JP2928798B2

JP2928798B2 - プラスミノーゲンアクチベーターの変異体およびその製造方法

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Publication number: JP2928798B2
Application number: JP1506287A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン，ステファン; キート，ブルース
Original assignee: JENENTETSUKU Inc
Current assignee: JENENTETSUKU Inc
Priority date: 1988-05-20
Filing date: 1989-05-04
Publication date: 1999-08-03
Anticipated expiration: 2014-08-03
Also published as: DE68918279D1; DE68918279T2; DK274990D0; CA1341432C; DK175938B1; ATE111525T1; JPH03504327A; DK274990A; EP0424405A1; EP0424405B1; IL90146A; IL90146A0; HK1007333A1; NZ229081A; ES2013500A6; WO1989011531A1; AU3744889A; AU624158B2

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、プラスミノーゲンアクチベーターの特定の
変異体、それを製造する方法、および予想外の改良され
た治療学的および物理化学的特徴、特に改良された循環
半減期とクリアランス速度を有する医薬的に活性な組成
物を製造するための、そのような変異体を利用する方法
およびそのような組成物に関する。

プラスミノーゲンアクチベーターは、酵素前駆体（チ
モーゲン）プラスミノーゲンを活性化し、フィブリンな
どの種々のタンパク質を分解するセリンプロテイナーゼ
のプラスミンを（Arg561−Val562部位での開裂によっ
て）生成される酵素である。研究されているプラスミノ
ーゲンアクチベーターの中には細菌性タンパク質である
ストレプトキナーゼ、腎およびその他の場所で合成さ
れ、普通は尿から排出される酵素であるウロキナーゼ、
および細胞内層の血管壁から産生される酵素であるヒト
組織プラスミノーゲンアクチベーター（ｔ−PA）があ
る。

これらプラスミノーゲンアクチベーターの作用機序は
それぞれ異なっており、ストレプトキナーセはプラスミ
ノーゲンと複合体を形成してプラスミン活性を生じさ
せ、ウロキナーゼはプラスミノーゲンを直接開裂し、そ
してｔ−PAはフィブリンおおびプラスミノーゲンと３成
分の複合体を形成して血餅の存在する場所でプラスミノ
ーゲン活性を誘導する。

ｔ−PAは、その高いフィブリン特異性とインビボにお
ける強力な血餅溶解能のおかげで、心筋梗塞などの心疾
患を並外れて処置できると示されている、特に重要かつ
強力な新たな生物学的医薬物質として同定され、記載さ
れている。

ｔ−PAは多くの科学雑誌および特許出願公報の標的と
なっている。その存在は幾つかの研究グループを刺激
し、多くの情報が提供されてきたが、最初は、コーレン
［Collen、1981年12月16日公開の欧州特許出願公開第4
1,766号］らにより、天然起源から実質的に純粋な単離
物として同定され、要件としてのプラスミノーゲンアク
チベーター活性がインビボにおいて試験された。さら
に、対応する科学雑誌であるリッケン（Rijken）らのJ.
Biol.Chem.,256:7035（1981）も参照のこと。

その後、組換えDNA技術が使用されて独特の環境下で
大量のｔ−PAを得ることに成功し、その研究に基づきDN
A配列および推定アミノ酸配列が明らかにされ、ｔ−PA
の完全な同定および特性化がなされた。この研究は、ペ
ニカ（Pennica）らのNature,301:214（1983）、および1
983年11月９日公開の欧州特許出願公開第93,619号に報
告されている。

多くの他の研究者が、基本的にこの後者の開示を利用
することにより組換えDNA技術によってｔ−PA分子を調
製できるようになり、それに基づく報告を行っている。
これらの研究者の中には、この基本的な構造の将来可能
な変異体を公に開示している者もあるが、彼らは、生物
学的または薬物動態的効果が全体として変動し得る誘導
体を、机上論として単に予測しているに過ぎない。これ
らの開示事項は大部分、実際の生物学的または薬物動態
的な全体の効果に関して予言的であり、不確かなもので
ある。

最初のｔ−PAの組換え工学的な生産に引き続いて、そ
の分子特性の確定および生物学的効果と確認という研究
所における類似した試みが、科学文献および各種の特許
出願の両方に現実に報告されている。これらすべては、
生物学に基づく種々の最終目的に応じ、ｔ−PAの商業的
可能性を完全に探究し、開発するために、その基本構造
を修飾しようという試みに沿った研究が好まれる傾向に
あるようである。

このような研究および開示事項に部分的に基づけば、
ｔ−PAの分子は、トリプシン、キモトリプシン、プラス
ミノーゲン、プロトロンビン、フィブロネクチンおよび
表皮性成長因子（EGF）などの他の種々のタンパク質中
に同定される相同的（ホモローガス）な、またはそうで
なくてもそれらに類似した構造に照らして規定される５
つのドメイン（アミノ酸配列の並び）を含有しているこ
とは、現在では明らかであると思われる。これらのドメ
インは、ｔ−PAのアミノ酸配列のＮ−末端から開始し
て、（１）アミノ酸１から約44を包含するものとして種
々規定されるフィンガー領域（Ｆ）、（２）アミノ酸約
45からアミノ酸91にまで伸長するものとして種々規定さ
れる成長因子領域（Ｇ）［EGFとの相同性に基づく］、
（３）アミノ酸約92からアミノ酸約173にまで伸長する
ものとして種々規定されるクリングル１（K1）、（４）
アミノ酸約180から約261にまで伸長するものとして種々
規定されるクリングル２（K2）、および（５）アミノ酸
約264からｔ−PA分子のＣ−末端にまで伸長するものと
して一般に規定される、いわゆるセリンプロテアーゼド
メイン（Ｐ）、と命名されている。これらのドメインは
一般に、互いに隣接して配置しているか、または短い
「リンカー」領域によって分割され、推定された成熟型
のｔ−PAの１から527アミノ酸全体のアミノ酸配列を占
めている。

各ドメインは、ある種の比活性に関与するものとして
種々記載されている。フィンガードメインは、フィブリ
ンとの高い結合親和性にとって少なくも主要な重要性を
持つ配列を含有しているものとして種々記載されている
（この活性は、ｔ−PAがフィブリン豊富な血栓の病巣に
おける血餅の溶解に対して顕す高い特異性にとって重要
であると考えられている）。成長因子様領域も、同様
に、好くなくともウロキナーゼに関しては細胞表面結合
活性に関係している。クリングル２領域も、フィブリン
結合性、およびｔ−PAの活性を刺激するフィブリンの刺
激能に強く関係している。セリンプロテアーゼドメイン
は、プラスミノーゲンを活性化するためのｔ−PA活性に
関与している。

可能性あるＮ−連結グリコシル化部位は、天然の成熟
ｔ−PAについて番号付けすれば分子内の117、184、218
および448アミノ酸部位に存在している。218アミノ酸部
位は天然ｔ−PAではグリコシル化されていない。117ア
ミノ酸におけるグリコシル化部位は、高いマンノース型
であると特性化され、他の２つの部位はいわゆる複合オ
リゴサッカライド構造を呈している。ｔ−PA分子をグリ
コシル化可能な宿主細胞から誘導させた場合、117およ
び448部位は常にグリコシル化されるようであるが、184
部位は分子の約50％がグリコシル化されると考えられ
る。

この184部位のグリコシル化／非グリコシル化現象
は、SDS−PAGE分析によって証明されており、それによ
れば１つは184位のグリコシル化分子に関連し、他方は1
84位の非グリコシル化分子に関連する２つのバンドを認
めることができる。これらのバンドはそれぞれｔ−PAの
Ｉ型およびII型と命名されている。この部分的なグリコ
シル化パターンは、184部位がｔ−PAタンパク質内の立
体配座的（コンホーメーション的）に保護された部位に
配置している結果であると考えられる。

科学的に注目されている他の場所は、アミノ酸275か
ら約279として規定される領域内にある、いわゆるタン
パク分解的開裂部位、より具体的には天然分子の275お
よび276アミノ酸間の結合である。タンパク分解的に崩
壊され難くなるようにこの部位に突然変異を起こさせれ
ば、生物学的および商業的に何等かの利点を有すると考
えられる、単一鎖すなわち１本鎖形態を維持した分子が
創製される。

既述のように、もう１つのプラスミノーゲンアクチベ
ーターであるウロキナーゼは、ヒトの尿およびヒト腎細
胞培養液から精製され［グンツラー（Gunzler）らのHop
pe−Seyler′s Z.Physiol.Chem.,363:1155−1165（198
2）、およびステフェンス（Steffens）らのHoppe Seyle
r′s Z.Physiol.Chem.,363:1043−1058（1982）］、組
換え的に製造されている［EPO公開第154,272号およびホ
ーメス（Holmes）らのBiotechnology,3:923−929（198
5）］。

ウロキナーゼは411個のアミノ酸を含有しており、そ
れはＮ−末端リーダー配列を伴って産生されてプロウロ
キナーゼの生産を導びき、それが成熟期に開裂されて製
造される。プロウロキナーゼは逆にピラスミンにより開
裂され、２つのウロキナーゼ種になる：分子量54,000ダ
ルトンのものと分子量33,000ダルトンのものである。

ウロキナーゼは３つの同定可能なドメインを有してい
る：すなわち、５位から49位までを包含する成長因子ド
メイン、50位から136位までを含むクリングルドメイ
ン、および159位から411位までを包含するセリンプロテ
アーゼドメインである。プロウロキナーゼも同様に、こ
れら３つのドメインから構成される。グンツラーらを参
照（前掲）。ウロキナーゼ内における酵素学的に活性な
アミノ酸残基は204位、255位および356位に位置してお
り、Ｎ−連結グリコシル化部位はAsn302に存在する。

ウロキナーゼは、大量に使用した場合、凝集の崩壊と
フィブリン分解因子の活性化を招来し、出血傾向に導
く。これとは対照的に、EPO公開第139,447号およびJ.Bi
ol.Chem.260:12377（1985）に記載されている、ヒトウ
ロキナーゼの前駆体であるプロウロキナーゼは、実質的
な出血を誘発させることなく、血栓を溶解する［Cell S
truc.Func.,10:151（1985）］。

プラスミノーゲンアクチベーターおよび第二世代のそ
の誘導体に関しては、ハリス（Harris）のProtein Engi
neering,1:449−458（1987）に概説されている。

天然のｔ−PAは、治療学的有効量で患者に投与した場
合、通常約６分またはそれ以下の血漿半減期を示す。プ
ロウロキナーゼも同様の半減期を有する。このような半
減期は、例えば心筋梗塞または肺塞栓症などの致死性の
疾患に対して急性の攻撃的治療を施すような特定の場合
には望ましい。この高い危険性を伴う状況下では、制御
できない出血傾向を引き起こす重要な、または認識でき
ない可能性を有する患者を処置してしまう場合がある。
このような出血が起こった場合は、薬物投与を中止すれ
ば、その原因となるｔ−PAレベルは速いクリアランス速
度によって即座に消失されよう。

しかし、他の状況下、例えば再灌流（reperfusion）
を行って心筋梗塞を処置する場合、望ましい治療計画は
攻撃性の低い、長時間（４から12時間）にわたるもので
ある。長い半減期型のｔ−PAは、生命が脅かされている
ような状況にない患者ではさらに望ましく、効率的かつ
簡便な処置と考えることができる。さらに、より長い半
減期のｔ−PAはボーラス投与用の剤として望ましいであ
ろう。例えば、救急車の職員は一般に注入の資格をもっ
ていないので、より大きな半減期を有するｔ−PA様物質
を使用するのは非常に望ましいであろう。

ｔ−PAにおける上記の規定されたドメインおよびグリ
コシル化部位のすべて、および１本鎖/2本鎖開裂部位
は、特定の潜在的生物学的活性成分を有するものとして
記載されている。例えば、フィンガードメインの実質的
部分またはそのすべてを除去すれば、フィブリン結合特
性が実質的に減じられているが、代わって得られた分子
の全体としてのクリアランス速度は低下している分子が
得られることになる。

天然分子を修飾して１本鎖から２本鎖への開裂部位を
破壊すると、若干改変された生物活性と、より良好な安
定性とを有しており、同時にフィブリン結合性とフィブ
リン刺激性とが２本鎖ｔ−PAと比較して増大している分
子が得られる。

117−119、184−186および448−450におけるグリコイ
ル化突然変異体は、炭水化物のモル％が現象するに連れ
て、より高い比活性を示した。EPO公開第227,462号を参
照のこと。さらにDNA修飾によってＮ−フリコシル化部
位は選択的に除去されているが残りのＯ−連結炭水化物
は含有している、Asn119、Ala186およびAsn450のｔ−PA
突然変異体は、インビトロ溶解性試験においてメラノー
マ（黒色腫）ｔ−PAの約２倍も強力であることが見いだ
された。EPO公開第225,286号参照。

しかし、グリコシル化部位を改変、特に117アミノ酸
を改変した場合、改変された循環半減期のパターンおよ
び／またはフィブリン結合特性を付加的に招来する場合
のある、溶解性に影響を受けた分子が常に得られるよう
である。

ｔ−PAの成長因子ドメインを除去した場合は、ファン
・ゾンネベルド（A.J.van Zonneveld）らのThrombos.Ha
emostas.,54（１）４（1985）に報告されているよう
に、得られた突然変異体は依然活性であり、フィブリン
と結合する。また、成長因子ドメインに種々の欠損を施
した場合については特許文献に報告されている。EPO公
開第241,209号（デス51−87）、EPO公開第241,208号
（デス51−87およびデス51−173）、PCT87/04722（Ｎ−
末端１−91のすべてまたはその一部を除去）、EPO公開
第231,624号（成長因子ドメインすべての除去）、およ
びEPO公開第242,836号および日本国特許出願公開第62−
269688号（成長因子ドメインのいずれかまたはすべての
除去）を参照のこと。

ｔ−PAの最初のクリングルドメインおよび成長因子ド
メインに修飾を施すことで、循環半減期を増大させるこ
とができる。1987年10月14日公開のEPO特許公開第241,2
08号を参照のこと。アミノ酸51および87間の領域をまと
めてｔ−PAから除去すれば、血漿からのクリアランスが
よりゆるやかな変異体を得ることができる［ブローン
（Browne）らのJ.Biol.Chem.263:1599−1602（198
8）］。さらに、ｔ−PAは、特定のアミノ酸残基を除去
するか、または１つもしくはそれ以上のアミノ酸を別の
アミノ酸と置換することによって、逆の生物学的効果を
伴わずに、成熟した天然ｔ−PAの67−69アミノ領域を修
飾することができる。1987年10月７日公開のEPO特許公
開第240,334号を参照のこと。さらに、ヒトプロウロキ
ナーゼタンパク質の表皮性成長因子ドメインのすべてま
たはその一部を除去するか、１つもしくはそれ以上の別
のアミノ酸残基と置換した場合、得られた変異体は血中
半減期が増大している。1988年１月20日公開のEPO特許
公開第253,241号を参照のこと。

当該技術分野においては、天然のプラスミノーゲンア
クチベーター分子以上に改善された薬物動態特性のプラ
スミノーゲンアクチベーター分子を付与するよう修飾す
ることのできる、該分子内における特定の部位を確定す
ることが現在の継続的な要求である。このような変異体
分子は、心臓血管疾患、および血管の血栓塞栓性閉塞に
起因する他の多くの臨床状態を処置する上で医療科学的
に重要である新規な代替法を提供することになろう。

このように、本発明の目的の１つは、改善された治療
学的および医薬的性質を示す血餅−溶解性物質を必要す
る患者にプラスミノーゲンアクチベーター分子を提供す
ることである。

本発明の他の目的は、現在入手可能な血餅−溶解性物
質と比較してより長い半減期およびより遅い血漿からの
クリアランス速度を有するプラスミノーゲンアクチベー
ター分子を提供することである。

また、本発明は、天然ｔ−PAと比較してより長い循環
半減期およびより長い血漿からのクリアランス速度を有
する血餅−溶解性物質を使用することのできる状態、例
えば深静脈血栓または末梢動脈血栓（末梢血管疾患）な
どの疾患を処置することを目的としている。

これらおよびその他の目的は当業者には明白であろ
う。

これらの目的は、フィブリン溶解活性を示し、かつ対
応する天然プラスミノーゲンアクチベーターではグリコ
シル化されていない１つまたはそれ以上の領域がグリコ
シル化されているプラスミノーゲンアクチベーターのア
ミノ酸配列変異体が得られたことによって達成される。

１つの好ましい態様では、このようなグリコシル化
は、式:Asn−Ｘ−SerまたはAsn−Ｘ−Tyr［式中、Ｘは
プロリン以外のアミノ酸である］で示されるトリペプチ
ド配列を含有する変異体の部位で行われる。

もう１つの態様では、プラスミノーゲンアクチベータ
ーはその成長因子ドメイン内がグリコシル化されてい
る。

さらに他の態様では、プラスミノーゲンアクチベータ
ーはｔ−PAであり、ｔ−PAの天然アミノ酸配列にしたが
って番号付けした場合のその67位におけるチロシン残基
が、アスパラギン、セリンまたはスレオニンなどのグリ
コシル化することのできる他のアミノ酸（好ましくはア
スパラギン）と置換しているものである。

本発明はその他の態様として、上記の変異体をコード
しているDNA配列、形質転換宿主細胞内でそのDNA配列を
発現することのできる複製可能な発現ベクター、および
そのベクターによって形質転換されている微生物および
細胞培養物を提供するものである。

さらに、本発明は、医薬的に許容され得る担体と一緒
になって本明細書に記載の変異体を治療学的有効量で含
有してなる、血管疾患または症状を処置するための組成
物を提供するものである。

さらにもう１つの態様として、本発明は、本発明の変
異体を含有する前記の組成物を患者に投与することを特
徴とする、患者における血管疾患または症状の処置方法
を提供するものである。

本発明は、天然分子では通常グリコシル化されていな
いプラスミノーゲンアクチベーターの部位がグリコシル
化されることにより、天然物質と比較して延長した循環
半減期とより遅いクリアランス速度とを示す変異体が得
られることを証明した、特定の成功を収めた研究を特に
基礎としている発明である。本発明の結果物は、アミノ
酸配列が全体としては実質径に天然物質と異なっている
が、商業的方面の開発において天然物質と競合できる程
に、またはその代替物質としての薬物動態的性質を有す
る分子である。

第１図は、哺乳動物細胞および酵母から産生されたタ
ンパク質のＮ−連結グリコシル化のポターンを表示する
ものであり、図中、SAはシアル酸を、galはガラクトー
スを、manはマンノースを、GlcNaCはＮ−アセチルグリ
コサミンを、そしてAsnはアスパラギンをそれぞれ表し
ている。

第２図は、５つのドメイン、ジスルフィド架橋および
グリコシル化部位の位置を示しているｔ−PAの１次構造
である。

第３図は、３つのドメイン、ジスルフィド架橋および
グリコシル化部位の位置を示しているウロキナーゼの１
次構造である。

第4a図、第4b図および第5a図、第5b図は、pCISt−PA
を調製するための適当な方法を説明し、その主要な制限
部位を幾つか併せて記載している模式図である。

第６図はp7−1Hを調製するための適当な方法を説明
し、その主要な制限部位も幾つか併せて記載している模
式図である。

第７図は、天然の比活性に対する百分率（％）として
表している、rt−PAおよびグリコシル化されているN67t
−PAのインビトロ血餅溶解の結果およびＳ−2251の結果
を示すものである。結果は、幾つかの独立した観察事項
（血餅溶解、４つの測定値;S−2251、２つの測定値）の
平均である。すべては、293細胞において一時的に発現
された物質由来であり、ELISAによって定量した。

第８図は、ｔ−PA濃度10ng/mlにおけるrt−PAおよび
グリコシル化されているN67t−PAのフィブリン結合性を
示している。両者共に293細胞で一時的に発現させた。

第9A−9C図は、還元し、カルボキシメチル化したrt−
PA、N67t−PA、およびＮ−グリカナーゼ処理（脱グリコ
シル化）N67t−PAのトリプシン・マッピング分析におけ
る逆相HPLCプロフィルをそれぞれ示すものである。すべ
て、293細胞で一時的に発現させた。

第10図は、rt−PA、デス１−44t−PA、デス１−44E27
5t−PA、デス１−44E275D184、およびグリコシル化N67t
−PAのウサギにおける薬物動態プロフィルを示すもので
ある（N67t−PAを除いてすべて、安定なCHOセルライン
から発現された）。N67物質は293細胞における一時的な
発現により入手した。

好ましい態様の詳細な説明 A.定義本明細書で使用している「プラスミノーゲンアクチベ
ーター」なる用語は、プラスミノーゲンをプラスミンに
変換できるタンパク質を意味する。このようなプラスミ
ノーゲンアクチベーターには例えば、あらゆる種由来
の、好ましくはヒト由来の組織型プラスミノーゲンアク
チベーター、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ；ストレ
プトキナーゼなどがある。これらプラスミノーゲンアク
チベーターは、例えば組換え細胞培養系によって生物活
性型で産生させることができる。配列全体におけるアミ
ノ酸（群）の相違から証明されるように、個体間毎に天
然のアレル変異体が存在し、生じていることは理解され
よう。

「対応する天然のプラスミノーゲンアクチベーターで
はグリコシル化されていない１つまたはそれ以上の領域
がグリコシル化されている」なる表現は、Ｎ−またはＯ
−連結の別は問わず、酵母または哺乳動物宿主という由
来を問わず、また複雑な高マンノースまたは雑種構造の
いかんにかかわらず、天然分子では実際にまたは潜在的
にもグリコシル化されない領域に起こっているグリコシ
ル化を意味する。このような実際または潜在的な位置
は、ｔ−PAおよびウロキナーゼについてそれぞれ第１図
および第２図に丸印で示している。したがって、例えば
ｔ−PA分子内にはＮ−グリコシド連結の可能性ある部位
は４つあるが（Asn117、Asn184、Asn218およびAsn44
8）、天然のｔ−PAは実際には３つの部位（117、184、
（分子の50％）および448）しかグリコシル化されてい
ない。ｔ−PAにおけるAsn218−Pro−Ser部位はグリコシ
ル化の可能性ある部位であるが、その配列にはプロリン
が存在しているので、哺乳動物細胞では、炭水化物結合
に利用されない［ポール（G.Pohl）らのBiochemistry,2
33701（1984）を参照］。ウロキナーゼでは、グリコシ
ル化は302位に起こる。

本明細書で使用している「成長因子ドメイン」なる用
語は、ヒトおよび／またはネズミ表皮性成長因子と構造
的にホモローガス（相同的）なプラスミノーゲンアクチ
ベーターの領域を意味する［例えば、バニャイ（Banya
i）らのFEBS Lett.,163:37（1983）を参照］。ｔ−PA内
では、この領域はアミノ酸約44から約91にまでわたる。
プロウロキナーゼでは、この領域は約Ｎ−末端セリンか
ら約49番目のアミノ酸残基スレオニンにまでわたる。そ
して、ウロキナーゼでは、約５から約49にこの領域がわ
たっている。ｔ−PAにおけるこのドメインの大部分（51
−86残基）をコードしているDNAおよび50−87残基を部
分的にコードしているDNAは、単一のエクソンに含有さ
れている［ネイ（Ny）らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.
A.,81:5355（1984）］。

本明細書で使用している「ヒト組織プラスミノーゲン
アクチベーター」、「ヒトｔ−PA」および「ｔ−PA」な
る用語は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換するこ
とのできるプロテアーゼドメイン、およびフィブリン結
合性に関与していると考えられているグリングル含有ド
メインから構成される２つの機能的領域を含有するヒト
外因性（組織型）プラスミノーゲンアクチベーターを規
定するものである。したがって、これら３つの用語に
は、配列全体の一部としてこれらの機能的なドメインを
含有するポリペプチドが含有される。

ｔ−PAにおける「２本鎖開裂部位」は少なくとも275
位のアルギニン残基を含有している。しあし、275位の
幾つかの残基内のまたはそれに隣接している種々のアミ
ノ酸も、プラスミノーゲンアクチベーターをその２本鎖
型に変換させる酵素によって認識されるドメインの一部
であると考えられる。したがって、275位以外のそのド
メイン内の位置のアミノ酸を置換することにより、２本
鎖型への変換に耐性である突然変異プラスミノーゲンア
クチベーターを得ることができるであろう。

特定の態様では、「１本鎖プラスミノーゲンアクチベ
ーター突然変異体」とは、２本鎖型への変換に耐性であ
るプラスミノーゲンアクチベーターである。その特徴
は、２本鎖活性部位における単一または多重アミノ酸の
置換である。修飾されれば、このような活性部位は酵素
学的に認識されず、したがって通常プラスミノーゲンア
クチベーターをその２本鎖型に変換する酵素によっては
加水分解されない。このような突然変異体の注目に値す
る例としては、275から279領域内に修飾を施すことによ
って、例えば275位にグリシンまたはグルタミン酸など
のアルギニン以外のアミノ酸を有する、および275位に
グルタミン酸および277位にイソロイシンを有する、275
/276開裂部位の開裂に対して耐性である分子（それぞれ
G275,E275、おおびE275I277と命名される）が挙げられ
る。これらの１本鎖突然変異体は欧州特許出願第199574
号（1986年10月29日）により詳細に記載されている。

B.一般的方法 1.グリコシル化プラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸配列変異
体は、Ｏ−またはＮ−連結を介してグリコシル化するこ
とができ、そして天然分子では通常はグリコシル化され
ていない少なくとも１つのアミノ酸配列を含有していな
ければならない。

Ｎ−連結グリコシル化を考えた場合、変異体における
グルコシル化部位は、式：アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−
スレオニン［式中、アスパラギンはアクセプターであり、Ｘはグリ
コシル化を妨げるプロリンを除く、遺伝学的にコードさ
れた20個のアミノ酸のいずれかである］で示されるトリペプチド配列である。ストラック（D.K.
Struck）およびレンナーツ（W.J.Lennarz）のThe Bioch
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ーツ編，プレノーン・プレス,1980,35頁；マーシャル
（R.D.Marshall）のBiochem.Soc.Symp.,40:17（197
4）、およびウィンツラー（Winzler,R.J.）のHormonal
Proteins and Peptides（リー（Li,C.I.）編）１−15頁
（アカデミック・プレス，ニューヨーク,1973）を参照
のこと。本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、適切
な部位（群）に適当なアミノ酸（群）を挿入するか、ま
たは適切な部位（群）のアミノ酸（群）を適当なアミノ
酸と置換してグリコシル化を行うことによって、修飾さ
れている。

Ｏ−連結グリコシル化を使用する場合は、Ｏ−グリコ
シド連結は動作細胞では、Ｎ−アセチルガラクトサミ
ン、ガラクトースまたはキシロースと、数種のヒドロキ
シアミノ酸の中の１つ、最も普通にはセリンまたはスレ
オニンで起こるが、さらにある場合には、分子の適当な
領域内に位置する５−ヒドロキシプロリンまたは５−ヒ
ドロキシリジン残基との間でも起こる。

哺乳動物によって産生されるタンパク質のグリコシル
化パタンーンは、The Plasma Proteins:Structure,Func
tion and Genetic Control,プットナン（F.W.Putnam）
編,2版,4巻（アカデミック・プレス，ニューヨーク,198
4）,271−315頁に詳細に記載されている。この章では、
アスパラギン連結オリゴサッカライドが論じられてお
り、これはその文献の中で、複合体、高マンノース（hi
gh mannose）および雑種構造と命名される少なくとも３
つのグループ、ならびにＯ−グルコシル的に連結したオ
リゴサッカライドに細分類されている。

グリコシドのタンパク質への化学的および／または酵
素学的カップリングは、例えばアプリン（Aplin）およ
びリストン（Wriston）のCRC Crit.Rev.Biochem.,259−
306頁（1981）に記載されているように、種々の活性化
された基を使用して行うことができる。この化学的カッ
プリング法の利点は、それが比較的単純であり、天然に
おけるＯ−およびＮ−連結グルコシル化に要求される複
雑な酵素学的機構を必要としない点である。使用するカ
ップリング法の態様に応じて、糖（群）を、（ａ）アル
ギニンまたはヒスチジン、（ｂ）グルタミン酸またはア
スパラギン酸などの遊離カルボキシ基、（ｃ）システイ
ンなどの遊離スルフィドリル基、（ｄ）セリン、スレオ
ニンまたはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシ
基、（ｅ）フェニルアラニン、チロシンまたはトリプト
ファンなどの芳香性残基、または（ｆ）グルタミンのア
ミド基と結合させればよい。これらの方法は、1987年９
月11日公開のPCT WO87/05330により詳細に記載されてい
る。

酵母から産生されるタンパク質のフリコシル化のパタ
ーンはタンナー（Tanner）およびレール（Lehle）のBio
chim.Biophys.Acta,906（１）:81−99（1987）およびク
クルチンスカ（Kukuruzinska）らのAnnu.Rev.Biochem.,
56:915−944（1987）に詳細に記載されている。

さらに、第１図には、哺乳動物細胞および酵母から産
生されるタンパク質のＮ−連結グリコシル化の両パター
ンを比較して示している。

2.アミノ酸配列変異体本明細書に記載の変異体について論じるために、ｔ−
PAおよびヒトウロキナーゼの一次構造をそれぞれ示した
第２図および第３図を引用して行う。

第２図では、丸印内の文字は１文字アミノ酸コードで
あり、両鎖間の連結線はジスルフィド架橋を示してお
り、白抜きの丸印はグリコシル化部位を示しており、そ
してＦ、GF、K1、K2およびSPなる略語はそれぞれ、フィ
ンガー、成長因子、クリングル１、クリングル２および
セリンプロテアーゼドメインを表している。

第３図では、丸印内の文字は１文字アミノ酸コードで
あり、両鎖間の連結線はジスルフィド架橋を、白抜きの
丸印はグリコシル化部位を、そしてGF、ＫおよびSPなる
略語はそれぞれ成長因子、クリングルおよびセリンプロ
テアーゼドメインを示している。

本明細書に記載しているプラスミノーゲンアクチベー
ター変異体を簡略命名法によって命名するため、数字
は、推定の成熟ｔ−PA［EPA公開第93,619号］、成熟ヒ
トウロキナーゼおよびプロウロキナーゼのアミノ酸配列
に沿ったアミノ酸残基／位置を表していることに留意さ
れたい。アミノ酸の特定には以下のようなアルファベッ
トの１文字を使用している：このような１文字の後にある数字はアミノ酸の位置を
表しており、したがって例えばD184は、184位にアスパ
ラギン酸を有している変異体を意味している。

本発明の目的に適うグリコシル化部位（群）は、対応
する天然タンパク質において既にグリコシル化されてお
らず、またはその可能性のない分子内のあらゆる部位
（群）でよいのであるが、外部にさらされている分子位
置内の部位であることが好ましい。このような領域とし
ては、例えばｔ−PAの（成長因子ドメイン内の）57位か
ら61位、63位から69位、および78位から82位のアミノ酸
位置が挙げられる。これらの領域はそれぞれ、アペラ
（Appella）らのFEBS Letters,231:1−４（1988）の第
２図に示された１型成長因子ドメインのＡ、ＢおよびＣ
ループに相当する。したがって、Ｏ−連結グリコシル化
のためには、これらの領域内の１つまたはそれ以上のア
ミノ酸をセリン、スレオニンまたは５−ヒドロキシリジ
ン残基と置換またはそれらを付加する。

これらの領域を使用するＮ−連結グルコシル化に適し
た代表的変異体には、S60t−PA、S17ウロキナーゼ、T60
t−PA、T17ウロキナーゼ、N64S66t−PA、N64T66t−PA、
Ｓ−24ウロキナーゼ、T24ウロキナーゼ、N65S67t−PA、
N65T67t−PA、N23S25ウロキナーゼ、N23T25ウロキナー
ゼ、N67t−PA、N67T69t−PA、N25ウロキナーゼ、N25T27
ウロキナーゼ、N78S80t−PA、N78T80t−PA、N36S38ウロ
キナーゼ、N36T38ウロキナーゼ、N79S81t−PA、N79T81t
−PA、N37T39ウロキナーゼ、N37T39ウロキナーゼ、N80S
82t−PA、N80T82t−PA、N38S40ウロキナーゼ、N38T40ウ
ロキナーゼ、または例えばS60N65T67t−PAもしくは、S6
0N78S80t−PAなどの、１つのループと他のループとの組
合わせ物がある（ここに、ウロキナーゼはヒトウロキナ
ーゼを意味し、ヒトプロウロキナーゼをも包含する）。

１つの好ましい態様は、Ｎ−連結グリコシル化部位が
ｔ−PAの67位から69位、ならびにヒトウロキナーゼおよ
びヒトプロウロキナーゼの25位から27位におけるチロシ
ン−フェニルアラニン−セリンのトリペプチド配列の場
合である。

本明細書に記載のプラスミノーゲンアクチベーター変
異体は、天然の配列における１つまたはそれ以上の部位
が修飾されていることにより天然分子では通常グリコシ
ル化されない部位がグリコシル化されていることに加
え、さらに天然配列におけるその他の領域に残基の置
換、欠失または挿入を含み該分子の特定の性質が改良さ
れていることもある。

例えば、本発明のｔ−PA変異体には、少なくともフィ
ンガードメインの部分を欠き、および／または184アミ
ノ酸の回りのグリコシル化部位におけるグリコシル化能
を欠いているものがあり、また275および276アミノ酸の
回りの部位にタンパク分解的開裂に対して耐性を示し、
および／またはグリングル２の推定リジン結合部位にア
ミノ酸修飾を有するものもある。

さらに、ｔ−PAのフィブリン結合性は調整することが
でき、最も好ましいものは、ｔ−PAの推定リガンド結合
性ポケットの反対の端における陽性または陰性に帯電す
るアミノ酸残基を適当に置換することによって、フィブ
リン結合性を修復または増大させることである。本発明
の変異体は一般に、以下で詳細に説明する部位−特異的
突然変異まはた切除／連結法によって調製される。

このようなｔ−PA変異体を特別に例示すれば、アミノ
酸１−44を欠いている分子（デス１−44と命名）、184
位にアスパラギン酸を有している分子（D184と命名）、
および１本鎖プラスミノーゲン突然変異体が挙げられ
る。アミノ酸１−44を欠く変異体は同時係属中の米国特
許出願第68,448号（前掲）により完全に記載されてい
る。

上記のｔ−PA変異体はすべて、本分子内の種々の他領
域が修飾されていてもよい。例えば、１クリングル１の修飾、例えば約92から179の欠失、
および／または２クリングル２の修飾、例えばアミノ酸約205−215領
域、特に210−213における修飾、および／または３アミノ酸約244−255、特に252またはその部位、お
よび／または４アミノ酸約233−242、特に236−238、および／また
は５アミノ酸184などの既知のグリコシル化部位。

67位にアスパラギンを有する上記変異体の具体例を以
下に記載する：デス１−44N67D184G275t−PA、デス１−
44N67D184E275t−PA、デス１−44N67G275t−PA、デス１
−44N67E275t−PA、デス１−44N67Q275I277t−PA、デス
１−44N67D184E275I277t−PA、デス１−44N67E275I277t
−PA、デス１−44N67R210A211R212R213E275t−PA、デス
１−44N67R210A211R212R213E275I277t−PA、デス１−44
N67K213E275t−PA、デス１−44N67K213E275I277t−PA、
デス１−44N67R252E275t−PA、デス１−44N67R252E275I
277t−PA、デス１−44N67K210E275t−PA、デス１−44N6
7K210E275I277t−PA、デス１−44N67R210H211Q212K213E
275t−PA、デス１−44N67R210H211Q212K213E275I277t−
PA、デス１−44N67D184R210A211R212R213R252E275t−P
A、デス１−44N67D184R210A211R212R213R252E275I277t
−PA、N67−デス92−179D184R210A211R212R213R252E275
t−PA、またはそれらのN184およびS184同族体、および
それらの組合わせ物。

これら多くの修飾により、天然のｔ−PAと比較して有
意にクリアランス速度およびフィブリン結合性を改変す
ることができる。当業者ならば、適当な検定法によっ
て、個々の場合に望まれる、各変異体の最高の性質が何
であるのかを決定することができよう。

当業界で知られているあらゆる手段、例えば以下に記
載するような、部位特異的突然変異、または適当な配設
を関連タンパク質をコードしているDNAに連結する手段
によって、天然分子内の適当なアミノ酸（群）を変化ま
たは挿入する修飾を施して上記のような様々な配列を得
ることができる。

3.部位−特異的突然変異本明細書に沿ってｔ−PA変異体を製造するに当たって
は、好ましくは、ｔ−PAタンパク質の初期に調製された
変異型または非変異型誘導体をコードしているDNAに部
位−特異的突然変異を施す。部位−特異的突然変異によ
れば、回避しようとする（トラバースしようとする）突
然変異部位の両側に安定な二重ラセン（duplex）を形成
するに充分な大きさおよび配列複雑性を有する配列とな
る、所望の突然変異のDNA配列をコードしている特定の
オリゴヌクレオチド配列、および十分な数の隣接ヌクレ
オチドを使用することによって、ｔ−PA変異体を製造す
ることができる。通常は、約20−25長のヌクレオチドの
プライマーが好ましく、その配列の接合部の両側におけ
る約５−10の残基が改変される。部位−特異的突然変異
の技法は、アデルマン（Adelman）らのDNA2:183（198
3）などの刊行物によって例示されているように、一般
には当業界周知である。

この部位−特異的突然変異技法は通常、１本鎖および
２本鎖の両形態で存在するファージベクターを使用する
ことは理解されているとおりである。部位−特異的突然
変異に有用である代表的なベクターにはM13ファージな
どのベクターがあり、これは例えばメッシング（Messin
g）らの第３回クリーブランドにおける、巨大分子およ
び組換えDNAについてのシンポジウム［Third Cleveland
Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA、
ウオルトン（A.Walton）編，エルセビア（Elsevier），
アムステルダム（1981）］に開示されている。これらの
ファージは市販されており容易に入手でき、それらの使
用法は一般に当業者には周知である。あるいは、１本鎖
DNAを得るために、１本鎖ファージの複製起点を含有す
るプラスミドベクター［エイラ（Veira）らのMeth.Enzy
mol.153:3（1987）］を使用することもできる。

一般に、本発明にしたがった部位−特異的突然変異
は、適切なプラスミノーゲンアクチベーターをコードし
ているDNA配列をその配列内に含有する１本鎖ベクター
をまず入手することにより実施する。所望の突然変異配
列を有するオリゴヌクレオチドプライマーは、一般には
合成的に、例えばクレア［Crea,Proc.Natl.Acad.Sci.,
U.S.A.75:5765（1978）］らの方法によって調製する。
次いで、このプライマーを１本鎖のｔ−PA配列含有ベク
ターとアニーリングし、E.coli（大腸菌）ポリメラーゼ
ＩクレノーフラグメントなどのDNAポリメラーゼ酵素反
応に供することにより、突然変異を含有する鎖（ストラ
ンド）の合成を行う。このようにして、一方の鎖が元の
非突然変異配列をコードしており、他方の鎖が所望の突
然変異を有しているヘテロ二重ラセン（heteroduplex）
を形成させる。次いで、このヘテロ二重ラセンベクター
を使用し、JM101細胞などの適当な細胞を形質転換する
ことにより、突然変異配列の並びを有する組換えベクタ
ーを含有したクローンを選択する。

このようなクローンを選択した後、ｔ−PAの産生に適
したベクター、一般には適当な真核生物宿主の形質転換
に使用することのできるタイプの発現ベクター内に、得
られた突然変異ｔ−PA領域を移動させ、配置させる。本
発明においては、長期に安定なｔ−PA産生体を調製する
ための好ましい細胞は、CHO細胞または293細胞［グラハ
ム（Graham）らのJ.Gen.Virol.,36:59（1977）に記載さ
れているイト腎細胞］である。しかし、本発明のCHO生
産に限定されるものではなく、特に、試験目的として該
酸素を一時的にだけ生産させたい場合などは、多くの他
のタイプの細胞を使用することができることが分かって
いる。例えば、293細胞を使用する一時的系を以下に記
載しているが、これは分析用のｔ−PA変異体を生産する
ための簡便な系を提供するものである。

4.開裂／連結法プラスミノーゲンアクチベーターをコードしているDN
A配列に突然変異を作成して新たなグリコシル化部位を
導入する別の方法は、プラスミノーゲンアクチベーター
をコードしているDNAを制限酵素により適当な場所で開
裂し、適切に開裂されたDNAを回収し、グリコシル化の
ために望ましいアミノ酸配列をコードしているオリゴヌ
クレオチドを合成し、そして平滑末端を有するポリリン
カーなどの領域をフランキングし（あるいは、ポリリン
カーを使用する代わりに、該アクチベーター−コード化
DNAの開裂にも使用される制限酵素を使用して合成オリ
ゴヌクレオチドを消化し、それにより粘着末端を作成す
る）、最後に得られた合成DNAをプラスミノーゲン−コ
ード化構造遺伝子の残りの部分内に連結することを包含
している。

5.宿主細胞培養およびベクターチャイニーズハムスター卵巣（CHO）における発現は
結局はｔ−PA生産のために好ましいが、本明細書に記載
しているベクターおよび方法は、タンパク質のグリコシ
ル化を行う真核生物という広範な範囲にわたる宿主細胞
に好適に使用される。

一般に、DNA配列の最初のクローニングおよび本発明
に有用なベクターの構築には原核生物が好ましいのは当
然である。例えば、E.coli（大腸菌）K12株294（ATCC N
o.31,446）は特に有用である。他の使用することができ
る微生物株には、E.coli BおよびE.coli X1776（ATCC N
o.31＜537）などのE.coli株がある。当然ながら、これ
らの例示した株は限定的なものではなく、単なる説明の
ためのものである。

発現のためには、酵母および哺乳動物細胞培養物など
の真核生物宿主を使用する。サッカロマイセス・セレビ
シアエ（Saccharomyces cerevisiae）、または普通のパ
ン酵母が真核微生物の中でも最も普通に使用されている
が、他の多くの株も普通に利用することができる。サッ
カロマイセスにおいて発現させるためには通常、例えば
プラスミドYRp7が使用される［スチンクコム（Stinchco
mb）らのNature282:39（1979）、キングスマン（Kingsm
an）らのGene7:141（1979）、シェンパー（Tschemper）
らのGene10:157（1980）］。このプラスミドは、トリプ
トファン環境下での増殖能を欠いている酵母の突然変異
体株に選択マーカーを付与するtrp1遺伝子を既に含有し
ている［例えば、ATCC No.44,076またはPEP4−１（ジョ
ーンズ（Jones）のGenetics,85:12（1977））］。一
方、この酵母宿主細胞のゲノムの特徴はtrp1欠損の存在
であるので、トリプトファン不存在下で増殖させれば、
形質転換を検出するために有効な環境が提供される。

酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列には、
３−ホスホグリセレートキナーゼにかかるプロモーター
［ヒッツェマン（Hitzeman）らのJ.Biol.Chem.255:2073
（1980）］、またはエノラーゼ、グリセルアルデヒド−
３−ホスフェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピルビ
ン酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グ
ルコース−６−ホスフェートイソメラーゼ、３−ホスホ
グリセレートムターゼ、ポルビン酸キナーゼ、トリオセ
ホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラ
ーゼ、およびグルコキナーゼなどの他の解糖系酵素［ヘ
ス（Hess）らのJ.Adv.Enzyme Reg.7:149（1968）、ホー
ランド（Holland）らのBiochemistry17,4900（1978）］
にかかるプロモーターがある。適当な発現プラスミドを
構築するに当たっては、これらの遺伝子に付随する終止
配列も、発現させようとする配列の３′側で発現ベクタ
ーに連結させ、mRNAのポリアデニル化および終止を行わ
せる。増殖条件によって転写が制御されるという付加的
な利点を有している他のプロモーターには、アルコール
脱水素酵素２、イソチトクロームＣ、酸ホスファター
ゼ、窒素代謝に関与する分解酵素、および上記のグリセ
ルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素、およびマ
ルトースとガラクトースの利用に関与する酵素、にかか
るプロモーター領域がある。酵母適合性のプロモータ
ー、複製起点および終止配列を含有するプラスミドベク
ターが好適である。

真核微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物も
宿主として使用することができる。基本的には、脊椎動
物または無脊椎動物のいずれであっても、このような細
胞培養物として使用してもよい。しかし、脊椎動物細胞
への関心が高まっており、、培養物（組織培養物）中に
おける脊椎動物細胞の増殖は最近では常法になって来て
いる［Tissue Culture、アカデミック・プレス、クルス
ら（Kruse and Patterson）編集（1973）］。このよう
な有用な宿主セルラインとしては例えば、VEROおよびHe
La細胞、チャイニーズハムスター卵巣（CHO）セルライ
ン、およびW138、BHK、COS−７、293およびMDCKセルラ
インが挙げられる。このような細胞のための発現ベクタ
ーは通常、（要すれば）複製起点、発現すべき遺伝子の
前に位置するプロモーターを、必須のリボソーム結合部
位、RNAスプライス部位、ポリアデニル化部位、および
転写ターミネーター配列と共に含有している。

哺乳動物細胞で使用する場合、ウイルス材料によって
発現ベクター上に制限機能を付与することが多い。例え
ば、普通使用させるプロモーターは、ポリオーマ、アデ
ノウイルス２、および最も頻繁にはサルウイルス40（SV
40）から誘導する。SV40ウイルスにおける初期および後
期プロモーターは、両者共にSV40ウイルスの複製起点を
も含有するフラグメントとして該ウイルスから容易に入
手されるので、特に有用である［フィールズ（Fiers）
らのNature,273:113（1978）］。また、このウイルスの
複製起点内に位置するH ind III部位からBgl I部位に伸
長する約250bp配列を含有している限りは、それよりも
小さく、または大きなSV40フラグメントを使用すること
もできる。さらに、所望の遺伝子配列に正常には伴われ
ているプロモーターまたは制御配列も、そのような制御
配列が宿主細胞系に受け入れられる限りは利用すること
ができ、それは望ましいことが多い。

複製起点を付与するには、ベクターの構築に当たり、
SV40または他のウイルス（例えば、ポリオーマ、アデ
ノ、VSV、BPV）起源から誘導され得るような外来性の起
点を含有させるか、または宿主細胞の染色体における複
製メカニズムにより付与すればよい。後者の場合、ベク
ターが宿主細胞の染色体に組み込まれれば十分である場
合が多い。

変異型ｔ−PAおよびDHFRタンパク質の両方をコードし
ているDNA配列を含有する本発明のベクターによってト
ランスフェクトするための、好ましい宿主細胞を選択す
るに当たっては、使用するDHFRタンパク質のタイプに応
じて宿主を選択するのが適当である。野生型DHFRタンパ
ク質を使用する場合、DHFRに欠損がある宿主細胞を選択
することが好ましく、それによりヒポキサンチン、グリ
シンおよびチミジンを欠く選択培地中でのフォランスフ
ェクションを成功させるようなマーカーとして、DHFRを
コードしている配列が使用できるようにする。この場合
の適当な宿主細胞は、ウルローブおよびチャシン（Urla
ub and Chasin）のPeoc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.77:4216
（1980）に記載されているように調製され、増殖され
る、DHFR活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（CH
O）セルラインである。

他方、メトトレキサート（MTX）に対する低い結合親
和性を有するDHFRタンパク質を制御配列として使用する
場合、必ずしもDHFR欠損細胞を使用する必要はない。突
然変異DHFRはメトトレキサートに対して耐性であるの
で、宿主細胞自身がメトトレキサートに感受性である限
り、MTX−含有培地を選択手段として使用することがで
きる。MTXを吸収することのできる殆どの真核生物細胞
がメトトレキサートに感受性であるようである。このよ
うな有用なセルラインの例としてはCHOライン、CHO−K1
（ATCC No.CCL61）が挙げられる。

細胞培養物から満足のいく量のヒトｔ−PAが生産され
る。しかし、ある第２のコード化配列を使用して純化す
れば、さらに生産レベルを向上させることができる。こ
の第２のコード化配列は、メトトレキサートなどの外部
的に制御されたパラメーターによって影響を受けるジヒ
ドロ葉酸還元酵素（DHFR）を含有しており、したがって
メトトレキサート（MTX）濃度をコントロールすること
によって発現を制御することができる。

例えば、酵母宿主は、発現されるタンパク質に結合す
る糖の数と糖のタイプが哺乳動物宿主と異なってグリコ
シル化されるので、グリコシル化にとって最も良好な宿
主の選別は、所望のグリコシル化の型に左右される。

6.使用し得る代表的なクローニングおよび発現の方法強靱な細胞膜バリアーの無い細胞を宿主細胞として使
用する場合は、グラハム（Graham）およびフェン・デル
（Van der）編のVirology52:546（1978）に記載されて
いるリン酸カルシウム沈降法によってトランスフェクシ
ョンを行う。しかし、核注入（核インジェクション）ま
たはプロトプラスト融合法などのDNAを細胞に導入する
ための他の方法も使用することができる。

原核生物細胞、または実質的な細胞壁構築物を含有す
る細胞を使用する場合、トランスフェクションの好まし
い方法は、コーエン（Cohen）らのProc.Natl.Acad.Sc
i.,U.S.A.69,2110（1972）に記載されているような、カ
ルシウムを使用するカルシウム処置である。

所望のコード化配列および制御配列を含有する適当な
ベクターの構築には、標準的な連結法を使用する。単離
したプラスミドまたはDNAフラグントを開裂し、仕立
て、必要なプラスミドを得るのに望ましい形態に再連結
する。

開裂は、適当な緩衝液中において制限酵素（または酵
素群）で処理して行う。一般には、緩衝溶液約20μｌ
中、酵素約１単位と共にプラスミドまたはDNAフラグメ
ント約１μｇを使用する（個々の制限酵素に対して適当
な緩衝液および基質の量は、その製造会社によって特定
されている）。37℃で約１時間インキュベートする。イ
ンキュベートした後、フェノールおよびクロロホルム抽
出によってタンパク質を除去し、次いでエタノール沈殿
によって、その水性画分から核酸を回収する。

平滑末端が必要な場合は、15℃においてポリメラーゼ
Ｉ（クレノー）10単位で15分間処理し、フェノール−ク
ロロホルム抽出し、次いでエタノール沈殿すればよい。

開裂させたフラグメントのサイズ分離は、６％ポリア
クリルアミドゲルを使用して行う［ゴーデル（Goedde
l）らのNucleic Acids Res.8,4057（1980）］。

約等モル量の所望の成分を連結するためには、正しく
適合するように仕立てた適当な末端をDNA0.5μｇ当たり
T4DNAリガーゼ約10単位で処理する（開裂されたベクタ
ーを成分として使用する場合は、最近アルカリホスファ
ターゼで前処理して開裂ベクターの再連結を防止するの
が有用であるかもしれない）。

上述のように、ｔ−PA変異体は特異的当然変異法によ
って生産するのが好ましい。本発明を実施する上で有用
である突然変異体は、横切ろうとする（トラバースしよ
うとする）突然変異部位の両側に安定な二重ラセンを形
成するに充分な大きなおよび配列複雑性を有する配列と
なる、所望の突然変異のDNA配列をコードしている特定
のオリゴヌクレオチド配列、および十分な数の隣接ヌク
レオチドを使用することによって最も容易に作成するこ
とができる。

構築されたプラスミドが正しい配列であることを確認
するための分析には通常、連結混合物（ライゲーション
混合物）により、E.coli K12株294（ATCC 31,446）また
は他の適当なE.coli株を形質転換し、その場に適当であ
るアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって、
成功している形質転換体を選択する。得られた形質転換
体からプラスミドを調製し、メッシング（Messing）ら
のNucleic Acids Res.,9:309（1981）の方法またはマキ
サム（Maxam）らのMethods of Enzymology,65:499（198
0）の方法に基づく制限マッピングおよび／またはDNA配
列決定法によって分析する。

DNAを哺乳動物細胞宿主に導入し、安定なトランスフ
ェクト体のための培地中で選択した後、宿主細胞培養物
を、DHFR活性の競合的インヒビターであるメトトレキサ
ート約20,000−500,000nM濃度の存在下で増殖させ、そ
れによりDHFRタンパク質をコードしている配列の増幅を
行う。当然ながら、メトトレキサートの有効濃度の範囲
は、DHFR遺伝子の本質、タンパク質、宿主の特性に非常
に左右される。明らかに一般に規定される上限および下
限は確認することができない。他の葉酸同族体またはDH
FRを阻害する他の化合物も適当な濃度で使用することが
できる。しかし、MTXが簡便であり、容易に入手でき、
かつ有効である。

以下に記載の実施例を平易にするため、頻繁に出てく
るある種の方法は速記的熟語で表す。

「プラスミド」は、小文字のｐの後ろにアルファベッ
トの名称を付して表す。本発明における出発プラスミド
は市販されて、制限無く公に入手可能となっており、ま
た文献開示の方法によってこのような入手可能なプラス
ミドから構築することができる。さらに、他の同等なプ
ラスミドも当業界周知であり、当業者には明白である。

DNAの「消化」とは、DNA内のある特定の場所でのみ働
く酵素でそのDNAを触媒的に開裂することを意味する。
このような酵素は制限酵素と呼ばれ、それが特異的な各
部位は制限部位と呼ばれている。本明細書で使用してい
る種々の制限酵素は市販されており、酵素の供給元で確
立されているそれぞれの反応条件、補因子および他の要
件を使用した。制限酵素は通常、大文字の後ろに各制限
酵素が普通得られる微生物を表す他の文字を付し、次に
個々の酵素を示す番号を付けて命名される。一般に、プ
ラスミドまたはDNAフラグメント約１μｇを緩衝溶液約2
0μｌ中、酵素約２単位と共に使用する。特定の制限酵
素にとって適当な緩衝液および基質の量は製造会社によ
って特定されている。37℃では約１時間のインキュベー
ト時間が普通使用されるが、製造元の取り扱い説明書に
よって変動させることができる。インキュベートした
後、フェノールおよびクロロホルム抽出によってタンパ
ク質を除去し、次いでエタノール沈殿によって、消化さ
れた核酸を水性画分から回収する。制限酵素による消化
は、DNAフラグメントの２つの制限開裂末端が、もう１
つのDNAフラグメントが制限部位に挿入するのを妨げ得
る「環状化」または閉じたループを形成することから護
るために、５′末端のリン酸を細菌アルカリホスファタ
ーゼによる加水分解と共に行うことがたまにある。しか
し、特に明記しない限りは、プラスミドの消化後には
５′末端の脱リン酸化は行なっていない。脱リン酸化の
ための操作法および試薬は既知である［マニアチス（T.
Maniatis）らのMolecular Cloning:A Laboratory Manua
l,（コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリー；
ニューヨーク,1982）,133−134頁］。

特定のDNAフラグメントを制限消化物から「回収」ま
たは「単離」するとは、ポリアクリルアミドまたはアガ
ロースゲルを使用して電気泳動法により消化物を分離
し、目的とするフラグメントを既知の分子量のマーカー
DNAフラグメントの移動度と比較してその同定を行い、
所望のフラグメントを含有するゲル切片を取り出し、そ
してDNAからゲルを分離することを意味する。この操作
法は一般に知られている。例えば、ローン（R.Lawn）ら
のNucleic Adids Res.9:6103−6114（1981）、およびゴ
ーデル（D.Goeddel）らのNucleic Acids Res,8:4057（1
980）を参照のこと。

「サザーン分析」とは、既知の標識化オリゴヌクレオ
チドまたはDNAフラグメントとハイブリダイズすること
により、消化物またはDNA含有組成物中にあるDNA配列の
存在を確かめる方法である。本明細書では、特に明記し
ない限り、サザーン分析とは、サザーン（E.Southern）
のJ.Mol.Biol.98:503−517（1975）に記載のように、１
％アガロースにより消化物を分離し、変性させ、ニトロ
セルロースに移動させ、そしてT.マニアチスらのCell1
5:687−701（1978）に記載されているようにハイブリダ
イズすうことを意味する。

「形質転換」とは、DNAを染色体外要素または染色体
成分として複製できるようにそのDNAを生物に導入する
ことを意味する。特に明記していなければ、本明細書に
記載のE.coliの形質転換方法は、マンデル（Mandel）ら
のJ.Mol.Biol.53:154（1970）のCaCl₂法である。

「連結」とは、２つの２本鎖核酸フラグメント間にホ
スホジエステル結合を生成させる工程を意味する［T.マ
ニアチスらの前掲、146頁］。特に明記しない限り、連
結しようとするDNAフラグメントの約等モル量（0.5μ
ｇ）に対してT4 DNAリガーゼ（リガーゼ）10単位を使用
し、既知の緩衝液および条件によって、連結を行うこと
ができる。

DNAを形質転換体から「調製する」とは、DNAを微生物
培養物から単離することを意味する。特に明記しない限
り、マニアチスらの前掲90頁のアルカリ/SDS法を使用す
ることができる。

「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法によって化学
的に合成され、次いでポリアクリルアミドゲルで精製さ
れた、短い長さの１本鎖または２本鎖ポリデオキシヌク
レオチドである。

C.医薬組成物本発明のプラスミノーゲンアクチベーター産物を医薬
的に許容され得る担体ビヒクルとの混合物中に混合する
ことにより、本発明の化合物は、医薬的に有用な組成物
を製造するための既知の方法によって製剤化することが
できる。適当なビヒクルおよび他のヒトタンパク質、例
えばヒト血清アルブミンを含んだそれらの製剤は、例え
ばオスロー（Oslo）ら編のRemington′s Pharmaceutica
l Sciences16版、1980［マック・パブリッシングCo.］
に記載されている。このような組成物は、宿主に効果的
に投与するのに適した医薬的に許容され得る組成物に調
製されるように適量のビヒクルと共に、本発明の変異体
を有効量で、例えば約0.5から約5mg/mlで含有してい
る。本発明のプラスミノーゲンアクチベーター変異体
は、心臓血管疾患または症状に罹患した対象に非経口的
に、またはその有効型が血流に供給されるような他の方
法で投与することができる。

本発明を実施する上で使用される変異型プラスミノー
ゲンアクチベーター産物を臨床投与するのに特に適して
いる組成物には、例えば滅菌水溶液剤、または凍結乾燥
タンパク質などの滅菌水和性の粉末剤などがある。この
製剤中にはさらに、医薬的に許容され得る塩を適量、一
般には製剤の等張性を変化させるに十分な量で含有させ
るのが概して望ましい。アルギニン塩基、およびリン酸
などのpH調節物質も、適当なpH、一般には5.5−7.5を維
持する十分な量で通常含有させる。さらに、水性製剤の
貯蔵寿命または安定性を改善するため、グリセロールな
どの物質もさらに含有させるのが望ましい場合がある。
この場合、変異型ｔ−PA製剤は、非経口投与、特に静脈
内投与するに好適となるように調製する。

本発明の医薬組成物の投与量および望ましい薬物濃度
は、目的とする個々の用途に応じて変動し得る。例え
ば、深静脈血栓または末梢血管疾患の処置に当たって
は、約0.05から約0.3mg/kgオーダーの「ボーラス」投与
が通常好ましく、その後は、血中レベルをほぼ一定に、
好ましくは約３μg/mlのオーダーが維持されるよう約0.
1から約0.2mg/kgの投与を行うのが好ましい。

しかし、一般に灌流が行えない場面である緊急医療に
関連して使用するためには、および処置する疾患が一般
に危険性を孕む場合（塞栓症、心筋梗塞）、若干多めの
初期投与量、例えば約0.3mg/kgオーダーの静脈内ボーラ
ス投与が通常好ましい。

例えば、本発明のプラスミノーゲンアクチベーター変
異体は、心臓血管の疾患または症状に罹患した患者に非
経口的に投与すればよい。投与量および投与速度は、他
の心臓血管薬、血栓溶解薬が臨床試験で通常使用されて
いるものと同様であり得、例えば心筋梗塞、肺塞栓症な
どに罹患したヒト患者では、約１−2mg/kg体重で、1.5
−12時間かけて静脈内または動脈内投与を行えばよい。

適当な投与剤形の１例としては、ｔ−PA 50mg、アル
ギニン、リン酸、およびポリソルベート80を含有するバ
イアルを滅菌水50mlにより注射用に再構成し、それを適
量の0.9％塩化ナトリウム注射液と混合することが挙げ
られる。

半減期が延長された本発明のプラスミノーゲンアクチ
ベーター変異体は、急速静脈内注射用剤、特に例えばボ
ーラスとして適当であり得る。これは、複雑な投与操作
を行う必要性を減少させるであろうし、例えば人員が診
療補助者である救急車内におけるように、限定された医
療器具により対処する上で、プラスミノーゲンアクチベ
ーターを使用する機会を増大させ得るものである。延長
された半減期を有する本発明のプラスミノーゲンアクチ
ベーター変異体によれば、さらに少ない、より安全な初
期投与量が可能となり、45分またはそれ以上、血栓溶解
に活性である有効な血漿レベルを維持させることができ
よう。そして、より長い半減期の本発明の変異体は、成
功した急性血栓溶解に続く閉塞の再発を回避するのに必
須であり得る低容量の長期療法、または末梢の血管が閉
塞した場合に必要であり得る長期血栓溶解、にとっても
有用であろう。

以下に、本発明の実施する上で現在知られている最も
最良の方法を説明するために実施例を挙げるが、これは
本発明の限定を意図するものではない。

実施例１ A.本発明のｔ−PA変異体の組換え的生産のための発現ベ
クターの調製およびその利用 1.プラスミドp7−1Hの構築ａ）プラスミドpCISt−PA プラスミドpCISt−PAを例えば1986年10月29日公開のE
PO公開199,475号（前掲）に記載のように調製した。要
約すれば、サイトメガロウイルスのエンハンサーおよび
プロモーター、サイトメガロウイルスのスプライス・ド
ナー部位およびイントロン、Ig可変領域スプライス・ア
クセプター部位、ｔ−PAをコードしているcDNA［ペニカ
（Pennica）らのNature301:214（1983）］ならびに肝炎
表面抗原のポリアデニル化および転写終止部位を含有す
るpCIHt−PAベクターをまず始めに構築した：サイトメガロウイルスのエンハンサー［ボシャート
（Boshart）らのCell41:520（1985）］およびプロモー
ター［トムソン（Thomsen）らのProc.Natl.Acad.Sci.,
U.S.A.81:659（1984）］、サイトメガロウイルスのスプ
ライス・ドナー部位およびイトロンの部分［ステルンベ
ルグ（Sternberg）らのJ.of Virol.49:190（1984）］、
Ig可変領域イントロンおよびスプライス・アクセプター
部位、第VIII因子をコードしているcDNAおよびSV40ポリ
アデニル化部位を含有するpF8CISベクターを構築した。
この構築法の３つの手順を以下に詳細に説明する。

1.この最終ベクターのアンピシリン耐性マーカーおよび
複製起点を、プラスミドpML［ルスキー（Lusky）らのNa
ture293:79（1981）］の変異体である、出発プラスミド
pUC13pMLから誘導した。pUC13pMLは、pUC13［ベイラ（V
eira）らのGene19:259（1982）］のポリリンカーをpML
のEcoRIおよびHindIII部位に移すことによって構築し
た。別の出発プラスミドであるpUC8CMVはCMVエンハンサ
ー、プロモーターおよびスプライス・ドナー配列の供給
源であった。pUC8CMVは、CMVエンハンサー、プロモータ
ーおよびスプライス・ドナー配列にかかる１から732の
ヌクレオチドをpUC8の平滑化PstIおよびSphI部位に挿入
することによって構築した（ベイラら、前掲）。粘着性
のBamH I末端に、合成BamH I−HindIIIリンカー［ニュ
ー・イングランド・バイオラブス（New England Biolab
s）から市販されている］を連結し、HindIII部位を作成
した。この連結の後、HindIII−HincII消化を行った。
この消化により、CMVエンハンサー、プロモーターおよ
びスプランス・ドナー部位を含有している約800bpのフ
ラグメントを得た。ゲル単離した後、この800bpフラグ
メントをpUC13pMLの2900bp片に連結した。pF8CISの構築
に必要とされるこのフラグメントは、上記の中間プラス
ミドをSalIおよびHindIIIで消化することによって得ら
れた。この3123bp片は、アンピシリンについての耐性マ
ーカー、pUC13pML由来の複製起点ならびにエンハンサ
ー、プロモーターおよびスプライス・ドナー部位など
の、CMVに関する制御配列を含有していた。

2.Ig可変領域イントロンおよびスプライス・アクセプタ
ー配列は、合成オリゴマーを使用して構築した。IgGイ
ントロンおよびスプライス・アクセプター部位にかかる
以下の配列を有する99−merおよび30−merを、化学的に
合成した［ボスウェル（Bothwell）らのCell24:625（19
81）］： DNAポリメラーゼＩ（クレノーフラグメント）によ
り、合成した片を充填し、２本鎖フラグメントを作成し
た［ワーテル（Wartell）らのGene9:307（1980）］。次
いで、PstIおよびHindIIIの２重消化を行った。この合
成リンカーをpUC13（ベイラら、前掲）のPstIおよびHin
dIII部位にクローンした。合成オリゴヌクレオチドを含
有するクローン（これをpUCIg.10と命名する）をPstIで
消化した。PstI−ClaIリンカーを使用して、ClaI部位を
このフラグメントに付加した。HindIIIで消化した後、I
gイントロンおよびIg可変領域スプライス・アクセプタ
ーの部分を含有する118bp片をゲル単離した。

3.本構築手順の第３番目は、肝炎表面抗原の３′末端を
SV40初期領域のポリアデニル化部位および転写終止部位
と置き換えることである。SV40配列を含有するpUC.SV40
ベクターをpUC8のBamH I部位［ベリラら、前掲に記載さ
れている］に挿入し、次いでpUC.SV40をEcoR IおよびHp
aIで消化した。SV40ポリアデニル化部位のみを含有する
143bpフラグメントをこの消化物からゲル単離した。pSV
E.8clD［EPO公開第160,457号］の消化後、さらに２つの
フラグメントをゲル単離した。EcoR IおよびClaI消化に
よって生成される4.8kbフラグメントは、SV40−DHFR転
写単位、pMLの複製起点およびアンピシリン耐性マーカ
ーを含有している。ClaIおよびHpaI消化後に得られる7.
5kbフラグメントは、第VIII因子のcDNAを含有してい
る。スリー・パート連結（three−part ligation）によ
り、pSVE.8c24Dが得られる。この中間プラスミドをClaI
およびSalIで消化することにより、SV40ポリアデニル化
および転写終止部位、次にSV40 DHFR転写単位を有す
る、第VIII因子のcDNAを含有する9611bpフラグメントを
得た。

pF8CISを得るための最終的スリー・パート連結では、
ａ）複製起点、アンピシリン耐性マーカー、およびCMV
エンハンサー、プロモーターおよびスプライス・ドナー
を含有する3123bp SalI−HindIIIフラグメント、ｂ）Ig
イントロンおよびスプライス・アクセプターを含有する
118bp HindIII−ClaIフラグメント、ならびにｃ）第VII
I因子のcDNA、SV40ポリアデニル化部位およびSV40 DHFR
転写単位を含有する9611pb ClaI−SalIフラグメントを
使用した。

次に、中間プラスミドpCla t−PAおよびプラスミドpF
8CIS（上述）からプラスミドpCIH t−PAを完全に構築し
た：まず始めにｔ−PA cDNAにpMLにクローンし、その遺伝
子の５′末端にClaI部位を付与した。これを行うため、
pSVpa−DHFR（あるいは、pETPFRとも称する、前掲）由
来の3238bpHindIIIフラグメントをpMLのHindIII部位に
挿入した［ラスキー（Lusky）ら、前掲）］。そのClaI
部位に接して並ぶ（juxtaposed）cDNAの５′末端を有す
るクローンについて、コロニー群をスクリーニングし
た。得られた中間プラスミドをpCLAt−PAと命名した。
３′ポリアデニル化領域が後続するｔ−PA cDNAを2870b
pのClaI−KpnIフラグメントとして単離した。このフラ
グメントをpF8CISの5146bpフラグメントと連結した。CI
SベクターのこのClaI−KpnIフラグメントは、pML由来の
５′制御領域、SV40−DHFR転写単位、アンピシリン耐性
遺伝子および起点領域を提供した。第4a図および第4b図
を参照のこと。

ｔ−PAの発現レベルは、それ自体一般に知られている
上述の方法にしたがって、CHOおよび293細胞をpCIHt−P
Aでトランスフェクトすることによって得た。例えば、
トランスフェクトされた293細胞由来の媒質を検定する
ことにより、pCIH t−PAは420ng/mlでｔ−PAを産生した
ことが証明された。

サイトメガロウイルスのエンハンサーおよびプロモー
ター、サイトメガロウイルスのスプライス・ドナー部位
およびイントロン、Ig可変領域のスプライス・アクセプ
ター部位、ｔ−PAをコードしているcDNAならびにpSV40
ポリアデニル化配列を含有するpCISt−PAベクターを最
後に、以下のようにして構築した：この構築のための出発ベクターはpCIHt−PAおよびpF8
CIS（上述）であった。この後者のベクターは、pCIHt−
PAと同じ５′制御を有しているが、第VIII因子のcDNAお
よびSV40ポリアデニル化部位を含有している。SacIIを
使用し、そのｔ−PA cDNAの３′を開裂した。得られた
３′突出部をT4ポリメラーゼによって平滑末端化した。
次いで、pCIHt−PAをClaIで切断した。この部位は、CMV
イントロ配列とIg可変領域イントロンとに開裂するキメ
ライントロンを分割している。このClaI処理物から2870
bpフラグメントをゲル単離した。SV40ポリアデニル化部
位、DHFR、転写制御、細菌性複製起点およびamp^r遺伝
子、ならびにCMVエンハンサーおよびプロモーターおよ
びスプライス・ドナーをpF8CISから単離した。これらの
要素を、2525bpSal−ClaIフラグメントおよび3113bpのH
paI−SalIフラグメントとして分離し、フラグメントと
した。KpnI（平滑）−ClaIフラグメントと、HpaI−Sal
フラグメントおよびSalからBamHIフラグメントとのスリ
ー・パート連結により、pCISt−PAを得、これを、プラ
スミドpCIHt−PAについて上述したようにCHOおよび293
の両細胞において発現させて、それぞれｔ−PAを55およ
び3000ng/mlで得た。第5a図および第5b図参照のこと。

ｂ）p7−1Hの最終的構築プラスミドpCIS t−PAをSpeIで消化し、次いでE.coli
DNAポリメラーゼＩの大きいフラグメント（クレノー）
およびデオキシリボヌクレオシド三リン酸で処理するこ
とにより、平滑末端を作成した。得られた線状フラグメ
ントを、ジンダー（Zinder）らのMicrobiol.Rev.,49:10
1（1985）に記載されているように、T4 DNAリガーゼを
使用して１本鎖DNAファージf1由来の＋鎖起点を含有す
る0.45kb RsaI/AhaIIIフラグメントに連結した。pCISt
−PAフラグメントのSpaI部位に可能性ある両方向性で挿
入されるf1起点を有する連結産物を単離した。ｔ−PA遺
伝子のアンチセンス鎖がヘルパーファージの存在下にビ
リオン中にパッケージングされているような方向性でこ
の起点を含有するプラスミドを選択し、p7−1Hと命名し
た。第６図参照。

2.突然変異実験ａ）鋳型の調製プラスミドp7−1HをCaCl₂−媒介性形質転換によって
E.coli株JM101（ATCC No.33,876）に導入した。次い
で、ベイラらのMeth.Enzymol.153:3（1987）に記載のよ
うに、これらの細胞をヘルパーウイルスM13K07でインフ
ェクトし（感染させ）、１本鎖pp7−1H DNAを調製し
た。簡単に説明すれば、2YTブロス中、形質転換細胞の
飽和培養物0.3mlに10⁹−10¹⁰pfuのM13K07を加え、得ら
れた混合物を37℃で15分間インキュベートした。50μg/
mlカルベニシリン（carbenicillin）を含有する新鮮な2
YTブロス1.5mlを加え、その培養物を37℃で16時間穏や
かに振盪させた。細胞をペレット化した後、ファージ、
およびパッケージング化プラスミドDNAを採取し、アン
ダーソン（Anderson）のNucl.Acids.Res.,9:3015（198
1）に記載のように１本鎖DNAを調製した。

ｂ）部位特異的インビトロ突然変異突然変異Tyr67Asn67を有する突然変異体をプラーク
ハイブリダイゼーションではなく、コロニーハイブリダ
イゼーションによって同定する以外は、ゾラー（Zolle
r）らのMeth.Enzymol.,100:468（1983）に実質的に記載
されているように、オリゴデオキシリボヌクレオチド:5
−CAGCAGGCCCTGAATTTCTCAG−３′を使用し、p7−1Hの突
然変異を行った。ジデオキシヌクレオチド鎖成長停止法
を使用し、１本鎖プラスミドDNAを直接DNA配列決定する
ことにより、突然変異を確認した［サンガー（Sanger）
らのProc.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.74:5463（1977）］。

3.発現および精製ａ）プラスミドの調製 50μg/mlカルベニシリンを含有するLBブロス500ml中
で、形質転換した細胞を飽和状態になるまで増殖させ
た。遠心により細胞をペレット化し、50ml mMグルコー
ス、10nM EDTA、25mMトリスHCl（pH8.0）40ml中に再懸
濁した。この懸濁液に１％ドデシル硫酸ナトリウム、0.
07M水酸化ナトリウム60mlを加え、得られた混合物を25
℃で２分間インキュベートし、次いで０℃で10分間イン
キュベートした。これに、4M酢酸、3M酢酸ナトリウム52
mlを加え、得られた混合物を０℃で30分間インキュベー
トした。次いで、11,500rpmで20分間遠心し、得られた
上清を２容量の100％冷エタノールと混合し、生成した
沈澱物を遠心によって採取した。プラスミドDNAおよびR
NAを含有するペレットを乾燥させ、100mMトリス（pH8.
0）、10mM EDTA、１μg/ml RNase Aに再溶解した。得ら
れた溶液を遠心により清澄化した後、それを臭化エチジ
ウム中0.5mg/mlに調節し、同重量の塩化セシウムを加え
た。次いで、得られたDNAをベックマンVT165ローターに
より遠心にかけた（18℃、55,000rpm、16時間）。側面
注射によりDNAバンドを採取し、ｎ−ブタノールで抽出
して臭化エチジウムを除去し、水で希釈し、エタノール
により沈澱させた。DNAを10mMトリス（pH8.0）、1mM ED
TA中に再溶解し、終濃度1mg/mlとした。

ｂ）トランスフェクションおよび発現 293細胞を全面成長するまで増殖させた。ｔ−PA突然
変異プラスミドDNA10μｇをVA RNA遺伝子をコードして
いるDNA［チンマッパヤ（Thimmappaya）らのCell31:543
（1982）］１μｇと混合し、1mMトリス−HCl、0.1mM ED
TA、0.227M CaCl₂500μｌ中に溶解した。これに50mM HE
PES（pH7.35）、280mM NaCl、1.5mM NaPO₄500μｌを加
え（旋回（ボルテックス）下に滴加した）、25℃で10分
間沈澱を生成させた。次いで、懸濁した沈澱物を細胞
（100mMピレート中）に加え、インキュベーター中に４
時間放置した。次いで、培地を吸引除去し、リン酸緩衝
化食塩水中20％グリセロール2mlを30秒間で加えた。得
られた細胞を血清不含の培地5mlで２回洗浄した後、新
鮮な培地を加え、細胞を５日間インキュベートした。

ｔ−PA変異体を発現する安定なCHOセルラインを作成
するため、ｔ−PAのコード化配列のバルクを含有するBg
lII/ApaIフラグメント（第６図）をpPADHFR−６ベクタ
ー（EPO特許公開第93,619号に記載されている）由来の
6.0kb BglII/ApaIフラグメントと連結させる。次いで、
得られたプラスミドをCHO細胞に導入し、メトトレキサ
ート含有培地中で選択することにより、そのコード化配
列を増幅させ、それによりｔ−PA変異体を過剰に発現さ
せる。

ｃ）精製抗−ｔ−PAヤギポリクローナルA6抗体（これ自体は常
法によって調製される）をカップリングさせた制御化ガ
ラスビームのカラム（1mlベッド容量）にならし培地（c
onditioned medium）を通すことによって、得られたｔ
−PA産物を精製した。培地を入れる前に、カラムをリン
酸緩衝化食塩水で平衡化させ、それを入れた後は、カラ
ムを0.1Mトリス−HClpH7.5、1M NaClで平衡化させた。
0.1M酢酸、0.15M NaCl、0.02Mアルギニン、0.01％Tween
80（pH2.0）でｔ−PAを溶出させ、得られた画分をトリ
ス−塩基で素早く中和した。プールする前に、画分を0.
01％Tween80に調節した。

B.生物学的および薬物動態的検定 1.t−PAの定量天然のｔ−PA配列に標準化したELISAによって、タン
パク質濃度を常法にしたがって測定した［EPO特許公開
第93,619号（前掲）を参照のこと］。タンパク質の純度
および均質性は、レムリ（Laemmli）のNature,227:680
（1970）の緩衝系を使用した、ドデシル硫酸ナトリウム
の存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（PAGE−SD
S）によって分析した。通常は、７−17％のグラジエン
トゲルを使用し、モリッセイ（Morrissey）のAnal.Bioc
hem.,117:307（1981）の銀−染色法によりタンパク質を
視覚化した。既述のようにして調製したN67 t−PA変異
体は、この方法により純粋であり、均質であることが判
明した。

2.S−2251検定ｔ−PAがプラスミノーゲンを活性化する活性化能は、
ｔ−PAおよびプラスミノーゲンを前インキュベートし、
次いでプラスミン−特異的基質であるＨ−Ｄ−バリル−
Ｈ−ロイシル−Ｈ−リジン−ｐ−ニトロニリド（nitron
ilide）［Ｓ−2251］を加えることに基づくインビトロ
検定により測定することができる。この反応の最大速度
は、この反応系の刺激物質として機能するフィブリン
（フィブリノーゲン）またはそのフラグメントの存在下
に観察される。

プラスミド−特異的基質であるＳ−2251を２段階検定
法に使用し、試料がプラスミノーゲンを活性化する活性
化能を測定した。0.05Mトリス−HCl、0.12M NaCl、0.01
％Tween80,pH7.4の全量0.12ml中、20mg/mlフィブリノー
ゲン溶液0.02mlと共にその試料をインキュベートするこ
とにより、フィブリノーゲンは試料刺激物質として使用
することができよう。

次いで、Glu−プラスミノーゲン溶液（市販されてい
る）、0.05Mトリス0.12M NaCl緩衝液,pH8中、2.0mg/ml
溶液0.03mlを加えた。37℃、10分経過後、0.037Mトリ
ス、0.086M NaCl、0.007％Tween80,pH7.4中、0.86mM S
−2251（0.35ml）を加えた。得られた混合物を５分間イ
ンキュベートした；次いで、50％氷酢酸0.1mlを添加し
てその反応を停止させた。405nmの吸光度を測定した。
活性は、基質存在下の１分当たりng単位の吸光度の変化
として表した。

既述の検定法を、フィブリノーゲンを含有していない
試料の組みをさらに使用して既述のように検定を行っ
た。刺激性は、フィブリノーゲンを含有しない試料の比
活性に対するフィブリノーゲンを含有する試料のそれの
比である。rt−PAおよびN67 t−PAの両者に関する得ら
れた結果を、血餅溶解の結果と共に第７図に示す。N67t
−PAのインビトロ比活性はフィブリノーゲン不存在下に
おいて比較的有意に落ちたようであるので、フィブリノ
ゲーゲン刺激％（これはフィブリノーゲン不存在下にお
ける活性に対するフィブリノーゲン存在下の活性の比を
反映する）は若干野生型rt−PAよりも増大される。

3.血餅溶解野生型およびN67 t−PAのフィブリン溶解能を検定す
るに当たり、カールセン（Carlsen）らのAnal.Bioche
m.,168:428（1988）の方法にしたがい、飽和濃度のプラ
スミノーゲンの存在下に行った。インビトロ血餅溶解検
定は、マイクロ遠心分析器を使用する比濁分析により、
組織プラスミノーゲンアクチベーターの活性を測定する
ものである。トロンビンおよびｔ−PA試験試料の混合物
をフィブリノーゲンおよびプラスミノーゲンの混合物中
に遠心することにより、血餅形成を開始させ、その後に
血餅溶解を誘導させる。得られた吸光度と時間とのプロ
フィルを分析し、検定の終点を決定した。ｔ−PA変異体
と活性と、rt−PAの標準曲線（EPO公開第93,619号，上
述）と比較した。この検定の全体にわたって使用する緩
衝液は、0.01％（v/v）Tween80および0.01％（w/v）ア
ジ化ナトリウムを含有する0.06Mリン酸ナトリウムpH7.4
であった。ヒトトロンビンは濃度33単位/mlであった。
フィブリノーゲン（2.0mg/ml凝固し得るタンパク質）を
湿氷上で冷し、フィブロネクチンを沈殿させ、次いで重
力濾過した。Glu−プラスミノーゲンは濃度1mg/mlであ
った。分析器の内容内温度は37℃に設定する。充填器に
は、標準曲線にかかる試料としてrt−PA（約500ng/mlか
ら1.5μg/ml）20μｌを、またはその標準曲線の範囲内
で溶解を起こす濃度の変異型rt−PA20μｌを分散させ
る。第２の試薬としてトロンビン20μｌおよび第１の試
薬としてフィブリノーゲン：プラスミノーゲン50:1（v/
v）混合物20μｌを使用した。５分間のインキュベート
時間、340−μｍ−フィルターおよび90−間隔の判読に
よって、吸光度／時間プログラムを行った。

第７図に示した得られた結果は、N67変異体が、正常
の野生型ｔ−PAの血餅溶解比活性の約53％であることを
示している。

4.フィブリン結合性フィブリン結合性に関する方法は、リッケン（Rijke
n）らのJ.Biol.Chem.,257:2920（1982）に記載されてい
る方法の改変法である。試験するｔ−PA試料を、0.05M
トリス（pH7.4）、0.12M NaCl、0.01％Tween80、1mg/ml
ヒト血清アルブミン、および種々の濃度のプラスミノー
ゲン不含のフィブリン（０、0.05、0.1、0.25および0.5
mg/ml）を含有する溶液に加える。この反応混合物の最
終容量は1mlであった、得られた試料を37℃で５分間イ
ンキュベートした後、トロンビン１単位を加えた。次い
で、この試料を37℃で１時間インキュベートした。生成
した血餅を遠心によって除去し、未結合のままの上清中
ｔ−PAの量をELISAによって測定した。

第８図には、N67 t−PAおよびrt−PAの両者につい
て、結合したｔ−PA変異体対フィブリン（フィブリノー
ゲン）濃度の％としてプロットしたデータを示してい
る。この結果は、N67 t−PAが使用した検定条件下では
フィブリンと結合しないことを示している。

5.グルコシル化の確認トリプシンのペプチド混合物を個々の成分またはピー
クに分割し、その同定を行い組成を知るための高速液体
クロマトグラフィー（HPLC）を利用するトリプシンのマ
ッピング法によって、アスパラギン67における過剰のグ
ルコシル化を測定した。ペプチドに炭水化物が付加する
と、そのペプチドの親水性が増し、結果としてHPLCプロ
フィルが変化する（すなわち、より早く溶出される）。
単離されるペプチドを含有する個々のクロマトグラフィ
ーのピークをまとめ、アミノ酸分析にかけてペプチドの
同定および炭水化物の存在を確認する。

a.試料の調製トリプシン・マッピング法のための試料の調製法は、
クレストフィールド（Crestfield）、ステイン（Stei
n）およびモーレ（Moore）のJ.Biol.Chem.,238:622（19
63）の改変法であった。分析すべきタンパク質試料（各
1.0mg）を、2mM EDTAを含有する8M尿素、0.5Mトリス（p
H8.6）中に一晩透析した。この試料を25℃において２時
間10mMジチオトレイトール［シグマ・ケミカルCo.］で
還元し、次いで25mMヨード酢酸（シグマ・ケミカルC
o.）を用いて25℃、暗所でＳ−カルボキシメチル化し
た。30分後、このアルキル化反応を20mMジチオトレイト
ールを添加してクエンチ（停止）させ、次いで3500分子
量排除能を有する透析チューブを使用し、カルボキシメ
チル化（RCM）試料を100mM重炭酸アンモニウム（pH8.
3）中で一晩透析した。

b.N−グルコシダーゼＦによる処置還元してカルボキシメチル化したrt−PAをトリプシン
消化の前にＮ−グリコシダーゼＦ（ジェンチームCorp.
（Genzyme Corp.））で脱グリコシル化した。還元して
カルボキシメチル化したrt−PA（0.4mg）を、10mM EDTA
および0.02％アジ化ナトリウムを含有する250mMリン酸
ナトリウム（pH8.6）0.08ml中で再構成した。Ｎ−グル
コシダーゼＦ（50％グリセロール0.018ml中、5.0製造者
単位（Manufactureer′s Units））をその試料に加え、
次いでそれを37℃で一晩インキュベートした。得られた
試料を水で0.4mlにまで希釈し、トリプシン消化する前
に100mM重炭酸アンモニウムに対して透析した。

c.トリプシン消化 RCMrt−PAを環境温度の0.1M重炭酸アンモニウム中で
消化するに当たり、［Ｌ−（トシルアミド−２−フェニ
ル）エチルクロロメチルケトン］（TPCK）処置トリプシ
ン［クーパー・バイオメディカル（Cooper Biomedica
l）］を酵素：基質の比率1:100（w/w）で加え、次いで
８時間後、1:100を別に添加した。この消化は、凍結
（−70℃）によって24時間後に停止させた d.クトマトグラフィー 0.4×15cmノバ・パック（Nova PAK）,5ミクロン,C−1
8逆相カラム（ウォーターズ（Waters,Inc.））を使用し
たヒューレット−パッカード（Hewlett−Packard）1090
M液体クロマトグラフ装置により、HPLC分離を行った。2
14および280ナノメーターにおける二重波長検出法によ
り溶出プロフィルをモニターした。トリフルオロ酢酸
（TFA）溶媒系を使用したが、それは流速0.5％／分、50
分のアセトニトリル［バーディック・アンド・ジャクソ
ン（Burdick ＆ Jackson）］中、0.08％TFAの一次グラ
ジエントを用いた0.1％TFA［ピース・ケミカル（Pierce
Chemical）］、次いで流速1.0ml/分、30分の1.0％／分
の一次グラジエントを用いたものであった。

e.アミノ酸分析 HPLCによって採取したピークペプチドを酸加水分解し
た後、アミノ酸分析して特性化した。加水分解は、ペプ
チドを、110℃に減圧下で20時間、定沸点塩酸中でイン
キュベートすることによって行った。酸加水分解物の分
析は、ベックマン（Beckman）6300アミノ酸分析器を使
用して行った。

f.結果第９図には、野生型RCM rt−PA、N67突然変異RCM t−
PAおよびＮ−グリカナーゼ−処置N67突然変異RCM rt−P
Aについてのトリプシン消化のHPLCプロフィルを、それ
ぞれ9A、9Bおよび9Cとして示している。すべての試料
は、293ヒト腎細胞における一時的発現によって調製し
た。第9A−9C図に示している溶出プロフィルは、トリプ
シンペプチド（56−82）が野生型ｔ−PAについて溶出さ
れることが認められているグラジエントのセグメントか
ら採取した。このペプチド（56−82）は、第9A図におい
て矢印で示しているように、５分時点に部分的に分割さ
れた二重線として溶出された。

N67 t−PA突然変異体を同様に調査し（第9B図）、そ
れが55分時点に溶出された野生型トリプシンペプチド
（56−82）を喪失していることが判明した。先行するピ
ーク（50.5分）における肩として51分時点における広い
ピークが対応して増加しているようである。51分時点に
おけるこの新しいピークを採取し、酸加水分解してアミ
ノ酸分析により定量した。この分析により、グリコシル
化ペプチド（56−82）の初期溶出と矛盾しない、アミノ
−糖含有ペプチドの存在が示唆された。

（56−82）トリプシンペプチドのグリコシル化を確認
するため、RCM N67 t−PA突然変異体をＮ−グリコシダ
ーゼで処置し、Ｎ−連結炭水化物部分を除去した。この
グリカナーゼ処置突然変異タンパク質のトリプシン消化
物を逆相HPLCによって分析した（第9C図）。51分時点に
おける初期に溶出する肩はＮ−グリカナーゼ処置により
消失し、そのトリプシン地図には新たに、54.5分時点に
おけるピークが現れた。55分における野生型トリプシン
ペプチド（56−82）と比較して54.5分におけるこの若干
早いN67（56−82）の溶出は、アスパラギン酸とチロシ
ンとを置換したことに対応した結果であった［グオー
（Guo）らのJ.Chrom.,359:499−517（1986）］。（N67
突然変異体はアスパラギンに連結した炭水化物を含有し
ているが、Ｎ−グリカナーゼ処置後にはそのアスパラギ
ンがアスパラギン酸残基に変換されている）。アミノ酸
分析により、第9C図の54.5分におけるピークが確かにペ
プチド（56−82）と帰属された。以下の第１表に示され
るように、観察したアミノ酸組成は期待した組成に従っ
ており、それによりアスパラギンがチロシンに置換さ
れ、その67位における残基がＮ−連結グリコシル化され
ていることが確かめられる。

6.薬物動態 20匹のウサギを無作為に２つの処置群の１つに振り分
けた:rt−PA、およびグリコシル化N67 t−PA。これらタ
ンパク質を¹²⁵Iで約10μCi/kgにまで標識し、この標識
化タンパク質の非特異的吸着を減少させるため0.1mg rt
−PAと混合した。TCAを沈殿し得る¹²⁵I−タンパク質の
線量は、名目上５μCi/kgであった。

各ウサギは両耳にヘパリン・ロック（look）を有する
カテーテルを有していた。薬物を１つのカテーテル中IV
ボーラスとして投与し、次いで食塩水を投与した。反対
の耳から全血試料を採取した。血液試料1mlは以下の時
点に入手した:0（投与前）、および投与後２、５、15、
30、45、60、75、90、120、150、および180分。各時点
毎に食塩水をカテーテルに流し（フラッシュし）、血液
容量で置き換えた。採取した血液試料を、4.2mM EDTAお
よび1mM PPACK（フェニルアラニン−プロリン−アルギ
ニン−クロロメチル・ケトンのペプチド）を含有する1.
5ml容量エッペンドルフ遠心管中に注いだ。各遠心管は
遠心するまで氷上で保存した。遠心後、血漿を素早く取
り出し、エッペンドルフ遠心管に入れ、試験が終わるま
で氷上で保存した。各血漿試料100μｌ中のタンパク質
をトリクロロ酢酸で沈降させた。各沈降物のガンマ放射
線をカウントすることにより、タンパク質に結合した
¹²⁵Iを定量した。得られた結果はCPM/試料100μｌ基準
であるので、各データ解析をCPM/mlに変換した。

血中濃度−時間曲線下面積（AUC）操作を使用する台
形法によって、各ウサギのAUCを２から180分で電算機計
算した。クリアランスは、等式:CL＝投与量／′AUCから
計算した。

上記¹²⁵I−標識化タンパク質にかかるターミナル半減
期（terminal half−lives）の順番は次ぎのようであ
る:rt−PA、N67 t−PA。実際の半減期の値を決定するに
は、非標識化タンパク質を使用して薬物動態試験を行わ
なければならない。第10図は、rt−PAおよびグリコシル
化N67 t−PA、ならびに比較のためにデス１−44t−PA、
デス１−44E275 t−PAおよびデス１−44E275D184 t−PA
についての、CPM/ml対分のプロット（投与量に基づいて
標準化）を示すものである。

N67 t−PAは、野生型ｔ−PAよりもゆっくりと血漿か
ら消失した。野生型rt−PAに対するそのN67 t−PAのク
リアランスの比率は0.63であった。結局、等しい注入速
度では、N67 t−PAは野生型ｔ−PAと比較して1.6倍高い
血漿濃度を有していると結論付けられる。

フロントページの続き (56)参考文献欧州公開225286（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開227462（ＥＰ，Ａ１) 欧州公開238304（ＥＰ，Ａ１) ＪｏｕｒｎａｌｏｆＢｉｏｌｏｇｉｃａｌＣｈｅｍｉｓｔｒｙ，263 （12）（1988），ｐ．5948−54 (58)調査した分野(Int.Cl.⁶，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12N 9/64 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ) ＥＰＡＴ（ＱＵＥＳＴＥＬ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】フィブリン分解活性を示し、天然プラスミ
ノーゲンアクチベーターには存在しないグリコシル化さ
れることができるアミノ酸部位を有する組織プラスミノ
ーゲンアクチベーター（ｔ−PA）アミノ酸配列変異体で
あって、フィブリン分解活性を有し、天然分子に比べて
半減期が長いか、またはクリアランス速度が遅い該アミ
ノ酸配列変異体。
【請求項２】グリコシル化がＮ−連結グリコシル化であ
る請求項１に記載の変異体。
【請求項３】Ｎ−連結グリコシル化部位が外部にさらさ
れているｔ−PA変異体が位置に付加されている請求項２
に記載の変異体。
【請求項４】グリコシル化がＯ−連結グリコシル化であ
る請求項１に記載の変異体。
【請求項５】Asn−Ｘ−SerまたはAsn−Ｘ−Thrで示され
るトリペプチド配列（ここで、Ｘはプロリンを除いたい
ずれかのアミノ酸である）を含有する変異体の部位がグ
リコシル化されている請求項２に記載の変異体。
【請求項６】成長因子ドメイン内がグリコシル化されて
いる請求項１〜５のいずれかに記載の変異体。
【請求項７】（１）天然ｔ−PAにおける60位にセリンま
たはスレオニン、（２）天然ｔ−PAにおける64位にアス
パラギンおよび66位にセリンまたはスレオニン（３）天
然ｔ−PAにおける65位にアスパラギンおよび67位にセリ
ンまたはスレオニン、（４）天然ｔ−PAにおける67位に
アスパラギン、（５）天然ｔ−PAにおける78位にアスパ
ラギンおよび80位にセリンまたはスレオニン（６）天然
ｔ−PAにおける79位にアスパラギンおよび81位にセリン
またはスレオニン、（７）天然ｔ−PAにおける80位にア
スパラギンおよび82位にセリンまたはスレオニン、また
は（８）このような（１）から（７）の任意の２個また
はそれ以上の組合わせを含有している請求項５に記載の
変異体。
【請求項８】天然ｔ−PAの67位にアスパラギンを含有し
ている請求項７に記載の変異体。
【請求項９】フィブリン結合性に関与しているドメイン
の少なくとも一部が機能的に除去されて修飾を受けてい
るが、フィブリン結合性は修復されてそれが天然のｔ−
PAに匹敵している請求項６に記載の変異体。
【請求項１０】少なくともフィンガードメインの部分を
欠いている請求項６に記載の変異体。
【請求項１１】アミノ酸１−44を欠く天然ｔ−PAからな
る請求項10に記載の変異体。
【請求項１２】117、184、218、または448アミノ酸部位
の機能的炭水化物構造を欠いている請求項１〜11に記載
の変異体。
【請求項１３】アミノ酸184位の機能的炭水化物構造を
欠いている請求項12に記載の変異体。
【請求項１４】天然のｔ−PAと比較して（１）205−215
領域、（２）244−255領域、（３）233−242領域、また
は（４）これら（１）、（２）および（３）の２つまた
はそれ以上の領域、のアミノ酸がさらに修飾されている
請求項13に記載の変異体。
【請求項１５】特定の酵素的開裂に対して耐性である請
求項６に記載の変異体。
【請求項１６】実質的に２本鎖型を含まない請求項15に
記載の変異体。
【請求項１７】１本鎖突然変異体である請求項16に記載
の変異体。
【請求項１８】２本鎖開裂部位における部位−特異的突
然変異によって１本鎖型で安定化されている請求項17に
記載の変異体。
【請求項１９】成熟プラスミノーゲンアクチベーターに
従って番号付けした275位がアルギニン以外のアミノ酸
によって占有されている請求項18に記載の変異体。
【請求項２０】該アミノ酸がグリシンおよびグルタミン
酸の中から選ばれる請求項19に記載の変異体。
【請求項２１】該アミノ酸がグルタミン酸である請求項
20に記載の変異体。
【請求項２２】成熟プラスミノーゲンアクチベーターに
従って番号付けした277位がリジン以外のアミノ酸によ
って占有されている請求項19に記載の変異体。
【請求項２３】該アミノ酸がイソロイシンである請求項
22に記載の変異体。
【請求項２４】アミン酸275位または277位またはその両
部位における酵素的開裂に対して耐性である請求項11に
記載の変異体。
【請求項２５】デス１−44N67E275 t−PA、デス１−44N
67D184E275 t−PA、デス１−44N67S184E275 t−PA、デ
ス１−44N67K213E275 t−PA、デス１−44N67R210A211R2
12R213E275 t−PA、デス１−44N67R252E275 t−PA、デ
ス１−44N67K210E275 t−PA、デス１−44N67E275I277 t
−PA、デス１−44N67D184E275I277 t−PA、デス１−44N
67S184E275I277 t−PA、デス１−44N67K213E275I277 t
−PA、デス１−44N67R210A211R212R213E275I277 t−P
A、デス１−44N67R252E275I277 t−PA、およびデス１−
44N67K210E275I277 t−PAの中から選ばれる、請求項24
に記載の変異体。
【請求項２６】請求項１〜14および19〜25のいずれかに
記載の変異体をコードしているDNA配列。
【請求項２７】請求項26に記載のDNA配列を真核生物の
形質転換宿主細胞において発現することができる複製可
能な発現ベクター。
【請求項２８】請求項27に記載のベクターで形質転換さ
れた真核生物宿主細胞。
【請求項２９】酵母細胞である請求項28に記載の細胞。
【請求項３０】哺乳動物細胞である請求項28に記載の細
胞。
【請求項３１】チャイニーズハムスター卵巣セルライン
由来である、請求項30に記載の細胞。
【請求項３２】医薬的に許容され得る担体と共に、請求
項１〜25のいずれかに記載のプラスミノーゲンアクチベ
ーター変異体の治療学的有効量を含有してなる、血管疾
患または症状を処置するための組成物。