KR970005251B1

KR970005251B1 - 크링글 치환이 있는 돌연변이 이체 티-피에이

Info

Publication number: KR970005251B1
Application number: KR1019880006716A
Authority: KR
Inventors: 알. 멀비힐 아일린; 에이. 넥소 브요른; 신찌 요시다께; 야수노리 이께다; 수구루 스즈끼; 아끼라 하시모또; 데루아끼 유쭈리하
Original assignee: 그레고리 디. 펠프스; 자이모 제네틱스, 인코포레이티드; 앤 세커; 노보 인더스트리 에이/에스; 가네꼬 요시마사; 에이사이 가부시끼가이샤
Priority date: 1987-06-04
Filing date: 1988-06-04
Publication date: 1997-04-14
Also published as: DE3851259T2; AU617323B2; IE881681L; IE64782B1; DK302288A; NO882453L; FI882628A; ES2058180T3; JPS6485078A; AU1741088A; JPH0448433B2; ATE110772T1; KR890000665A; NO179754B; EP0293934A1; NO179754C; DK302288D0; FI882628A0; NZ224915A; DE3851259D1

Abstract

내용 없음.

Description

크링글 치환이 있는 돌연변이체 t-PA

제1도는 cDNA 및 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 작제된 프리-프로 t-PA 암호화 서열 및 암호화된 단백질의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 상단 번호는 뉴클레오타이드 위치를 언급한 것이고 하단 번호는 아미노산 위치를 언급한 것이다.

제2도는 벡터 Zem99의 작제를 도시한 것이다.

제3도는 플라즈미노겐의 K1 도메인의 아미노산 서열 및 DNA 서열은 도시한 것이다.

제4도는 플라즈미노겐 K1 도메인의 일부를 암호화하는, 클론 #1-3 및 #8-5의 부분 제한지도를 도시한 것이다.

제5도는 플라즈미드 pPKA의 작제를 도시한 것이다.

제6도는 플라즈미노겐 K1 암호화 서열을 함유하는 벡터의 작제를 도시한 것이다.

제7도는 플라즈미드 Zem99-2020의 작제를 도시한 것이다.

제8도는 플라즈미드 Zem99 8000 및 Zem99 8100의 작제를 도시한 것이다.

제9도는 및 제10도는 대표적인 t-PA 유사체의 cDNA 서열 및 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제11도는 절단 부위가 변형된 t-PA 유사체를 암호화하는 변이 DNA 서열을 포함하는, pMH 계열의 프라즈미드 작제를 도시한 것이다.

제12도는 플라즈미드 Zem182b의 작제를 도시한 것이다.

제13도는 플라즈미드 Zem219b의 작제를 도시한 것이다.

제14도는 플라즈미드 Zem99-9100 및 Zem99-9200의 작제를 도시한 것이다.

제15도는 플라즈미드 Zem99-9100내의 돌연변이된 t-PA 서열 및 암호화된 t-PA 유사체의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 번호는 아미노산 위치를 언급한다.

제16도는 Zem99-9200내의 돌연변이 DNA 서열의 뉴클레오타이드 서열 및 암호화된 t-PA 유사체의 아미노산 서열을 도시한 것이다. 번호는 아미노산 위치를 언급한다.

제17도는 래트(rat)에 투여한, 천연 t-PA 및 대표적인 t-PA 유사체에 있어서 시간에 대한 혈장 농도의 플롯을 도시한 것이다. (_____ )는 천연 t-PA, (……)는 유사체 8000을 나타낸다.

제18도는 천연 t-PA 및 본 발명의 대표적인 t-PA 유사체에 있어서 혈전 용해 분석의 결과를 도시한 것이다. (_____ )는 천연 t-PA, (……)는 유사체 #8000을 나타낸다.

제19(a)-(i)도는 천연 t-PA의 핑거 도메인 및 컨센서스 핑거 도메인의 아미노산 서열을 도시한 것이다.

제20도는 우로키나제(U), 천연 t-PA(tPA), 플라즈미노겐(PL), 인자 XII(FXII) 및 프로트롬빈(PT)의 크링글 도메인간의 상동성을 도시한 것이다. (-)는 서열 정렬을 최대화시키기 위해 삽입시킨 갭을 나타낸다.

본 발명은 피브린용해제, 이의 제조방법, 및 이를 함유하는 약제학적 조성물에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 변형된 크링글 도메인(kringle domain)을 지니는 조직형 프라즈미노겐 활성인자(t-PA) 유사체에 관한 것이다.

혈액 응고는 여러 가지 혈액 성분의 복합적 상호반응으로 이루어지며, 궁극적으로 피브린 망상구조물, 또는 응혈을 생성하는 반응이다. 피브린 망상구조물의 분해는 자이모겐(zymogen) 플라즈미노겐을 플라즈민으로 활성화시킴으로써 수행될 수 있다. 플라즈민은 피브린 망상 구조물을 직접 분해함으로써 응고과정을 조절하는데 작용하는 세린 프로테아제이다. 프라즈미노겐이 플라즈민으로 전환되는 과정은 통상 조직형 플라즈미노겐 활성 인자(t-PA)(피브린-특이적 세린 프로테아제:이것은 플라즈미노겐의 생리학적 혈관 활성인자인 것으로 여겨진다)에 의해 생체내에서 촉진될 수 있다. 우로키나제형 플라즈미노겐 활성인자(u-PA)는 세린 프로테아제로 분류된 플라즈미노겐 활성 인자 부류중의 하나이다. t-PA 및 u-PA는 기능 및 면역학적인 면에서 구별된다.

t-PA는 통상 단일 폴리펩타이드 쇄(Mr=72,000달톤)상태로 순환하며, 이것은 아미노산 275(Arg) 및 276(Ile) 사이의 펩타이드 결합이 절단됨으로써 2개의 쇄로 전환된다. t-PA의 중쇄(Mr 40,000 및 37,000의 2개의 변이체)는 아미노-말단에서 유도되는 반면, 경쇄(Mr 33,000)는 t-PA 분자의 카복시-말단으로으로유도된다. 상기의 절단은 트립신 또는 플라즈민에 의해 촉매되며, 합성 기질을 사용하여 측정된 바와 같은 활성의 증가 및 피브린 용해 활성의 증가 현상을 수반한다. 단일쇄 t-PA는 피브린과 결합되면 활성화되는데, 이것은 피브린과의 결합에 의해 유도되는 활성인자내의 구조적 변화에 기인하는 것으로 추정된다. 2개의 쇄 형태로 절단되는 것은 혈류로부터 t-PA의 신속한 제거 정도와 관련될 수 있으나, 이와 모순되는 연구 결과[참조 : Wallen et al., Eur. J. Biochem. 132 : 681-686, 1983]가 보고된 바 있으며, 제거기작에 대하여는 아직 충분히 밝혀지지 않았다.

잠정적인 전구체 t-PA 단백질에 대한 이차원 모델이 제시된 바 있다[참조 : Ny et al., PRoc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 5355-5359, 1984]. 상기 모델로부터, 중쇄는 크링글(kringle)로 알려진 2개의 삼중디설파이드 구조물을 포함하는 것으로 밝혀졌다. 이와 유사한 크링글 구조는 프로트롬빈, 플라즈미노겐 및 우로키나제에서도 발견되는데, 이것은 피브린과 결합하는데 중요한 것으로 추측된다[참조 : Ny et al., 상기참조]. t-PA의 제2크링글(K2)은 제1크링글(K1)보다도 피브린과의 친화도가 더욱 높은 것으로 여겨진다[참조 : Ichinose, Takio and Fujikawa, J. Clin. Invest. 78 : 163-169, 1986 ; Verheijen et al., EMBO. J. 5 : 3525-3530, 1986].

또한, t-PA의 중쇄는 삼중 디설파이드-결합된 구조물인 성장인자 도메인(이것은 상피 성장인자와 상동성이며, 단백질 C, 인자 Ⅶ, 인자 Ⅸ 및 인자Ⅹ의 유사 도메인과도 상동성이다)을 포함한다. 성장인자 도메인은 생체내에서 신속한 t-PA의 신속한 제거에 관여하면, 성장인자 도메인을 결실하여도 생성된 분자가 피브린에 결합하는 것을 억제하거나 이의 플라즈미노겐 활성화 기능을 차단하지는 않는 것으로 밝혀졌다.

t-PA의 중쇄는 또한 피브로넥틴의 핑거(finger) 도메인과 상동성인 핑거도메인을 포함한다. 피브로넥틴은 피브린 결합을 포함한 다양한 생물학적 활성을 나타내며, 이의 피브린-결합 활성은 9개의 핑거 도메인중 4개 또는 5개와 관련되어 있다.

t-PA의 경쇄는 세린 프로테아제 활성을 위한 활성 부위를 포함하는데, 이 부위는 다른 세린 프로테아제의 활성 부위와 상동성이 매우 높다.

t-PA의 전구체는 추가로 프리(pre)-영역 및 그 아래로 이어지는 프로(pro)-영역을 포함하는데, 이를 총칭해서 프리-프로(pre-pro)영역이라 한다. 프리 영역은 혈관 내피 세포에 의한 t-PA의 분비에 중요한 시그날 펩타이드를 함유한다[참조 : Ny et al., 상기 참조]. 프리 서열은 세포의 분비의 필수단계인, 소포체의 루멘으로 t-PA를 분비시키는데 관여하는 것으로 믿어진다. 프로 서열은 소포체에서 골지체로 이동된후 t-PA 분자에서 제거되는 것으로 믿어진다.

피브린용해를 위해 동물 및 환자에게 t-PA를 사용하는 것은 천연분자의 몇몇 단점에 의해 제한되어 왔다. 생체내에서 t-PA의 반감기(half-life)는 사람의 경우 3분 정도로 짧다[참조 : Nilsson et al., Scand. J. Haematol. 33 : 49-53, 1984]. 주입된 t-PA는 간에서 신속하게 제거되고, 30분 이내에 주입된 물질의 대부분이 저 분자량 형태로 대사된다. 이렇게 짧은 반감기는 상당히 많은 양의 t-PA를 필요로 함으로써 혈전용해제로서의 t-PA 효율을 제한한다. 통상적으로 천연 t-PA는 환자당 30 내지 150mg의 용량으로 투여되며, 용해도가 낮으므로 지속적으로 주입해야 한다. 푸쿠스 등[참조 : Fuchs et al., Blood 65 : 539-544, 1985]은, 주입된 t-PA가 원시분해(protoolytic) 부위와 무관한 과정으로 간에 의해 제거되고, 체내에 축적 되지 않으므로 제거 기작은 포화될 수 없다고 결론지었다. 또한 관상동맥의 혈전을 용해하기에 충분한 t-PA의 용량은 정상적인 생리학적 농도보다 훨씬 크며, 상기한 용량으로 체내 전반에 걸쳐 플라즈미노겐의 활성화를 유도하면 전신계적 피브린 분해를 유도하여[참조:Sherry, 상기 참조] 위험한 출혈 상태에 이르게 할 수 있다. 이러한 전신계적 활성은 분명히 2-쇄 형태의 분자의 낮은 특이성에 기인한다.

많은 연구자들은 t-PA의 임상적인 적합성을 증대시키기 위한 시도로 t-PA를 변형시켰다. 이중 한가지는 t-PA의 단일쇄 형태를 안정화시키기 위해 t-PA의 277번 위치의 Lys를 변형시킨 것이다[참조:Rosa and Rosa, 국제특허출원 WO 86/01538]. 이.콜라이에서 생성된 Ile(277) t-PA는 천연 t-PA와 비교할 때, 단일쇄 분자로서 덜 활성적인 것으로 밝혀졌다. 상기의 리진 잔기는 단일쇄 t-PA의 단백분해 활성에 관여 할 수 있는 것으로 추측된다[참조 : Wallen et al., 상기 참조]. 헤이네커 및 베하르는 t-PA 절단 부위 주위의 아미노산 치환에 대해 기술하였다[참조 : Heyneker and Vehar, 공개된 영국 특허원 제2,173,804호]. 275번 위치에 Glu를 함유하는 t-PA 변형체는 천연 t-PA와 비교할 때, 더 우수한 특이 활성을 나타내었다. 이러한 t-PA 변형체는 t-PA 억제제와의 복합체를 더 적게 형성하였다. 또한 단일쇄 형태는 2-쇄 형태 보다 피브린에 대한 친화성이 큰 것으로 밝혀졌다. 로빈슨[참조 : Robinson, WO 84/01786]은 혈장 반감기를 증대시키기 위해 t-PA로부터 탄수화물 측쇄를 제거시키는 효소학적 수단을 사용하였다. 반 존네밸트등[참조 : Van Zonneveld et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83 : 4670-4674, 1986]은 중쇄의 일부가 결실된 변형된 형태의 t-PA에 대하여 기술하였다. 로빈슨 등[참조 : Robinson, et al., EP 207,589 A1]은 성장인자 도메인이 결실되거나 다르게 변형된 t-PA의 돌연변이체 형태에 대하여 기술하였다. 그러나, 이러한 t-PA의 변형체는 천연 단백질과 관련된 문제를 완전히 극복하지는 못한다.

혈장 반감기가 길고 피브린에 대한 친화도가 증진된, 플라즈미노겐 활성화 단백질이 당해 분야에서 요구되고 있다. 본 발명은, 크링글 1도메인이 다른 단백질로부터 유도된 크링글 도메인으로 교체되어 있는 조직 플라즈미노겐 활성인자의 신규 유도체를 제공함으로써 이러한 필요성을 충족시킨다. 본원에 설명된 t-PA유사체는 치료제로 사용되는 경우 천연 t-PA 보다 상당한 잇점을 제공한다. 이러한 잇점에는 피브린에 대한 특이성 증진, 즉 혈전 용해에 대한 특이성의 증가를 초래하는 피브린에 대한 친화성 증진이 포함된다. 증가된 특이성은 천연 t-PA가 나타내는 전신적 출혈 효과를 감소시킬 수 있다. 크링글 1도메인의 치환은 또한 t-PA내의 다른 돌연변이와 조합되어 증진된 임상 적합성을 갖는 추가 신규한 유사체를 제공할 수 있다. 재조합 DNA 기술을 이용하여, 이러한 단백질의 일정하고 균일한 공급원을 제공한다. 이러한 단백질은 심장 발작 환자에 있어서 존재하는 혈전을 용해하고, 다른 환자에 있어서는 형성된 피브린을 분해하거나 이의 형성을 억제할 필요가 치료학적으로 요구되는 경우에 이용될 수 있다.

즉, 본 발명은 천연 t-PA의 K1 도메인인 피브린에 대한 유사체의 결합을 중재하는 다른 크링글 도메인으로 교체된 조직 플라즈미노겐 활성 인자 유사체에 관한 것이다. 상기 크링글은 6개의 시스테인 잔기를 함유하고, 유사체는 천연 t-PA 보다 피브린에 대한 특이성이 우수하다. 본 발명의 선택된 양태에 있어서, 크링글 도메인은 t-PA K2 도메인, 프로트롬빈 K1 도메인, 플라즈미노겐 K4 도메인, 프라즈미노겐 K5 도메인, 인자 XII 크링글 도메인, 글라즈미노겐 K1 도메인 및 프로트롬빈 K2 도메인으로 이루어진 그룹중에서 선택된다. 본 발명의 특정 양태에서는, 크링글 도메인이 77 내지 81개의 아미노산을 함유할 수 있고, 하기 아미노산 서열을 함유할 수 있다 :

Cys Lys Thr Gly X Gly Lys Asn Tyr Arg Gly Thr Met Ser Lys Thr Lys Asn Gly Ile Thr Cys Gln Lys Trp Ser Ser Thr Ser Pro His Arg Pro Arg Phe Ser Pro Ala Thr His Pro Ser Glu Gly Leu Glu Glu Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asn Asp Pro Gln Gly Pro Trp Cys Tyr Thr Thr Asp Pro Glu Lys Arg Tyr Asp Tyr Cys Asp Ile Leu Glu Cys(여기에서, X는 Asp 또는 Asn이다).

본원된 기술된 t-PA 유사체는 추가로 절단 부위의 13개 아미노산 잔기내에 하나 이상의 치환된 아미노산을 함유할 수 있으며, 이러한 치환으로 플라즈민에 의한 분해에 대해서 내성이 증가된다. 또한, 본원에 기술된 t-PA 유사체는 제19(a) 내지 (i)도에 나타낸 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산을 갖는 핑거 도메인을 함유할 수 있다.

본 발명의 다른 양태로서, 크링글 도메인은 탄수화물이 결핍되도록 추가 변형된 프로트롬빈 K1 도메인일수 있다. 또한, 본원의 유사체는 아미노산 위치 183 및 186이 각각 세린 및 트레오닌으로 변형된 천연 t-PA의 K2 도메인을 함유할 수 있다. 또한 본원의 유사체는 성장 인자 도메인이 결핍될 수 있거나, 천연 t-PA, 단백질 C, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X로 이루어진 그룹에서 선택되는 단백질의 성장 인자 도메인을 함유할 수도 있다. 특히 바람직한 양태에 있어서, 성장 인자 도메인은 하나 이상의 시스테인 잔기가 다른 아미노산으로 교체되도록 변형된 천연 t-PA의 성장 인자 도메인이다. 상기 아미노산은 바람직하게는 세린 또는 알라닌이다.

본원에 기술된 바람직한 특정 양태로는, 시스테인 잔기가 크링글 도메인의 N-말단에 대해 위치 1 및 22, 및 크링글 도메인의 C-말단에 대해 위치 1,6,18 또는 19, 및 29, 30 또는 31중 어느 것에 위치한다.

상술한 t-PA 유사체를 암호화하는 DNA 서열뿐 아니라, 이러한 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터도 또한 기재되어 있다. 이 경우의 바람직한 발현 벡터는 Zem99-8000 또는 Zem99-8100이다.

이러한 발현 벡터로 형질감염 또는 형질전환된 숙주 세포도 또한 기재되어 있다. 숙주 세포는 이.콜라이(E. coli) 또는 BHK 숙주 세포와 같은 포유 동물 숙주 세포일 수 있다.

본 발명의 또다른 양태로서, 본원에 설명된 것과 같은 t-PA 유사체 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하는 약제학적 조성물이 기재되어 있다.

본 발명의 이러한 여러 양태는 하기 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 명확해질 것이다.

본 발명을 수행하기 위한 최선의 방법

본 발명을 기술하기 전에, 본 명세서에 사용된 특정 용어의 정의를 설명하는 것이 본 발명을 이해하는데 도움이 될 수 있다.

상보성 DNA 또는 cDNA:mRNA 주형에 존재하는 서열로부터 효소적으로 합성되는 DNA 분자 또는 서열, 또는 그러한 분자의 클론.

DNA 작제물:천연적으로는 존재하지 않는 방법으로 조합되고 병렬된 DNA 서열을 함유하도록 사람의 유전자 조작을 통하여 변형된, 단일-또는 이중 쇄 DNA 단편, 또는 그러한 분자의 클론.

플라즈미드 또는 벡터:숙주 세포에 삽입시 복제를 위하여 제공되는 유전 정보를 함유하는 DNA 작제물. 복제는 자발적으로 또는 숙주 게놈에 통합됨으로써 수행될 수 있다. 플라즈미드는 일반적으로 숙주 세포에서 발현되는 하나 이상의 유전자 서열뿐만 아니라 프로모터, 전사 개시 부위 및 전사 터미네이터를 포함하여, 상기와 같은 유전자 발현을 용이하게 하는 기능을 암호화하는 서열을 함유한다. 이것은 선상 분자 또는 폐쇄된 환상 분자일 수 있다.

프리-프로 영역:특정 단백질 전구체의 아미노 말단에 일반적으로 존재하며, 일반적으로 분비중에 최소한 부분적으로 단백질로부터 분해되는 아미노산 서열, 프리-프로 영역은 부분적으로 세포의 단백질을 분비경로로 이끄는 서열을 포함하며, 일반적으로 소수성 아미노산이 풍부한 영역을 함유한다.

도메인(domain):단백질 분자의 아미노산이 3차원적으로 자기-조립 정렬된 것으로서 특정 생물학적 활성에 필요한 구조적 요소를 함유한다.

생물학적 활성:생물학적 관계(즉, 유기체, 세포 또는 이의 시험관내 부류)에 있어서, 분자에 의해 수행되는 기능 또는 기능의 세트, 단백질의 생물학적 활성은 촉매 활성 및 효과 활성으로 나누어질 수 있다. 피브린 용해제의 촉매 활성은 흔히 전구체의 특정 분해를 통해 다른 단백질의 활성화를 포함한다. 반대로, 효과 활성은 피브린과 같은 분자 또는 세포에 대한 생물학적 활성 분자의 특정 결합을 포함한다. 효과 활성은 종종 증가하거나, 생리학적 조건하에서 촉매적 활성에 대해 필수적이다. 촉매 활성 및 효과 활성은, 몇몇 경우 단백질의 동일 도메인중에 존재할 수 있다. 플라즈미노겐 활성인자에 있어서, 생물학적 활성은 프로-효소 또는 자이모겐 플라즈미노겐을 프라즈민으로 전환시키고 이어서 피브린 매트릭스를 분해하는 것으로 특정지워진다. t-PA에 의한 프라즈미노겐의 활성화에 있어서 피브린이 보조인자로서 작용하기 때문에, 단일쇄 t-PA는 피브린의 부재하에서 활성이 비교적 낮다.

천연 t-PA:사람 흑색종 세포로부터 분리시킨 조직형 플라즈미노겐 활성 인자의 구조 및 생물학적 활성을 갖는 단백질(유럽 특허 제004176 A2호 참고). 천연 t-PA는 흑색종 세포 t-PA의 아미노산 서열을 갖거나 약간 변형된 서열을 함유할 수 있다. 예를 들어 유전자의 다형 현상에 의해 유발되는 것과 같은 변형은, 단백질의 구조 또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않는다. 천연 t-PA는 천연적으로 t-PA를 생산하는 세포로부터 분리할 수 있거나, 천연 t-PA를 암호화하는 DNA 서열로 형질 감염시키거나 형질전환시킨 재조합 세포로부터 제조할 수 있다. 대표적인 천연 t-PA의 아미노산 서열을 제1도에 나타내었다.

t-PA 유사체:상기 정의한 바와 같은 플라즈미노겐 활성인자의 특정적인 생물학적 활성을 가지며, 아미노산 서열내에 인위적으로 유발된 특정 돌연변이가 존재하는 단백질. t-PA 유사체를 암호화하는 DNA 서열은 돌연변이 DNA 서열로 나타내며, 일반적으로 cDNA의 형태로 존재한다. 인위적으로 유도된 특정 돌연변이는 클로닝된 DNA 서열의 조작(manipulation)을 통하여 도입될 수 있는, 아미노산 서열에 있어서의 결실, 삽입 및 치환을 포함한다. 일반적으로, t-PA 유사체의 생물학적 활성은 천연 t-PA의 생물학적 활성으로부터 적당히 변화된다.

상기 언급한 바와 같이, 천연 t-PA는 크링글 도메인으로 공지된 2개의 삼중 디설파이드-결합 영역을 함유하며, 이하 K1 및 K2로 언급한다. 이러한 도메인은 프로트롬빈, 플라즈미노겐, 우로키나아제 및 그밖의 단백질에서 발견되는 유사한 도메인과 상동이며, t-PA가 피브린으로 결합하는 것에 관여한다. K2 도메인은 천연 t-PA에 의해 플라즈미노겐의 활성에 있어서 피브린의 자극 효과를 매개하는 것으로 나타난다. 천연 t-PA의 K1 도메인은 시스테인 잔기의 위치 및 관계에 따라 특징지워질 수 있다. 본 발명의 목적상, 천연 t-PA의 K1은 Cys(92) 내지 Cys(173)의 단백질 부위로서 정의한다. 이 도메인에는 4개의 다른 시스테인 잔기가 포함되며, 6개의 시스테인이 3개의 분자내 디설파이드 결합으로 배열되어 있다. 결합은 시스테인 잔기 92와 173, 113과 155, 및 144와 168을 연결시킨다.

상술한 디설파이드-결합 부위는 플라즈미노겐, 인자 XII 및 프로트롬빈을 포함한 다른 단백질에서 발견되는 크링글 도메인의 특징이다. 시스테인 잔기의 위치는 상당히 보존된다. 또한 매우 유리하게는 천연 t-PA의 잔기 100-102에 상응하는 위치에 서열 Tyr-Arg-Gly, Tyr-Asp-Gly 또는 Tyr-Gln-Gly, 잔기 100에 상응하는 위치에 Gly, 잔기 116에 상응하는 위치에 Trp 잔기 130에 상응하는 위치에 Leu 및 잔기 154에 상응하는 위치에서 Trp가 존재한다. 또한, 천연 t-PA의 상동성 스패닝(spanning) 잔기 142-148의 영역이 있다.

제20도는 우로키나아제, 천연 t-PA, 플라즈미노겐, 인자 XII 및 프로트롬빈의 크링글 도메인간의 상동성을 나타낸다. 특히, 유리하게는 N-말단으로부터 9 내지 11 위치에 Tyr-Arg-Gly, Tyr-Asp-Gly 또는 Tyr-Gln-Gly; N-말단으로부터 19 위치에 Gly 잔기; N-말단으로부터 25위치에 Trp; N-말단으로부터 44 위치 내지 47 위치중 하나의 위치에 Leu; C-말단으로부터 18 위치 또는 19 위치의 Cys에 대해 바로 N-말단에 Trp; C-말단으로부터 29 위치 내지 31 위치의 Cys에 대해 바로 C-말단에 Arg-Asn-Pro-Asp; 및 C-말단으로부터 29 내지 31 위치의 Cys에 대해 바로 N-말단에 Asn-Tyr, Asn-Phe 또는 Ala-Phe이 존재한다.

본 발명자들은 천연 t-PA의 K1 도메인을 다른 단백질로부터 유도된 크링글 도메인으로 교체함으로써, 수득되는 단백질의 피브린 친화성 및 응혈 용해에 대한 특이성이 현저히 증가된다는 것을 발견하였다. 적합한 치환 크링글 도메인에는 플라즈미노겐의 K1, K2, K3, K4 및 K5 도메인, 천연 t-PA의 K2 도메인, 프로트롬빈의 K1 및 K2 도메인, 및 인자 XII의 크링글 도메인이 포함된다. 바람직하게는 플라즈미노겐의 K1, K4 또는 K5 도메인, 특히 바람직하게는 K1 도메인을 사용한다. 플라즈미노겐을 암호화하는 일부 cDNA 서열은 문헌[참조 : Malinowski 등, Biochemistry 23 : 4243, 1984]에 기술되어 있다. 이 서열은 완전한 길이의 클론을 수득하기 위한 탐침으로서 사용될 수 있다. 플라즈미노겐의 크링글 도메인의 아미노산 서열은 문헌[참조 : Sottrup-Jensen 등, Prog. Chem. Fibringlysis Thrombolysis 3 : 191-209, 1978 : Lerch 등, Eur. J. Biochem. 197 : 7-13, 1980 ; 및 DeMarco 등, J. Biol. Chem. 257 : 12716-12721, 1982]에 기술되어 있다. 인자 XII 크링글 도메인의 아미노산 서열은 문헌[참조 : McMullen 및 Fujikawa, J. Biol. Chem. 260 : 5328-5341, 1985]에 기술되어 있다. 여러 가지 크링글 도메인을 암호화하는 DNA 서열은 cDNA의 효소 분해에 의해 수득할 수 있거나, 바람직하게는 공지된 아미노산 또는 DNA 서열을 기준으로한 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 작제될 수 있다. DNA 합성 방법은 당 분야에 널리 공지되어 있다. 또한, 적합한 올리고뉴클레오타이드는 공지된 아미노산 또은 DNA 서열을 기준으로 한 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 작제될 수 있다. DNA 합성 방법은 당분야에 널리 공지되어 있다. 이와는 달리, 적합한 올리고뉴클레오타이드를 시판자로부터 구입할 수 있다.

본 발명에 따라서, 출발물질로서 cDNA 클론 또는 게놈성 클론을 사용한 재조합 기술을 이용하여 이들 신규한 단백질을 제조하는 것이 바람직하다. 적절한 DNA 서열은 또한 표준 방법에 따라 합성될 수 있다. 변형된 t-PA를 생성하기 위한 출발물질로서 천연 t-PA를 암호화하는 전체 길이의 cDNA를 사용함으로써, 천연 t-PA의 모든 엑손(exon)이 존재하고 서로 정확하게 배향되도록 인트론이 제거되므로, cDNA 클론을 사용하는 것이 바람직하다. cDNA는 또한 올리고뉴클레오타이드-지시된 돌연변이유발을 통해서 서열을 결실, 변경 또는 삽입하기 위한 주형으로도 사용될 수 있다.

천연 t-PA 이외에 전술한 것을 포함한 t-PA의 변이체는, 본 발명에 따라 변형된 크링글 도메인을 포함하도록 변형시킬 수 있다. 이런 방법으로, 변형된 크링글 도메인의 장점을 t-PA 변이체의 장점과 조합시켜 특히 유용한 생성물을 수득할 수 있다. 예를들면, 다음 실시예에 상세히 기술된 바와 같이, 플라즈민에 의한 절단에 내성이 있는 t-PA 유사체의 k1 도메인을 변형시켜 응혈-특이성이 높은 플라즈미노겐 활성인자를 생성시킬 수 있다. 플라즈민에 의한 절단에 내성이 있는 t-PA 유사체는 천연 t-PA의 Arg(275)-Ile(276) 절단 부위주위의 아미노산 서열을 변경시킴으로써 생성된다. 이와 같은 변경은 일반적으로 절단 부위의 13개 아미노산 잔기내의 마미노산 치환 및 첨가의 형태이다. 이들 변경중 일부에 의해 트롬빈에 의해 제거될 수 있는 t-PA 유사체가 생성된다. 또한, 본 명세서에 기술된 바와 같이, K1 변형은 핑거 도메인의 변형과 조합되어 특이성이 높은 활성인자를 생성하거나; 변형된 크링글 도메인을 갖는 t-PA 유사체의 성장 인자 도메인을 변형시키거나 결실시켜 혈장 반감기를 증가시킬 수 있다. 성장 인자 도메인의 바람직한 변형은 하나 이상의 시스테인 잔기의 다른 아미노산으로의 대체이다. 또한, 혈장 반감기가 긴 단백질로부터의 성장 인자 도메인으로 천연 t-PA 성장 인자 도메인이 치환될 수 있다. 치환 성장 인자 도메인은 예를 들면 단백질 C, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X로부터 유도될 수 있다. 이러한 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 문헌[참조:예를들면, Hagen et al., EP2000, 421; Fester et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 4673-4677, 1985 ; Kurachi and Pavie, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 6461-6464, 1982 ; 및 Leytus et al., Biochemistry 25 : 5098-5102, 1986]에 기술되어 있다.

기타 바람직한 변형예는 t-PA 유사체의 글리코실화 패턴을 변형시키기 위해 탄수화물 부착 부위를 변형 시키는 것이 포함된다. 천연 t-PA는 다양한 정도로[참조:Pohl et al., Biochemistry 23 : 3701-3707, 1984] 글리코실화되어 단백질의 제조시 이질성을 제공하는 K2 도메인내에서 탄수화물 첨가 부위를 함유한다. 이러한 이질성은 아미노산 서열을 변경시킴으로써, 바람직하게는 183 및 186 위치의 Gly 및 Ser을 각기 Ser 및 Thr로 치환시킴으로써 제거될 수 있다. 이 변형은 보다 균일하고 가용성인 생성물이 제조되도록 한다. 또한 K1 도메인상에서 글리코실화를 차단함으로써, t-PA의 혈장 반감기를 연장시킨다는 것이 밝혀졌다. 이는 바람직하게는 Ser(119)을 Met로 교체시킴으로써 달성된다. 따라서, 본 발명의 t-PA 유사체에 있어서, 유사체의 K1 도메인이 탄수화물 첨가 부위를 함유하는 경우, K1 도메인을 변형시켜 글리코실화를 차단하는 것이 바람직하다.

재조합 DNA 기술은 천연 t-PA의 피브린-결합 도메인의 용이한 증강을 허용한다. 전술한 크링글 치환을 갖는 t-PA 유사체는 추가의 크링글 구조의 삽입, 핑거 도메인의 첨가 또는 핑거 도메인의 치환에 의해 추가로 변형될 수 있다. 이 방법은 천연 t-PA 또는 관련 단백질에서 발견되는 기능적 도메인의 최적 조합을 선택하는 수단을 제공하여, 피브린 결합 및 세린 프로테아제 활성의 특이성에 대한 증진된 생물학적 활성을 지닌 피브린 용해제를 제공한다.

아미노산 치환, 첨가 또는 결실 과정은 클로닝된 t-PA DNA 서열 또는 이의 일부를 주형으로서 사용하여 부위-특이적 돌연변이를 유발시킴으로써 도입된다. 올리고뉴클레오타이드-지시된 시험관내 돌연변이유발에 대한 기술이 일반적으로 당해 분야에 공지되어 있다. 바람직한 방법은 문헌(참조 : Zoller and Smith, DNA 3 : 479-488, 1984)에 기술된 것이다. 이어서 돌연변이된 서열을 t-PA 암호화 서열의 잔여물에 결합시키고 재작제된(돌연변이) 암호화 서열을 그후 발현벡터에 삽입한다. 돌연변이 서열은 다양한 숙주세포(포유동물 세포, 효모 및 기타 진균, 및 세균을 포함)에서 발현될 수 있다.

세균, 효모, 및 포유동물 세포내에서 재조합 t-PA를 제조하는 것은 문헌[참조예:Goeddel et al.(EP93619 A1), Meyhack and Hinnen(EP 143,081 A2), 및 Gill(EP 174,835 A1)]에 기술되어 있다. 외래 DNA를 사용한 포유동물 세포의 형질감염 방법, 및 세균 및 진균의 형질전환 방법이 당해 분야에 공지되어 있다. 적합한 발현 벡터는 숙주세포에서 외래 유전자의 전사를 지시할 수 있는 프로모터 및 작용성 전사 말단 부위를 함유할 수 있다. 경우에 따라, 발현 벡터는 복제기원뿐 아니라, 발현 수준을 조절하고/하거나 증진시키는 서열을 선택된 숙주세포에 따라 추가로 함유하는 것이 바람직하다. 적합한 발현 벡터는 플라즈미드, RNA 및 DNA 바이러스 또는 세포성 DNA 서열로부터 유도되거나, 각각의 성분을 함유할 수 있다.

본 발명을 수행하는데 사용하기에 바람직한 원핵 숙주는 바실러스(Bacillus) 및 다른 속의 생물체도 유용하지만, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 균주가 유용하다. 이러한 숙주를 형질전환시키고, 외래 DNA서열을 발현시키는 방법은 본 분야에 공지되어 있다[참조 : Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboratory Manual, COld Spring Harbor Laboratory, 1982]. 세균 숙주에서 외래 DNA를 발현시키기 위해 사용되는 벡터는 일반적으로 항생제 내성에 대한 유전자와 같은 선별 표지물, 및 숙주 세포에서 기능하는 프로모터를 함유한다. 적합한 프로모터는 trp[참조 : Nichols 및 Yanofsky Meth, in Enzymology 101 : 155, 1983], lac[참조 : Casadaban et al., J. Bact. 143 : 971-980, 1980], TAC[참조 : Russell et al., Gene 20 : 231-243, 1982], 및 파아지 λ 프로모터 시스템을 포함한다. 세균을 형질전환시키는데 유용한 플라즈미드는 pBR322[참조 : Bolivar et al., Gene 2 : 95-110, 1977], pUC 플라즈미드[참조 : Messing Meth, in Enzymology 101 : 20-77, 1983 ; 및 Vieira 및 Messing, Gene 10 : 259-268, 1982], pCQV2[참조 : Queen, J. Mol. Appl. Conot. 2 : 1-10, 1983], 및 이의 유도체를 포함한다.

효모 사카로마이세스 세레비지에(Saccharomyces cerevisiae), 또는 아스퍼질러스(Aspergillus)를 포함하는 사상균과 같은 진핵 미생물도 또한 숙주 세포로서 사용할 수 있다. 특히 바람직한 아스퍼질러스종은 에이, 니둘란스(A. nidulans), 에이, 니거(A. niger), 에이. 오라자에(A. oryzae) 및 에이, 테레우스(A. terreus)를 포함한다. 효모를 형질전환시키는 방법은 문헌[참조 : Beggs, Nature 275 : 104-108, 1978]에 기술되어 있다. 아스퍼질러스종은 옐톤(Yelton) 등의 문헌[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 1740-2747, 1984]에 공지된 방법에 따라 형질전환시킬 수 있다. 효모에 사용하기 위한 발현 벡터는 YRp7[참조 : Struhl et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76 : 1035-1039, 1979], YEp13[참조 : Broach et al., Gene 8 : 121-133, 1979], pJDB248 및 pJDB219(Beggs, 상기 참조), 및 이의 유도체를 포함한다. 이러한 벡터는 일반적으로 trp1 돌연변이를 수반하는 균주에서 선별을 가능케 하는 영양 포지물 TRP I와 같은 선별 표지물을 포함한다. 효모 발현 벡터에 사용하기에 바람직한 프로모터는 효모 해당 유전자[참조 : Hitzemen et al., J. Biol. Chem. 255 : 12073-12080, 1980 ; Alber 및 Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1 : 419-434, 1982 ; Kawasaki, 미합중국 특허 제4,599,311호] 또는 알코올 탈수소효소 유전자[참조 : Young et al., Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., eds., p.335, Plenum, New York, 1982; 및 Ammoror, Meth. in Enzymology 101 : 192-201, 1983]로부터의 프로모터를 포함한다. 효모를 형질전환시켜 생성된 변형된 t-PA 단백질의 정제를 용이하게 하고, 적절한 디설파이드 결합을 형성하기 위해서, 선택된 단백질을 암호화하는 효모 유전자로부터의 시그날 서열로 t-PA 프리프로 서열을 치환시킬 수 있다. 특히 바람직한 시그날 서열은 MFα1 유전자의 프리프로 영역이다[참조 : Kurjan 및 Herskowitz, Cell 30 : 933-943, 1982 ; 및 Singh(Ep 123, 544)]

보다 고등한 진핵 세포도 본 발명을 수행하기 위한 숙주 세포로서 또한 제공될 수 있다. 배양된 포유동물 세포(예 : BHK, CHO, Ns-1, SP2/0 및 J558L 세포주)가 바람직하다. 예를들면, 이들 세포주는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에서 수득할 수 있다. 특히 바람직한 유착성 세포주는 BHK 세포주 tK^-ts13[참조 : Waechter 및 Baserga, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 1106-1110, 1982]인데, 이후에서는 tk^--BHK 세포라 언급한다. 포유동물 세포에서 사용하기 위한 발현벡터는 포유동물 세포내로 도입된 외래 유전자의 전사를 지시할 수 있는 프로모터를 포함한다. 특히 바람직한 프로모터에는 SV40 프로모터[참조 : Sudramani et al., Mol. Cell Biol. 1 : 854-64, 1981], MT-I 프로모터[참조 : Palmiter et al, Science 222 : 809-814, 1983], 및 마우스 카파 유전자 프로모터[참조 : Bergman et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 : 7041-7045, 1984]가 포함된다. 또한 발현벡터는 발현될 DNA 서열에 대한 삽입 부위의 하부에 위치하는 전사 터미네이터를 포함한다. 바람직한 터미네이터는 사람 성장 호르몬(hGH) 유전자 터미네이터[참조 : DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9 : 3719-3730, 1981]이다. 또한, 벡터는 특정 숙주 세포주에 대해 적절한 인헨서(enhancer) 서열을 함유하는 것이 바람직하다.

배양된 포유동물 세포에서 돌연변이 t-PA를 발현시키기 위해, 클로닝 t-PA 서열을 함유하는 발현 베턱를 인산칼슘-중재된 형질감염 방법[참조 : Graham 및 Van der Eb, Virology 52 : 456-467, 1973 ; 변형법 : Wigler et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 : 3567-3570, 1980 ; Leyter et al, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 422, 1982] 또는 전기 천공방법[참조 : Neumann et al., EMBO J. 1 : 841-845, 1982]과 같은 형질 전환 기술 세포에 도입한다. 세포의 소분획이 숙주세포의 게놈으로 DNA를 통합시키거나 비염색체성 핵 구조물내에서 DNA를 유지시킨다. 이러한 형질감염체는 선별가능한 표현형(선별성 표지물)을 제공하는 유전자를 사용한 동시형질감염으로 확인할 수 있다. 바람직한 선별 마커는 뉴클레오타이드 합성억제제인, 메토트렉세이트(MTX)에 대해 세포 내성을 부여하는 DHFR 유전자, 또는 단백질 합성 억제제인 약제 G-418에 대해 내성을 제공하는 세균성 네오마이신 내성 유전자를 포함한다. 숙주세포가 DNA를 취하면, 약물 내성이 생겨, 약물에 대한 내성을 부여하기에 충분하게 높은 수준의 선별성 표지물을 발현시키는 세포 집단이 선별된다. 선별성 표지물은 사용된 형질감염 방법에 따라서 t-PA 유사체를 암화화시키는 서열과 동일한 벡터 상에서 존재하거나 분리된 벡터 상에서 존재할 수 있다.

본 발명의 t-PA 유사체는 혈전증 치료시 약제학적 조성물내에 사용할 수 있다. 약제학적 조성물은 멸균수 또는 멸균 염수와 같은 희석제 또는 담체와 혼합된 t-PA 유사체를 포함하고, 또한 적절한 부형제 및/또는 용매를 포함할 수 있다. 생성된 수용액은 사용하기 위해 포장되거나 무균 조건하에서 여과 및 동결건조시킬 수 있는데, 동결건조시킨 제제는 투여전 멸균 수용액과 혼합된다.

전형적으로, 만니톨 3g 및 t-PA 유사체 10⁶단위를 함유하는 수용액을 멸균 조건하에서 제조한다. 이 용액 분취량 1ml을 작은 바이알에 피펫으로 옮기고, 동결건조시킨 후 밀봉한다. 주입시, 동결건조시킨 물질을 멸균수 2ml와 혼합하는데, 물은 밀봉한 앰플내에 제공한다. 투여는 주사로 수행하는 것이 바람직하다. 본 발명의 단백질은 일반적으로 환자의 체중 및 용해될 혈전의 특성에 따라, 환자당 약 6 내지 약 30mg 용량으로 투여한다. 그러나, 본 발명은 상기 범위로 제한되는 것이 아니며, 용량은 조건에 따라 변할 수 있다. 적절한 용량은 숙련된 전문가에 의해 명백하게 결정될 것이다.

실시예

실시예 1

완전한 길이의 t-PA 클론의 작제

사람의 천연 t-PA cDNA 클론의 서열은 보고되어 있다[참조 : Pennica 등, Nature 301 : 214-221, 1983)]. 이 서열은 32 내지 35개의 아미노산으로 이루어진 프리-프로 펩타이드에 이어서 527 내지 530개 아미노산의 성숙 단백질을 암호화한다.

성숙한 t-PA에 대한 암호화 서열을 포함하는 cDNA 클론은, 출발 물질로서 보웨스(Bowes) 흑색종 세포주로부터의 mRNA를 사용하여 제조한다[참조 : Rijken 및 Collen, J. Biol. Chem. 256 : 7035-7041, 1981)]. 다음 이 cDNA는 플라즈미드 pDR1296을 작제하는데 사용된다. pDR1296으로 형질전환된 에스케리키아 콜라이 균주 JM83은 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션(American Type Culture Collection)에 기탁번호 제 53347호로 기탁되어 있다.

프리-프로 서열이 cDNA 클론 pDR1296내에 존재하지 않으므로, 이것을 합성 올리고뉴클레오타이드로부터 작제하여 cDNA에 결합시킨다. 합성 t-PA 프리-프로 서열에서, BamHT 및 Nco I에 대한 절단 부위는 프리-프로 서열의 첫번째 코돈(ATG)의 5'에 인접하게 도입시키고, BglII(Sau3A, XhoII) 부위는 프리-프로 서열의 3'말단에서 유지시킨다. 천연의 프리-프로 서열은 중간 부위 근처에 용이한 제한 부위가 결여되어 있다; 그러나 서열 GGAGCA(아미노산-20 내지 19번 위치의 Gly-Ala을 암호화함)는 아미노산 서열의 변화없이 Nar I 부위를 제공하기 위해 GGCGCC로 변경시킬 수 있다.

프리-프로 서열을 작제하기 위해서, 어플라이드 바이오시스템스 모델 380-A DNA 합성기를 사용하여 하기의 올리고뉴클레오타이드를 합성한다.

ZC131:5' GGA TCC ATG GAT GCA ATG AAG AGA GGG CTC TGC GTG 3'

ZC132:5' TCC CCC CAC ACA CCA GCA GCA CAC AGG AGAG 3'

ZC133:5' GGC GCC GTC TTC GTT TCG CCC AGC CAG GAA ATC CATG 3'

ZC134:5' AGA TCT GGC TCC TCT TCT GAA TCG GGC ATG GAT TTC CT 3'

정제한후, 올리고머 ZC131과 ZC132를 어닐링시켜 12개 염기쌍의 오버랩을 제조한다(단편 1). 올리고머 ZC133과 ZC134를 유사하게 어닐링시킨다(단편 2). 이 올리고머를 Pol I 완충액(Bethesda Research Labs) 중에서 혼합하고, 5분 동안 65℃로 가열한 후, 4시간 동안 실온으로 서서히 냉각하여 어닐링시킨다. 10단위의 DNA 폴리머라제 I을 가하고 반응을 실온에서 2시간 동안 진행시킨다. 혼합물을 8%의 폴리아크릴아미드-우레아 서열분석 겔상에서 1000V로

시간 동안 전기영동하여 반응물을 크기별로 분류한다. 정확한 크기의 단편(폴리머라제 반응이 완결된 것중의 것)을 겔로부터 절단하여 추출한다.

어닐링시킨 후, 단편 1을 BamH I과 Nar I로 절단하고 BamH I+Nar I-절단 pUC8[참조 : Vieira 및 Messing, Gene 19 : 259-268, 1982 ; 및 Messing, Meth in Enzymology 101 : 20-77, 1983]을 클로닝한다. 단편 2를 재어닐링하여 Nar I 과 BalII로 전단하고 BamH I+Nar I-절단 pUC8내로 클로닝한다. 콜로니를 적절히 표지한 올리고뉴클레오타이드로 스크리닝한다. 콜로니 하이브리드화에 의해 양성으로 나타난 플라즈미드를 서열분석하여 올바른 서열이 클론되었음을 확인한다.

다음, 단편 1을 적절한 pUC 클론의 BamH I+Nar I 이중 분해로부터 정제한다. 단편 2를 Nar I + Xho II 분해로부터 정제한다. 두 단판을 Nar I 위치에서 결합시켜 BamH I-절단 pUC8내로 클로닝한다.

다음, pDR1296의 t-PA 서열을 하기 방법으로 합성된 프리-프로 서열에 결합시킨다(제2도).

프라즈미드 pIC19R[참조 : Marsh et al., Gene 32 : 481-486, 1984]을 Sma I과 HindIII로 분해한다. 지도(map) 위치 270(PvuII)에서 위치 5171(HindIII)까지의 SV40의 오리(Ori)-영역을 선형화된 pIC19R에 연결시켜 플라즈미드 Zem67을 제조한다. 다음, 이 플라즈미드를 Bg1II로 절단하고 사람 성장 호르몬 유전자로부터의 터미네이터 영역을[참조 : De Noto et al., Nuc. Acids Res. 9 : 3719-3730, 1981] Bg1II-BamIII 단편으로서 삽입하여 플라즈미드 Zem86을 제조한다. 합성된 t-PA 프리-프로 서열을 pUC8 벡터로부터 BamH I과 Xho II로 분해하여 꺼낸다. 이 단편을 Bg1II-분해된 Zem86으로 삽입시켜 플라즈미드 Zem88을 제조한다. 플라즈미드 pDR296을 Bg1II와 BamH I으로 분해하고 t-PA cDNA 단편을 분리하여 BglII-절단 Zem88내로 삽입한다. 생성된 플라즈미드를 Zem94라 명명한다.

MT-1 프로모터, 완전한 t-PA 암호화 서열 및 hGH 터미네이터를 함유하는 벡터 Zem99을 하기 방법에 따라 조립한다(제2도).

MT-1 프로모터를 함유하는 Kpn I-BamH I 단편을 MThGH111[참조:Palmiter et al., Science 222 : 809-814, 1983]로부터 분리하고 pUC18내로 삽입하여 Zem93을 작제한다. 프라즈미드 MThGH112[참조 : Palmiter et al., 상기 참조]를 BglII로 분해하고 재연결시켜 hGH 암호화 서열을 제거한다. 다음, MT-1 프로모터와 hGH 터미네이터를 EcoR I 단편으로서 분리시키고 pUC13내에 삽입하여 Zem4를 작제한다. 다음, Zem93을 BamIII 및 Sal I으로 분해하여 선형화한다. Zem4를 BglII 및 Sal I으로 분해하고 hGH 터미네이터를 정제한다. t-PA 프레-프로 서열을 pUC8 벡터로부터 BamH I-Xho II 단편으로서 떼어낸다. 다음, 세 개의 DNA 단편을 결합시키고 Zem97 구조를 갖는 플라즈미드(제2도)를 선택한다. Zem97을 BglII로 절단하고 Zem94로부터 Xho II t-PA 단편을 삽입한다. 생성된 벡터는 Zem99이다.

실시예 2

플라즈미노겐의 K1 도메인을 암호화하는 DNA 서열의 작제

플라즈미드 pK1은 제3도에 나타낸 플라즈미노겐 K1 도메인의 암호화 서열을 함유한다. 이는 표 1에 나타낸 서열과 같이 PK1-1, PK1-2, PK1-3…PK1-12로 지정된 일련의 11개의 올리고뉴클레노타이드로부터 작제된다.

플라즈미노겐 K1 도메인의 뉴클레오타이드 1 내지 182에 대한 암호화 서열은 하기의 방법으로 올리고뉴클레오타이드 PK 1-1 내지 PK 1-7로부터 작제된다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 PK 1-1, PK1-2, PK1-3 및 PK 1-4 100 피코몰을 5'말단부에서 인산화시킨다. 인산화된 올리고뉴클레오타이드를 각각의 PK 1-5, PK 1-6 및 PK 1-7 100 피코몰과 혼합한다. 혼합물을 에탄올로 침전시키고 이 침전물을 HO중에 재현탁하고 90℃ 에서 30분 동안 가열한다. 용액을 실온에서 10분간 정치시킨 다음 빙상에 놓아 둔다. 급냉된 혼합물에 6.6mM MgCl, 0.1M 디티오트레이톨 10㎕, 5mM ATP 10㎕ 및 T리가제 1000 단위를 함유한 660mM 트리스 HCl(pH 7.6) 10㎕를 가한다. 이 혼합물을 14℃에서 15시간 동안 항온처리한다. 에탄올을 가하고 침전물을 TE 완충액(10mM 트리스·HCl, 1mm EDTA, pH 8.0) 20㎕ 중에 재현탁한 다음, 알칼리 로딩 완충액(20mM NaCl, 2mM EDTA, 80% 포름아미드, 0.1% 크실렌 시아놀 및 0.1% 브롬페놀 블루) 등용적을 가한다. 이 혼합물을 90℃에서 3분간 가열하고, 0.4M 우레아를 함유하는 6% 폴리아크릴아미드 겔 상에서 300볼트에서 1시간 동안 전기영동시킨다. 겔을 에티튬 브로마이드로 염색시키고, DEAE-셀룰로오즈 페이퍼로의 전기영동적 이동에 의해 250bp 밴드를 회수한다[참조 : Dretzen et al., Anal. Biochem 112 : 295 내지 198, 1981]. 회수된 DNA를 TE 완충액 100㎕중에 용해하며 이 단편을 PK 1-n이라 지정한다. PK 1-n을 PK 1-n 용액 10㎕를 pH 7.6 100mM 나트륨 카코딜레이트-25mM HEPES 2㎕, 1mM dCTP 6.2㎕, 말단 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제 10단위 및 HO 5㎕와 혼합함으로써 3'말단부를 C-테일링시킨다. 반응 혼합물을 37℃에서 10분간 항온처리한 다음 페놀:클로로포롬(1:1)로 추출한다.

3'-올리고(dG) 테일링된 pUC9(Pharmacia로부터 입수됨) 1㎕를 Sma I으로 절단한다. 선형의 테일링된 플라즈미드를 C-테일링된 PK 1-n에 가한다. 이 혼합물을 에탄올로 침전시킨 다음, DNA를 2M KCl 0.5μl 및 TE 완충액 9.5㎕ 중에 재현탁하고, 65℃에서 10분간 항온처리한 다음, 실온으로 냉각한다. 냉각된 혼합물에 0.1M MgCl및 0.1M 디티오트레이톨을 함유하는 pH 7.5인 0.2M 트리스 HCl 5μ, 2.5mM dNTP 20㎕, 5mM ATP 10㎕, HO 53㎕, DNA 폴리머라제 1(클레나오 단편) 5단위, 및 TDNA 리가제 300단위(최종 용적 100㎕)에 가한다. 이 혼합물을 14℃에서 12시간 동안 항온처리한 다음 이.콜라이 JM83을 형질감염 시키는데 사용한다. 형질감염된 JM83 세포를 윌레스(Wallace) 등의 방법을 이용하여 PK 1-6으로 탐침한다[참조 : Nuc, Acids Res 9 : 879 내지 894, 1981]. 20개의 양성 클론을 서열화하고 염기쌍 1 내지 170개를 포함하는 #1-3, 염기쌍 68 내지 186을 포함하는 #8-5를 선별한다(제4도 참조).

제5도에 나타난 바와 같이, 클론 #1-3을 EcoR I 및 Fok I으로 분해하고, Kpn I 부위를 함유하는 130bp 단편을 회수한다. 유사하게, 클론 #8-5를 Fok I 및 HindIII으로 분해하고, 90bp 단편을 회수한다. 두개의 단편을 EcoR I, HindIII으로 분해된 pUC12에 결합시키고, 생성된 플라즈미드는 pPKA라 지정한다. 상기 플라즈미드는 플라즈미노겐 K1 서열의 뉴클레오타이드 1 내지 182에 상응하는 DNA 서열을 함유한다.

K1 서열의 나머지는 올리고뉴클레오타이드 PK 1-9, PK 1-10, PK 1-11 및 PK 1-12를 사용하여 작제한다. 각각의 올리고뉴클레오타이드 1pmol을 5'말단에서 인산화시키고, 합한 올리고뉴클레오타이드를 BamH I, Sph I-1으로 분해된 M13tg130RF(Amersham으로부터 입수함) 40ng과 혼합한다. 상기 혼합물에 66mM MgCl를 함유하는 pH 7.6의 660mM 트리스 HCl 4㎕ 및 HO 22㎕를 가한다. 이 용액을 90℃에서 3분간 가열하고, 1시간에 걸쳐 실온으로 냉각시킨다. 0.1M 디티오트레이톨 4㎕, 5mM ATP 4㎕ 및TDNA 리가제 300단위를 가하고, 혼합물을 14℃에서 12시간 동안 항온처리한다. M13PKB RF(제6도)로 지명되는, 생성된 파아지 클론은 K1 서열의 183 내지 250의 뉴클레오타이드를 함유한다.

완전한 K1 암호 서열의 조립이 제6도에 제시되어 있다. 플라즈미드 pPKA를 Mlu I 및 Sau3AI으로 분해하고, 176bp 단편을 회수한다. M13PKB RF를 Sau3AI 및 EcoR I으로 분해하고, 88bp 단편을 회수한다. 이들 단편을 Mlu I, EcoR I으로 분해된 M13um 20RF(IBI로부터 수득함)에 결합시키며, 생성된 플라즈미드는 M13um20-PK1이라 지명한다.

그 다음에 PK1 암호화 서열을 t-PA 크링글 1 서열의 대체물로서 t-PA cDNA내에 삽입시킨다(제7도 및 제8도).

먼저 t-PA 서열을 돌연변이시켜 Mlu I 및 EcoRV 부위를 삽입시킨다. 플라즈미드 pDR1496을 Sph I 및 Xba I로 분해하고, 알파 인자 및 t-PA 서열을 함유하는 2.1kb 단편을 분리한다[참조:pDR1496으로 형질 전환된 에스.세레비지애 균주 E8-11c는 아메리칸 타입 컬쳐 컬렉션에 기탁번호 제20728호로 기탁되었다]. 이 단편을 Sph I, Xba I로 분해된 M13tg130(RF)에 결합시키며, 생성된 파아지는 M13tg130-W로 지명한다. 그 다음 단일쇄 파아지 DNA를 올리고뉴클레오타이드(GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC)에 어닐링시키고, 표준방법에 따라 돌연변이를 유발시킨다. 돌연변이된 파아지는 M13tg130-PKA1로 지명한다. M13tg130-PKA1의 단일쇄 DNA를 분리하고, 서열CTC AGA GCA TTC CAG GAT ATC GCA GAA CTC를 갖는 올리고뉴클레오타이드로 돌연변이시킨다. 크링글 1 암호화 서열의 5'말단에 Mlu I 부위 및 3'말단에 EcoRV 부위를 함유하는 클론을 선별하여 M13tg130-PKA2로 지명한다(제7도).

M13tg130-PKA2로부터 복제형 DNA를 제조한 후, BglII 및 Apa I로 분해한다. Mlu I 및 EcoRV 부위를 함유하는 단편을 회수하고, 제7도에 제시된 바와 같이, BglII, Apa I로 분해된 Zem99에 결합시킨다. 생성된 플라즈미드를 Zem99-2020이라 명명한다.

그 다음에 PK1 서열을 t-PA cDNA에 삽입시킨다. M13um20-PK1 RF를 Mlu I 및 EcoRV로 분해하고, 336bp 단편을 회수한다. 이 단편을 Mlu I, EcoRV로 분해된 Zem99-2020에 결합시켜 Zem99-8000을 작제한다(제8도). Zem99-8000의 돌연변이체 t-PA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열이 제9도에 제시되어 있다. Zem99-8000으로 형질전환된 이.콜라이(E. coli)는 기탁기관[the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan(FRI)]에 기탁번호 제P-9272호로 기탁되어 있다.

플라즈미드 Zem99-8000 및 pSV2-dhfr[참조:Subramani et al., 상기 참조]을 사용하여 로이터(Loyter)방법[참조 : Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79 : 422, 1982]에 의해 tkBHK 세포를 공동형질감염시킨다. 형질감염주를 한정된 희석 방법에 의해 클론화한다. #8000으로 지명된, 돌연변이체 t-PA 단백질은 천연 t-PA에 대한 항체를 함유하는 칼럼상에서 친화-정제된다.

실시예 3

#8100의 제조

96위치에서 Asn을 암호화하는 제2플라즈미노겐 K1 서열을 작제한다(제8도). Zem99-8000을 BamH I으로 분해하고, BglII 부위를 함유하는 단편을 회수한다. 이 단편을 BamH I-절단 M13mp18에 결합시켜 M13-8000R을 작제한다. 올리고뉴클레오타이드 프라이머(서열TTT TTA CCA TTA CCG GTC TT)을 단일쇄 M13-8000R에 어닐링시키고, 일상적인 방법에 따라 돌연변이 유발시킨다. 클론을 스크리닝하여 서열분석하고, M13-8000RF로 지명하는 이쇄 DNA를 양성 클론으로부터 제조한다. 이 파아지를 BglII 및 Apa I으로 분해하고, t-PA 단편을 분리한 다음 BglII, Apa I-절단 Zem99에 결합시킨다. 생성된 플라즈미드는 Zem99-8100으로 지명한다. t-PA 암호화 서열이 Zem99-8100에 존재하며 암호화된 아미노산 서열은 제10도에 나타나 있다. Zem99-8100으로 형질전환시킨 이.콜라이 RR1은 기탁기관[Fermentation Research Institute]에 기탁번호 제FERM P-9315호로 기탁되어 있다.

8100 돌연변이체 단백질을 발현시키기 위해, Zem99-8100 및 pSV2-dhfr을 로이터 방법(상기 참조)에 의해 tkBHK 세포를 동시 형질감염시키는데 사용한다. 형질감염주는 한정된 희석 방법에 의해 클론화된다. 단백질을 상술한 바와 같이 언급한 대로 친화성-정제한다.

실시예 4

플라즈민에 의한 절단에 내성이 있는 t-PA 유사체내 K1 도메인의 치환

A : 돌연변이유발

절단 부위의 부위-특이적 돌연변이유발을 위해, bp802로부터 bp1274까지의 t-PA 서열을 함유하는 472bp의 EcoR I 단편을 Zem99로부터 분리하고 M13mp18의 EcoR I 부위내로 클로닝시킨다(복제 형태). 재조합체 파아지를 이.콜라이(JM101)내에 형질감염시키고, 안티-센스쇄의 DNA를 분리시킨다.

부위 특이적 돌연변이유발은 표 2에 나타낸 돌연변이 유발성 프라이머 및 제2의 프라이머로서 ZC85(TCC CAG TCA CGA CGT)중 하나를 사용하여 단일쇄 안티-센스 주형 DNA 상에서 수행한다. 올리고뉴클레오타이드 ZC487, 488, 489 및 620은 274 위치의 Phe를 각각, Glu, Gly, Arg 또는 Pro로 변화시킨다. 올리고뉴클레오타이드 ZC797, 874, 1013 및 1027은 275위치의 Arg를 각각 Gly, Leu, Pro 또는 Asp로 변화시킨다. 올리고뉴클레오타이드 621은 277위치에서 Lys 대신에 Leu이 도입시킨다. 올리고뉴클레오타이드 928에서는 276위치의 Ile를 Pro로 변화시킨다. 이미 Lys(277)이 Leu로 전환된 돌연변이체에 있어서, 올리고뉴클레오타이드 875는 Arg(275)를 Leu로 변화시키고 올리고뉴클레오타이드 927은 Phe(274)를 Pro로 변화시킨다. 따라서, 올리고뉴클레오타이드 875 및 927은 이중 돌연변이를 유발시키는데 이용할 수 있다. 인산화된 돌연변이유발성 프라이머 20pM 및 제2프라이머 20pM을 20mM 트리스(pH 7.5), 10mM MgCl, 50mM NaCl, 1mM DTT의 10㎕중의 단일쇄 주형 1pM과 합하고 65℃에서 10분 동안 항온처리한 다음, 실온에서 5분 동안 항온처리하며, 빙상에 방치한다. 1mM Mgcl, 2mM ATP, 10mM DTT의 10㎕를 어닐링된 DNA에 가하고, 이 혼합물을 15℃에서 3시간동안 항온처리한다. 그후 DNA를 컴피턴트 이.콜라이 JM101내로 형질감염시키고, 세포를 YT 한천상에 도말한 다음 37℃에서 항온처리한다. 그후 DNA를 니트로셀룰로우즈에 이동시키고 돌연변이유발성 프라이머의 T-4℃에서 1시간 동안 6×SSC, 10x 덴하르츠(Denhardt)중에서 예비 하이브리드화하고, 동일한 용액중에서 T-4℃에서P-표지된 돌연변이유발성 프라이머에 하이브리드화시킨다. T-4℃에서 3회 세척후에, 필터를 밤새 X-선 필름에 노출시킨다. 추가의 세척 단계를 경우에 따라 5℃에서 온도를 증가시키면서 수행하여 돌연변이 플라크를 동정한다. 돌연변이된 삽입물을 디데옥시 방법으로 서열분석한다.

B : 벡터작제

변경된 서열에 대한 발현 벡터를 작제한다(제11도). 플라즈미드 Zem86(실시예 1에서 기술됨)을 HindIII로 분해하고 말단을 DNA 폴리머라제 I(클레나우 단편)을 사용하여 채운다. 그후 선형화된 DNA를 EcoR I으로 분해하고:SV40ori 서열을 갖는 350bp 단편을 겔-정제하여 Sma I+EcoR I-분해된 pUC13에 연결한다. 생성된 벡터를 pDR3001이라 지명한다. 플라스미드 pDR3001을 Sal I 및 EcoR I으로 분해하고 SV40ori 및 폴리링커 서열을 갖는 350bp 단편을 겔-정제한다. Zem86을 EcoR I으로 부분적으로 분해하고 Xho I으로 완전히 분해하여 SV40ori 서열을 제거한다. pDR3001로부터의 SV40 단편을 선형화된 Zem86에 연결한다. 생성된 플라즈미드를 pDR3002로 지명한다(제11도).

Zem94중 t-PA 서열의 ATG 개시 코돈의 상부 서열을 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 변형시켜 ATG에 인접한 HindIII 및 BamH I 부위를 위치시킨다. 생성된 뉴클레오타이드 서열은-3 위치에 아데닌을 함유한다. 폴리링커, 프리-프로 및 성숙한 t-PA 서열의 일부를 함유한 Zem94로부터 800bp HindIII-EcoR

I 단편을 M13mp19에 삽입시킴으로써 단일쇄 M13 주형 DNA를 제조한다. 부위-특이적 돌연변이 유발은, 돌연변이유발성 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 ZC444(^5'CAT CCA TGG TGG ATC CAA GCT TGG C^3')를 사용하여 문헌[참조:Zollr et al., , Cold Spring Harbor Laboratory, 1983]에 기술된 바에 따라 수행한다. 올리고뉴클레오타이드 ZC87(^5'TCC CAG TCA CGA CGT^3')를 제2프라이머로서 사용한다. 디데옥시 방법에 따라 돌연변이된 삽입물을 서열분석하고, 폴리링커의 서열이 결실되고 프리-프로 서열의 5'말단의 BamH I 부위가 복원된 클론을 선별한다. 이 파아지 클론을 BamH I 및 EcoR I으로 분해한 후, 5' t-PA 서열을 분리한다. Zem99를 EcoR I으로 분해한 후, t-PA 서열의 3'부분 및 hGH 터미네이터를 함유하는 단편을 분리한다. 두개의 단편을 BamH I+EcoR I에 의해 분해된 pIC19H[참조:Marsh et al., Gene32 : 481-486, 1984]와 함께 3부분 결합으로 연결시킨다. 적절한 배향으로 t-PA 단편을 하뮤하는 플라즈미드를 선별하여 Zem182로 칭한다. 플라즈미드 Zem182를 EcoR I으로 부분 분해시키고 말단부분을 DNA 폴리머라제 I(클레나우 단편)를 사용하여 채운다. 선형화된 플라즈미드를 겔-정제하고 T₄DNA 리가제를 사용하여 재환형화시킨다. hGH 터미네이터의 3' 말단의 EcoR I 부위가 파괴된 플라즈미드를 선별하여 Zem182b라 지명한다(제12도).

실시예 4A에 기술된 돌연변이된 파아지로부터 복제 형태(RF)의 DNA를 제조하고, 변형된 t-PA 서열을 EcoR I 단편으로 정제한다. EcoR I으로 플라즈미드 Zem182b를 분해하고, t-PA 암호화 서열의 5' 및 3'부분을 함유하는 벡터 서열을 송아지의 알칼리성 장 포스파타제로 분해하여, 변형된 t-PA 서열을 삽입한다. 생성된 플라즈미드를 BamH I 및 Xba I으로 분해시킨 후, t-PA 단편을 BamH I+Xbal-절단된 pDR3002에 삽입시킨다. 생성된 벡터들을 pMH7에서 pMH20으로 칭한다(표 3 및 제11도).

pMH10, pMH13 및 pMH17의 활성화 부위 돌연변이체를 실시예 3에 기술된 8100 돌연변이체와 조합하여 실질적으로 응혈 결합 및 용해 특이성이 증가된 t-PA 유사체를 제조한다. 이러한 유사체에 대한 암호화 서열을 함유한 벡터는, BamH I, Xba I-분해된 Zem219b으로부터의 벡터 단편, Zem99-8100으로부터의 BamH I-Apa I 크링글 단편 및 적절한 pMH 벡터로부터의 Apa I, Xba I 활성화 부위단편을 3부분의 결합을 통해 연결시켜 작제한다. 생성된 플라즈미드를 사용하여 전기천공법으로써 tkBHK 세포를 형질감염시킨다. 선별 및 규모 확장후, 돌연변이체 단백질을 정제 및 특성화한다.

실시예 5

K1 도메인 및 핑거 도메인이 치환된 t-PA 유사체

t-PA 핑거 도메인을 컨센서스 핑거 영역으로 대체시켜 Arg-27 및 Lys-49에서 잠점적인 단백질 분해 부위를 제거시킨다. 피브로넥틴 및 t-PA의 핑거 도메인의 분석을 기준하여, 8개의 핑거 대체 서열을 작제한다. 이러한 컨센서스핑거 도메인의 아미노산 서열은 제19도 및 표4에 나타나 있다.

후술하는 바와 같이 올리고뉴클레오타이드로부터 컨센서스 핑거 서열을 작제한 후, t-PA 암호화 서열에 삽입시킨다. 이러한 삽입을 용이하게 하기 위해, 야생형의 핑거 도메인을 암호화하는 영역의 하부(3')에 Kpn I 부위를 도입하다. 생성된 서열을 BglII 및 Kpn I으로 분해하여 핑거 도메인을 결실시킨다.

A. 핑거 도메인과 성장인자 도메인 사이에 Kpn I 부위의 삽입

t-PA의 핑거 도메인 뒤에 Kpn I 부위를 설정하기 위해, 올리고뉴클레오타이드 ZC986(TTT GAC ACG TAC CGA GTG GCA)을 사용하여 돌연변이 유발을 수행한다. 천연 t-PA cDNA의 5' BamH I-EcoR I 단편을 함유한 파아지 M13 클론의 DNA를 제조한다. 100㎕의 DNA 용액을 사용하여 0.1㎕/ml의 우리딘으로 보충시킨 YT 배지 100㎕ 중에서 이.콜라이 RZ1032를 감염시킨다. 이 배양물을 격렬히 진탕하면서, 밤새 37℃에서 배양한다. RZ1032에서 성장한 M13은 RZ1032에서 생육할 수 있으나 JM101에서는 생육할 수 없는 우리딘 함유 파아지를 생산한다.

세포를 원심분리하고 파아지 상등액을 사용하여 이.콜라이; RZ1032를 재감염시킨다. 우라실을 함유치 않은 JM101-유도된 파아지를 희석하기 위해 상기의 방법을 다시 수행한다. 다시, 세포를 원심분리한 후, 파아지를 JM101 및 RZ1032에 도말한다. RZ1032 평판에서는 정상적인 생존이 관찰되었으나(10pfu/ml의 파아지), JM101 세포에서는 어떠한 감염도 관찰되지 않았다. 돌연변이 유발성 올리고뉴클레오타이드로 프라이밍된 상보쇄를 실험관 내에서 제조한다. 돌연변이를 갖는 새로운 쇄는 티미딘을 함유하며, 따라서 JM101에서 생육가능하고, 야생형의 주형은 생육가능하지 않다.

파아지의 상등액을 PEG 침전시킨 후, 페놀-클로로포름으로 추출하고 에탄올로 침전시켜 주형 DNA를 제조한다. 1㎍의 주형 DNA를 1-10㎍의 올리고뉴클레오타이드 ZC986과 함께 잠시 비등시켜 하이브리드화시키고, 65℃에서 5분간 항온처리한 후, 온도를 4℃로 서서히 낮추고, 이어서 10㎕의 0.2M HEPES(pH 7.8), 2㎕의 100mM DTT, 1㎕의 1M MgCl, 20㎕의 2.5mM dNTP, 10㎕의 10mM ATP, 1㎕의 2.5μ/㎕ 클레나우 및 2μ의 1μ/㎕ TDNA 리가제를 첨가하고, 최종 용적을 HO를 사용하여 100㎕로 조정한다. 37℃에서 2시간동안 연장시킨 후, DNA를 컴피턴트 JM101 세포로 형질감염시킨다. 오염 RNA 또는 DNA 종에 프라이밍되어 연장됨으로써 생성된 백그라운드의 양을 비교하기 위해, 대조군의 연장 반응(올리고뉴클레오타이드 비함유)을 수행한다. 형질감염에 의해, 비돌연변이 주형의 경우 어떠한 플라크도 없었으며, 대조군의 연장(뉴클레오타이드 비함유)의 경우 150개의 플라크 및 돌연변이된 주형의 경우 300개의 플라크가 나타났다.

플라크를P-표지된 돌연변이유발성 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화시킨 후 3M TMACl(참조 : Wood et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 : 1585-1588, 1985)중에서 Tm-5℃에서 30분간 세척하고 또한 무작위로 채취한 플라크를 서열분석하여 평판을 스크리닝한다. 하나의 양성 클론이 수득되었다.

B. 핑거 교체 도메인의 제조

표 4 및 제19도에 나타낸 컨센서스 핑거 영역의 대체물을 작제한다.

8개의 컨센서스 서열을 지시된 올리고뉴클레오타이드로부터 제조한다. 올리고뉴클레오타이드(표 5)는 DNA 합성기(Applied Biosystems Model 380A DNA 합성기)를 사용하여 제조한다. 우선, 12개의 올리고 뉴클레오타이드를 키나제 처리하고 동시에 각각을 폴리뉴클레오타이드 키나제와 함께 30분 동안 37℃에서 항온처리하여

ATP로 저 특이 활성으로 표지한다. 이어서, 지시된 8개의 조합물(ABC, DEF, ABF, AEC, AEF, DBF, DEC 및 DBC)을 적합한 올리고뉴클레오타이드를 혼합하고 DNA 리가제를 첨가한 후 1시간 동안 37℃에서 항온처리하여 제조한다. 이러한 반응 생성물을 6% 폴리아크릴아미드-8M 우레아 서열분석 겔상에서 분류한다. 전체 길이의 핑거 도메인을 암호화하는 DNA에 상응하는 밴드를 절단하여, DNA를 2.5M 암모늄 아세테이트 중에 용출시킨다. DNA를 에탄올-침전시키고 1pmole/㎕ 농도로 물에 현탁시킨다.

RF DNA를 실시예 5A에 기술된 양성 클론으로부터 제조하고, BamH I 내지 EcoR I t-PA 단편을 정제한다. 플라즈미드 Zem219a(하기 실시예 5D에 기술됨)를 Xba I으로 분해한 다음 EcoR I으로 부분 분해한다. 3't-PA 암호화 영역을 함유하는 1010bp 단편을 정제한다. 플라즈미드 Zem219b(하기 실시예 5D에 기술됨)를 BamH I 및 XbaII으로 분해하고 5't-PA 단편(BamH I-EcoR I) 및 1010bp EcoR I-Xba I단편에 연결시킨다. 생성된 벡터를 Zem238이라 지명하며, 이는 핑거 도메인 뒤에 Kpn I 부위를 함유한다. Zem238을 BglII 및 Kpn I으로 분해하고, 겔-정제하여 야생형 핑거 도메인을 제거한 후, 8개의 컨센서스 서열 각각과 연결시켜 발현 벡터 238-Fcon1 내지 238-Fcon8을 생성시킨다.

C. 컨센서스 핑거 도메인과 조합된, 치환된 K1 도메인을 갖는 t-PA 유사체

단일쇄의 M13-8000 DNA을 올리고뉴클레오타이드 ZC986(실시예 5A)으로 돌연변이를 유발시키기 위한 주형으로서 사용하여 상술한 바와 같이 핑거 영역의 3'말단에 Kpn I 부위에 삽입시킨다. 정확한 클론(M13-8100-K)을 서열분석하여 스크리닝하고, RF DNA를 Kpn I 및 Xba I 으로 분해하여 돌연변이체 K1 단편을 분리한다. 돌연변이 K1 단편을 Kpn I, Xba I-분해된 플라즈미드 238-Fcon1 내지 Fcon8에 삽입시킨다. 생성되는 플라즈미드 8100-F1 내지 8100-F8을 전기천공법에 의해 tk^-BHK 세포내로 형질감염시킨다. 돌연변이체 단백질을 정제하고 특성화한다.

D. Zem219b의 작제

플라즈미드 pSV2-DHFR(참조:Subramani et al., 상기참조)을 Cfo T로 분해하고, DHFR cDNA 및 3'부착된 SV40 서열을 함유하는 단편을 분리하여 보수하고, HamH I 링커에 연결시킨다. BamH I으로 분해한 후, 전체 cDNA 및 SV40 터미네이터 영역을 함유하는 약 800bp 단편을 정제하고 BamH I-분해된 pUC8에 연결시킨다. Zem67(실시예 1)을 BglII로 분해하고 BamH I DHFR-SV40 단편에 연결시켜 플라즈미드 Zem176을 제조한다. 프라즈미드 Zem93을 Sst I으로 분해하고 재결합시켜 플라즈미드 Zem106을 생성시키는데, 이것은 MT-1 프로모터에 대해 5'방향으로 약 600bp 서열이 제거된 것이다. 프라즈미드 Zem106를 EcoR I으로 절단하고 플라즈미드 Zem176으로부터의 DHFR 유전자를 함유하는 EcoR I 단편에 결합시킨다. 생성된 플라즈미드는 Zts13이라 한다. 플라즈미드 Zts13을 BamH I 으로 분해하고 전체 t-PA 암호화 영역 및 hGH 터미네이터 서열을 함유하는 플라즈미드 Zem 99로부터의 BamH I 단편에 결합시킨다. 생성된 플라즈미드는 Zts15라 한다. Zts15를 BamH I으로 부분 분해하고, 보수하여 재결합시킨 후 형질전환시켜 플라즈미드 Zem219를 생성시키는데, 이는 3'BamH I 부위가 파괴되어 있다. 프라즈미드 Zem219를 Xba I으로 부분 분해하고, 보수하여 재연결시킨 후 형질전환시켜 플라즈미드 Zem219a를 제조하는데, 이는 3' Xba I 부위가 파괴되어 있다. 플라즈미드 Zem219a를 BamH I 및 Xba I으로 분해하고, 벡터서열을 t-PA cDNA 서열로부터 정제하고, 올리고머성 BamH I-Xba I 어댑터와 결합시켜 발현벡터Zem219b(제13도)를 생성시키고, 돌연변이체 BamH I-Xba I t-PA 서열을 이에 삽입한다.

실시예 6

K1 도메인이 치환되고 성장 인자 도메인이 결여된 t-PA 유사체

성장 인자 도메인 암호화 서열이 결여된 돌연변이체 서열은 올리고뉴클레오타이드 ZC820(^5'CTA CCa CGT GGC CCT GGT TTT GAC AGG CAC TGa GTG^3') 및 단일쇄 파지 주형 M13-8000을 사용한 결실 돌연변이유발에 의해 작제된다. 정확한 클론은 서열분석에 의해 확인되며 M13-8100-820으로 지명한다. M13-8100-820의 RF DNA를 BamH I 및 Xba I 로 분해하고, 이중-돌연변이유발된 DNA 단편을 분리한다. Zem219b는 BamH I 및 Xba I으로 분해하고, 큰(벡터)단편은 분리하여 T₄DNA 리가제로 돌연변이체 단편에 연결시킨다. 형질전환 후, 정확한 클론을 확인(8100-820)하고 전기천공법에 의해 tk^-BHK 세포내로 형질감염시킨다. 돌연변이체 단백질을 정제하고 특성화한다.

실시예 7

K1 도메인이 치환되고 성장 인자 도메인이 변형된 t-PA 유사체

A. Cys(83)의 치환

Zem99중의 t-PA 암호화 서열을 돌연변이유발시켜 83 위치에서 세린을 암호화시킨(아미노산 숫자는 제1도에 도시한 서열을 지칭한다). Zem99를 BamH I으로 분해하고, t-PA 암호화 서열 및 hGH 터미네이터를 포함하는 2.4kb 단편을 분리한다. 이 단편을 BamH I-분해된 M13mp18(Pharmacia Japan Co.에서 구입)에 연결시키고, 생성되는 재조합 파지를 사용하여 이.콜라이 JM103을 형질감염시킨다. 목적하는 삽입물을 가진 파지 클론을 M13mp18/Bam-Zem99로 지명한다.

부위-특이적 돌연변이를 위해, 올리고뉴클레오타이드(서열^5'CT GGT ATC GAT TTC ACA GCT CTT CCC AGC A^3')를 합성하여 돌연변이유발성 프라이머로서 사용한다. 이 올리고뉴클레오타이드를 단일쇄 M13mp18/Bam-Zem99에 어닐링시킨다. 표준 방법에 따라서 돌연변이유발을 수행하고, 단일쇄 DNA를 분리하여 서열분석한다. Bg1 II 및 HindIII를 사용하여, M13-9100RF라고 명명된 돌연변이된 파아지의 복제형태를 분해한다. t-PA 서열을 포함하는 2.2kb 단편을 회수하고, BglII 및 HindIII(제14도)을 사용하여 분해한 Zem99에 연결시키며, 이 DNA를 사용하여 이.콜라이 TB1을 형질전환시킨다. 바람직하게 서열 변경된 플라스미드를 회수하고, Zem99-9100(제14도)라고 명명한다. Zem99-9100의 돌연변이된 t-PA 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 제15도에 나타내었다.

로이터(Loyter) 등의 방법(상기 참조)에 의하여 플라즈미드 Zem99-9100 및 pSV2-dhfr을 사용하여 tk^-BHK 세포를 형질감염시킨다. 제한 희석 방법에 의하여 형질전환체를 클론화시킨다. 9100으로 명명된 돌연변이체 단백질을 친화성 정제에 의해 세포 배양배지로부터 정제한다.

플라즈미드 Zem99-9100을 포함하는 이.콜라이 TB1 형질전환체를 기탁기관[Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry, Japan(FRI)]에 기탁번호 제FERM P-9269호로 기탁되어 있다.

B. Cys(84)의 치환

올리고뉴클레오타이드^5'CCT GGT ATC GAT TTC ACT GCA CTT CCC^3'를 사용한 부위-특이적 돌연변이유발에 의해 t-PA DNA 서열을 돌연변이유발시켜 아미노산 84에서 세린을 암호화시킨다. 이 올리고뉴클레오타이드를 M13mp18/Bam-Zem99에 어닐링시키고, 표준방법을 이용하여 돌연변이유발시킨다. 단 일쇄 돌연변이된 파아지를 서열분석하고, 바람직하게 서열 변형된 클론을 선별한다. M13-9200RF라고 명명된 복제형 DNA를 제조하고, BglII 및 HindIII를 사용하여 분해한다. 2.3kb t-PA 단편을 분리하고, BglII+HindIII로 절단된 Zem99에 연결시킨다. 수득되는 벡터를 Zem99-9200이라 지명한다(제14도). Zem99-9200의 변형된 t-PA 암호화 서열 및 암호화된 아미노산 서열을 제16도에 나타내었다.

Zem99-9200 및 pSV2-dhfr을 로이터(Loyter; 상기 참조)에 방법에 의해tk-BHK 세포를 공동형질감염시키는데 사용한다. 형질전환체를 제한 희석 방법으로 클론화시킨다. 돌연변이체 단백질(9200)을 친화성정제법으로 정제한다.

플라즈미드 Zem99-9100을 함유하는 이.콜라이 RR1 형질전환체는 FRI에 기탁번호 제FERM P-9274호로 기탁되어 있다.

C. Cys 대체와 K1 치환의 조합

단일쇄 DNA를 M13-9200으로부터 분리시키고 올리고뉴클레오타이드^5'GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC^3'을 사용하여 돌연변이유발시켜 Mlu I 위치를 도입시킨다. 돌연변이된 파아지를 M13-92.05 PKA1으로 지명한다. RF DNA를 돌연변이된 파아지로부터 제조하고, BglII 및 Mlu I으로 분해시킨후, 264bp 단편을 회수한다. Zem99-8000을 Mlu I 및 Apa I으로 분해하고, 1126bp 단편을 회수한다. 이들 2개의 단편들을 BglII, Apa I-분해된 Zem99에 연결시키고 생성된 플라즈미드를 Zem99-9280으로 명명한다. 따라서 이 플라즈미드는 아미노산 84에서 Ser이 있는 돌연변이체 t-PA 및 96 위치에서 Asp가 있는 플라즈미노겐의 K1 도메인을 암호화한다.

아미노산 84에 Ser이 있는 t-PA 유사체 및 위치 96에 Asn이 있는 플라즈미노겐의 K1 도메인을 암호화하는 돌연변이체 t-PA 서열을 함유하는, 제2벡터를 작제한다. M13-92.05 PKA1으로부터의 RF DNA를 BglII 및 Mlu I으로 분해하고, 264bp 단편을 회수한다. Zem99-8100을 Mlu I 및 Apa I으로 분해하고, 1126bp 단편을 회수한다. 이들 2개의 단편을 BglII, Apa I-분해된 Zem99에 연결시키고, 수득된 플라즈미드를 Zem99-9281로 지명한다.

실시예 8

t-PA 유사체내의 탄수화물 부착 부위의 변형

Gly(183) 및 Ser(186)을 각각 Ser 및 Thr로 교체하기 위해 올리고뉴클레오타이드 프라이머(^5'ACG GTA GGC TGT CCC ATT CCT AAA GTA GCA^3')를 제조한다. 부위-지시된 돌연변이유발은 표준 방법에 따라 주형 M13mp18/Bam-Zem99상에서 수행한다(실시예 7). 단일쇄 돌연변이된 파지 DNA를 제조하고 서열분석한다. 목적하는 서열 변형을 갖는 클론을 M13-6000이라 명명한다.

M13-6000의 RF DNA를 분리하고, BglII 및 Apa I으로 분해시킨 후, 약 1.4kb의 단편을 분리시킨다.

이 단편을 BglII, Apa I-분해된 Zem99에 연결시켜 벡터 Zem99-6000을 제조한다. Zem99-6000으로 형질전환된 이.콜라이 RR1은 기탁기관(Fermentation Research Institute)에 기탁번호 제FERM P-9126호로 기탁되어 있다.

단일쇄 M13-6000의 DNA를 돌연변이유발시켜 EcoRV 위치를 돌연변이체 t-PA 서열에 도입시킨다. 돌연변이유발은 올리고뉴클레오타이드^5'CTC AGA CGA TTC CAC GAT ATC GCA GAA CTC^3'를 사용하는 1-프라이머 방법에 의해 수행한다. 돌연변이시킨 파지는 M13-6000PKA2로 명명한다. M13-6000 PKA2의 RF DNA를 EcoRV 및 Apa I으로 분해하여, 890bp 단편을 회수한다. Zem99-8000을 BglII 및 EcoR V로 분해하고, 500bp 단편을 회수한다. 이들 두 단편을 BglII, Apa I-분해된 Zem99에 연결시키고, 생성된 플라즈미드는 Zem99-8060으로 명명한다.

실시예 9

단백질의 특성화

돌연변이체 단백질 #8000의 혈장 반감기를 시험하고, 이 결과를 천연 t-PA(재조합체 BHK 세포에서 생성됨) 대조군 샘플과 비교한다. 시험할 단백질을 염수 용액에 용해시킨다. 용액을 숫컷 스프라그-돌리(Sprague-Rawley) 래트를(각각 체중 230g 내지 270g)에게 0.4mg/kg 체중의 용량으로 주입시킨다. 혈액샘플(0.5ml)을 대퇴정맥으로부터 채혈하고, 3.8% 시트르산으로 조절한 후, 원심분리하여 혈장을 분리시킨다. t-PA 단백질의 혈장 농도는 샌드위치-형 효소 면역검정에 의해 측정한다. 제17도는 천연 t-PA 및 단백질 #8000에 대한 혈중 농도 커브의 그래프이다.

혈중 농도의 변화는 2-구획 모델에 의해 분석한다(참조 : Shargel, L. 및 Yu, A.B.C., edc., Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics Appleton-Century Crofto, N.Y. 1980, 38 내지 48페이지). 반감기는 청명화(clearance)의 알파 및 베타상에 대해 측정하며, 세로좌표(B)에 대한 베타상의 역 외삽 절편 및 곡선 하부 면적(AUC)도 측정한다. 여러 가지 단백질에 대하여 수득한 값을 표 6에 나타내었다.

대조군으로서 천연 재조합 t-PA를 사용하여 t-PA 유사체 #8000의 응혈 분해 활성에 대해 시험한다. 길이 3cm의 견사를 소정맥 카테테르(4Fr 3.5cm)내에 도입시키고 카테테르를 주입용 주사기에 연결시킨다. 혈액과 3.8% 나트륨 시트레이트의 용액을 9:1의 비율로 혼합시켜 사람의 시트르산 처리된 혈액을 제조한다. 시트르산 처리된 혈액(0.5ml)을I-피브리노겐(생리염수 용액 50㎕중 25μ Ci), 50㎕의 0.25M CaCl및 트롬빈(5U/10㎕의 용액)과 합한다. 16㎕의 생성 용액을 카테테르내로 주입시키고 카테테르를 실온에서 60분 동안 정치시킨다. 그후 견사를 카테테르로부터 꺼내어 생리염수 용액으로 세척한다. 그후 견사를 카테테르로부터 꺼내어 생리염수 용액으로 세척한다. 실에 결합된 방사능(최초의 피브린 혈전 값)을 특정한다. 다음에, 실을 체중이 200 내지 300g인 숫컷 스프라그-돌리 래트상의 경동맥의 동정맥(A-V) 측로중에 도입시킨다. ml당 50단위의 헤파린을 함유하는 염수 용액중의 단백질 샘플 1ml를 동물의 대퇴 정맥에 주입한다. 2시간 후, 견사를 측로로부터 꺼내고 방사능(잔류 피브린 혈정 값)을 측정한다. 잔류 혈전율은 다음식에 따라 측정한다:

제18도는 다양한 용량의 천연 t-PA 및 유사체 #8000을 사용하여 수득한 결과에 대한 그래프이다. 이 데이타는 돌연변이체 단백질이 생체내 혈전을 분해시키는 능력에 있어서 천연 t-PA 보다 우수함을 나타낸다.

상기로부터, 본 발명의 특정한 양태를 예시할 목적으로 본 명세서에 기재하였지만, 본 발명의 취지 및 범위를 이탈하지 않으면서도 다양하게 변경할 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명은 첨부된 특허청구의 범위에 의해서만 제한된다.

Claims

천연 조직형 플라즈미노겐 활성인자(t-PA)의 크링글 1(K1) 도메인이, 피브린에 대한 유사체의 결합을 조절하며 6개의 시스테인 잔기를 함유하는 다른 크링글 도메인으로 치환되고, 피브린에 대해 천연 t-PA 보다 특이성이 높은 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 크링글 도메인이 77 내지 81개의 아미노산으로 이루어진 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 시스테인 잔기가 크링글 도메인의 N-말단에 대해 1번 및 22번 위치, 및 크링글 도메인의 C-말단에 대해 1, 6, 18 또는 19번, 및 29, 30 또는 31번 위치에 존재하는 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 크링글 도메인이 t-PA K2 도메인, 플라즈미노겐 K1 도메인, 플라즈미노겐 K4 도메인, 프라즈미노겐 K5 도메인, 인자 XII크링글 도메인, 프로트롬빈 K1 도메인 및 프로트롬빈 K2 도메인으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 크링글 도메인이 하기의 아미노산 서열을 포함하는 t-PA 유사체.

상기 서열에서, X는 Asp 또는 Asn이다.
제1항에 있어서, 추가로 절단 부위의 13개의 아미노산 잔기중 하나 이상의 아미노산이 치환되어, 플라즈민에 의한 절단에 대해 내성이 향상된 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 제19(a) 내지 (i)도에 도시된 서열로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 갖는 핑거 도메인을 함유하는 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 크링글 도메인이, 탄수화물이 결핍되도록 추가로 변형된 프로트롬빈 K1 도메인인 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 각각 아미노산 위치 183 및 186번에서 세린 및 트레오닌을 함유하도록 변형된 천연 t-PA의 K2 도메인을 추가로 함유하는 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 성장 인자 도메인이 결핍된 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 천연 t-PA, 단백질 C, 인자 VII, 인자 IX 및 인자 X로 이루어진 그룹에서 선택된 단백질의 성장 인자 도메인을 함유하는 t-PA 유사체.
제1항에 있어서, 성장 인자 도메인이, 하나 이상의 시스테인 잔기가 세린 또는 알라닌으로 치환된 천연 t-PA의 성장 인자 도메인인 t-PA 유사체.
제9도 및 제10도에 나타낸 t-PA 유사체를 암호화하는 DNA 서열.
제13항에 따르는 t-PA 유사체를 암호화하는 DNA 서열을 함유하는 발현 벡터.
제14항에 있어서, Zem99-8000 또는 Zem99-8100인 발현 벡터.
제14항에 또는 제15항에 따르는 발현 벡터로 형질감염되거나 형질전환된 숙주 세포.
제16항에 있어서, 에스케리챠 콜라이(Escherichia coli) 또는 포유동물 숙주 세포인 숙주 세포.
제1항 내지 제12항 중의 어느 한 항에 따르는 t-PA 유사체 및 생리학적으로 허용되는 담체 또는 희석제를 함유하는 응혈 용해 활성을 갖는 약제학적 조성물.