JPH03504327A - プラスミノーゲンアクチベーターの変異体およびその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ５１、酵母細胞である請求項５０に記載の細胞。

５２、＠乳動物細胞である請求項５０に記載の細胞。

５３、チャイニーズハムスター卵巣セルライン由来である、請求項５２に記載の 細胞培養物。

５４、医薬的に許容され得る担体と共に、請求項１に記載のブラスミノーゲンア クチベーター変異体の治療学的有効量を含有してなる、血管疾患または症状を処 置するための組成物。

５５、患者に請求項５４に記載の組成物を投与することを特徴とする、血管疾患 または症状を処置するための方法。

明　　細　　書 プラスミ／−ゲンアクチベーターの変異体およびその製造方法本発明は、ブラス ミノーゲンアクチベーターの特定の変異体、それを製造する方法、および予想外 の改良された治療学的および物理化学的特徴、特に改良された循環半減期とクリ アランス速度を有する医薬的に活性な組成物を製造するための、そのような変異 体を利用する方法およびそのような組成物に関する。

ブラスミノーゲンアクチベーターは、酵素前駆体（チモーゲン）プラスミノーゲ ンを活性化し、フィブリンなどの種々のタンパク質を分解するセリンブロテイナ ーゼのプラスミンを（Ａｒｇ５６１−Ｖａ１５６２部位での開裂によって）生成 させる酵素である。研究されているプラスミノーゲンアクチベーターの中には細 菌性タンパク質であるストレプトキナーゼ、腎およびその他の場所で合成され、 普通は尿から排出される酵素であるウロキナーゼ、および細胞内層の血管壁から 産生される酵素であるヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ−（ｔ−ＰＡ）が ある。

これらプラスミ／−ゲンアクチベーターの作用機序はそれぞれ異なっており、ス トレプトキナーゼはプラスミノーゲンと複合体を形成してプラスミン活性を生じ させ、ウロキナーゼはプラスミノーゲンを直接開裂し、モしてｔ−ＰＡはフィブ リンおよびプラスミノーゲンと３成分の複合体を形成して血餅の存在する場所で プラスミノーゲン活性を誘導する。

ｔ−ＰＡは、その高いフィブリン特異性とインビボにおける強力な血餅溶解能の おかげで、心筋梗塞などの心疾患を並外れて処置できると示されている、特に重 要かつ強力な新たな生物学的医薬物質として同定され、記載されている。

ｔ−ＰＡは多くの科学雑誌および特許出願公報の標的となっている。

その存在は幾つかの研究グループを刺激し、多くの情報が提供されてきたが、最 初は、ニーレン［Ｃｏ１１ｅｎ、　１９８１年１２月１６日公開の欧州特許出願 公開第４１．７６６号コらにより、天然起源から実質的に純粋な単離物として同 定され、要件としてのブラスミノーゲンアクチベーター活性がインビボにおいて 試験された。さらに、対応する科学雑誌であるリノケン（Ｒｉｊｋｅｎ）らのＪ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、　、　２５６：７０３５（１９８１）も膠解のこと 。

その後、組換えＤＮＡ技術が使用されて独特の環境下で大量のｔ−ＰＡを得るこ とに成功し、その研究に基づきＤＮＡ配列および推定アミノ酸配列が明らかにさ れ、ｔ−ＰＡの完全な同定および特性化がなされた。この研究は、ペニカ（Ｐｅ ｎｎｉｃａ）らのＮａｔｕｒｅ、　３０１：２１４（１９８３）、および１９８ ３年１１月９日公開の欧州特許出願公開第９３．６１９号に報告されている。

多くの他の研究者が、基本的にこの後者の開示を利用することにより組換えＤＮ Ａ技術によってｔ−ＰＡ分子を調製できるようになり、それに基づく報告を行っ ている。これらの研究者の中には、この基本的な構造の将来可能な変異体を公に 開示している者もあるが、彼らは、生物学的または薬物動態的効果が全体として 変動し得る誘導体を、机上論として単に予測しているに過ぎない。これらの開示 事項は大部分、実際の生物学的または薬物動態的な全体の効果に関して予言的で あり、不確かなものである。

最初のｔ−ＰＡの組換え工学的な生産に引き続いて、その分子特性の確定および 生物学的効果の確認という研究所における類似した試みが、科学文献および各種 の特許出願の両方に現実に報告されている。これらすべては、生物学に基づく種 々の最終目的に応じ、ｔ−ＰＡの商業的可能性を完全に探求し、開発するために 、その基本構造を修飾しようという試みに沿った研究が好まれる傾向にあるよう である。

このような研究および開示事項に部分的に基づけば、ｔ−Ｆ　Ａの分子は、トリ プシン、キモトリプシン、プラスミノーゲン、プロトロンビン、フィブロネクチ ンおよび表皮性成長因子（ＥＧＦ）などの他の種々のタンパク質中に同定される 相同的（ホモローガス）な、またはそうでなくてもそれらに類似した構造に照ら して規定される５つのドメイン（アミノ酸配列の並び）を含有していることは、 現在では配列のＮ−末端から開始して、（］、）アミノ酸Ｉから約４４を包含す るものとして種々規定されるフィンガー領域（Ｆ）、（２）アミノ酸約４５から アミノ酸９１にまで伸長するものとして種々規定される成長因子領域（Ｇ）［Ｅ ＧＦとの相同性に基づく］、（３）アミノ酸約９２からアミノ酸約１７３にまで 伸長するものとして種々規定されるクリングル１（Ｋｌ）、（４）アミノ酸約１ ８０から約２６１にまで伸長するものとして種々規定されるクリングル２（Ｋ２ ）、および（５）アミノ酸約２６４からｔ−ＰＡ分子のＣ−末端にまで伸長する ものとして一般に規定される、いわゆるセリンプロテアーゼドメイン（Ｐ）、と 命名されている。これらのドメインは一般に、互いに隣接して配置しているか、 または短い「リンカ−」領域によって分割され、推定された成熟型のｔ−ＦＡの １から５２７アミノ酸全体のアミノ酸配列を占めている。

各ドメインは、ある種の比活性に関与するものとして種々記載されている。フィ ンガードメインは、フィブリンとの高い結合親和性にとって少なくも主要な重要 性を持つ配列を含有しているものとして種々記載されている（この活性は、ｔ− ＰＡがフィブリン豊富な血栓の病巣における血餅の溶解に対して顕す高い特異性 にとって重要であると考えられている）。成長因子様領域も、同様に、少なくと もウロキナーゼに関しては細胞表面結合活性に関係している。クリングル２領域 も、フィブリン結合性、およびｔ−ＰＡの活性を刺激するフィブリンの刺激能に 強く関係している。セリンプロテアーゼドメインは、プラスミノーゲンを活性化 するためのｔ−ＰＡ活性に関与している。

可能性あるＮ一連結グリコシル化部位は、天然の成熟ｔ−ＰＡについて番号付け すれば分子内の１１７．１８４．２１８および４４８アミノ酸部位に存在してい る。２１８アミノ酸部位は天然ｔ−ＰＡではグリコジル化されていない。１１７ アミノ酸におけるグリコジル化部位は、高いマンノース型であると特性化され、 他の２つの部位はいわゆる複合オリゴサンカライド構造を呈している。ｔ−ＰＡ 分子をグリコジル化可能な宿主細胞から誘導させた場合、１１７および４４８部 位は常にグリコジル化されるようであるが、１８４部位は分子の約５０％がグリ コンル化されると考えられる。

この１８４部位のグリコジル化／非グリコジル化現象は、５ＤＳ−ＰＡＧＥ分析 によって証明されており、それによれば１つは１８４位のグリコジル化分子に関 連し、他方は１８４位の非グリコジル化分子に関連する２つのバンドを認めるこ とができる。これらのバンドはそれぞれｔ−ＰＡのＩ型および■型と命名されて いる。この部分的なグリコジル化パターンは、１８４部位がｔ−ＰＡタンパク質 内の立体配座的（コンホーメーンヨン的）に保護された部位に配置している結果 であると考えられる。

科学的に注目されている他の場所は、アミノ酸２７５から約２７９として規定さ れる領域内にある、いわゆるタンパク分解的開裂部位、より具体的には天然分子 の２７５および２７６アミノ酸間の結合である。タンパク分解的に崩壊され難く なるようにこの部位に突然変異を起こさせれば、生物学的および商業的に何等か の利点を有すると考えられる、単一鎖すなわち１本鎖形態を維持した分子が創製 される。

既述のように、もう１つのブラスミノーゲンアクチベーターであるウロキナーゼ は、ヒトの尿およびヒト腎細胞培養液から精製され［グンツラ−（ｃｕｎｚｌｅ ｒ）らのＨｏｐｐｅ−３ｅｙｌｅｒ’　ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏｌ、　ＣｈｅＩ ｌｌ、　、　３６３：１１５５−１１６５（１９８２）、およびステフェンス（ Ｓｔｅｆｆｅｎｓ）らのＨｏｐｐｅ　５ｅｙｌｅｒ’　ｓ　Ｚ、　Ｐｈｙｓｉｏ ｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　３６３：１０４１０４３−１０５８（１９］、組換え的 に製造されている［ＥＰＯ公開第１５４．２７２号およびホーメス（ＨｏｒＩＩ ｌｅｓ）らのＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、　３：９２３−９２９（１９８５） ］。

ウロ牛ナーゼは４１１個のアミノ酸を含有しており、それはＮ−末端リーダー配 列を伴って産生されてプロウロキナーゼの生産を導びき、それが成熟期に開裂さ れて製造される。プロウロキナーゼは逆にプラスミンにより開裂され、２つのウ ロキナーゼ種になる二分子量５４，０００ダルトンのものと分子量３３．０００ ダルトンのものである。

ウロキナーゼは３つの同定可能なドメインを有している：すなわち、５位から４ ９位までを包含する成長因子ドメイン、５０位から１３６位までを含むクリング ルドメイン、および１５８位から４１１位までを包含するセリンプロテアーゼド メインである。プロウロキナーゼも同様に、これら３つのドメインから構成され る。グンツラーらを参照（前掲）。ウロキナーゼ内における酵素学的に活性なア ミノ酸残基は２０４位、２５５位および３５６位に位置しており、Ｎ一連結グリ コシル化部位はＡｓｎ３０２に存在する。

ウロキナーゼは、大量に使用した場合、凝集の崩壊とフィブリン分解因子の活性 化を招来し、出血傾向に導く。これとは対照的に、ＥＰＯ公開第１３９．４４７ 号およびＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｒａ、　２６０　：１２３７７（１９８５） に記載されている、ヒトウロキナーゼの前駆体であるプロウロキナーゼは、実質 的な出血を誘発させることなく、血栓を溶解する［Ｃｅ１ｌ　５ｔｒｕｃ。

Ｆｕｎｃ、、１０：１５１（１９８５）コ。

プラスミノーゲンアクチベーターおよび第二世代のその誘導体に関しては、ハリ ス（Ｈａｒｒｉｓ）のＰｒｏｔｅｉｎ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ４：４４９−４ ５８（１９８７）に概説されている。

天然のｔ−ＰＡは、治療学的有効量で患者に投与した場合、通常約６分またはそ れ以下の血漿半減期を示す。プロウロキナーゼも同様の半減期を有する。このよ うな半減期は、例えば心筋梗塞または肺塞栓症などの致死性の疾患に対して急性 の攻撃的治療を施すような特定の場合には望ましい。この高い危険性を伴う状況 下では、制御できない出血傾向を引き起こす重要な、または認識できない可能性 を有する患者を処置してしまう場合がある。このような出血が起こった場合は、 薬物投与を中止すれば、その原因となるｔ−ＰＡレベルは速いクリアランス速度 によって即座に消失されよう。

しかし、他の状況下、例えば再潅流（ｒｅｐｅｒｆｕｓｉｏｎ）を行って心筋梗 塞を処置する場合、望ましい治療計画は攻撃性の低い、長時間（４から１２時間 ）にわたるものである。長い半減期型のｔ−ＰＡは、生命が脅かされているよう な状況にない患者ではさらに望ましく、効率的かつ簡便な処置と考えることがで きる。さらに、より長い半減期のｔ−ＰＡはポーラス投与用の剤として望ましい であろう。例えば、救急車の職員は一般に注入の資格を持っていないので、より 大きな半減期を有するｔ−ＰＡ様物質を使用するのは非常に望ましいであろｔ− ＰＡにおける上記の規定されたドメインおよびグリコンル化部位のすへて、およ び１本鎖／２本鎖開裂部位は、特定の潜在的生物学的活性成分を有するものとし て記載されている。例えば、フィンガードメインの実質的部分またはそのすべて を除去すれば、フィブリン結合特性が実質的に減じられているが、代わって得ら れた分子の全体としてのクリアランス速度は低下している分子が得られることに なる。

天然分子を修飾して１本鎖から２本鎖への開裂部位を破壊すると、若干改変され た生物活性と、より良好な安定性とを有しており、同時にフィブリン結合性とフ ィブリン刺激性とが２重鎖ｔ−ＰＡと比較して増大している分子が得られる。

１１７−］１９．１８４−１８６および４４８−４５０におけるグリコジル化突 然変異体は、炭水化物のモル％が減少するに連れて、より高い比活性を示した。

ＥＰＯ公開第２２７．４６２号を参照のこと。

さらに、ＤＮＡ修飾によってＮ−グリコンル化部位は選択的に除去されているが 残りの〇一連結炭水化物は含有している、Ａｓｎ１１９、ＡＩａ１８６およびＡ ｓｎ４５０のｔ−ＰＡ突然変異体は、インビトロ溶解性試験においてメラ／−マ （黒色腫）ｔ−Ｐ　Ａの約２倍も強力であることが見いだされた。ＥＰＯ公開第 ２２５．２８６号参照。

しかし、グリコンル化部位を改変、特に１．１７アミノ酸を改変した場合、改変 された循環半減期のパターンおよび／またはフィブリン結合特性を付加的に招来 する場合のある、溶解性に影響を受けた分子が常に得られるようである。

ｔ−ＰＡの成長因子ドメインを除去した場合は、ファン・ジン不ベルド（Ａ、　 Ｊ、　ｖａｎ　Ｚｏｎｎｅｖｅｌｄ）らのＴｈｒｏｍｂｏｓ、　Ｈａｅｍｏｓｔ ａｓ、　、　５４（１）４（１９８５）に報告されているように、得られた突然 変異体は依然活性であり、フィブリンと結合する。また、成長因子ドメインに種 々の欠損を施した場合については特許文献に報告されている。ＥＰＯ公開第２４ １゜２０９号（デス５ｌ−８７）、ＥＰＯ公開第２４１．２０８号（デス５１− ８７およびデス５ｌ−１７３）、Ｐ　ＣＴ　８７１０４７２２（Ｎ−末端１−９ １のすべてまたはその一部の除去）、ＥＰＯ公開第２３１．６２４号（成長因子 ドメインすべての除去）、およびＥＰＯ公開第２４２．８３６号および日本国特 許出願公開筒６２−２６９６８８号（成長因子ドメインのいずれかまたはすべて の除去）を参照のこと。

ｔ−ＰＡの最初のクリングルドメインおよび成長因子ドメインに修飾を施すこと で、循環半減期を増大させることができる。１９８７年１０月１４日公開のＥＰ Ｏ特許公開第２４１．２０８号を参照のこと。アミノ酸５１および８７間の領域 をまとめてｔ−ＰＡから除去すれば、血漿からのクリアランスがよりゆるやかな 変異体を得ることができる［ブローン（Ｂｒｏｗｎｅ）らのＪ、　Ｂｉｏｌ、　 Ｃｈｅｗ、　２６３：１５９９−１６０２（１９８８）コ。さらに、ｔ−ＰＡは 、特定のアミノ酸残基を除去するか、または１つもしくはそれ以上のアミノ酸を 別のアミノ酸と置換することによって、逆の生物学的効果を伴わずに、成熟した 天然ｔ−ＰＡの６７−６９アミノ酸領域を修飾することができる。１９８７年１ ０月７日公開のＥＰＯ特許公開第２４０．３３４号を参照のこと。さらに、ヒト ブロウロ牛ナーゼタンパク質の表皮性成長因子ドメインのすべてまたはその一部 を除去するか、１つもしくはそれ以上の別のアミノ酸残基と置換した場合、得ら れた変異体は血中半減期が増大している。１９８８年１月２０日公開のＥＰＯ特 許公開第２５３．２４１号を参照のこと。

当該技術分野においては、天然のプラスミノーゲンアクチベーター分子以上に改 善された薬物動態特性をブラスミノーゲンアクチベーター分子に付与するよう修 飾することのできる、該分子内における特定の部位を確定することが現在の継続 的な要求である。このような変異体分子は、心臓血管疾患、および血管の血栓塞 栓性閉塞に起因する他の多くの臨床状態を処置する上で医療科学的に重要である 新規な代替法を提供することになろう。

このように、本発明の目的の１つは、改善された治療学的および医薬的性質を示 す血餅−溶解性物質を必要する患者にブラスミノーゲンアクチベーター分子を提 供することである。

本発明の他の目的は、現在人手可能な血餅−溶解性物質と比較してより長い半減 期およびより遅い血漿からのクリアランス速度を有するブラスミノーゲンアクチ ベーター分子を提供することである。

また、本発明は、天然ｔ−ＰＡと比較してより長い循環半減期およびより長い血 漿からのクリアランス速度を有する血餅−溶解性物質を使用することのできる状 態、例えば深静脈血栓または末梢動脈血栓（末梢血管疾患）などの疾患を処置す ることを目的としている。

これらおよびその他の目的は当業者には明白であろう。

これらの目的は、フィブリン溶解活性を示し、かつ対応する天然ブラスミノーゲ ンアクチベーターではグリコフル化されていない１つまたはそれ以上の領域がグ リコジル化されているプラスミノーケンアクチベーターのアミノ酸配列変異体が 得られたことによって達成される。

１つの好ましい態様では、このようなグリコフル化は、式＝Ａ　５ｎ−Ｘ　−５ ｅｒまたはＡ　５ｎ−Ｘ　−Ｔ　ｙｒ［式中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸であ る］で示されるトリペプチド配列を含有する変異体の部位で行われる。

もう１つの態様では、ブラスミノーゲンアクチベーターはその成長因子ドメイン 内がグリフシル化されている。

さらに他の態様では、ブラスミノーゲンアクチベーターはｔ−ＰＡであり、ｔ− ＰＡの天然アミノ酸配列にしたがって番号付けした場合のその６７位におけるチ ロシン残基が、アスパラギン、セリンまたはスレオニンなどのグリコジル化する ことのできる他のアミノ酸（好ましくはアスパラギン）と置換しているものであ る。

本発明はその池の態様として、上記の変異体をコードしているＤＮＡ配列、形質 転換宿主細胞内でそのＤＮＡ配列を発現することのできる複製可能な発現ベクタ ー、およびそのベクターによって形質転換されている微生物および細胞培養物を 提供するものである。

さらに、本発明は、医薬的に許容され得る担体と一緒になって本明細書に記載の 変異体を治療学的有効量で含有してなる、血管疾患または症状を処置するための 組成物を提供するものである。

さらにもう１つの態様として、本発明は、本発明の変異体を含有する前記の組成 物を患者に投与することを特徴とする、患者における血管疾患または症状の処置 方法を提供するものである。

本発明は、天然分子では通常グリコジル化されていないプラスミノーゲンアクチ ベーターの部位がグリコジル化されることにより、天然物質と比較して延長した 循環半減期とより遅いクリアランス速度とを示す変異体が得られることを証明し た、特定の成功を収めた研究を特に基礎としている発明である。本発明の結果物 は、アミノ酸配列が全体としては実質的に天然物質と異なっているが、商業的方 面の開発において天然物質と競合できる程に、またはその代替物質としての薬物 動態的性質を有する分子である。

第１図は、哺乳動物細胞および酵母から産生されたタンパク質のＮ一連結グリコ シル化のパターンを表示するものであり、図中、ＳＡはシアル酸を、ｇａｌはガ ラクトースを、ｍａｎはマンノースを、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミ ンを、そしてＡｓｎはアスパラギンをそれぞれ表している。

第２図は、５つのドメイン、ジスルフィド架橋およびグリフシル化部位の位置を 示しているｔ−ＰＡの１次構造である。

第３図は、３つのドメイン、ジスルフィド架橋およびグリコジル化部位の位置を 示しているウロキナーゼの１次構造である。

第４ａ図、第４ｂ図および第５ａ図、第５ｂ図は、ｐｃｒｓｔ−ｐＡをの調製す るための適当な方法を説明し、その主要な制限部位も幾つか併せて記載している 模式図である。

第６図は、ｐ７−ＩＨを調製するための適当な方法を説明し、その主要な制限部 位も幾つか併せて記載している模式図である。

第７図は、天然の比活性に対する百分率（％）として表している、ｒｔ−ＰＡお よびグリコジル化されているＮ６７ｔ−ＰＡのインビトロ血餅溶解の結果および Ｓ−２２５１の結果を示すものである。結果は、幾つかの独立した観察事項（血 餅溶解、４つの測定値；Ｓ−２２５１，２つの測定値）の平均である。すべては 、２９３細胞において一時的に発現された物質由来であり、ＥＬＩＳＡによって 定量した。

第８図は、ｔ−Ｐ　Ａ濃度１０ｎｇ／ｚＱにおけるｒｔ−ＰＡおよびグリコフル 化されているＮ６７ｔ−ＰＡのフィブリン結合性を示している。

両者共に２９３細胞で一時的に発現させた。

第９Ａ、−９Ｃ図は、還元し、カルボキシメチル化したｒｔ−ＰＡ、　Ｎ６７　 ｔ−Ｐ　Ａ、およびＮ−グリカナーゼ処理（脱グリコジル化）Ｎ６７ｔ−ＰＡの トリプシン・マツピング分析における逆相ＨＰＬＣプロフイルをそれぞれ示すも のである。すべて、２９３細胞で一時的に発現させた。

第１０図は、ｒｔ−ＰＡ、デス１−４４　ｔ−Ｐ　Ａ、デス１−４４Ｅ２７５　 ｔ−Ｐ　Ａ、デスｌ−４４Ｅ２７５ＤＩ８４、およびグリコジル化Ｎ６７　ｔ− Ｐ　Ａのウサギにおける薬物動態プロフィルを示すものである（Ｎ６７ｔ−ＰＡ を除いてすべて、安定なＣＨＯセルラインから発現させた）。Ｎ６７物質は２９ ３細胞における一時的な発現により八本明細書で使用している［ブラスミノーゲ ンアクチベーター」する用語は、プラスミノーゲンをプラスミンに変換できるタ ンパク質を意味する。このようなブラスミノーゲンアクチベーターには例えば、 あらゆる種由来の、好ましくはヒト由来の組織型プラスミノーゲンアクチベータ ー、ウロキナーゼ、プロウロキナーゼ：ストレプトキナーゼなどがある。これら ブラスミノーゲンアクチベーターは、例えば組換え細胞培養系によって生物活性 型で産生させることができる。配列全体におけるアミノ酸（群）の相違から証明 されるように、個体間毎に天然のアレル変異体が存在し、生じていることは理解 されよう。

「対応する天然のブラスミノーゲンアクチベーターではグリフシル化されていな い１つまたはそれ以上の領域がグリコフル化されている」なる表現は、Ｎ−また は〇一連結の別は問わず、酵母または哺乳動物宿主という由来を問わず、また複 雑な高マンノースまたは雑種構造のいかんにかかわらず、天然分子では実際にま たは潜在的にもグリコジル化されない領域に起こっているグリコジル化を意味す る。このような実際または潜在的な位置は、ｔ−ＰＡおよびウロキナーゼについ てそれぞれ第１図および第２図に丸印で示している。したがって、例えばｔ−Ｐ Ａ分子内にはＮ−グリコシド連結の可能性ある部位は４つあるが（Ａｓｎ１１７ 、Ａｓｎ１８４、Ａｓｎ２１８およびＡｓｎ４４８）、天然のｔ−ＰＡは実際に は３つの部位（１１７，１８４（分子の５０％）および４４８）Ｌかグリコジル 化されていない。ｔ−ＰＡにおけるＡｓｎ２１８−Ｐ　ｒｏ−３ｅｔ部位はグリ コジル化の可能性ある部位であるが、その配列にはプロリンが存在しているので 、哺乳動物細胞では炭水化物結合に利用されないＥボール（Ｇ、　Ｐｏｈｌ）ら のＢｉ。

ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　２３：３７０ｒ（１９８４）を参照］。ウロキナーゼで は、グリコジル化は３０２位に起こる。

本明細書で使用している「成長因子ドメイン」なる用語は、ヒトおよび／または ネズミ表皮性成長因子と構造的にホモローガス（相同的）なブラスミノーゲンア クチベーターの領域を意味するし例えば、バニャイ（Ｂａｎｙａｉ）らのＦＥＢ Ｓ　Ｌｅｔｔ、　、　１６３：３７（１９８３）を参照］。ｔ−ＰＡ内では、こ の領域はアミノ酸約４４から約９１にまでわたる。プロウロキナーゼでは、この 領域は約Ｎ−末端セリンから約４９番目のアミノ酸残基スレオニンにまでわたる 。そして、ウロキナーゼでは、約５から約４９にこの領域がわたっている。ｔ− Ｐ　Ａにおけるこのドメインの大部分（５１−８６残基）をコードしているＤＮ Ａおよび５０−８７残基を部分的にコードしているＤＮＡは、単一のエクソンに 含有されている［ネイ（Ｎｙ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓ ｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　、　８１　：５３５５（１９８４）］。

本明細書で使用している「ヒト組織ブラスミノーゲンアクチベーター」、［ヒト ｔ−ＰＡＪおよびｒｔ−Ｐ　ＡＪなる用語は、プラスミノーゲンをプラスミンに 変換することのできるプロテアーゼドメイン、およびフィブリン結合性に関与し ていると考えられているクリングル含有ドメインから構成される２つの機能的領 域を含有するヒト外因性（組織型）ブラスミノーゲンアクチベーターを規定する ものである。したがって、これら３つの用語には、配列全体の一部としてこれら の機能的なドメインを含有するポリペプチドが包含される。

ｔ−ＰＡにおける「２本鎖開裂部位」は少なくとも２７５位のアルギニン残基を 含有している。しかし、２７５位の幾つかの残基内のまたはそれに隣接している 種々のアミノ酸も、ブラスミノーゲンアクチベーターをその２本鎖型に変換させ る酵素によって認識されるドメインの一部であると考えられる。したがって、２ ７５位以外のそのドメイン内の位置のアミノ酸を置換することにより、２本鎖型 への変換に耐性である突然変異ブラスミノーゲンアクチベーターを得ることがで きるであろう。

特定の態様では、「１木調ブラ、スミノーゲンアクチベーター突然変異体」とは 、２本鎖型への変換に耐性であるブラスミノーゲンアクチベーターである。その 特徴は、２本鎖活性部位における単一または多重アミノ酸の置換である。修飾さ れれば、このような活性部位は酵素学的に認識されず、したがって通常プラスミ ノーゲンアクチベーターをその２本鎖型に変換する酵素によっては加水分解され ない。このような突然変異体の注目に値する例としては、２７５から２７９領域 内に修飾を施すことによって、例えば２７５位にグリシンまたはグルタミン酸な どのアルギニン以外のアミノ酸を有する、および２７５位にグルタミン酸および ２７７位にインロイシンを有する、２７５／２７６開裂部位の開裂に対して耐性 である分子（それぞれＧ２７５、Ｅ２７５、およびＥ２７５１２７７と命名され る）が挙げられる。これらの１本鎖突然変異体は欧州特許出願第１．９９５７４ 号（１９８６年］Ｏ月２９日）により詳細に記載されている。

１、グリコジル化 プラスミノーゲンアクチベーターのアミノ酸配列変異体は、Ｏ−またはＮ一連結 を介してグリコジル化することができ、そして天然分子では通常はグリコジル化 されていない少なくとも１つのアミノ酸配列を含有していなければならない。

Ｎ一連結グリコシル化を考えた場合、変異体におけるグリコジル化部位は、式： アスパラギン−Ｘ−セリンまたはアスパラギン−Ｘ−スレオニン［式中、アスパ ラギンはアクセプターであり、Ｘはグリコジル化を妨げるプロリンを除く、遺伝 学的にコードされた２０個のアミノ酸のいずれかである］ で示されるトリペプチド配列である。ストラック（Ｄ、　Ｋ、　５ｔｒｕｃｋ） およびレンナーツ（Ｗ、　Ｊ、　Ｌｅｎｎａｒｚ）のＴｈｅ　Ｂｉｏｃｈｅａ＋ １ｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓａｎｄ　Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃ ａｎｓ、レンナーツ編、ブレノーン・プレス、　１９８０．３５頁；マーシャル （Ｒ，Ｄ、　Ｍａｒｓｈａｌｌ）のＢｉｏｃｈｅ＋ａ、　Ｓｏｃ、　Ｓｙｍｐ、 　、　４０：１７（１９７４）、およびウインツク−（Ｗｉｎｚｌｅｒ、　Ｒ， Ｊ、　）のＨｏｒｍｏｎａｌ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ａｎｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅｓ（ リー（Ｌｉ、　Ｃ，１，）編）１−１５頁（アカデミツク・プレス、ニューヨー ク、１９７３）を参照のこと。本明細書に記載のアミノ酸配列変異体は、適切な 部位（群）に適当なアミノ酸（群）を挿入するか、または適切な部位（群）のア ミノ酸（群）を適当なアミノ酸と置換してグリコジル化を行うことによって、修 飾されている。

〇一連結グリフシル化を使用する場合は、０−グリコシド連結は動物細胞では、 Ｎ−アセチルガラクトサミン、ガラクトースまたはキシロースと、数種のヒドロ キシアミノ酸の中の１つ、最も普通にはセリンまたはスレオニンで起こるが、さ らにある場合には、分子の適当な領域内に位置する５−ヒドロキシプロリンまた は５−ヒドロキシリジン残基との間でも起こる。

哺乳動物によって産生されるタンパク質のグリコジル化パターンは、Ｔｈｅ　Ｐ ｌａｓｍａ　Ｐｒｏｔｅｉｎｓ：　５ｔｒｕｃｔｕｒｅ、　Ｆｕｎｃｔｉｏｎ　 ａｎｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　ＣｏｎｔｒｏＬプットナン（Ｆ、　Ｗ、　Ｐｕｔｎａ ｍ）編、２版、４巻（アカデミツク・プレス。

ニューヨーク、　１９８４）、　２７１−３１５頁に詳細に記載されている。こ の章では、アスパラギン連結オリゴサツカライドが論じられており、これは、そ の文献の中で、複合体、高マンノース（ｈｉｇ）１　ｎａｎｎｏｓｅ）および雑 種構造と命名される少なくとも３つのグループ、ならびにＯ−グルコシル的に連 結したオリゴサツカライドに細分類されている。

グリコシドのタンパク質への化学的および／または酵素学的カップリングは、例 えばアブリン（Ａｐｌ　ｉｎ）およびリストン（Ｗｒｉｓｔｏｎ）のＣＲＣＣｒ １ｔ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　２５９−３０６頁（１９８１）に記 載されているように、種々の活性化された基を使用して行うことができる。この 化学的カップリング法の利点は、それが比較的単純であり、天然におけるＯ−お よびＮ一連結グリコシル化に要求される複雑な酵素学的機構を必要としない点で ある。使用するカップリング法の態様に応じて、糖（群）を、（ａ）アルギニン またはヒスチジン、（ｂ）グルタミン酸またはアスパラギン酸などの遊離カルボ キシ基、（Ｃ）システィンなどの遊離スルフィドリル基、（ｄ）セリン、スレオ ニンまたはヒドロキシプロリンなどの遊離ヒドロキシ基、（ｅ）フェニルアラニ ン、チロシンまたはトリプトファンなどの芳香性残基、または（ｆ）グルタミン のアミド基と結合させればよい。これらの方法は、１９８７年９月１１日公開の ＰＣＴ　ＷＯ３７１０５３３０により詳細に記載されている。

酵母から産生されるタンパク質のグリコジル化のパターンはタンナー（Ｔａｎｎ ｅｒ）およびレール（Ｌｅｈｌｅ）のＢｉｏｃｈｉｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ａ ｃｔａ、　９０６（１）：８ｌ−９９（１９８７）およびククルチンスカ（Ｋｕ ｋｕｒｕｚｉｎｓｋａ）らのＡｎｎｕ、　Ｒｅｖ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　５ ６：９１５−９４４（１９８７）に詳細に記載されている。

さらに、第１図には、哺乳動物細胞および酵母から産生されるタンパク質のＮ一 連結グリコシル化の両パターンを比較して示している。

２、アミノ酸配列変異体 本明細書に記載の変異体について論じるために、ｔ−ＰＡおよびヒトウロキナー ゼの一次構造をそれぞれ示した第２図および第３図を引用して行う。

第２図では、丸印内の文字は１文字アミノ酸コードであり、両路間の連結線はジ スルフィド架橋を示しており、白抜きの丸印はグリコジル化部位を示しており、 そしてＦ、ＧＦ、Ｋｌ、Ｎ２およびＳＰなる略語はそれぞれ、フィンガー、成長 因子、クリングル１、クリングル２およびセリンプロテアーゼドメインを表して いる。

第３図では、丸印内の文字は１文字アミノ酸コードであり、両路間の連結線はジ スルフィド架橋を、白抜きの丸印はグリコジル化部位を、そしてＧＦ、におよび ＳＰなる略語はそれぞれ成長因子、クリングルおよびセリンプロテアーゼドメイ ンを示している。

本明細書に記載しているブラスミノーゲンアクチベーター変異体を簡略命名法に よって命名するため、数字は、推定の成熟ｔ−Ｐ　Ａ　［ＥＰＡ公開第９３．６ １９号］、成熟ヒトウロキナーゼおよびプロウロキナーゼのアミノ酸配列に沿っ たアミノ酸残基／位置を表していることに留意されたい。アミノ酸の特定には以 下のようなアルファべ、７トの１文字を使用している： Ａｓｐ　　Ｄ　　アスパラギン酸　　　１１ｅｌ　　イソロイシンＴｈｒ　　Ｔ 　　スレオニン　　　　　Ｌｅｕ　　Ｌ　　ロイシン５ｅｒＳ　　セリン　　　 　　　　Ｔｙｒ　　Ｙ　　チロシンＧｌｕ　　Ｅ　　クルタミン酸Ｐｈｅ　　Ｆ 　　フェニルアラニンＰｒｏＰ　　プロリン　　　　　　Ｈｉｓ　　Ｈヒスチジ ンＧｌｙ　　Ｇ　　グリシン　　　　　　Ｌｙｓ　　Ｋ　　リジンＡｌａ　　Ａ 　　アラニン　　　　　　Ａｒｇ　　ＲアルギニンＣｙｓＣシスティン　　　　 　Ｔｒｐ　　Ｗ　　）リブトファンＶａｌ　　Ｖ　　バリン　　　　　　　Ｇｌ ｎ　　Ｑ　　グルタミンＭｅｔ　　Ｍ　　メチオニン　　　　　Ａｓｎ　　Ｎ　 　アスパラギンこのような１文字の後にある数字はアミノ酸の位置を表しており 、したがって例えばＤ１８４は、１８４位にアスパラギン酸を有している変異体 を意味している。

本発明の目的に適うグリコジル化部位（群）は、対応する天然タンパク質におい て既にグリコジル化されておらず、またはその可能性のない分子内のあらゆる部 位（群）でよいのであるが、外部にさらされている分子位置内の部位であること が好ましい。このような領域としては、例えばｔ−ＰＡの（成長因子ドメイン内 の）５７位から６１位、６３位から６９位、および７８位から８２位のアミノ酸 位置が挙げられる。これらの領域はそれぞれ、アベラ（ＡＩ）ｐｅｌｌａ）らの ＦＥＢＳＬｅｔｔｅｒｓ、　２３１　：１−４（１９８８）の第２図に示された １型成長因子ドメインのＡＳＢおよびＣループに相当する。したがって、〇一連 結グリコシル化のためには、これらの領域内の１つまたはそれ以上のアミノ酸を セリン、スレオニンまたは５−ヒドロキシリジン残基と置換またはそれらを付加 する。

これらの領域を使用するＮ一連結グリコシル化に適した代表的変異体には、Ｓ　 ６ｏｔ−ｐＡ、Ｓ　１７ウロキナーゼ、Ｔ６０ｔ−ＰＡ、Ｔ１７ウロキナーゼ、 Ｎ６４Ｓ６６ｔ−ＰＡ、Ｎ６４Ｔ６６ｔ−ＰＡ、Ｓ２４ウロキナーゼ、Ｔ２４ウ ロキナーゼ、Ｎ６５Ｓ６７ｔ−ＰＡ、Ｎ６５Ｔ６７ｔ−ＰＡＳＮ２３Ｓ２５ウロ キナーゼ、Ｎ２５Ｔ２５ウロキナーゼ、Ｎ６７ｔ−ＰＡ、Ｎ６７Ｔ６９ｔ−ＰＡ 、Ｎ２５ウロキナーゼ、Ｎ２５Ｔ２７ウロキナーゼ、Ｎ７８ｓ８０ｔ−ｐＡ、Ｎ ７８Ｔ８０ｔ−ＰＡ、Ｎ３６Ｓ３８ウロキナーゼ、Ｎ３６Ｔ３８ウロキナーゼ、 Ｎ７９Ｓ８　ｔｔ−ＰＡ、Ｎ７９Ｔ８１ｔ−ｐＡＳＮ３７Ｓ３９ウロキナーゼ、 Ｎ３７Ｔ３９ウロキナーゼ、Ｎ８０Ｓ８２ｔ−ｐＡＳＮ８０Ｔ８２ｔ−ＰＡ、Ｎ ３８Ｓ４０ウロキナーゼ、Ｎ３８Ｔ４０ウロキナーゼ、または例えば５６ＯＮ６ ５Ｔ６７ｔ−ＰＡもしくは５６ＯＮ７８Ｓ　８Ｑ’ｔ−Ｐ　Ａなどの、１つのル ープと他のループとの組合わせ物がある（ここに、ウロキナーゼはヒトウロキナ ーゼを意味し、ヒトプロウロキナーゼをも包含する）。

１つの好ましい態様は、Ｎ一連結グリコシル化部位がｔ−ＰＡの６７位から６９ 位、ならびにヒトウロキナーゼおよびヒトプロウロキナーゼの２５位から２７位 におけるチロシン−フェニルアラニン−セリンのトリペプチド配列の場合である 。

本明細書に記載のプラスミノーゲンアクチベーター変異体は、天然の配列におけ る１つまたはそれ以上の部位が修飾されていることにより天然分子では通常グリ コジル化されない部位がグリコジル化されていることに加え、さらに天然配列に おけるその他の領域に残基の置換、欠失または挿入を含み該分子の特定の性質が 改良されていることもある。

例えば、本発明のｔ−ＰＡ変異体には、少なくともフィンガードメインの部分を 欠き、および／または１８４アミノ酸の回りのグリコジル化部位におけるグリコ ジル化能を欠いているものがあり、また２７５および２７６アミノ酸の回りの部 位のタンパク分解的開裂に対して耐性を示し、および／またはクリングル２の推 定リジン結合部位にアミノ酸修飾を有するものもある。

さらに、ｔ−ＰＡのフィブリン結合性は調整することができ、最も好ましいもの は、ｔ−ＰＡの推定リガンド結合性ポケットの反対の端における陽性または陰性 に帯電するアミノ酸残基を適当に置換することによって、フィブリン結合性を修 復または増大させることである。本発明の変異体は一般に、以下で詳細に説明す る部位−特異的突然変異または切除／連結法によって調製される。

このようなｔ−ＰＡ変異体を特別に例示すれば、アミノ酸１−４４を欠いている 分子（デス１−４４と命名）、１８４位にアスパラギン酸を有している分子（Ｄ １８４と命名）、および１本鎖プラスミノーゲン突然変異体が挙げられる。アミ ノ酸１−４４を欠く変異体は同時係属中の米国特許出願第６８．４４８号（前掲 ）により完全に記載されている。

上記のｔ−ＰＡ変異体はすべて、本分子内の種々の他領域が修飾されていてもよ い。例えば、 １　クリングル１の修飾、例えば約９２から１７９！７）欠失、および／または ２　クリングル２の修飾、例えばアミノ酸約２０５−２１５領域、特に２１０− ２１３における修飾、および／または３　アミノ酸約２４４−２５５、特に２５ ２またはその部位、および／または ４　アミノ酸約２３３−２４２、特に２３６−２３８、および／または ５　アミノ酸１８４などの既知のグリコジル化部位。

６７位にアスパラギンを有する上記変異体の具体例を以下に記載する：デス１− ４４Ｎ６７Ｄ１８４Ｇ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４　Ｎ６７Ｄ］、８４Ｅ２７ ５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｇ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｅ２７ ５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｑ２７５１２７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６ ７Ｄ１８４Ｅ２７５１２７７ｔ−ＰＡ１デス１−４４Ｎ６７Ｅ２７５１２７７ｔ −ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２１ＯＡ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７５ｔ−Ｐ Ａ、デス１４４Ｎ６７Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｅ２７５　Ｔ　２７７ ｔ−ＰＡ１デス１−４４Ｎ６７に２１３Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７ に２１３Ｅ２７５　Ｉ　２７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２５２Ｅ　２７ ５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２５２Ｅ２７５Ｉ２７７ｔ−ＰＡ、デス１− ４４Ｎ６７に２１０Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４　Ｎ６７に２１０Ｅ２７５ 　Ｔ　２７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２１０Ｈ２１１Ｑ２１２に２１３ Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デスｌ−４４Ｎ６７Ｒ２１０Ｈ２１ＩＱ２１２に２１３Ｅ２ ７５１２７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｄ１８４Ｒ２１ＯＡ２１１Ｒ２１２ Ｒ２１３Ｒ２５２Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｄ１８４Ｒ２１ＯＡ２ １１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｒ２５２Ｅ２７５　Ｉ　２７７ｔ−ＰＡ、Ｎ６フーデス９ ２−１７９Ｄ１８４Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２１３Ｒ２５２Ｅ　２７５ｔ− ＰＡ、またはそれらのＮ１８４および５１８４同族体、およびそれらの組合わせ 物。

これら多くの修飾により、天然のｔ−ＰＡと比較して有意にクリアランス速度お よびフィブリン結合性を改変することができる。当業者ならば、適当な検定法に よって、個々の場合に望まれる、各変異体の最高の性質が何であるのかを決定す ることができよう。

当業界で知られているあらゆる手段、例えば以下に記載するような、部位特異的 突然変異、または適当な配列を関連タンパク質をコードしているＤＮＡに連結す る手段によって、天然分子内の適当なアミノ酸（群）を変化または挿入する修飾 を施して上記のような様々な配列を得ることかできる。

３、部位−特異的突然変異 本明細書に沿ってｔ−ＰＡ変異体を製造するに当たっては、好ましくは、ｔ−Ｐ Ａタンパク質の初期に調製された変異型または非変異型誘導体をコードしている ＤＮＡに部位−特異的突然変異を施す。部位−特異的突然変異によれば、回避し ようとする（トラバースしようとする）突然変異部位の両側に安定な二重ラセン （ｄｕｐｌｅｘ）を形成するに充分な大きさおよび配列複雑性を有する配列とな る、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコードしている特定のオリゴヌクレオチド配 列、および十分な数の隣接ヌクレオチドを使用することによって、ｔ−ＰＡ変異 体を製造することかできる。通常は、約２０−２５長のヌクレオチドのブライマ ーが好ましく、その配列の接合部の両側における約５−１０残基が改変される。

部位−特異的突然変異の技法は、アデルマン（Ａｄｅｌｍａｎ）らのＤＮＡ　２ ：１８３（１９８３）なとの刊行物によって例示されているように、一般には当 業界周知である。

この部位−特異的突然変異技法は通常、１本鎖および２本鎖の両形態で存在する ファージベクターを使用することは理解されているとおりである。部位−特異的 突然変異に有用である代表的なベクターにはＭ１３ファー７などのベクターかあ り、これは例えばメノシング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）らの第３回クリーブランドにお ける、巨大分子および組換えＤＮＡについてのシンポジウム［Ｔｈ１ｒｄ　Ｃ１ ｅｖｅｌａｎｄ　Ｓｙｍｐｏｓｉｕｍ　ｏｎ　Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ　 ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ＤＮＡ、ウオルトン（Ａ、Ｗａｌｔ。

ｎ）編、エルセピア（Ｅｌｓｅｖｉｅｒ）、　アムステルダム（１９８１）］に 開示されている。これらのファージは市販されており容易に入手でき、それらの 使用法は一般に当業者には周知である。あるいは、１本鎖ＤＮＡを得るために、 １本鎖ファージの複製起点を含有するプラスミドベクター［ベイラ（Ｖｅｉｒａ ）らのＭｅｔｈ、Ｅｎｚｙｍｏｌ、　　１５３：３（１９８７）］を使用するこ ともできる。

一般に、本発明にしたかった部位−特異的突然変異は、適切なブラスミノーゲン アクチベーターをコードしているＤＮＡ配列をその配列内に含有する１本鎖ベク ターをまず入手することにより実施する。所望の突然変異配列を有するオリゴヌ クレオチドブライマーは、一般には合成的に、例えばフレア［Ｃｒｅａ、　Ｐｒ ｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃ　ｉ、　、　Ｕ、　ＳＡ、　７５：５ ７６５（１９７ｇ）］らの方法によって調製する。次いで、このブライマーを１ 本鎖のｔ−ＰＡ配列含有ベクターとアニーリングし、Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）ポ リメラーゼＩクレノーフラグメントなどのＤＮＡポリメラーゼ酵素反応に供する ことにより、突然変異を含有する鎖（ストランド）の合成を行う。このようにし て、一方の鎖が元の非突然変異配列をコードしており、他方の鎖が所望の突然変 異を有しているヘテロ二重ラセン（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ）を形成させる。

次いで、このヘテロ二重ラセンベクターを使用し、ＪＭＩＯＩ細胞などの適当な 細胞を形質転換することにより、突然変異配列の並びを有する組換えベクターを 含有したクローンを選択する。

このようなりローンを選択した後、ｔ−Ｐ　Ａの産生に適したベクター、一般に は適当な真核生物宿主の形質転換に使用することのできるタイプの発現ベクター 内に、得られた突然変異ｔ−ＰＡ領域を移動させ、配置させる。本発明において は、長期に安定なｔ−ＰＡ産生体を調製するための好ましい細胞は、ＣＨＯ細胞 または２９３細胞［グラハム（Ｇｒａｈａｍ）らのＪ、　Ｇｅｎ、　Ｖｉｒｏｌ 、　、　３６：５９（１９７７）に記載されているヒト腎細胞］である。しかし 、本発明はＣＨＯ生産に限定されるものではなく、特に、試験目的として該酵素 を一時的にだけ生産させたい場合などは、多くの他のタイプの細胞を使用するこ とができることが分かっている。例えば、２９３細胞を使用する一時的系を以下 に記載しているが、これは分析用のｔ−ＰＡ変異体を生産するための簡便な系を 提供するものである。

４、開裂／連結法 ブラスミノーゲンアクチベーターをコードしているＤＮＡ配列に突然変異を作成 して新たなグリコジル化部位を導入する別の方法は、プラスミノーゲンアクチベ ーターをコードしているＤＮＡを制限酵素により適当な場所で開裂し、適切に開 裂されたＤＮＡを回収し、グリコジル化のために望ましいアミノ酸配列をコード しているオリゴヌクレオチドを合成し、そして平滑末端を有するポリリンカーな どの領域をフランキングしくあるいは、ポリリンカーを使用する代わりに、該ア クチベーターーコード化ＤＮＡの開裂にも使用される制限酵素を使用して合成オ リゴヌクレオチドを消化し、それにより粘着末端を作成する）、最後に得られた 合成りＮＡをプラスミノーゲン−コード化構造遺伝子の残りの部分内に連結する ことを包含している。

５、宿主細胞培養およびベクター チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）における発現は結局はｔ−ｐＡ生産のた めに好ましいが、本明細書に記載しているベクターおよび方法は、タンパク質の グリコジル化を行う真核生物という広範な範囲にわたる宿主細胞に好適に使用さ れる。

一般に、ＤＮＡ配列の最初のクローニングおよび本発明に有用なベクターの構築 には原核生物が好ましいのは当然である。例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ（大腸菌）Ｋ１ ２株２９４　（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．４４６）は特に有用である。他の使用す ることができる微生物株には、Ｅ、ｃｏｌｉ　ＢおよびＥ、　ｃｏｌｉ　Ｘ　１ ７７６　（ＡＴＣＣＮｏ、　３１．５３７）などのＥ、ｃｏｌｉ株がある。当然 ながら、これらの例示した株は限定的なものではなく、単なる説明のためのもの である。

発現のためには、酵母および哺乳動物細胞培養物などの真核生物宿主ヲ使用する 。サツカロマイセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏａ＋ｙｃｅｓｃｅｒｅｖ ｉｓｉａｅ）、または普通のパン酵母が真核微生物の中でも最も普通に使用され ているが、他の多くの株も普通に利用することができる。サツカロマイセスにお いて発現させるためには通常、例えばプラスミドＹＲｐ７が使用される［スチン クコム（Ｓｔ　ｉｎｃｈｃｏｍｂ）らのｌ１ａｔｕは、トリプトファン環境下で の増殖能を欠いている酵母の突然変異体法に選択マーカーを付与するｔｒｐ　ｌ 遺伝子を既に含有している［例えば、ＡＴＣＣＮｏ、　４４．０７６またはＰＥ Ｐ４−１（ジョーンズ（Ｊｏｎｅｓ）のＧｅｎｅｔｉｃｓ。

欠損の存在であるので、トリプトファン不存在下で増殖させれば、形質転換を検 出するために有効な環境が提供される。

酵母ベクターにおける適当なプロモーター配列には、３−ホスホグリセレートキ ナーゼにかかるプロモーター［ヒノツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａｎ）らのＪ、　Ｂ ｉｏｌ、　ＣｈｅＩｌｌ、　２５５：２０７３（１９８０）］、またはエノラー ゼ、グリセルアルデヒド−３−ホスフェート脱水素酵素、ヘキソキナーゼ、ピル ビン酸デカルボキンラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グルコース−６−ホスフ ェートイソメラーゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、 トリオセホスフェートイソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、およびグ ルコキナーゼなどの他の解糖系ある。適当な発現プラスミドを構築するに当たっ ては、これらの遺伝子に付随する終止配列も、発現させようとする配列の３′側 で発現ベクターに連結させ、ｍＲＮＡのポリアデニル化および終止を行わせる。

増殖条件によって転写が制御されるという付加的な利点を有している他のプロモ ーターには、アルコール脱水素酵素２、イソチトクロームＣ１酸ホスフアターゼ 、窒素代謝に関与する分解酵素、および上記のグリセルアルデヒド−３−ホスフ ェート脱水素酵素、およびマルトースとガラクトースの利用に関与する酵素、に かかるプロモーター領域がある。酵母適合性のプロモーター、複製起点および終 止配列を含有するプラスミドベクターが好適である。

真核微生物に加えて、多細胞生物由来の細胞培養物も宿主として使用することが できる。基本的には、を推動物または無を推動物のいずれであっても、このよう な細胞培養物として使用してもよい。

しかし、を推動物細胞への関心が高まっており、培養物（組織培養物）中におけ るを推動物細胞の増殖は最近では常法になって来ている［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ ｔｕｒｅ、アカデミツク・プレス、クルスら（Ｋｒｕｓｅ　ａｎｄＰａｔｔｅｒ ｓｏｎ）ｍ集（１９７３）］。このような有用な宿主セルラインとしては例えば 、ＶＥＲＯおよびＨｅＬａ細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルラ イン、オヨびＷ２Ｂ５、ＢＨＫ、ＣＯ３−７，２９３およびＭＤＣＫセルライン が挙げられる。このような細胞のための発現ベクターは通常、（要すれば）複製 起点、発現すべき遺伝子の前に位置するプロモーターを、必須のワホンーム結合 部位、ＲＮＡスプライス部位、ポリアデニル化部位、および転写ターミネータ− 配列と共に含有している。

哺乳動物細胞で使用する場合、ウィルス材料によって発現ベクター上に制御機能 を付与することが多い。例えば、普通使用されるプロモーターは、ポリオーマ、 アデノウィルス２、および最も頻繁にはサルウィルス４０（ＳＶ４０）から誘導 する。５Ｖ４Ｑウイルスにおける初期および後期プロモーターは、両者共に５Ｖ ４Ｑウイルスの複製起点をも含有するフラグメントとして該ウィルスから容易に 入手されるので、特に有用である［フィールズ（Ｆｉｅｒｓ）らのＮａｔｕｒｅ 、　２７３：１１３（１９７８）］。また、このウィルスの複製起点内に位置す るＨｉｎｄ■部位からＢｇ１１部位に伸長する約２５０ｂｐ配列を含有している 限りは、それよりも小さく、または大きな５Ｖ４Ｑフラグメントを使用すること もできる。さらに、所望の遺伝子配列に正常には伴われているプロモーターまた は制御配列も、そのような制御配列が宿主細胞系に受は入れられる限りは利用す るごとができ、それは望ましいことが多い。

復製起点を付与するには、ベクターの構築に当たり、ＳＶ４０または他のウィル ス（例えば、ポリオーマ、アデノ、ＶＳＶ、ＢＰＶ）起源から誘導され得るよう な外来性の起点を含有させるか、または宿主細胞の染色体における複製メカニズ ムにより付与すればよい。

後者の場合、ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれれば十分である場合か多 い。

変異型ｔ−ＰＡおよびＤＨＦＲタンパク質の両方をコードしているＤＮＡ配列を 含有する本発明のベクターによってトランスフェクトするための、好ましい宿主 細胞を選択するに当たっては、使用するＤＨＦＲタンパク質のタイプに応じて宿 主を選択するのが適当である。野生型ＤＨＦＲタンパク質を使用する場合、ＤＨ ＦＲに欠損がある宿主細胞を選択することが好ましく、それによりヒボキサンチ ン、グリシンおよびチミジンを欠く選択培地中でのトランスフェクションを成功 させるようなマーカーとして、ＤＨＦＲをコードしている配列が使用できるよう にする。この場合の適当な宿主細胞は、ウルローブおよびチャシン（Ｕｒｌａｕ ｂ　ａｎｄ　Ｃｈａｓｉｎ）のＰｒｏｃ、　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ。

される、ＤＨＦＲ活性を欠くチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）セルライン である。

他方、メトトレキサート（Ｍ　Ｔ　Ｘ　）に対する低い結合親和性を有するＤＨ ＦＲタンパク質を制御配列として使用する場合、必ずしもＤＨＦＲ欠損細胞を使 用する必要はない。突然変異ＤＨＦＲはメトトレキサートに対して耐性であるの で、宿主細胞目身がメトトレキサートに感受性である限り、ＭＴＸ−含有培地を 選択手段として使用することができる。ＭＴＸを吸収することのできる殆どの真 核生物細胞がメトトレキサートに感受性であるようである。このような有用なセ ルラインノ例としてはＣＨＯライン、ＣＨＯ−Ｋ　１　（ＡＴＣＣＮｏ。

ＣＣＬ６１）が挙げられる。

細胞培養物から満足のいく量のヒトｔ−Ｐ　Ａが生産される。しかし、ある第２ のコード化配列を使用して純化すれば、さらに生産レベルを向上させることがで きる。この第２のコード化配列は、メトトレキサートなどの外部的に制御された パラメーターによって影響を受けるジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）を含有し ており、したがってメトトレキサート（Ｍ　Ｔ　Ｘ　）濃度をコントロールする ことによって発現を制御することができる。

例えば、酵母宿主は、発現されるタンパク質に結合する糖の数と糖のタイプが哺 乳動物宿主ど異なってグリコジル化されるので、グリコジル化にとって最も良好 な宿主の選別は、所望のグリコジル化の型に左右される。

６、使用し得る代表的なりローコングおよび発現の方法強靭な細胞膜バリアーの 無い細胞を宿主細胞として使用する場合は、グラハム（Ｇｒａｈａｉ）およびフ ォノ・デル（Ｖａｎ　ｄｅｒ）ｔｉのＶｉｒｏｌｏｇｙ５２、５４６（１９７ｇ ）に記載されているリン酸カルシウム沈降法によってトランスフェクションを行 う。しかし、核注入（核インジェクション）またはプロトプラスト融合法などの ＤＮＡを細胞に導入するための他の方法も使用することができる。

原核生物細胞、または実質的な細胞壁構築物を含有する細胞を使用する場合、ト ランスフェクションの好ましい方法は、ニーエン（Ｃｏｈｅｎ）らのＰｒｏｃ、 　Ｎａｔ　１．　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ、　６９．２１１ ０（１９７２）に記載されているような、カルンウムを使用するカルンウム処置 である。

所望のコード化配列および制御配列を含有する適当なベクターの構築には、標準 的な連結法を使用する。単離したプラスミドまたはＤＮＡフラグメントを開裂し 、仕立て、必要なプラスミドを得るのに望ましい形態に再連結する。

開裂は、適当な緩衝液中において制限酵素（または酵素群）で処理して行う。一 般には、緩衝溶液約２０μρ中、酵素約１単位と共にプラスミドまたはＤＮＡフ ラグメント約１μｇを使用する（個々の制限酵素に対して適当な緩衝液および基 質の量は、その製造会社によって特定されている）。３７°Ｃで約１時間インキ ュベートする。

インキュベートした後、フェノールおよびクロロホルム抽出によってタンパク質 を除去し、次いでエタノール沈殿によって、その水性画分から核酸を回収する。

平滑末端が必要な場合は、１５６Ｃにおいてポリメラーゼ■（クレノー）ＩＯ単 位で１５分間処理し、フェノール−クロロホルム抽出し、次いでエタノール沈殿 すればよい。

開裂させたフラグメントのサイズ分離は、６％ポリアクリルアミドゲルを使用し て行う［ゴーデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ 。

８、４０５７（１９８０）］。

約等モル量の所望の成分を連結するためには、正しく適合するように仕立てた適 当な末端をＤＮＡ０．５μｇ当たりＴ４ＤＮＡリガーセ約１０単位で処理する（ 開裂させたベクターを成分として使用する場合は、細菌アルカリホスファターゼ で前処理して開裂ベクターの再連結を防止するのが有用であるかもしれない）。

上述のように、ｔ−ＰＡ変異体は特異的突然変異法によって生産するのが好まし い。本発明を実施する上で有用である突然変異体は、横切ろうとする（トラバー スしようとする）突然変異部位の両側に安定な二重ラセンを形成するに充分な大 きなおよび配列複雑性を有する配列となる、所望の突然変異のＤＮＡ配列をコー ドしている特定のオリゴヌクレオチド配列、および十分な数の隣接ヌクレオチド を使用することによって最も容易に作成することができる。。

構築されたプラスミドが正しい配列であることを確認するための分析には通常、 連結混合物（ライゲーンヨン混合物）により、Ｅ、ｃｏｌｉＫ１２株２９４　（ ＡＴＣＣ３１，４４６）または他の適当なＥ　、　ｃｏｌｉ株を形質転換し、そ の場に適当であるアンピシリンまたはテトラサイクリン耐性によって、成功して いる形質転換体を選択する。得られた形質転換体からプラスミドを調製し、メノ シング（Ｍｅｓｓｉｎｇ）らのＮｕｃｌｅｉｃび／またはＤＮＡ配列決定法によ って分析する。

ＤＮＡを哺乳動物細胞宿主に導入し、安定なトランスフェクト体のための培地中 で選択した後、宿主細胞培養物を、ＤＨＦＲ活性の競合的インヒビターであるメ トトレキサート約２０．　ＯＯＯ−５００゜０００ｎＭ濃度の存在下で増殖させ 、それによりＤＨＦＲタンパク質をコードしている配列の増幅を行う。当然なが ら、メトトレキサートの有効濃度の範囲は、ＤＨＦＲ遺伝子の本質、タンパク質 、宿主の特性に非常に左右される。明らかに一般に規定される上限および下限は 確認することができない。他の葉酸同族体またはＤＨＦＲを阻害する他の化合物 も適当な濃度で使用することができる。しかし、ＭＴＸが簡便であり、容易に入 手でき、かつ有効である。

以下に記載の実施例を平易にするため、頻繁に出てくるある種の方法は速記的熟 語で表す。

「プラスミド」は、小文字のｐの後ろにアルファベットの名称を付して表す。本 発明における出発プラスミドは市販されて、制限無く公に入手可能となっており 、また文献開示の方法によってこのような入手可能なプラスミドから構築するこ とができる。さらに、他の同等なプラスミドも当業界周知であり、当業者には明 白である。

ＤＮＡの［消化」とは、ＤＮＡ内のある特定の場所でのみ働く酵素でそのＤＮＡ を触媒的に開裂することを意味する。このような酵素は制限酵素と呼ばれ、それ が特異的な各部位は制限部位と呼ばれている。本明細書で使用している種々の制 限酵素は市販されており、酵素の供給元で確立されているそれぞれの反応条件、 補因子および他の要件を使用した。制限酵素は通常、大文字の後ろに各制限酵素 が普通得られる微生物を表す他の文字を付し、次に個々の酵素を示す番号を付け て命名される。一般に、プラスミドまたはＤ　Ｎ　Ａフラグメント約Ｉμｇを緩 衝溶液約２０μρ中、酵素約２単位と共に使用する。特定の制限酵素にとって適 当な緩衝液および基質の量は製造会社によって特定されている。３７°Ｃでは約 １時間のインキュベート時間が普通使用されるが、製造元の取り扱い説明書によ って変動させることができる。インキュベートした後、フェノールおよびクロロ ホルム抽出によってタンパク質を除去し、次いでエタノール沈殿によって、消化 された核酸を水性画分から回収する。制限酵素による消化は、ＤＮＡフラグメン トの２つの制限開裂末端が、もう１つのＤＮＡフラグメントか制限部位に挿入す るのを妨げ得る「環状化」または閉じたループを形成することから護るために、 ５′末端のリン酸を細菌アルカリホスファターゼによる加水分解と共に行うこと がたまにある。しかし、特に明記しない限りは、プラスミドの消化後には５′末 端の脱リン酸化は行なっていない。脱リン酸化のための操作法および試薬は既知 である［マニアチス（Ｔ、　Ｍａｎｉａｔｉｓ）らのＭｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌ ｏｎｉｎｇ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　（コールド°スプ リング・バーバー・ラホラトリー、ニューヨーク、　１９８２）、　１３３−１ ３４頁］。

特定のＤ　Ｎ　Ａフラグメントを制限消化物から「回収」または「単離」すると は、ポリアクリルアミドまたはアガロースゲルを使用して電気泳動法により消化 物を分離し、目的とするフラグメントを既知の分子量のマーカーＤＮＡフラグメ ントの移動度と比較してその同定を行い、所望のフラグメントを含有するゲル切 片を取り出し、そしてＤＮＡからゲルを分離することを意味する。この操作法は 一般に知られている。例えば、ローン（Ｒ，Ｌａｗｎ）らのＮｕｃｌｅｉｃ　Ａ ｃ１ｄｓ　Ｒｅ「サザーン分析」とは、既知の標識化オリゴヌクレオチドまたは ＤＮＡフラグメントとハイブリクイズすることにより、消化物またはＤＮＡ含有 組成物中にあるＤＮＡ配列の存在を確かめる方法である。本明細書では、特に明 記しない限り、ササーン分析とは、サザーン（Ｅ、　５ｏｕｔｈｅｒｎ）のＪ、 　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　９８：５０３−５１７（１９７５）に記載のように、 １％アガロースにより消化物を分離し、変性させ、ニトロセルロースに移動させ 、モしてＴ、マニアチスらのＣｅ１ｌ　１５：６８７−７０１（１９７ｇ）に記 載されているようにハイブリダイズすることを意味する。

「形質転換」とは、ＤＮＡを染色体外要素または染色体成分として複製できるよ うにそのＤ　Ｎ　Ａを生物に導入することを意味する。

特に明記していなければ、本明細書に記載のＥ、ｃｏｌｉの形質転換方法は、マ ンデル（Ｍａｎｄｅｌ）らのＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　５３：１５４（１９ ７０）のＣａＣＱ、法である。

「連結」とは、２つの２本鎖核酸フラグメント間にホスホジエステル結合を生成 させる工程を意味する［Ｔ、マニアチスらの前掲、１４６頁コ。特に明記しない 限り、連結しようとするＤＮＡフラグメントの約等モル量（０，５μｇ）に対し てＴ４　　ＤＮＡリガーゼ（リガーゼ）１０単位を使用し、既知の緩衝液および 条件によって、連結を行うことができる。

Ｄ　Ｎ　Ａを形質転換体から「調製する」とは、ＤＮＡを微生物培養物から単離 することを意味する。特に明記しない限り、マニアチスらの前掲９０頁のアルカ リ／ＳＤＳ法を使用することができる。

「オリゴヌクレオチド」は、既知の方法によって化学的に合成され、次いでポリ アクリルアミドゲルで精製された、短い長さの１本鎖または２本鎖ポリデオキシ ヌクレオチドである。

Ｃ３医薬組成物 本発明のブラスミノーゲンアクチベーター産物を医薬的に許容され得る担体ビヒ クルとの混合物中に混合することにより、本発明の化合物は、医薬的に有用な組 成物を製造するための既知の方法によって製剤化することができる。適当なビヒ クルおよび他のヒトタンパク質、例えばヒト血清アルブミンを含んだそれらの製 剤は、例えばオスロー（Ｏｓ　ｌｏ）ら編のＲｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ　Ｐｈａｒ ｍａｃｅｕｔｉｃａｌ　５ｃｉｅｎｃｅｓ　１６版、ｒｙｓｏＥマソク・バブツ ・ノシングＣｏ、　ＪにＳ２載されている。このような組成物は、宿主に効果的 に投与するのに適した医薬的に許容され得る組成物に調製されるように適量のビ ヒクルと共に、本発明の変異体を有効量で、例えば約０．５から約５ｘｇ／ｙＱ で含有している。本発明のブラスミノーゲンアクチベーター変異体は、心臓血管 疾患または症状に罹患した対象に非経口的に、またはその有効型か血流に供給さ れるような他の方法で投与することができる。

本発明を実施する上で使用される変異型プラスミ／−ゲンアクチベーター産物を 臨床投与するのに特に適している組成物には、例えば滅菌水溶液剤、または凍結 乾燥タンパク質などの滅菌水相性の粉末剤などがある。この製剤中にはさらに、 医薬的に許容され得る塩を適量、一般には製剤の等優性を変化させるに十分な量 で含有させるのか概して望ましい。アルキニン塩基、およびリン酸などのｐＨ調 節物質も、適当なｐＨ１一般には５．５−７．５を維持するに十分な量で通常含 有させる。さらに、水性製剤の貯蔵寿命または安定性を改善するため、グリセロ ールなとの物質もさらに含有させるのが望ましい場合がある。この場合、変異型 ｔ−ＰＡ製剤は、非経口投与、特に静脈内投与するに好適となるように調製する 。

本発明の医薬組成物の投与ｍおよび望ましい薬物濃度は、目的とする個々の用途 に応じて変動し得る。例えば、深静脈血栓または末梢血管疾患の処置に当たって は、約０．０５から約０．３ｘｇ／ｋｇオーダーの「ポーラス」投与が通常好ま しく、その後は、血中レベルをほぼ一定に、好ましくは約３μｇ／ｉσのオーダ ーが維持されるよう約０．１から約０．２ｘｇ／ｋｇの投与を行うのが好ましい 。

しかし、一般に潅流が行えない場面である緊急医療に関連して使用するためには 、および処置する疾患が一般に危険性を孕む場合（塞栓症、心筋梗塞）、若干多 めの初期投与量、例えば約０．３ｘｇ／ｋｇオーダーの静脈内ホーラス投与が通 常好ましい。

例えば、本発明のブラスミノーゲンアクチベーター変異体は、心臓血管の疾患ま たは症状に罹患した患者に非経口的に投与すればよい。投与量および投与速度は 、他の心臓血管薬、血栓溶解薬が臨床試験で通常使用されているものと同様であ り得、例えば心筋梗塞、肺塞栓症などに罹患したヒト患者では、約１−２ｍｇ／ ｋｇ体重で、１゜５−１２時間かけて静脈内または動脈内投与を行えばよい。

適当な投与剤形の１例としては、ｔ−ＰＡ　５０ｘｇ、アルギニン、リン酸、お よびポリソルベート８０を含有するバイアルを滅菌水５０ｚＱにより注射用に再 構成し、それを適量の０．９％塩化ナトリウム注射液と混合することが挙げられ る。

半減期が延長された本発明のブラスミノーゲンアクチベーター変異体は、急速静 脈内注射用剤、特に例えばポーラスとして適当であり得る。これは、複雑な投与 操作を行う必要性を減少させるであろうし、例えば人員が診療補助者である救急 車内におけるように、限定された医療器具により対処する上で、ブラスミノーゲ ンアクチベーターを使用する機会を増大させ得るものである。延長された半減期 を有する本発明のブラスミノーゲンアクチベーター変異体によれば、さらに少な い、より安全な初期投与量が可能となり、４５分またはそれ以上、血栓溶解に活 性である有効な血定レベルを維持させることができよう。そして、より長い半減 期の本発明の変異体は、成功した急性血栓溶解に続く閉塞の再発を回避するのに 必須であり得る低容量の長期療法、または末梢の血管が閉塞した場合に必要であ り得る長期血栓溶解、にとっても有用であろう。

以下に、本発明を実施する上で現在知られている最も最良の方法を説明するため に実施例を挙げるが、これは本発明の限定を意図するものではない。

１、プラスミドｐ７−ＩＨの構築 ａ）プラスミドｐｃ１ｓｔ−ＰＡ プラスミドｐｃ１ｓｔ−ＰＡを例えば１９８６年１０月２９日公開のＥＰＯ公開 １９９．４７５号（前掲）に記載のように調製した。要約すれば、サイトメガロ ウィルスのエンハンサ−およびプロモーター、サイトメガロウィルスのスプライ ス・ドナ一部位およびイントロン、１ｇ可変領域スプライス・アクセプタ一部位 、ｔ−ＰＡをコードしているｃＤＮＡ［ベニ力（Ｐｅｎｎｉｃａ）らのＮａｔｕ ｒｅ　３０１：２１４（１９８３）］ならびに肝炎表面抗原のポリアデニル化お よび転写終止部位を含有するｐｃ、Ｉ　Ｈｔ−ＰＡベクターをまず始めに構築し た； サイトメガロウィルスのエンハンサ−［ポジヤード（Ｂｏｓｈａｒｔ）らののス プライス・ドナ一部位およびイントロンの部分［ステルンベルグ（Ｓｔｅｒｎｂ ｅｒｇ）らのＪ、ｏｒ　Ｖｉｒｏｌ、４９：１９０（１！１８４）コ、１ｇ可変 領域イントロンおよびスプライス・アクセプタ一部位、第■因子をコードしてい るｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含有するｐＦ８ＣＩｓベクター を構築した。この構築法の３つの手順を以下に詳細に説明する。

１、この最終ベクターのアンピシリン耐性マーカーおよび複製起点を、プラスミ ドｐＭＬ［ルス牛−（Ｌｕｓｋｙ）らのＮａｔｕｒｅ　２９３ニア９（１９８１ ）］の変異体である、出発プラスミドｐＵｃ１３ｐＭＬから誘導した。ｐＵＣ１ ３ｐＭＬは、ｐＵｃ１３［ベイラ（Ｖｅｉｒａ）らのＧｅｎｅ　１９：２５９（ １９８２）］のポリリンカーをｐＭＬのＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｎ部位に移 すことによって構築した。別の出発プラスミドであるｌ）ＵＣ８ＣＭＶはＣＭＶ エンハンサ−、プロモーターおよびスプライス・ドナー配列の供給源であった。

ｐＵｃ８ｃＭＶは、ＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびスプライス・ドナ ー配列にがかる１がら７３２のヌクレオチドをｐＵｃ３の平滑化Ｐｓｔｌおよび Ｓ　ｐｈ　１部位に挿入することによって構築した（ベイラら、前掲）。粘着性 のＢａｍＨＩ末端に、合成りａｍＨｒ−ＨｉｎｄｒｆＩリンカ−Ｃユニー・イン グランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）から市販 されている］を連結し、Ｈｉｎｄ■部位を作成した。この連結の後、Ｈ１ｎｄＩ Ｉ［−Ｈ１ｎｃＩＩ消化を行った。

この消化により、ＣＭＶエンハンサ−、プロモーターおよびスプライス・ドナ一 部位を含有している約８００ｂｐのフラグメントを得た。ゲル単離した後、この ８００ｂｐフラグメントをｐＵｃ１３ｐＭＬの２９００ｂｐ片に連結した。Ｉ） Ｆ８］Ｓの構築に必要とされるこのフラグメントは、上記の中間プラスミドを５ ａｉｌおよびＨｉｎｄ■で消化することによって得られた。この３１２３ｂｐ片 は、アンピシリンについての耐性マーカー、ｐＵＣ１３ｐＭＬ由来の複製起点な らびにエンハンサ−、プロモーターおよびスプライス・ドナ一部位などの、ＣＭ Ｖに関する制御配列を含有していた。

２．１ｇ可変領域イントロンおよびスプライス・アクセプター配列は、合成オリ ゴマーを使用して構築した。ＩｇＧイントロンおよびスプライス・アクセプタ一 部位にかかる以下の配列を有する９９−ｍｅｒおよび３０−ｍｅｒを、化学的に 合成した［ボスウェル（Ｂｏｔｈｗｅｌ　ｌ）らのＣｅ１ｌ　２４　：　６２５ （１９８１）］　：１　５’−ＡＧＴＡＧＣＡＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＧＴＧＧＣ ＡＧＧＣＴＴＧＡ、、。

３１　　　ＧＡＴＣＴＧＧＣＣＡＴＡＣＡＣＴＴＧＡＧＴＧＡＣＡＡＴＧＡ、、 。

６０　　　ＣＡＴＣＣＡＣＴＴＴＧＣＣＴＴＴＣＴＣＴＣＣＡＣＡＧＧＴ、　、 　。

８８　　　ＧＴＣＣＡＣＴＣＣＣＡＧ−３’１　３’−ＣＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴ ＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＧＴＣＧＴＣＧＧＡ−５゜Ｄ　Ｎ　ＡポリメラーゼＩ（ク レノーフラグメント）により、合成した片を充填し、２本鎖フラグメントを作成 した［ワーデル（Ｗａｒｔｅｌ　ｌ）らのＧｅｎｅ　９：３０７（１９８０）］ 。次いで、ＰｓｔｌおよびＨｉｎｄｌＩ［の２重消化を行った。この合成リンカ −をｐＵｃ１３（ベイラら、前掲）のＰｓｔｌおよびＨｉｎｄＩ［１部位にクロ ーンした。合成オリゴヌクレオチドを含有するクローン（これをｐＵｃＩｇ、１ ０と命名する）をＰｓｔｌで消化した。Ｐｓｔｌ−Ｃ１ａｌリンカ−を使用して 、Ｃｌａｌ部位をこのフラグメントに付加した。ＨｉｎｄＩＩ［で消化した後、 １ｇイントロンおよび１ｇ可変領域スプライス・アクセプターの部分を含有する １１８ｂｐ片をゲル単離した。

３、本構築手順の第３番目は、肝炎表面抗原の３°末端を５ｖ４０初期領域のポ リアデニル化部位および転写終止部位と置き換えることである。５Ｖ４Ｑ配列を 含有するｐＵｃ、５Ｖ４０ベクターをｐＵＣ８のＢａｍＨ１部位［ペリラら、前 掲に記載されている］に挿入し、次いでｐＵＣ，５Ｖ４ＱをＥｃｏＲＩおよびＨ ｐａｌで消化した。５ｖ４０ポリアデニル化部位のみを含有する１４３ｂｐフラ グメントをこの消化物からゲル単離した。ｐｓＶＥ、８ｃｌＤ［ＥＰｏ公開第１ ６０．４５７号コの消化後、さらに２つのフラグメントをゲル単離した。Ｅｃｏ ＲＩおよびＣｏａｌ消化によって生成される４、８ｋｂフラグメントは、５Ｖ４ ０−ＤＨＦＲ転写単位、ｐＭＬの複製起点およびアンピシリン耐性マーカーを含 有している。Ｃ１ａｌおよびＨｐａＩ消化後に得られる７、５ｋｂフラグメント は、第■因子のｃＤＮＡを含有している。

スリー・パート連結（ｔｈｒｅｅ−ｐａｒｔ　Ｉｉｇａｔｉｏｎ）により、ｐＳ ＶＥ、８ｃ２４Ｄが得られる。この中間プラスミドをＣ１ａｌおよびＳａ冊て消 化することにより、５Ｖ４Ｑボリアテニル化および転写終止部位、次にＳＶ４０ 　ＤＨＦＲ転写単位を有する、第■因子のｃＤＮＡを含有する９６］、１ｂｐフ ラグメントを得た。

ｐＦ８ｃＩｓを得るための最終的スリー・パート連結では、ａ）複製起点、アン ピシリン耐性マーカー、およびＣＭＶエンノ＼ンサー、プロモーターおよびスプ ライス・ドナーを含有する３１２３ｂｐＳａ１１−Ｈ１ｎｄｌＩＩフラグメント 、ｂＬＩｇイントロンおよびスプライス・アクセプターを含有する１　１８ｂｐ 　ＨｉｎｄＩＩ［−Ｃ１ａＩフラグメント、ならびにＣ）第■因子のｃＤＮＡ、 ＳＶ４０ポリアデニル化部位およびＳＶ４０　　ＤＨＦＲ転写単位を含有する９ 　６１１ｂｐ　Ｃ１ａｌ−５ａｌ■フラグメントを使用した。

次に、中間プラスミドｐｃｌａｔ−ＰＡおよびプラスミドｐＦ８ｃＩＳ（上述） からプラスミドｐＣＩＨｔ−ＰＡを完全に構築した：まず始めにｔ−ＰＡ　ｃＤ ＮＡをｐＭＬにクローンし、その遺伝子の５゛末端にＣｌａＩ部位を付与した。

これを行うため、ｐＳ　Ｖ　ｐａ−Ｄ　ＨＦＲ（あるいは、ｐＥＴＰＦＲとも称 する、前掲）由来の３２３８ｂｐＨｉｎｄ１１１フラグメントをｐＭＬのＨｉｎ ｄｌＩ［部位に挿入した［ラスキー（Ｌｕｓｋｙ）ら、前掲］。そのＣｌａＩ部 位に接して並ふ（ｊｕｘｔａｐｏｓｅｄ）ｃＤ　ＮＡの５“末端を有するクロー ンについて、コロニ一群をスクリーニングした。得られた中間プラスミドをｐＣ ＬＡｔ−ＰＡと命名した。

３′ポリアデニル化領域が後続するｔ−ＰＡ　ｃＤＮＡを２８７０ｂｐのＣ１ａ ｌ−Ｋｐｎｌフラグメントとして単離した。このフラグメントをｐＦ８ＣＩＳの ５１４６ｂｐフラグメントと連結した。ＣＩＳベクターのこのＣ１ａｌ−Ｋｐｎ Ｉフラグメントは、ｐＭＬ由来の５′制御領域、ＳＶ４．０−ＤＨＦＲ転写単位 、アンピシリン耐性遺伝子および起点領域を提供した。第４ａ図および第４ｂ図 を参照のこと。

ｔ−ＰＡの発現レベルは、それ自体一般に知られている上述の方法にしたがって 、ＣＨＯおよび２９３細胞をｐｃＩＨｔ−ＰＡでトランスフェクトすることによ って得た。例えば、トランスフェクトされた２９３細胞由来の媒質を検定するこ とにより、ｐｃＴＨｔ−ＰＡは４２０ｎｇ／ｚＱでｔ−ＰＡを産生したことが証 明された。

サイトメガロウィルスのエンハンサ−およびプロモーター、サイトメガロウィル スのスプライス・ドナ一部位およびイントロン、１ｇ可変領域のスプライス・ア クセプタ一部位、ｔ−ＰＡをコードしているｃＤＮＡならびにｐｓＶ４０ポリア デニル化配列を含有するｐＣＩＳｔ−ＰＡベクターを最後に、以下のようにして 構築した：この構築のための出発ベクターはｐｃＩＨｔ−ＰＡおよびｐＦ８ｃＩ Ｓ（上述）であった。この後者のベクターは、ｐ（ｌＨｔ−ＰＡと同じ５°制御 を有しているが、第■因子のｃＤＮＡおよびＳＶ４０ポリアデニル化部位を含有 している。５ａｃｎを使用し、そのｔ−Ｐ　Ａ　ｃＤ　ＮＡの３”を開裂した。

得られた３゛突出をＴ４ポリメラーゼによって平滑末端化した。次いで、ｐｃＩ Ｈｔ−ＰＡをＣ１ａｌで切断した。

この部位は、ＣＭＶイントロン配列と１ｇ可変領域イントロンとに開裂するキメ ライントロンを分割している。このＣＩａＩ処理物から２８７０ｂｐフラグメン トをゲル単離した。５Ｖ４Ｑポリアデニル化部位、ＤＨＦＲ１転写制御、細菌性 複製起点およびａｍｐ’遺伝子、ならびにＣＭＶエンハンサ−およびプロモータ ーおよびスプライス・ドナーをｐＦ１３ｃＩｓから単離した。これらの要素を、 ２５２５ｂｐＳ　ａｉｃ　ｌａ　Ｉフラグメントおよび３１１３ｂｐのＨｐａＩ −３ａｌＩフラグメントとして分離し、フラグメントとした。ＫｐｎＩ（平滑） −Ｃ１ａ■フラグメントと、Ｈｐａｌ−ＳａｔフラグメントおよびＳａｌからＢ ａｍＨｌフラグメントとのスリー・パート連結により、ｐＣＩＳｔ−ＰＡを得、 これを、プラスミドｐＣＩＨｔ−ＰＡについて上述したようにＣＨＯおよび２９ ３の両細胞において発現させて、それぞれｔ−ＰＡを５５および３０００ｎｇ／ ｘρで得た。第５ａ図および第５ｂ図参照のこと。

ｂ）ｐ７−ＩＨの最終的構築 プラスミドｐｃＩｓｔ−ＰＡを５ｐｅＩで消化し、次いでＥ、ｃｏｌｉ　ＤＮＡ ポリメラーゼ■の大きいフラグメント（クレノー）およびデオキシリボヌクレオ シド三リン酸で処理することにより、平滑末端を作成した。得られた線状フラグ メントを、ジングー（Ｚｉｎｄｅｒ）らのＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｒｅｖ、　、 　４９：１０１（１９８５）に記載されているように、Ｔ４　　ＤＮＡリガーゼ を使用して１本鎖ＤＮＡファージ１１由来の十鎖起点を含有する０、　４５ｋｂ 　Ｒｓａｌ／ＡｈａＤＩＩフラグメントに連結した。ｐＣＩＳｔ−ＰＡフラグメ ントのＳ　ｐｅ　１部位に可能性ある両方向性で挿入されるｆ１起点を有する連 結産物を単離した。Ｌ−ＰＡ遺伝子のアンチセンス鎖かへルバーファージの存在 下にピリオン中にパッケージングされているような方向性でこの起点を含有する プラスミドを選択し、ｐ７−ＩＨと命名した。第６図参照。

２、突然変異実験 ａ）鋳型の調製 プラスミドｐ７−ＩＨ′４：ＣａＣｆ２−媒介性形質転換によってＥ　、　ｃｏ ｌ　ｉ株Ｊ　Ｍ　１０１　（ＡＴＣＣＮｏ、　３３．８７６）に導入した。次い で、ベイラらのＭｅｔｈ、　Ｅｎｚｙｍｏｌ、　１５３：３（１９８７）に記載 のように、これらの細胞をヘルパーウィルスＭ１３ＫＯ７でインフェクトしく感 染させ）、１木調ｐ７−ＩＨＤＮＡを調製した。簡単に説明すれば、２ＹＴグロ ス中、形質転換細胞の飽和培養物０．３ＲＱに１０”　　１０”ｐｆｕのＭ１３ ＫＯ７を加え、得られた混合物を３７°Ｃで１５分間インキュベートした。

５０ＡＩｇ＃＋Ｃカルベニンリン（ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ）を含有する新 鮮な２ＹＴブロス１．５ＩＱを加え、その培養物を３７°Ｃで１６時時間中かに 振盪させた。細胞をペレット化した後、ファージ、およびパッケージング化プラ スミドＤＮＡを採取し、アンダーソン（Ａｎｄｅｒｓｏｎ）のＮｕｃｌ、　Ａｃ １ｄｓ、　Ｒｅｓ、　、　９：３０１５（１９８１）に記載のように１本鎖ＤＮ Ａを調製した。

ｂ）部位特異的インビトロ突然変異 突然変異Ｔｙｒ５７−−−＞Ａｓｎ６７を有する突然変異体をプラークハイブリ ダイゼーションではなく、コロニーハイブリダイゼーショＨの突然変異を行った 。ジデオキシヌクレオチド鎖成長停止法を使用し、１本鎖プラスミドＤＮＡを直 接ＤＮＡ配列決定することにより、突然変異を確認した［サンガー（Ｓａｎｇｅ ｒ）らのＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　、　Ｕ、　Ｓ、　Ａ 、　７４：５４６３（１９７７）］。

３、発現および精製 ａ）プラスミドの調製 ５０μｇ　ｌｘＱカルベニ／リンを含有するＬＢブロス５００Ｘ１２中で、形質 転換した細胞を飽和状態になるまで増殖させた。遠心により細胞をペレット化し 、５０ｘ（！ｍＭグルコース、ｌｏｍＭＥＤＴＡ。

２５ｍＭ）リス−ＨＣｌ２（Ｉ）Ｈ８，Ｏ）４０ｘ（ｌ中に再懸濁した。この懸 濁液に１％ドデシル硫酸ナトリウム、０．０７Ｍ水酸化ナトリウム６０舷を加え 、得られた混合物を２５°Ｃで２分間インキュベートし、次いでＯ′Ｃで１０分 間インキュベートした。これに、４Ｍ酢酸、３Ｍ酢酸ナトリウム５２１１Ｑを加 え、得られた混合物を０℃で３０分間インキュベートした。次いで、１１．５０ Ｏｒｐｍで２０分間遠心し、得られた上清を２容量の１００％冷エタ／−ルと混 合し、生成した沈澱物を遠心によって採取した。プラスミドＤＮＡおよびＲＮＡ を含有するペレットを乾燥させ、１００＋ｎＭ）リス（ｐＨ８゜０）、ｌｏｍＭ 　ＥＤＴＡ、　　１μｇ／ｘＱ　ＲＮａｓｅ　Ａに再溶解した。得られた溶液を 遠心により清澄化した後、それを臭化エチジウム中０゜５ｘｇ／ｚ（に調節し、 同重量の塩化セシウムを加えた。次いで、得られたＤＮＡをベックマンＶＴＩ６ ５０−ターにより遠心にかけた（１８°Ｃ１５５，００Ｏｒｐｍ、１６時間）。

側面注射によりＤＮＡバンドを採取し、ｎ−ブタノールで抽出して臭化エチジウ ムを除去し、水で希釈し、エタノールにより沈澱させた。ＤＮＡを１０ｍＭ）リ ス（ｐＨ８，０）、１ｍＭＥＤＴＡ中に再溶解し、終濃度１ｘｇ／ｘ（ｌとした 。

ｂ）トランスフェクションおよび発現 ２９３細胞を全面成長するまで増殖させた。ｔ−ＰＡ突然変異プラスミドＤＮＡ 　１０μｇをＶＡ　　ＲＮＡ遺伝子をコードしているＤＮＡ［チンマノバヤ（Ｔ ｈｉｍｍａｐｐａｙａ）らのＣｅ１ｌ　３１：５４３（１９８２）］　１　！ｌ 　ｇと混合し、ｌｎＭ）リス−ＨＣ１２，０，１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０．２２７Ｍ 　ＣａＣｆｆ、５００　ｔｔ（ｌ中に溶解した。これに５０ｍＭ　ＨＥＰＥＳ（ ｐＨ７゜３５）、２８０ｍＭ　ＮａＣｌ２．１．５ｆｆｉＭ　ＮａＰＯ４５００ ｕＱを加え（旋回（ポルテックス）下に滴加した）、２５℃で１０分間沈澱を生 成させた。次いで、懸濁した沈澱物を細胞（１００ｍＭプレート中）に加え、イ ンキュベーター中に４時間放置した。次いで、培地を吸引除去し、リン酸緩衝化 食塩水中２０％グリセロール２Ｍ（ｌを３０秒間で加えた。得られた細胞を血清 不含の培地５籾で２回洗浄した後、新鮮な培地を加え、細胞を５日間インキュベ ートした。

Ｌ−ＰＡ変異体を発現する安定なＣＨＯセルラインを作成するため、ｔ−ＰＡの コード化配列のバルクを含有するＢｇ劃側ＡｐａＩフラグメ７）（第６図）をｐ ＰＡＤＨＦＲ−６ベ’）９−（ＥＰＯ特許公開第９３．６１９号に記載されてい る）由来の６．０ｋｂ　ＢｇｌＩｌ／Ａｐａｌフラグメントと連結させる。次い で、得られたプラスミドをＣＨＯ細胞に導入し、メトトレキサート含有培地中で 選択することにより、そのコード化配列を増幅させ、それによりｔ−ＰＡ変異体 を過剰に発現させる。

Ｃ）精製 抗−ｔ−ＰＡヤギポリクローナルＡ６抗体（これ自体は常法によって調製される ）をカップリングさせた制御化ガラスピーズのカラム（１及Ｑべ・ノド容量）に ならし培地（ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ｍｅｄｉｕｍ）を通すことによって、得 られたｔ−ＰＡ産物を精製した。培地を入れる前に、カラムをリン酸緩衝化食塩 水で平衡化させ、それを入れた後は、カラムを０１１Ｍ　トリス−ＨＣＱ　ｐＨ ７，５，１ＭＮａｃｃで平衡化させた。０．１Ｍ酢酸、Ｏ６１５Ｍ　ＮａＣＱ− ，０，０２Ｍアルギニン、０．Ｏ１％Ｔｗｅｅｎ８０　（Ｔ）　Ｈ２，Ｏ）でｔ −ＰＡを溶出させ、得られた画分をトリス−塩基で素早く中和した。プールする 前に、画分を０．０１％Ｔ　ｗｅｅｎ８０に調節した。

Ｂ、生物学的および薬物動態的検定 １、ｔ−ＰＡの定量 天然のｔ−ＰＡ配列に標準化したＥＬＩＳＡによって、タンパク質濃度を常法に したがって測定した［ＥＰＯ特許公開第９３，６１９号（前掲）を参照のこと］ 。タンパク質の純度および均質性は、レムリ（Ｌａｅｍｍｌｉ）のＮａｔｕｒｅ 、　２２７：６８０（１９７０）の緩衝系を使用した、ドデシル硫酸ナトリウム の存在下、ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ｐ　Ａ　ａ　Ｅ　−３ＤＳ）によ って分析した。通常は、７−１７％のグラジェントゲルを使用し、モリノセイ（ Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ）のＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　、　１１７：３０７（ １９８１）の銀−染色法によりタンパク質を視覚化した。既述のようにして調製 したＮ６７　ｔ−ＰＡ変異体は、この方法により純粋であり、均質であることか 判明した。

２．３−２２５１検定 ｔ−ＰＡがプラスミノーゲンを活性化する活性化能は、Ｌ−ＰＡおよびプラスミ ノーゲンを前インキュベートし、次いでプラスミン−特Ｘ　的基質であるＨ−Ｄ −バリル−Ｈ−口イシル−Ｈ−リジン−ｐ−ニトロニリド（ｎｉｔｒｏｎｉｌｉ ｄｅ）［Ｓ　−２２５１］を加えることに基づくインビトロ検定により測定する ことができる。この反応の最大速度は、この反応系の刺激物質として機能するフ ィブリン（フィブリ／−ゲン）またはそのフラグメントの存在下に観察される。

プラスミン−特異的基質であるＳ−２２５１を２段階検定法に使用し、試料がプ ラスミノーゲンを活性化する活性化能を測定した。０゜０５Ｍ　トリス−ＨＣＱ 、０．１２Ｍ　ＮａＣＱ、０．０１％Ｔｖｅｅｎ８０．ｐＨ７，４の全量０．１ ２ａ＋１！中、２０ｘｇ／ｘｇフィブリノーゲン溶液０゜０２１Ｑと共にその試 料をインキュベートすることにより、フィブリノーゲンは試料刺激物質として使 用することができよう。

次いで、Ｇｌｕ−プラスミノーゲン溶液（市販されている）、０．０５Ｍ　トリ ス０．１２Ｍ　ＮａＣＱ緩衝液、ｐＨ８中、２．ＯｒｘｇｈＱ溶液０゜０３１ｆ ｆを加えた。３７°Ｃ１１０分経過後、０．０３７Ｍ　　トリス、０．０８６Ｍ 　ＮａＣＱ、０．００７％Ｔｗｅｅｎ８０．ｐＨ７，４中、０．８６ｍＭ　Ｓ− ２２５１（０，３５１１２）を加えた。得られた混合物を５分間インキュベート した；次いで、５０％氷酢酸０．１ｍ（ｌを添加してその反応を停止させた。４ ０５ｎｍの吸光度を測定した。活性は、基質存在下の１９当たりｎｇ単位の吸光 度の変化として表した。

既述の検定法を、フィブリノーゲンを含有していない試料の組みをさらに使用し て既述のように検定を行った。刺激性は、フィブリノーゲンを含有しない試料の 比活性に対するフィブリノーゲンを含有する試料のそれの比である。ｒｔ−ＰＡ およびＮ６７　ｔ−ＰＡの両者に関する得られた結果を、血餅溶解の結果と共に 第７図に示す。Ｎ６７ｔ−ＰＡのインビトロ比活性はフィブリノーゲン不存在下 において比較的有意に落ちたようであるので、フィブリノーゲン刺激％（これは フィブリノーゲン不存在下における活性に対するフィブリノーゲン存在下の活性 の比を反映する）は若干野生型ｒｔ−ＰＡよりも増大される。

３．血餅溶解 野生型およびＮ６７　ｔ−ＰＡのフィブリン溶解能を検定するに当たり、カール セン（Ｃａｒｌｓｅｎ）らのＡｎａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅ＋＋＋、　、　１６４４ ２ｇ（１９８ｇ）の方法にしたがい、飽和濃度のプラスミノーゲンの存在下に行 った。インビトロ血餅溶解検定は、マイクロ遠心分析器を使用する比濁分析によ り、組織ブラスミノーゲンアクチベーターの活性を測定するものである。トロン ビンおよびｔ−ＰＡＡ験試料の混合物をフィブリノーゲンおよびプラスミノーゲ ンの混合物中に遠心することにより、血餅形成を開始させ、その後に血餅溶解を 誘導させる。得られた吸光度と時間とのプロフィルを分析し、検定の終点を決定 した。ｔ−ＰＡＡ異体の活性を、ｒｔ−ＰＡの標準曲線（ＥＰＯ公開第９３．６ １９号、上述）と比較した。この検定の全体にわたって使用する緩衝液は、０゜ ０１％（ｖ／ｖ）　Ｔ　ｗｅｅｎ　８０および０．０１％（ｖ／ｖ）アジ化ナト リウムを含有する０、０６Ｍ　　リン酸ナトリウムｐＨ７，４であった。ヒトト ロンビンは濃度３３単位／ｘ（ｌであった。フィブリノーゲン（２，０ｘｇ／Ｒ ρ凝固し得るタンパク質）を湿水上で冷し、フィブロネクチンを沈殿させ、次い で重力濾過した。Ｇｌｕ−プラスミノーゲンは濃度１肩ｇ　／ｘＱであった。分 析器の容器内温度は３７°Ｃに設定する。充填器には、標準曲線にかかる試料と してｒｔ−ＰＡ（約５００ｎｇ＃１２から１．５μｇ　／ｘＩ２＞　２０μａを 、またはその標準曲線の範囲内で溶解を起こす濃度の変異型ｒｔ−Ｐ　Ａ　２０ μＣを分散させる。第２の試薬としてトロンビン２０μＱ、および第１の試薬と してフィブリノーゲン：プラスミノーゲン５０　：　１　（ｖ／ｖ）混合物２０ ０μＱを使用した。５分間のインキュベート時間、３４０−μｍ−フィルターお よび９ｏ−間隔の判読によって、吸光度／時間プログラムを行った。

第７図に示した得られた結果は、Ｎ６７変異体が、正常の野生型ｔ−ＰＡの血餅 溶解比活性の約５３％であることを示している。

４、フィブリン結合性 フィブリン結合性に関する方法は、リッケン（Ｒｉｊｋｅｎ）らのＪ、　Ｂｉｏ ｌ。

ＣｈｅＩ！、　、　２５７：２９２０（１９ｇ２）に記載されている方法の改変 法である。試験するｔ−Ｐ　Ａ試料を、０．０５Ｍ　　トリス（ｐＨ７，４＞、 Ｏ，１２ＭＮａＣＱ％０．０１％Ｔｗｅｅｎ８０、ｌｘｇ／＋ｆｆヒト血清アル ブミン、および種々の濃度のプラスミノーゲン不含のフィブリン（０，０，０５ ，０，１，０，２５および０．５ｘｇ／＋＋２）を含有する溶液に加える。この 反応混合物の最終容量は１１Ｉ２であった。得られた試料を３７°Ｃで５分間イ ンキュベートした後、トロンピント単位を加えた。次いで、この試料を３７°Ｃ で１時間インキュベートした。生成した血餅を遠心によって除去し、未結合のま まの上清中ｔ−ＰＡの量をＥＬＩＳＡによって測定した。

第８図には、Ｎ６７　ｔ−ＰＡおよびｒｔ−ＰＡの両者について、結合したｔ− ＰＡ変変異体ラフイブリンフィブリノーゲン）濃度の％としてプロットしたデー タを示している。この結果は、Ｎ６７ｔ−ＰＡが使用した検定条件下ではフィブ リンと結合しないことを示している。

５、グリコジル化の確認 トリプシンのペプチド混合物を個々の成分またはピークに分割し、その同定を行 い組成を知るための高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）を利用するトリプ シンのマツピング法によって、アスパラギン６７における過剰のグリコジル化を 測定した。ペプチドに炭水化物が付加すると、そのペプチドの親水性が増し、結 果としてＨＰＬＣプロフィルが変化する（すなわち、より早く溶出される）。単 離されるペプチドを含有する個々のクロマトグラフィーのピークをまとめ、アミ ノ酸分析にかけてペプチドの同定および炭水化物の存在を確認する。

ａ、試料の調製 トリプシン・マツピング法のための試料の調製法は、フレストフィールド（Ｃｒ ｅｓｔｆ　１ｅｌｄ）、スティン（Ｓｔｅｉｎ）およびモーレ（Ｍｏｏｒｅ）の Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｗ、　、　２３８：６２２（１９６３）の改変法であ った。分析すべきタンパク質試料（各１．Ｏｉｇ）を、２ｍＭＥＤＴＡを含有す る８Ｍ尿素、０．５Ｍ　トリス（ｐＨ８，６）中に一晩透析した。この試料を２ ５℃において２時間１０ｍＭ　ジチオトレイトール［シグマ・ケミカルＣｏ、］ で還元し、次いで２５ａ＋Ｍ　ヨード酢酸（シグマ・ケミカルＣ００）を用いて ２５°Ｃ１暗所でＳ−カルボキシメチル化した。３０分後、このアル牛ル化反応 を２０ｍＭ　ジチオトレイトールを添加してクエンチ（停止）させ、次いで３５ ００分子量排除能を有する透析チューブを使用し、カルボキシメチル化（ＲＣＭ ）試料を１００＋ｎＭ重炭酸アンモニウム（ｐＨ８，３）中で一晩透析シた。

ｂ、　　Ｎ−グリコシダーゼＦによる処置還元してカルボキシメチル化したｒｔ −ＰＡをトリプシン消化の前にＮ−グリコンダーゼＦ（ジエンチームＣｏｒｐ、 　（Ｇｅｎｚｙｍｅ　Ｃｏｒｐ、　））で脱グリコ／ル化した。還元してカルボ キシメチル化したｒｔ−ＰＡ（０゜４πｇ）を、］ＯｍＭＥＤＴＡおよび０．０ ２％アジ化ナトリウムヲ含有する２５０ｍＭ　　リン酸ナトリウム（ｐＨ８，６ ）０．０８１１２中で再構成した。Ｎ−グリフ／ダーゼＦ（５０％グリセロール ０．０１８＋（！中、５．０製造者単位（Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｅｅｒ’ｓ　Ｕ ｎｉｔｓ））をその試料に加え、次いでそれを３７℃で一晩インキユベートした 。得られた試料を水で０．４１（ｌにまで希釈し、トリプシン消化する前に１０ ０ｍＭ重炭酸アンモニウムに対して透析した。

ＲＣＭ　ｒｔ−Ｐ　Ａを環境ｉ＆ＷのＯ，１Ｍ重炭酸アンモニウム中で消化する に当たり、［Ｌ−（トシルアミド−２−フェニル）エチルクロロメチルケトン］ （ＴＰＣＫ）処置トリプシン［クーパー・バイオメディカル（Ｃｏｏｐｅｒ　Ｂ ｉｏｍｅｄｉｃａｌ）］を酵素・基質の比率１　：　１００（ｗ／ｗ）で加え、 次いで８時間後、Ｉ　：　１００を別に添加した。この消化は、凍結（−７０° Ｃ）によって２４時間後に停止させたｄ、クロマトグラフィー Ｑ、４ｘ１５ｃｘツバ・パック（Ｎｏｖａ　ＰＡＫ）１５ミクロン、Ｃ−１８逆 相カラム（ウォーターズ（Ｗａｔｅｒｓ、　Ｉｎｃ、　））を使用したヒユーレ ット−パラカード（Ｈｅｗｌｅｔｔ−Ｐａｃｋａｒｄ）１０９０Ｍ液体クロマト グラフ装置により、ＨＰＬＣ分離を行った。２１４および２８０ナノメーターに おける二重波長検出法により溶出プロフィルをモニターした。トリフルオロ酢酸 （Ｔ　Ｆ　Ａ）溶媒系を使用したが、それは流速０．５％／分、５０分のアセト ニトリル［バーディツク・アンド・ジャクシンＣＢｕｒｄｉｃｋ＆　Ｊａｃｋｓ ｏｎ）］中、０．０８％ＴＦＡの一次グラジエントを用いた０゜Ｉ％ＴＦＡ［ピ ース・ケミカル（Ｐｉｅｒｃ”：　Ｃｈｅｍｉｃａ１月、次いで流速１゜０ｊ！ ρ／分、３０分の１．０％／分の一次グラジエントを用いたちのＨＰＬＣによっ て採取したピークペプチドを酸加水分解した後、アミノ酸分析して特性化した。

加水分解は、ペプチドを、１１０℃の減圧下で２０時間、定沸点塩酸中でインキ ュベートすることによって行った。酸加水分解物の分析は、ベックマン（Ｂｅｃ ｋｍａｎ）　６３００アミノ酸分析器を使用して行った。

ｆ、結果 第９図には、野生型ＲＣＭ　ｒｔ−ＰＡ、Ｎ６７突然変異ＲＣＭｔ−ＰＡおよび Ｎ−グリカナーゼー処置Ｎ６７突然変異ＲＣＭ　ｒｔ−Ｐ　Ａについてのトリプ シン消化のＨＰＬＣプロフィルを、それぞれ９Ａ。

９Ｂおよび９Ｃとして示している。すべての試料は、２９３ヒト腎細胞における 一時的発現によって調製した。第９Ａ−９Ｃ図に示している溶出プロフィルは、 トリプシンペプチド（５６−８２）が野生型ｔ−ＰＡについて溶出されることが 認められているグラジェントのセグメントから採取した。このペプチド（５６− ８２）は、第９Ａ図において矢印で示しているように、５５分時点に部分的に分 割された二重線として溶出された。

Ｎ６７ｔ−ＰＡ突然変異体を同様に調査しく第９Ｂ図）、それが５５分時点に溶 出された野生型トリプシンペプチド（５６−８２）を喪失していることが判明し た。先行するピーク（５０，５分）における肩として５１分時点における広いピ ークが対応して増加しているようである。５１分時点におけるこの新しいピーク を採取し、酸加水分解してアミノ酸分析により定量した。この分析により、グリ コジル化ペプチド（５６−８２）の初期溶出と矛盾しない、アミノ−糖含宵ペプ チドの存在が示唆された。

（５６−８２））リブシンペプチドのグソコシル化を確認するため、ＲＣＭ　Ｎ ６７　ｔ−ＰＡ突然変異体をＮ−グリコシダーゼで処置し、Ｎ一連結炭水化物部 分を除去した。このグリカナーゼ処置突然変異タンパク質のトリプシン消化物を 逆相ＨＰＬＣによって分析した（第９Ｃ図）。５１分時点における初期に溶出す る肩はＮ−グリカナーゼ処置により消失し、そのトリプシン地図には新たに、５ ４．５分時点におけるピークが現れた。５５分における野生型トリプシンペプチ ド（５６−８２）と比較して５４．５分におけるこの若干早いＮ６７（５６−８ ２）の溶出は、アスパラギン酸とチロシンとを置換したことに対応した結果であ った［グオー（Ｇｕｏ）らのＪ、　Ｃｈｒｏｍ、　、　３５９：４９９−５１７ （１９８６）］。（Ｎ６７突然変異体はアスパラギンに連結した炭水化物を含有 しているが、Ｎ−グリカナーゼ処置後にはそのアスパラギンがアスパラギン酸残 基に変換されている）。アミノ酸分析により、第９Ｃ図の５４．５分におけるピ ークが確かにペプチド（５６−８２）と帰属された。以下の第１表に示されるよ うに、観察したアミノ酸組成は期待した組成に従っており、それによりアスパラ ギンがチロシンに置換され、その６７位における残基がＮ一連結グリコシル化さ れていることが確かめられる。

第１表 脱グリフシル化トリプシンペプチド（Ｎ６７　：　５６−８２）のアミノ酸組成 アミノ酸　　　　　　期待値　　観察値カルボキシメチルシスティン”　　４　 　　　３．４アスパルテート／アスパラギン　３３．０スレオニン　　　　　　 　　　　１１．０グルタメート／グルタミン　　　　４４．０プロリン／システ イン酸”　　　　　１　　　　　１．．３半一システイン”　　　　　　　　　 ０　　　　　０．２バリン　　　　　　　　　　１１．１ メチオニン　　　　　　　　　　００．１イソロイシン　　　　　　　　　Ｏｏ 、３０イシン　　　　　　　　　　　１　　　　　１．４チロシン　　　　　　 　　　　　００．１フエニルアラニン　　　　　　　４３．８ヒスチジン　　　 　　　　　　　０　　　　０．２ａ）カルボキシメチル化システィン、システィ ン酸および半システィンの値に３．９を付加すると、期待値４．０に匹敵する。

６、薬物動態 ２０匹のウサギを無作為に２つの処置群の１つに振り分けた：ｒｔ−Ｐ　Ａ、お よびグリコジル化Ｎｆ３７　　ｔ−ＰＡｏこれらタンパク質を＋１５１で約１０ μＣｉ　／　ｋｇにまで標識し、この標識化タンパク質の非特異的吸着を減少さ せるため０．１ａｇ／ｋｇ　ｒｔ−ＰＡと混合した。ＴＣＡを沈殿し得る＋１５ １−タンパク質の線量は、名目上５μＣｉ／ｋｇであった。

各ウサギは両耳にヘパリン・ロック（ｌｏｏｋ）を有するカテーテルを有してい た。薬物を１つのカテーテル中ＩＶポーラスとして投与し、次いで食塩水を投与 した。反対の耳から全血試料を採取した。血液試料１ｊ１１２は以下の時点に入 手した二〇（投与前）、および投与後２．５．１５．３０．４５．６０．７５． ９０．１２０．１５０、および１８０分。各時点毎に食塩水をカテーテルに流し くフラ・ノシ二し）、血液容量で置き換えた。採取した血液試料を、４．２ｍＭ 　ＥＤＴＡおよび１ｍＭ　ＰＰＡＣＫ（フェニルアラニン−プロリン−アルギニ ン−クロロメチル・ケトンのペプチド）を含有する１、５ｆｆＱ、容量工・ノベ ンドルフ遠心管中に注いだ。各遠心管は遠心するまで水上で保存した。遠心後、 血漿を素早く取り出し、エノベンドルフ遠心管に入れ、試験が終わるまで水上で 保存した。各血漿試料ｌＯＯμＱ中のタンパク質をトリクロロ酢酸で沈降させた 。各沈降物のガンマ放射線をカウントすることにより、タンパク質に結合した１ １５■を定量した。

得られた結果はＣＰＭ／試料１００μρ基準であるので、各データ解析をＣＰＭ ／ｚ（ｌに変換した。

血中濃度一時間曲線下面槽（ＡＵＧ）操作を使用する台形法によって、各ウサギ のＡｔＪＣを２から１．８０分で電算機計算した。クリアランスは、等式二ＣＬ −投与量／ＡＵＧから計算した。

上記”’Ｉ−１識化タンパク質にかかるターミナル半減期（ｔｅｒｍｉｎａｌ　 ｈａｌｆ−ｌｉｖｅｓ）の順番は次ぎのようである：ｒｔ−ＰＡ、　Ｎ６７　ｔ −ＰＡ０実際の半減期の値を決定するには、非標識化タンパク質を使用して薬物 動態試験を行わなければならない。第１０図は、ｒｔ−ＰＡおよびグリコジル化 Ｎ６７　ｔ−ＰＡ、ならびに比較のためにデス１−４４ｔ−ＰＡ、デス１−４４ Ｅ２７５　ｔ−ＰＡおよびデス１−４４Ｅ２７５Ｄ１’８４　　ｔ−ＰＡについ ての、ＣＰＭ／Ｍ（ｉ対分のプロット（投与量に基ついて標準化）を示すもので ある。

Ｎ６７　ｔ−ＰＡは、野生型ｔ−ＰＡよりもゆっくりと血漿から消失した。野生 型ｒｔ−ＰＡに対するそのＮ６７ｔ−ＰＡのクリアランスの比率は０．６３であ った。結局、等しい注入速度では、Ｎ６７ｔ−ｐＡは野生型ｔ−ＰＡと比較して １．６倍高い血漿濃度を有していると結論付けられる。

タンパク　　Ｎ−ｉｉｆ？ｓ　　り″ｌノコシル［ｙ−シ市゛岬事ργ汐ホ田Ｒ ＦＬｔ　− フィブ“すｙ　　（ｍｇ／ｍ１） ＝べχ＝デ°＾ト４４ −・令・−Ｎ６７ 国際調査報告 国際調査報告

Claims (55)

【特許請求の範囲】
1. １．フィブリン分解活性を示し、対応する天然プラスミノーゲンアクチベーター ではグリコシル化されていない１つまたはそれ以上の領域がグリコシル化されて いるプラスミノーゲンアクチベーターアミノ酸配列変異体。
2. ２．グリコシル化がＮ−連結グリコシル化である請求項１に記載の変異体。
3. ３．グリコシル化がＯ−連結グリコシル化である請求項１に記載の変異体。
4. ４．Ａｓｎ−Ｘ−ＳｅｒまたはＡｓｎ−Ｘ−Ｔｈｒで示されるトリペプチド配列 （ここに、Ｘはプロリンを除いたいずれかのアミノ酸である）を含有する変異体 の部位がグリコシル化されている請求項２に記載の変異体。
5. ５．成長因子ドメイン内がグリコシル化されている請求項１に記載の変異体。
6. ６．成長因子ドメイン内がグリコシル化されている請求項４に記載の変異体。
7. ７．プラスミノーゲンアクチベーターがヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ ー（ｔ−ＰＡ）、ヒトウロキナーゼまたはヒトプロウロキナーゼである請求項１ に記載の変異体。
8. ８．ｔ−ＰＡである請求項７に記載の変異体。
9. ９．プラスミノーゲンアクチベーターがヒト組織プラスミノーゲンアクチベータ ー（ｔ−ＰＡ）、ヒトウロキナーゼまたはヒトプロウロキナーゼである請求項４ に記載の変異体。
10. １０．ｔ−ＰＡである請求項９に記載の変異体。
11. １１．（１）天然ｔ−ＰＡにおける６０位にセリンまたはスレオニン、（２）天 然ｔ−ＰＡにおける６４位にアスパラギンおよび６６位にセリンまたはスレオニ ン、（３）天然ｔ−ＰＡにおける６５位にアスパラギンおよび６７位にセリンま たはスレオニン、（４）天然ｔ−ＰＡにおける６７位にアスパラギン、（５）天 然ｔ−ＰＡにおける７８位にアスパラギンおよび８０位にセリンまたはスレオニ ン、（６）天然ｔ−ＰＡにおける７９位にアスパラギンおよび８１位にセリンま たはスレオニン、（７）天然ｔ−ＰＡにおける８０位にアスパラギンおよび８２ 位にセリンまたはスレオニン、または（８）このような（１）から（７）の任意 の２個またはそれ以上の組合わせ を含有している請求項１０に記載の変異体。
12. １２．天然ｔ−ＰＡの６７位にアスパラギンを含有している請求項１１に記載の 変異体。
13. １３．プラスミノーゲンアクチベーターがｔ−ＰＡである請求項５に記載の変異 体。
14. １４．フィブリン結合性に関与しているドメインの少なくとも一部が機能的に除 去されて修飾を受けているが、フィブリン結合性は修復されてそれが天然のｔ− ＰＡに匹敵している請求項１３に記載の変異体。
15. １５．少なくともフィンガードメインの部分を欠いている請求項１３に記載の変 異体。
16. １６．アミノ酸１−４４を欠く天然ｔ−ＰＡからなる請求項１５に記載の変異体 。
17. １７．アミノ酸１８４位の機能的炭水化物構造を欠いている請求項１６に記載の 変異体。
18. １８．天然のｔ−ＰＡと比較して（１）２０５−２１５領域、（２）２４４−２ ５５領域、（３）２３３−２４２領域、または（４）これら（１）、（２）およ び（３）の２つまたはそれ以上の領域、のアミノ酸がさらに修飾されている請求 項１７に記載の変異体。
19. １９．特定の酵素学的開裂に対して耐性である請求項１３に記載の変異体。
20. ２０．実質的に２本鎖型を含まない請求項１９に記載の変異体。
21. ２１．１本鎖突然変異体である請求項２０に記載の変異体。
22. ２２．２本鎖開裂部位における部位−特異的突然変異によって１本鎖型で安定化 されている請求項２１に記載の変異体。
23. ２３．成熟プラスミノーゲンアクチベーターに従って番号付けした２７５位がア ルギニン以外のアミノ酸によって占有されている請求項２２に記載の変異体。
24. ２４．該アミノ酸がグリシンおよびグルタミン酸の中から選ばれる請求項２３に 記載の変異体。
25. ２５．該チミノ酸がグルタミン酸である請求項２４に記載の変異体。
26. ２６．成熟プラスミノーゲンアクチベーターに従って番号付けした２７７位がリ ジン以外のアミノ酸によって占有されている請求項２３に記載の変異体。
27. ２７．該アミノ酸がイソロイシンである請求項２６に記載の変異体。
28. ２８．アミノ酸２７５位または２７７位またはその両部位における酵素学的開裂 に対して耐性である請求項１６に記載の変異体。
29. ２９．デス１−４４Ｎ６７Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｄ１８４Ｅ２ ７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｓ１８４Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ ６７Ｋ２１３Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２ Ｒ２１３Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２５２Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デ ス１−４４Ｎ６７Ｋ２１０Ｅ２７５ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｅ２７５Ｉ２ ７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｄ１８４Ｅ２７５Ｉ２７７ｔ−ＰＡ、デス１ −４４Ｎ６７Ｓ１８４Ｅ２７５Ｉ２７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｋ２１３ Ｅ２７５Ｉ２７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２１０Ａ２１１Ｒ２１２Ｒ２ １３Ｅ２７５Ｉ２７７ｔ−ＰＡ、デス１−４４Ｎ６７Ｒ２５２Ｅ２７５Ｉ２７７ ｔ−ＰＡ、およびデス１−４４Ｎ６７Ｋ２１０Ｅ２７５Ｉ２７７ｔ−ＰＡの中か ら選ばれる、請求項２８に記載の変異体。
30. ３０．請求項１に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
31. ３１．請求項２に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
32. ３２．請求項３に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
33. ３３．請求項４に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
34. ３４．請求項５に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
35. ３５．請求項７に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
36. ３６．請求項８に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
37. ３７．請求項１１に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
38. ３８．請求項１２に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
39. ３９．請求項１３に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
40. ４０．請求項１６に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
41. ４１．請求項１７に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
42. ４２．請求項１８に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
43. ４３．請求項２３に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
44. ４４．請求項２４に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
45. ４５．請求項２５に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
46. ４６．請求項２６に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
47. ４７．請求項２８に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
48. ４８．請求項２９に記載の変異体をコードしているＤＮＡ配列。
49. ４９．請求項３０に記載のＤＮＡ配列を真核生物の形質転換細胞において発現す ることができる複製可能な発現ベクター。
50. ５０．請求項４９に記載のベクターで形質転換された真核生物宿主細胞。
51. ５１．酵母細胞である請求項５０に記載の細胞。
52. ５２．哺乳動物細胞である請求項５０に記載の細胞。
53. ５３．チャイニーズハムスター卵巣セルライン由来である、請求項５２に記載の 細胞培養物。
54. ５４．医薬的に許容され得る担体と共に、請求項１に記載のプラスミノーゲンア クチベーター変異体の治療学的有効量を含有してなる、血管疾患または症状を処 置するための組成物。
55. ５５．患者に請求項５４に記載の組成物を投与することを特徴とする、血管疾患 または症状を処置するための方法。