja trombiini in <5 U/10 μΐ liuosta). 16 μΐ tuloksena olevaa liuosta injektoitiin katetriin ja katetrin annettiin seisoa huoneen lämpötilassa 60 minuuttia. Sitten silkkilanka poistettiin katetrista ja pestiin -fysiologisella suolaliuoksella. Lankaan sitoutunut radioaktiivisuus (alkuperäinen fibriinitukoksen arvo) määritettiin. Tämän jälkeen lanka vietiin urospuolisissa Sprague-Dawley-rotissa, joiden paino on 200 — 300 g, yhteisen päänvaltimon (carotid) ja laskimon väliseen (V-L) sivukanavaan. Eläimen reisi laskimoon injektoitiin yhden millilitran suuruisia proteiininäytteitä suolaliuoksessa, joka sisälsi 50 yksikköä hepariinia millilit-rassa. Silkkilanka poistettiin kahden tunnin kuluttua sivukana-vasta ja radioaktiivisuus (jäljelle jääneen -f ibri ini tukoksen arvo) määritettiin. Jäljelle jäänyt tukossuhde määritettiin yhtälöstä: Jäljelle jäänyt tukossuhde = Jäljelle jääneen -f ibri ini tukoksen arvo κ 100

Alkuperäisen fibriinitukoksen arvo

Kuvio 19 on graa-finen esitys tuloksista, jotka saatiin käytettäessä luonnollista t—PAsta, analogia 9100 sekä analogia 9200 erisuuruisina annoksina. Tiedot osoittavat, että mutanttiproteiini en kyky hajottaa hyytymiä in vivo on verrattavissa luonnollisen t-PA:n vastaavaan kykyyn.

Jotta saataisiin määritetyksi puoliintumisaika plasmassa, proteiinit liuotettiin suolaliuokseen. Tätä liuosta injektoitiin urospuolisten Sprague—Dawley—rottien (ruumiin paino 230 — 270 g) reisi laskimoon annoksena, jonka suuruus oli 0,4 mg/kg. Veri-! näytteitä (0,5 ml) otettiin kaulai askimosta, niihin lisättiin sitruunahappoa pitoisuudeksi 3,θ V. ja ne sentri-fugoitiin. t— PA:n määrä plasmassa määritettiin kerrostetyyppisellä entsy-maattisella immunokokeella. Kuvio 20 esittää käyränä proteiinin määrää plasmassa ajan funktiona injektion jälkeen.

51 101306

Veressä läsnäolevien protei ini määrien muutokset analysoitiin käyttäen kahteen osastoon perustuvaa mallia (Shargel, L ja Yu, A.B.C., toim., Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics. Appleton—Century—Crofts, New York, 1980, sivut 38—48) . Puol i intumisajat määritettiin katoamisen al-fa— ja beeta-vaiheille. Samoin määritettiin beeta—vaiheen ekstrapoloitu leikkauspiste oordinaatan (B) kanssa sekä käyrän alle jäävä pinta-ala (KAP-A). Saadut arvot esitetään taulukossa 9.

Taulukko 9

Proteiini Tl/2(<x) Τ1/2(β) B KAP-A

Luonnol. t-PA 1,60 31,74 0,186 33,11 9200 2,22 153,22 1,780 462,95

Luonnollisen t—PA:n sekä mutanttiproteiinien ZpL7—A, ZpL7-B ja ZpL7-F (vastaten kuvioita 8A, B ja F) puoliintumisaika plasmassa määritettiin rotissa. Kutakin testattavaa proteiinia varten kaksi naaraspuolista Balb/c-hiirtä, jotka painoivat 20-21 g, nukutettiin eetterillä ja niihin injektoitiin häntä-laskimon kautta 10 pg affiniteetin perusteella puhdistettua proteiinia yhteensä 100 pl:ssa PBS—liuosta. Injektioruiskut punnittiin ennen injektointia ja sen jälkeen. Eläinten silmäkuopan takaisesta punoksesta (plexus) otettiin asianmukaisten ajanjaksojen jälkeen plasmanäytteitä (25 μΐ) käyttäen hepari— noituja mikropipettejä. Näytteet sentrifugoiti in punaisten verisolujen poistamiseksi ja ne laimennettiin määritystä varten. t-PA:n määrä plasmassa määritettiin ELISA—menetelmäl1ä käyttäen affiniteetin perusteella puhdistettua kaniinin poly— klonaalista, ihmisen luonnollista t-PA:ta vastaan vaikuttavaa vasta-ainetta.

Näistä kokeista saadut tulokset esitetään kuviossa 21. Kaikkien kolmen mutanttiproteiintn todettiin katoavan merkittävästi luonnollista t-PA:ta hitaammin. Näiden tulosten perusteella voidaan päätellä, että aminohappomuutokset analogin A kasvu— tekijädomeenissa sekä tekijän IX ja tekijän VII kasvutekijä-korvaukset analogeissa B ja F häiritsevät näiden molekyylien 52 101306 katoamista normaalia reittiä (reittejä) pitkin.

Samankaltaisten kokeiden perusteella mutanttiproteiinin ZpL5A (katso esimerkki Θ) puoliintumisaika oli 7,7 minuuttia. Luonnollisen t-PA:n puoliintumisaika näissä kokeissa oli 1,5 minuuttia.

Mutanttiproteiinien 1601 _ia 1606 puoliintumisaika plasmassa määritettiin kaniineissa. Tulokset esitetään taulukossa 10.

Taulukko 10

Protei ini Tl/2 (minuuttia)

Luonnol. t-PA (yksi ketju) 2,3 ± 0,1

Luonnol. t-PA (kaksi ketjua) 2,0 ±0,1 1601 3,2 - 3,5 1606 3,2 - 3,0

Edellä esitetyn perusteella on selvää, että vaikka ohessa kuvataankin keksinnön havainnollistamiseksi sen erityisiä suoritusmuotoja, niin kuitenkin lukuisat muutokset ovat mahdollisia keksinnön hengestä ja tavoitteista tällöin kuitenkaan poikkeamatta. Näin ollen keksintöä rajoittavat yksinomaan liitteenä olevat patenttivaatimukset.

Claims (7)

101306

1. Menetelmä t-PA-analogin valmistamiseksi, tunnettu siitä, että menetelmä käsittää vaiheet, joissa (1) viljellään isäntäsolua, joka on transformoitu ilmentämis-vektorilla sisältäen t-PA-analogia koodaavan DNA:n, joka t-PA-analogilla on kuvion 6 mukainen, numerolla 1 alkava aminohapposekvenssi ja sisältää natiivin t-PA:n kasvutekijäalueen, jossa alueessa natiivin t-PA:n kysteiinijäännös no. 84 on korvattu seriinillä, ja (2) otetaan talteen saatu t-PA-analogi.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että analogi sisältää kaksi kringle-rakennetta, joista vähintään toisesta puuttuu hiilihydraatti.

3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että isäntäsolu on nisäkkään solu.

4. Rekombinantti-DNA-sekvenssi, tunnettu siitä, että se koo-daa sellaista natiivin t-PA:n kasvutekijäalueen sisältävää, kuvion 6 mukaisen, numerolla 1 alkavan aminohapposekvenssin omaavaa t-PA-analogia, jossa alueessa kysteiinijäännös no. 84 on korvattu seriinillä.

5. Isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on transformoitu il-mentämisvektorilla, joka sisältää patenttivaatimuksen 4 mukaisen DNA-sekvenssin, joka on toiminnallisesti kytketty promoottoriin.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen isäntäsolu, tunnettu siitä, että se on nisäkkään solu.

7. Ilmentämisvektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 4 mukaista aminohapposekvenssiä koodaavan DNA-sekvenssin. 1 Patenttivaatimuksen 7 mukainen vektori, tunnettu siitä, että vektori on Zem 99-9200, joka on talletettu talletuslaitokseen FERM talletusnumerolla P-9274. 101306