KR0135427B1 - 변형된 성장인자 도메인을 갖는 조직 플라스미노겐 활성화제 동족체를 암호화하는 dna, 이를 함유하는 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포 - Google Patents
변형된 성장인자 도메인을 갖는 조직 플라스미노겐 활성화제 동족체를 암호화하는 dna, 이를 함유하는 발현 벡터 및 이를 포함하는 숙주세포Info
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Abstract
내용없음.
Description
제1도는 암호화된 단백질의 아미노산 서열과 함께, cDNA 및 합성된 올리고뉴크레오타이드로부터 작제된 프리-프로(pre-pro) t-PA 암호화 서열을 나타낸다. 라인 위의 수는 뉴클레오타이드의 위치를 언급하고, 라인 아래의 수는 아미노산 위치를 언급한다.
제2도는 벡터 Zem99의 작제를 나타낸다.
제3도는 벡터 Zem219b 및 Zem219c의 작제를 나타낸다.
제4도는 벡터 Zem99-9100 및 Zem99-9200의 작제를 나타낸다.
제5도는 암호화된 t-PA 동족체의 아미노산 서열과 함께, Zem99-9100내의 돌연변이체 DNA 서열의 뉴클레오타이드 서열을 나타낸다. 수는 아미노산 위치를 나타낸다.
제7도는 벡터 ZpL5 및 ZpL7의 작제를 나타낸다.
제8도는 키메릭 도메인(Chimeric domain)을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드의 결합과 함께, 특정한 성장인자 도메인 서열 치환을 나타낸다.
제9도는 변경된 활성부위를 갖는 플라스미노겐 활성화제를 암호화하는 DNA 서열을 포함하는 발현 백터의 pMH 계열의 작제를 나타낸다.
제10(A)-(I)도는 천연 t-PA의 핑거 도메인(finger domain) 및 콘센서스 핑거 도메인의 아미노산 서열을 나타낸다.
제11도는 플라스미노겐의 K1 도메인의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 나타낸다.
제12도는 플라스미노겐 K1 도메인의 일부를 암화화하는 클론 #1-3 및 #8-5의 부분 제한 지도를 나타낸다.
제13도는 플라스미드 pPKA의 작제를 나타낸다.
제14도는 플라스미노겐 K1 암호화 서열을 함유하는 벡터의 작제를 나타낸다.
제15도는 플라스미드 Zem99-2020의 작제를 나타낸다.
제16도는 플라스미드 Zem99-8000 및 Zem99-8100의 작제를 나타낸다.
제17도 및 제18도는 대표적인 t-PA 동족체인 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 나타낸다.
제19도는 천연 t-PA 및 본 발명의 대표적인 t-PA 동족체상에서의 응괴 용해 검정의 결과를 나타낸다. (-)는 천연 t-PA를, (----)는 동족체 #9100를, (- -)는 동족체 #9200을 나타낸다.
제20도는 래트에게 투여시 천연 t-PA 및 대표적인 t-PA에 대한 시간에 따른 혈장 수준을 플롯팅한 결과를 나타낸다. 사용된 기호 ●는 동족체 9100을, △는 동족체 9200을, ○는 천연 t-PA를 표시한다.
제21도는 천연 t-PA 및 3개의 대표적인 돌연변이체 t-PA의 혈장 반감기 연구의 결과를 나타낸다.
제22A, B 및 C도는 다양하게 선택된 단백질의 성장인자 도메인의 아미노산 서열의 비교를 나타낸다. 그 서열들은 하기와 같이 명시된다 : TPA, 천연 조직 플라스미노겐 활성화제 ; Urok, 우로키나제; F7, 인자 VII;F9 인자 IX;F10, 인자 X;PS, 단백질 Z; EGF, 표피성장인자; TGFa, 형질전환 성장인자 α; TGFtr, 형질전환 성장인자 타입 I(래트); C9, 상보적 인자 9; LDLr, 저밀도 지방 단백질 수용체; EGFr, EGF 수용체; PC, 단백질 C. 다른 기호로는 h, 사람; p, 돼지; m, 마우스; b, 소; rb, 래비트가 있다. 인자 VII, IX, X 및 단백질 C, S 및 Z의 경우, 수 및 상부 문자 유전자 엑손(exon)을 의미한다. EGF 수용체 및 LDL 수용체의 경우, 각각의 수 및 상부 문자는 특정한 성장인자 도메인을 가리킨다. 예를 들어, PC-4h는 사람 단백질 C 4번째 엑손 성장인자 도메인; LDLrBrb는 래비트의 저밀도 지방 단백질 수용체의 성장인자 도메인 B를 나타낸다. 갭(-)은 단백질중 상동성을 최대화하기 위해 삽입되었다. 아미노산은 표준 단일 문자 코드로 고안된다.
본 발명은 피브린 분해제, 그들의 재조방법 및 그들을 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 보다 특히, 변형된 성장인자 도메인을 갖는 조직 플라스미노겐 활성화제 동족체에 관한 것이다.
조혈은 여러 효소들의 복합 상호작용에 의해 유지된다. 응괴인자는 활성화 단계의 캐스케이드(cascade)에서 상호작용으로 궁극적으로는 피브린 응괴의 형성을 야기시킨다. 후속적인 피브린 응괴의 분해는, 피브린을 분해시키는 단백질 분해 효소인 세린 프로테아제 플라스민(serine protease plasmin)이 관여한느 피브린 분해 시스템의 의해 달성된다. 플라스민은 또한 특정의 응고 인자를 절단하여 이들을 불활성화시키는 광범위한 스펙트럼을 갖는 프로테아제이다. 이의 불활성 전구체인 플라스미노겐으로부터 플라스민의 생성은 플라스미노겐의 생리학적 혈관 활성화제로서 간주되는 피브린-특이성 세린 프로테아제인 조직 플라스미노겐 활성화제(t-PA)에 의해 조절된다. 우로키나제-형 플라스미노겐 활성화제(u-PA)는 세린 프로테아제로서 특징지워지는 플라스미노겐 활성화제 부류의 다른 성분이다. t-PA 및 u-PA는 기능적으로 및 면역학적으로 구별가능하다. 정상적인 조혈 시스템이 와해되는 경우, 부적절한 시기 및 장소에서 응괴가 형성되어 심근경색, 심부정맥 혈전증, 폐동맥 색전증 및 발작을 야기시킬 수 있다. 이들 질환으로부터 기인된 조직 손상은 사망 또는 심각한 불구를 야기시킬 수 있다.
t-PA는 일반적으로 Mr 약 72,000달톤(daltons)의 폴리펩타이드 일본쇄로서 순환하며, 아미노산 275(Arg)와 276(Ile) 사이의 펩타이드 결합의 절단에 의해 이본쇄 형태로 전환된다. t-PA중의 중쇄(Mr 40,000 및 37,000의 2개의 변이체)는 t-PA 분자의 아미노-말단으로부터 유도되는 반면, 경쇄(Mr 33,000)는 t-PA 분자의 카복시-말단으로부터 유도된다. 이러한 절단은 트립신 또는 플라스민에 의해 촉매화되며, 합성 기질을 사용하여 측정하는 경우 활성의 증가, 및 피브린 분해 활성의 증가를 수반한다. 일본쇄 t-PA는 피브린에 결합되면 활성으로 되는데, 이는 아마 피브린에 결합함으로써 유발된 활성화제에 있어서의 구조적 변화에 기인된 것으로 보인다. 이본쇄 형으로의 분해는 혈류로부터 t-PA의 신속한 제거와 연관될 수 있지만, 이와 상충되는 보고서도 발표되어 있으며〔참조 : Wallen et al., Eur. J. Biochem. 132 : 681-686, 1983〕, 이러한 제거 기작은 거의 이해되지 않는다.
잠재적인 전구체 t-PA 단백질의 2-차원 모델이 정립되어 있다〔참조 : Ny et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 5355-5359, 1984〕. 이 모델로부터, 중쇄가 크링클(Kringle)로서 알려진 2개의 삼중 디설파이드구조를 함유하고 있다는 것이 밝혀졌다. 유사한 크링글 구조물이 또한 프로트롬빈, 플라스미노겐 및 우로키나제에 존재하며, 피브린에 대한 결합에 중요한 것으로 생각된다〔참조 : Ny et al., 상기 참조〕. t-PA의 제2크링클(K2)은 제1크링클(K1) 보다 피브린에 대한 친화성이 높다고 간주된다〔참조 : Ichinose Takio 및 Fujikawa, J. Clin. Invest., 78 :163-169, 1986; Verheijen et al., EMBO J. 5 : 3525-3530, 1986〕.
또한, t-PA의 중쇄는 표피 성장인자, 및 단백질 C, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X중의 유사한 도메인과 동종인 삼중 디설파이드-결합된 구조인 성장인자 도메인을 함유한다. 천연 t-PA의 성장인자 도메인은 대략 48 내지 90개의 아미노산을 함유한다. 성장인자 도메인은 t-PA의 신속한 생체내 제거반응에 관여하며, 성장인자 도메인의 결실은 생성된 분자의 피브린에 대한 결합을 방해하지도 않고, 플라스미노겐을 활성화시키는 이의 능력을 차단시키지도 않는다고 밝혀졌다.
t-PA의 중쇄는 또한 피브로텍틴의 핑거(finger) 도메인과 상동적인 핑거 도메인을 함유한다. 피브로넥틴은 피브린 결합을 포함하여, 다양한 생물학적 활성을 나타내는데; 이의 피브린 결합 활성은 9개의 핑거 도메인중 4 또는 5개와 상관 관계가 있다.
t-PA의 전구체 형태는 프리-영역(pre-region) 다음의 하부에 프로-영역(pro-region)을 함유하고, 이것을 집합적으로 프리-프로(pre-pro) 영역이라 언급한다. 프리-영역은 혈관 내피세포에 의해 t-PA가 분비되기 위해 중요한 단일 펩타이드를 함유한다(참조 : Ny et al., 상기 참조). 프리 서열은 세포의 분비에 있어서 필요한 단계인, t-PA를 소포체의 루멘(lumen)으로 분비하는데 관여하는 것으로 생각되어진다. 프로 서열은, 소포체에서 골지체로 이동된 후 t-PA 분자로부터 절단되는 것으로 간주된다.
동물 및 사람에서 피브린 분해를 위한 t-PA의 용도는 천연 분자의 몇가지 단점을 강조하여 왔다. 생체내에서의 t-PA의 반감기는 사람의 경우 3분 정도로 짧은 것으로 나타나 있다(참조 : Nilsson et al., Scand. J. Haematol. 33: 49-53, 1984). 주입된 t-PA는 신속히 간에 의해 제거되거, 30분 내에, 주입된 물질의 거의 대부분이 저분자량 형태로 대사된다. 이러한 짧은 반감기로 높은 치료 투여용량의 필요성이 초래될 수 있다. 전형적으로, 천연 t-PA는 환자당 30 내지 150mg의 용량으로 투여되고, 단백질의 저용해성으로 장기간 주입이 필요하다. 푸치스(Fuchs)등은(참조:Blood 65:539-544, 1985), 주입된 t-PA가 단백질 분해 부위와 독립적인 과정에서 간에 의해 제거되고, 주입된 t-PA는 체내에 축적되지 않음을, 즉, 제거기작이 포화될 수 없다고 결론지였다. 또한, 관상 혈전을 분해하기에 충분한 t-PA의 투여용량은 정상 생리학적 수준 보다 훨씬 크고, 신체 전체에 플라스미노겐의 활성을 일으켜 피브리토겐의 전신적 분해를 야기시키고(참조; Sherry, 상기 참조), 위험한 출혈 상태를 초래할 수 있다.
많은 학자들이 이외 임상적 적합성을 강화시키기 위한 시도로 t-PA를 변형시켜 왔다. 로사 및 로사(Rosa and Rosa: International Patent Application WO 86/01538)는 t-PA의 일본쇄 형태를 안정화시키기 위하여 t-PA의 277위치에 Lys을 변형시켰다. 이.콜라이(E. Coli)에서 생성된 Ile(277) t-PA는 천연 t-PA와 비교해서 일본쇄 분자라소 덜 활성적이라고 밝혀졌다. 왈렌(Wallen)(상기 참조)등은 이 리신 잔기가 일본쇄 t-PA의 단백질 분해 활성헤 책임이 있다고 가정하였다. 헤이네커 및 베하(Heyneker and Vehar)는 t-PA의 절단 부위 주위의 아미노산 치환을 기술하였다(공개된 영국 특허원 제2,173,804호). 275 위치에 Glu를 포함하는 변이체 t-PA는 천연 t-PA에 비해 더 큰 특이적 활성을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 변이체 t-PA는 또한 t-PA 억제제와 거의 복합체를 형성하지 않는다. 일본쇄 형태는 또한 이본쇄 형태보다 피브린에 대한 친화성이 큰 것으로 나타났다. 로빈슨(Robinson)은 혈장 반감기를 증가시키기 위해 t-PA로부터 탄수화물 측쇄를 제거하는데 효소적 방법을 사용하였다(참조; WO 제84/01786호); 라우(Lau)등은 [참조; Bio/Technology, 5 : 953, 1987] 451 위치에 탄수화물이 결핍된 t-PA변치체를 기술하였다. 반 존네벨드(Van Zonneveld)등은 중쇄의 부분이 결실된 t-PA의 변형된 형태를 기술하였다.[참조; Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:4670-4674,1986]. 로빈슨 등은(유럽 특허 제207,589호 A1) 성장인자 도메인이 결실되었거나 달리 변형된 t-PA의 돌이변이체 형태를 기술하였다. 라센(Larsen)등은 아미노산 치환 및/또는 결실이 있는 t-PA-유사 단백질을 기술하였다(WO 제87/04722호). 에를리히(Ehrlich)등은 크링글 도메인이 결여된 재조합 t-PA분자를 기술하였다[참조; Fibrinolysis 1: 75, 1987]. 그러나, t-PA의 이러한 변이체 형태는 천연 단백질과 관련된 문제를 완전히 해결하지는 않는다.
본 분야에는 장 반감기 및 피브린에 대한 고특이성을 갖는 플라스미노겐-활성화 단백질이 여전히 요구되고 있다. 본 발명은 성장인자 도메인이 구조적으로 변형된 조직 플라스미노겐 활성화제의 신규한 유도체를 제공함으로써 상기의 욕구를 충족시켜 준다. 본 명세서에 기술된 t-PA 동족체는 훨씬 더 소량을 사용할 수 있음으로써, 천연 t-PA의 저용해성 문제점을 극복해주며, 효능적으로 주입 보다는 주사로의 투여를 가능케하여 줌으로써, 치료학적 피브린 분해제로서 천연 t-PA에 비해 상당한 이점을 제공해준다. DNA재조합 기술을 사용하여, 상기 단백질의 일관되고 균질한 공급원을 제공할 수 있다. 이 단백질은, 심장마비 및 발작 환자 및 치료학적으로 피브린 매트릭스의 형성을 용해시키거나 억제시킬 필요가 있는 기타 환자에게서 나타나는 응괴를 용해시키는데 사용할 수 있다.
간략해서, 본 발명은 천연 t-PA의 성장인자 도메인(이때, 도메인은 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산으로 치환된 상태이다)을 함유하는 조직 플라스미노겐 황성화제 동족체를 제공한다. 본 발명의 특정양태에서, 시스테인 잔기는 천연 t-PA의 84번이고, 아미노산은 세린 또는 알라닌이다. 특정의 바람직한 태양에서, 시스테인 잔기는 천연 t-PA의 84번이고, 이 아미노산은 세린이다.
본 발명의 또다른 양태로, 천연 t-PA의 성장인자 도메인에 비해 실질적으로 연속적인 다수의 아미노산이 치환되어 혈장내 반감기가 증가되는 성장인자 도메인, 크링글 도메인 및 세린 프로테아제 도메인을 포함하는 플라스미노겐 활성제가 제공된다. 본 발명의 목적을 위해, 용어 다수의 치환이란 4개 이상의 치환을 의미한다. 이러한 실질적으로 연속적인 아미노산 치환은 성장인자 도메인의 하나 이상의 영역에서 이루어질 수 있다. 성장인자 도메인은 인자 Ⅶ, 인자Ⅸ, 단백질 C 또는 표피성장인자와 같은 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 양태에 있어, 성장인자 도메인은 제8도에 도시된 바와 같이 단편 A내지 N중 어느 하나의 성장인자 도메인의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명에 기술된 t-PA 동족체 및 플라스미노겐 황성화제는 또한 절단부위의 13개의 아미노산 잔기내에서 하나 이상의 아미노산이 치환될 수 있고, 이러한 치환으로 플라스민에 의한 절단내성은 증가된다. 또한, 본 발명에 기술된 t-PA 동족체는 제10(A) 내지 (I)도에 도시된 서열로 이루어진 그룹중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 핑거 도메인(finger domain)을 함유할 수 있다.
본 발명의 또다른 측면에 있어, 동족체 또는 플라스미노겐 황성화제는 두 개의 크링글 구조를 함유하는데, 이중 적어도 하나는 탄수화물이 결여된 상태이다. 또한, 본 명세서에 기술된 동족체 및 플라스미노겐 활성화제는 플라스미노겐으로부터 유도된 크링글 구조를 함유할 수 있다. 바람직한 태양으로, 플라스미노겐크링글 구조는 플라스미노겐의 K1, K4 및 K5 크링글 도메인으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 플라스미노겐 크링글 구조이외에도, t-PA 동족체 및 플라스미노겐 황성화제는 또는 플라스미노겐 크링글 구조의 하부에 위치한 천연 t-PA의 K2 크링글 구조를 추가로 함유할 수 있다.
본 발명의 관련 양태 및 상기의 양태에서, t-PA 동족체는 단백질 C, 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ 및 인자 Ⅹ으로 이루어진 그룹중에서 선택된 단백질의 성장인자 도메인을 함유하는 것으로 기술된다. 이들 동족체는 또한 상술한 치환 및 기타 변형을 포함할 수 있다.
상술한 t-PA 동족체 및 플라스미노겐 황성화제를 암호화하는 DNA 서열 뿐만 아니라, 상기와 같은 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터가 또한 기술되어 있다. 이러한 면에 있어서 바람직한 발현 벡터는 Zem99-9100 또는 Zem99-9200이다.
상기와 같은 발현 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주세포가 또한 기술되어 있다. 숙주세포는 이. 콜라이 또는 BHK 숙주세포와 같은 포유동물 숙주세포일 수 있다.
본 발명의 또다른 양태는, 상술한 바와 같은 t-PA동족체 또는 플라스미노겐 황성화제, 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 기술하고 있다.
이들 및 본 발명의 다른 양태는 다음의 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참고로 하여 더욱 명료해질 것이다.
본 발명을 기술하기 전에, 본 명세서에 사용된 특정 용어의 정의를 설명하는 것이 본 발명을 이해하는데 도움이 될 수 있다.
상보성 DNA 또는 cDNA : mRNA 주형에 존재하는 서열로부터 효소적으로 합성되는 DNA 분자 또는 서열, 또는 그러한 분자의 클론(Clone).
DNA 작제물: 천연적으로는 존재하지 않는 방식으로 혼합되고 병렬된 DNA 단편을 함유하도록 사람이 개입하여 변형시킨, 일본쇄 또는 이본쇄의 DNA 분자, 또는 그러한 분자의 클론.
플라스미드 또는 벡터 : 숙주세포에 삽입되는 경우 유전 정보의 복제를 제공하도록 유전 정보를 함유하는 DNA 작제물, 복제는 자발적으로 또는 숙주 게놈(genome)내로 통합시켜 수행할 수 있다. 플라스미드는 일반적으로 숙주세포에서 발현되는 1개 이상의 유전자 서열 및 프로모터(promoter), 전사개시부위 및 전사터미네이터를 포함하는, 상기와 같은 유전자 발현을 돕는 기능을 암호화하는 서열을 함유한다. 이것은 선형분자 또는 환상분자일 수 있다.
프리-프로 영역: 특정 단백질의 전구체의 아미노 말단에 존재하며, 일반적으로 분비중에, 적어도 부분적으로 단백질로부터 절단되는 아미노산 서열. 프리-프로 영역은 세포의 분비경로로 단백질을 유도하는 서열을 부분적으로 포함하며, 일반적으로 소수성 아미노산이 풍부한 영역을 함유한다.
도메인(Domain) : 단백질 분자의 아미노산의 3차원인, 자가-조합 배열(self-assembling array)로서, 단백질의 특이적 생물학적 활성에 필요한 구조 요소를 함유한다.
생물학적 활성 : 생물학적 대상(즉, 유기체, 세포, 도는 이의 시험관내 시험 복사)에 있어서, 분자에 의해 나누어질 수 있다. 피브린 분해제의 촉매적 활성은 종종 전구체의 특이적 절단을 통해 기타 단백질의 활성화와 관련된다. 반대로, 주효체 활성은 피브린과 가은 다른 분자, 또는 세포에 대한 생물학적 활성분자의 특이적 결합을 포함한다. 주효체 활성은 자주 증가하거나, 생리학적 조건하에서 촉매적 활성에 대해 필수적이다. 어떤 경우에, 촉매 및 주효체 활성은 단백질의 동일 도메인중에 존재할 수 있다. 플라스미노겐 활성화제에 대해서, 생물학적 활성은 프로-효소(pro-enzyme) 또는 자이모겐 플라스미노겐(Zymogen plasminogen)이 플라스민으로 전환되고, 차례로 피브린 매트릭스를 분해시키는 것을 특징으로 한다. t-PA에 의한 플라스미노겐의 활성화에 있어서 피브린이 보조인자(co-factor)로서 작용하기 때문에, 일본쇄 t-PA는 피브린의 부재시 활성을 비교적 적게 갖는다.
플라스미노겐 활성화제 : 피브린의 존재하에서, 프로-효소 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시킬 수 있는 단백질.
천연 t-PA: 사람 흑색종 세포로부터 분리되는 조직 플라스미노겐 활성화제의 구조 및 생물학적 활성을 갖는 단백질[참조 : 유럽 특허 제0041766 A2호]. 천연 t-PA는 흑색종 세포 t-PA의 아미노산 서열을 갖거나, 또는 서열중에서 약간의 변형을 함유할 수 있다. 예를 들어, 유전적 다형성(polymorphisms)으로부터 야기된 이러한 변형은 단백질의 구조 또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 천연 t-PA의 생물학적 활성은 프로-효소 또는 자이모겐 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키고, 차례로 피브린 매트릭스를 분해시키는 특징이 있다. 천연 t-PA는 천연적으로 이를 생성시키는 세포로부터 분리될 수 있거나, 천연 t-PA를 암호화하는 DNA 서열에 의해 형질감염되거나 형질전환되는 재조합 세포로부터 제조될 수 있다. 대표적인 천연 t-PA의 아미노산 서열은 제1도에 예시되어 있다.
t-PA 동족체 : 상기에서 정의한 플라스미노겐 활성화제의 특징적인 생물학적 활성을 가지며, 또한 아미노산 서열에서 인위적으로 유발된 특이적 돌연변이의 존재에 의해 특지지워지는 단백질, t-PA 동족체를 암호화하는 DNA 서열에 의해 형질감염되거나 형질전환되는 재조합 세포로부터 제조될 수 있다. 대표적인 천연 t-PA의 아미노산 서열은 제1도에 예시되어 있다.
t-PA 동족체 : 상기에서 정의한 플라스미노겐 활성화제의 특징적인 생물학적 활성을 가지며, 또한 아미노산 서열에서 인위적으로 유발된 특이적 돌연변이의 존재에 의해 특징지워지는 단백질, t-PA 동족체를 암호화하는 DNA 서열은 돌연변이 DNA 서열로서 언급되며, 일반적으로 cDNA의 형태로 존재할 수 있다. 인위적으로 유발된 특이적 돌연변이에는 아미노산 서열에 있어서의 결실, 삽입 및 치환이 포함되며, 이는 클로닝된 DNA 서열의 조작을 통하여 도입될 수 있다. 일반적으로, t-PA 동족체의 생물학적 활성은 천연 t-PA의 활성으로부터 상당히 변화될 수 있다.
혈장 반감기 : 동물의 혈류로부터 물질의 50%를 제거 또는 불활성화시키는데 필요한 시간. t-PA의 경우, 혈장 반감기는 예를 들어 효소-결합된 면역흡착 검정법(enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA)을 사용하여, 래트와 같은 시험 동물의 혈류로부터 t-PA의 소멸을 모니터하여 측정한다.
전술한 바와 같이, 사람 t-PA는 이본쇄 형태로 존재 할 수 있는 72,000달톤의 단백질이다. 단백질은 개별적으로 또는 집합적으로 단백질의 생물학적 활성에 기여하는 다수의 구조적 도메인을 함유한다. 이러한 도메인중의 하나는 표피성앙인자(EGF)와의 상동성으로 인하여 성앙인자 도메인(이후, GF 도메인으로 기술한다)이라고 한다. 전체적인 성숙 단백질은 35개의 시스테인 잔기를 함유하는데, 이중 34개는 연쇄간 또는 연쇄내 디설파이드 결합에 참여한다([참조: Ny et al., 상기 문헌]. 이들 시스테인중 7개는 GF 도메인내에 존재하며, 세 개의 디설파이드 결합으로 배열되고 7번째 시스테인은 쌍을 이루지 않는다.
또한 전술한 바와 같이, GF 도메인은 약제학적 제제로서 천연 t-PA를 사용하는데 있어서 일정한 제한의 원인이 되는 것으로 밝혀졌다. 발명자들의 연구에 의하여, GF 도메인이 혈류로부터 t-PA를 신속히 제거하는데 있어서 부분적으로 원인이 될 수 있음을 예시하는 데이터가 제공되었다. 또한, GF 도메인에서의 유리 설프하이드릴 그룹의 존재는 단백질을불안정화시킬 수 있다. 일반적으로, 용액중의 단백질의 유리 설프하이드릴 그룹은자발적으로 산화되는 경향이 있으며, 또한 단백질 응집을 야기시키는 분자간 디설파이드 브릿지를 형성할 수 있다. 유리 설프하이드릴 그룹을 갖는 단백질을 약제학적 제제로서 사용하는 경우, 유리 설프하이드릴 그룹으로부터 비롯되는 생리화학적 특성에서의 이러한변화는 단백질의 면역학적 또는 항원적 특성을 변화시킬 수 있으므로, 이의 치료학적 용도를 제한한다. 이러한작용은 인터루킨(interleukin)-2에 대해서 관찰된다[참조 : Wang et al., Science 224 : 1431-1433, 1984 및 Liang et al., J. Biol. Chem. 261 : 334-337, 1986].
피브린 결합 활성 및 세린 프로테아제 활성을 둘다 갖도록 하기 위해서, 본 발명의 플라스미노겐 활성화제는 적어도 GF 도메인, 크링글 도메인 및 세린 프로테아제 도메인을 함유한다. 바람직하게는, 크링글 도메인은 천연 t-PA의 K2 도메인일 수 있다. 또다른크링글 도메인이 포함될 수도 있으며, 이는 하기에서 더욱 상세하게 설명된다. 또한, 피브린에 대한 더욱 큰 친화성을 제이기고 하기 위해서는 핑거 도메인을 함유하는 것이 유리하다. 바람직한 핑거 도메인은 천연 t-PA의 핑거 도메인이다.
본 발명자들은 t-PA의 GF 도메인의 구조를 변경시킴으로써, 단백질의 혈장 반감기를 연장시킬 수 있다는 사실을발견하였다. 이러한 변경중의 하나는 t-PA의 GF 도메인으로부터 시스테인 잔기를 제거시키는 것을 포함한다. 바람직하게는 51, 56, 62, 73, 75 및 83 위치의 다른 시스테인 잔기가 또한 단독으로 또는 함께 제거될 수 있음에도 불구하고, 84 위치의 시스테인 잔기가 제거된다. 어떤 경우에도, 상술된 이유로 인해, 생성된 분자가 쌍을 이루지 않는 것이 바람직하다. 시스테인 잔기는 결실 또는 아미노산 치환에 의해 제거될 수 있는데, 치환이 바람직한 방법이다. 특히, 세린 및 알라닌이 바람직함에도 불구하고 , 어떠한 아미노산도 시스테인을 대신하여 치환될수 있다. 특히 바람직한 아미노산 치환체는 세린이다. GF 도메인 서열의 기타 변형은 천연 t-PA의 GF 도메인의 실질적으로 연속적인 아미노산의 다수 치환을 포함한다. 아미노산 치환은성장인자 도메인 내에 위치하는 잦재적 수용체 영역을 크게 변형시키지 않고, 혈장으로부터 t-PA의 신속한 제거와 관련되는 영역을 파괴시키기 위해 상기 영역에서 수행한다. 아미노산 62 및 73에 의해 결합된 루프(loop) 구조는 다른 성장인자 도메인-함유 단백질중의 상응하는 영역과의 낮은 상동성으로 인해, 수용체 결합 영역에 대한 중요한 후보로서 단백질 표면상에 위치함을 제시하는 특성이 된다. 치환체 아미노산은 다른 단백질의 성장인자 도메인중 상응하는 위치에서 발견되는 것들중에서 선택하는 것이 바람직하다. 목표된 변화는, 도메인을 시스테인쌍 51과 62, 56과 73 및 75와 84사이의 디설파이드 결합을 포함하여, 그의 전체적인 EGF-성 구조를 갖게 하는 그들의 특징을 파괴하지 않고, 특이적 수용체 상호작용을 제거할 수 있다. 일반적으로, 이들 영역이 성장인자 도메인으로서 작용하는 능력을 유지시키는 것이 바람직하다. 이를 위하여, 구조에 있어서의 주요한 변화는 피하지만, 특정 위치에 존재하는 1개 이상의 아미노산 잔기의 화학적 특성을 변화시키도록 아미노산 치환을 선택한다. 예를 들면, 성장인자 도메인의 특정의 고도로 보존된 특징을 유지시키는 것이 바람직할 것이다. 제22도에 제시된 바와 같이, 이들 특징은 ⒜ t-PA 성장인자 도메인의 두 번째 시스테인 잔기에 가까운 서열 Asn-Gly-Gly(NGG)의 존재; 및 ⒝ 천연 L-PA 성장인자 도메인의 4 및 5개 시스테인 잔기에 상응하는, 서열 Cys-X-Cys(여기에서, X는 아미노산이다)의 존재를 포함할 수 있다.
바람직한 치환은 비교적 긴 혈장 반감기를 갖는 1개 이상의 단백질(예 : 응고인자 Ⅶ 및 Ⅸ)의 성장인자 도메인으로부터 실질적으로 연속적인 아미노산의 다수의 치환을 포함한다. 또한 천연 t-PA의 1개 이상의 성장인자 도메인 영역이 상기에 기재된 아미노산의 각각의 차단물로 치환될 수 있다. 또한, 다른 단백질로부터의 완전한 성장인자 도메인을 치환할 수 도 있다. 기타 치환은, 인자 Ⅶ, 인자Ⅸ, 단백질 C, 표피성장인자 및 성장인자 도메인을 함유하는 다른 단백질의 서열을 기본으로 하여 콘센서스(consensus)성장인자 서열을 조작함으로써 이루어진다. 성장인자 도메인은 또한 우로키나제, 인자 Ⅹ, 단백질 S, 단백질 Z, 저밀도 지단백질 수용체, 변형 성장인자, 표피장인자 수용체, 트룸보모듈린(thrombomodulin) 및 트롬보스폰딘(thrombospondin)중에서 발견된다. 특히 바람직한 이러한 콘샌서스 서열은 아미노산 서열 이는 천연 t-PA의 아미노산 63 내지 70 대신에 치환되는 것이다. 특정의 바람직한 실시태양에서, 천연 t-PA GF 도메인의 아미노산 잔기 83에 상응하는 시스테인 잔기는 생성된 분자의 안정성을 증가시키기 위해서 또다른 아미노산으로 치환된다. 특히, 세린 및 알라닌이 바람직하지만, 어떠한 아미노산도 시스테인 대신에 치환될수 있다. 특히 바람직한 치환 아미노산은 세린이다.
본 발명의 t-PA 동족체는, GF 도메인의 변경외에 추가의 돌연변이를 함유할 수 있다. 이들 돌연변이들은 아미노산 치환, 결실 또는 첨가일 수 있다. 많은 이들 돌연변이는 상기한 바와 같이 기술되었다. 특히 바람직한 돌연변이는 핑거 및/또는 K1 도메인의 치환, 절단(활성화)부위 근처의 아미노산 치환, K1 도메인 중 탄수화물 부착부위의 제거 또는 K2 도메인중 탄수화물 부착부위의 변형을 포함한다. 이들 돌연변이는 t-PA 동족체의 임상적 적합성을 향상시킬 것이다. 예를 들면, 천연 t-PA의 K1 도메인은 생성된 동족체의 피브린 특이성을 향상시키기 위해 다른 단백질로부터 유도된 크링글 도메인으로 대치시킬 수 있다. 이를 위한 적합한 크링글 도메인은 플라스미노겐의 K1, K2, K3, K4 및 K5 도메인, 천연 t-PA의 K2 도메인, 프로트롬빈의 K1 및 K2 도메인 및, 인자 ?의 크링글 도메인을 포함한다. 플리스미노겐의 K1 도메인이 특히 바람직하다. 활성화 부위에 대한 변형은 플라스민에 의한 단백분해적 절단에 대한 감응성을 줄이고/줄이거나 트롬빈에 의한 절단을 허용함으로써 t-PA 동족체의 응괴 특이성을 증가시킬 수 있다. 탄수화물 부착부위를 변형시킨 단백질 생성물의 단일성을 증가시키고, 혈장 반감기를 증가시킨다. N-연결된 글리코실화 부위(서열 Asn-X-Ser/Thr, 여기서 X는 아미노산이다)에서 Asn 잔기를 다른 아미노산 잔기로 변형시킴으로써 글리코실화는 차단될 수 있다. Asn 잔기를 Gln 잔기로 바꾸는 것이 특히 바람직하다. Asn은 또한 Ser 또는 Thr로 치환될 수 있다. 추가로, 서열중 다른 변경은 암호화된 단백질의 글리코실화 차단을 목적으로 도입될 수 있다. 예를 들면, 서열 Asn-Ser/Thr의 제2위치에서 프롤린 잔기는 글리코실화를 방해할 것이다[참조: Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40 : 17-26, 1974]. 다른 치환도 또한 이 위치에서 이루어질 수 있다. N-연결된 글리코실화 부위의 세 번째 아미노산은 또한, 바람직하게는 Ala, Cys, Gly, Asn 또는 Gln으로 바뀔 것이다. 글리코실화 부위는 개별적으로 또는 결합하여 바뀔 것이다. 한 바람직한 양태로, Asn-117에서의 탄수화물 첨가는 글루타민의 잔기의 치환에 의해 차단된다.
본 발명에 따라, 출발물질로서 cDNA 클론 또는 계놈성 클론을 사용하여, 재조합 DNA 기술의 사용을 통해, 이들 신규한 단백질을 생산하는 것이 바람직하다. 적합한 DNA 서열은 자동화된 합성을 포함하는, 표준 방법에 따라 또한 합성시킬 수 있거나, 시관공급원으로부터 얻을 수 있다. 변형된 t-PA를 제조하기 위한 출발물질로서 천연 t-PA를 암호화하는 완전한 길이의 cDANA를 사용하여, 인트론을 제거함으로써, 천연 t-PA의 모든 엑손이 존재하게 하고, 각각에 대해 정확하게 배향되도록 cDNA 클론을 사용하는 것이 바람직하다. cDNA는 올리고뉴클레오타이드-유도된 돌연변이를 통해 서열의 결실, 변경 또는 삽입용 주형으로서 또한 사용될 수 있다.
재조합 DNA 기술은 천연 t-PA의 피브린-결합 도메인의 강화를 편리하게 허용한다. 이러한 강화는 추가 크링글 구조의 변형, 핑거 도메인의 첨가, 또는 핑거 도메인의 치환에 의해 성취할 수 있다. 이 방법은 천연 t-PA 또는 관련 단백질에서 발견되는 기능적 도메인의 최적의 조합을 선택하기 위한 수단을 제공하며, 따라서 피브린 결합에 관한 향상된 생물학적 활성 및 세린 프로테아제 활성의 특이성을 지니는 피브린 분해제를 제공한다.
아미노산 치환 또는 결실은 주형으로서 클로닝된 t-PA 서열 또는 이의 일부분을 사용하여, 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 도입시킨다. 시험관내에서 올리고뉴클레오타이드-유도된 돌연변이를 위한 기술은 일반적으로 당해분야에 공지되어 있다. 바람직한 이러한 방법은 졸러(Zoller) 및 스미스(Smith)의 방법[참조: DNA 3: 479-488, 1984]이다.
아미노산 치환은 바람직하게는 편리한 길이의 올리고뉴클레오타이드(바람직하게는 길이 약 30 내지 50의 뉴클레오타이드)를 합성하고, 이를 목적하는 암호화 서열이 작재되도록 조합함으로써 수행한다. 이러한 길이의 올리고뉴클레오타이드는 다수의 완전한 서열을 얻기 위해서 여러 조합으로 배열될 수 있는 기준 서열의 디자인을 허용한다. 이러한 조합은, 쌍을 이룬 경우 생성된 단편 말단이 평활화되거나 인접 서열을 암호화하는 올리고뉴클레오타이드쌍에 상보성이 되도록 올리고뉴클레오타이드를 디자인함으로써 용이해진다. 그러나, 완전한 GF 치환은 완전한 길이의 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 작재될 수 있는 것으로 이해될 것이다. 올리고뉴클레오타이드는 선택된 숙주세포 유형에 적합한 코돈 사용의 최적화를 허용하는 추가의 이점을 제공한다.
또한, GF 치환제를 암호화하는 DNA 서열은 GF 도메인을 갖는 단백질을 암호화하는 cDNA 또는 게놈 클론으로부터 수득될 수 있다. 인자 IX[Kurachi and Davie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 6461-6464, 1982; Anson et al., EMBO J. 3 : 1053-1060, 1984], 인자 VII[Hagen et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 2412-2416, 1986], 단백질 C[Foster et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4673-4677, 1985] 및 표피성장인자[Gray et al. Nature 303 : 722-725, 1983]의 클론이 기술되어 있다. 이들 및 기타 단백질을 암호화하는 적합한 클론이 유전공학 분야에서 통상의 기술을 가진 자들에게 익숙한 방법에 의해 수득될 수 있다.
그다음, GF 도메인 치환제를 암호화하는 서열은 편리한 제한부위에서 t-PA 서열로 삽입된다. 몇몇 경우에는 시험관내 돌연변이를 사용하여 서열을 적절히 결합시킬 필요가 있을 것이다.
경우에 따라, 돌연변이 서열을 t-PA 암호화 서열의 나머지에 결합시킨 다음, 완전한 암호화 서열을 발현 벡터에 삽입시킨다. 돌연변이 서열은 포유동물세포, 효모 및 기타의 진균, 및 세균을 포함하는 다양한 숙주세포에서 발현시킬 수 있다.
세균, 효모 및 포유동물 세포에서의 재조합 t-PA의 생산은 문헌[예를 들면, Goeddel et al. (EP 93619 A1), Meyhack and Hinnen(EP 143,081 A2) 및 Gill(EP 174,835 A1)]에 기술되어 있다. 외래 DNA로 포유동물 세포를 형질감염시키기 위한 방법 및 세균 진균을 형질전환시키기 위한 방법은 본 분야에 널리 공지되어 있다. 적절한 발현 벡터는 클로닝된 DNA 서열을 숙주세포 및 작용성 전사 말단부위내에서 전사시킬 수 있는 프로모터를 포함한다.
몇몇 경우에는, 발현 벡터가 선택된 숙주세포에 따라 복제원, 및 발현정도를 조절하고/하거나 증가시키는 서열을 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 적합한 발현벡터는 플라스미드, RNA 및 DNA 바이러스 또는 세포 DNA 서열로부터 유도될 수 있거나, 각각의 성분을 삼유할 수 있다.
본 발명을 수행하는데 사용하기 위해 바람직한 원핵세포 숙주는 이.콜라이 세균 균주이나, 바실러스속 및 기타 속의 균주도 사용할 수 있다. 이들 숙주를 형질전환시키고 상기 숙주에 클로닝된 외래 DNA 서열을 발현시키기 위한 기술은 본 분야에 널리 공지되어 있다[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982]. 세균 숙주에서 외래 DNA를 발현시키기 위해 사용되는 벡터는 통상적으로 항생물질 내성 유전자와 같은 선별성 마커, 및 숙주세포에서 작용하는 프로모터를 함유한다. 적절한 프로모터로는 trp(Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101 :155, 1983), lac(Casadaban et al., J. Bact. 143 : 971-980, 1980), TAC(Russell et al., Gene 20 :231-243, 1982) 및 파아지 λ프로모터 시스템이 포함된다. 세균의 형질전환용으로 유용한 플라스미드에는 pBR 322(Bolivar et al., Gene 2 : 95-113, 1977), pUC 플라스미드(Messing, Meth. in Enzymology 101 : 20-78 1983; and Vieira and Messing, Gene 19 : 259-268, 1982), pCQV2(Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2 : 1-10, 1983) 및 이의 유도체가 포함된다.
진핵세포 미생물, 예를 들면 효모인 사카로마이세스 세레비지애(Saccharomyces cerevisiae), 또는 아스퍼질러스(Aspergillus)를 포함하는 필라멘트성 진균을 숙주세포로 사용할 수도 있다. 특히 바람직한 아스퍼질러스 종에는 에이. 니둘란스(A. nidulans), 에이. 나이거(A. niger), 에이. 오리재(A. oryzae) 및 에이.테레우스(A. terreus)가 포함된다. 효모를 형질전환시키기 위한 기술은 예를 들면 문헌[Beggs, Nature 275 : 104-108, 1978]에 기술되어 있다. 아스퍼질러스 종은 공지의 방법, 예를 들면 문헌[Yelton et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1740-1747, 1984]에 따라 형질전환시킬 수 있다. 효모에 사용하기 위한 발현 벡터는 YRp7(Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 1035-1039, 1979), YEp 13(Broach et al., Gene 8 : 121-133, 1979), pJDB 248 및 pJDB 219(Beggs, 상기 참조) 및 이의 유도체이다. 상기 벡터는 통상적으로 trpl 돌연변이를 일으킨 숙주 균주를 선별할 수 있게 하는 영양성 마커 TRPI과 같은 선별성 마커를 포함한다. 효모 발현 벡터에 사용하기에 바람직한 프로모터는 효모 당분해성 유전자(Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255 : 12073-12080, 1980; Alber and Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1 : 419-434, 1982 : Kawasaki, U.S. Patent 4,599,311) 또는 알코올 데하이드로게나제 유전자(Young et al., in Genetic Engineering og Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., eds., p. 335, Plenum, New York, 1982; and Ammerer, Meth. in Enzymology 101 : 192-201, 1983)이다. 효모 형질전환에서 생성된 변형 t-PA 단백질의 정제를 용이하게 하고, 적당한 디설파이드 결합형성을 얻기 위해, 분비된 단백질을 암호화하는 효모 유전자로부터의 시그날 서열로 t-PA 프리-프로 서열을 치환할 수 있다. 특히 바람직한 시그날 서열은 MFal 유전자의 프리-프로 영역이다(Kurijan and Herskowiz, Cell 30 : 933-943, 1982; and Singh, EP 123,544).
고등 진핵 세포는 또한 본 발명을 수행함에 있어서 숙주세포로서 작용할 수도 있다. BHK, CHO, NS-1, SP2/0 및 J558L 세포주와 같은 배양된 포유동물 세포가 바람직하다. 이들 및 다른 세포주들은 예를 들어, 아메리칸 타입 켤쳐 컬렉션[American Type Culture Collection]으로부터 용이하게 구입할 수 있다. 특히 바람직한 점착성 세포주는 BHK 세포주 tk-ts 13(참조: Waechter and Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 1106-1110, 1982)이며, 이는 이후에 tk-BHK 세포로서 지칭한다. 포유동물 세포에 사용하기 위한 발현 벡터는 포유동물 세포내로 도입된 클로닝된 유전자의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함할 것이다. 특히 바람직한 프로모터에는 SV40 프로모터(참조: Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1 : 854-64, 1981), MT-1 프로모터(참조: Palmiter et al., Science 222 : 809-814, 1983), 및 마우스 카파 유전자 프로모터(참조: Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 7041-7045, 1984)가 포함된다. 또한 발현 벡터에는 발현된 DNA 서열에 대한 삽입 부위의 하부에 위치한 전사 터미네이터가 함유된다. 바람직한 터미네이터는 사람 성장 호르몬(hGH) 유전자 터미네이터(참조: DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9 : 3719-3730, 1981)이다. 또한, 벡터는 특정 숙주세포주에 적절한 인헨서 서열을 함유하는 것이 바람직할 것이다.
배양된 포유동물 세포내에서 변이체 t-PA의 발현을 위해, 클로닝된 t-PA 서열을 함유하는 발현 벡터는 인산 칼슘-조절된 형질감염(참조: Graham and Van der Eb, Virology 52 : 456-467, 1973); Wigler 등에 의해 변형된 것(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 3567-3570, 1980); 또는 Loyter 등에 의해 기술된 것(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 422, 1982) 또는 전기영동(참조: Neumann et al., EMBO J. 1 : 841-845, 1982)과 같은 적절한 형질감염 기술에 의해 세포내로 도입시킨다. 일부의 세포는 상기 DNA를 흡수하여 이를 수일간 세포내에서 유지한다. 세포의 소단편은 숙주세포의 게놈중에 DNA를 통합시키거나 또는 DNA를 비-염색체 핵 구조물중에 유지시킨다. 이들 형질감염체는 선별적 표현형(선별성 마커)을 부여하는 유전자로 공형질감염시켜 동정할 수 있다. 바람직한 선별성 마커에는 뉴클레오타이드 합성의 억제제 메토트렉세이트(MTX)에 대한 세포 내성을 부여하는 DHFR 유전자; 또는 단백질 합성의 억제제인 약제 G-418에 대해 내성을 부여하는 세균성 네오마이신 내성 유전자가 포함된다. 상기 숙주세포가 DNA를 흡수한 후, 약물 선별을 적용해 내성을 부여하기에 충분히 높은 정도로 선별성 마커를 발현시키는 세포의 집단에 대해 선택한다. 선별성 마커는 t-PA 동족체를 암호화하는 서열과 동일한 벡터상에서 수행할 수 있거나 또는 별개의 벡터 상에서 수행할 수 있다.
메토트렉세이트 선별을 사용하는 경우, 초기 선별시 배양배지에 고농도의 MTX를 가하거나, 또는 배지중에 MTX의 농도를 순차적으로 증가시키고, 이어서 약제-내성 세포주의 희석에 의해 반복 클로닝함으로써 발현 정도를 증가시키기 위해 공동증폭시킬 수 있다. 증폭능력에 있어 다양성이 나타나고 공형질감염된 DNA 서열의 초기 게놈 배치(즉, 염색체외 대 염색체) 및 증폭 자체의 기작 모두와 관련이 있는데, 여기에서 다양한 양의 DNA 재배열이 발생할 수 있다. 이는 이미 안정한 것처럼 보이는 클론의 추가 증폭시 알수 있다. 이와 같은 이유 때문에, 매 증폭단계 후에 희석에 의해 클로닝할 필요가 있다. 그후 DHFR 마커를 발현시키는 세포를 선택하고 t-PA의 생성을 위해 스크리닝한다. 스크리닝은 효소-결합된 면역 흡착검정(ELISA) 또는 생물학적 활성 검정에 의해 수행할 수 있다.
본 발명의 플라스미노겐 활성화제는 천연 t-PA의 피브린 분해 효과에 상응하는 피브린 분해 효과를 나타낸다. 그러나, 이들 단백질은 천연 t-PA의 것보다 5배 더 긴 혈장 반감기를 갖는 점에서 천연 t-PA보다 잇점을 나타내는데, 이는 이들 단백질이 우수한 치료제일 수 있음을 시사한다.
본 발명의 플라스미노겐 활성화제는 혈전증 치료를 위한 약제학적 조성물내에 사용할 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균수 또는 멸균염수와 같은 희석제 또는 담체와 혼합된 플라스미노겐 활성화제를 포함하며, 또한 적절한 부형제 및/또는 용매를 포함할 수도 있다. 생성된 수용액은 사용하기 위해 포장하거나 또는 무균 상태하에서 여과하여, 동결건조시킬 수 있는데 이 동결 건조된 제제를 투여하기 전에 멸균 수용액과 혼합시킨다.
전형적으로, 만니톨 3g 및 t-PA 동족체 10(6) 단위를 함유하는 수용액을 멸균상태하에서 제조한다. 이 용액의 1ml 분취량을 작은 바이알내로 피펫팅한 후, 동결건조시키고, 밀봉한다. 주사를 위하여, 동결건조 물질을 멸균수 2ml와 혼합하는데, 이 멸균수는 밀봉 앰풀중에서 제공된다. 주사에 의한 투여가 바람직하다. 본 발명의 단백질은 전형적으로 환자당 약 6mg 내지 약 100mg의 투여량으로 투여되는데, 이는 환자의 체중 및 용해될 혈전의 특성에 따라 좌우된다. 그러나, 본 발명은 상기 범위로 제한되는 것이 아니며, 질환에 따라 투여량이 변화할 것이다. 적절한 투여량의 결정은 숙련가들에게는 명백할 것이다.
하기 실시예는 실예를 제공하는 것이지, 제한하는 것은 아니다.
[실시예]
[실시예1]
완전한 길이의 t-PA클론의 작제
사람의 천연 t-PA cDNA 클론의 서열이 문헌[Pennica et at., Nature 301; 214-221, 1983]에 보고되어 있다. 서열은 32 내지 35개의 아미노산의 프리-프로펩타이드를 암호화하며, 이어서 527 내지 530개의 아미노산인 성숙 단백질을 암호화한다.
성숙 t-PA에 대한 암호화 서열을 포함하는 cDNA 클론을 출발물질로서 보우스(Bowes) 흑색종 세포주로부터의 mRNA를 사용하여 작제한다(Rijken and Collen, J. Biol. Chem. 256; 7035-7041, 1981). 이어서, 콜라이 균주 JM 83은 기탁기관(American Type Culture Collection]에 기탁번호 제53347호로 기탁되었다.
프리-프로 서열이 cDNA 클론 pDR 1296에 존재하지 않기 때문에, 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 작제한 후, cDNA로 연결시킨다. 합성된 t-PA 프리-프로 서열에서, Bam H Ⅰ 및 Nco Ⅰ에 대한 절단 부위를 프리-프로 서열의 제1코돈(ATG)의 5' 말단에 도입시키고, Bgl Ⅱ(Sau 3A, Xho Ⅱ)부위를 프리-프로 서열의 3' 말단에 유지시킨다. 천연 발생 프리-프로 서열은 중앙 부근의 편리한 제한 부위가 결여되어 있으나, 서열 GGAGCA(아미노산-20 및 19를 암호화, Gly-Ala)는 GGCGCC로 변경되어, 아미노산 서열 변화없이 Nar Ⅰ 부위를 제공할 수 있다.
프리-프로 서열을 작제하기 위하여, 하기의 올리고뉴클레오타이드를, DNA 합성기[Applied Biosystem 모델 380-A]를 사용하여 합성한다.
ZC131: 5' GGRMFJAMFH TCC AT GGAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC TGT GTG 3'
ZC132: 5' TGG CGC CAC ACA GCA GCA GCA CAC AGC AGAG 3'
ZC133: 5' GGC GCC GTC TTC GTT TCG CCC AGC CAG GAA ATC CATG 3'
AC134: 5' AGA TCT GGC TCC TCT TCT GARMFJAMFH TCG GGC ATG GA TTTC CT 3'
정제후, 올리고머 ZC 131 및 ZC 132를 어닐링하여 12개 bp의 오버랩(overlap)을 생성한다(섹션 1). 올리고머 ZC 133 및 ZC 134를 유사하게 어닐링한다(섹션 2). 올리고머를 Pol Ⅰ 완충액(Bethesda Research Labs)중에서 혼합하고, 5분 동안 65℃로 가열하여, 어닐링을 위해 4시간 동안 실온으로 서서히 냉각시킨다. DNA 폴리머라제 I의 10단위를 가하고 실온에서 2시간 동안 반응을 수행한다. 이 혼합물은 8% 폴리아크릴아미드-우레아 연쇄 겔상에서 1,000볼토로 2 1/2시간 동안 반응 생성물의 크기 분별을 위하여 전기 영동한다. 정확한 크기 단편(폴리머라제 반응이 완결된 것)을 겔로부터 절단 및 추출한다.
어닐링 후, 섹션 I을 Bam H I 및 Nar I 로 절단하여, Bam H I + Nar I -절단 pUC 8에 클로닝시킨다{참조 : Vieira and Messing, Gene 19; 259-268, 1982; and Messing, Meth. in Enzymology 101 : 20-77, 1983]. 섹션 2를 재어닐링시키고, Nar I 및 Bg1 II로 절단하여, Bam H I + Nar I - 절단 pUC 8에 클로닝시킨다. 적절히 표지된 올리고뉴클레오타이드로 콜로니를 스크리닝한다. 콜로니 하이브리드화에 의하여 양성으로 동정된 플라스미드를 연결시켜 정확한 서열이 클로닝되었는지 확인한다.
이후 섹션 I을 적합한 pUC 클론의 Bam H I + Nar I 이중 분해물로부터 정제한다. 섹션 2를 Nar I + Xho II 분해물로부터 정제한다. 2개의 단편을 Nar I 부위에 결합시켜, Bam HI - 절단 pUC 8내로 클로닝시킨다.
pDR 1296의 t-PA 서열을 하기의 방법으로 합성된 프리-프로 서열에 결합시킨다(제2도). 플라스미드 pIC 19R(참조: Marsh et al., Gene 32 : 481-486, 1984)를 Sam I 및 Hind III으로 분해한다. 지도상의 위치 270(Pvu II)에서 위치 5171(Hind III)까지의 SV 40의 ori 영역을 이후 선형화된 pIC 19R에 결합시켜, 플라스미드 Zem 67을 생성시킨다. 이후 이 플라스미드를 Bg1 II로 절단하고, 사람의 성장 호르몬 유전자(참조: De Noto et al., Nuc. Acids Res. 9 : 3719-3730, 1981)로부터의 터미네이터 영역을 Bgl Ⅱ-Bam H Ⅰ 단편으로서 삽입하여, 플라스미드 Zem 86을 생성시킨다. 합성된 t-PA 프리-프로 서열을 Bam HⅠ 및 Xho Ⅱ로 절단시켜 pUC 8 백터로부터 제거한다. 이 단편을 Bgl Ⅱ-분해된 Zem 86내로 삽입시켜, 플라스미드 Zem 88을 생성시킨다. 플라스미드 pDR 1296을 Bgl Ⅱ 및 Bam H Ⅰ로 분해하고, t-PA cDNA 단편을 분리하여, Bgl Ⅱ-절단 Zem 88내로 삽입한다. 생성된 플라스미드를 Zem 94로 명시한다.
MT-1 프로모터, 완전한 t-PA 암호화 서열 및 hGH 터미네이터를 포함하는 백터 Zem 99를 하기의 방법으로 조합시킨다(제2도). MT-1 프로모터를 포함하는 Kpn Ⅰ-Bam Ⅲ 단편을 MThGH 111로부터 분리시키고(참조: Palmiter et al., Science 222; 809-814, 1983), pUC 18에 삽입시켜 Zem 93을 작제한다. 플라스미드 MThGH 112(참조: Palmiter et al., 상기 참조)를 Bgl Ⅱ로 분해하고, 재-결합시켜 hGH 암호화 서열을 제거한다. MT-1 프로모터 및 hGH 터미네이터를 이후 Eco R Ⅰ 단편으로서 분리하여 pUC 13에 삽입하여, Zem 4를 작제한다. 이후 Zem 93을 Bam H Ⅰ 및 Sal Ⅰ로 분해하여 선형화시킨다. Zem 4를 Bgl Ⅱ 및 Sal Ⅰ로 분해하고, hGH 터미네이터를 정제한다. t-PA 프리-프로 서열을 Bam H Ⅰ - Xho Ⅱ 단편으로서 pUC 8 벡터로부터 제거한다. 3개의 DNA 단편을 이후 결합시키고, zEM 97(제2도)의 구조를 갖는 플라스미드를 선별한다. Zem 97을 Bgl Ⅱ로 절단하고, Zem 94로부터의 Xho Ⅱ t-PA 단편을 삽입한다. 생선된 벡터가 Zem 99이다.
[실시예 2]
Zem 219c의 작제
벡터 Zem 219c를 제3도에 나타낸 바와 같이 작제한다. 플라스미드 pSV 2-DHFR(참조: Subramani etal., 상기 참조)를 Cfo Ⅰ로 분해하고, DHFR cDNA 및 3'-부착된 SV 40 서열을 포함한 단편을 분리하고, 수선하여, Bam H Ⅰ 링커에 결합시킨다. Bam H Ⅰ로 분해한 후, 완전한 cDNA 및 SV 40 터미네이터 영역을 함유하는 약 800bp 단편을 정제하여, Bam H Ⅰ-분해된 pUC 8에 결합시킨다. Zem 67(실시예 1)을 Bgl Ⅱ로 분해시키고, Bam H Ⅰ DHFR-SV 40 단편과 결합시켜, 플라스미드 Zem 176을 생성시킨다. 플라스미드 Zem 93을 Sst Ⅰ로 분해하고 재-결합시켜 플라스미드 Zem 106을 생성시키는데, 이때 MT-1 프로모터 5'의 서열 약 600bp가 제거된다. 플라스미드 Zem 106을 Eco R Ⅰ로 분해하고, 플라스미드 Zem 176으로부터의 DHFR 유전자를 함유하는 Eco R Ⅰ 단편에 결합시킨다. 생성된 플라스미드는 Zts 13으로 명명한다. 플라스미드 Zts 13을 Bam H Ⅰ로 분해하고, 완전한 t-PA 암호화 영역 및 hGH 터미네이터 서열을 함유하는 플라스미드 Zem 99로부터의 Bam H Ⅰ 단편에 결합시킨다. 생성된 플라스미드는 Zts 15로 명명한다. Zts 15를 Bam H Ⅰ로 부분적으로 분해하고, 수선하며, 재결합시켜, 3' Bam H Ⅰ 부위가 파괴된 플라스미드 Zem 219를 생성한다. 플라스미드 Zem 219를 Xba Ⅰ로 부분적으로 분해하고, 수선하며, 재결합시켜, 3' Xba Ⅰ 부위가 파괴된 플라스미드 Zem 219a를 생성한다. 플라스미드 Zem 291a를 Bam H Ⅰ 및 XbaⅠ로 절단시켜 벡터 서열을 t-PA cDNA 서열로부터 떨어져 정제시키고, 올리고머성 Bam H Ⅰ-Xba Ⅰ 어뎁터부위를 Xho Ⅰ로 절단시켜 파괴하고 수선하여, 새로이 평활시킨 말단에 재결합시킨다. 생성된 플라스미드는 Zem 219c로 명명한다.
[실시예 3]
Cys(83)의 치환
Zem 99에서 t-PA 암호화 서열을 돌연변이시켜 위치 83(아미노산 번호는 제1도에 도시된 서열에 대한 것이다)에서 세린을 암호화시킨다. Zem 99를 Bam H Ⅰ로 절단시키고, t-PA 암호화 서열 및 hGH 터미네이터를 함유하는 2.4kb 단편을 분리시킨다. 이 단편을 Bam H Ⅰ-분해된 M13mp18(Pharmacia로부터 입수)에 연결시키고, 생성된 재조합 파지는 이. 콜라이 JM 103을 형질감염시키는데 사용한다. 목적하는 삽입물을 갖는 파지 클론은 M13mp18/Bam-Zem 99로 명명한다.
부위-특이적 돌연변이 유발을 위해, 올리고뉴클레오타이드(서열 5' CT GGT ATC GAT TTC ACA GCT CTT CCC AGC A 3')를 합성하고 돌연변이원 프라이머로 사용한다. 올리고뉴클레오타이드를 일본쇄 M13mp18/Bam-Zem 99로 어닐링시킨다. 돌연변이 유발은 표준 방법에 따라 수행하고, 일본쇄 DNA는 서열화를 위해 분리시킨다. M13-9100RF로 명명되는 돌연변이 유발된 파지의 복제형을 BGl Ⅱ 및 Hind Ⅲ로 분해한다. t-PA 서열을 함유하는. 2.3kb 단편을 회수하고 Bgl Ⅱ 및 Hind Ⅲ으로 절단된 Zem 99에 연결시키고(제4도), DNA를 사용하여 이.콜라이 TB1을 형질전환시킨다. 목적하는 서열이 변경된 플라스미드를 회수하고 Zem 99-9100으로 명명한다. Zem 99-9100의 돌연변이된 t-PA 서열 및 암호화된 아미노산 서열이 제5도에 도시되었다.
플라스미드 Zem 99-9100 및 p2V2-옭(Subramani et al., 상기 참조)는 로이터(Loyter)의 방법(Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 422, 1982]에 의해 tk￣BHK 세포를 형질감염시키는데 사용된다. 형질전환체는 제한 희석법에 의해 클로닝시킨다. 9100으로 명명되는 돌연변이체 단백질을 친화 정제법에 의해 세포 배양배지로부터 정제한다.
플라스미드 Zem 99-9100을 함유하는 이.콜라이 TBI 형질전환체는 기탁번호 제FERM P-9269호로 기관[Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan(FRI)]에 기탁되어 있다.
[실시예 4]
Cys(84)의 치환
t-PA DNA 서열을 돌연변이 유발시켜 올리고뉴클레오타이드 5' CCT GGT ATC GAT TTC ACT GCA CTT CCC 3'을 사용하는 부위-특이적 돌연변이 유발 방법에 의해 아미노산 84에서 세린을 암호화시킨다. 올리고뉴클레오타이드를 M13mpl18/Bam-Zem 99로 어닐링시키고, 돌연변이 유발을 표준 방법을 사용하여 수행한다. 일본쇄 돌연변이 유발된 파지를 서열화시키고, 목적하는 서열이 변경된 클론을 선별한다. 복제형 DNA를 제조하고(M13-9200RF로 명명함), Bgl Ⅱ 및 Hind Ⅲ으로 분해한다. 2.3kb t-PA 단편을 분리하고 Bgl Ⅱ + Hind Ⅲ-절단 Zem 99에 연결시킨다. 생성된 벡터는 Zem 99-9200으로 명명한다(제4도). Zem 99-9200의 변경된 t-PA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열이 제6도에 도시되어 있다.
Zem 99-9200 및 pSV2-옭은 로이터(Loyter)의 방법(상기 참조)에 의해 tk￣BHK를 공-형질감염시키는데 사용된다. 형질전환체를 제한 희석법에 의해 클로닝시킨다. 돌연변이체 단백질(9200)을 친화 정제법에 의해 정제한다.
플라스미드 Zem 99-9200을 함유하는 이.콜라이 RRI 형질전환체는 FRI에 기탁번호 제FERM P-9274호로 기탁되었다.
[실시예 5]
t-PA 성장인자 도메인의 돌연변이 유발
다른 성장인자 서열을 갖는 진정한 t-PA GF 도메인을 치환하기 위하여, 천연 t-PA 서열을 먼저 변형시켜, 핑거 및 성장인자 도메인 암호화 서열 사이에 kpn I 부위를 위치시킨다. 플라스미드 Zem 99를 Bam H I 및 Eco R I 로 절단하고, 5' t-PA 단편을 회수하고, Bam H I + Eco R I 절단 M13mp18에 삽입한다. 파지 DNA를 제조하고, 100μg/ml 우리딘을 보충한 YT 배지 100μl 중에 이.콜라이 RZ 1032를 감염시킨다. 이 배양물을 밤새 격렬히 진탕하면서 37℃에서 배양시킨다. RZ 1032중 M13을 성장시켜 RZ 1032중에서 생존가능하나 JM 101에서는 불가능한, 우리딘을 함유하는 피지를 생산한다.
세포를 원심분리하고 파지 상등액을 사용하여 이.콜라이 RZ 1032를 재감염시킨다. 이 두 번째 통과를 수행하여 우라실이 없는 JM 101-유도된 파지를 희석한다. 다시 세포를 원심분리하고 파지를 JM 101 및 RZ 1032에 놓는다. 정상적인 생존이 RZ 1032 플레이트에서 관측되지만(109pfu/ml의 파지를 나타냄), JM 101 세포상에서는 플라크를 관찰할 수 없다. 그 다음에 돌연변이원 올리고뉴클레오타이드로 프라임된 상보성쇄를 시험관내에서 생성시킨다. 돌연변이된 신규한 쇄는 티미딘을 함유함으로써, JM 101에서 생존가능하다; 야생형 주형은 아니다.
주형 DNA는 파지 상등액을 PEG 침전시키고, 페놀-클로로포롬으로 추출한 후, 에탄올로 침전시켜 제조한다. 이 주형 DNA 1μg을, 간단히 비등시키고, 65℃에서 5분간 배양시킨 후, 10μl 0.2M HEPES pH 7.8 2μl의 100mM DTT, 1μl의 1M MgCl2, 각각 20μl의 2.5mM dNTP, 10μl의 10mM ATP, 1μl의 2.5U/μl 클레노우, 및 2μl의 1U/μl T4DNA 리가제(H2O를 사용해서 최종 용적을 100μl로 조절한다)를 가하기 전에 4℃ 이하로 서서히 온도를 낮춤으로써, 10μg의 올리고뉴클레오타이드 ZC 986과 하이브리드화한다. 37℃에서 2시간 동안 연장한 후, DNA를 컴피턴트 이.콜라이 JM 101 세포에 형질감염시킨다. 오염된 RNA 또는 DNA 종상에 프라이밍(priming) 연장에 의해 생성된 기본량을 비교하기 위해 대조용 연장(마이너스 올리고뉴클레오타이드)을 수행한다. 형질감염시 비돌연변이 주형으로 0개의 플라크, 대조용 연장물(마이너스 올리고뉴클레오타이드)의 경우에는 150개 및 돌연변이 주형으로 한 경우에는 300개의 플라크가 생성된다.
플레이트는 플라크 리프트를32P-표지화된 돌연변이원 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화시키고 5℃에서 30분간 3M TMAC1로 세척하고[참조: Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 1585-1588, 1985], 또한 무작위적으로 선택된 플라크를 서열화시켜 스크리닝한다. 하나의 양성 클론이 수득된다.
Kpn I 부위를 함유하는 돌연변이된 Bam H I -Eco R I 단편을 추가로 돌연변이시켜 GF 도메인 3' 말단에 Xho I 부위를 삽입한다. 주형 DNA는 파지 상동액을 PEG 침전시킨 후, 페놀-클로로포름 추출시키고, 에탄올 침전시킴으로써 Kpn I 부위를 함유하는 M13 파지 클론으로부터 제조한다. 이 DNA 1μg을 올리고뉴클레오타이드 ZC 987(5' CAC GTG GCT CGA CTA TCT ATT TC 3') 10μg과 하이브리드화한다. 혼합물을 잠깐 동안 비등시키고, 65℃에서 5분 동안 배양한 다음, 0.2M HEPES pH 7.8 10μl, 100mM DTT 2μl, 1M MgCl2 1μl, 2.5mM 각각의 dNTP 20μl, 10mM ATP 10μl, DNA 폴리머라제 I(클레노우단편) 2.5단위 및 T4 DNA 리가제 2단위(최종 용적은 H2O를 사용하여 100μl로 조정한다)를 가하기 전에 온도를 서서히 4℃로 감온시킨다. 37℃에서 2시간 동안 추가로 연장시킨 후, DNA를 컴피턴트 이.콜라이 JM 101 세포로 형질감염시킨다. 플레이트를 하이브리드화하여 선별하고, 돌연변이의 서열 확인 후, 새로운 파지 클론(ZpL1)을 사용하여 제2돌연변이용 주형을 제조한다. 올리고뉴클레오타이드 ZC 988(5' CTC AGA GCA TGC AGG GG 3')을 사용하여 제1크링클 영역의 3' 말단에서 Sph I 부위를 도입한다. 돌연변이를 확인하고 파지 클론을 Zpl 2로 지정한다. 복제형 DNA를 ZpL 2로부터 제조하고, t-PA 암호화 서열의 5' 부분을 포함하는 Bam H I-Eco R I 단편을 분리한다. 이 단편을 Zem 99 및 Bam H I + Xba I 분해된 Zem 219c로부터의 부분 Eco R I - Xba I 3' t-PA 단편에 연결시킨다(제7도). 생성된 작제물을 ZpL 7로 지칭한다.
성장인자 도메인 치환제를 표 1에 나타낸 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 작제한다. 18개의 올리고뉴클레오타이드를 4 또는 6개 서열의 다양한 조합으로 혼합하여 제8에 나타낸 조합을 생성한다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 500mg을 50mM의 트리스-HCL(pH 8.0), 10mM의 MgCl2, 10μ Ci(0.3μM) 32P-ATP를 함유하는 150mM 디티오트레이톨 및 0.5단위의 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 함유하는 분리된 튜브중에서, 37℃에서 30분간(총 반응 용적=30μl) 배양시킨다. 특정 올리고뉴클레오타이드를 함유하는 반응 혼합물 5μl 분취량을 제8도에 명시한 조합으로 혼합한다(4개의 올리고뉴클레오타이드를 혼합할 경우 총 용적 20μl, 6개를 혼합할 경우 30μl). T4 DNA 리가제 1단위를 가하고, 혼합물을 실온에서 2시간 동안 배양시킨다. 결합된 올리고뉴클레오타이드 집합체를 8M 우레아를 함유하는 5% 폴리아크릴아미드 겔상에서 전기영동시킨다. 완전한 길이로 조합된 단편에 상응하는 밴드를 절단해 0.3M 아세트산나트륨으로 밤새 용출시키고 DNA를 에탄올 침전시킨다. 올리고뉴클레오타이드 집합체를 1-, 10- 및 50- 배 희석시키고 정제된 Kpn I, Xho I - 절단 ZpL 7과 함께 결합 혼합물에 가한다. 정확하게 치환된 플라스미드를 먼저 서던 블롯 분석으로 확인한 후 전체 치환된 영역을 횡단하는 서열 분석으로 확인한다. 제8도에 있어서, 단편 A는 t-PA 아미노산 63 내지 70을 서열 MEGNHLAN으로 치환하고, 단편 B는 t-PA 아미노산 51 내지 84를 사람 인자 IX의 전체 성장인자 도메인으로 치환하고, 단편 C는 t-PA 아미노산 51 내지 60을 사람 인자 IX의 상응하는 영역으로 치환하고, 단편 D는 t-PA 아미노산 51 내지 60을 인자 IX의 상응하는 영역으로, 아미노산 63 내지 70은 MEGNHLAN으로 치환하고, 단편 E는 t-PA 아미노산 63 내지 70을 사람 인자 IX의 상응하는 영역으로 치환하고, 단편 F는 t-PA 아미노산 51 내지 84를 사람 인자 VII의 전체 성장 인자 영역으로 치환하고, 단편 G는 t-PA 아미노산 63 내지 84를 사람 인자 VII의 상응하는 영역으로 치환한다. 단편 A, C, D 및 E에서, 83의 유리 시스테인은 세린으로 변환되어 단백질 안정성을 증진시킨다.
대표적인 올리고뉴클레오타이드 조합의 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 제6도에 나타내었다. 짝지은 올리고뉴클레오타이드(1351+1352, 1353+1354, 1355+1356, 1357+1358, 1359+1360, 1361+1362, 1363+1364, 1457+1458, 및 1459+1460)도 또한 제8도에 나타낸 바와 같이 기타 조합으로 조합될 수 있다.
변형된 t-PA 서열에 대한 발현 벡터를 작제하기 위해서, 벡터 ZpL 7을 Kpn I 및 Xho I으로 분해하고, 벡터 단편을 겔 정제한다. 벡터 DNA를 각각의 성장 인자 치환 단편 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J 및 K와 결합시킨다. 결합 혼합물은 컴피턴트 이.콜라이 HB 101 세포를 형질전환시키기 위해 사용한다. 클론을 선택해 DNA를 제조하고, Eco-R I 로 분해한 후, 1% 아가로스 겔상에서 분별한다. DNA를 니트로셀룰로오스로 옮기고, 적당한 γ32P-표지된 올리고뉴클레오타이드로 탐침화하여 치환체의 존재를 확인한다. ZpL 7 A, B, C, D, E, F, G, H, I, J 및 K로 표시되는 생성된 플라스미드를 Eco R I 및 Bam H I로 분해하고, 5' t-PA 단편을 M13 파지 벡터로 클로닝시킨 후, 다시 확인하기 위해서 서열화시킨다. 그 다음에, 플라스미드를 tk-BHK 세포로 형질 감염시키고, 고생산성 클론을 단백질 생성 및 특성화를 위해 증량한다.
변형된 활성화 부위를 갖는 t-PA 동족체중의 Cys를 치환
부위- 특이적 돌연변이 유발을 위해, bp 802 내지 bp 1274의 t-PA 서열을 포함하는 472 bp Eco R I 단편을 Zem 99로부터 분리시키고, M13mp18(복제형)의 Eco R I 부위로 클로닝시킨다. 재조합 파지를 이.콜라이(JM 101)로 형질감염시키고, 안티-센스쇄 DNA를 분리시킨다.
그 다음에 부위-특이적 돌연변이 유발을 표 2에서 제시된 돌연변이 프라이머중의 하나 및 제2프라이머로서 ZC 87을 사용하여 일본쇄 안티-센스 주형 DNA상에서 수행한다. 올리고뉴클레오타이드 ZC 487, 488, 489 및 620은 274 위치의 Phe를 각각 Glu, Gly, Arg 또는 Pro로 변형시킨다. 올리고뉴클레오타이드 ZC 797, 874, 1013 및 1027은 275 위치의 Arg를 각각 Gly, Leu, Pro 또는 Asp로 변화시킨다. 올리고뉴클레오타이드 621은 277 위치에서 Lys 대신에 Leu를 도입시킨다. 올리고뉴클레오타이드 928은 276 위치의 Ile를 Pro로 변화시킨다. 올리고뉴클레오타이드는 875는 Arg(275)를 Leu로 변환시키고 올리고뉴클레오타이드927은 Phe(274)를, 먼저 Lys(277)를 Leu로 전환시킨 돌연변이체내에서 Pro로 변화시킨다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 875 및 927을 이중 돌연변이를 일으키는데 사용할 수 있다. 20pmoles의 포스포릴화된 돌연변이원 프라이머 및 20pmoles의 제2프라이머를 20mM 트리스(pH 7.5), 10mM MgCl2, 50mM NaCl, 1mM DTT 10μ 중에서 일본쇄 주형 1pmole과 결합시키고, 65℃에서 10분 동안 배양시킨 수, 실온에서 5분 동안 배양시키고, 얼음에 방치시킨다. 20mM 트리스(pH 7.5), 10mM MgCl2 2mM ATP, 1mM dNTPs를 함유하는 10mM DTT, 2.5단위 클레노우 폴리머라제, 및 3.5단위 DNA 리가제 10μl를 어닐링시킨 DNA에 가하고, 그 혼합물을 15℃에서 3시간 동안 배양시킨다. 그 다음에 DNA를 컴피턴트 이.콜라이 JM 101호 형질감염시키고, 세포를 YT 한천상에 도말시킨 다음, 37℃에서 배양시킨다. 그런 다음 DNA를 니트로셀룰로오스로 옮기고, 6×SSC 및 10×덴하르트(Denhardt's) 용액중에서 4℃에서 돌연변이원 프라이머와 1시간 동안 예비 하이브리드화시킨 후, 동일한 용액중 4℃에서 32P-표지된 돌연변이원 프라이머로 하이브리드화시킨다. 4℃에서 3회 세척한 후, 여액을 X-선 필름에 밤새 노출시킨다. 추가의 세척 단계를 돌연변이 플라크를 동정하는데 필요한 고증분에 대해 5℃에서 수행한다. 돌연변이된 삽입물을 디데옥시 방법으로 서열화시킨다.
그 다음, 변경된 서열에 대한 발현 벡터를 작제한다(제9도). 복제형(RF) DNA를 돌연변이된 파지로부터 제조하고, 변형된 t-PA 서열을 Eco R I 단편으로서 정제한다. 플라스미드 Zem 182b를 Eco R I 로 분해하고, t-PA 암호화 서열의 5' 및 3' 부위를 함유하는 벡터 서열을 송아지의 알칼린 포스파타제로 처리한 후, 변형된 t-PA 서열을 삽입한다. 생성된 플라스미드를 Bam H I 및 Xba I로 분해하고, t-PA 단편을 Bam H I + Xba I 절단 pDR 3002에 삽입한다. 생성된 pMH 7 내지 pMH 20으로 명명한다.
그 다음에 변형된 GF 도메인과 활성화 부위 돌연변이를 하기 위한 방법으로 결합시킨다. Zem 99-9200으로부터 Cys(84) 돌연변이체 DNA를 Bam H I - Sca I 단편으로서 분리하고, 3부분의 연결부, 즉, Bam H I, Xba I - 분해된 Zem 219b 및 Sca I - Xba I 단편에 결합하여, pMH 10, pMH 13 또는 pMH 17로부터 변형된 활성화 부위를 암호화한다. 생성된 발현 벡터(9290-10, 9200-13, 및 9200-17로 명명)는 일렉트로포레이션(electroporation)으로 tk-BHK 세포를 형질감염시키는데 사용한다. 생산성이 높은 클론을 증량시켜 단백질을 정제한다.
[실시예 7]
콘센서스 핑거 도메인(Consensus Finger Domain)을 함유하는 t-PA 동족체중의 Cys의 치환
t-PA 핑거 도메인을 콘센서스 핑거 영역으로 치환하여 Arg-27, Lys-49 및 Arg-89의 잠정적 단백질 분해 절단 부위를 제거한다. 8개의 핑거 치환 서열을 피브로넥틴 및 t-PA의 핑거 도메인의 분석에 기초하여 작제한다.
콘센서스 핑거 서열을 하기에 기술된 바와 같이 올리고뉴클레오타이드로부터 작제한 후, t-PA 암호화서열을 삽입한다. 이러한 삽입을 용이하게 하기 위해, Kpn I 부위를 야생형 핑거 도메인을 암호화하는 영역의 하부(3')에 도입시킨다. 생성된 서역을 Bgl II 및 Kpn I로 분해하여 야생형 핑거 도메인을 결실시킨다.
A. 핑거 및 성장 인자 도메인 사이의 Kpn I 부위 삽입
Kpn I 부위를 t-PA중 핑거 도메인 뒤에 위치시키기 위하여, 돌연변이 유발을 올리고뉴클레오타이드 ZC 986(5' TTT GAC AGG TAC CGA GTG GCA 3')을 사용하여 수행한다. 천연 t-PA cDNA의 5' Bam H I - Eco R I 단편을 함유하는 파지 M 13 클론의 DNA를 제조한다. 100μl의 DNA 용액을 사용하여, 0.1μg/ml의 우리딘으로 보충된 YT 배지 100μl중에서 이.콜라이 RZ 1032를 감염시킨다. 상기의 배양물은 37℃에서 밤새 강하게 진탕시키면서 배양시킨다. RZ 1032 내에서 M 13을 성장시켜, RZ 1032내에서는 생존하나, JM 101에서는 생존 못하는 우리딘을 함유하는 파지를 생성한다.
세포를 원심분리하고, 파지 상등액을 사용하여, 이.콜라이 RZ 1032를 재감염시킨다. 이 두 번째 계대배양을 수행하여, 우라실을 함유하지 않는 특정한 JM 101-유도된 파지를 희석시킨다. 다시, 세포를 원심분리하고, 파지를 MN 101 및 RZ 1032상에 플레이팅한다. 정상적인 생존이 RZ 1032 플레이트상에서 관찰되며 (10 pfu/ml의 파지를 나타냄). JM 101 세포상에서는 플라크가 관찰되지 않는다. 그후 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드로 프라임된 상보성 쇄를 시험관내에서 생성한다. 돌연변이를 함유하는 신규한 쇄는 티미딘을 함유하며, 따라서 JM 101내에서 생존할 수 있다; 야생형 주형은 생존 불가능하다.
주형 DNA는 파지 상등액을 PEG 침전시키고, 다음에 페놀-클로로포름 추출 및 에탄올 침전시켜 제조한다. 이 주형 DNA 1μg을 잠깐 비등시키고, 65℃에서 5분간 배양시킨 후, 10μl의 0.2M HEPES pH 7.8, 2μl의 100mM의 DTT, 1μl의 1M MgCl2, 각각 2.5mM의 dNTP 20μl, 10μl의 10mM의 ATP, 1μl의 2.5U/μl의 클레노우, 및 2μl의 1U/μl T4 DNA 리가제(H2O를 사용하여 최종 용적이 100μl가 되게 한다)를 가하기 전에 서서히 4℃로 감온시켜 10μg의 올리고뉴클레오타이드 ZC 986과 하이브리드화시킨다. 37℃에서 2시간 동안 연장한 후, DNA를 컴피턴트 JM 101 세포내로 형질감염시킨다. 오염된 RNA 또는 DNA종 상에 프라임, 연장시켜 생성된 기본량을 비교하기 위해, 대조 연장(마이너스 올리고뉴클레오타이드)을 수행한다. 돌연변이가 일어나지 않은 주형으로 형질감염을 시킨 경우는 플라크가 생성되지 않으며, 대조용 연장물(마이너스 올리고뉴클레오타이드)의 경우에는 150개 및 돌연변이 유발된 주형으로 한 경우는 300개의 플라크가 형성되었다.
플레이트는 리프트된 플라크를 P-표지된 돌연변이원 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화시켜, 5℃에서 30분 동안 3M의 TMAC1(참조: Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82; 1585-1588, 1985)로 세척하고, 또한 무작위 선택된 플라크를 서열화시켜 스크린한다. 하나의 양성 클론이 수득된다.
B. 핑거 치환 도메인의 제조
콘센서스 핑거 영역의 치환이 표 4에 제시되어 있고, 제10도가 작성되었다.
지시된 올리고뉴클레오타이드로부터 8개의 콘센서스 서열이 생성된다. 올리고뉴클레오타이드(표 5)는 DNA 합성기(Applied Biosystems Model 380A DNA Synthesizer)를 사용하여 제조한다. 우선, 37℃에서 1/2시간 동안 폴리뉴클레오타이드키나제와 함께 각각 배양하여, 12개의 올리고뉴클레오타이드를 키나제화하고, 동시에 γ-32P ATP를 사용하여 저특이적 활성으로 표지화시킨다. 그 다음에 지시한 8개의 조합 (ABC, DEF, ABF, AEC, AEF, DBF, DEC 및 DBC)은 적합한 올리고뉴클레오타이드를 혼합하고, DNA리가제를 가하여, 37℃에서 1시간 동안 배양시킴으로써 제조한다. 이 반응의 생성물을 6% 폴리아크릴아는 밴드를 절단하고, DNA를 2.5M 암모늄 아세테이트중에서 용출시킨다. DNA를 에탄올-침전시키고, 물에 재현탁하여 1pmol/μl의 농도가 되도록 한다.
RF DNA를 실시예 5A에서 기술한 양성 클론으로부터 제조하고, Bam H I 내지 Eco R I t-PA 단편을 정제한다. 플라스미드 Zem 219a(실시예 2에 기술)를 Xba I 로 절단시킨 후 부분적으로 Eco R I 로 절단한다. 3' t-PA 암호화 영역을 함유하는 1010bp 단편을 정제한다. 플라스미드 Zem 219b(실시예 2에 기술)를 Bam H I 및 Xba I 로 분해하고, 5' t-PA 단편(Bam H I - Eco R I) 및 1010bp Eco R I-Xba I 단편에 결합시킨다. Zem 238로 명명되는 생성된 벡터는 핑거 도메인 다음에 Kpn I 부위를 함유한다. Zem 238을 Bgl II 및 Kpn I로 분해하고, 겔-정제하여 야생형 핑거 도메인을 제거하고, 8개의 콘센서스 서열 각각과 결합하여, 발현 벡터 238-Fcon 1 내지 238-Fcon 8을 생성시킨다.
C. Cys(84) 치환체와 콘센서스 핑거의 조합
M 13-9200(실시예 4)로부터의 주형 DNA를 실시예 7A에서 기술한 바와 같이 올리고뉴클레오타이드 프라이머 ZC 986으로 어닐링시킨다. 핑거 도메인의 3' 말단에 삽입된 Kpn I 부위를 갖는 정확하게 돌연변이된 클론을 동정하여 서열화한다. 이 클론으로부터의 RF DNA를 갖는 Kpn I 및 Xba I로 분해하고, Cys(84) 돌연변이체 DNA를 Kpn I Xba I-분해된 플라스미드 238-Fcon 1 내지 238-Fcon 8로부터의 벡터 DNA에 결합시킨다. 9200-Fcon 1 내지 9200-Fcon 8로 명명되는, 생성된 벡터를 tk-BHK 세포로 형질감염시키고, 돌연변이체 단백질을 정제하여 특성화시킨다.
[실시예 8]
GF 도메인이 변경된 t-PA 동족체에서의 탄수화물 부가위치의 변형
조직 플라스미노겐 활성화제는 잠재적 글리코실화 부위(아미노산 서열 Asn-X-Ser/Thr)를 4개 갖는다. 문헌[참조: 포올(Pohl) 등, Biochemistry 23: 3701-3707, 1984]에 따르면 이중의 세 부위(Asn-117, -184 및 -448)는 보우스 흑색종 세포로부터 수득한 t-PA에서 글리코실화되어 있다. 글리코실화 부위에서 Asn 잔기를 기타의 아미노산 잔기로 변경시켜, 글리코실화를 차단한다. 특히, Asn 잔기를 Gln 잔기로 변화시키는 것이 바람직하다. t-PA를 암호화하는 DNA 서열에서의 변경은 부위-특이적 돌연변이 유발에 의해 수행된다. 뉴클레오타이드는 단독으로 또는 조합하여 변화시켜 하나 이상의 글리코실화 부위를 변경시킬 수 있다. 더욱이, 돌연변이 서열은 기타 t-PA 암호화 서열의 결실, 삽입 또는 치환을 포함하는 DNA 단편과 혼합하여, 몇몇의 돌연변이가 조합된 신규한 단백질을 생성할 수도 있다.
부위-특이적 돌연변이 유발은 돌연벼이원 프라이머 ZC 294, ZC 295 및 ZC 297(참조:표 6)을 사용하여, 일본쇄 M13 파지 주형상에서 수행하여 Asn-117, -184 및 -448에서 각각 변형시킨다. 이어서, pDR 1296에서 t-PA 암호화하는 DNA 서열을 작제한다. 다음의 플라스미드를 작제한다 :
(1) Asn-117이 돌연변이된 pDR 1601,
(2) Asn-184가 돌연변이된 pDR 1602,
(3) Asn-448이 돌연변이된 pDR 1603,
(4) Asn-117 및 -448이 돌연변이된 pDR 1604,
(5) Asn-184 및 -448이 돌연변이된 pDR 1605 및
(6) 3개가 돌연변이된 pDR 1606.
추가의 돌연변이 유발에서, 올리뉴클레오타이드 프라이머(5' ACG GTA GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA 3')는 Gly(183) 및 Ser(186)을 Ser 및 Thr로 각각 치환시키기 위하여 제조한다. 이러한 돌연변이로 인하여, K2 도메인에서 보다 균일한 글리코실화가 이루어진다. 부위-특이적 돌연변이 유발은 원-프라이머(one-primer) 방법으로, 주형 M13mp18/Bam-Zem 99를 사용하여 수행한다(실시예 3). 일본쇄 돌연변이된 파지 DNA를 제조하고, 서열화한다. 목적하는 서열이 변경된 클론은 M13-6000이라고 명명한다.
M13-6000으로부터의 RF DNA를 분리하고, Bgl II 및 Apa I 로 분해한 다음, 약 1.4kb의 단편을 분리한다. 이 단편을 Bgl II, Apa I- 분해된 Zem 99에 결합시켜, 벡터 Zem 99-6000을 제조한다. Zem 99-6000으로 형질전환된 이.콜라이 RRI는 기탁번호 제FERM P-9126호로 기탁기관[Fermentation Research Institute]에 기탁되어 있다.
플라스미드 Zem 99-9200으로부터의 Cys(84) 돌연변이체 DNA를 Bgl II 및 Nar I로 분해한다. 돌연변이체 DNA 서열을 Nar I-Xha I 단편으로서 pDR 1601로부터의 Nar I-Xba I 단편, 및 Zem 219a 벡터 단편을 결합시켜 생성시킨다. 이러한 플라스미드를 사용하여 일렉트로포레이션시켜 tk-BHK 세포를 형질감염시킨다. 돌연변이체 단백질을 정제하고 특성화한다.
pDR 1601 및 pDR 1606의 돌연변이체 t-PA 서열을 Bam H I - Xba I 단편으로서 분리하고, Zem 99에 삽입한다. 생성된 발현 벡터로 tk-BHK 세포를 형질감염시킨다. 돌연변이체 단백질 1601 및 1606을 형질감염된 세포로부터 분리하고 특성화한다.
실시예 5에 기술된 GF 치환 돌연변이체의 K1 글리코실화 부위에 있는 Asn을 치환시키기 위하여, 주형 DNA를 파지 ZpL 2로부터 제조한 다음, 올리고뉴클레오타이드 ZC 1452(5' CAA CGC GCT AGA TTG CCA GTT GGT 3')를 사용하여 돌연변이 유발시킨다. 생성된 파지 클론을 ZpL 3으로 명명한다(제7도)
복제형 DNA를 ZpL 3으로부터 제조한 다음, t-PA 암호화 서열의 5' 위치를 포함하는 Bam H I - Eco R I 단편을 분리시킨다, 이 단편을 Zem 99 및 Bam H I + Xba I 분해된 Zem 219c로부터 수득한 부분적인 Eco R I- Xba I 3' t-PA 단편에 결합시킨다(제7도). 생성된 벡터(ZpL 5로 명명함)를 Kpn I 및 Xho I로 분해한 다음, 벡터 단편을 겔 정제한다. 벡터 DNA를 실시예 5에 기술된 성장인자 치환 단편 A, B, D 및 G와 결합시킨다. 결합 혼합물을 사용하여 컴피턴트 이.콜라이 HB 101 세포를 형질전환시킨다. 클론을 취한 다음, GF 도메인 치환을 플라스미드 ZpL 5A, B 및 D에 대한 하이브리드화 및 서열 분석하여 확인한다. ZpL 5A를 tk-BHK 세포로 형질감염시킨 다음, 고생산성 클론을 증량하여 단백질을 생산하고 특성화한다.
[실시예 9]
GF 변형체와 크링글 도메인 치환체와의 조합
A. Asp(96) 플라스미노겐 크링글
플라스미드 pK1은 제11도에 도시된 플라스미노겐의 K1 도메인을 위한 암호화 서열을 포함한다. 이는 표 7에 도시된 일련의 11개의 올리고뉴클레오타이드(PK1-1, PK1-3, …, PK1-12로 명명됨)부터 작제된다.
플라스미노겐 K1 도메인의 뉴클레오타이드 1 내지 182에 대한 암호화 서열을 하기 방법으로 올리고뉴클레오타이드 PK1-1 내지 PK1-7로부터 제조한다. 올리고뉴클레오타이드 PK1-1, PK1-2, PK1-3 및 PK1-4 각각 100pmole을 그들의 5' 말단에서 포스포릴화시킨다. 포스포릴화된 올리고뉴클레오타이드를 PK1-5, PK1-6 및 PK1-7 각각 100pmol과 혼합한다. 혼합물을 에탄올로 침전시킨 다음, 침전물을 H2O에 재현탁시켜, 90℃에서 3분 동안 가열한다. 이어서, 용액을 실온에서 10분 동안 방치한 다음 얼음위에 놓는다. 이 냉각된 혼합물에 6.6mM MgCl2를 함유한 10μl의 660mM 트리스 HCl(pH 7.6), 10μl의 0.1M 디티오트레이톨, 10μl의 5mM ATP 및 1000단위의 T4 DNA 리가제를 가한다. 이 혼합물을 14℃에서15시간 동안 배양한다. 에탄올을 가하고, 생성된 침전물을 20μl의 TE 완충액(10mM 트리스-HCl, 1mM EDTA, pH 8.0) 중에 재현탁시킨후, 동량의 알칼리 로링 완충액(20mM NaCl, 2mM EDTA, 80% 포름아미드, 0.1% 크실렌 시아놀 및 0.1% 브롬페놀 블루)을 가한다. 이 혼합물을 90℃에서 3분간 가열하고, 8.4M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 겔상에서 300볼트로 1시간 동안 전기 영동시킨다. 겔을 에티듐 브로마이드로 염색하고, DEAE-셀룰로오스 페이퍼로 전기 영동에 의한 전달을 통해 250bp 밴드를 회수한다[문헌:Dretzen et al., Anal. Biochem 112:295-298, 1981]. 회수한 DNA를 TE 완충액 100μl에 용해시키고 이 단편을 PK1-n이라 칭한다. 10μl의 PK1-n을 2μl의 100mM 나트륨 카코딜레이트-25mM HEPES(pH 7.6), 6.2μl의 1mM dCTP, 10단위의 말단 데오시뉴클레오디틸 트랜스 퍼라제 및 5μl의 H2O와 혼합시켜, PK1-n의 3' 말단부에 C가 붙도록 한다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분간 배양하고, 페놀 :클로로포름(1 : 1)으로 추출한다.
3'-올리고(dG) 말단의 pUC9(Pharmacia로부터 구입) 1μl를 Sam I로 절단한다. 선형화된 말단의 플라스미드를 C-말단의 PK1-n에 가한다. 이 혼합물을 에탄올 침전시키고, DNA를 0.5μl의 2M KCl 및 9.5μl의 TE 완충액에 재현탁시켜, 65℃에서 10분간 배양한 후, 실온으로 냉각시킨다. 0.1M MgCl2 및 0.1M 디티오트레이톨을 함유하는, 5μl의 0.2M 트리스 HCl(pH 7.5), 20μl의 2.5mM dNTPS, 10μl의 5mM ATP, 53 μl의 물, 5단위 DNA 폴리머라제 I(클레노우 단편) 및 300단위의 T4 DNA 리가제(최종 용적이 100μl)를 냉각된 혼합물에 가한다. 혼합물을 14℃에서 12시간 동안 배양한 후, 이.콜라이 JM 83을 형질감염시키는데 사용한다.
형질감염된 JM83 세포를 문현[참조 : Wallace et al., Nuc. Acids Res. 9 : 879-894, 1981]의 방법을 사용하여 PK1-6으로 탐침화시킨다. 20개의 양성 클론을 서열화하고, 2개를 선별한다 : bp 1 내지 170을 포함하는 #1-3 및 bp 68 내지 186을 포함하는 #8-5(제12도 참조).
제13도에 있어서, 클론 #1-3은 Eco R I 및 Fork I 로 분해하고, Kpn I 부위를 함유하는 130bp 단편을 회수한다. 유사하게, 클론 #8-5를 Fok I 및 Hind III로 분해하여, 90bp 단편을 회수한다. 두 개의 단편을 Eco R I, Hind III-분해된 pUC 12에 결합시켜, 생성된 플라스미드를 pPKA라 명명한다. 즉, 이 플라스미드는 플라스미노겐 K1 서열의 뉴클레오타이드 1 내지 182에 상응하는 DNA 서열을 함유한다.
올리고뉴클레오타이드 PK1-9, PK1-10, Pk1-11 및 PK1-12를 사용하여 나머지 부분을 작제한다. 올리고뉴클레타이드 각각 1pmole을 5' 말단에서 포스포릴화시키고, 혼합된 올리고뉴클레오타이드들을 40μg의 Bam H I, Sph I - 분해된 M13 tg 130 RF(Amersham으로부터 구입)과 혼합한다. 이 혼합물에 4μl의 660mM 트리스 HCl(pH 7.6)(66mM MgCl2 및 22μl의 H2O를 함유)을 가한다. 이 용액을 90℃에서 3분간 가열하고, 한시간에 걸쳐 실온까지 냉각시킨다. 다시 4μl의 0.1M 디티오트레이톨, 4μl의 5mM ATP 및 300단위의 T4 DNA 리가제를 가하고, 이 혼합물을 14℃에서 12시간 동안 배양한다. 생성된 파지 클론은 플라스미노겐 K1 서열의 뉴클레오타이드 183 내지 250을 함유하며, M13 PKB RF(제14도)로 명명한다.
완전한 플라스미노겐 K1 암호화 서열의 집합체가 제14도에 나타나 있다. 플라스미드 pPKA를 Mlu I 및 Sau 3A I 로 분해하고, 176bp 단편을 회수한다. M13 PKB RF를 Sau 3A I 및 Eco R I로 분해후, 88bp 단편을 회수한다. 이 단편들은 Mlu I, Eco R I-분해된 Ml3um20 RF(IBI로부터 구입)에 결합시킨 후, 생성된 플라스미드를 Ml3um20-PK1로 명명한다.
그 다음에 PK1 암호화 서열을 t-PA 크링글 1 서열을 위한 치환체로서 t-PA cDNA에 삽입시킨다(제15 및 16도). 서열화된 t-PA를 우선 Mlu I 및 Eco RV 부위에 삽입시키기 위해 돌연변이를 유발시킨다. 플라스미드 pDR 1496을 Sph I 및 Xha I으로 분해하고, 알파 인자 및 t-PA 서열을 함유하는 2.1kb 단편을 분리한다(pDR 1496으로 형질전환시킨 에스. 세레비지에(S. cerevisiae) 균주 E8-11C는 기탁 번호 제207828호로 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁되어 있다). 이 단편을 Sph I, Xba I-분해된 M13tg 130(RF)에 결합시키고, 생성된 파지를 M13tg 130-W라 명명한다. 그후 일본쇄 파지 DNA를 올리고뉴클레오타이드(5' GCA CGT GGC ACG CGT AYC TAT TTC 3')에 어닐링시키고, 표준 방법에 따라 돌연변이를 일으킨다. 변이가 일어난 파지를 M13tg 130-PKA1이라 명명한다. M13tg 130-PKA의 일본쇄 DNA를 분리하고, 서열이 5' CTC AGA GCA TTC CAG GAT ATC GCA GAA CTC 3'인 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 원-프라이머 방법에 의해 변이를 일으킨다. 일본쇄 DNA는 돌연변이된 파지로부터 제조하여 서열 분석한다. 크링글 1 암호화 서열의 5' 말단에 Mlu I 부위 및 3' 말단에 Eco RV 부위를 함유하는 클론을 선택하여 M13tg 130-PKA2라 명명한다.
복제형 DNA는 M13tg 130-PKA2로부터 제조하고 Bgl II 및 Apa I으로 분해한다. Mlu I 및 Eco RV 부위를 함유하는 단편을 회수하여, Bgl II, Apa I - 분해된 Zem 99에 결합시킨다(제15도). 생성된 플라스미드를 Zem 99-2020이라 한다.
PK1 서열을 t-PA cDNA에 삽입한다. M13um20-PK1 RF를 Mhu I 및 Eco RV로 분해하고 336bp 단편을 회수한다. 이 단편을 Mlu I, Eco RV-분해된 Zem 99-2020에 결합시키고, Zem 99-8000을 작작한다(제16도). Zem 99-8000의 t-PA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열은 제17도와 같다.
B. Asn(96) 플라스미노겐 크링글
96위치에서 Asn을 암호화하는 제2플라스미노겐 K1 서열을 작제한다(제16도). Zem 99-8000을 Bam H I 로 분해하고, Bgl II 부위를 함유하는 단편을 회수한다. 이 단편을 Bam H I 절단 M13mp18에 결합시켜 M13-8000R을 작제한다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열 5' TTT TTA CCA TTA CCG GTC TT 3')를 일본쇄 M13-8000R에 어닐링시키고, 원-프라이머 방법에 대한 통상적인 방법에 따라 돌연변이를 유발한다. 클론을 선별하여 서열화시키고, M13-8000RF로 명명된, 이본쇄 DNA를 양성 클론으로부터 제조한다. 이 파지를 Bgl II 및 Apa I로 분해하고, t-PA 단편을 분리한 다음, Bgl II, Apa I-절단 Zem 99에 결합시킨다. 생성된 플라스미드는 Zem 99-8100으로 명명한다. Zem 99-8100에 존재하는 t-PA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 제18도에 나타내었다.
플라스미드 Zem 99-8000 및 Zem 99-8100(이.콜라이 RRI 형질전환체)은 FRI에 각각 기탁되어 있다[기탁번호 : FERM P-9272 및 FERM P-9315].
C. GF 변형체 및 치환체의 조합
일본쇄 DNA를 M13-9200으로부터 분리하고 올리고뉴클레오타이드 5' GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC 3'를 이용하여 돌연변이시켜 Mlu I 부위를 삽입한다. 돌연변이된 파지는 M13-92.05 PKA1로 명명한다. 변이체 파지로부터 RF DNA를 제조하고, Bgl II 및 Mlu I로 절단한 다음, 264bp 단편을 회수한다. Zem 99-8000를 Mlu I 및 Apa I로 분해하고, 1126bp 단편을 회수한다. 이들 두 단편을 Bgl II, Apa I-분해된 Zem 99에 결합시키고, 생성된 플라스미드는 Zem 99-9280으로 명명한다. 즉, 이 플라스미드는 아미노산 84 위치에Ser을 갖는 돌연변이체 t-PA 및 96 위치에 Asp를 갖는 플라스미노겐의 K1 도메인을 암호화한다.
아미노산 84 위치에 Ser을 갖는 t-PA 동족체 및 96 위치에 Asn을 갖는 플라스미노겐의 K1 도메인을 암호화하는 돌연변이체 t-PA 서열을 함유하는 두 번째 벡터를 작제한다. M13-92.05 KPA1으로부터 제조된 RF DNA를 Bgl II 및 Mlu I로 분해하고, 264bp 단편을 회수한다. Zem 99-8100을 Mlu I 및 Apa I로 분해하고, 1126bp 단편을 회수한다. 이들 두 단편을 Bgl II, Apa I-분해된 Zem 99에 결합시키고, 생성된 플라스미드는 Zem 99-9281로 나타낸다.
플라스미드 Zem 99-8000을 Spe I 및 Hind III으로 분해하고, 3' 변이체 t-PA 암호화 서열 및 전체 hGH 터미네이터를 함유하는 단편을 겔 정제시킨다. 플라스미드 ZpL 7을 Hind III으로 부분적으로 분해하고, Xho I로 완전히 분해한 다음, 벡터 서열을 3' t-PA 암호화 서열 및 hGH 터미네이터로부터 정제 분리시킨다. 올리고뉴클레오타이드 ZC 1639 및 ZC 1640(표 8)을 어닐링시키고, 생성된 Xho I 내지 Spe I 단편(플라스미노겐 K1 크링클의 5' 영역을 암호화)을 상기 두 개의 정제된 단편과 함께 결합 반응물중 결합시킨다. 생성된 플라스미드는 8900으로 명명한다. GF 및 K1 치환체를 함유하는 t-PA 유도체를 암호화하는 키메릭 서열을 작제하기 위해, 플라스미드 8900을 Bam H I 및 Xho I 로 절단하고, GF 영역은 플라스미드 ZpL 7A-N 중의 하나에서 분리된 Bam H I 내지 Xho I 영역으로 치환시킨다.
[실시예 10]
단백질의 특성화
상술한 바와 같이 단백질 9100 및 9200을 제조하고, 대조군으로서 형질감염된 tk-BHK 세포로부터 제조된 천연 t-PA를 이용하여 활성 및 혈장 반감기를 시험한다.
t-PA 동족체 #9100 및 #9200을 대조군으로서 천연의 재조합 t-PA를 사용하여 응괴 용해 활성에 대해 시험한다. 길이 3cm의 견사를 원자 정맥 카테테르(Atom Venous Catheter; 4Fr 3.5cm)에 도입시키고, 카테테르를 주사기에 연결시킨다. 사람의 시트레이트 혈액을, 혈액 및 3.8% 시트르산 나트륨 용액을 9 : 1 비율로 혼합하여 제조한다. 시트레이트 혈액(0.5ml)을 125I-피브리노겐(생리 식염수 용액 50μl중 25μ Ci), 0.25M CaCl2 50μl 및 트롬빈(5U/용액 10μl)과 함께 혼합시킨다. 생성된 용액 16μl를 카테테르 속으로 주사하고, 실온에서 60분 동안 카테테르를 방치한다. 카테테르에서 견사를 제거한 다음, 생리 식염수 용액으로 세척한다. 견사에 부착된 방사능(최초 피브린 혈전가)을 측정한다. 견사를 체중이 200 내지 300g인 스프라그-도울리 숫컷(Sprague-Dawley) 래트의 경동정맥(A-V) 속에 삽입시킨다. ml당 헤파린 50단위를 함유하는 식염수 용액중의 단백질 샘플 1ml를 동물의 대퇴정맥내에 주사한다. 2시간후에, 분합으로부터 견사를 제거하고, 방사능(잔여 피브린 혈전가)을 측정한다. 잔여 혈전가는 다음 식으로 측정된다
제19도는 다양한 투여량의 천연 t-PA, #9100 및 9200을 사용하여 수득된 결과의 그래프이다. 데이터는 돌연변이체 생체내에서 응괴를 용해하는 능력에 있어 천연 t-PA와 비견됨을 나타낸다.
혈장 반감기를 측정하기 위하여, 단백질을 식염수 용액에 용해시킨다. 용액을 0.4mg/kg의 용량으로 스프라그-도울리 래트 숫컷(체중 230g 내지 270g)의 대퇴정맥내에 주사한다. 혈액 샘플(0.5ml)을 경정맥으로부터 제거하고, 3.8% 시트르산으로 조정한 다음, 원심분리한다. 혈장의 t-PA 수준을 샌드위치-형 효소 면역학적 감정을 사용하여 검정을 사용하여 측정한다. 제20도는 주사후의 시간에 따른 혈장수준을 도시한 것이다.
단백질의 혈장수준의 변화는 2-구획 모델[참조:Shargel, L. and Yu. A. B. C., eds., Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, Appleton-Century-Crofts, New York 1980. pp. 38-48]로 분석한다. 반감기는 제거(clearance)의 α 및 β상에 대하여 측정한다. 종좌표인 β상의 역외삽절편(B) 및 곡선 아래의 면적(AUC)을 또한 측정한다. 수득된 수치를 표 9에 나타내었다.
천연 t-PA 및 돌연변이체 단백질 ZpL 7-A, ZpL 7-B 및 ZpL 7-F(제8A, B 및 F도에 상응함)를 래트의 혈장 반감기에 대해 시험한다. 시험한 각 단백질에 대하여, 체중 20 내지 21g의 Balb/c 마우스 암컷 2마리를 에테르로 마취시키고, 총 용적 100μl의 PBS중의 친화 정제 단백질 10μg을 꼬리 정맥을 통해 주사한다. 주사 전후에 주사기의 무게를 측정한다. 적절한 시간 간격으로, 헤파린화된 마이크로피펫을 사용하여 후안와총(retroorbital plexus)으로부터 혈장 샘플(25μl)을 수거한다. 샘플을 원심분리하여 적혈구 세포를 제거하고, 검정을 위해 희석한다. 혈장 t-PA 수준은 천연 사람 t-PA에 대한 친화 정제된 래비트의 폴리클로날 항체를 사용하여 ELISA로 측정한다.
실험 결과를 제21도에 나타내었다. 세 개의 변이체 단백질 모두는 천연 t-PA보다 상당히 느린 속도로 제거된다는 것이 밝혀졌다. 이러한 결과는 동족체 A의 성장인자 도메인에서의 아미노산 변화 및 동족체 B 및 F의 인자 IX 및 인자 VII 성장인자 치환체가 정상적인 경로로 이러한 분자가 제거되는 것을 방해한다는 것을 제시하였다.
유사한 실험에서, 돌연변이체 단백질 ZpL 5A(실시예 8 참조)는 7.7분의 반감기를 갖는다. 이러한 실험에서 천연 t-PA의 반감기는 1.5분이다.
래비트의 혈장 반감기에 대해 돌연변이체 단백질 1601 및 1606을 시험하였다. 결과를 표 10에 나타낸다.
상기로부터, 본 발명의 특정한 양태를 기술할 목적으로 본 명세서에 기술하였으나, 발명의 목적 및 범주를 벗어남이 없이 여러 가지로 변형될 수 있음을 이해할 수 있다. 따라서, 발명은 첨부된 특히 청구범위를 제외하고는 제한되지 않는다.
Claims (7)
- 천연 t-PA의 아미노산 위치 84에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 t-PA 동족체를 암호화하는 DNA.
- 천연 t-PA의 아미노산 위치 84에서 시스테인 잔기가 세린으로 치환된 t-PA 동족체를 암호화하며 프로모터에 작동적으로 연결된 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터.
- 제2항에 있어서, Zem 99-9200인 발현 벡터.
- 제2항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제4항에 있어서, 세균, 진균 또는 동물 세포인 숙주 세포.
- 제3항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제6항에 있어서, 세균, 진균 또는 동물 세포인 숙주 세포.
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