JPH0595786A - 変異ヒトプロウロキナーゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ヒトプロウロキナーゼ（ヒトＰＵＫ）のエピ
ダーマルグロースファクター（epidermal growth facto
r)領域内の中性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換、また
は酸性アミノ酸を非酸性アミノ酸に置換した変異ヒトプ
ロウロキナーゼ、および当該変異ヒトプロウロキナーゼ
をコードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミドによ
り形質転換された宿主を培養して変異ヒトプロウロキナ
ーゼを発現することを特徴とするヒトプロウロキナーゼ
の製造方法。 【効果】 繊維素溶解酵素であるヒトＰＵＫのＥＧＦ領
域内の中性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換することに
より、あるいは酸性アミノ酸を非酸性アミノ酸に置換す
ることにより、血中半減期を増加させると同時に、フィ
ブリンへの親和性を改善できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ヒトプロウロキナーゼ
（以下ヒトＰＵＫ）を分子構造的に修飾してなる変異ヒ
トＰＵＫ、その製造方法、該変異ヒトＰＵＫをコードす
るＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列の組み込まれたプラスミ
ド、および該プラスミドによって形質転換された形質転
換体に関する。さらに詳しくは、遺伝子レベルにおいて
特定遺伝子のアミノ酸配列を他のアミノ酸配列にて置換
させ、該遺伝子を組み換えＤＮＡ技術を応用して発現さ
せることからなる変異ヒトＰＵＫを提供する一連の技術
に関する。

【０００２】

【従来の技術】繊維素溶解に係わるプラスミノーゲン活
性化因子には、血管内皮細胞の産生する組織性のｔ−Ｐ
Ａ、ウロキナーゼ（ＵＫ）が知られており、従来繊維素
溶解酵素としてはＵＫが著名である。このものは、従来
人尿および人腎細胞の培養液から精製されていたが、近
年ＤＮＡ組み換え技術による生産も可能となった（特開
昭６０−１８０５９１号明細書）。しかし、ＵＫは大量
に用いると、凝固・線溶諸因子の分解並びに活性化を惹
起し、出血傾向を誘起する欠点を有している。他方、本
発明者らは、人腎細胞によって産生されるヒトウロキナ
ーゼの不活性型前駆物質（ＰＵＫ） [特開昭６０−６２
９８１号明細書、J. Biol. Chem., 260, 12377 (1985)]
が、ＵＫと異なり出血傾向を惹起することなく血栓を溶
解することをすでに見出している [Cell Struc. Func.,
10, 151 (1985)]。

【０００３】ヒトＰＵＫは、３つのドメイン（domain)
、即ち、エピダーマルグロースファクター(epidermal
growth factor、以下ＥＧＦと略称する）ドメイン、ク
リングル（kringle)ドメイン、酵素活性ドメインから構
成されている[Hoppe-Seyler■sZ. Physiol. Chem., 36
3, 1155(1982)] 。

【０００４】ところで、従来より、血中半減期を延長さ
せる目的をもってヒトＰＵＫを修飾することが試みられ
ている。例えば、ＥＧＦ全領域の欠失（特開昭６３−１
４６７８９号）、ＥＧＦ領域中の第１または第３ループ
の欠失（特開平３−８７１７１号）、ＥＧＦ領域内のア
ミノ酸を置換して特定の部分構造を構築して糖鎖の付加
をめざしたもの（特開平３−８７１７９号）等が検討さ
れている。

【０００５】しかし、フィブリン親和性の向上の試み
は、具体的には、抗フィブリン抗体とＵＫ、ｔＰＡのハ
イブリッドタンパク、プラスミノーゲンのようなフィブ
リン親和性の高い蛋白質のクリングル領域をｔＰＡやＵ
Ｋに組み入れたものが報告されているが、アミノ酸置換
でフィブリン親和性を上げた例はない。

【０００６】

【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
はＥＧＦ領域を欠失させることなく、極力少ない修飾に
よって、ＥＧＦ領域除去ヒト変異ＰＵＫの血中半減期の
増加を維持しながら、フィブリンへの親和性が向上し、
しかも他の性質はヒトＰＵＫと実質的に変わらない変異
ヒトＰＵＫ、その製造方法、当該変異ヒトＰＵＫをコー
ドするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配列の組み込まれたプラス
ミド、形質転換体を提供することである。

【０００７】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記事情に
鑑み、鋭意検討を重ねた結果、ヒトＰＵＫのＥＧＦ領域
内の中性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換することによ
り、あるいは酸性アミノ酸を非酸性アミノ酸に置換する
ことにより、血中半減期を増加させると同時に、フィブ
リンへの親和性を改善できることを見出し、本発明を完
成した。

【０００８】本発明は、ヒトプロウロキナーゼのエピダ
ーマルグロースファクター（epidermal growth factor)
領域内の中性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換、または
酸性アミノ酸を非酸性アミノ酸に置換した変異ヒトプロ
ウロキナーゼ、および当該変異ヒトプロウロキナーゼを
コードするＤＮＡ配列が組み込まれたプラスミドを形質
転換された宿主を培養して変異ヒトプロウロキナーゼを
発現することを特徴とするヒトプロウロキナーゼの製造
方法に関する。

【０００９】本発明において、各用語は以下のように定
義されている。ヒトＰＵＫは４１１のアミノ酸から成
り、そのアミノ酸配列およびＤＮＡ配列は後記の配列表
で表されている。ＰＵＫのＥＧＦ領域は１０番目のAsn
から４９番目のThr までである。このＥＧＦ領域は３つ
のループから成る。すなわち、第１ループは１０番目の
Asn から１９番目のCys までであり、第２ループは２０
番目のVal から３１番目のCys までであり、第３ループ
は３３番目のCys から４２番目のCys までである。

【００１０】（１）変異ヒトＰＵＫ 本発明者の変異ヒトＰＵＫは、ヒトＰＵＫのＥＧＦ領域
内の中性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換されたもの
（）、あるいは酸性アミノ酸を非酸性アミノ酸に置換
されたもの（）である。

【００１１】の中性アミノ酸としては非電荷のアミノ
酸が挙げられ、具体的にはGly 、Ser 等が例示される。
また、塩基性アミノ酸としてはLys 、Arg 、His 等が例
示される。の酸性アミノ酸としてはGlu 、Asp 等が例
示される。非酸性アミノ酸としては酸性アミノ酸のアミ
ド体、中性アミノ酸、塩基性アミノ酸等が挙げられる。
酸性アミノ酸のアミド体としてはAsn 、Gln 等が例示さ
れる。

【００１２】具体的には、１６番目のGly をLys に置換
したもの、３８番めのGly をLys に置換したもの、４５
番目のAsp をAsn に置換したもの等が例示される。

【００１３】アミノ酸配列は、通常ＥＧＦドメインの任
意のアミノ酸配列を欠失させ、所望のアミノ酸、ないし
はアミノ酸配列を導入することによって置換される。ア
ミノ酸配列の置換処理には、プロテインエンジニアリン
グとして知られる方法が広く利用できるが、例えばSite
-directed deletion (部位指定削除）法 [Nucl. Acids
Res., 11. 1645 (1983)]、Site-specific mutagenesis
（部位特異的変異）法、制限酵素処理と合成遺伝子の利
用による方法等がある。

【００１４】具体的にはヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ
配列を用いて処理を行う。このＤＮＡ配列は後記配列表
で示される。また、このＤＮＡは特開昭６０−１８０５
９１号明細書、特開昭６３−１４６７８９号明細書等に
開示された方法により調製することができる。このヒト
ＰＵＫをコードするＤＮＡ配列を担持するプラスミドと
してはｐＳＶ−Ｇ₁ −ｐｒｅＵＫ（図１または特開昭６
０−１８０５９１号明細書）が例示される。

【００１５】（２）発現系 置換処理された変異ＰＵＫは、発現ベクター系に挿入し
て、発現用宿主・ベクター系を構築する。宿主・ベクタ
ー系は一般に宿主細胞とコンバーチブルな種から由来す
るレプリコンと制御配列を有するプラスミドベクター
と、この宿主を組み合わせて使用する。ベクターは一般
に複製部位を有しており、また形質転換細胞中で表現型
の選択が可能となるマーカーの配列を有している。宿主
として、大腸菌、酵母、枯草菌、動物細胞を用いる方法
については特開昭６３−１４６７８９号で開示されてい
る。このうち、好ましくは動物細胞を用いる。動物細胞
を用いる方法として上記公報以外にもＤＨＦＲ遺伝子を
利用した増幅系を利用する方法（特開昭６３−１０５９
７５号）、ＤＨＦＲ遺伝子をＵＫプロモーターで制御す
ることによりさらに増幅系を強化する方法（特願平２−
１２３５０３号）等を利用できる。

【００１６】（３）具体的な発現方法 本発明は、動物細胞での発現を制御できるプロモーター
を上流部に付加させた変異ヒトＰＵＫ遺伝子及びウロキ
ナーゼ（ＵＫ）プロモーターを付加させたジヒドロ葉酸
還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を組み込んでなるプラスミ
ドを用いて形質転換させた動物細胞、該動物細胞を培養
して変異ヒトＰＵＫを発現させることによる変異ヒトＰ
ＵＫの製造方法に関する。

【００１７】以下、これを詳述する。 〔Ｉ〕プラスミド 本発明においてプラスミドは、(i) 動物細胞での発現
を制御できるプロモーターを上流部に付加させた変異ヒ
トＰＵＫをコードするＤＮＡ、及び(ii) ウロキナーゼ
（ＵＫ）プロモーターを上流部に付加させたジヒドロ葉
酸還元酵素（ＤＨＦＲ）をコードするＤＮＡを同一プラ
スミドに組み込んでなる。

【００１８】当該プラスミドにおいては、動物細胞での
発現を制御できるプロモーターを変異ヒトＰＵＫをコー
ドするＤＮＡの上流部に付加させ、動物細胞での発現を
制御できるプロモーターの支配下にヒトＰＵＫをコード
するＤＮＡが働くようにしたものである。

【００１９】動物細胞での発現を制御できるプロモータ
ーは、ポリオーマ、アデノウイルス．２、あるいは最も
多用されているシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）由来
である。ＳＶ４０ウイルスの初期及び後期プロモーター
は特に有用である。というのは、これらは、ＳＶ４０の
複製起点を含む断片として容易にウイルスから得られる
からである〔Fiers et al. Nature, 273, 113(1978)]
。ウイルスのHindIII部位から複製起点のBglI部位まで
の約250 bpを含む断片も使用できる。更に目的とする遺
伝子に関連したプロモーターや制御配列（エンハンサ
ー) も宿主とコンバーチブルならば使用できる。

【００２０】動物細胞発現ベクターに用いるプロモータ
ー・エンハンサーとしては、ＳＶ４０初期遺伝子又は後
期遺伝子のプロモーター・エンハンサーやアデノウイル
スメジャーレート・プロモーター領域、グロブリンエン
ハンサー・プロモーター領域、ＲＮＡウイルスのＬＴ
Ｒ、メタロチオネインプロモーター領域、β−アクチン
プロモーターなどが使用できる。複製起点は、ＳＶ４０
や他のウイルス（ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ
等) 由来のものをベクターに組み込んでもよいし、宿主
細胞染色体の複製機構を用いてもよい。ベクターが宿主
細胞の染色体に組み込まれるならば後者で十分である。

【００２１】ＵＫプロモーターを上流部に付加させたＤ
ＨＦＲをコードするＤＮＡは、ＵＫプロモーターの支配
下にＤＨＦＲをコードするＤＮＡが働く様にしたもので
ある。当該ＵＫプロモーター及びＤＨＦＲをコードする
ＤＮＡは、共に公知のものであり、ＵＫプロモーターは
Nucl. Acids Res., 13, 2759-2771(1985) 等に、ＤＨＦ
ＲをコードするＤＮＡは特開昭59-192089 、同63-10567
5 等に開示されている。

【００２２】なお、当該プラスミドにおいて、動物細胞
での発現を制御できるプロモーターと変異ヒトＰＵＫを
コードするＤＮＡからなるユニット、及びＵＫプロモー
ターとＤＨＦＲをコードするＤＮＡからなるユニット
は、順方向に配置されていてもよく、逆方向に配置され
ていてもよい。また、当該プラスミドは、動物細胞での
発現を制御できるプロモーターを上流側に付加した変異
ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡユニットの上流側に複製
起点、下流側に、リボソーム結合部位、ＲＮＡスプライ
ス部位、ポリＡ付加部位あるいは転写終結配列を有して
いてもよい。

【００２３】〔II〕 形質転換体 形質転換体は〔Ｉ〕のプラスミドを用いて動物細胞を形
質転換させたものである。

【００２４】本発明で使用される動物細胞としては、細
胞株として有用な例として、VERO、HeLa細胞、Chinese
hamster ovary (CHO) cell line 、W138、BHK、COS-7
、MDCK Cell line、C127、HKG 、Human kidney cell l
ineなどが挙げられる。具体的にはCHO-K1（チャイニー
ズハムスター卵巣細胞：ATCC CCL61) 、BHK(新生子ハム
スター腎細胞：ATCC CCL10) 、COS-7(CV-1 Origin, SV-
40細胞：ATCC CRL1651)、Vero( アフリカミドリザル腎
細胞：ATCC CCL-81)等がある。また、このような細胞と
しては特にＤＨＦＲ遺伝子欠損細胞であることが好まし
い。

【００２５】動物細胞の形質転換は公知の方法、例え
ば、リン酸カルシウム沈澱法、プロトプラストポリエチ
レングリコール融合法、エレクトロポレーション法など
により行うことができる。

【００２６】また、ＭＴＸ（メトトレキセート）による
遺伝子増幅の方法としては、形質転換体を１０ｎＭ〜４
μＭのＭＴＸを含む培地（ＭＴＸ濃度は段階的に上げて
いってもよく、最初から高濃度でシングルステップで行
ってもよい）中で耐性株を選択すればよい。

【００２７】培地としては、1 〜10％ＦＣＳを含んだME
M-α、或いはダルベッコ変法−ＭＥＭ（Ｄ−ＭＥＭ）等
が挙げられる。培養条件は１０〜３７℃，１〜２００時
間程度である。

【００２８】[III] 変異ヒトＰＵＫの製造方法 [II]の形質転換体を培養し、自体既知の手段に変異ヒト
ＰＵＫを発現させる。

【００２９】（４）精製 変異ヒトＰＵＫの精製は、既知のヒトＰＵＫの精製法に
準じておこなうことができる（特開昭６０−６２９８１
号）。本発明では、精製にはChelating Sepharose 6B,
anti-UK formyl cellurofine, Benzamidine-Sepharose
6Bのカラムクロマトグラフィーを併用したが、特にChel
ating Sepharose 6Bは粗精製に、anti-UK formyl cellu
rofine 4B は高度精製に、さらにBenzamidine-Sepharos
e 6Bは混入活性型ウロキナーゼ（ＵＫ）の除去に各々有
効である。

【００３０】かくして得られた産生物を解析したとこ
ろ、ＰＵＫ活性においては変異型および非変異型で全く
差はなく、変異型ＰＵＫは分子量約５０，０００〜５
５，０００の一本鎖型のプロエンザイムであり、プラス
ミン処理により完全に活性型に変換した。さらにこの変
異ヒトＰＵＫのフィブリンへの親和性を人腎細胞由来Ｐ
ＵＫ[J. Biol. Chem., 260, 12377(1985)] のそれと比
較したところ、変異ヒトＰＵＫのほうが有意に増強され
た。

【００３１】

【発明の効果】本発明においては、繊維素溶解酵素であ
るヒトＰＵＫのＥＧＦ領域内の中性アミノ酸を塩基性ア
ミノ酸に置換することにより、あるいは酸性アミノ酸を
非酸性アミノ酸に置換することにより、血中半減期を増
加させると同時に、フィブリンへの親和性を向上できる
ことが判明した。

【００３２】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例を
挙げるが、本発明は、これらによって何ら限定されるも
のではない。尚、本発明においては以下のプラスミド、
酵素、キット、技術等を用いる。

【００３３】 使用プラスミド ｐＵＨ７：特開昭６３−１４６７８９号において構築さ
れた発現ベクターで、ＰＵＫのｃＤＮＡより、全ＥＧＦ
領域（Asn¹⁰ 〜Cys⁴²)が除去されている。 ｐＳＶ−Ｇ１−ｐｒｅＵＫ：ヒトＰＵＫの発現ベクター
（特開昭６０─１８０５９１号）。 ｐＴＴ０６：ＤＨＦＲ発現ベクター（後記参考例１参
照）。 尚、上記３つのプラスミドの構造を図１に示す。 酵素、キット 制限酵素、Ｔ４ＤＮＡポリメレース、Ｔ４ポリヌクレオ
チドカイネース、バクテリア由来アルカリフォスファテ
ース（ＢＡＰ）、Ｍ１３シークエンスキット、ライゲー
ションキット、ＪＭ１０９コンピテントセルは、宝酒造
製のものを用いた。ミュータジェネシスにはOligonucle
otide-directed mutagenesis system ver.2 （アマーシ
ャム）を用いた。 リコンビナントＤＮＡテクニック Maniatisら、"Molecular Cloning" Cold Spring Harbo
r, NY : Cold Spring Harbor Laboratory (1982) の方
法に準じた。

【００３４】実施例１ アミノ酸置換変異型ＰＵＫ発現
用プラスミドの構築 〔Ｉ〕Lys¹⁶-PUK 発現用プラスミドの構築 (i) 合成プライマーの調製 ３８１Ａ ＤＮＡ合成機（アプライド バイオシステ
ム）を用いて、一本鎖ＤＮＡを作製した。ＳＤ１６はミ
ュータジェネシスのプライマーで、Gly¹⁶(GGA)をLys¹⁶
(AAA) に置換し、新たにKpnI site を導入した（図
２）。合成したＤＮＡを３ｍｌの３０％アンモニア水で
カラムから溶出し、うち１ｍｌを一夜加熱後、オリゴヌ
クレオチド精製カラム（ＡＢＪ）にて精製した。その結
果、ＳＤ１６を１３３μｇ得た。

【００３５】(ii) 一本鎖ＤＮＡ、ｓｐＴＴ１０の構築 構築工程の概略を図３に示した。ｐＳＶ−Ｇ１−ｐｒｅ
ＵＫのHindIII− EcoRI断片（１．２ｋｂ）をｐＵＣ１
１８のHindIII − EcoRI間に挿入し、ｐＴＴ１０とし
た。このＤＮＡ断片はＳＶ４０のエンハンサー・プロモ
ーター、スプライシングジャンクションに続き、ＰＵＫ
のｃＤＮＡの第６５３塩基まで、即ちクリングルドメイ
ン内のGly¹⁶²までをコードする塩基配列を含む。ｐＴＴ
１０を大腸菌ＪＭ１０９にトランスフォームし、ヘルパ
ーウィルスＭ１３Ｋ０７株を感染させた。この培養液２
４０ｍｌから１本鎖ＤＮＡを調製し、３５０μｇのｓｐ
ＴＴ１０を得た。

【００３６】(iii) Site directed mutagenesis プライマーＤＮＡ（ＳＤ１６）とtemplateＤＮＡ（ｓｐ
ＴＴ１０）を用いてLys¹⁶-PPA をコードするＤＮＡを担
持するプラスミドｐＭＲ３２６を構築した。得られたｐ
ＭＲ３２６を用いて、ＪＭ１０９をトランスフォームし
た。各反応の成否をモニターするため、サンプルをアガ
ロース電気泳動して、ＤＮＡバンドの大きさをチェック
した。

【００３７】(iv) ｐＭＲ３２６を保持する株のスクリ
ーニング ミュータジェネスの結果得られたトランスフォーマント
のうちランダムに１２株を選んで、プラスミドのミニプ
レップを行った。これらのプラスミドを KpnIで消化
し、アガロースゲル上で電気泳動して、4.1 kbp と220
bpの二本のＤＮＡバンドが見えるか否かでスクリーニン
グした。その結果、12株中４株が目的のプラスミドを保
持していた。

【００３８】(v) シークエンシングによるミューテー
ションの確認 スクリーニングで選出されたプラスミドにつき、意図し
た位置にミューテーションが起こっていること、及びミ
ュータジェネシスの過程を通じてその他の部分が変異し
ていないことを確認するため、ｐＭＲ３２６の KpnI −
BglII 間(430bp) をダイデオキシ法でシークエンシング
した。シークエンシングの結果、塩基番号51〜BglII 間
の配列はこれと一致していた。

【００３９】(vi) ＤＨＦＲ発現ユニットとΔE₁E₂E₃
−ＰＵＫ発現ユニットを持つプラスミドの構築 プラスミドの構築の手順を図４に示した。ＤＨＦＲ遺伝
子発現ユニットを持つプラスミド、ｐＴＴ０６をBglII
で部分消化し、末端をKlenowfragment で平滑化した
後、セルフライゲーションを行い、出来上がったプラス
ミドをｐＭＲ３４３とした。この操作により、ＤＨＦＲ
ｃＤＮＡとＳＶ４０のｐｏｌｙＡ付加領域との間にあっ
たユニークサイトのBglII サイトが除去された。次にｐ
ＭＲ３４３を SalI 、 KpnI 、 ApaLIの３酵素で消化
後、アガロースゲル電気泳動し、ＤＨＦＲ発現ユニット
である SalI − KpnI 断片（２．９ｋｂ）をＤＥＡＥ紙
法で精製した。このＤＮＡ断片とｐＵＨ７を SalI で消
化したものをライゲーションした。この反応では、ＤＨ
ＦＲ発現ユニットの SalI サイトとｐＵＨ７の一方のSa
lIサイトのみがライゲーションされるだけなので、ライ
ゲーションされずに残った末端をＴ４ＤＮＡポリメラー
ゼにより平滑化した。セルフライゲーション後、大腸菌
JM109にトランスフォームした。得られたコロニーから
プラスミドを抽出し、BamHI で消化してインサートの有
無及び向きを確認した。ＤＨＦＲ発現ユニットとｍ−Ｐ
ＵＫ発現ユニットが順方向になっているｐＭＲ３４４で
は、3.4 、1.6 、1.4 、1.0 、0.3kb のバンドが、それ
らが逆方向になっているｐＭＲ３４５では、3.1 、1.6
、1.4 、1.3 、0.3kb のバンドが生成した。

【００４０】(vii) ミューテーションを導入したＤＮ
Ａ断片の発現ベクターへの組み込みシークエンス確認
後、ｐＭＲ３２６の KpnI −BglII 部分（430bp)を、ｐ
ＭＲ３４５の KpnI −BglII 部分と置換し、できあがっ
たプラスミドをｐＭＲ３２７とした。プラスミドの構築
の概略を図５に示した。これを大量調製し、333 μgの
プラスミドを得、トランスフェクションに供した。

【００４１】[II] Lys³⁸-PUK 発現用プラスミドの構築 (i) 合成プライマーの調製 ３８１Ａ ＤＮＡ合成機（アプライド バイオシステ
ム）を用いて、一本鎖ＤＮＡを作製した。ＳＤ１３はミ
ュータジェネシスのプライマーで、Gly³⁸(GGA)をLys³⁸
(AAA) に置換し、新たにDraI site を導入した（図
６）。合成したＤＮＡを３ｍｌの３０％アンモニア水で
カラムから溶出し、うち１ｍｌを一夜加熱後、オリゴヌ
クレオチド精製カラム（ＡＢＪ）にて精製した。

【００４２】(ii) ミュータジェネシス 〔Ｉ〕−(iii) 項に準じてｓｐＴＴ１０およびＳＤ１３
から、ｐＭＲ３１６を構築した。

【００４３】(iii)ｐＭＲ３１６を保持する株のスクリ
ーニング ミュータジェネシスの結果得られた形質転換体のうちラ
ンダムに１２株を選んで、プラスミドのミニプレップを
行った。これらのプラスミドを DraI で消化し、アガロ
ースゲル上で電気泳動して、2.95、1.25、0.7 kbの３本
のＤＮＡバンドが見えるか否かでスクリーニングした。
その結果、12株中４株が目的のプラスミドを保持してい
た。

【００４４】(iv) シークエンシングによるミューテー
ションの確認 スクリーニングで選出されたプラスミドにつき、意図し
た位置にミューテーションが起こっていること、及びミ
ュータジェネシスの過程を通じてその他の部分が変異し
ていないことを確認するため、ｐＭＲ３１６の KpnI −
BglII 間(430bp) をダイデオキシ法でシークエンシング
した。シークエンシングの結果、塩基番号52〜BglII 間
の配列はこれと一致していた。

【００４５】(v) ミューテーションを導入したＤＮＡ
断片の発現ベクターへの組み込み シークエンシング確認後、ｐＭＲ３１６の KpnI −BglI
I間(430bp) を、ｐＭＲ３４５の、 KpnI −BglII 部分
と置換し、できあがったプラスミドをｐＭＲ３１７とし
た。プラスミドの構築の概略を図７に示した。これを大
量調製して543μg のプラスミドを得、トランスフェク
ションに供した。

【００４６】[III] Asn⁴⁵-PUK発現用プラスミドの構築 (i) 合成プライマーの調製 ３８１Ａ ＤＮＡ合成機（アプライド バイオシステ
ム）を用いて、一本鎖ＤＮＡを作製した。ＳＤ３０はミ
ュータジェネシスのプライマーで、Asp⁴⁵(GAT)をAsn⁴⁵
(AAT) に置換し、新たにVspI site とNsp(7524)I site
を導入した（図８）。合成したＤＮＡを３ｍｌの30％ア
ンモニア水でカラムから溶出し、うち１ｍｌを一夜加熱
後、オリゴヌクレオチド精製カラム（ＡＢＪ）にて精製
した。その結果、ＳＤ３０を80μｇ、ＳＤ３３を109 μ
ｇ得た。

【００４７】(ii) ミュータジェネシス 〔Ｉ〕−(iii) 項に準じてｓｐＴＴ１０およびＳＤ３０
から、ｐＭＲ３４７を構築した。

【００４８】(iii)ｐＭＲ３４７を保持する株のスクリ
ーニング ミュータジェネシスの結果得られたトランスフォーマン
トのうちランダムに１２株を選んで、プラスミドのミニ
プレップを行った。これらのプラスミドを VspI で消化
し、アガロースゲル上で電気泳動して、2.5 、1.2 、0.
5 kbの３本のＤＮＡバンドが見えるか否かでスクリーニ
ングした。その結果、１２株中２株が目的のプラスミド
を保持していた。

【００４９】(iv) シークエンシングによるミューテー
ションの確認 スクリーニングで選出されたプラスミドにつき、意図し
た位置にミューテーションが起こっていること、及びミ
ュータジェネシスの過程を通じてその他の部分が変異し
ていないことを確認するため、ｐＭＲ３４７の KpnI −
BglII 間(430bp) をダイデオキシ法でシークエンシング
した。シークエンシングの結果、塩基番号 KpnI −BglI
I 間の配列は高次構造形成のため当該方法ではシークエ
ンシング出来なかった塩基番号５０までを除きこれと一
致していた。

【００５０】(v) ミューテーションを導入したＤＮＡ
断片の発現ベクターへの組み込み シークエンス確認後、ｐＭＲ３４７の KpnI −BglII 間
(430bp) を、ｐＭＺ１１７の、 KpnI −BglII部分と置
換し、できあがったプラスミドをｐＭＺ３４８とした。
ｐＭＲ３１７からＤＨＦＲ発現ユニット（2.9kb)をSalI
で切り出し、ｐＭＺ３４８のSalIサイトに挿入した。得
られたプラスミドをBamHIで消化し、ＤＨＦＲ発現ユニ
ットとｍ−ＰＵＫ発現ユニットが逆方向になっているも
のを選択して、ｐＭＲ３７１とした。プラスミドの構築
の概略を図９、図１０に示した。

【００５１】実施例２ アミノ酸置換ｍ−ＰＵＫの産生 (1) 細胞 ＤＸＢ−１１細胞：ＣＨＯ−Ｋ１細胞由来ＤＨＦＲ欠損
株 Proc.Natl.Acad.Sci(USA) 77, 4216 (1980) に記載の方
法で調製、増殖させた。

【００５２】(2) メトトレキセート（ＭＴＸ） Sigma 社製（＋）Amethopterinを0.14M NaCl, 0.02M HE
PES （ナカライテスク）に溶解し、２mMストック液を調
製した。これを培地に、目的の濃度になるように添加し
使用した。

【００５３】(3) 培地と血清 MEM-α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
入り）（Gibco) MEM-α（リボヌクレオシドとデオキシリボヌクレオシド
無し）（Gibco) それぞれ、MEM-α（w)、MEM-α（w/o)と略す。血清は牛
胎児血清（FCS)（三菱化成 MH01)を非働化し使用した。

【００５４】(4) ＤＮＡ導入とトランスフェクタントの
選択 MEM-α（W), 10％FCS で継代しているDXB-11細胞をトリ
プシン(0.25 ％トリプシン、0.02％EDTA) 処理により、
ディッシュよりはがし、10⁷cell/mlとなるようHanks 液
に懸濁した。この懸濁液0.5 ml, ５×10⁶ 個の細胞に５
μｇのプラスミドＤＮＡを、Electroporation 法により
導入した。この細胞を５枚の10ｃｍディッシュにまい
た。２日間、ＭＥＭ−α（ｗ）、10％ＦＣＳで培養後、
選択培地であるＭＥＭ−α（ｗ／ｏ）、10％ＦＣＳに交
換した。２〜３日毎に培地交換を行い、10日間培養する
とコロニーの形成が見られたので、各コロニーを96ウェ
ルプレートに移し、さらに培養を続けた。96ウェルプレ
ート中で細胞がほぼコンフルエントなったところで各培
養上清中のプラスミノーゲン アクチベーター（ＰＡ）
活性を測定した。高い活性を与えたいくつかの細胞をス
ケールアップし、ＭＴＸによるＤＮＡ増幅に供した。

【００５５】(5) ＭＴＸによる導入遺伝子の増幅 (4) で得られたアミノ酸置換ｍ−ＰＵＫ産生細胞をＭＥ
Ｍ−α（ｗ／ｏ）、10％ＦＣＳ、10nM ＭＴＸを培地と
して１×10⁴cell/ml の濃度で６ウェルプレート(Falco
n, 3046)に２ｍｌ植え込んだ。培養３〜４日でかなりの
細胞が死滅するが、３日毎に培地交換を続けていると細
胞の成長が見られた。２〜４週間で充分な細胞数になる
ので、次の段階のＭＴＸ濃度の培地に継代した。このよ
うに10nMのＭＴＸ濃度からスタートして順次２〜４倍ず
つＭＴＸ濃度を上げていった。各濃度のＭＴＸ耐性細胞
はそれぞれ６ｃｍディッシュまたは10ｃｍディッシュ
（Falcon, 3803) で培養し、上清中のＰＡ活性をフィブ
リン平板法により測定した。尚、活性測定の標準品とし
て、Urokinase reference standard（ミドリ十字社製、
Lot.S-004)を用いた。増幅による各ｍ−ＰＵＫ産生量の
増加を表１に示した。

【００５６】

【表１】

【００５７】(6) アミノ酸置換ｍ−ＰＵＫ産生細胞のロ
ーラーボトルでの培養 得られた各アミノ酸置換ｍ−ＰＵＫ産生細胞を、順次ス
ケールアップし、850cm² ローラーボトル(Falcon, 302
7)で培養を行った。細胞増殖中はＦＣＳ（三菱化成、Lo
t.MH01) を10％添加したＭＥＭ−α（Ｗ）を、ハーベス
ト用には、無血清培地〔基礎培地としてＲＰＭＩ１６４
０培地[Goding, J.W (1980) J. Immunol. Methods 39,
285, JAMA 199 (1957)]10.2gを用い、添加物としてイン
シュリン1mg 、ＢＰ（牛肉由来ペプトン）５ｇ、トラン
スフェリン10mg、ＨＳＡ（ヒト血清アルブミン）１ｇ、
ヒポキサンチン13mg、チミジン４mg、α−トコフェロー
ル0.13mgおよびセレン４μｇを加えたもの〕にアプロチ
ニン(Sigma) を10 KIU/ml添加したものを用いた。細胞
は10cmディッシュ１枚分を750cm²ローラーボトル１本に
継代し、さらに 850cm² ローラーボトル１本に継代して
スケールアップした。ローラーボトルで細胞がコンフル
エントになったところで増殖用培地からハーベスト培地
に交換し、培養を続けた。培養上清のハーベストは細胞
のｍ−ＰＵＫ産生量に応じて２日ないしは３日おきに行
った。継代なしに、４〜５回ハーベストを行えるが、さ
らにハーベストが必要なものは継代を行った後にハーベ
ストを行った。なお、培養上清中のＰＡ活性はペプチド
ＭＣＡ法によった。

【００５８】実施例３ アミノ酸置換ｍ−ＰＵＫの精製 培養上清を５μｍフィルター濾過後にZn-chelating Sep
harose カラムクロマトグラフィーで処理した。吸着・
洗浄は、1M NaCl, 20mM Tris-Cl, pH7.5, 10KIU/ml Apr
otininで、溶出は1M NaCl, 20mM Tris-Cl, 50mM Imidaz
ole, pH7.5, 10KIU/ml Aprotininで行った。得られた溶
出画分を抗ＵＫ抗体Formyl Cellulofineカラムクロマト
グラフィーで処理した。吸着・洗浄は、0.5M NaCl, 0.1
M Na-PO₄, pH6.5 で、溶出は0.5M NaCl, 0.2M Glycine-
Cl, pH2.5 で行った。得られた溶出画分をpH6.3 に調整
(2M Tris液) し、0.5M NaCl, 0.1M Na-PO₄,pH6.2 で透
析した。その透析画分をBenzamidine Sepharose カラム
クロマトグラフィーで処理した。吸着・洗浄を、0.5M N
aCl, 0.1M Na-PO₄, pH6.2 で行い、非吸着画分を回収し
た。結果を表２に示す。

【００５９】

【表２】

【００６０】実施例４ フィブリンへの親和性 (i) フィブリンセライトカラムの調製 Husainらの方法を若干変更して行った。 Ａ緩衝液：50mM Sodium Phosphate (pH 7.4), 1mM EDT
A, 100mM NaCl Ｂ緩衝液：50mM Sodium Phosphate (pH 7.4), 1mM EDT
A, 100mM NaCl, 0.2M Arginine Ｃ緩衝液：50mM Sodium Phosphate (pH 7.4), 1mM EDT
A, 100mM NaCl, 0.02%NaN₃ Celite (Hyflo Super-Cel, 半井化学) 10g を１Ｌの蒸
留水に懸濁し、１時間放置した。上清を除去し、再び蒸
留水に懸濁した後に、Celiteをブフナー漏斗に受け、Ａ
緩衝液で洗浄した。CeliteをＡ緩衝液で50mlに懸濁し、
Ａ緩衝液に溶解した２％ Plasminogen-free fibrinogen
（生化学工業社製）溶液50mlを添加した。混合液を30℃
に保ち、攪拌しながら、0.15M NaClに溶解した100 unit
s/ml thrombin ２mlを１分間費やして一滴ずつ添加し
た。さらに30℃で15分間攪拌した。直ちにガラスフィル
ター上で吸引し、100mlのＡ緩衝液で洗浄した。当該操
作をＡ緩衝液またはＢ緩衝液で繰り返し、後にガラスフ
ィルター上で吸引した。次に100ml のＣ緩衝液に懸濁
し、Settled volumeで約５mlのフィブリン−セライトを
カラムに充填し、残りは４℃で保存した。Ａ緩衝液で平
衡化（流速10ml/hr)して、試験に供した。

【００６１】(ii) セライトに結合したフィブリン量の
測定 Settled volumeで1ml のフィブリン−セライトに１Ｎの
NaOHを５mlを加え、90℃で15分間加熱した。室温で冷却
した後、上清の280nm での吸光度を測定した。既知濃度
のフィブリン溶液を同様に処理して得られた検量線から
試料中のフィブリン量を算出した。

【００６２】(iii) サンプルの調製 ｎ−ＰＵＫ（Lot No. T-012)、ΔE₁E₂E₃-PUK (Lot No.
C-006)、３種のｍ−ＰＵＫは5000IU/ml となるように、
使用直前にＡ’緩衝液 [50mM Sodium Phospate(pH 7.
4), 1mM EDTA, 100mM NaCl, 0.1% BSA]にて希釈した。

【００６３】(iv) フィブリン−セライトへの吸着能の
測定 バッチ法により各ＰＵＫに付き３回づつ測定した。測定
手順の概略を以下の通りである。 Ａ’緩衝液による平衡化操作 遠心後のカラム容積が１mlとなるようにフィブリン−セ
ライト緩衝液を15ml遠心管（コーニング、＃25311)に分
注し、卓上遠心機にて1300回転で30秒間遠心し、上清を
除去した。10mlのＡ’緩衝液を添加し、回転機（大洋科
学工業、ローライターII) にて５分間30rpm(回転数目盛
５）で回転し、卓上遠心機にて1300回転で30秒間遠心
し、上清を除去した。 Ａ’緩衝液による洗浄操作 Ａ’緩衝液で5000IU/ml に調製されたＰＵＫサンプルを
500μl 添加し、10分間攪拌した。直ちに10mlのＡ’緩
衝液を添加し、回転機にて５分間30rpm で回転した。後
に卓上遠心機にて1300回転で30秒間遠心、上清を除去し
活性測定用に保存した（パス画分）。 Ｂ’緩衝液による溶出操作 10mlのＢ’緩衝液（0.2M Arginine を含有するＡ’緩衝
液）を添加し、回転機にて５分間30 rpmで回転した。後
に卓上遠心機にて1300回転で30秒間遠心、上清を除去し
活性測定用に保存した（溶出画分）。各上清（10ml) 中
のＰＡ活性を、フィブリン平板法で測定した。

【００６４】(v) フィブリンセライトへの吸着率の計算 ただし、パス画分とはＡ’緩衝液にて洗浄したときの上
清、溶出画分とはＢ’緩衝液にて溶出したきの上清をい
う。吸着率を次式より求める。

【００６５】

【数１】

【００６６】結果を表３に示す。

【００６７】

【表３】

【００６８】実施例５ 変異ヒトＰＵＫの性状 (i) 比活性 比活性は３種の変異ヒトＰＵＫ（Lys¹⁶-PUK 、Lys³⁸-PU
K 、Asn⁴⁵-PUK)ともに15万IU/mg 蛋白（プラスミン処理
時) であった。

【００６９】(ii) 分子量 Laemmli の方法[Nature, 227 p680, (1970)]に基づき、
以下の条件で泳動ＳＤＳ−ＰＡＧＥ(SDS-polyacrylamid
e gel electrophoresis)を行った。180-350IUの各種変
異ヒトＰＵＫを２％2-mercaptoethanol 、２％ＳＤＳ、
10％glycerin、50mM Tris-HCl(pH6.8)の還元溶液中100
℃で10分間煮沸後、10〜20％のグラジエントゲル（第一
化学薬品製）に重層し、30mAの定電流で２時間泳動し
た。なお、分子量マーカーは低分子量マーカー(Phospho
rylase b 94000, bovineserum albumin 67000, ovalubm
in 43000, carbonic anhydrase 30000, trypsin inhibi
tor20100, α-lactalbumin 14400、ファルマシア社製)
を使用した。ゲル上のバンドはCoomassie Brilliant Bl
ue R-250で染色した。その結果、３種の変異ヒトＰＵＫ
ともに、54000 付近に同一のバンドが認められた。ま
た、３種の変異ヒトＰＵＫとも、還元条件および非還元
条件下でバンドの移動は認められず、一本鎖の分子構造
を有することが判明した。

【００７０】(iii) 酵素動力学的検討 材料と方法 試薬類 Glt-Gly-Arg-MCA （以下ＭＣＡと略す）、7-amino-4-me
thyl-Coumarin （以下ＡＭＣと略す）はペプチド研究所
より購入した。ＵＫ標準品、Plasmin は（株）ミドリ十
字社製を用いた。 初期反応速度の測定 30IU/ml の変異ヒトＰＵＫ50μl と0.2CU/mlのプラスミ
ン50μl とを混合後、37℃で10分間インキュベートし
た。前もって37℃に加温した2.0, 0.4, 0.25, 0.2, 0.1
5mM のＭＣＡ溶液50μl を添加した後、37℃で３分間イ
ンキュベートした。40% 酢酸溶液50μl を添加（反応停
止）の後に蛍光強度を測定した。ＡＭＣ（0.2, 5, 10,
20μM)の蛍光強度を測定して検量線を作製し、酵素反応
により生成したＡＭＣの濃度を算出した。 Ｋ_m 値とｋ_cat 値の導出） Lineweaver-Burk plot法[Segei, I. H. (1976) Biochem
ical Calculcations.2nd ed. John Wiley & Sons, In
c., New York.) によりＫ_m 値と、Ｖ_max 値を導入し
た。ＵＫの１ＩＵは1.33×10^-7μmoleに相当するから、
ｋ_cat は下記の式にて代入して算出した。

【００７１】

【数２】

【００７２】 結果各変異ヒトＰＵＫの酵素力学的定
数を表４に示す。

【００７３】

【表４】

【００７４】表４に示したように、各変異ヒトＰＵＫの
酵素力学的定数に顕著な差はなかった。

【００７５】（iv) 血中半減期 実験方法 投与動物 ラットのウィスター系雄性ラット（６週令）を使用し
た。 ¹²⁵I-PUK調製法 各薬剤をlactroperoxidase Enzymobeads(BIO-RAD) 法に
より¹²⁵Iで標識した。得られた ¹²⁵I-PUK の放射化学的
比活性は280nm での吸光度から求めた蛋白含量および放
射活性より算出した。各薬剤の比活性は6000〜10000cpm
/IU であった。 投与量及び投与方法 投与液は各薬剤共非標識の薬剤で２×10⁴IU/ml（ヒトア
ルブミン濃度：５％）に調製し、尾静脈より投与した。
投与容量は１ml/kg とした。 採血法 動物をケタラール（三共）35mg/kg i.m.と、ウレタン
（半井化学）1.5g/kg i.m.の併用で麻酔し、背位に固定
した。左頸動脈に3.8 ％クエン酸ナトリウム水溶液〔チ
トラート、（株) ミドリ十字）〕を満たしたアトム静脈
カテーテル（３Ｆｒ）を挿入した。薬物投与１、２、
３、５、７、10、15、20分後のチトラート30μl を入れ
たＪＭＳ１ｍｌディスポーザブル・シリンジで330 μl
の目盛りまで（血液300 μl)採血した。3000rpm で10分
間遠心して得られた血漿を100 μl 採取し、ドライアイ
ス上で急速に凍結し、血漿の放射能をγ−カウンターで
測定した。 血漿中濃度推移の解析 血漿中放射活性は％of dose として算出した。血中半減
期は、市販のソフトにより算出した。 実験結果 血中半減期の結果は表５に示した。今回新たにスクリー
ニングされた変異ヒトＰＵＫの放射活性からみた血中半
減期はｎ−ＰＵＫと比較して1.2 〜1.4 倍延長し有意な
差を求めた。

【００７６】

【表５】

【００７７】（v) 血栓溶解能 ウィスター系雄性ラットの肺塞栓モデルを用いて実験を
行った。 ¹²⁵I-Fibrin suspension(¹²⁵I-FS )作成法の改良 ラットのクエン酸血漿40mlに¹²⁵-フィブリノゲン約60μ
Ciを加え混和した後、2ml 宛分注した。この2ml にCaCl
₂ およびトロンビンを終濃度がそれぞれ25mMおよび10U
になるように添加して、37℃、30分間インキュベート
し、クロットを作成した。クロットは生理食塩水で洗浄
した後、液体窒素で冷却した乳鉢中で粉砕した。これに
生理食塩水５ｍｌを加え、¹²⁵I-FS とした。 ラットの肺塞栓モデルの作成方法および被験薬剤の
投与方法 体重216 〜263gのラットをウレタン1.25g/kg皮下投与に
より麻酔し、尾静脈より２％ＮａＩ溶液100 μl を注入
した。その後、あらかじめ放射活性を測定した¹²⁵I-FS
１ｍｌを尾静脈より投与し、肺塞栓を作成した。¹²⁵I-F
S 投与５分後に被験薬剤（10万IU/kg)を尾静脈よりbolu
s 投与した( 投与容量はvehicle を用いてすべて1.5ml
になるようにする) 。¹²⁵I-FS 投与60分後、動物を屠殺
し、肺に残存する¹²⁵I- フィブリンの放射活性を測定
し、血栓溶解率を求めた、尚、血栓溶解率は次式により
計算した。

【００７８】

【数３】

【００７９】結果を表６に示す。

【００８０】

【表６】

【００８１】参考例１ ｐＴＴ０６の構築 〔動物細胞での発現を制御できるプロモーター（ＳＶ４
０）及びウロキナーゼ（ＵＫ）プロモーターを上流部に
付加させたジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ)をコード
するＤＮＡを組み込んでなるプラスミドの構築〕

【００８２】(i) ｐＵＫＰ−１の構築：ウロキナーゼ
（ＵＫ）プロモーターをコードするＤＮＡの調製

【００８３】 プローブの作製 ヒトウロキナーゼｃＤＮＡの一部を含むプラスミドｐＵ
Ｋ４（特開昭61-177987 号公報) をPstIで消化して、１
％アガロースゲルで電気泳動後、約400 bpの断片をエレ
クトロエリューションにより回収した。このＤＮＡ断片
0.4 μｇをマルチプライムにより [α- ³²Ｐ]dCTP(アマ
ーシャム, PB10205)でラベルした。 目的分画を集めてCerenkov countを調べた結果、9.69×
10⁷cpmであった。ラベルの収率は41％ラベルの比放射活
性は2.4 ×10⁸ cpm/μｇと計算された。

【００８４】 ＨＫＧ細胞ＤＮＡのサザンハイブリダ
イゼーション Riccio et al.[(Nucl.Acids Res., 13, 2759-2771 (198
5)] の報告によれば、ヒトウロキナーゼプロモーター領
域はヒト染色体ＤＮＡの5.8 kb EcoRI断片及び12 kb の
BamHI 断片として得られる。ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡを
EcoRI 及びBamHI で消化し各10μg を０．８％アガロー
スゲルで電気泳動後、で調製したプローブを用いてサ
ザンハイブリダイゼーションによりこれを確認した。そ
の結果、それぞれのサイズに相当する位置にシグナルが
検出された。

【００８５】 5.8 kb EcoRI断片の調製 ＨＫＧ細胞高分子ＤＮＡ 200μg を1000ユニットのEcoR
I で37℃、一夜消化した。０．８％アガロースゲル（宝
酒造、HE-12 泳動装置）で電気泳動後、エチジウムブロ
マイド染色し、マーカーとして泳動した。λ−ＤＮＡ H
indIII消化物から求めた5.8 kbの位置を中心に２ｍｍ幅
でゲルを切り出し（ゲル２）、更にその上（ゲル１）下
（ゲル３）各３ｍｍ幅についてもゲルを切り出し、エレ
クトロエリューションによりＤＮＡ断片を抽出した。抽
出したＤＮＡの一部を０．８％アガロースゲルで電気泳
動し、サザンハイブリダイゼーションにより目的のＤＮ
Ａ断片が含まれているかどうか確認した。ゲル２から抽
出したＤＮＡ断片中に目的のウロキナーゼプロモーター
領域が存在すると推定された。

【００８６】 ＤＮＡライブラリーの作製とスクリー
ニング 前項で抽出したＤＮＡについてファージベクターλ_gt10
を用いてＤＮＡライブラリーを作製した。合計６．５×
１０⁵ 個の組み換えファージをプラークハイブリダイゼ
ーションにより一次スクリーニングした。一次スクリー
ニングで28個のポジティブクローンが得られた。これを
更にプラークハイブリダイゼーションによる二次スクリ
ーニングしたところ、５個のポジティブクローンに絞ら
れた。ポジティブクローンの組み換えファージより簡易
抽出法でＤＮＡを抽出し、EcoRI消化後、１％アガロー
スゲルで電気泳動し、サザンハイブリダイゼーションを
行った。その結果、２種類の組み換えファージがポジテ
ィブと判定された。クローン１，４，５は同じクローン
由来であり１種類とみなした。クローン１５はこれらと
は別のクローン由来である。

【００８７】 5.8kb EcoRI 断片のサブクローニング サザンハイブリダイゼーションでポジティブと判定され
たクローンよりファージＤＮＡを簡易抽出法にて調製
し、 EcoRI消化した。これをフェノールクロロホルム抽
出し、水相を更にクロロホルム抽出後エタノール沈澱し
た。プラスミドｐＵＣ９（Pharmacia 社）を EcoRI消化
後アルカリフォスファターゼ処理し、その一部（１μ
ｇ）と上記ファージＤＮＡの EcoRI消化物をライゲーシ
ョンし、 E.Coli HB101 を形質転換させた。形質転換菌
のいくつかについて簡易抽出法にてプラスミドＤＮＡを
抽出し、 EcoRI消化後１％アガロースゲルで電気泳動し
た。その結果、いくつかのサブクローンが5.8 kbに相当
するＤＮＡ断片を有していた。これらのクローン１と４
を更に各種制限酵素で消化後１％アガロースゲルで電気
泳動した。クローン１と４は切断様式は異なったもの
の、いくつかの共通する断片も見られたので5.8 kb断片
が逆方向に挿入されたものと推定された。それぞれのプ
ラスミドをｐＵＫＰ１（図１１参照）及びｐＵＫＰ２と
命名した。

【００８８】 ｐＵＫＰ１の制限酵素処理 Riccio等（前述）が報告したヒトウロキナーゼ遺伝子の
塩基配列から推定した制限酵素切断部位地図を基に、こ
の図から推定される酵素断片が得られるかどうかを確認
した。ｐＵＫＰ１を有するE.coli HB101を40μｇ/ml ア
ンピシリン含有スーパーブロス100 mlで37℃、一夜培養
後、ミニプレップ法にてプラスミドＤＮＡを調製した。
このＤＮＡについて各種制限酵素処理を行った。また、
プラスミドについて推定される制限酵素断片はすべて検
出され、目的のヒトウロキナーゼプロモーター部位をコ
ードするＤＮＡ断片がクローニングされたことが確認さ
れた。

【００８９】 ｐＵＫＰ１の一部塩基配列の確認 前項で調製したプラスミドＤＮＡについてダイデオキシ
法にて塩基配列の一部を調べた結果、Riccio等の報告
（前述）と一致した。

【００９０】(ii) ｐＴＴ０６の構築 〔ＵＫプロモーター，DHFR cＤＮＡ, ＳＶ４０ポリＡを
含むプラスミドの構築〕図１２にプラスミド構築の概要
を示した。pSV2-dhfr （特開昭63-105675 号公報）をPv
uII, PstIで処理して得たＳＶ４０エンハンサー・プロ
モーター、dhfrcＤＮＡ, ＳＶ４０ late ポリＡ付加シ
グナルを含む2.5 KbのＤＮＡ断片をさらにHindIII で切
断しＳＶ４０エンハンサー・プロモーターを除いた2.1
KbのＤＮＡ断片を得た。このHindIII- PstI ＤＮＡ断片
をＴ４ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端化した後、ｐＵＣ
１９（宝酒造）のSmaI切断部位にクローニングした。そ
の結果、dhfr cＤＮＡの５’側（タンパクのＮ末側）が
ｐＵＣ１９のポリリンカーのHindIII の方を向いたｐＴ
Ｔ０４が得られた。プラスミドの確認はBamHI 消化によ
りｐＵＣ１９のポリリンカー中のBamHIとＳＶ４０ポリ
Ａ付加シグナルの下流にあるBamHI で切り出されるＤＮ
Ａ断片の大きさにより行った。ｐＴＴ０４からは1.6 kb
のDNA 断片が得られた。次に、ｐＵＫＰ−１をHpaIとSm
aIで切断し、ウロキナーゼ遺伝子転写開始点より下流約
30 bp のSmaI認識部位と転写開始点より上流約800 bpの
HpaI認識部位より切り出される約800 bpのDNA 断片を回
収した。このＵＫプロモーター部位を含むＤＮＡ断片を
ｐＴＴ０４のＤＨＦＲ cＤＮＡの上流に挿入した。すな
わちｐＴＴ０４をXbaIで消化後、ＢＡＰ処理、Ｔ₄ ＤＮ
Ａポリメラーゼで平滑末端化し、ＵＫプロモーターのHp
aI−SmaI断片とライゲーションを行った。トランスフォ
ーメーション後、得られたコロニーよりＤＨＦＲ遺伝子
とＵＫプロモーターが同じ転写方向を向いたクローンを
選択した。ｐＴＴ０４からはＵＫプロモーターＤＮＡ断
片の５’近傍のEcoRV とｐＵＣ１９のSalIでの切断で 2
80 bpのＤＮＡ断片を与えるプラスミドを選び、ｐＴＴ
０６とした。プラスミドはさらに、 EcoRV＋SacI, EcoR
V ＋BamHI の切断によりその構造を確認した。ｐＴＴ０
６の EcoRV, SacI消化では、0.9, 1.8, 2,9 kbの断片
が、EcoRV, BamHI消化では0.6, 1.6, 3.5 kbの断片が得
られた。これらの断片のサイズは、目的とするプラスミ
ドの制限酵素地図と一致した。

【００９１】

【配列表】配列の長さ：１２３６ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：両形態 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：ヒト 配列の特徴 特徴を示す記号：ＣＤＳ 存在位置：１−１２３３ 特徴を決定した方法：Ｅ 他の特徴：ＰＵＫのＥＧＦ領域は１０番目のAsn から４
９番目のThr までである。このＥＧＦ領域は１０番目の
Asn から１９番目のCys までの第１ループ、２０番目の
Val から３１番目のCysまでの第２ループ、３３番目のC
ys から４２番目のCys までの第３ループから成る。 配列 AGC AAT GAA CTT CAT CAA GTT CCA TCG AAC TGT GAC TGT CTA AAT GGA 48 Ser Asn Glu Leu His Gln Val Pro Ser Asn Cys Asp Cys Leu Asn Gly 5 10 15 GGA ACA TGT GTG TCC AAC AAG TAC TTC TCC AAC ATT CAC TGG TGC AAC 96 Gly Thr Cys Val Ser Asn Lys Tyr Phe Ser Asn Ile His Trp Cys Asn 20 25 30 TGC CCA AAG AAA TTC GGA GGG CAG CAC TGT GAA ATA GAT AAG TCA AAA 144 Cys Pro Lys Lys Phe Gly Gly Gln His Cys Glu Ile Asp Lys Ser Lys 35 40 45 ACC TGC TAT GAG GGG AAT GGT CAC TTT TAC CGA GGA AAG GCC AGC AGT 192 Thr Cys Tyr Glu Gly Asn Gly His Phe Tyr Arg Gly Lys Ala Ser Thr 50 55 60 GAC ACC ATG GGC CGG CCC TGC CTG CCC TGG AAC TCT GCC ACT GTC CTT 240 Asp Thr Met Gly Arg Pro Cys Leu Pro Trp Asn Ser Ala Thr Val Leu 65 70 75 80 CAG CAA ACG TAC CAT GCC CAC AGA TCT GAT GCT CTT CAG CTG GGC CTG 288 Gln Gln Thr Tyr His Ala His Arg Ser Asp Ala Leu Gln Leu Gly Leu 85 90 95 GGG AAA CAT AAT TAC TGC AGG AAC CCA GAC AAC CGG AGG CGA CCC TGG 336 Gly Lys His Asn Tyr Cys Arg Asn Pro Asp Asn Arg Arg Arg Pro Trp 100 105 110 TGC TAT GTG CAG GTG GGC CTA AAG CCG CTT GTC CAA GAG TGC ATG GTG 384 Cys Tyr Val Gln Val Gly Leu Lys Pro Leu Val Gln Glu Cys Met Val 115 120 125 CAT GAC TGC GCA GAT GGA AAA AAG CCC TCC TCT CCT CCA GAA GAA TTA 432 His Asp Cys Ala Asp Gly Lys Lys Pro Ser Ser Pro Pro Glu Glu Leu 130 135 140 AAA TTT CAG TGT GGC CAA AAG ACT CTG AGG CCC CGC TTT AAG ATT ATT 480 Lys Phe Gln Cys Gly Gln Lys Thr Leu Arg Pro Arg Phe Lys Ile Ile 145 150 155 160 GGG GGA GAA TTC ACC ACC ATC GAG AAC CAG CCC TGG TTT GCG GCC ATC 528 Gly Gly Glu Phe Thr Thr Ile Glu Asn Gln Pro Trp Phe Ala Ala Ile 165 170 175 TAC AGG AGG CAC CGG GGG GGC TCT GTC ACC TAC GTG TGT GGA GGC AGC 576 Thr Arg Arg His Arg Gly Gly Ser Val Thr Tyr Val Cys Gly Gly Ser 180 185 190 CTC ATC AGC CCT TGC TGG GTG ATC AGC GCC ACA CAC TGC TTC ATT GAT 624 Leu Ile Ser Pro Cys Trp Val Ile Ser Ala Thr His Cys Phe Ile Asp 195 200 205 TAC CCA AAG AAG GAG GAC TAC ATC GTC TAC CTG GGT CGC TCA AGG CTT 672 Tyr Pro Lys Lys Glu Asp Tyr Ile Val Tyr Leu Gly Arg Ser Arg Leu 210 215 220 AAC TCC AAC ACG CAA GGG GAG ATG AAG TTT GAG GTG GAA AAC CTC ATC 720 Asn Ser Asn Thr Gln Gly Glu Met Lys Phe Glu Val Glu Asn Leu Ile 225 230 235 240 CTA CAC AAG GAC TAC AGC GCT GAC ACG CTT GCT CAC CAC AAC GAC ATT 768 Leu His Lys Asp Tyr Ser Ala Asp Thr Leu Ala His His Asn Asp Ile 245 250 255 GCC TTG CTG AAG ATC CGT TCC AAG GAG GGC AGG TGT GCG CAG CCA TCC 816 Ala Leu Leu Lys Ile Arg Ser Lys Glu Gly Arg Cys Ala Gln Pro Ser 260 265 270 CGG ACT ATA CAG ACC ATC TGC CTG CCC TCG ATG TAT AAC GAT CCC CAG 864 Arg Thr Ile Gln Thr Ile Cys Leu Pro Ser Met Tyr Asn Asp Pro Gln 275 280 285 TTT GGC ACA AGC TGT GAG ATC ACT GGC TTT GGA AAA GAG AAT TCT ACC 912 Phe Gly Thr Ser Cys Glu Ile Thr Gly Phe Gly Lys Glu Asn Ser Thr 290 295 300 GAC TAT CTC TAT CCG GAG CAG CTG AAG ATG ACT GTT GTG AAG CTG ATT 960 Asp Tyr Leu Tyr Pro Glu Gln Leu Lys Met Thr Val Val Lys Leu Ile 305 310 315 320 TCC CAC CGG GAG TGT CAG CAG CCC CAC TAC TAC GGC TCT GAA GTC ACC 1008 Ser His Arg Glu Cys Gln Gln Pro His Tyr Tyr Gly Ser Glu Val Thr 325 330 335 ACC AAA ATG CTG TGT GCT GCT GAC CCA CAG TGG AAA ACA GAT TCC TGC 1056 Thr Lys Met Leu Cys Ala Ala Asp Pro Gln Trp Lys Thr Asp Ser Cys 340 345 350 CAG GGA GAC TCA GGG GGA CCC CTC GTC TGT TCC CTC CAA GGC CGC ATG 1104 Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Ser Leu Gln Gly Arg Met 355 360 365 ACT TTG ACT GGA ATT GTG AGC TGG GGC CGT GGA TGT GCC CTG AAG GAC 1152 Thr Leu Thr Gly Ile Val Ser Trp Gly Arg Gly Cys Ala Leu Lys Asp 370 375 380 AAG CCA GGC GTC TAC ACG AGA GTC TCA CAC TTC TTA CCC TGG ATC CGC 1200 Lys Pro Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser His Phe Leu Pro Trp Ile Arg 385 390 395 400 AGT CAC ACC AAG GAA GAG AAT GGC CTG GCC CTC TGA Ser His Thr Lys Glu Glu Asn Gly Leu Ala Leu *** 405 410

【図面の簡単な説明】

【図１】ｐＳＶ−Ｇ₁ −ｐｒｅＵＫ，ｐＵＨ７及びｐＴ
Ｔ０６の構造を示す。

【図２】SD16 (32mer)の配列と導入した変異を示す。

【図３】一本鎖ＤＮＡ、ｓｐＴＴ１０の構築工程を示
す。

【図４】ＤＨＦＲ及びΔE₁E₂E₃-PUK発現ユニットを持つ
プラスミドの構築工程を示す。

【図５】ｐＭＲ３２７の構築手順の概略を示す。

【図６】SD13 (33mer)の配列と導入した変異を示す。

【図７】ｐＭＲ３１７の構築手順の概略を示す。

【図８】SD30 (45mer)の配列と導入した変異を示す。

【図９】ｐＭＲ３７１の構築手順の概略を示す。

【図１０】ｐＭＲ３７１の構築手順の概略（続き）を示
す。

【図１１】ｐＵＫＰ１の構造を示す。

【図１２】ｐＴＴ０６の構築手順の概略を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁵ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 天辻 康夫 大阪府枚方市招提大谷２丁目25番１号 株 式会社ミドリ十字中央研究所内

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグ
   ロースファクター（epidermal growth factor)領域内の
   中性アミノ酸を塩基性アミノ酸に置換、または酸性アミ
   ノ酸を非酸性アミノ酸に置換した変異ヒトプロウロキナ
   ーゼ。
2. 【請求項２】 請求項１の変異ヒトプロウロキナーゼを
   コードするＤＮＡ配列。
3. 【請求項３】 請求項２のＤＮＡ配列が組み込まれたプ
   ラスミド。
4. 【請求項４】 請求項３のプラスミドによって形質転換
   された宿主。
5. 【請求項５】 請求項４の宿主を培養して変異ヒトプロ
   ウロキナーゼを発現することを特徴とするヒトプロウロ
   キナーゼの製造方法。