JPH0387180A - 変異ヒトプロウロキナーゼ、その製法、ｄｎａ配列、プラスミド、宿主 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、ヒトプロウロキナーゼ（以下ヒトＰＵＫ）を
分子構造的に修飾してなる変異ヒｌ−Ｐ　ＵＫ、その製
造方法、′該変異ヒ）ＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、
該ＤＮＡ配列の組み込まれたプラスごド、および該プラ
スごドによって形質転換された形質転換体に関する。さ
らに詳しくは、蛋白質レベルにおいて＃Ｎ鎖を修飾結合
させるべく遺伝子レベルにおいて特定遺伝子のアミノ酸
配列を他のアミノ酸配列にて置換させ、該遺伝子をａ置
換えＤＮＡ技術を応用して発現させることからなる変異
ヒ）ＰＵＫを提供する一連の技術に関する。

〔従来技術・発明が解決しようとする課題］線維素溶解
に係わるプラスくノーケン活性化因子には、血管内皮細
胞の産生するＭｉ織性のｔ−ｐＡ、ウロキナーゼ（Ｕ　
Ｋ　）が知られており、従来線維素溶解酵素としてはＵ
Ｋが著名である。このものは、従来人尿および人腎細胞
の培養液から精製されていたが、近年ＤＮＡ組み換え技
術による生産も可能となった（特開昭６Ｏ−Ｌ８０５９
１号明細書）。しかし、ＵＫは大量に用いると、凝固・
線溶諸因子の分解並びに活性化を惹起し、出直傾向を誘
起する欠点を有している。他方、本発明者らは、人腎細
胞によって産生されるヒトウロキナーゼの不活性型前駆
物質（ＰＵＫ）［特開昭６０−６２９８１号１！１１細
害、Ｊ、１ｌｉｏ１．Ｃｈｅｍ、　、　２６０１２３７
７（１９８５）　〕が、ＵＫと異なり出血傾向を惹起す
ることなく血栓を溶解することを既に見出している（Ｃ
ｅｌｌ　５ｔｒｕｃ、　Ｐｕｎｃ、　、１０．１５１（
１９８５）　）。

ヒトＰＵＫは、３つの機能ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）、
即ち、エピダーマルグロースフアクター（ｅｐｉｄｅｒ
ｍａｌｇｒｏｗｔｈ　ｆａｃｔｏｒ　、以下ＥＧＦと略
称する）ドメイン、クリングル（ｋｒｉｎｇｌｅ）　　
ドメイン、酵素活性ドメインから構成されている（Ｉｌ
ｏｐｐｅ−５ｅｙｌｅｒ’ｓ　Ｚ。

Ｐｈｙｓｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、、　３６３．１１５５　
（１９Ｂ２）　）。

また、以下に示す３つの理由から肝細胞上にＰＵＫ特異
レセプターが存在し、血中半減期を左右すると仮定され
ている。即ち、第１にラット静脈に投与されたＰＵＫが
、主として肝臓で代謝され（Ｓｕｙａｍａ、　ｅｔ　ａ
ｌ、、Ｆｉｂｒｉｎｏｌｙｓｉｓ　：ｃｕｒｒｅｎｔ　
ｐｒ。

５ｐｅｃｔｓ”、　Ｊｏｈｎ　Ｌｉｂｂｅｙ　＆　Ｃｏ
ｍｐａｎｙ　Ｌｔｄ、、　Ｌｏｎｄｏｎ。

ｐｐ３５〜４３（１９８８）　）　、第２に構造的に似
ているＬＰＡがＥＣ，Ｆ領域を除去することにより血中
半減期の増大が見られ（Ｂｏｗｎｅ、ｅｔ　ａｌ、、　
Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、。

垣、　１５９９（１９８Ｂ））　、第３にヒト単球株化
細胞Ｕ９３７上にはＵＫ特異的なレセプターが存在し、
ＵＫとレセプターの結合には、ＵＫのＥ　Ｇ　Ｆ　ｆＪ
域が関与している（Ａｐｐｅｌｌａ、　ｅｔ　ａｔ、、
　Ｊ、旧ｏ１．ｃｈｅｍ、。

２６２　．１４３７（１９８７））。

ところで、Ｅ　Ｇ　Ｆ　Ｓ’ｆＡ域除去ヒトＰＵＫは、
ラットでの血中半減期試験において除去前のＰＵＫより
も約３倍長い半減期を示すことを本発明者らは見出して
いる（特開昭６１−１４６７８９号明細書）。しかし、
天然のタンパク質に大きな欠失を与えることは、元のタ
ンパク質の構造に大きな変化を来す恐れがある。

従って、本発明の目的はＥＧＦ領域を欠失させることな
く、極力少ない修飾によって、ＥＧＦ領域除去ヒト変異
ＰＵＫの血中半減期の増加を維持しながら、フィブリン
への親和性が良好で、しかも他の性質はヒ１−ＰＵＫと
実質的に変わらない変異ヒトＰＵＫ、その製造方法、当
該線維素溶解酵素をコードするＤＮＡ配列、該ＤＮＡ配
列の組み込まれたプラスミド、形質転換体を提供するこ
とである。

〔課題を解決するための手段〕

かかる目的を達成するために本発明者らは種々研究を重
ねて来たところ、ヒトＰＵＫのＥＧＦＩ’メイン中に、
式 ％式％） （式中、Ｘは任意の１個のアミノ酸残基を表し、ＹはＳ
ｅｒ又はＴｈｒを表ず） で表されるアくノ酸配列（１）を持つように改変された
変異ヒトＰＵＫはヒトＰＵＫよりも血中半減期が長く、
フィブリンへの親和性が良好で、ＥＧＦ領域除去変異Ｐ
ＵＫと同様の血中半減期をもち、しかもヒ１−ＰＵＫや
ＥＧＦ領域除去変異ＰＵＫと同様出血傾向の極めて低い
ことを見出した。

即ち、本発明はヒトＰＵＫのＥＧＦ）メイン中に、アミ
ノ酸配列（Ｉ）を持つように改変された変異ヒトＰＵＫ
、当該変異ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列、当該Ｄ
ＮＡ配列が組の込まれたプラスミド、当該プラスミドに
よって形質転換された宿主および前記変異ヒ）ＰＵＫの
製造方法を提供するものである。

ところで、ヒトＰＵＫの４１１アくノ酸残基のうら、成
熟タンパク質のＮ末のセリンより４９番目のスレオニン
までがＥＧＦドメインと報告されている（Ｒ４ｃｃｉｏ
、　Ａ、　ｅｔ　ａｌ、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　
　Ｒｅｓ、。

１３、２７５９−２７７１　（１９８５））。そこで本
発明は、このＥＧＦドメインに＃Ｎ鎖を結合修飾させる
べくＥＧＦドメイン中にアミノ酸配列（１）を持つよう
に改変された変異ヒ）ＰＵＫを生産する一連の技術を提
供するものである。

ＰＵＫのＥＧＦ領域（Ａｓｎ−１０〜Ｃｙｓ４２）は３
つのループよりなる。即ち、第１ルプはＡｓ　ｎ−１０
〜Ｃｙ　ｓ−１９であり、第２ループはＶａ　ｌ−２０
−Ｃｙ　ｓ−３１であり、第３ループはＣｙｓ−３３−
Ｃｙｓ−４２である。しかして、第３ループのＣ末端側
にフィブリンとの親和性に寄与すると言われるＫｒｉｎ
ｇｌｅ領域が存在している。ＥＧＦとＥＧＦレセプター
の系、およびＵＫとＵＫレセプターを用いた系で、Ｅ　
Ｇ　Ｆ　Ｔｉｆｆ域とレセプターとの結合には、ＥＧＦ
の第１、第２ループが主として働いており、第２ループ
が結合の特異性に、第１ループが結合の安定化に寄与し
゛（いるとの知見がある。

また、本発明者等の研究によれば、Ｐ　Ｕ　Ｋの糖鎖構
造と血中半減期の長さとの関係は次の通りである。

マンノース結合型〈糖鎖結合なしく複合糖結合型即ち、
複合糖鎖結合型のものは血中でのＰＵＫの安定性を増加
させる方向に働くことが示唆された。また、蛋白質と糖
鎖との結合様式にはＮ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎと
０−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎがあるが、アミノ酸配
列（１）をもつ蛋白質は生合成過程で動物細胞内で糖鎖
が修飾される（Ｎ−ｇｌｙｃｏｓｙｌａｔｉｏｎ　）。

本発明において、アミノ酸配列（Ｉ）においてＸで表さ
れるアミノ酸残基は特に制限されない。

Ｘはアミノ酸ならば何でもよく、天然のままでも他のも
のに置換してもどちらでもよい。

本発明において、アミノ酸配列（Ｉ）は、ＥＣＦドメイ
ンの任意の位置に持た一已ればよいが、好適には第２ル
ープに持たせる。特に第２ループ上のＴｙｒ２４を５ｅ
ｒ２４に、Ｔｙｒ２４をＡｓｎ２４にまたはＨｉｓ２９
を５ｅｒ２９に置換することが好ましい。かくして、Ｅ
　Ｇ　Ｆ　領域のＡｓｎ２２、Ａｓｎ２４またはＡｓｎ
２７に糖鎖が結合される。

アミノ酸配列（Ｔ）は、通常ＥＣ’Ｆドメインの任意の
アミノ酸配列を欠失させ、所望のアミノ酸ないしはアミ
ノ酸配列で置換することによって導入される。アミノ酸
配列の欠失置換処理には、プロティンエンジニアリング
として知られる方法が広く利用できるが、たとえば５ｉ
ｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｄｅｌｅｔｉｏｎ　（部位指
定削除）法［Ｎｕｃｌ、　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、＋　１
１＋１６４５　（１９８３）　］　、５ｉｔｅ−ｓｐｅ
ｃｉｆｉｃ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　　（部位特異的
変異）法、制限酵素処理と合成遺伝子の利用による方法
等がある。

具体的にはヒトＰＵＫをコードするり、ＮＡ配列を用い
て欠失処理を行う。このＤＮＡ配列は図３で示される。

また、このＤＮＡ配列は特開昭６０１８０５９１号明細
書、特開昭６３−１４６７８９号明細書等に開示された
方法により調製することができる。このヒトＰＵＫをコ
ードするＤＮＡ配列を担持するプラスミドとしてＰＳＶ
−Ｇ１−ｐｒｅＵＫ（図４または特開昭６０−１８０５
９１号明細書）が例示される。

欠失置換処理された変異ＰＵＫは、発現ベクター系に挿
入して、発現用宿主・ベクター系を構築する。宿主・ベ
クター系は一般に宿主細胞とコンバーチプルな種から由
来するレプリコンと制御配列を有するプラスミドベクタ
ーと、この宿主を組み合わせて使用する。ベクターは一
般に複製部位を有し°ており、また形質転換細胞中で表
現型の選択が可能となるマーカーの配列を有している。

たとえば、酵母ベクターにおける適当なプロモーターと
して３−ホスホグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ）のプロ
モーター（ｌｌｉｔｚｅｍａｎ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ｂ
ｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、、　　２５５．２０７３　（１９６Ｂ））や
他の解糖系酵素〔Ｈｅ５ｓ　ｅｔ　ａｌ、　Ｊ、Ａｄｖ
、、　Ｅｎｚｙｍｅ−Ｒｅｇ、、７，１４９（１９６Ｂ
）；Ｈｏ１ｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、　Ｂｉｏｃｈｅｍｉ
ｓｔｒｙ、　１７．４９００　（１９７８））であるエ
ノラーゼ、グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲ
ナーゼ（ＣＡＰ−ＤＨ）　、ヘキソキナーゼ、ピルビン
酸デカルボキシラーゼ、ホスホフルクトキナーゼ、グル
コース−６−リン酸イソメラーゼ、３−ホスホグリセル
リン酸ムターゼ、ピルビン酸キナーゼ、トリオースリン
酸イソメラーゼ、ホスホグルコースイソメラーゼ、グル
コキナーゼの様な酵素のプロモーターである。これらの
中でも、小型化Ｇ　Ａ　Ｐ　−Ｄ　Ｈプロモーター（特
開昭６２−１７５１８０号明細書）、ＰＧＫプロモータ
ー（Ｎｕｃｌｃｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、、　１０（８
）　２６２５　（１９８２））は有用である。適当な発
現ベクターを作製する場合、これらの遺伝子に存在する
転写終結配列も又発現したい遺伝子の３′側に挿入し、
ｍＲＮＡのポリＡ化と転写終結が生しる様にする。増殖
条件により、転写の制御ができる様な利点を有するプロ
モーターとして、アルコールデヒドロゲナーゼ２、イソ
チトクロムＣ１酸性ホスファターゼ、あるいは窒素代謝
に関連した分解酵素、前述のグリセルアルデヒド−３−
リン酸デヒドロゲナーゼ、あるいはマルトースやガラク
トースを使用するのに関連した酵素のプロモーターも使
える。酵母のコンバーチプルプロモーター、複製起点及
び転写終結配列を含むすべてのプラス旦ドヘククーが使
える。

そして宿主としては、Ｓａｃｃｂａｒｏｍ　ｃｅｓ　ｃ
ｅｒｅｖｉｓｉａｅＧＲＦ１Ｂ株（特開昭５１−４８０
８２号明細書）Ａ　Ｈ２２株（八ＴＣ（：、　Ｎｏ、　
３８６２６）などを用いる。

さらに枯草菌の分泌発現ベクターとしては、プラス兆ド
ｐＵＢ１１０の複製起点をもら、かつ、α−アミラーゼ
遺伝子のプロモーター、シグナルペプチド、クーξ−ネ
ーターをイｆするプラス旦ドが利用でき、この宿主とし
てはＢ、　ｎａｔｔｏ　、Ｂ。

５ｕｂｔｉｌｉｓなどが使用できる。近年を椎動物の細
胞を培養して（組織培養）増やすことがルーチン化して
いる。［Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、　Ａｃａｄｅ
ｍｉｃ　ＰｒｅｓｓＫｒｕｓｅ　ａｎｄ　Ｐａｔｔｅｒ
ｓｏｎ、　ｅｄｉｔｏｒｓ　（１９７３）　］宿主細胞
株として有用な例としてＶＥＲＯｌＩｔ　ｅ　Ｌ　ａ細
胞、Ｃｈｉｎｅｓｅ　ｈａｍｓｔｅｒ　ｏｖａｒｙ　（
ＣＩＩＯ）　ｃｅｌｌ　１ｉｎｅ、　Ｗ１３ＢＢＨＫ　
　ＣＯ５−７ＭＤＣＫ　　ｃｅｌｌ　　Ｌｉｎｅ、Ｃ１
２７，ＩＩＫＧ、ｈｕｍａｎｋｉｄｎｅｙ　ｃｅｌｌ　
１ｉｎｅなどがある。これらの細胞の発現ベクターは通
常、複製起点、発現する予定の遺伝子上流に位置するブ
ロモ−クー、リポソーム結合部位、ＲＮＡスプライス部
位、ポリＡ付加部位、１ 転写終結配列を有する。

哺乳動物細胞を使用する場合、発現ベクター上の制御機
能はウィルス由来であることが多い。たとえば、−船釣
に使われるプロモーターはポリオーマ、アデノウィルス
、２、あるいは最も多用されているシミアンウィルス４
０　（ＳＶ４０）由来である。ＳＶ４０ウイルスの初期
および後期プロモーターは特に有用である。というのは
これらはＳＶ４０の複製起点を含む断片として容易に１
シイルスから得られるからである。［Ｆｉｅｒｓ　ｅｔ
　ａｌ。

Ｎａｔｕｒｅ、　２７３．１１３　（１９７８）　］ウ
ィルスのｌｌｌｎｄｌｌｌ部位から複製起点中のＢｇｌ
　１部位までの約２５０ｂｐを含む断片も使用できる。

更に目的とする遺伝子に関連したプロモーターや制御配
列（エンハンサ−）も宿主とコンバーチプルならば使用
できる。

動物細胞発現ベクターに用いるプロモーター・エンハン
サ−としては、ＳＶ４０初期遺伝子または後期遺伝子の
プロモーター・エンハンサ−やアデノウィルスメジャー
レート・プロモーター領域、グロブリンエンハンサ−・
プロモーター領域、Ｒ２ ＮＡウィルスのＬＴＲ、メタロチオネインプロモーター
領域、β−アクチンプロモーターなどが使用できる。複
製起点ばＳＶ４０や他のウィルス（ポリオーマ、アデノ
、ＶＳＶ、ＢＰＶ等）出来のものをベクターに組み込ん
でもよいし、宿主細胞染色体の複製機構を用いてもよい
。ベクターが宿主細胞の染色体に組み込まれるならば後
者で十分である。また、これ以外の高生産系として、Ｄ
ＨＦＲ遺伝子を利用した遺伝子の増帽系を用いることが
可能である。以上、具体的な例を挙げて説明した本発明
は、以上に例として述べた宿主細胞ベクター・発現系に
限定して解釈されるべきではない。

本発明においては、たとえば好適な具体例として、ＳＶ
４０初期プロモーター領域の下流に変異ヒトＰＵＫをコ
ードする遺伝子を挿入して、動物細胞用発現ベクターを
構築した。これらをＣＨ○に１細胞に導入して形質転換
させた。本実験系では、８０．３４０．３７１０／ｍｌ
／　３日の変異ヒトＰＵＫを産生ずるクローン（高産生
株）を得た。

変異ヒ１−ＰＵＫの精製は、既知のヒトＰＵＫの精製法
に準しておこなうことができる（特開昭６０６２９８１
）。本発明では、精製にはＣｈｅｌａｔｉｎｇＳｅｐｈ
ａｒｏｓｅ　６Ｂ、　ａｎｔｉ−１１Ｋ　ｆｏｒｍｙｌ
　ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅＢｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−５
ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂのカラムクロマトグラフィーを
併用したが、特にＣｈｅｌａｔｉｎｇ　５ｅｐｈａｒｏ
ｓｅ６Ｂは粗精製に、ａｎｔｉ−ＵＫ　ｆｏｒｍｙｌ　
ｃｅｌｌｕｌｏｆｉｎｅ　４Ｂは高度精製に、さらにＢ
ｅｎｚａｍｉｄｉｎｅ−５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂは混
入活性型ウロキナーゼ（ＵＫ）の除去に各々有効である
。

かくして得られた産生物を解析したところ、ＰＵＫ活性
において番１変異型および非変異型で全く差はなく、変
異型ＰＵＫは分子量約４９，０００〜５３，０００の一
本鎖型のプロエンザイムであり、プラス兆ン処理により
完全に活性型に変換した。さらにこの変異しトＰＵＫの
血中半減期を人腎細胞由来ＰＵＫ　（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、
　Ｃｈｅｍ、、　２６０．１２３７７　（１９８５）　
］のそれと比較したところ、変異ヒトプロウロキナーゼ
の血中半減期のほうが有意に長かった。

〔実施例〕 実施例１ （ＥＧＦドメイン番こアスパラギン結合糖鎖をもつ変異
ヒ）ＰＵＫの動物細胞での発現） ＰＵＫのＥＧＦドメイン内に新たな糖鎖結合部位を２２
位にもつ変異ヒトＰＵＫ　（Ｔｙ　ｒ　２４を５ｅｒ２
４に置換）、２４位にもつ変異ヒｌ−Ｐ　ＵＫ（Ｔｙｒ
２４をＡｓｎ２４に置換）、２７位にもつ変異ヒトＰＵ
Ｋ（Ｈｉｓ２９を５ｅｒ２９に置換）の発現ヘクターを
作製した。ヒトＰＵＩ！伝子のＥＧＦドメインコーディ
ング領域での置換方法、およびそれらの動物細胞におけ
る発現ヘクターの構築方法の概略を図１と図２に示した
。

これら発現ヘククー作製の詳細を以下に述べる。

なお、本実施例において、台底ＤＮＡは変成ボリアクリ
ルアごドゲルで精製した。制限酵素、Ｔ４　　ＤＮＡボ
リメレース、Ｍ１３シークエンスキット、ライゲーショ
ンキットなどの酵素・キット類、大腸菌ＨＢＩＯＩおよ
びＪＭ１０９コンピテントセルは宝酒造製のものを用い
た。子牛小腸アルカリフォスファテースはヘーリンガー
　マンハイム社製を用いた。また、リコンビナンｌ−Ｄ
　Ｎ　Ａテクニックは’Ｍｏ１ｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎ
ｉｎｇ’　Ｃｏ１ｄ　ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ　Ｎｅ
ｖｒ　Ｙｏｒｋ：Ｃｏ１ｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　１（ａｒｂ
ｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８２）に記載の方法
に準じた。

（イ）オリゴヌクレオチドの台底 自動ＤＮＡ合戒合成３８１Ａ、アプライドバイオシステ
ム社）を用いて、−本領ＤＮＡ６個（ＤＮＡ−１、ＤＮ
Ａ−２、ＤＮＡ−３、ＤＮＡ−４、ＤＮＡ−５とＤＮＡ
−６）を作成した。各々の塩基配列を以下に示す。

Ｔｙｒ２４を５ｅｒ２４に置換（Ａｓｎ２２にｔｌ！鎖
付加）５°−ＣＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡ
３”−ＴＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡｓｎＣｙ
ｓＡｓｐＣｙｓｌ−ｅｕＡｓｐｎｌ ＴＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＣＣ
ＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＣＡＧＧＴＴＧｎＧｌｙＧｌ
ｙＴｈｒＣｙｓＶａｌＳｅｒＡｓｎ５ｐｌ ＡＡＧＴＣＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＣＴｂ ＴＴＣＡＧＣ；ＡＡＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＣＴＧＡＬｙ
ｓＳｅｒＰｈｅＳｅｒＡｓｎｌ　　ＩｅＨｉｓＴＧＧＴ
ＧＣＡＡＣＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴ
ＴＧＡＣＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＡｒｐＣｙｓＡｓｎＣ
ｙｓＰｒｏＬｙｓＬｙｓＰｈＣＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡ
ＣＴＧＴＣ、ＡＡＡＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣ（１，ＴＧ
ＡＣＡＣＴＴＴＡＧｅＧｌｙＧＩｙｃ；ＩｎＨｉｓＣｙ
ｓＧｌｕｌ　　ｌｅ３″　　ＤＮＡ−１ Ｃ−５ＤＮＡ−２ Ｔｙｒ２４をＡｓｎ２４に置換（Ａｓｎ２４に糖鎖イ１
加） ５’　−ＣＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡ３’
−ＴＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡｓｎＣｙｓＡ
ｓｐＣｙｓＬｅｕＡｓ ｐｎｌ ＴＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧＴＧＴＣＣＡＡＣＡＣＣ
ＴＣＣＡＴＧＧΔＣＡＣＡＣＡＧＣ；ＴＴＧｎＧＩｙＧ
ｌｙＴｈｒＣｙｓＶａｌＳｅｒＡｓｎＳｓｐｌ ＡＡＧＡＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＣＡＣＴＴＴＣ
ＴＴＧＡＡＧＡＧＧＴＴＡＴＡＡＧＴＧＡＬｙｓＡｓｎ
ＰｈｃＳｅｒＡｓｎｌｌｅＨｉｓＴＧＧＴＧＣＡＡＣＴ
ＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴＴＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣＧＧ
ＧＴＴＴＣＴＴＴＡＡｒｐＣｙｓＡｓｎＣｙｓＰｒｏＬ
ｙｓＬｙｓＰｈＣＧＧＡＧＧＧＣＡＣＣＡＣＴＧＴＣΔ
ＡＡＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣＴＴＴＡＧ
ｅＧＩｙＧＩｙＧＩｎＨｉｓＣｙｓＧＩｕｌｌｅ３　　
　　ＤＮＡ−３ Ｃ−５ＤＮＡ−４ Ｈｉｓ２９を５ｅｒ２９に置換（Ａｓｎ２７に糖鎖付加
） ５　−ＣＧＡＡＣＴＧＴＧＡＣＴＧＴＣＴＡＡＡ３’−
ＴＴＧＡＣＡＣＴＧＡＣＡＧＡＴＴＴＡｓｎＣｙｓＡｓ
ｐＣｙｓＬｅｕＡｓ ｐｎｌ ＴＧＧＡＧＧＴＡＣＣＴＧＴＧ′ＦＧＴＣＣＡＡＣＡＣ
ＣＴＣＣＡＴＧＧＡＣＡＣＡＣＡＧＧＴ’ｌ’ＧｎＧＩ
ｙＧｌｙＴｈｒＣｙｓＶａｌＳｅｒＡｓｎ５ｐｌ ＡＡＧＴＡＣＴＴＣＴＣＣＡＡＴＡＴＴＴＣＣＴＴＴＣ
ＡＴＧＡＡＣＡＣＣＴＴＡＴＡＡＡＣＣＡＬｙｓＴｙｒ
ＰｈｅＳｅｒＡｓｎｌｌｅＳｅｒＴＧＧＴＧ　ＣＡＡＣ
ＴＧＣＣＣＡＡＡＧＡＡＡＴ”「ＣＣＡＣＧＴＴＧＡＣ
ＧＧＧＴＴＴＣＴＴＴＡＡｒｐＣｙｓＡｓｎＣｙｓＰｒ
ｏＬｙｓＬｙｓＰｈＣＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＡＣＴＧＴ
ＧＡＡＡＴＧＣＣＴＣＣＣＧＴＣＧＴＧＡＣＡＣＴＴＴ
ＡＧｅＧｌｙＧ］ｙＧｌｎＨｉｓＣｙｓＧｌｕｌｌｅＮ
Ａ ５゛ ＮＡ ９ ＤＮＡ−１とＤＮＡ−２はＰＵＫの２４位チロシン残基
がセリン残基に、ＤＮＡ−３、ＤＮＡ−４はＰＵＫの２
４位チロシン残基がアスパラギン残基に、ＤＮＩ−５と
ＤＮＩ−６はＰＵＫの２９位ヒスチジン残基がセリン残
基に置換されたＤＮＡ配列を含んでいる。また、ＧＧＡ
ＡＣＡをＧＧＴＡＣＣに変換してＫｐｎ　　Ｉ認識部位
を、ＡＡＣＡＴＴを八ＡＴＡＴＴに変換してＳｓｐ　　
ｆ認識部位を導入した。

台底したオリゴヌクレオチドは、保護基の脱離処理後、
全合成量の６４／１００を１２％２％アクリルアミドゲ
ル電気泳動で精製した結果、ＤＮＡ−１，１５，９ａｇ
；ＤＮＡ−２，２２，０μｇ；ＤＮＡ−３，１９，０ａ
ｇ　；　ＤＮＡ−４，２１，１ａｇ　ｉ　ＤＮＡ−５，
８，８ａｇｉＤＮＡ−６．１２．１μｇの一木！！　Ｄ
　Ｎ　Ａとして得た。

（ロ）プラスミドの作製 構築手順の概略を図１（１）に示した。

Ｉ ０ にのシグナル配列並びにＰＵＫの２４位チロシン残基が
セリン残基に置換された合成ＤＮＡを含んだｐＨＲ２１
を構築した。同様に、２４位チロシン残基がアスパラギ
ン残基に置換されたｐＨＲ２３と、２９位ヒスチジン残
基がセリン残基に置換されたｐＨＲ２６を構築した。３
種のプラスミドはいずれも同し長さの台底ＤＮＡをｐＴ
ＴＯ３に挿入して作製し、その確認も全く同じなのでこ
こではｐＨＲ２１の構築のみを述べる。

ｐＴＴＯ３をＣ１ａ　　Ｔで消化し、直線状になった３
、９ｋｂの断片をアガロースゲル電気泳動により単離・
精製した。これを子牛小腸アルカリフォスファターゼで
末端の脱リン酸化を行った。一方、前記（イ）で台底し
たオリゴヌクレオチドＤＮＡ１とＤＮＡ−２をカイネー
ション後アニーリングし、脱リン酸化した３、９ｋｂの
断片とライゲーションした。Ｈ４ｎｄｌｌｌとＣ１ａ　
　Ｉで消化して、８００ｂｐのＤＮＡ断片を与えたプラ
スミドをｐ　ＨＲ２１とした。１２個の形質転換体のス
クリーニングを行った結果、ｐＨＲ２１の形質転換体は
６個得られた。

また、ｐ　ＨＲ２３では１２個のうち８個が、ｐＨＲ２
６では１２個のうち６個が目的のプラスミドを持った形
質転換体であった。なお、各プラスごドの台底ＤＮＡを
使用した部分の確認は、その塩基配列を決定することに
よっても行った。

ＨＲ２２、ＨＲ２４ＨＲ２７の ｐＨＲ２１、ｐＨＲ２３、ｐ　ＨＲ２６はＰＵＫの４４
位のイソロイシン残基までをコードするＤＮＡ配列を持
っているので、これに４５位アスパラギン酸よりＣ末端
側をコードするＤＮＡを連結し、それぞれ順にｐ　ＨＲ
２２、ｐＨＲ２４、ｐＨＲ２７を構築した。ここでもｐ
　ＨＲ２２の構築についてのみ述べる。

ｐＵＨ７をＣ１ａ　　Ｉ消化し、４．２ｋｂのＤＮＡ断
片をアガロースゲル電気泳動で単離・精製した。これを
子牛小腸アルカリフォスファターゼで末端の脱リン酸化
を行い、ｐＨＲ２１の１ｌｉｎｄｌｌｌ　−Ｃ１ａ　　
Ｉ消化で得た８００ｂｐのＤＮＡ断片とＣ１ａ　　［認
識部位を使ってライゲーションした。次に、Ｔ４　　Ｄ
ＮＡポリメレースで旧ｎｄｌｌ［認識部位並びにもう−
３ 方のＣ１ａ　　Ｉ認識部位を平滑末端とした後、再びラ
イゲーションした。２４株について一次スクリニングは
環状プラスミドの大きさを指標にした。

即ち、目的のプラスミドよりも１００ｂｐ小さいｐＵＨ
７の環状プラスミドとの比較を行った。その結果、２４
個のうち５個が目的の大きさのプラスミドであった。こ
の構築手順では、挿入する１ｌｉｎｄｉｌｌ　−Ｃ１ａ
　　Ｉ断片が逆向きに連結される可能性もあるので、Ｋ
ｐｎ　　Ｉ消化で９００ｂｐのＤＮＡ断片を与えるプラ
スミドのスクリーニングを次に行った。

その結果、５個のうち４個が目的のプラスミドであるこ
とがわかった。本プラスミドｐＨＲ２２は財団法人発酵
研究所（あて名；大阪市淀用区十三本町２丁目１７番８
５号）へ、平底１年４月２８日に、菌株名：　Ｅｓｃｈ
ｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ＩＩＢＩＯＩ／ｐＨＲ２２
、受入番号：１Ｆ０１４８７１号として受託されている
。

なお、Ｔ）ＨＲ２４とｐ　ＨＲ２７のどちらにおいても
、２４個のうち１個のみが目的のプラス短ドであった。

−Ｌ工」」」コ何４築 ４ Ｓ■４０由来のエンハンサ−・プロモーター領域と、Ｐ
ＰＡのシグナル配列並びにＰＵＫのＮ末端４アミノ酸を
コードする遺伝子を含んだプラスくドｐＴＴＯ３を構築
した。ＳＶ４０のエンハンサ−・プロモーターのＢａｍ
１ｌ　Ｉ認識部位の５”領域を得るために、ｐＵＨ７を
旧ｎｄｌｌＩとＢａｍＨＩで消化し、４２０ｂｐの断片
をアガロースゲル電気泳動により単離・精製した。一方
、ｐＵＨ３も旧ｎｄｎｌとＢａｍ１ｌ　Ｉで消化し、直
線状になった３、５ｋｂのＤＮＡ断片をアガロースゲル
電気泳動により単離・精製し、これを先の４２０ｂｐの
断片とＤＮＡリガーゼで連結した。旧ｎｄＩＩＩとＢａ
ｍＨＩで消化して、３．５ｋｂおよび４２０ｂｐの断片
を与えたプラスミドをｐＴＴＯ３とした。１２個の形質
転換体について確認を行ったが、全てｐＴＴＯ３の形質
転換体であった（図１（２）参照）。

なお、ｐＴＴＯ３の構築に必要なプラスごＦｐＵＨシリ
ーズの調製方法を以下に述べる。

ＵＨシ冨−ズの ＰＵＫ　　ｃＤＮＡのクローニングおよびその塩基配列
、またｐｓＶ−Ｇ＋　−ｐｒｅＵＫプラスミドの作製方
法等については、特開昭６０−１８０５９１号明細書、
欧州特許出願公開第１５４２７２号明細書に記載の方法
に準した。

ヒトＰＵＫ遺伝子からのＥＧＦドメインコーディング領
域の近傍にあるＮｃｏｌとＴａｑ１部位を利用し、これ
らの領域の除去を試みた。まず、ヒトＰＵＫ発現ベクタ
ーｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫをｌｌ１ｎｄＩＩ［とＴａ
ｑｌで消化し、Ｎ末から１０番目のＡｓｎまでのコーデ
ィング領域を含む部分ヒｉ　Ｐ　Ｕ　Ｋ遺伝子フラグメ
ントを取り出し、これをプラスミドｐＢＲ３２２に挿入
してプラスごドｐＬＩｌ１１を作製した。次に、ヒトＰ
ＵＫの＾５ｎ−５４からＭｅｔ−６７の領域をツー１′
シ、かつ両宋ｙ：；；がＣ１ａ＋及びＵｃｏＲ１部位で
ある合成遺伝子を作り、これをプラスミドｐｕｔ（１に
挿入することにより、プラスミドｐＵ１１２を作製した
。また、この合成遺伝子上には特異的な制限酵素である
５ｆｉ１部位を設けた。

合成遺伝子上の５ｆｉｒ部位だけを含むＢａｍＨＩ　−
ＥｃｏＲ１フラグメントをＢＬＵＥＳＣＲＩＢＩＥプラ
スミド（ＶＩＥＣＴＯＩＩＣＬＯＮＩＮＧ　ＳＹＳＴＨ
ＭＳ）に押入して、プラスミドｐＵＩ＋３を作製した。

このｐＵＨ３の５ｆｉｌ−Ｃｌａｌ部位に、Ｇｌｕ−４
３〜Ｇｌｙ−５３をコードし、かつ両末端がＣ１ａｌお
よびＳｆｉ１部位である合成遺伝子を押入することによ
り、ＥＧＦドメイン領域が除去された部分ヒトＰＵＫ（
Ｎ末〜ＭｅＬ−６７）遺伝子ををするプラスミドｐＵＩ
＋４を作製した。次にこれらのＥＧＦドメインを除去し
た領域を発現ヘクターに組み込むため、まずｐｕ＋１４
のＢａｍＨｌ−ＮｃｏｌフラグメントとｐＳＶ−Ｇｌ−
ｐｒｅＵＫの１ｌｉｎｄ　Ｉｌｌ−ＢａｍＨＩを連結し
た。その後、このフラグメントをｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅ
ｌｌＫの１ｌｉｎｄ　ＩＩＩ−Ｎｃｏｌ領域に挿入して
、ＥＧＦドメイン欠失変異ヒトＰＵＫ用発現ベクターｐ
Ｈｌ＋７を作製した。これら発現ヘクター作製の許細を
以下に述べる（図２）。

（１）プラスミドｐＵＨ１〜３の作製 プラスξドｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫ上には、Ｔａｑ１
部位が多数存在し、１回の制限酵素処理では、ＥＧＦド
メイン近傍のＴａｑ　１部位だけを切断することは困難
である。そこでまずこのＴａｑ１部位を含むＤＮＡフラ
グメントを取り出した。ｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫを制
限酵素１１ｉｎｄｌ［とＢｇｌｌｌで消化し、アガロー
スゲル電気法７ 動によりそのＤＮＡを調べた。泳動後ゲルよりＥＧＦド
メインコーディング領域を含む１．１ｋｂのＤＮＡフラ
グメントをゲルから切り出し、そのＤＮＡを回収した。

次に、このフラグメントをＴａｑｌで部分消化し、ポリ
アクリルア実ドゲル電気泳動にかけた。目的の７６０ｂ
ｐのハンドの存在を確認した後、このＤＮＡフラグメン
トを回収した。

一方、プラスミドｐＢＲ３２２を１ｌｉｎｄｌｌｌとＣ
１ａｌで消化し、４．３ｋｂのＤＮＡフラグメ７１−を
（；Ｉた。そしてこのＤＮＡと先に調製した７６０ｂｐ
　１ｌｉｎｄｌ−Ｔａｑｌ　ＤＮＡフラグメン１〜をリ
ゲーションした。このリゲションにより、７　Ｇ　Ｏｂ
　ｐフラグメントの３゛宋Ｄ：Ｎ’を上に存在するＴａ
ｑ　１部位は、Ｃｌａｌ部位へと変換した。

反応後、この溶液を用いて大腸菌Ｈ８１０１株をトラン
スフオームした。得られたトランスフＡ−マント２４株
より調製したＤＮＡをそれぞれＣｌａｌおよびＮｃｏ　
Ｉで消化した。目的のプラスミドｐＨｌ１１　（図２）
であれば、ＣＩａＴおよびＮｃｏＴで共に−か所でのめ
切断される。電気泳動にか６ノ調べたところ、６クロー
ンが目的のプラスミドであった。

　Ｒ このｐＬＩＩ＋１をＥｃｏＲＩ　とＣ１ａｌで消化し、
アガロースゲル電気泳動にかＵた。ゲルより約５．Ｏｋ
ｂのＤＮＡフラグメントを回収し、このＤＮＡとヒトｌ
）　ＵＫのＡｓｎ−５４からＭｅｔ−６７の領域をコー
ドし、かつ両末端がＣ１ａｌ及びＥｃｏＲ１部位となる
ように作られた５６−ｍａｒと５４−ｍａｒの合成オリ
ゴヌクレオチドのアニーリング産物とをリゲーションし
た。そして、この反応液を用い、大腸菌１１ＢＩＯＩを
トランスフオームした。得られたトランスフォーマント
２０株よりＤＮＡを調製して、このＤＮＡをＮｃｏＩ及
びＥｃｏＲＩと旧ｎｄＩ［で消化した。目的プラスごド
ｐ　Ｕ　Ｉ＋　２であれば、Ｎｃｏ　Ｉ消化により約７
００ｂｐのＤＮＡフラグメントが、またＥｃｏＲＩ　と
ｌ１ｉｎｄＩ［ｌの消化により、約８１０ｂｐのＤＮＡ
フラグメントが生しる。泳動の結果、４クローンが目的
のプラス逅ドであった。

次にｐＵＩ！２にはＳｆｉ１部位が２か所隣接して存在
することから、合成遺伝子由来のＳｆｉ［部位を含むＢ
ａｍ１ｌ　Ｉ　−ＥｃｏＲＩフラグメントを他のへフタ
−へ移した。

まず、ｐ　Ｕ　Ｉ＋　２をＢａｍ１ｌｌ　とＥｃｏＲＩ
を用いて消化した。

これをボリアクリルアごドゲル電気泳動にかけ、ゲルよ
り３３０ｂｐのＤＮＡフラグメントを切取り、エレクト
ロエリューションにてＤＮＡを回収した。

一方、プラスミドＢＬＵＥＳＣＲＩＢＥ　（ＶＥＣＴＯ
ＲＣＬＯＮＩＮＧＳＹＳＴＥＭＳ製）をＢａｍ１ｌｌ　
とＥｃｏＲＩで消化し、得られた約３．１ｋｂのＤＮＡ
フラグメントと先に調製した３３０ｂｐのＢａｍ１ｌｌ
−ＥｃｏＲＩ　フラグメントとをリゲーションした。そ
して、この反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０５株をトラ
ンスフオームした。得られたトランスフォーマントより
１２株を選びそのＤＮＡを調製しＳｆｉ！及びＣ１ａｌ
で消化した。目的のプラスミドｐ　Ｕ　Ｉ＋　３であれ
ば、５ｆｉｌおよびＣ１ａＴで共に−か所でのみ切断さ
れる。電気泳動の結果、８クローンが目的のプラスごド
を有していた。

（２）プラスミドＴ）ＵＫ４及びｐＵＨ７の作製プラス
ミドｐＵＩ＋３のＣ１ａｌ−３ｆｉｌ領域に合成遺伝子
を挿入することにより、ＥＧＦドメインを除去したヒト
ＰＵＫの部分遺伝子を有するプラスミドｐｕＨ４の作製
を試みた。先ず、ｐＵＨ３をＣ１ａｌと５ｆｉＴで消化
し、アガロースゲル電気泳動にかけ、エレクトロエリュ
ーションにて約３．１ｋｂのＤＮＡフラグメントを回収
した。このフラグメントと合成遺伝子とをリゲーション
した。これらの反応液を用いて、大腸菌ＪＭ１０５株を
トランスフオームした。得られたトランスフォーマント
から１０株選び、ＤＮＡを調製した後、Ｂａｍ１（［と
ｌ１ｃｏＲＩで消化した。目的のプラスミドｐＨｌ＋４
であれば、制限酵素消化により、３６０ｂｐのフラグメ
ントが生しる。アクリルアミドゲル電気泳動の結果、ｐ
　ＩＩ　ＩＩ　４を２クローン得ることができた。

そこで、このプラスミドを用いて、ＥＧＦドメイン領域
のＤＮＡ塩基配列を決定した。その結果、予定していた
領域が除去されており、またその他のアミノ酸配列には
変化がなかった。

次に、このｐ　Ｕ　ＩＩ　４のプラスミドよりＳＶ４０
初期遺伝子プロモーター領域−ＥＧＦドメイン欠失変異
ヒトＰＵＫの部分遺伝子を切り出し、動物細胞用ヒｉ　
Ｐ　Ｕ　Ｋ発現ヘクターｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅ［ＩＫへ
の導入を試みた６ｐＵＨ４をＮｃｏ　Ｉで切断後ＣＴＰ
処理をおこない、５′末端を脱リン酸化した。次に、こ
のＤＮＡをＢａｍ１ｌｌで消化した後ポリアクリルアミ
ドゲル電気１ 泳動にかけ、３６０ｂｐのＤＮＡフラグメントを切り出
し、エレクトロエリューションにてＤＮＡを回収した。

さらにこのＤＮＡと別途調製したプラスミドｐＳＶ−Ｇ
ｌ−ｐｒｅＵＫの４００ｂｐ　Ｂａｍ１ｌｌ−１１ｉｎ
ｄ　］［ｌフラグメントとをリゲーションし、反応終了
後エタノール沈澱によりＤＮＡを回収した。

一方、ｐＳＶ−Ｇｌ−ｐｒｅＵＫをｌ１ｊｎｄｌｌｌと
Ｎｃｏｌで消化し、電気泳動にかけた。ゲルから約４．
２ｋｂのＤＮＡフラグメントを切り出し、エレクトロエ
リューソヨンにてＤＮＡを回収した。そして、上述の３
種類のリゲーションサンプルと、この４．２ｋｂ　１Ｉ
ｉｎｄｌｌＴ−ＮｃｏｌＤＮＡフラグメ７１−を再びリ
ゲーソヨンした。

反応液を用いて、大腸菌ＩＩ　８１０１株をトランスフ
オームした。反応液から得られたｌ・ランスフォーマン
トより１６株選んでＤＮＡを抽出し、各ＤＮＡを１１ｉ
ｎｄｌｌｌ及び旧ｎｄｌｌｌとＢｇｌＵで消化した。目
的のプラスミドｐυ１１７であれば、１ｌｉｎｄｌｌｌ
消化からは約４．９ｋｂのＤＮＡフラグメントが、また
ｌ１ｉｎｄｌｌｌとｌ（Ｐ、ＩＩＩとの？＋’ｊ化から
は約１．Ｏｋｈのフラグメントがみられる。電気泳動の
結果、目的とするｐＵ１１７が３クロー２ ン得られた。なお、プラスミドｐｕｔ（７は財団法人醗
酵研究所（前述）へ、昭和６２年７月２日、菌株名：　
Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　ｔｌＢ１０１／ｐ
ＵＨ７，受入番号＝ｌＦ０１４６３６号として受託され
ている。そこで１クロンを選んで、このプラスごドを大
量調製した。

（ハ）　ＥＧＦドメインに新たなるＩｌ！鎖を持つ変異
ヒｌ−Ｐ　Ｕ　Ｋ発現ベクターのＣＨＯ細胞への導入３
種類の変異ヒ）ＰＵＫ発現発現ダクターｐＨＲ２２／２
４／２フＨＯＫＩ細胞に導入した。

び′ 培地はｌｌａｍ’ｓ　ＰＩ３（日永製薬）を使用した。

血清は牛胎児血清（以下、Ｆｅ２という）（三菱化成Ｍ
ＨＯＩ）を非動化し、培地Ｖ！濃度が１０％になるよう
に添加した。

また、除菌濾過した０４１８　（ＧｒＢＣＯ社製）を終
濃度４００μｇ７ａｌｌで含む上記血清培地を選択培地
とした。

培養用インキュベータとしてはタバイエスペック社製Ｎ
２−０゜−ＣＯ２−インキュベータＢＰＮＩＩＯを使用
した。ＣＯ２濃度は５％に設定した。

８　　ヒ　　　ＰＵＫゝ　　ｆ・の？ＩＸ培養上清中の
変異ヒＩ−Ｐ　Ｕ　Ｋ活性は天然型ウロキナーゼ（ＵＫ
）活性に相関していると見做した。

培地交換３日後に上清を採取し、そのプラスごノーケン
アクチヘータ−（ＰＡ）活性をＵＫ検定標品を検量基準
としてフィブリン寒天平板法（Ａｒｃｈ。

［１ｉｏｃｈｅｍ、、　４（１，３４６−３５１（１９
５２））で測定した。

へのＤＮＡ　　　　エレクトロポレーション法） 対数増殖期にあるＣＨＯ−Ｋｌ細胞（細胞数５×１０６
個）に変異し）ＰｔＪＫ発現用プラスξドｐＨＲＯ２２
（１０μｇまたは１００　、）ｇ）を選択マーカーとな
るプラスミドｐｓＶ−Ｇｌ−Ｎｅ。

（図５、特開昭６０−１８０５９１号明細書）（０，１
３μｇ）とともにエレクトロポレーション法によりｃｏ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔ＋ｏｎ　シた。この細胞を】Ｏ％Ｆ
Ｃ３を含むｌｌａｍ’ｓ　Ｆ１２培地５０ｍｆｆに懸濁
し、１００　ｕ℃ずつ９６六マイクロプレー１−に分注
した。４８時間後にＧ４１８を終濃度４００μｇ　／　
ｍｌとなるように加え、その後は３〜４日毎に選択培地
の交換を行った。細胞がほぼコンフルエントになった段
階で培養上清のＰＡ活性を測定した。ＩＩＵ／ｍ１以上
の変異ヒＩ−Ｐ　Ｕ　Ｋを産生した細胞株を選び１０印
デイツシユまでスケールアップし、再度活性を測定した
。ｐＨＲ０２４（１０μｇまたは１００μｇ）、ｐＨＲ
Ｏ２７（１０μｇまたは１００μｇ）も同様にしてそれ
ぞれ導入し、培養した。

〔以下余白〕

５ 発現プラス旦ド１０μｇを形質導入したときには、その
効率は０．９〜１．３Ｘ１０−’と各プラスミド間で顕
著な差は認められなかった。また、１００μｇを形質導
入した時にも、０．２〜０．４Ｘ１０−’と効率の差は
なかった。しかし、導入プラスミド間を１０μｇとした
時と１００μｇにしたときとでは前者のほうが、形質導
入効率が３〜４倍高い値を示した。

他方、ＩＯμｇの発現プラスミドを使用するよりも１０
０μｇの発現プラスミドを使用する方が、つまり発現プ
ラスミドのモル比が高い方が、Ｇ４１８耐性クローンに
占める変異ヒトＰＵＫ産生クローンの割合は高くなって
いることがわかる。

ｐＨＲＯ２７は例外とすれば、発現プラスミド１０μｇ
使用すれば１０〜２０％の、１００μｇ使用すれば５０
％以上という高頻度で変異ヒ）ＰＵＫ産生株を得ること
ができるのである。これは、これまでに行った形質導入
実験の結果とよく一致する。また、そればかりでなく、
高産生株の分離も可能となった。

表２　９６ｗｅ１１プレートにおける変異ヒトＰＵＫ発
現プラスミド導入細胞の産生量分布 導入プラスミド 各ＰＡ活性（ＴＩ／ｍ之） ０　　　０−５　　５−２０ 領域のクローン数 ２０−５０　５０ ｐＨＲＯ２２／１０ ｐＨＲＯ２４／１０ ｐＨＲＯ２７／１０ μｇ μｇ μｇ ３ ５２　　５　　　２ ４１　　２　　０ ０ ０ ０ ０ ｐＨＲＯ２２／１００μｇ　　　　７１　　　７　　　
　１　　　０ｐＨＲＯ２４／１００μｇ　　　　６９　
　　４　　　　　０　　　１１）ｌＩＲＱ２７／１００
μｇ　　　１０　　０　　　０　　　　０　　　０形質
導入により得られた変異ヒトＰＵＫ産生クローンは、表
２に示した産生量分布を示した。ただ、９６ｗｅｌｌプ
レートの生育条件では、培地交換が完全に行えないうえ
、細胞数のばらつきも著しい。そこで、１１０／ｄ以上
産生したクローンについてスケールアップを行い、１０
ｃｍデイツシュにおける活性を比較した。

１３　１０ｃｍデインシュにおける変異ヒトＰＵＫ発現
プラスミド導入細胞の産生量分布 表２と表３を比較すると、各クローンのＰＡ活性が表３
で全体的に高くなっていることがわかる。

これより９６ｗｅ１１プレートでの状態よりも１０ｃ＋
ｎデイツシユにおりる生育条件の方が変異ヒトＰｔＪＫ
産生にとって好ましいといえる。

また、１０印デイツシユにおける変異ヒトＰＵＫ産生景
が２０１Ｕ／ｍ１以上であったクローンを９６ｗｅｌ！
の時の活性とあわせて表４に示した。ここでも、１０ｃ
ｍデイツシュにおける培養条件がより好ましいことがわ
かる。

各発現プラスミドをＣＨＯ−に１細胞に導入することに
より、１０μｇのｐ　ＨＲＯ２２の導入で８０ＩＵ／ｍ
ｆｆ１のクローンが、１００／１７ｇのｐＨＲ０２４の
導入で３４０１Ｕ／准のクローンが、１０μｇのｐＨＲ
Ｏ２７の導入で３″ＩＩＵ／ｍｌのクローンが得られた
。

〔以下余白〕

表４ １０ｃｍデイツシュ中の変異ヒ）ＰＵＫ活性クロりン名 活性（■口／　ｍｌ　） １０ｃｍデイツシュ ６ｗｅｌｌ ｐＨＲ０２２（１０）２１３ ρＩＩＲＱ２２　（１０）　１２２ ｐＨＲ０２２（１０）２５３ ｐＨＲＯ２２（１００）　２０１ ｐｌＩＲ０２２（１００）１１２ ｐＨＲ０２２（１００）２１１ ｐｌＩＲ０２２（１００）６１１ ｐＨＲＯ２４（１００）　４０２ ｐＨＲＯ２４（１００）　３１１ ｐ１１Ｒ０２４（１００）４１３ ｐｌ（ＲＯ２４（１００）　４２２ ｐＨＲＯ２７（１０）　１２１ ０ （ニ）変異ヒトｐ　Ｕ　Ｋ ・　ヒトＰＵＫの　１１ ｐＨＲ２２を導入したＣｌｌ０−に、細胞（５ｅｔ２４
−ＰＵＫ産生細胞）　、ｐＨＲ２４を導入したＣｌｌ０
−に＋細胞（へ５ｎ２４−ＰＩＫ産生細胞）　、ｐｉ（
Ｒ２７を導入したＣｌｌ０−に＋細胞（Ｓｅｒ２９−ｒ
’ＵＫ産生細胞）の３種のトランスフェクタントを用い
た。

トランスフェクタントの培養上清を、亜鉛イオンを固定
化したＣｈｅｌａｔｉｎｇ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ　６Ｂ
　（ファルマシア社製）に通し、変異ヒトＰＵＫを吸着
させた。アプロチニンｌ０ＫＩＵ／ｉｆｆおよびＩＭ塩
化ナトリウム含有２０ｍＭ）リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７
，５）で洗浄後、５０ｍＭ０ｍＭイミダゾールロチニン
１０ＫＩＵ／ｄおよび１Ｍ塩化ナトリウム含有２０１ト
リス−塩酸緩衝液（ｐＨ７，５）で変異ヒトＰＵＫを溶
出した。

ヘンザくジン−セファロース６Ｂ（ファルマシア社製）
を０．５Ｍ塩化すトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（
ｐＨ６，５）で平衡化した後、上記の溶出画分をアプラ
イした。アプロチニンｌ０ＫＩＵ／ｍｆｆ１および０．
５Ｍ塩化すトリウム含有０．１　Ｍリン酸緩衝液（ｐ１
１６．５）で洗浄し、パス画分を回収した。

フォルミルーセルロファイン（ファルマシア社製）に、
尿由来ウロキナーゼ抗体を結合したものを予め、０．５
Ｍ塩化ナトリウム含有０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋６
．５）で平衡化しておき、上記バス画分をアプライし、
同緩衝液で洗浄した後に０．５　Ｍ塩化ナトリウム含有
０．２Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐｌ＋２．５　）で溶
出した。

さらにベンザミジン−セファロース６Ｂｔｌ用いて精製
を行い、バス画分を回収した。

パス画分を０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ＋６．２）で透
析した。

比活性は３種の変異ヒトＰ　Ｕ　Ｋ　（Ｓｅｒ２４−Ｐ
ＵＫ、八５ｎ２４−ＰＵＫ　、　５ｅｒ２９−Ｐ［ＩＫ
　）ともに１５万ＩＵ／■蛋白（プラスミン処理時）で
あった。

・−ヒ　ＰｔＪＫの　　゛ （ｉ）分子量 Ｌａｅｍｍｌ　ｉ　の方法（Ｎａｔｕｒｅ、　２２７　
ｐ６８０−　（１９７０）に基づき、以下の条件で泳動
５ＤＳ−ＰＡＧＥ　（ＳＤＳ−ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍ
ｉｄｅ　Ｂｅｔ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）を
行った。

１８０−３５０１　Ｕの各種変異ヒＩ−Ｐ　Ｕ　Ｋを２
％２ｍｅｒｃａｐｔｏｅｔｈａｎｏ１．２％ＳＤＳ、１
０％ｇｌｙｃｃｌｉｎ　　。

５０ｍＭ　　　Ｔｒ　　ｉ　　ｓ　　−ＨＣｌ　　（ｐ
Ｈ６，８）　　の還元ン容？Ｐｊ。

中１００°Ｃで１０分間煮沸後、１０〜２０％のグラジ
ェントゲル（第−化学薬品製）に重層し、３０ｍＡの定
電流で２時間泳動した。なお、分子量マーカーは低分子
量マーカー（ｐｈｏｓｐｈｏｒｙｌａｓｅ　＋１９４０
００ｂｏｖｉｎｅ　ｓｅｒｕｍ　ａｌｂｕｍｉｎ　６７
０００　　ｏｖａｌｕｂｍｉｎ　４３０００ｃａｒｂｏ
ｎｉｃ　ａｎｈｙｄｒａｓｅ　３００００＋　ｔｒｙｐ
ｓｉｎ　１ｎｈｉｂｉｔｏｒ２０１００、　αｌａｃｔ
ａｌｂｕｍｉｎ　１４４００．、ファルマシア社製）を
使用した。

ゲル上のバンドはＣｏｏｍａｓｓｉｅ　Ｂｒ１ｌｌｉａ
ｎｔ　Ｂｌｕｅ　Ｒ２５０で染色した。

その結果、５ｅｒ２４−ＰＵＫ　、八５ｎ２４−ＰＵＫ
では５０ＫＤおよび５２ＫＤの２本のバンドが認められ
、５ｅｒ２９−ＰＵＫでは５０ＫＤ付近にスメア状のハ
ンドが認められた。

また、３種の変異ヒＩ−Ｐ　Ｕ　Ｋとも、還元条件下１
ｊ および非還元条件下でハンドの移動は認められず、−本
領の分子構造を有することが判明した。

（ｉｔ）酵素動力学的検討 材料と方法 試薬類 Ｇｌｔ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−ＭＣＡ（以下ＭＣＡと略す。

）、７ａｍｉｎｏ−４−ｍｅｔｈｙｌ−Ｃｏｕｍａｒｉ
ｎ　（以下ＡＭＣと略す。）はペプチド研究所より購入
した。ＵＫ標準品、ｐｌａｓｍｉｎは■ξトリ＋字社製
を用いた。

初期反応速度の測定 以下に方法の概略を示した。

２００ｔｔｌ／ｍＱの変異ヒトＰＵＫ１００μｆｆと０
、．２　ＣＵ　／　ｍｌのプラスミン１００μｌとを混
合。

↓ ３７°Ｃで１０分間インキュベー１・。

↓ 前もって３７°Ｃに加温した１、０．０．５．０．２５
．０．１２５、０．０６２５　ｍＭのＭＣＡ溶液０．８
　ｍｌを添加。

↓ ３７°Ｃで３分間インキュベート。

４ ↓ １５％酢酸溶液を２ｍｆｌ添加。（反応停止）↓ 螢光強度測定。１０μＭのＡＭＣの螢光強度を１００と
し、酵素反応により生成したＡＭＣの濃度を算出した。

Ｋｍ値とＫｃａｔ値の導出 Ｌｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　ｐｌｏｔ法（Ｓｅｇ
ｅｉ、　１．　Ｈ，（１９７６）Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａ
ｌ　Ｃａ１ｃｕｌａｔｉｏｎｓ、　２ｎｄ　ｅｄ、Ｊｏ
ｈｎ　Ｗｉｌｅｙ＆　５ｏｎｓ、　Ｉｎｃ、、　Ｎｅｗ
　Ｙｏｒｋ、）によりＫｍ値と、■、ｌ、ｌＸ値を導出
した。ＵＫのＩＩＵは、１．３３Ｘ１０−７μｍｏｌｅ
に相当するから、Ｋｃａｔは下記の式に代入して算出し
た。

結果 各変異しＩ−ＰＵＫの酵素動力学定数を下表に示した。

Ｃ以下余白〕 表５ 変異ヒ１−ＰＵＫの酵素動力学定数 表中の数値は、平均信士標準偏差。ｎ−ＰＵＫについて
は１回、その他の変異ヒトＰＵＫについては２回測定し
た。

上表に示したように、各変異ヒトＰＵＫの酵素動力学定
数に顕著な差はなかった。

（ｉｉｉ）血中半減期 実験方法 １）投与動物 ラットはウィスター系雄性ラット（６週令）を使用した
。

２）投与製剤 ａ）　ｎ−ＰＵＫ　（天然）ｌ（ＫＧ細胞由来天然型Ｐ
ＵＫｂ）　ｎ−ＰＵＫ　（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ）、
組換Ｃｌｌ０−に＋細胞により産生されたＩ’ＵＫ Ｃ）ΔＥ＋ＥＪｉ−ＰＵＫ、　ＥＧＦ全領域除去ｍ−Ｐ
ＩＩＫｄ）Ｓｅｒ２４−ＰＬＩＫ、　ＰＵＫのＴｙｒ２
４をＳｅｒに変換しＡｓｎ２２にＩｌ！鎖が付加した変
異ＰＵＫ ｅ）Ａｓｎ２４−ＰＵＫ、　ＰＵＫのＴｙｒ２４を八ｓ
ｎに変換しＡｓｎ２４に糖鎖が付加した変異ＰＩＩＫ ｆ）Ｓｅｒ２９−１’ＵＫ、　ＰＵＫのｌｌ１ｓ２９を
Ｓｅｒに変換し八５ｎ２７に糖鎖が付加した変異ＰＵＫ ３）”Ｉ−ＰＰＡ調製法 上記５薬剤をＩａｃｔｏｐｅｒｏｘｉｄａｓｅ　ｌＥｎ
ｚｙｍｏｂｅａｄｓ　（Ｂ１０−ＲＡＤ）法により　＋
２５１で標識した。得られた”５Ｔ−ＰＵＫの放射化学
的比活性は２８０ｎｍでの吸光度から求めた蛋白含量お
よび放射活性より算出した。各薬剤の比活性は１１００
０〜５６０００ｃｐｍ／ＩＵであった。

４）投与量および投与方法 投与液は各薬剤共非標識の薬剤で２Ｘ１０’　　ＩＵ／
ｍｌ（ヒトアルブミン濃度＝５％）に調製し、尾静脈よ
り投与した。投与容量は１　ｍｌ　／　ｋｇとした。

７ ５）採血法 動物をケクラール（三共）３５■／　ｋｇ　ｉ　、　ｍ
、と、ウレタン（牛丼化学）　１．５　ｇ／ｋｇ　ｉ、
ｍ、の併用で麻酔し、背位に固定した。左頚動脈に３．
８％クエン酸す］・リウム水溶液（チトラート、■ごト
リ＋字）を満たしたアトム静脈カテーテル（３Ｆｒ）を
挿入した。薬物投与１．２．３．５．７．１Ｏ１１５，
２０分後にチトラート３０μｌを入れたＪＭ　Ｓ　１　
ｍｌディスポーザブル・シリンジで３３０μｉの目盛り
まで（血液３００μｌ）採血した。シリンジ内で混和後
金血の放射活性をｒ−カウンターで測定した。全血の放
射活性測定後、３０００ｒｐｍで１０分間遠心して得ら
れた血漿を１００μ乏採取し、ドライアイス上で急速に
凍結し、フィブリン溶解活性を測定するまで、−２０°
Ｃで保存した。

６）血漿中の放射活性の測定 γ−カウンター（ＣＯＭＰ［ＩＧＡＭＭＡ　１２８２型
、ＬＫＢＷＡＬＬＡＣ）で測定した。

７）血中濃度推移の解析 血中放射活性は％ｏｆ　ｄｏｓｅとして算出した。血８ 中半減期は、市販のソフトにより算出した。

実験結果 血中半減期の結果は表６に示した。今回新たにスクリー
ニングされた変異ヒトＰＵＫの放射活性からみた血中半
減期はｎ−ＰＵＫと比較して２〜３倍延長し有意な差を
認めた。

表６　　Ｔ　　Ｉ／２　　α　　　　（単位：分）各値
は平均値上Ｓ、Ｄ、　（ｎ・８）である。

すべての変異ヒトＰＵＫグループのＴ１／２αはｎ−Ｐ
ＵＫグループ（ｐ＜０．０５）のＴｌ／２αと較べて著
しい差を示した。ＬＥｚＥ＋−ＰＵＫグループ以外のす
べての変異ヒ）ＰＵＫグループのＴ１／２αには、ΔＥ
＋ＥｚＥ、３−ＰＵＫグループのＴ１／２αと比較して
顕著な差はみられなかった。

［作用・効果］ 本発明により、ＥＧＦドメイン、特にその第２ループに
アミノ酸配列（１）を有するように改変された変異ヒト
ＰＵＫは、その代謝過程において動物細胞内でＩＪ！鎖
が修飾結合され、かくして肝細胞上のレセプターとの相
互作用を阻害し、血中半減期（肝細胞による取り込み）
を左右する（増加させる）。また、当該変異ヒトＰＵＫ
における構造変化は微小であると考えられ、その結果フ
ィブリンとの親和性が維持されると期待される。

本発明により、ＵＫの前駆体型の生理的意義を有した変
異し）ＰＵＫを提供可能にし、しかも該変異ヒトＰＵＫ
は、既知ヒトＰＵＫ、ウロキナーゼに比してより有意に
長い、またＥＣＦ全領域欠失変異ヒ）ＰＵＫに比して同
程度の、血中半減期を有することを可能にするものであ
る。

１ このため本発明は、より理想的な線維素溶解酵素を提供
するものであり、医療分野への大きな効果が期待される
。

【図面の簡単な説明】

図１はｐＨＲ２１〜２７の調製工程を示す。 図２はｐＵＨ１〜４、および７の調製工程を示す。 図３は天然型ヒ）ＰＵＫのアミノ酸配列およびＤＮＡ配
列を示す。 図４は天然型ヒトＰＵＫをコードするＤＮＡ配列を担持
するプラスミドｐｓＶ−Ｇ＋　−ｐ　ｒ　ｅＵＫの制限
酵素地図を示す。 図５はプラスくドｐｓＶ−Ｇ、　−Ｎｅｏの制限酵素地
図を示す。 ２ Ｉｌ￥］　ｌ　（２） ＢａｍＨよ りａｍＨＩ 圃 ＳＶ４０　Ｅ／Ｐ ａｍＨＩ （１）から５危く ↓ 仁上ａ工 図２　（１） ら３ 図２（３） 特開平３ ８７１８０　（１９） 戸き 第４図 第５図 ｓｖ−４０Ａｒｎ）

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒトプロウロキナーゼのエピダーマルグロースフ
   アクター（ｅｐｉｄｅｒｍａｌｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏ
   ｒ、ＥＧＦと略記）ドメイン（ｄｏｍａｉｎ）中に、式
   Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（ I ） （式中、Ｘは任意の１個のアミノ酸残基を表し、ＹはＳ
   ｅｒ又はＴｈｒを表す） で表されるアミノ酸配列（ I ）を持つように改変され
   た変異ヒトプロウロキナーゼ。
2. （２）アミノ酸配列（ I ）がＥＧＦドメインの第２ル
   ープに存在することを特徴とする請求項１記載の変異ヒ
   トプロウロキナーゼ。
3. （３）請求項１または２記載の変異ヒトプロウロキナー
   ゼをコードするＤＮＡ配列。
4. （４）請求項３記載のＤＮＡ配列が組み込まれたプラス
   ミド。
5. （５）請求項４記載のプラスミドによって形質転換され
   た宿主。
6. （６）宿主が動物細胞である請求項５記載の宿主。
7. （７）ヒトプロウロキナーゼのＥＧＦドメイン中に、式 Ａｓｎ−Ｘ−Ｙ（ I ） （式中、Ｘは任意の１個のアミノ酸残基を表し、ＹはＳ
   ｅｒ又はＴｈｒを表す） で表されるアミノ酸配列（ I ）を持つように改変され
   た変異ヒトプロウロキナーゼをコードするＤＮＡ配列が
   組み込まれたプラスミドによって形質転換された宿主を
   発現させることからなる変異ヒトプロウロキナーゼの製
   造方法。