NO179874B

NO179874B - Fremgangsmåte for fremstilling av en t-PA-analog, DNA-sekvens som koder for t-PA-analogen, samt ekspresjonsvektor omfattende DNA-sekvensen og vertcelle omfattende denne

Info

Publication number: NO179874B
Application number: NO882454A
Authority: NO
Inventors: Eileen R Mulvihill; Patrick J O'hara; Bjoern A Nexoe; Shinji Yoshitake; Yasunori Ikeda; Suguru Suzuki; Akira Hashimoto; Teruaki Yuzuriha
Original assignee: Zymogenetics Inc; Novo Nordisk As; Eisai Co Ltd; Novo Industri As
Priority date: 1987-06-04
Filing date: 1988-06-03
Publication date: 1996-09-23
Also published as: US5403734A; EP0293936B1; ES2069536T3; JPH0448434B2; FI101306B; IE67036B1; NO179874C; CA1341446C; JPS6485079A; AU1743088A; DK302388D0; FI882627A0; NZ224914A; IE881680L; FI101306B1; EP0293936A2; DK302388A; NO882454L; DE3853100D1; KR0135427B1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for produksjon av fibrinolytiske agenser. Mere spesifikt vedrører den fremgangsmåte for fremstilling av en t-PA-analog inneholdende vekstfaktorområdet til naturlig t-PA, hvilket område har cysteinresten nr. 84 i naturlig t-PA erstattet med serin eller alanin, hvori analogen eventuelt videre inneholder en substitusjon på minst én aminosyrerest innenfor 13 aminosyre-rester fra spaltnings-setet, hvilken substitusjon fører til en øket resistens mot spaltning med plasmin, hvori analogen eventuelt inneholder 2 kringlestrukturer, hvorav minst én mangler karbohydrat, eller hvori analogen inneholder en kringlestruktur som stammer fra plasminogen.

Hemostase opprettholdes ved et komplekst samspill av flere forskjellige enzymer. Blodlevringsfaktorer samvirker i en "kaskade" av aktiveringstrinn som til slutt fører til dannelsen av et fibrinkoagel. Påfølgende nedbrytning av fibrinkoagelen utføres av det fibrinolytiske systemet, som involverer serin-proteaseplasminet, et proteolytisk enzym som bryter ned fibrin. Plasmin er en bredspektret protease som også spalter visse koagulasjonsfaktorer, og derved inaktiverer dem. Produksjon av plasmin fra dets inaktive forløper, plasminogen, kommer i stand ved vevs-plasminogenaktivator (t-PA), en fibrin-spesifikk serin-protease som antas å være den fysiologiske vaskulære aktivator for plasminogen. Plasminogenaktivator av urokinase-typen (u-PA) er et annet medlem av klassen av plasminogen-aktivatorer som karakteriseres som serin-proteaser. t-PA og u-PA lar seg adskille funksjonelt og immunologisk. Dersom det normale hemostatiske systemet blir forstyrret, kan koagel dannes på ubeleilige tider og steder, og lede til myokardialt infarkt, trombose i dype vener, pulmonær embolisme og slag. Ødelagt vev som skriver seg fra disse tilstandene kan resultere i død eller alvorlig uførhet.

t-PA sirkulerer vanligvis som en enkel polypeptidkjede av Mr « 72000 dalton, som omdannes til en to-kjedet form ved spalting av en peptidbinding mellom aminosyrene 275 (Arg) og

276 (Ile). Den tunge kjeden av t-PA (to varianter av Mr 40000 og 37000) avledes fra amino-terminus, mens den lette kjeden (Mr 33000) avledes fra karboksyterminal-enden av t-PA molekylet. Denne spaltingen katalyseres av trypsin eller plasmin, og følges av en økning i aktivitet, som måles ved å bruke syntetiske substrater, og ved en økning i fibrinolytisk aktivitet. Enkel-kjedet t-PA blir aktivt ved binding til fibrin, antagelig på grunn av en konformasjonsforandring i aktivatoren forårsaket av bindingen til fibrin. Spaltningen til den to-kjedete formen kan følges av en rask klarering av t-PA fra blodstrømmen, men motstridende rapporter er blitt publisert om dette (se Wallen et al., Eur. J. Biochem. 132:681-686, 1983), og klareringsmekanismen forstår man dårlig.

En to-dimensjonal modell av det potensielle forløper t-PA proteinet er blitt etablert (Ny et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U.S.A. 81:5355-5359, 1984). Ut fra denne modellen ble det bestemt at den tunge kjeden inneholder to trippel-disulfid-strukturer kjent som "kringler". Lignende kringlestrukturer finnes også i protrombin, plasminogen og urokinase, og antas å være viktige for binding til fibrin (Ny et al., ibid.). Den andre kringlen (K2) i t-PA antas å ha større affinitet for fibrin enn den første kringlen (Kl) (Ichinose, Takio og Fujikawa, J. Clin. Invest. 78:163-169, 1986; Verheijen et al., EMBO J. 5:3525-3530. 1986).

I tillegg inneholder den tunge kjeden av t-PA et "vekstfaktor" domene, en trippel disulfid-bundet struktur som er homolog med epidermal vekstfaktor og med lignende domener i protein C, faktor VII, faktor IX og faktor X. Vekstfaktor-domenet i naturlig t-PA omfatter om lag aminosyrene 48-90.

Det er blitt funnet at vekstfaktordomenet deltar i den raske in vivo klareringen av t-PA, og at delesjonen av vekstfaktor-domenet hverken forhindrer bindingen av det resulterende molekylet til fibrin eller blokkerer dets evne til å aktivere plasminogen.

Den tunge kjeden i t-PA inneholder også et "finger" domene som er homologt med fingerdomenene i fibronektin. Fibronektin utviser flere biologiske aktiviteter, omfattende fibrinbinding; dets fibrinbindende aktivitet er blitt korrelert til fire eller fem av dets ni fingerdomener.

Den lette kjeden i t-PA inneholder det aktive setet for serinprotease-aktivitet (serinproteasedomenet), som er i høy grad homologt med de aktive setene i andre serinproteaser.

Forløperformen av t-PA omfatter i tillegg en pre-region som etterfølges nedstrøms av en pro-region, som kollektivt refereres til som "pre-pro"-regionen. Pre-regionen inneholder et signalpeptid som er viktig for sekresjon av t-PA fra vaskulære endoteliale celler (Ny et al., ibid.). Pre-sekvensen antas å være ansvarlig for sekresjon av t-PA til lumen i det endoplasmatiske retikulum, et nødvendig trinn i ekstracellulær sekresjon. Pro-sekvensen antas å bli spaltet fra t-PA molekylet etter transport fra det endoplasmatiske retikulum til Golgi-apparatet.

Bruken av t-PA til fibrinolyse hos dyr og mennesker har kastet lys over flere mangler ved det naturlige molekylet.

Det er blitt vist at halveringstiden av t-PA in vivo er så kort som tre minutter hos mennesker (Nilsson et al., Scand. J. Haematol. 33:49-53, 1984). Injisert t-PA blir raskt klarert av leveren, g i løpet av 3 0 minutter er mesteparten av de injiserte materialer metabolisert til lavmolekylære former. Denne korte halveringstiden kan resultere i et behov for høye terapeutiske doseringer. Typisk administreres naturlig t-PA i en dose på 30 til 150 mg pr. pasient, og den lave løseligheten av proteinet gjør det nødvendig å forlenge infusjonen. Fuchs et al., (Blood 65:539:544, 1985) konkluderte at infusert t-PA klareres av leveren i en prosess som er uavhengig av det proteolytiske setet, og at infusert t-PA ikke vil akkumulere i kroppen; dvs. at klareringsmekanismen ikke kan mettes. Dessuten er doser av t-PA som er tilstrekkelig til å bryte ned koronære trombi, langt større enn normalt fysiologisk nivå, og kan forårsake aktivering av plasminogen i hele kroppen, og føre til systemisk nedbrytning av fibrinogen (Sherry, ibid.), som fører til farlige blødningsepisoder.

Forskjellige forskere har modifisert t-PA i forsøk på å gjøre det bedre klinisk egnet. Rosa og Rosa (International

Patent søknad WO 86/01538) modifiserte Lys i stilling 277 i t-PA for å stabilisere enkeltkjedeformen av t-PA. Ile (277) t-PA produsert i E.coli ble funnet å være mindre aktivt som enkelt-kjedemolekyl enn sammenlignet med naturlig t-PA. Wallen et al., (ibid.) postulerte at dette lysin-residuet kan være ansvarlig for proteolytisk aktivitet av enkeltkjedet t-PA. Heyneker og Vehar (Publisert Britisk patentsøknad nr. 2.173.804) åpenbarer aminosyresubstitusjoner omkring spaltningssetet for t-PA. En variant t-PA omfattende Glu i posisjon 275 ble vist å ha større spesifikk aktivitet enn sammenlignet med naturlig t-PA. Denne varianten av t-PA dannet også færre komplekser med t-PA inhibitor. Den enkelt-kjedete formen ble også vist å ha større affinitet for fibrin enn den to-kjedete formen. Robinson (WO 84/01786) brukte enzymatiske midler for å fjerne karbohydrat-sidekjeder fra t-PA for å øke halveringstiden for plasma. Lau et al., (Bio/Techonolgy 5:953, 1987) åpenbarer en t-PA variant som mangler karbohydrat i posisjon 451. Van Zonneveld et al.

(Proe. Nati. Aca. Sei. USA. 83:4670:4674, 1986) åpenbarer modifiserte former av t-PA hvori deler av den tunge kjeden er blitt deletert. Robinson et al (EP 207.589 Al) åpenbarer mutante former av t-PA hvori vekstfaktordomenet er blitt deletert eller på annen måte modifisert. Larsen et al., (WO 87/04722) åpenbarer t-PA-lignende proteiner med aminosyre-substitus joner og/eller delesjon. Ehrlich et al.

(Fibrinolysis 1:75, 1987) åpenbarer et rekombinant t-PA molekyl som mangler kringledomenene. Disse variantformene av t-PA løser allikevel ikke fullstendig de problemene som henger sammen med det naturlige proteinet.

Det er fortsatt et behov på dette fagområdet for et plasminogenaktiverende protein med en lang halveringstid og høy spesifisitet for fibrin. Den foreliggende oppfinnelsen fyller dette behovet ved å tilveiebringe nye derivater av vevsplasminogenaktivator hvori vekstfaktordomenet er blitt strukturelt forandret. t-PA analogene som er beskrevet heri, har betydelige fordeler over naturlig t-PA som terapeutiske fibrinolytiske agenser ved å tillate bruk av mye lavere doser, og således løse problemene med lav løselighet av naturlig t-PA, og potensielt tillate administrasjon ved injeksjon i stedet for infusjon. Ved bruk av rekombinant DNA-teknologi, tilveiebringes en konsistent og homogen kilde for disse proteinene. Proteinene kan anvendes for å nedbryte eksisterende blodpropper ved hjerteattakk og slagtilfeller, og hos andre hvor behovet for å lyse eller undertrykke dannelsen av fibrinmatriser er terapeutisk ønskelig.

Kort sagt åpenbarer den foreliggende oppfinnelsen en fremgangsmåte for fremstilling av vevs-plasminogenaktivator-analoger som inneholder vekstfaktordomenet fra naturlig t-PA, hvilket område har cysteinresten nr. 84 i naturlig t-PA erstattet med serin eller alanin, hvori analogen eventuelt videre inneholder en substitusjon på minst én aminosyrerest innenfor 13 aminosyre-rester fra spaltnings-setet, hvilken substitusjon fører til en øket resistens mot spaltning med plasmin, hvori analogen eventuelt inneholder 2 kringlestrukturer, hvorav minst én mangler karbohydrat, eller hvori analogen inneholder en kringlestruktur som stammer fra plasminogen, karakterisert ved at man (1) dyrker en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende DNA som koder for denne t-PA-analog og

(2) isolerer den resulterende t-PA-analog.

I en spesiell foretrukket utførelse er cystein-residuet nr. 84 i naturlig t-PA og aminosyren er serin.

DNA-sekvenser som koder for t-PA analogene og plasminogen-aktivatorene som er beskrevet ovenfor, hvilke inneholder vekstfaktorområdet for naturlig t-PA, hvilket område har cysteinresten i posisjonen 84 erstattet med serin eller alanin, såvel som ekspresjonsvektorer som inneholder slike DNA-sekvenser, er også åpenbart. Foretrukne ekspresjonsvektorer i denne sammenheng er Zem99-9l00 eller Zem99-9200.

Vertsceller som er transfektert eller transformert med en slik ekspresjonsvektor er også åpenbart. Vertscellen kan være E.coli eller en vertscelle fra pattedyr, så som BHK-verts-

celler.

Disse og andre aspekter ved den foreliggende oppfinnelsen vil bli åpenbaret ved referanse til den følgende detaljerte beskrivelsen og de vedlagte tegningene. Figur 1 viser den sekvensen som koder for pre-pro t-PA, og som er konstruert fra cDNA og syntetiserte oligonukleotider, sammen med aminosyresekvensen for det proteinet som den koder for. Tallene over linjene viser til nukleotidposisjonen, og tallene under linjene viser til aminosyre-posisj onen.

Figur 2 viser konstruksjonen av vektoren Zem99.

Figur 3 viser konstruksjonen av vektorene Zem2l9b og Zem2l9c. Figur 4 viser konstruksjonen av vektorene Zem99-9100 og Zem99-9200. Figur 5 viser nukleotidsekvensen for den mutante DNA-sekvensen i Zem99-9100, sammen med aminosyresekvensen for den t-PA analogen som den koder for. Tallene viser til aminosyre-posisj onene. Figur 6 viser nukleotidsekvensen for den mutante DNA-sekvensen i Zem99-92 00, sammen med aminosyresekvensen for den t-PA analogen som den koder for. Tallene viser til aminosyre-posisjonene. Figur 7 viser konstruksjonen av vektorene ZpL5 og ZpL7. Figur 8 illustrerer visse sekvenssubstitusjoner for vekstfaktordomenet, sammen med kombinasjonene av oligonukleotider som koder for de chimere domenene. Figur 9 viser konstruksjonen pMH-serien av ekspresjons-vektorer som omfatter DNA-sekvenser som koder for plasminogen-aktivatorer med forandrede aktiveringsseter. Figur 10(A)-(I) viser aminosyresekvensene i fingerdomenet i naturlig t-PA og i konsensus fingerdomener. Figur 11 viser aminosyresekvensen og DNA-sekvensen i Kl domenet i plasminogen. Figur 12 viser partielle restriksjonskart for klonene #1-3 og #8-5, som koder for deler av Kl-domenet i plasminogen.

Figur 13 viser konstruksjonen av plasmid pPKA.

Figur 14 viser konstruksjonen av en vektor som inneholder

sekvensen som koder for plasminogen Kl.

Figur 15 viser konstruksjonen av plasmid Zem99-2020. Figur 16 viser konstruksjonen av plasmidene Zem99-8000 og

Zem99-8100. Figurene 17 og 18 viser cDNA-sekvensene og aminosyresekvensene for representative t-PA analoger. Figur 19 viser resultatene av en undersøkelse av nedbrytning av koagel på naturlig t-PA og representative t-PA analoger fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse. ( ) indikerer naturlig t-PA, analog #9100, (-"-) analog #9200. Figur 20 viser et diagram av plasmanivå over tid for naturlig t-PA og en representativ t-PA analog som ble admini-strert til rotter. Anvendte symboler er 0, analog 9100, Å,

analog 9200; og 0, naturlig t-PA.

Figur 21 viser resultatene av studier over plasma-halverings-tid for naturlig t-PA og tre representative t-PA mutanter. Figurene 22A, B og C beskriver en sammenligning av aminosyresekvensene for vekstfaktordomener i flere forskjellige utvalgte proteiner. Sekvensene identifiseres som følger: TPA, naturlig vevsplasminogenaktivator; Urok, urokinase; F7, faktor VII; F9, faktor IX; F10, faktor X; PS, protein S; PZ, protein Z; EGF, epidermal vekstfaktor; TGFa, transformerende

vekstfaktor alfa; TGFIr, transformerende vekstfaktor type I

(rotte); C9, komplementfaktor 9; LDLr, lav densitets-lipoprotein-reseptor; EGFr, EGF reseptor; PC, protein C. Andre betegnelser er h, human; p, svin=porcine; m, mus;

b, bovin; og rb, kanin = rabbit. For faktorene VII, IX, X og proteinene C, S og Z refererer tallene og supersskript-bokstavene til genexoner. For henholdsvis EGF-reseptor og LDL reseptor indikerer tallene og superskript-bokstavene et spesielt vekstfaktordomene. For eksempel er PC-4h det fjerde exonets vekstfaktordomene i humant protein C; LDLrBrb er lavdensitets lipoproteinreseptor i vekstfaktordomene B hos kanin. Gap (-) er plassert for å maksimere homologiene mellom

proteinene. Aminosyrer er betegnet med standard enkelt bokstavkode.

Før fremsetting av oppfinnelsen, kan det være nyttig for en forståelse av denne, å definere bestemte uttrykk som anvendes heri.

Komplementær DNA eller cDNA: Et DNA molekyl eller en sekvens som er syntetisert enzymatisk fra de sekvensene som er tilstede i en mRNA templat, eller en klon av et slikt molekyl.

DNA konstruksjon: Et DNA molekyl, eller en klon av et slikt molekyl, enten enkelt- eller dobbelt-trådet, som er modifisert ved human intervensjon slik at det inneholder segmenter av DNA kombinert og plassert ved siden av hverandre på en måte som ellers ikke ville eksistere i naturen.

Plasmid eller vektor: En DNA konstruksjon som inneholder genetisk informasjon som sørger for sin replikasjon når den innsettes i en vertscelle. Replikasjonen kan være autonom eller oppnådd ved integrering i vertsgenomet. Et plasmid inneholder vanligvis minst en gensekvens som skal uttrykkes i vertscellen, såvel som sekvenser som koder for funksjoner som letter en slik genekspresjon, omfattende promotorer, initiasjons-seter for transkripsjon og transkripsjons-terminatorer. Det kan være et lineært molekyl eller et lukket, sirkulært molekyl.

Pre-pro region: En aminosyresekvens som vanligvis forekommer i amino-terminalene i forløperene for visse proteiner, og som vanligvis er spaltet fra proteinet, i det minste delvis, under sekresjon. Pre-pro regionen omfatter delvis sekvenser som styrer proteinet inn i cellens sekretoriske utskillingsvei, og inneholder vanligvis en region som er rik på hydrofobe aminosyrer.

Domene: En tre-dimensjonal, selvorganiserende ansamling av aminosyrer i et proteinmolekyl, som inneholder strukturelle elementer som er nødvendig for en spesifikk biologisk aktivitet av dette proteinet.

Biologisk aktivitet: Funksjonen eller sett av funksjoner som utføres av et molekyl i biologisk sammenheng (dvs. i en organisme, en celle, eller en in vitro faksimile derav). Biologiske aktiviteter av proteiner kan inndeles i katalytiske og effektor-aktiviteter. Katalytiske aktiviteter av fibrinolytiske agenser medfører ofte aktivering av andre proteiner ved spesifikk spaltning av forløpere. I motsetning omfatter effektor-aktiviteter spesifikk binding av det biologisk aktive molekylet til andre molekyler, så som fibrin eller til celler. Effektor-aktiviteten øker ofte, eller er vesentlig for, katalytisk aktivitet under fysiologiske betingelser. Katalytiske og effektor-aktiviteter kan i enkelte tilfeller finnes i det samme domenet av proteinet. For plasminogen-aktivatorer karakteriseres biologisk aktivitet ved omdanningen av av pro-enzymet eller zymogent plasminogen til plasmin, som i sin tur nedbryter fibrinmatriser. Fordi fibrinet virker som en ko-faktor ved aktivering av plasminogen med t-PA, har enkeltkjedet t-PA relativt liten aktivitet i fravær av fibrin.

Plasminogen-aktivator: Et protein som i nærvær av fibrin kan omdanne pro-enzymplasminogenet til plasmin.

Naturlig t-PA: Et protein som har strukturen og den biologiske aktiviteten av vevsplasminogenaktivator som isolert fra humane melanomceller (se EP 0041766 A2). Naturlig t-PA har den samme aminosyresekvensen som t-PA i melanomcellen, eller kan inneholde små variasjoner i sekvensen. Slike variasjoner som skriver seg fra f.eks. genetisk polymorfisme, vil ikke i vesentlig grad forandre strukturen eller aktiviteten av proteinet. Den biologiske aktiviteten av naturlig t-PA karakteriseres ved omdanningen av pro-enzym eller zymogen plasminogenet til plasmin, som i sin tur nedbryter fibrinmatriser. Naturlig t-PA kan isoleres fra celler som naturlig produserer dette, eller det kan fremstilles fra rekombinante celler som er transfektert eller transformert med en DNA-sekvens som koder for naturlig t-PA. Aminosyresekvensen for en representativ naturlig t-PA, er vist i figur 1.

t-PA analog: Et protein som har den karakteristiske biologiske aktiviteten til plasminogenaktivatorer som definert ovenfor, ytterligere karakterisert ved nærvær av en spesifikk kunstig indusert mutasjon i aminosyresekvensen. DNA-sekvensen som koder for en t-PA analog betegnes som en "mutant DNA-

sekvens", og vil vanligvis være i form av et cDNA. Begrepet "spesifikk kunstig indusert mutasjon", omfatter delesjoner, innsetninger og substitusjoner i aminosyresekvensen, som kan innføres ved manipulering av en klonet DNA-sekvens. Vanligvis vil den biologiske aktiviteten av t-PA analogene være målbart forandret i forhold til naturlig t-PA.

Plasma halveringstid: Den tidsperiode som kreves for å eliminere eller inaktivere 50 % av en substans fra blod-strømmen i et dyr. For t-PA, måles plasmahalveringstiden ved å registrere bortfallet av t-PA fra blodstrømmen i et forsøks-dyr, så som en rotte, ved å anvende f.eks. en undersøkelse av enzymbundet immun-sorbens (ELISA, enzyme-linked immunosorbent assay).

Som bemerket ovenfor, er human t-PA et 72000 dalton protein som kan eksistere i en to-kjede form. Proteinet inneholder et antall strukturelle domener som enkeltvis og kollekstivt bidrar til den biologiske aktiviteten av proteinet. Et av disse domenene kalles "vekstfaktor-domenet"

(heretter "GF-domenet") fordi det er homologt med epidermal vekstfaktor (EGF). Hele det ferdigproseserte proteinet inneholder 35 cystein-rester, og 34 av disse deltar i inter-eller intrakjede-disulfidbindinger (Ny et al., ibid.). Syv av disse cysteinene er innenfor GF domenet og er ordnet i tre disulfidbindinger, slik at det syvende cysteinet forblir uparret.

Videre har man som bemerket ovenfor funnet at GF-domenet er ansvarlig for visse begrensninger ved bruk av naturlig t-PA som farmasøytisk medikament. Undersøkelser av oppfinnerne har gitt data som viser at GF-domenet kan være delvis ansvarlig for den raske klareringenav t-PA fra blodsirkulasjonen. Dessuten kan nærværet av en fri sulfhydrylgruppe i GF-domenet, virke til å destabilisere proteinet. Vanligvis vil frie sulfhydrylgrupper av proteiner i løsning ha en tendens til spontan oksydasjon, og kan også danne intermolekylære disulfidbroer, som fører til proteinaggregasjon. Når et protein som har en fri sulfhydrylgruppe brukes som farma-søytisk medikament, kan disse forandringene i fysiokjemiske egenskaper som skriver seg fra frie sulfhydrylgrupper, forandre immunogeniteten eller antigenegenskapene av proteinet, og derfor begrense dets terapeutiske nytteverdi. Denne virkningen er blitt observert for interleukin-2 (Wang et al., Science 224:1431-1433, 1984; og Liang et al., J. Biol. Chem.261:334-337, 1986).

For å ha både fibrinbindende aktivitet og serinprotease-aktivitet vil plasminogenaktivatorene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen inneholde minst et GF-domene, et kringledomene og et serinprotease-domene. Fortrinnsvis vil kringledomenet være K2-domenet i naturlig t-PA. Ytterligere kringledomener kan også inkluderes som diskutert mere i detalj nedenfor. Det er også fordelaktig å inkludere et fingerdomene for å gi større affinitet for fibrin. Et foretrukket fingerdomene er det som finnes i naturlig t-PA.

Oppfinnerne har oppdaget at ved å forandre strukturen av GF-domenet i t-PA, kan man forlenge plasma-halveringstiden for proteinet. En slik forandring innebærer å eliminere en cystein-rest fra GF-domenet i t-PA. Fortrinnsvis fjerner man cysteinresten i posisjon 84, skjønt de andre cysteinrestene i posisjonene 51, 56, 62, 73, 75 og 83 også kan fjernes, enten enkeltvis eller i kombinasjon. I alle fall er det å fore-trekke at det resulterende molekylet ikke har et uparret cystein, av grunner som er diskutert ovenfor. Cysteinrester kan fjernes ved delesjon eller aminosyresubstitusjon, med substitisjon som den foretrukne metoden. I prinsippet kan en hvilken som helst aminosyre substitueres for cystein, skjønt serin og alanin blir foretrukket. En spesielt foretrukket aminosyresubstituent er serin. Andre modifikasjoner av GF-domene sekvensen omfatter substitusjonen av flere hovedsakelig konsekutive aminosyrer i GF-domenet i naturlig t-PA. Aminosyresubstitusjoner foretas i denne regionen med det formål å bryte opp regionen som medvirker til den raske klareringen av t-PA fra plasma, uten drastisk å forandre den potensielle reseptorregionen som ligger innenfor vekstfaktor-domenet. Sløyfestrukturen som er begrenset av aminosyrene 62 og 73, er en primærkandidat for den reseptorbindende regionen fordi den er lite homolog med tilsvarende regioner i andre proteiner som inneholder vekstfaktordomener, og på grunn av dens egenskaper som antyder at den er lokalisert på proteinoverflaten. Det foretrekkes at aminosyresubstitutter velges fra dem som finnes i tilsvarende posisjoner i vekstfaktor-domener i andre proteiner. Programmert forandringer kan eliminere spesifikke reseptorinteraksjoner uten å ødelegge de særtrekkene som tillater domenet å anta sin generelle EGF-lignende konformasjon, omfatter disulfidbinding mellom cystein-parrene 51 og 62, 56 og 73, og 75 og 84. Vanligvis ønsker man å opprettholde denne regionens evne til å virke som et vekstfaktordomene. For dette formålet velges aminosyresubstitusjoner slik at man unngår større forandringer i konformasjon, men med det formål å forandre den kjemiske karakter av en eller flere aminosyrerester i spesielle posisjoner. For eksempel kan det være ønskelig å beholde visse godt beskyttede særtrekk ved vekstfaktordomener. Som vist i fig. 22, kan disse særtrekkene omfatte (a) tilstedeværelsen av sekvensen Asn-Gly-Gly (NGG) umiddelbart i nærheten av den andre cysteinresten i t-PA vekstfaktordomenet; og (b) tilstedeværelsen av sekvensen Cys-X-Cys, hvor X er en hvilken som helst aminosyre, som tilsvarer cysteinrestene fire og fem i det naturlige t-PA vekstfaktordomenet.

Foretrukne substitusjoner omfatter substitusjon av flere hovedsakelig konsekutive aminosyrer fra vekstfaktordomenene fra ett eller flere proteiner med en relativt lang plasma-halverings-tid, så som koagulasjonsfaktorene VII og IX. Dessuten kan mer enn en region av vekstfaktordomenet i naturlig t-PA erstattes med de respektive blokkene av aminosyrer som er diskutert ovenfor. Videre kan man substi-tuere et fullstendig vekstfaktordomene fra et annet protein. Andre substitusjoner gjøres ved å utforme konsensus vekstfaktorsekvenser basert på sekvenser i faktor VII, faktor IX, protein C, epidermal vekstfaktor og andre proteiner som inneholder et vekstfaktordomene. Vekstfaktor-domener finnes også i urokinase, faktor X, protein S, protein Z, lav densitets lipoproteinreseptor, transformerende vekstfaktor, epidermal vekstfaktorreseptor, trombomodulin og trombospondin. En spesielt foretrukket slik konsesus-sekvens er aminosyresekvensen methionin-glutaminsyre-glycin-asparagin-histidin-leucin-alanain-asparagin (MEGNHLAN), som ble substituert for aminosyrene 63-70 i naturlig t-PA. I bestemte foretrukne utførelser, blir cysteinresten som svarer til aminosyreresten 83 i det naturlig t-PA GF-domenet, også erstattet med en annen aminosyre, for å øke stabiliteten av det resulterende molekyl. I prinsippet kan en hvilken som helst aminosyre substitueres for cystein, skjønt serin og alanin blir foretrukket. En spesielt foretrukket aminosyresubstituent er serin.

I tillegg til forandringene i GF-domenet, kan t-PA analogene i den foreliggende oppfinnelsen inneholde ytterligere mutasjoner. Disse mutasjonene kan være aminosyre-substitusjoner, delesjoner eller addisjoner. Mange slike mutasjoner er beskrevet, som diskutert ovenfor. Spesielt foretrukne mutasjoner omfatter substitusjoner av finger-og/eller Kl domener, aminosyresubstitusjoner nær spaltings (aktiverings) setet, fjerning av karbohydrat-tilknytningssetet i Kl domenet eller modifiseringen av karbonhydrattilknytnings-setet i K2 domenet. Slike mutasjoner vil øke den kliniske egnetheten av t-PA analogene. For eksempel kan Kl domenet i naturlig t-PA erstattes med et kringledomene avledet fra et annet protein, for å øke fibrinspesifisiteten av den resulterende analogen. Egnede kringledomener i denne sammenheng omfatter Kl, K2, K3, K4 og K5 domenene i plasminogen, K2 domenet i naturlig t-PA, Kl og K2 domenene i protrombin, og kringledomenet i faktor XII. Kl domenet i plasminogen blir spesielt foretrukket. Modifikasjoner ved aktiveringssetet kan øke koagel-spesifisiteten av t-PA analogen ved å redusere dens følsomhet for proteolytisk spalting med plasmin og/eller ved å tillate spalting ved trombiri. Modifikasjoner av karbohydrat-tilknytningsseter øker uniformiteten av proteinproduktet og øker plasma-halveringstiden. Ved å forandre Asn-restene i de N-bundne glykosyleringssetene (sekvens Asn-X-Ser/Thr, hvor X er en hvilken som helst aminosyre) til en annen aminosyrerest, kan glykosyleringen blokkeres. Det foretrekkes spesielt at Asn-restene blir forandret til Gln-rester. Asn kan også forandres til Ser eller Thr. I tillegg kan andre forandringer innføres i sekvensen med det formål å blokkere glykosyleringen av det proteinet som den koder for. For eksempel kan en prolinrest i den andre posisjonen i sekvensen Asn-X-Ser/Thr hindre glykosyleringen (Marshall, Biochem. Soc. Symp. 40:17-26, 1974). Andre substitusjoner kan også gjøres i denne posisjonen. En tredje aminosyre i et N-bundet glykosylerings-sete kan også forandres, hhv. til Ala, Cys, Gly, Asn eller Gin. Glykosyleringsseter kan forandres individuelt eller i kombinasjon. I en foretrukket utførelse blokkeres karbohydrat addisjon i Asn-117 ved substitusjon av en glutaminrest.

Ifølge den foreliggende oppfinnelsen foretrekkes det å fremstille disse nye proteinene ved bruk av rekombinant DNA-teknologi, ved å anvende cDNA kloner eller genomiske kloner som utgangsmaterialer. Egnede DNA-sekvenser kan også syntetiseres ifølge standard prosedyrer, omfattende auto-matiserte synteser, eller kan skaffes fra kommersielle kilder. Det foretrekkes å bruke cDNA-kloner fordi, ved anvendelse av cDNA av fullstendig lengde som koder for naturlig t-PA som utgangsmateriale for å fremstille modifisert t-PA, fjerner man introner slik at alle eksoner i det naturlige t-PA er tilstede og riktig orientert med hensyn til hverandre. cDNA kan også brukes som templat for delesjon, forandring eller innsetting av sekvenser via oligonukleotid-styrt mutagenese.

Rekombinant DNA-teknologi tillater å øke det fibrinbindende domenet i naturlig t-PA på en grei måte. En slik økning kan oppnås ved innsetting av ytterligere kringlestrukturer, modifisering av kringlestrukturer, addisjon av fingerdomener, eller substitusjon av fingerdomenet. Denne metodologien gir et middel til å velge den optimale kombina-sjonen av funksjonelle domener som finnes i naturlig t-PA eller i beslektede proteiner, og tilveiebringer således fibrinolytiske agenser med øket biologisk aktivitet med hensyn til fibrinbinding og spesifisitet av serinproteaseaktiviteten. Aminosyre-substitusjoner eller delesjoner innføres ved setespesifikk mutagenese ved å anvende den klonete t-PA-sekvensen eller en del derav som templat. Teknikker for oligonukleotidstyrt in vitro mutagenese er alminnelig kjent på dette fagområdet. En foretrukket slik metode er metoden til Zoller og Smith (DNA 3:479-488, 1984).

Aminosyre-substitusjoner utføres fortrinnsvis ved å syntetisere oligonukleotider av passende lengde, fortrinnsvis om lag 3 0 til 50 nukleotider i lengde, og sette dem sammen for å konstruere den ønskede kodesekvensen. Oligonukleotider av denne lengden gjør det mulig å utforme modulære sekvenser som deretter kan arrangeres på en rekke forskjellige måter for å oppnå et stort antall sekvenser totalt sett. Slike kombinasjoner gjøres lettere ved å utforme oligonukleotidene slik at når de parres er de resulterende fragmentendene butte, eller komplementære til fragmentendene på oligonukleotidpar som koder for nabosekvenser. Man vil allikevel forstå at fullstendige GF-substitusjoner kan konstrueres ved å bruke oligonukleotider av full lengde. Oligonukleotider gir ytterligere en fordel ved å tillate en optimalisering av kodon anvendelsen som passer til den valgte typen av vertscelle.

Alternativt kan DNA-sekvenser som koder for GF-substitusjonene skaffes fra cDNA eller genomiske kloner som koder for proteiner som har GF-domener. Kloner med faktor IX (Kurachi og Davie, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:6461-6464, 1982, Anson et al., EMBO J. 3:1053-1060, 1984), faktor VII (Hagen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:2412-2416, 1986), protein C (Foster et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:4673-4677, 1985), og epidermal vekstfaktor (Gray et al., Nature 303:722-725, 1983) er beskrevet. Egnede kloner som koder for disse og andre proteiner kan fremskaffes ved fremgangsmåter som er velkjent for folk som er vanlig dyktige på fagområdet genetisk engineering.

Sekvensene som koder for substitusjonene av GF-domenet, innsettes deretter i t-PA sekvensen i passende restriksjons-seter. I noen tilfeller vil det være nødvendig å bruke in vitro mutagenese for å binde sekvensene sammen på riktig måte. Den muterte sekvensen sammenbindes om nødvendig med den gjenværende delen av sekvensen som koder for t-PA, og den komplette kodingsekvensen innsettes deretter i en ekspresjonsvektor. De mutante sekvensene kan uttrykkes i forskjellige vertsceller, omfattende pattedyrceller, gjær og andre sopper, og bakterier.

Fremstilling av rekombinant t-PA i bakterier, gjær og pattedyrceller er åpenbart av f.eks. Goeddel et al., (EP 93619 Al), Mayhack og Hinnen (EP 143.081 A2), og Gill (EP 174.835 Al). Fremgangsmåter for å transfektere pattedyrceller og for å transformere bakterier og sopp med fremmed DNA er vel kjent på fagområdet. Egnede ekspresjonsvektorer vil omfatte en promotor som er i stand til å styre transkripsjonen av en klonet DNA sekvens i en vertscelle og et funksjonelt terminasjonssete for transkripsjonen.

I noen tilfeller foretrekkes det at ekspresjonsvektorene dessuten omfatter et startpunkt for replikasjonen, så vel som sekvenser som regulerer og/eller øker ekspresjonsnivået, avhengig av den vertscellen som velges. Egnede ekspresjons-vektorer kan avledes fra plasmider, RNA og DNA virus eller cellulære DNA-sekvenser, eller kan inneholde elementer av alle disse.

Foretrukne prokaryote verter som kan brukes til å utføre den foreliggende oppfinnelsen er stammer av bakterien Escherichia coli, skjønt Bacillus og andre slekter også kan brukes. Teknikker for å transformere disse vertene, og for å uttrykke fremmede DNA-sekvenser som er klonet i dem, er vel kjent på fagområdet (se f.eks. Maniatis et el., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982). Vektorer som brukes til å uttrykke fremmed DNA i bakterieverter vil vanligvis inneholde en valgbar markør, så som et gen for antibiotisk resistens, og en promotor som fungerer i vertscellen. Egnede promotorer omfatter trp (Nichols and Yanofsky, Meth. in Enzymology 101:155, 1983), lac (Casadaban et al., J. Bact. 143: 971-980, 1980), TAC (Russel et al., Gene 20:231-243, 1982) og fag y promotorsystemer. Plasmider som er nyttige til å transformere bakterier omfatter pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95-113, 1977), pUC plasmider

(Messing, Meth. in Enzymology 101:20-78, 1983; og Vierira og Messing, Gene 19:259-268, 1982), pCQV2 (Queen, J. Mol. Appl. Genet. 2:1-10, 1983) og derivater derav.

Eukaryote mikroorganismer, så som gjæren Saccharamyces cerevisiae, eller trådsopp omfattende Aspergillus, kan også anvendes som vertsceller. Spesielt foretrukne arter av Aspergillus omfatter A. nidulans, A. niger, A.oryzae, og A. terreus. Teknikker for transformering av gjær er beskrevet av f.eks. Beggs (Nature 275:104-108, 1978). Aspergillus arter kan transformeres ifølge kjente prosedyrer, f.eks. den til Yelton et al. (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:1740-1747, 1984). Ekspresjonsvektorer for bruk i gjær omfatter YRp7 (Struhl et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 76:1035-1039, 1979), YEpl3 (Broach et al., Gene 8:121-133, 1979), pJDB248 og pJDB2l9 (Beggs, ibid.), og derivater derav. Slike vektorer vil vanligvis omfatte en valgbar markør, så som ernæringsmarkøren TRP1, som tillater valg i en vertsstamme som bærer en trpl mutasjon. Foretrukne promotorer for anvendelse i gjærekspre-sjonsvektorer omfatter promotorer fra glykolyttiske gener i gjær (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. 255:12073-12080, 1980; Alber og Kawasaki, J. Mol. Appl. Genet. 1:419-434, 1982; Kawasaki, U.S. patent 4.599.311) eller alkohol dehydrogenase-gener (Young et al., i Genetic Engineering of Microorganisms for Chemicals, Hollaender et al., eds., p. 335, Plenum, New York, 1982; og Ammerer, Meth. in Enzymology 101:192-201, 1983). For å lette rensingen av et modifisert t-PA protein som er fremstilt i en gjærtransformant og for å oppnå en god dannelse av disulfid-bindinger, kanen signalsekvens fra et gjærgen som koder for et sekretert protein bli substituert for t-PA pre-pro-sekvensen. En spesielt foretrukket signalsekvens er pre-pro-regionen i MFal genet (Kurjan og Herskowitz, Cell 30:933-943, 1982; og Singh, EP 123.544).

Høyere eukaryote celler kan også tjene som vertsceller for å utføre den foreliggende oppfinnelsen. Dyrkede pattedyrceller, så som cellelinjene BHK, CHO, NS-1, SP2/0 og J558L, blir foretrukket. Disse og andre cellelinjer er lett til-gjengelige, f.eks. fra The American Type Culture Collection. En spesielt foretrukket vedhengende cellelinje er BHK cellelinjen tk"fcsl3 (Waechter og Baserga, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:1106-1110, 1982), herefter referert til som "tk"HK-celler". Ekspresjons-vektorer for bruk i pattedyrceller vil omfatte en promotor som er i stand til å styre transkripsjonen av et klonet gen som innføres i en pattedyr-celle. Spesielt foretrukne promotorer omfatter SV40 promotoren (Subramani et al., Mol. Cell Biol. 1:854-64, 1981), MT-1 promotoren (Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983), og kappagenpromotoren hos mus (Bergman et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:7041-7045, 1984). I ekspresjonsvektorene finnes også en transkripsjonsterminator, plassert nedstrøms fra innsettingssetet for DNA-sekvensen som skal uttrykkes. En foretrukket terminator er genterminatoren i humant veksthormon (hGH) (DeNoto et al., Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981). I tillegg vil vektorene fortrinnsvis inneholde enhanser-sekvenser som passer til den spesielle verts-cellelinje.

For ekspresjon av mutante t-PA i dyrkede pattedyrceller blir ekspresjonsvektorer som inneholder klonete t-PA-sekvenser innført i cellene ved egnede transfeksjonsteknikker, så som kalsiumfosfat-formidlet transfeksjon (Graham og Van der Eb, Virology 52:456-467, 1973; modifisert av Wigler et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 77:3567-3570, 1980; eller som beskrevet av Loyter et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:422, 1982) eller elektroporasjon (Neumann et al., EMBO J. 1:841-845, 1982). En del av cellene tar opp DNA og beholder den inne i cellen i flere døgn. En liten fraksjon av cellene integrerer DNA i genomet i vertscellen eller beholder DNA i ikke-kromosomale kjernestrukturer. Disse transfektantene kan identifiseres ved kotransfeksjon med et gen som bringer med seg en valgbar fenotype (en valgbar markør). Foretrukne valgbare markører omfatter DHFR genet, som gir cellulær resistens til methotrexat (MTX), en inhibitor for nukleotid-syntesen; eller det bakterielle neomycin resistensgenet, som medfører resistens mot medikamentet G-418, en inhibitor for proteinsyntesen. Etter at vertscellene har tatt opp DNA, anvendes medikamentseleksjon for å velge en cellepopulasjon som uttrykker den valgbare markøren ved et nivå som er høyt nok til å medføre resistens. Valgbare markører kan bæres på den samme vektor som sekvensen som koder for t-PA analogen, eller kan bæres av en separat vektor.

Når man anvender seleksjon av methotrexat, kan man bruke koamplifikasjon for å øke ekspresjonsnivået ved å tilsette høye konsentrasjoner av MTX til kulturmediet ved tidspunktet for begynnende seleksjon, eller ved trinnvis å øke MTX-konsentrasjonen i mediet, etterfulgt av gjentatt kloning ved fortynning av de medikament-resistente cellelinjene. Det finnes variasjoner i evnen til å forsterke og relatere, både til den opprinnelige genomiske konfigurasjonen (dvs. ekstra-kromosomal vs. kromosomal) av de kotransfekterte DNA-sekvensene, og til selve forsterknings-mekanismen, hvori det kan forekomme variable mengder av DNA-rearrangement. Dette bemerkes ved ytterligere forsterkning av kloner som man tidligere har påvist å være stabile. Av denne grunn er det nødvendig å klone ved fortynning etter hvert forsterknings-trinn. Celler som uttrykker DHFR-markøren blir deretter utvalgt og screenet for produksjon av t-PA. Screening kan utføres ved ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), eller ved biologisk aktivitetsundersøkelse.

Plasminogenaktivatorene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse utviser en fibrinolytisk virkning som er ekvivalent med virkningen av naturlig t-PA. Disse proteiner har imidlertid en fordel over naturlig t-PA ved at de kan ha en plasmahalveringstid så mye som fem ganger så lang som halveringstiden for naturlig t-PA, hvilket antyder at de kan være overlegne terapeutiske agenser.

Plasminogenaktivatorene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan anvendes i farmasøytiske blandinger for behandling av trombose. De farmasøytiske blandingene vil omfatte en plasminogenaktivator i kombinasjon med en bærer eller fortynningsmidde1, så som sterilt vann eller steril saltløsning, og kan også omfatte egnede bindemidler og/eller løsningsmidler. De resulterende vandige løsningene kan forpakkes for anvendelse eller filtreres under aseptiske betingelser og frysetørkes, slik at det frysetørkede preparatet blir kombinert med en steril vandig løsning før administrasjon.

Typisk fremstilles en vandig løsning som inneholder 3 g mannitol og IO<6> enheter av t-PA analogen under sterile betingelser. En ml alikvoter av denne løsningen pipetteres i små beholdere, som deretter frysetørkes og forsegles. For injeksjon, kombineres det frysetørkede materiale med 2 ml sterilt vann, som leveres i en forseglet ampulle. Administrasjon er fortrinnsvis ved injeksjon. Proteinene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen kan typisk bli admini-strert i doser på fra om lag 6 mg til om lag 100 mg pr. pasient, avhengig av pasientens vekt og karakteren av den trombe som skal oppløses. Anvendelsen av proteinene fremstilt ifølge den foreliggende oppfinnelsen er dog ikke begrenset til området ovenfor, og dosen kan varieres avhengig av beting-elsene. Bestemmelsen av riktig dose vil være åpenbar for den dyktige praktiker.

De følgende eksemplene gis som illustrasjon, og ikke som begrensning.

EKSEMPLER

Eksempel 1 - Konstruksjon av en t-PA klon i full lengde Sekvensen av en naturlig human t-PA cDNA klon er blitt rapportert (Pennica et al., Nature 301:214-221, 1983). Sekvensen koder for et pre-pro peptid med 32-35 aminosyrer etterfulgt av et 527-530 aminosyre ferdigprosessert protein.

En cDNA klon som omfatter den kodende sekvensen for ferdig prosessert t-PA, ble konstruert ved å bruke som utgangsmateriale mRNA fra Bowes melanom cellelinje (Rijken og Coilen, J. Biol. Chem. 256:7053-7041, 1981). Denne cDNA ble deretter brukt for å konstruere plasmidet pDRl2 96. Escherichia coli stammen JM83 transformert med pDRl296 er deponert hos the American Type Culture Collection under aksesjonsnummer 53347.

Fordi pre-pro sekvensen ikke var tilstede i cDNA klonen pDRl296, ble den konstruert fra syntetiserte oligonukleotider og deretter sammenføyd med cDNA. I den syntetiserte t-PA pre-pro sekvensen ble spaltningsseter for BamHI og Nco I innført umiddelbart 5' til det første kodon (ATG) i pre-pro sekvensen, og et Bgl II (Sau 3A, Xho II) setet ble beholdt i 3' enden av pre-pro sekvensen. Den naturlig forekommende pre-pro sekvensen mangler et beleilig restriksjonssete nær midten; sekvensen GGAGCA (som koder for aminosyrer -20 og -19, Gly-Ala) kan imidlertid forandres til GGCGCC for å fremskaffe et Nar I sete uten å forandre aminosyresekvensen.

For å konstruere pre-pro sekvensen ble følgende oligonukleotider syntetisert ved å bruke en Applied Biosystems Model 380-A DNA synthesizer:

Etter rensing ble oligomerene ZC131 og ZC132 anilert for å fremstille en overlap på 12 basepar (seksjon 1). Oligomerene ZC133 og ZC134 ble anilert på samme måten (seksjon 2). Oligomerene ble blanding i Pol 1 buffer (Bethesda Research Labs), oppvarmet til 65°C i fem minutter, og langsomt avkjølt til romtemperatur i fire timer for å anilere. Ti enheter av DNA polymerase I ble tilsatt, og reaksjonen fortsatte i 2 timer ved romtemperatur. Blandingene ble separert ved elektroforese på en 8 % polyakrylamid-urea sekvensgel ved 1000 volt i 2,5 timer for å størrelses-fraksjonere reaksjonsproduktene. De korrekte størrelses-fragmentene (de hvori polymerasereaksjonen var fullstendig) ble kuttet ut fra gelen og ekstrahert.

Etter anilering, ble seksjon 1 kuttet med Barn HI og Nar I og klonet inn i pUC8 kuttet med Barn HI + Nar I (Vieira og Messing, Gene 19:259-268, 1982; og Messing, Meth. in Enzymology 101:20-77, 1983). Seksjon 2 ble anilert om igjen og kuttet med Nar I og Bgl II og klonet inn i pUC8 kuttet med Barn HI + Nar I. Koloniene ble screenet med de passende merkede oligonukleotidene. Plasmider identifisert som positive ved kolonihybridisering ble sekvensert for å verifisere at den riktige sekvensen var blitt klonet.

Seksjon 1 ble deretter renset fra en Barn HI + Nar I dobbelt spalting av den passende pUC klonen. Seksjon 2 ble renset fra en Nar I + Xho II spalting. De to fragmentene ble sammenføyet på en Nar I setet, og klonet inn i Barn HI - kuttet pUC8 .

t-PA sekvensen i pDRl2 96 ble deretter sammenføyet med den syntetiserte pre-pro sekvensen på følgende måte (figur 2). Plasmidet pICl9R (Marsh et al., Gene 32:481-486, 1984) ble spaltet med Sma I og Hind III. Ori-regionen i SV40 fra kart-posisjon 270 (Pvu II) til posisjon 5171 (Hind III) ble deretter ligert til det lineariserte pICl9R for å fremstille plasmidet Zem67. Dette plasmidet ble deretter spaltet med Bgl II, og terminator-regionen fra det humane veksthormongenet (De Noto et al., Nuc. Acids Res. 9:3719-3730, 1981) ble innsatt som et Bgl- II-Bam HI fragment for å fremstille plasmidet Zem86. Den syntetiserte t-PA pre-pro sekvensen ble fjernet fra pUC8 vektoren ved spalting med Bam HI og Xho II. Dette fragmentet ble innsatt i Bgl II-spaltet Zem86 for å fremstille plasmidet Zem88. Plasmidet pDRl296 ble spaltet med Bgl II og Bam HI og t-PA cDNA fragmentet ble isolert og innsatt i Zem88 kuttet med Bgl II. Det resulterende plasmidet ble betegnet Zem94.

Vektoren Zem99, omfattende MT-1 promotoren, fullstendig t-PA kodende sekvens, og hGH terminatoren, ble deretter sammensatt på følgende måte (figur 2). Et Kpn I-Bam HI fragment omfattende MT-1 promotoren ble isolert fra MThGHl11 (Palmiter et al., Science 222:809-814, 1983) og innsatt i pUCl8 for å konstruere Zem93. Plasmidet MThGHl12 (Palmiter et al., ibid.) ble spaltet med Bgl II og re-ligert for å eliminere den hGH kodende sekvensen. MT-1 promotoren og hGH terminatoren ble deretter isolert som et Eco RI fragment og innsatt i pUCl3 for å konstruere Zem4. Zem93 ble deretter linearisert ved spalting med Bam HI og Sal I. Zem4 ble spaltet med Bgl II og Sal I, og hGH terminatoren ble renset. t-PA pre-pro sekvensen ble fjernet fra. pUC8 vektoren som et Bam HI-Xho II fragment. De tre DNA-fragmentene ble deretter sammenføyd, og et plasmid med Zem97 strukturen (figur 2) ble valgt. Zem97 ble kuttet med Bgl II, og Xho II t-PA fragmentet fra Zem94 ble innsatt. Den resulterende vektoren er Zem99.

Eksempel 2 - Konstruksjon av Zem219c

Vektoren Zem2l9c ble konstruert som vist i figur 3. Plasmidet pSV2-DHFR (Subramani et al., ibid) ble spaltet med Cfo I, og fragmentet som inneholdt DHFR cDNA og de 3' til-knyttede SV4 0 sekvensene ble isolert, reparert og ligert til Bam HI linkere. Etter spalting med Bam HI ble et om lag 800 bp fragment inneholdende den fullstendige cDNA og SV40 terminator-regionen renset og ligert med Bam HI-spaltet pUC8. Zem67 (eksempel 1) ble spaltet med Bgl II og ligert med Bam HI DHFR-SV40 fragmentet for å frembringe plasmidet Zeml76. Plasmidet Zem93 ble spaltet med Sst I og re-ligert for å frembringe plasmidet Zeml06, hvori om lag 600 bp av sekvens 5' til MT-1 promotoren ble eliminert. Plasmidet Zeml06 ble spaltet med Eco RI og ligert med Eco RI fragmentet inneholdende DHFR genet fra plasmidet Zeml76. Det resulterende plasmidet ble betegnet Ztsl3. Plasmidet Ztsl3 ble spaltet med Bam HI og ligert med Bam HI fragmentet fra plasmidet Zem99 inneholdende den fullstendige t-PA kodende regionen og hGH terminator sekvensen. Det resulterende plasmidet blir betegnet Ztsl5. Ztsl5 ble delvis spaltet med Bam HI, reparert og re-ligert for å frembringe plasmidet Zem2l9, hvori 3' Bam HI setet ble destruert. Plasmidet Zem2l9 ble delvis spaltet med Xba I, reparert og re-ligert for å frembringe plasmidet Zem2l9a, hvori 3' Xba I setet ble destruert. Plasmidet Zem2l9a ble spaltet med Bam HI og Xba I, vektorsekvensene renset vekk fra t-PA cDNA sekvensene, og ligert med en oligomer Bam HI-Xba I adaptor for å frembringe vektoren Zem219b. Xho I setet i polylinker-regionen i SV40-DHFR sekvensen i Zem2l9b ble destruert ved spalting med Xho I, reparasjon og religering av de nylig butte endene. Det resulterende plasmidet ble betegnet Zem2l9c.

Eksempel 3 - Erstatning av Cys (83)

Den t-PA kodende sekvensen i Zem99 ble mutagenisert til kode for et serin i posisjon 83 (aminosyre-numrene viser til sekvensen vist i figur 1). Zem99 ble spaltet med Bam HI, og et 2,4 kb fragment omfattende den t-PA kodende sekvensen og hGH terminatoren ble isolert. Dette fragmentet ble sammen-føyet med Bam HI-spaltet Ml3mpl8 (levert av Pharmacia), og den resulterende rekombinante fagen ble brukt til å transfektere E.coli JM103. En fagklon med det ønskede innskuddet ble betegnet Ml3mpl8/Bam-Zem99.

For sete-spesifikk mutagenese ble syntetisert et oligonukleotid (sekvens 5' CT GGT ATC GAT TTC ACA GCT CTT CCC AGC A 3'), og anvendt som mutagenprimer. Oligonukleotidet ble anilert til enkelttrådet M13mpl8/Bam-Zem99. Mutagenesen ble utført ifølge standardprosedyrer og enkelttrådet DNA ble isolert for sekvensering. Den replikative formen av den mutageniserte fagen, betegnet M13-9100RF, ble spaltet med Bgl II og Hind III. Et 2,3 kb fragment inneholdende t-PA sekvensen ble gjenvunnet og sammenføyd med Zem99, som var blitt spaltet med Bgl II og Hind III (figur 4), og DNA ble anvendt til å tranformere E.coli TBl. Et plasmid med den ønskede sekvens-forandring ble gjenvunnet og betegnet Zem99-9100. Den muterte t-PA sekvensen i Zem99-9100 og den aminosyresekvensen som den koder for, er vist i figur 5.

Plasmidene Zem99-9100 og pSV2-dhfr (Subramani et al., ibid.) ble brukt til å transfektere tk-BHK celler ved Loyters metode (Proe. Nati. Acad. Sei. USA 79:422, 1982). Tranformantene ble underkastet kloning med den begrensende fortynningsmetoden. Det mutante proteinet, betegnet 9100, ble renset fra cellekultur-mediet med affinitetsrensing.

En E.coli TBl transformant inneholdende plasmidet Zem99-9100 er deponert hos the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of Internatonal Trade og Industry, Japan (FRI), under aksesjons-

nummer FERM P-9269.

Eksempel 4 - Erstatning av Cys (84)

t-PA DNA sekvensen ble mutagenisert til å kode for serin i aminosyre 84 ved hjelp av sete-spesifikk mutagenese ved anvendelse av oligonukleotidet 5' CCT GGT ATC GAT TTC ACT GCA CTT CCC 3'. Oligonukleotidet ble anilert til Ml3mpl8/Bam-Zem99, og mutagenesen ble utført ved å bruke standard prosedyrer. Enkelttrådet mutagenisert fag ble sekvensert, og en klon med den ønskede sekvensforandringen ble utvalgt. Replikativ form av DNA ble fremstilt (betegnet M13-9200RF) og spaltet med Bgl II og Hind III. Det 2,3 kb t-PA fragmentet ble isolert og sammenføyd med Zem99 kuttet med Bgl II + Hind III. Den resulterende vektoren ble betegnet Zem99-9200 (figur 4). Den forandrede t-PA kodende sekvensen i Zem-99-9200 og den aminosyresekvensen som den koder for er vist i fig. 6.

Zem99-9200 og pSV2-dhfr ble anvendt til å kotransfektere tk"HK celler med Loyters metode (ibid) . Transformantene ble underkastet kloning med den begrensende fortynningsmetoden. Det mutante proteinet (9200) ble renset ved affinitetsrensing.

En E.coli RRl transformant inneholdende plasmidet Zem99-9200 er deponert hos FRI under aksesjonsnummer FERM P-9274.

Eksempel 5 - Mutagenese av t-PA vekstfaktordomenet

For å erstatte det autentiske t-PA GF domenet med alternative vekstfaktorsekvenser, ble den naturlige t-PA sekvensen først modifisert.til å plassere et Kpn I setet mellom de finger- og vekstfaktordomene-kodende sekvensene. Plasmidet Zem99 ble spaltet med Bam HI og Eco RI, og 5' t-PA fragmentet ble gjenvunnet og innsatt i Ml3mpl8 kuttet med Bam HI + Eco RI. Fag DNA ble fremstilt, og 100 jil av DNA-løsningen ble brukt til å infisere E.coli RZ1032 i 100 /il av YT medium tilsatt 0,1 /ig/ml uridin. Denne kulturen ble inkubert ved 37°C, med kraftig omrysting over natten. Dyrking av M13 i RZ1032 frembringer fag inneholdende uridin som er levedyktig i RZ1032 men ikke i JM101.

Cellene ble sentrifugert ut, og fag supernatanten ble anvendt til å reinfisere E.coli RZ1032. Denne andre omgangen ble gjennomført for å fortynne ut eventuelt JMlOl-avledet fag som ikke inneholdt uracil. Cellene ble igjen sentrifugert ut, og fagen ble platet ut på JM101 og RZ1032. Normal levedyktighet ble observert på RZ1032 plater (som viste fag ved IO<9 >pfu/ml), men ingen plaque ble observert på JMlOl celler. En komplementær tråd primet med det mutagene oligonukleotidet ble deretter laget in vitro. Den nye tråden med mutasjonen, inneholdt thymidin, og var derfor levedyktig i JJM101; templaten av den ville typen var ikke.

Templat DNA ble fremstilt ved PEG utfelling av fagsuper-natanten etterfulgt av fenol-kloroformekstraksjon og etanol-utfelling. 1 fig av denne templat DNA ble hybridisert med 10 fig av oligonukleotidet ZC986 ved koking en kort stund, inkubasjon ved 65°C i fem minutter, og deretter langsomt å bringe temperaturen ned til 4°C før tilsetting av 10 fil 0,2 M HEPES pH 7,8, 2 /il 100 mM DTT, 1 /ti 1 M MgCl2, 20 /il 2,5 mM av hver av dNTP, 10 /il 10 mM ATP, 1 /il 2,5 U//il Klenow, og 2 fil 1 U//il T4 DNA-ligase, det endelige volumet justert til 100 fil med H20. Etter henstand ved 37°C i 2 timer ble DNA trans-fektert inn i kompetente E.coli JM101 celler. En kontroll-henstand (minus oligonukleotid) ble gjennomført for å sammen-ligne bakgrunnsmengden fremkalt ved henstand ved priming på forurensende RNA eller DNA stykker. Transfeksjonen fremkalt 0 plaque med ikke-mutagenisert templat, 150 ved kontrollhenstand (minus oligonukleotid) og 300 med mutagenisert templat.

Platene ble screenet ved å hybridisere en plaque-lift med <32>P-merket mutagent oligonukleotid og vaske i 3 M TMACl (Wood et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:1585-1588, 1985) ved Tm-5°C i 30 minutter, og også ved å sekvensere vilkårlig utplukkede plaque. En positiv klon ble oppnådd.

Det mutageniserte Bam HI-Eco RI fragmentet inneholdende Kpn I setet ble ytterligere mutagenisert for å sette inn et Xho I sete i 3' enden av GF domenet. Templat DNA ble fremstilt fra Ml3 fag klonen inneholdende Kpn I setet ved PEG utfelling av fag-supernatanten, etterfulgt av fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling. Et fig av denne DNA ble hybridisert med 10 /xg av oligonukleotidet ZC987 (5' CAC GTG GCT CGA GTA TCT ATT TC 3'). Blandingen ble kokt en kort stund, inkubert ved 65°C i 5 minutter, og temperaturen bragt langsomt ned til 4°C før tilsetning av 10 /il av 0,2 M HEPES pH 7,8, 2 /il av 100 mM DTT, 1 (il av 1 M MgCl2, 20 /il av 2,5 mM av hver av dNTP, 10 /il av 10 mM ATP, 2,5 enheter av DNA polymerase 1 (Klenow fragment) og 2 enheter av T4 DNA-ligase, endelig volum justert til 100 /il med H20. Etter henstand ved 37°C i 2 timer ble DNA transfektert inn i kompetente E.coli JM101 celler. Platene ble screenet ved hybridisering, og etter sekvens-bekreftelse av mutagenesen, ble den nye fagklonen (ZpLl) brukt til å bruke templat for en andre mutagenese. Oligonukleotidet ZC988 (5' CTC AGA GCA TGC AGG GG 3') ble brukt til å føre inne et Sph I sete i 3' enden av det første kringledomenet. Mutagenesen ble bekreftet, og fagklonen ble betegnet ZpL2. Replikativ form av DNA ble fremstilt fra ZpL2, og Bam HI-Eco RI fragmentet omfattende 5' delen av den t-PA kodende sekvensen ble isolert. Dette fragmentet ble ligert med det partielle Eco RI-Xba I 3' t-PA fragmentet fra Zem99, og Zem2l9c spaltet med Bam HI + Xba I (figur 7). Den resulterende konstruksjonen ble betegnet ZpL7.

Erstatninger for vekstfaktordomenet ble konstruert ved å anvende oligonukleotidene vist i tabell 1. De 18 oligonukleotidene sammensettes i forskjellige kombinasjoner av fire eller seks sekvenser for å frembringe de kombinasjonene som er vist i figur 8. 500 ng av hvert oligonukleotid ble inkubert i et spesielt rør inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2, 150 mM diithiothreitol inneholdende 10 /iCi (0,3 /iM) <32>P-ATP og 0,5 enheter T4 polynukleotid kinase ved 37°C i 30 minutter (totalt reaksjonsvolum = 30 /il) . 5 /il alikvoter av reaksjons-blandinger inneholdende spesifikke oligonukleotider ble blandet i de spesifiserte kombinasjonene i figur 8 (totalt volum på 2 0 /il når fire oligonukleotider ble blandet; 3 0 /il når seks ble blandet). En enhet av T4 DNA ligase ble tilsatt, og blandingene ble inkubert ved romtemperatur i 2 timer. De sammensatte ligerte oligonukleotidene ble separert ved elektroforese på en 5 % polyakrylamidgel som inneholdt 8 M urea. Båndene tilsvarende de sammensatte fragmentene av full lengde, ble skåret ut, eluert over natten med 0,3 M natrium-acetat, og DNA ble utfelt med etanol. De sammensatte oligonukleotidene ble fortynnet 1, 10 og 50 ganger og tilsatt til ligeringsblandinger med renset ZpL7 kuttet med Kpn I, Xho I. Korrekt substituerte plasmider ble til å begynne med identifisert ved Southern blot analyse, og deretter ved sekvensering over hele den substituerte regionen. Med referanse til figur 8, skal fragment A erstatte t-PA aminosyrene 63-70 med sekvensen MEGNHLAN, fragment B erstatter t-PA aminosyrene 51-84 med hele vekstfaktordomenet i human-faktor IX, fragment C erstatter t-PA aminosyrene 51-60 med den tilsvarende regionen i human faktor IX, fragment D erstatter t-PA aminosyrene 51-60 med den tilsvarende regionen i faktor IX og aminosyrene 63-70 med MEGNHLAN, fragment E erstatter t-PA aminosyrene 63-70 med den tilsvarende regionen i human faktor IX, fragment F erstatter t-PA aminosyrene 51-84 med hele vekstfaktorregionen i human faktor VII og fragment G erstatter t-PA aminosyrene 63-84 med den tilsvarende regionen i human faktor VII. I fragmentene A, C, D og E forandres det frie cysteinet i 83 til serin for å øke protein-stabiliteten.

Sekvensene i representative kombinasjoner av oligonukleotider og de aminosyresekvensene som de koder for er vist i figur 6. De parrede oligonukleotidene (1351 + 1352, 1353 + 1354, 1355 + 1356, 1357 + 1358, 1359 + 1360, 1361 + 1362, 1363 + 1364, 1457 + 1458 og 1459 + 1460) kan også sammensettes i andre kombinasjoner som vist i figur 8.

For å konstruere ekspresjonsvektorer for de modifiserte t-PA sekvensene vektoren ZpL7 spaltet med Kpn I og Xho 1 og vektorfragmentet ble gelrenset. Vektor DNA ble ligert med hvert av vekstfaktor-erstatningsfragmentene A, B, C, D, E, F, G, H, I, J og K. Ligeringsblandingene ble brukt til å transformere kompetente E.coli HB101 celler. Kloner ble plukket ut og DNA ble fremstilt, spaltet med Eco RI og fraksjonert på en 1 % agarosegel. DNA ble overført til nitrocellulose og undersøkt med det passende å<32>P-merkede oligonukleotidet for å bekrefte at substitusjonene var tilstede. De resulterende plasmidene, betegnet ZpL7A, B, C, D, E, F, G, H, I, J og K, ble spaltet med Eco RI og Bam HI, og de 5' t-PA fragmentene ble klonet inn i M13 fagvektorer og sekvensert for ytterligere bekreftelse. Plasmidene ble deretter transfektert inn i tk"HK celler, og høyt produserende kloner ble oppskalert for proteinproduksjon og karakterisering.

Eksempel 6 - Substitusjon for Cys i t-PA analoger med

forandrede aktiveringsseter.

For sete-spesifikk mutagenese ble et 472 bp Eco RI fragment omfattende t-PA sekvensen fra bp 802 til bp 1274 isolert fra Zem99, og klonert inn i Eco RI setet i Ml3mpl8 (replikativ form). Den rekombinante fagen ble transfektert inn i E.coli (JM101) og anti-sense DNA tråd ble isolert.

Sete-spesifikk mutagenese ble deretter utført på den enkelt-trådede anti-sens DNA templaten ved å bruke en av de mutagene primerne vist i tabell 2 og ZC87 som andre primer. Oligonukleotidene ZC487, 488, 489 og 620 forandrer Phe i posisjon 274 til hhv. Glu, Gly, Arg eller Pro. Oligonukleotidene ZC797, 874, 1013 og 1027 forandrer Arg i posisjon 275 til hhv. Gly, Leu, Pro eller Asp. Oligonukleotid 621 innfører en Leu i stedet for Lys i posisjon 277. Oligonukleotid 928 forandrer Ile i posisjon 276 til Pro. Oligonukleotid 875 forandrer Arg (275) til Leu, og oligonukleotid 927 forandrer Phe (274) til Pro i den mutanten som tidligere hadde fått Lys (277) omdannet til Leu. Oligonukleotidene 875 og 927 kan således brukes til å frembringe doble mutasjoner. 20 pmol av fosforylert mutagen primer og 20 pmol av den andre primeren ble kombinder med ett pmol av enkelttrådet templat i 10 fil av 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM DTT og inkubert ved 65°C i 10 min., deretter 5 min. ved romtemperatur, og plassert på is. 10 til av 20 mM Tris pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM ATP, 10 mM DTT inneholdende 1 mM dNTPs, 2,5 enheter Klenow polymerase, og 3,5 enheter DNA-ligase ble tilsatt til den anilerte DNA, og blandingen ble inkubert 3 timer ved 15°C. DNA ble deretter transfektert inn i kompetent E.coli JM101, og cellene ble platet ut på YT agar og inkubert ved 37°C. DNA ble deretter overført til nitrocellulose og prehybridisert ved Tm-4°C av den mutagene primeren i 1 time i 6x SSC, 10x Denhardts og hybridisert til <32>P-merket mutagen primer ved Tm-4°C i den samme løsningen. Etter tre vaskinger ved Tm-4°C ble filtrene eksponert for røntgenstråletilm over natten. Ytterligere vasketrinn ble utført ved 5°C høyere trinn som nødvendig for å identifisere mutante plaque. De muterte innskuddene ble sekvensert ved dideoksy-metoden.

Ekspresjonsvektorer for de forandrede sekvensene ble deretter konstruert (figur 9). Replikativ form (RF) DNA ble fremstilt fra den mutageniserte fagen, og de modifiserte t-PA sekvensene ble renset som Eco RI fragmenter. Plasmid Zeml82b ble spaltet med Eco RI, vektorsekvensene som inneholdet 5' og 3' delene av den t-PA kodende sekvensen, ble behandlet med alkaliske kalvefosfatase, og de modifiserte t-PA sekvensene ble innsatt. De resulterende plasmidene ble spaltet med Bam HI og Xba I, og t-PA fragmentene ble innsatt i Bam HI + Xba

I - kuttet pDR3002. De resulterende vektorene ble betegnet pMH7 til pMH20 (tabell 3).

Det modifiserte GF domenet og aktiveringssete-mutasjoner blir deretter kombinert på følgende måte. Cys (84) butant DNA fra Zem99-9200 isoleres som et Bam HI-Sca I fragment, og sammenføyes i en tre-delers ligering til Bam HI, Xba I - spaltet Zem2l9b og Sea I-Xba I fragmentet som koder for det modifiserte aktiveringssetet, fra pMHlO, pMHl3 eller pMHl7.

De resulterende ekspresjonsvektorene, betegnet 9200-10, 9200-13 og 9200-17, anvendes til å transfektere tk"HK celler ved elektroporasjon. Høyt produserende kloner oppskaleres og proteinet renses.

Eksempel 7 - Substitusjon for Cys i en t-PA analog

som inneholder et konsensus fingerdomene Erstatning av t-PA fingerdomenet med en konsensus fingerregion resulterer i eliminering av potensielle proteolytiske spaltningsseter ved Arg-27, Lys-49 og Arg-89. Åtte finger-erstatningssekvenser ble konstruert, basert på analyse av fingerdomenene i fibronektin og t-PA.

Konsensus fingersekvensene ble konstruert fra oligonukleotider som beskrevet nedenfor, og deretter innsatt i den t-PA kodende sekvensen. For å lette denne innsettingen, ble et Kpn I sete innført nedstrøms (3') for den regionen som koder for fingerdomenet av den ville typen. Spalting av den resulterende sekvensen med Bgl II og Kpn I resulterte i delesjon av fingerdomenet av den ville typen.

A. Innsetting av Kpn I setet mellom finger- og vekstfaktordomenene

For å plassere et Kpn I setet etter fingerdomenet i t-PA ble gjennomført en mutagenese med oligonukleotid SC986 (5 ' TTT GAC AGG TAC CGA GTG GCA 3'). DNA fra en fag M13 klon inneholdende 5' Bam HI-Eco RI fragmentet i den naturlige t-PA cDNA ble fremstilt. 100 Lii av DNA-løsningen ble brukt til å infisere E.coli RZ1032 i 100 /il av YT medium tilsatt 0,1 /tg/ml uridin. Denne kulturen ble inkubert ved 3 7°C under kraftig omrysting over natten. Dyrking av M13 i RZ1032 frembringer fag inneholdende uridin som er levedyktige i RZ1032 men ikke i JM101.

Cellene ble sentrifugert ut, og fag supernatanten ble brukt til i reinfisere E.coli RZ1032. Denne andre omgangen ble utført for å tynne ut eventuelt JM101-avledet fag som ikke inneholdt uracil. Cellene ble igjen sentrifugert ut, og fagen ble platet ut på JM101 og RZ1032. Normal levedyktighet ble observert på RZ1032 plater (som viste fag ved IO<9> pfu/ml), men ingen plaque ble observert på JM101 celler. En komplementær tråd primet med det mutagene oligonukleotidet ble deretter produsert in vitro. Den nye tråden, inneholdende mutasjonen, inneholdt thymidin, og var derfor levedyktig i JM101; den

ville typen av templat var ikke.

Templat DNA ble fremstilt ved PEG utfelling av fag supernatanten etterfulgt av fenol-kloroform ekstraksjon og etanol utfelling. 1 fig av denne templat DNA ble hybridisert med 10 fig av oligonukleotid ZC986 ved kort koking, inkubering ved 65°C i 5 minutter, og deretter langsomt å bringe temperaturen ned til 4°C før tilsetning av 10 fil 0,2 M HEPES pH 7,8, 2 fil 100 mM DTT, 1 fil 1 M MgCl2, 20 fil 2,5 mM av hver av dNTP, 10 fil 10 mM ATP, 1 fil 2,5 U/til Klenow, og 2 fil 1 U/ fil T4 DNA ligase, sluttvolumet justert til 100 fil med H20. Etter henstand ved 3 7°C i 2 timer, ble DNA transfektert inn i kompetente JM101 celler. En kontrollhenstand (minus oligonukleotid) ble gjennomført for å sammenligne bakgrunnsmengden fremkommet ved henstand ved priming og forurensende RNA eller DNA stykker. Transfeksjonen frembragte null plaque med ikke-mutagenisert templat, 150 ved kontrollhenstand (minus oligonukleotid) og 300 med mutagenisert templat.

Platene ble screenet ved å hybridisere en plaquelift med <32>P-merket mutagent oligonukleotid og vaske i 3 M TMACl (Wood et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 82:1585-1588, 1985) ved Tm-5°C i 3 0 minutter, og også ved å sekvensere vilkårlig utplukkede plaque. En positiv klon ble oppnådd.

B. Fremstilling av fingererstatningsdomener

Konsensus fingerregion-erstatningene vist i tabell 4 og figur 10 ble konstruert.

De åtte konsensus-sekvensene ble fremstilt fra de viste oligonukleotidene. Oligonukleotidene (tabell 5) ble fremstilt ved å bruke en Applied Biosystems Model 3 80A DNA synthesizer. Først ble de 12 oligonukleotidene kinasert og samtidig merket til lav spesifikk aktivitet med å-<32>P ATP ved å inkubere alle med polynukleotidkinase ved 37°C i 1/2 time. Deretter ble de viste åtte kombinasjonene (ABC, DEF, ABF, AEC, AEF, DBF, DEC og DBC) fremstilt ved å blande sammen de angjeldende oligonukleotidene, tilsette DNA-ligase, og inkubere ved 37°C i 1 time. Produktene fra denne reaksjonen ble sortert ut på en 6 % polyakrylamid-8 M urea sekvensgel. Båndene som svarte til DNA kodingen for fingerområder av full lengde, ble kuttet ut, og DNA ble eluert i 2,5 M ammoniumacetat. DNA ble utfellt med etanol og oppslemmet igjeni vann til en konsentrasjon på 1 pmol//xl.

RF DNA ble fremstilt fra den positive klonen beskrevet i eksempel 5A, og Bam HI til Eco RI t-PA fragmentet ble renset. Plasmid Zem219a (beskrevet i eksempel 2) ble spaltet med Xba I og deretter delvis spaltet med Eco RI. 1010 bp fragmentet, inneholdende regionen som koder for 3' t-PA, ble renset. Plasmid Zem219b (beskrevet i eksempel 2) ble spaltet med Bam HI og Xba I og ligert til 5' t-PA fragmentet (Bam HI-Eco RI) og 1010 bp Eco RI-Xba I fragmentet. Den resulterende vektoren, betegnet Zem23 8, inneholder et Kpn I sete etter fingerdomenet. Zem238 ble spaltet med Bgl II og Kpn I, gelrenset for å fjerne fingerdomenet av den ville typen, og ligert med hver av de åtte konsensus-sekvensene for å fremstille ekspresjonsvektorene 238-Fcon 1 til 238-Fcon 8.

C. Kombinasjon av Cys (84) substitusjon med konsensusfinger

Templat DNA fra M13-9200 (eksempel 4) anileres til oligonukleotid primer ZC986, som beskrevet i eksempel 7A. En riktig mutert klon med ett Kpn I innsatt ved 3' enden av fingerdomenet, blir identifisert og sekvensert. RF DNA fra denne klonen spaltes med Kpn I og Xba I, og Cys (84) mutant DNA ligeres til vektor DNA fra Kpn I, Xba I-spaltede plasmider 238-Fcon 1 til 238-Fcon 8. De resulterende vektorene, betegnet 9200-Fcon 1 til 9200-Fcon 8 transfekteres inn i tk"HK celler, og de mutante proteinene renses og karakteriseres.

Eksempel 8 - Modifikasjon av karbohydrat addisjonssete i t-PA analoger med forandringer i GF domenet Vevsplasminogenaktivator inneholder fire potensielle glykosyleringsseter (aminosyre-sekvens Asn-X-Ser/Thr). Ifølge Phol et al., (Biochemistry 23:3701-3707, 1984), glykosyleres tre av disse setene (Asn-117, 184 og -448) i t-PA oppnådd fra Bowes melanomceller. Ved å forandre Asn restene i glyko-sylerings-setene til andre aminosyre-rester, blir glykosyleringen blokkert. Det foretrekkes spesielt at Asn-restene forandres til Gln-rester. Forandringer i DNA sekvensen som koder for t-PA gjøres ved setespesifikk mutagenese. Nukleotidforandringer kan gjøres enkeltvis eller i kombinasjon for å forandre ett eller flere av glykosyleringssetene. Dessuten kan muterte sekvenser kombineres med DNA fragmenter som omfatter andre delesjoner, innskudd eller substitusjoner av den t-PA kodende sekvensen for å fremstille nye proteiner som omfatter flere mutasjoner i kombinasjon.

Sete-spesifikk mutagenese ble utført på enkelttrådede M13 fagtemplater ved å bruke de mutagene primerne ZC294, ZC295 og ZC297 (Se tabell 6) for å fremstille forandringene i hhv. Asn-117, -184 og -448. DNA sekvenser som koder for mutante t-PAer ble deretter konstruert, omfattende enkle, doble eller tredoble mutasjoner ved å erstatte de t-PA kodende sekvensene i pDRl296. De følgende plasmidene ble konstruert: (1) pDRl60l, omfattende mutasjonen i Asn-117; (2) pDRl602, omfattende mutasjonen i Asn-184; (3) pDRl603, omfattende mutasjonen i Asn-448; (4) pDRl604, omfattende mutasjonene i Asn-117 og -448; (5) pDRl605, omfattende mutasjonene i Asn-184 og -448; og (6) pDRl606, omfattende de tre mutasjonene.

I en tilleggsmutagenese ble fremstilt en oligonukleotid primer (5' ACG GTA GGC TGT CCC ATT GCT AAA GTA GCA 3') for å erstatte Gly (183) og Ser (186) med hhv. Ser og Thr. Disse mutasjonene fører til jevnere glykosylering av K2 domenet. Sete-spesifikk mutagenese ble utført ifølge en-primer-metoden, ved å bruke templaten Ml3mpl8/Bam-Zem99 (Eksempel 3). Enkelttrådet mutagert fag DNA ble fremstilt og sekvensert. En klon som har den ønskede sekvensforandringen ble betegnet M13-6000.

RF DNA fra M13-600 ble isolert, spaltet med Bgl II og Apa I, og et fragment på om lag 1,4 kb ble isolert. Dette fragmentet ble sammenføyd med Bgl II, Apa I-spaltet Zem99 for å fremstillte vektoren Zem99-6000. E.coli RRI transformert med.Zem99-600 er deponert hos the Fermentation Research Institute under Accession Nr. FERM P9126.

Cys (84) mutant DNA fra plasmid Zem99-9200 spaltes med Bgl II og Nar I. De mutante DNA sekvensene isoleres fra pDR1601 og Zem99-6000 som Nar I-Xba I fragmenter. Plasmid 9200-1601 genereres ved ligering av Bgl II-Nar I fragmentet fra Zem99-9200, Nar I-Xba I fragmentet fra pDRl601 og Bgl II-Xba I (vektor) fragmentet fra Zem2l9a. Plasmidet 9200-6000 genereres ved ligering av Bgl II-Nar I fragmentet fra Zem99-9200, Nar I-Xba I fragmentet fra Zem99-6000, og Zem2l9a vektorfragmentet. Disse plasmidene brukes til å transfektere tk"HK celler ved elektroporasjon. De mutante proteinene renses og karakteriseres.

De mutante t-PA sekvensene i pDRl6 0l og pDRl606 ble isolert som Bam HI-Xba I fragmenter, og innsatt i Zem99. De resulterende ekspresjonsvektorene ble transfektert inn i tk"HK celler. De mutante proteinene 1601 og 1606 ble isolert fra de transfekterte cellene og karakterisert.

For å erstatte Asn i Kl glykosyleringssetet i GF erstatnings-mutanten beskrevet i eksempel 5, ble templat DNA fremstilt fra fag ZpL2 og mutagenisert med oligonukleotid ZC1452 (5' CAA CCC GCT AGA TTG CCA GTT GGT 3'). Den resulterende fagklonen ble betegnet ZpL3 (figur 7).

Replikativ form DNA ble fremstilt fra ZpL3 og Bam HI-Eco RI fragmentet omfattende 5' delen av den t-PA kodende sekvensen ble isolert. Dette fragmentet ble ligert til det partielle Eco RI-Xba I 3' t-PA fragmentet fra Zem99 og Bam HI + Xba I spaltet Zem2l9c (figur 7). Den resulterende vektoren, betegnet ZpL5, ble spaltet med Kpn I og Xho I og vektorfragmentet ble gelrenset. Vektor DNA ble ligert med vekstfaktor erstatnings-fragmentene A, B, D og G beskrevet i eksempel 5. Ligerings-blandingene ble brukt til å transformere kompetente E.coli HBlOl celler. Kloner ble plukket ut og Gf domene erstatningene ble bekreftet ved hybridisering og sekvensanalyse for plasmidene ZpL5A, B og D. ZpL5A ble transfektert inn i tk"HK celler og høyt produserende kloner ble skalert opp for proteinproduksjon og karakterisering.

Eksempel 9 - Kombinasjon av 6F modifikasjoner med kringledomene erstatninger.

A. Asp (96) plasminogen kringle

Plasmid pKl omfatter en kodende sekvens for Kl domenet i plasminogen, og sekvensen av dette er vist i figur 11. Det ble konstruert fra en serie på elleve oligonukleotider betegnet PK1-1, PKl-2, PK1-3, -- PKl-12, og sekvensene i disse vist i tabell 7.

Den kodende sekvensen for nukleotidene 1 til 182 av plasminogen Kl domenet ble konstruert fra oligonukleotidene PKl-1 til PKl-7 på følgende måte. 100 pmol av hver av oligonukleotidene PK1-1, PK1-2, PK1-3 og PKl-4 ble fosforylert i sine 5' termini. De fosforylerte oligonukleotidene ble blandet med 100 pmol av hvert av PKl-5, PKl-6, og PKl-7. Blandingen ble utfeldt med etanol, og bunnfallet ble oppslemmet igjen i H20 og oppvarmet i 3 minutter ved 90°C. Løsningen fikk deretter stå ved romtemperatur i 10 minutter, og ble deretter plassert på is. Til den avkjølte blandingen ble tilsatt 10 /ti av 660 mM tris HCl, pH 7,6, inneholdende 6,6 mM MgCl2, 10 ttl av 0,1 M dithiothreitol, 10 /xl av 5 mM ATP, og 1000 enheter av T4 DNA ligase. Blandingen ble inkubert 15 timer ved 14°C. Etanol ble tilsatt og bunnfallet ble oppslemmet igjen i 20 ttl av TE buffer (10 mM tris-HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0), etterfulgt av tilsetning av et like stort volum av alkaliopptagende buffer (20 mM NaCl, 2 mM EDTA, 80 % formamid, 0,1 % xylencyanol og 0,1 % bromfenolblått). Blandingen ble oppvarmet i 3 minutter ved 90°C, og separert ved elektroforese på en 6 % polyakrylamidgel inneholdende 8,4 M urea i en time ved 300 volt. Gelen ble farget med ethidiumbromid, og et 250 bp bånd ble gjenvunnet ved elektroforetisk overføring til DEAE-cellulosepapir (Dretzen et al., Anal. Biochem. 112:295-298, 1981) . Det gjenvunnede DNA ble solubilisert i 100 ttl av TE buffer, og fragmentet ble betegnet PKl-n. PKl-n ble C-tailet i 3 ' terminus ved å slå sammen 10 /il av PKl-n med 2 til av 100 mM natriumkakodylat--25 mM HEPES, pH 7,6, 6,2 ttl av en 1 mM dCTP, 10 enheter terminal deoksynukleotidyltransferase og 5 /xl H20. Reaksj onsblandingen ble inkubert ved 37°C i 10 minutter, deretter ekstrahert med fenol:kloroform (1:1). 1 ttl av 3'-oligo (dG) talet pUC9 (levert fra Pharmacia) ble spaltet med Sma I. Det lineæriserte, tailete plasmid ble tilsatt til det C-tailete PKl-n. Blandingen ble deretter ut felt med etanol, og DNA ble oppslemmet igjen i 0,5 fil av 2M KC1 og 9,5 fil av TE buffer, og inkubert ved 65°C i 10 minutter, og deretter avkjølt til romtemperatur. Til den avkjølte blandingen ble tilsatt 5 fil av 0,2 M Tris HCl, pH 7,5, inneholdende 0,1 M MgCl2 og 0,1 M dithiothreitol, 20 fil av 2,5 mM dNTPs, 10 fil av 5 mM ATP, 53 fil H20, 5 enheter DNA polymerase I (Klenow fragment), og 300 enheter T4 DNA ligase (endelig volum på 100 fil) . Blandingen ble inkubert i 14°C i 12 timer, og deretter til å transfektere E.coli JM83.

De transfekterte JM83 cellene ble undersøkt med PKl-6 ved å bruke metoden til Wallace et al., (Nuc. Acids Res. 9:879-894, 1981) . 20 positive kloner ble sekvensert og to ble utvalgt: #1-3 omfattende baseparene 1-170, og #8-5, omfattende baseparene 68-186 (se figur 12).

Med referanse til figur 13 ble klon #1-3 spaltet med Eco RI og Fok I, og ett 13 0 bp fragment som inneholdt et Kpn I sete, ble gjenvunnet. På lignende måte ble klon #8-5 spaltet med Fok I og Hind III, og et 90 bp fragment ble gjenvunnet.

De to fragmentene ble sammenføyet med Eco RI, og Hind III-spaltet pUCl2, og det resulterende plasmidet ble betegnet pPKA. Dette plasmidet inneholder således en DNA sekvens tilsvarende nukleo-tidene 1-182 av plasminogen Kl sekvensen.

Resten av Kl sekvensen ble konstruert ved å bruke oligonukleotidene PK1-9, PK1-10, PK1-11 og PKl-12. 1 pmol av hvert av oligonukleotidene ble fosforylert i 5' enden, og de kombi-nerte oligo ble blandet sammen med 40 fig av Bam HI, Sph I-spaltet Ml3tgl3 0RF (levert fra Amersham). Til denne blandingen ble tilsatt 4 fil av 660 mM Tris-HCl, pH 7,6, inneholdende 66 mM MgCl2, og 22 fil H20. Løsningen ble oppvarmet i 3 minutter ved 90°C, og fikk avkjøle seg til romtemperatur i løpet av 1 time. 4 fil av 0,1 M dithiothreitol, 4 fil av 5 mM ATP, og 3 00 enheter av T4 DNA ligase ble tilsatt, og blandingen ble inkubert i 12 timer ved 14°C. Den resulterende fagklonen, betegnet M13PKB RF (figur 14), inneholdt nukleotidene 183 til 250 av plasminogen Kl sekvensen. Sammenstillingen av den komplette sekvensen som koder for plasminogen Kl er vist i figur 14. Plasmid pPKA ble spaltet med Mlu I og Sau 3AI, og et 176 bp fragment ble gjenvunnet. M13PKB RF ble spaltet med Sau 3AI og Eco RI, og et 88 bp fragment ble gjenvunnet. Disse fragmentene ble sammenføyet med Mlu I, Eco RI-spaltet Ml3um20 RF (levert fra IBI), og det resulterende plasmidet ble betegnet Ml3um20-PK1.

Den PKl kodende sekvensen ble deretter innsatt i t-PA cDNA som en erstatning for t-PA kringle 1 sekvensen (figurene 15 og 16). t-PA sekvensen ble først mutagenisert for å innsette Mlu I og Eco RV seter. Plasmid pDRl496 ble spaltet med Sph I og Xba I, og 2,1 kb fragmentet omfattende alfa faktoren og t-PA sekvensene, ble isolert. (S. cerevisiae stammen E8-11C transformert med pDRl496 er blitt deponert hos American Type Culture Collection under Accession nr. 20728.) Dette fragmentet ble sammenføyet med Sph I, Xba I-spaltet Ml3tgl3 0 (RF), og den resulterende fagen ble betegnet Ml3tgl3 0-W. Enkelttrådet fag DNA ble deretter anilert til et oligonukleotid (5'GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC 3'), og mutagenesen ble utført ifølge standard prosedyrer. Den mutageniserte fagen ble betegnet Ml3tgl3 0-PKA1. Enkelttrådet DNA fra Ml3tgl3 0-PKA ble isolert og mutagenisert med en-primer metoden med et oligonukleotid som har sekvensen 5'CTC AGA GCA TTC CAG GAT ATC GCA GAA CTC 3'. Enkelttrådet DNA ble fremstilt fra den mutageniserte fagen og sekvensert. En klon inneholdende et Mlu I sete i 5' enden og et Eco RV sete i 3' enden av den kringle 1 kodende sekvensen ble utvalgt og betegnet Ml3tgl3 0-PKA2.

Replikativ form av DNA ble fremstilt fra Ml3tgl3 0-PKA2, og ble spaltet med Bgl II og Apa I. Fragmentet som inneholdt Mlu I og Eco RV setene, ble gjenvunnet og sammenføyet med Bgl II, Apa I spaltet Zem99, som vist i figur 15. Det resulterende plasmidet ble betegnet Zem99-2020.

PKl sekvensen ble deretter innsatt i t-PA cDNA. M13um20-PK1 RF ble spaltet med Mlu I og Eco RV, og 336 bp fragmentet ble gjenvunnet. Dette fragmentet ble sammenføyet med Mlu I, Eco RV-spaltet Zem99-2020 for å konstruere Zem99-8000 (figur 16). Den t-PA kodende sekvensen i Zem99-8000 og den

aminosyre-sekvensen som den koder for, er vist i figur 17.

B. Asn (96) plasminogen kringle

En andre plasminogen Kl sekvens som koder for Asn i posisjon 96, ble konstruert (figur 16). Zem99-8000 ble spaltet med Bam HI, og fragmentet som inneholdt Bgl II setet ble gjenvunnet. Dette fragmentet ble sammenføyet med Bam HI-kuttet Ml3mpl8 for å konstruere M13-8000R. En oligonukleotid primer (sekvens 5' TTT TTA CCA TTA CCG GTC TT 3') ble anilert til enkelttrådet M13-8000R, og mutagenese ble utført ifølge rutine-prosedyrer for en-primer metoden. Kloner ble screenet og sekvensert, og dobbelttrådet DNA, betegnet M13-8000RF, ble fremstilt fra en positiv klon. Denne fagen ble spaltet med Bgl II og Apa I, og t-PA fragmentet isolert og sammenføyet med Bgl II, Apa I - kuttet Zem99. Det resulterende plasmidet ble betegnet Zem99-8100. Den t-PA kodende sekvensen som er tilstede i Zem99-8100 og den aminosyresekvensen som den koder for, er vist i figur 18.

Plasmidene Zem99-8000 og Zem99-8100 er blitt deponert (som E.coli RRI transformanter) hos FRI under accessions nr. hhv. FERM P-9272 og FERM P-9315.

C. Kombinasjon av GF modifikasjoner og Kl substitusjon

Enkelttrådet DNA ble isolert fra M13-9200 og ble mutagenisert ved å bruke oligonukleotidet 5' GCA CGT GGC ACG CGT ATC TAT TTC 3' for å innføre et Mlu I sete. Den mutageniserte fagen ble betegnet M13-92.05PKA1. RF DNA ble fremstilt fra den mutante fagen, og ble spaltet med Bgl II og Mlu I, og 264 bp fragmentet ble gjenvunnet. Zem99-8000 ble spaltet med Mlu I og Apa I, og 1126 bp fragmentet ble gjenvunnet. Disse to fragmentene ble sammenføyd med Bgl II, Apa I-spaltet Zem99, og det resulterende plasmidet ble betegnet Zem99-9280. Dette plasmidet koder således for en mutant t-PA med Ser i aminosyre 84 og Kl domenet i plasminogen med Asp i posisjon 96.

En andre vektor, som inneholder en mutant t-PA sekvens som koder for en t-PA analog med Ser i aminosyre 84 og Kl domenet i plasminogen med Asn i posisjon 96, ble konstruert. RF DNA fra M13-92.05PKA1 ble spaltet med Bgl II og Mlu I, og 264 bp fragmentet ble gjenvunnet. Zem99-8100 ble spaltet med Mlu I og Apa I, og 1126 bp fragmentet ble gjenvunnet. Disse to fragmentene ble sammenføyd med Bgl II, Apa I-spaltet Zem99, og det resulterende plasmidet ble betegnet Zem99-928l.

Plasmid Zem99-8000 ble spaltet med Spe I og Hind III, og fragmentet inneholdende den 3' mutante t-PA kodende sekvensen og hele hGH terminatoren ble gelrenset. Plasmid ZpL7 ble delvis spaltet med Hind III og fullstendig spaltet med Xho I, og vektorsekvensene ble renset vekk fra den 3' t-PA kodende sekvensen og hGH terminatoren. Oligonukleotidene ZC163 9 og ZC1640 (tabell 8) ble anilert, og det resulterende Xho I til Spe I fragmentet (som koder for 5' delen av plasminogen Kl kringlen) ble sammenføyd i en ligeringsreaksjon med de to ovenfor rensede fragmentene. Det resulterende plasmidet ble betegnet 8900. For å konstruere chimere sekvenser som koder for t-PA derivater omfattende GF og Kl substitusjonene, spaltes plasmid 8900 med Bam HI og Xho I, og GF regionen erstattes med Bam HI til Xho I regionen som er isolert fra et av plasmidene ZpL7A-N.

Eksempel 10 - Karakterisering av proteiner Proteinene 9100 og 9200 ble fremstilt som beskrevet, og utprøvet for aktivitet og plasmahalveringstid ved bruk av naturlig t-PA fremstilt fra transfekterte tk"HK celler som kontroll.

t-PA analogene #9100 og #9200 ble utprøvet på koagel-nedbrytningsaktivitet ved å bruke naturlig rekombinant t-PA som kontroll. En 3 cm lang silketråd ble innført i et Atom vene-kateter (4Fr 3,5 cm) og kateteret ble forbundet med en injeksjons-sprøyte. Humant sitratbehandlet blod ble fremstilt ved å blande blod og en løsning av 3,8 % natriumsitrat i forholdet 9:1. Det sitratbehandlede blodet (0,5 ml) ble blandet med <125>J-fibrinogen (25 /xCi i 50 /xl fysiologisk saltløsning) , 50 /xl av 0,25 M CaCl2 og thrombin (5 U/10 /xl løsning) . 16 /xl av den resulterende løsningen ble injisert i

kateteret, og kateteret fikk stå ved romtemperatur i 60 minutter. Silketråden ble deretter fjernet fra kateteret og vasket med fysiologisk saltvannsløsning. Radioaktiviteten bundet til tråden (den opprinnelige fibrin thrombus verdien) ble bestemt. Tråden ble deretter innført i en karotid arterie shunt (A-V) på en Sprague-Dawley hanrotte som veidde mellom 200 og 300 gram. 1 ml prøver av proteinet i en saltløsning inneholdende 50 enheter heparin pr. ml. ble injisert inn i dyrets femoralvene. Etter to timer ble sliketråden fjernet fra shunten, og radioaktiviteten (restverdien av fibrin thrombus) ble bestemt. Thrombusrest-forholdet ble bestemt ifølge ligningen:

Figur 19 er et diagram av resultatene som ble oppnådd ved å bruke forskjellige doser av naturlig t-PA, #9100 og #9200. Disse data viser at de mutante proteinene kan sammenlignes med naturlig t-PA i sin evne til å nedbryte koagel in vivo.

For å undersøke plasmahalveringstid ble proteinene løst i saltløsning. Løsningen ble injisert i femoralvenene på Sprague-Dawley hanrotter (23 0 g til 270 g kroppsvekt) i en dose på 0,4 mg/kg. Blodprøver (0,5 ml) ble tatt fra jugularvenene, justert til 3,8 % sitronsyre, og sentrifugert. t-PA nivået i plasma ble bestemt ved å bruke enzym immun undersøkelse av sandwich-typen. Figur 20 viser et diagram av plasmainnhold mot tiden etter injeksjon.

Forandringer i plasmanivået av proteinene ble analysert med en to-delt modell (Shargel, L. og Yu, A.B.C., eds., Applied Biopharmaceutics and Pharmacokinetics, Appleton-Century-Crofts, New York, 1980, pp 38-48) . Halveringstiden ble bestemt for alfa og beta fasene av clearance. Den tilbake-ekstrapolerte skjæringen mellom betafasen og ordinaten

(B) og arealet under kurven (AUC) ble også bestemt. De oppnådde verdiene er vist i tabell 9.

Naturlig t-PA og de mutante proteinene ZpL7-A, ZpL7-B og ZpL7-F (tilsvarende figur 8A, B og F) ble utprøvet på plasmahalveringstid hos rotter. For hvert protein som ble utprøvet, ble to Balb/c hunmus som veide 20-21 gram anestesert med eter og injisert via halevenen med 10 /xg av affinitetsrenset protein i et samlet volum på 10 0 ttl av PBS. Sprøytene ble veiet før og etter injeksjonen. Ved passende tidsintervaller, ble plasmaprøver (25 /xl) tatt fra retroorbital plexus med hepariniserte mikro-pipetter. Prøvene ble sentrifugert for å fjerne røde blodlegemer og fortynnet for undersøkelse. Plasma t-PA innholdet ble målt med ELISA ved å bruke affinitetsrenset polyklonalt antistoff fra kanin til naturlig human t-PA.

Resultatene av eksperimentene er vist i figur 21. Man fant at alle de tre mutante proteinene ble eliminert ved en signifikant lavere hastighet enn naturlig t-PA. Disse resultatene antyder at aminosyreforandringene i vekstfaktordomenet i analog A og faktoren IX og faktor VII vekstfaktor-substitusjonene i analogene B og F påvirker klareringen av disse molekylene i den (de) normale utskillingsveien(e).

I lignende eksperimenter hadde det mutante proteinet ZpL5A (se eksempel 8) en halveringstid på 7,7 minutter. Halveringstiden for naturlig t-PA i disse eksperimentene var 1,5 minutter.

De mutante proteinene 1601 og 1606 ble utprøvet for plasmahalveringstid hos kaniner. Resultatene er vist i tabell 10.

Av det foregående vil man forstå at, selvom spesielle utførelser av oppfinnelsen er blitt beskrevet heri for illustrasjonsformål, kan forskjellige modifikasjoner gjøres uten å avvike fra ånden i og rammen av oppfinnelsen. Følgelig er oppfinnelsen ikke begrenset, med unntak av de vedlagte krav.

Claims

1. Fremgangsmåte ved fremstilling av en t-PA-analog inneholdende vekstfaktorområdet til naturlig t-PA, hvilket område har cysteinresten nr. 84 i naturlig t-PA erstattet med serin eller alanin, hvori analogen eventuelt videre inneholder en substitusjon på minst én aminosyrerest innenfor 13 aminosyre-rester fra spaltnings-setet, hvilken substitusjon fører til en øket resistens mot spaltning med plasmin, hvori analogen eventuelt inneholder 2 kringlestrukturer, hvorav minst én mangler karbohydrat, eller hvori analogen inneholder en kringlestruktur som stammer fra plasminogen, karakterisert ved at man

(1) dyrker en vertscelle transformert med en ekspresjonsvektor inneholdende DNA som koder for denne t-PA-analog og

(2) isolerer den resulterende t-PA-analog.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at plasminogenkringle-strukturen er Kl kringleområdet til plasminogen.

3. DNA-sekvens, karakterisert ved at den koder for t-PA-analogen som definert i krav 1, hvilken inneholder vekstfaktorområdet for naturlig t-PA, hvilket område har cysteinresten i posisjon 84 erstattet med serin eller alanin.

4. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den inneholder en DNA-sekvens som definert i krav 3, og er istand til å uttrykke den.

5. Ekspresjonsvektor ifølge krav 4, karakterisert ved at vektoren er Zem-99-9200, som vist i fig. 4.

6. Vertscelle, karakterisert ved at den er transfektert eller transformert med en ekspresjonsvektor omfattende en DNA-sekvens ifølge krav 4-5, operativt knyttet til en promotor.