FI89723C - Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell - Google Patents
Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell Download PDFInfo
- Publication number
- FI89723C FI89723C FI853761A FI853761A FI89723C FI 89723 C FI89723 C FI 89723C FI 853761 A FI853761 A FI 853761A FI 853761 A FI853761 A FI 853761A FI 89723 C FI89723 C FI 89723C
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- tpa
- utpa
- recombinant dna
- dna
- cdna
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 22
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 title claims description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 5
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 title claims 8
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 title claims 8
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 title claims 8
- 230000009466 transformation Effects 0.000 title description 8
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 35
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 11
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 11
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 9
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 6
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 6
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 5
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 5
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 5
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 5
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 4
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 4
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 abstract description 46
- 229920006345 thermoplastic polyamide Polymers 0.000 description 45
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 38
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 28
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 28
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 27
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 24
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 21
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 21
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 20
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 15
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 14
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 13
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 11
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 11
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 11
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 10
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 10
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 10
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 10
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 10
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 10
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 10
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 9
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 8
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 7
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 6
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 6
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 6
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 6
- 101150010939 tpa gene Proteins 0.000 description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 description 6
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 4
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 4
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 3
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 3
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 3
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 3
- ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M potassium thiocyanate Chemical compound [K+].[S-]C#N ZNNZYHKDIALBAK-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 208000034454 F12-related hereditary angioedema with normal C1Inh Diseases 0.000 description 2
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 2
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 2
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- -1 Nucleotide triphosphates Chemical class 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N Reactive blue 2 Chemical compound C1=2C(=O)C3=CC=CC=C3C(=O)C=2C(N)=C(S(O)(=O)=O)C=C1NC(C=C1S(O)(=O)=O)=CC=C1NC(N=1)=NC(Cl)=NC=1NC1=CC=CC(S(O)(=O)=O)=C1 JQYMGXZJTCOARG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 2
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000016861 hereditary angioedema type 3 Diseases 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101150026150 mt gene Proteins 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 229940012957 plasmin Drugs 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 2
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 2
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 2
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 2
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 2
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 2
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000010567 DNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010063113 DNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 108010076551 DNA polymerase C Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- 108010092160 Dactinomycin Proteins 0.000 description 1
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000009024 Epidermal Growth Factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000605403 Homo sapiens Plasminogen Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108091026898 Leader sequence (mRNA) Proteins 0.000 description 1
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 239000007990 PIPES buffer Substances 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 241000364057 Peoria Species 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 229920002584 Polyethylene Glycol 6000 Polymers 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 1
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010023197 Streptokinase Proteins 0.000 description 1
- 101150006914 TRP1 gene Proteins 0.000 description 1
- 108091036066 Three prime untranslated region Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 1
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 229930183665 actinomycin Natural products 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003024 amidolytic effect Effects 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N ammonium thiocyanate Chemical compound [NH4+].[S-]C#N SOIFLUNRINLCBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 210000001367 artery Anatomy 0.000 description 1
- 125000000613 asparagine group Chemical group N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 239000012455 biphasic mixture Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 238000004182 chemical digestion Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 1
- 108091036078 conserved sequence Proteins 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005546 dideoxynucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M dimethylarsinate Chemical compound C[As](C)([O-])=O OGGXGZAMXPVRFZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N dipyridamole Chemical compound C=12N=C(N(CCO)CCO)N=C(N3CCCCC3)C2=NC(N(CCO)CCO)=NC=1N1CCCCC1 IZEKFCXSFNUWAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 230000003278 mimic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 231100000219 mutagenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003505 mutagenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 208000010125 myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 125000004433 nitrogen atom Chemical group N* 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 1
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 1
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 1
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 1
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 229960005202 streptokinase Drugs 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 1
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 1
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 1
- 208000019553 vascular disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 230000003462 zymogenic effect Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6456—Plasminogen activators
- C12N9/6459—Plasminogen activators t-plasminogen activator (3.4.21.68), i.e. tPA
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/80—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi
- C12N15/81—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for fungi for yeasts
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21069—Protein C activated (3.4.21.69)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2795/00—Bacteriophages
- C12N2795/00011—Details
- C12N2795/14011—Details ssDNA Bacteriophages
- C12N2795/14111—Inoviridae
- C12N2795/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2795/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/001—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination
- C12N2830/002—Vector systems having a special element relevant for transcription controllable enhancer/promoter combination inducible enhancer/promoter combination, e.g. hypoxia, iron, transcription factor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/70—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi
- C12N2830/702—Vector systems having a special element relevant for transcription from fungi yeast
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/80—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates
- C12N2830/85—Vector systems having a special element relevant for transcription from vertebrates mammalian
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Control Of Ac Motors In General (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
39723
Menetelmä kudosplasminogeeniaktivaattorin valmistamiseksi, sitä koodaava yhdistelmä-DNA ja transformanttisoluja Tämä keksintö koskee yhdistelmä-DNA-molekyyliä, 5 menetelmää ihmisen kohtukudoksen plasminogeeniaktivaatto-riproteiinin (uTPA) valmistamiseksi yhdistelmä-DNA-teknii-kalla sekä menetelmässä käytettyä transformanttisolua.
Rijken et ai. Biochim. Biophys. Acta 580, (1979) 140 kuvaavat uTPA:n, yksiketjuisen tsymogeenisen, veren 10 plasmiinilla kaksiketjuiseksi aktivoituvan, fibriinihyyty-miä liuottamaan pystyvän entsyymin osittaista puhdistamista. uTPA on siten epäilemättä hyödyllinen terapeuttisena tuotteena liuottamaan hyytymiä potilaissa, jotka kärsivät erilaisista verisuonisairauksista, erityisesti sydänlihak-15 sen infarkteista, joista on seurauksena hyytymiä sydämen sisällä ja sen ympärillä.
Yhdistelmä-DNA-tekniikkaa on aiemmin käytetty mRNA:n valmistamiseen syöpäsolulinjasta (Bowesin melanoo-masoluista) ja mRNAsta on käytetty Bowesin TPA:ta koodaa-20 van cDNAsn valmistamiseen Goeddelin et ai. EP-hakemuksessa 0093619 kuvaamalla tavalla.
Keksinnön yleisenä ominaispiirteenä on aktiivia ihmisen kohdun TPA:ta koodaava cDNA-sekvenssi.
Esitellään edelleen replikoituva ekspressiovektori, 25 joka pystyy transformoidussa isäntäsolussa ilmentämään aktiivia ihmisen kohdun TPA:ta koodaavan DNA-sekvenssin, ja vektorilla transformoitu isäntäsolu, esim. hiiva- tai ni-: säkässolu.
Transformoitua soluviljelmää käytetään tuottamaan 30 uTPAsta, joka ei sisällä muita ei-ihmisperäisiä proteiineja, ja joka voidaan puhdistaa 97 paino-%rsesti vapaaksi muista ei-uTPA-proteiineista.
uTPA puhdistetaan nisäkässolujen viljelyalustasta, tai hiivan kyseessä ollen solumateriaaliuutteesta menetel-35 mällä, jonka ensimmäisenä vaiheena valinnaisesti on neste- 89723 2 neste-uutto, jolla poistetaan osa alustan ei-uTPA-proteii-neista ja saadaan tuote, jonka spesifinen uTPA-aktiivisuus on kasvanut.
Neste-neste-uutto tehdään sekoittamalla viljely-5 alusta tai uute kahden erilaisen vesiliukoisen polymeeri-yhdisteen kanssa, jolloin muodostuu kaksifaasinen seos, jossa vähintään 65 paino-% uTPAssta on toisessa faasissa ja vähintään 40 tilavuus-% alustan tai uutteen vedestä on toisessa faasissa. Puhdistus- ja konsentrointivaiheina 10 voivat olla myös ultrasuodatus ja/tai hydrofobinen affini-teettikromatografia. On edullista, jos menetelmään kuuluu vielä affiniteettikromatografiavaihe, jossa uTPA sidotaan anti-uTPA-vasta-aineeseen.
uTPAsta koodaavat ekspressiovektorit, jotka geenin 15 alkuperästä (normaali ihmisen kohtukudos) johtuen jäljittelevät uTPArn normaalia biosynteesiä ihmisissä (glykosy-laatioreaktiot mahdollisesti mukaan lukien eukaryoottisia isäntäsoluja käytettäessä), joten proteiinituote käyttäytyy luonnollisella tavalla ihmispotilaissa.
20 Lisäksi esitetään eukaryoottisoluissa tuotettuja osittain tai ei lainkaan glykosyloituja TPA-molekyylejä; näiden modifioitujen TPA-molekyylien etuna on pitempi puoliintumisaika .
Keksinnön mukaisille tuotteille ja menetelmille on 25 tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa esitetään.
Seuraavassa kuvataan keksinnön edulliset suoritusmuodot. Piirroksissa:
Kuvio 1 on ihmisen kohdun TPA-geenin ja sen reuna-alueiden emäsjärjestyksen kaavamainen esitys; kohdun TPA-30 geenin ja Bowesin melanoomasolujen TPA-geenin väliset erot on osoitettu.
Kuvio 2 on täydellisen uTPArn cDNA-sekvenssin konstruoinnin kaavamainen esitys.
Kuvio 3 on keksinnön mukaisen hiivan (Saccharomyces 35 cerevisiae) ekspressiovektorin kaavamainen esitys.
3 89723
Kuvio 4 on toisen keksinnön mukaisen hiivan eks-pressiovektorin kaavamainen esitys.
Kuvio 5 on nisäkkään ekspressiovektorin konstruoinnin kaavamainen esitys.
5 Kuvio 6 on toisen nisäkkään ekspressiovektorin kaa vamainen esitys.
Kuvio 7 on kolmannen nisäkkään ekspressiovektorin kaavamainen esitys.
Kuvio 8 on ihmisen kohdun TPA-geenin emäsjärjestyk-10 sen kaavamainen esitys, josta N-glykosylaatiokohdat ilmenevät .
Ihmisen kohdun TPA:n cDNA:n synteesi
Ihmisen kohdun TPA:ta koodaava cDNA valmistettiin ja kloonattiin seuraavien päävaiheiden mukaisesti: 15 1) kokonais-mRNA eristettiin ihmisen kohtukudoksesta; 2) uTPA-mRNA rikastettiin kokonais-mRNA:sta; 3) cDNA:n 3'- ja 5'-sekvenssit syntetisoitiin TPA-mRNA:sta; 4) cDNA:n 3'- ja 5'-sekvenssit yhdistettiin täydelliseksi 20 cDNA-sekvenssiksi välittävässä plasmidivektorissa.
uTPA-mRNA:n eristys mRNA eristettiin ihmisen kohtukudoksesta seuraavasti. Noin 30 g ihmisen kohtukudosta 40 ml:ssa guanidiini-tiosyanaattiliuosta sisältäen 4 M guanidiinitiosyanaattia, : 25 IM 2-merkaptoetanolia, 50 mM natriumasetaattia (pH 5,0) ja 1 mM EDTA:ta jauhettiin kudoshomogenisaattorissa. Sitten lisättiin 1 g CsCl:a ml:aan homogenaattia ja homoge-naattia sentrifugoitiin kierrosnopeudella 3000 min-1 10 minuutin ajan. Supernatantti laskettiin kerroksena 15 30 ml:aan "CsCl-vaimenninta", joka sisälsi 50 mM natriumase-taattia (pH 5,0), 1 mM EDTA:ta, ja 1,592 g CsCl:a ml:ssa liuotinta 50 ml putkissa ja seosta sentrifugoitiin kierrosnopeudella 45 000 min-1 20 °C:ssa 24 h ajan. RNA:n sisältävä valkoinen kerros kerättiin, CsCl-liuos laimennet- ‘ 35 tiin kolminkertaiseksi vedellä ja RNA saostettiin lisää- 4 8 9 723 mällä kaksi tilavuutta etanolia -20 °C:ssa. Saostuma kerättiin sentrifugoimalla. CsCl-kontaminaatio poistettiin toistamalla liuotus- ja saostusvaihe. Noin 11 mg puhdistettua RNA:ta saatiin talteen.
5 Puhdistettu RNA pantiin affiniteettikolonniin, joka
sisälsi 1 ml oligo-dT-selluloosaa väkevässä suolapuskuris-sa [10 M Tris-puskuria (pH 8,0), 0,5 M NaCl:a ja 0,2 % natriumdodekyylisulfaattia] ja konsentroitiin etanolisaos-tuksella ja saatiin 300 μg konsentroitua RNArta. RNA liuo-10 tettiin 200 μΐ^αη liuosta, jossa oli 0,1 M Tris-HCl:a (pH
7,5), 1 mM EDTAsta, 1 % natriumdodekyylisulfaattia ja 50 % formamidia, SW41-putkissa. Putkia sentrifugoitiin kierros-nopeudella 35 000 min"1 15 °C:ssa 16 tunnin ajan. Fraktiot kerättiin ja RNA:n koko kussakin fraktiossa määritettiin 15 sisäisillä 3H-leimatuilla 4S-, 18S- ja 28S-markkereilla.
TPA-mRNA:ta sisältävät fraktiot identifioitiin Northern blotting -analyysillä käyttäen 3JP-leimattua koe-tinta ja yhdistettiin. mRNA kerättiin talteen gradientista laimentamalla yhtä suurella tilavuudella 0,4 M NaOAc-liu-20 osta (pH 5) ja saostettiin etanolilla 2,5 kertaa laimennettua gradienttiliuosta suuremmassa tilavuudessa. Talteen kerättyä RNA:ta vielä kontaminoiva formamidi poistettiin toistamalla liuotus ja saostus.
uTPA:n cDNAtn 3'-sekvenssin valmistaminen 25 uTPA:n cDNAsn ensimmäinen säie valmistettiin eris tetystä RNA:sta seuraavasti. Kokonaistilavuudeltaan 50 μΐ liuoksessa, joka sisälsi 50 mM Tris-HCl:a pH 8,3, 50 mM KC1, 8 mM MgCl2, 1 mM dATP:ta, dCTP:tä, dGTP:tä ja dTTP:tä kutakin, 25 μς/ιηΐ oligo-dT12_18:a, 50 μg/ml aktinomysiini - 30 D:tä, 30 mM 2-merkaptoetanolia, 0,5 mCi/ml dCTP:tä, 50 yksikköä RNasiinia ja 40 yksikköä AMV-käänteiskopioijaent-syymiä, RNA:ta inkuboitiin 37 °C:ssa 1 tunnin ajan ja reaktio pysäytettiin lisäämällä 20 mM EDTA:ta. Reaktioseos pantiin sen jälkeen Sephadex G-100-kolonniin, joka oli 35 tasapainotettu 10 mM:lla Tris-HCl:a (pH 8,0), 1 mM:lla 5 89723 EDTAsta ja 0,1 %:lla natriumdodekyylisulfaattia ja esikro-matografoitu 50 μς:1ΐ3 E. colin tRNArta.
mRNA-cDNA-hybridin sisältävät fraktiot yhdistettiin ja saostettiin etanolilisäyksellä. Talteen kerättyä hybri-5 diä käsiteltiin 0,5 N NaOHtlla 37 °C:ssa usean tunnin ajan, neutraloitiin jääetikalla ja saostettiin etanolilla.
Nukleotiditrifosfaatit poistettiin saostamalla väkevällä suola-etanoliliuoksella seuraavasti. DNA liuotettiin ensin 20:stä 50:een μ1:33η vettä ja yhtä suuri tila-10 vuus 4 M ammoniumasetaattia lisättiin. Sitten lisättiin kaksi tilavuutta etanolia ja liuosta pidettiin -70 °C:ssa yli yön. Liuoksen annettiin lämmetä huoneen lämpötilaan ja sentrifugoitiin DNA:n pelletoimiseksi. Tämä menettely toistettiin vielä kaksi kertaa ja pelletti pestiin sitten 15 kerran 70 %:isella etanolilla, jolloin saatiin suurta osaa TPA-geenin 3'-päätä vastaavan cDNAsn puhdas ensimmäinen säie.
cDNAsn ensimmäistä säiettä käytettiin cDNA:n toisen säikeen synteesissä kokonaistilavuudeltaan 100 μ1:η liuok-20 sessa, joka sisälsi 50 mM HEPES-puskuria (pH 6,9), 10 mM MgCl2:a, 2 mM DTT:tä, 70 mM KCl:a, 0,5 mM dATP:tä, dCTPstä, dGTP:tä ja dTTP:tä kutakin. Seokseen lisättiin 20 yksikköä DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia 15 °C:ssa 20 tunnin kuluessa. DNA uutettiin fenolin ja kloroformin seoksella 25 (1:1, v/v) ja saostettiin etanolilla.
Kaksisäikeistä cDNA:ta käsiteltiin Sl-nukleaasilla hiusneularakenteiden poistamiseksi 100 μ1:η kokonaistilavuudessa, joka sisälsi 30 mM NaOAcra (pH 4,5), 0,3 M
NaCl:a, 4,5 mM ZnClsa ja 50 yksikköä Sl-nukleaasia huoneen - 30 lämpötilassa 30 minuutin ajan. Reaktio pysäytettiin lisää mällä EDTA:ta ja 1 M Tris-HCl:a, pH 8,0, loppukonsentraa-tioihin 10 mM ja 0,1 M, vastaavasti. DNA puhdistettiin fenoli-kloroformi-uutolla ja toistamalla etanolisaostus väkevässä suolaliuoksessa edellä kuvattuun tapaan.
35 Puhdistettu kaksisäikeinen cDNA-sekvenssi kloonat- 6 S 9 7 2 3 tiin seuraavasti. Kaksisäikeinen cDNA hännitettiin ensin oligo-dC:llä 100 μ1:η reaktiotilavuudessa, joka sisälsi 60 mM kakodylaattia, 0,14 M Tris-puskuria (pH 7,6), 1 mM di-tiotreitolia, 0,1 mM dCTP:tä ja 0,2 uCi/μΙ (3H)dCTP:tä.
5 Kymmenen mM CoCl2:a lisättiin viimeiseksi loppukonsentraa-tioon 1 mM ja 50 yksikköä terminaalista deoksitransferaasia lisättiin 15 °C:ssa 10 minuutin aikana. Reaktio pysäytettiin lisäämällä EDTAita 10 mM:n ja natriumdodekyy-lisulfaattia 0,1 %:n loppukonsentraatioon ja seos laimen-10 nettiin kaksinkertaiseksi vedellä. Reaktioseos pantiin sitten agaroosigeelielektroforeesiin ja 500 ep:n tai sitä pidemmät cDNA-fragmentit kerättiin geelistä talteen.
Oligo-dC-häntäinen cDNA liitettiin oligo-dG-häntäi-seen Pstlillä linearisoituun pBR322-DNA:hän, 0,5 ml:n ko-15 konaistilavuudessa, joka sisälsi 15 mM Tris-HCl:a (pH
7,5), 150 mM NaClsa ja 1 mM EDTA:ta, 10 minuutin käsittelyllä 65 °C:ssa, sitten 2 tunnin käsittelyllä 42 °C:ssa. Yhdistettyä DNA:ta käytettiin transformoimaan 2,5 ml kompetentteja E. coli (MC1061) -soluja, joita oli esikäsitel-20 ty CaCl2:lla ja pidetty jäädytettyinä. Solujen ja DNA:n seosta pidettiin jäissä 20 minuutin ajan, lämpöshokattiin 7 minuuttia 37 °C:ssa, inkuboitiin sitten 20 tilavuudessa L-lientä 37 °C:ssa 45 minuuttia ja siirrettiin 15 μg/ml tetrasykliiniä sisältäville L-maljoille.
25 Yhdistelmäkloonit siirrettiin nitroselluloosasuoti- mille ja yksi erä suotimia pantiin tetrasykliinimaljoille elävien kloonien varastoksi. Toinen yhdistelmäkloonien replikaatteja sisältävä suodinerä pantiin kloramfenikoli-maljoille 37 °C:seen yön ajaksi plasmidiamplifikaatiota 30 varten. Suotimia käsiteltiin DNA:n saamiseksi esiin. Suotimia esihybridisoitiin 50 % formamidia, 3XSSC:tä, 5X Den-hart'sia, 0,1 % natriumdodekyylisulfaattia ja 100 μg/ml E. colin tRNA:ta sisältävässä liuoksessa 42 °C:ssa 2 tunnin ajan tai kauemmin. TPA:n cDNA-sekvenssin sisältävä 32P-lei-35 mattu koetin lisättiin esihybridisaatioliuokseen ja sen 7 n o n o 7
O ? / z O
annettiin hybridisoitua suotimilla olevan DNA:n kanssa 42 °C:ssa 18 tunnin ajan tai kauemmin. Suotimia pestiin sitten neljä kertaa 3XSSC:ssä, 0,1 %:isessa SDSissä 65 °C:ssa 30 minuutin ajan ja vielä kerran 3XSSC:ssä huoneen 5 lämpötilassa 30 minuutin ajan. Suotimet kuivattiin ilmassa ja asetettiin sitten vahvistussuodattimella varustetulle Kodak XAR-5-röntgenfilmille -70 °C:seen 16 tunniksi.
Kymmenen positiivisiksi oletettua kloonia eristettiin, subkloonattiin ja seulottiin uudelleen edellä kuvat-10 tua menetelmää käyttäen. Ainoastaan ne kloonit, jotka antoivat toistuvasti positiivisia signaaleja, analysoitiin pilkkomalla restriktio-endonukleaasilla. pUPA327:ksi nimetty klooni sisälsi suurimman, 2,15 ke:n cDNA-insertin.
uTPA-cDNA:n 5'-sekvenssin valmistaminen 15 Koska suurimmassakaan cDNA-kloonissa ei ollut ko
konaista uTPAsta koodaavaa sekvenssiä, seuraavaa menettelyä noudatettiin puuttuvan 5'-sekvenssin eristämiseksi. mRNA eristettiin yllä kuvatulla tavalla, paitsi että koko-valintaa ei tehty. cDNA:n ensimmäinen säie syntetisoitiin 20 sitten alukkeenlaajennusmenetelmällä seuraavasti. TPA-cDNA:n 72 ep:n Pstl-fragmentti (nukleotidit 552-624) liitettiin mRNA:hän 100 μ1:η reaktioseoksessa, joka sisälsi 80 % formamidia, 10 mM PIPES-puskuria (pH 6,4), 0,4 M
NaCl:a, 0,25 μς 72 ep:n fragmenttia ja 70 μ9 mRNA: ta. 25 Seosta lämmitettiin 85 °C:seen 5 minuutiksi ja sitä inku-boitiin 50 °C:ssa 20 tunnin ajan hybridin muodostamiseksi. DNA-RNA -hybridi kerättiin talteen laimentamalla puskuri-liuos vedellä kolminkertaiseksi ja saostamalla etanolilla -20 °C:ssa yli yön. mRNA:n liuotus ja saostus toistettiin . 30 vielä kerran kontaminaation poistamiseksi. cDNA:n ensim mäisen säikeen synteesiolosuhteet olivat samat kuin 3'-sekvenssiä syntetisoitaessa, paitsi että oligo-dT jätettiin pois.
cDNA:n toinen säie syntetoitiin käyttäen synteet-35 tistä pentadekameeriä, CTGTGAAGCAATCAT:tä DNA-polymeraasi- _ C) ,Λ Π Λ 7 8 'ί Ζ> / /5 Ι:η Klenow-fragmentin alukkeena (nukleotidit 1-15). Viisisataa ng pentadekameeria liitettiin cDNA:n ensimmäiseen säikeeseen 100 μ1:383 liuosta, joka sisälsi 50 mM HEPES-puskuria (pH 6,9), 10 mM MgCl:a ja 70 mM KCl:a 65 °C:ssa 5 5 minuutin ajan, 60 °C:sta 43 °C:seen 15 minuutin ajan, 43 °Csssa 15 minuutin ajan ja sen jälkeen seosta pidettiin jäissä ennen käyttöä. Kaksisäikeinen cDNA syntetoitiin ja kloonattiin olennaisesti 3'-sekvenssin valmistuksesta yllä annetun kuvauksen mukaan.
10 Maljaviljelyn, seulonnan ja subkloonauksen jälkeen identifioitiin pUPA432:ksi nimetty klooni, joka sisälsi puuttuvan 5'-koodaussekvenssin ja jolla oli yhteistä aluetta klooni pUPA372:n kanssa 60 ep:n verran.
Tävspituisen uTPA-cDNA;n konstruointi 15 Ennen ihmisen kohdun TPAsta koodaavan kokonaisen cDNA-kloonin valmistusta, geenin 5'- ja 3'-osat sekventoi-tiin. Tämä tehtiin analysoimalla klooni pUPA432 (5'-koo-daussekvenssi) ja pUPA372 (3'-koodaussekvenssi) käyttäen Maxam-Gilbertin kemiallisen hajotusmenetelmän ja Sangerin 20 dideoksinukleotidiketjun päätemenetelmän yhdistelmää. Tulokseksi saatu nukleotidisekvenssi on esitetty kuviossa 1.
Sen jälkeen kun geenin sekvenssi oli määritetty, täydellinen cDNA-geeni konstruoitiin kuviossa 2 esitettyyn tapaan. Plasmidia pUPA432 (5'-sekvenssi) digestoitiin en-25 sin yhdistelmällä Bgll-Bglll. 400 ep:n BglI-BglII-frag-mentti eristettiin polyakryyliamidigeelistä ja se digestoitiin edelleen Haelllslla osittain. Tulokseksi saatu BglI-HaeIII-fragmentti (nukleotidit 117-387) puhdistettiin polyakryyliamidigeelielektroforeesilla. Fragmentti Pstl-30 Narl (nukleotidit 321-448) eristettiin yhdistetyllä Pstl-ja Narl-digestiolla ja sitä seuranneella geelielektro-foreesilla. Tätä fragmenttia digestoitiin edelleen HaeIII:lla 61 ep:n Haelll-Narl-fragmentin valmistamiseksi. Sekä Bglll-Haelll- että Haelll-Narl-fragmentit kloonat-35 tiin yhdistetyllä BamHI-Narl-digestiolla linearisoituun 9 -:9723 pBR322:een. Syntyneestä, pUPA-Bglll/Narl:ksi nimetystä kloonista eristettiin Bglll-Narl-fragmentti (nukleotidit 117-448) ja suuremmat BglII-SalI-fragmentit.
Plasmidin pUPA372 Bglll-paikka nukleotidissa 2091 5 muunnettiin Sali-paikaksi digestoimalla plasmidia Bgll:llä, muodostamalla tylpät päät DNA-polymeraasi I:llä, lisäämällä Sali-kytkijöitä ja tuottamalla sitten pUPA-372-Sall kloonaamalla E. colissa. Tätä seurannut pUPA372-Sall:n pilkkominen Narl-Sall-kaksoisdigestiolla tuotti 10 Narl-Sall-fragmentin (nukleotidit 448-2091).
Seuraavaksi rakennettiin kohdun TPA:n cDNA:n joh-tosekvenssi pUPA432:sta poistamalla siitä G-C-häntä ja lisäämällä Sali-kohta. Tämä Sali-kohta lisättiin eristämällä cDNA Pstl-digesteistä, katkaisemalla 5'-kääntymättö-15 män alueen kohdalta SfaNIsllä, muodostamalla tylpät päät DNA-polymeraasi Isllä, lisäämällä Sali-kytkijä, digestoimalla Sallin ja Bglllsn yhdistelmällä ja kloonaamalla BamHI-Sall-kaksoisdigestiolla linearisoidussa pBR322-vek-torissa. Valmistettu kohdun TPA:n alkusekvenssi erotettiin 20 vektorista yhdistetyllä XhoII- ja Sall-digestiolla. Tämä
SalI-BglII-fragmentti (nukleotidit 7-117) silmukoitiin Sall-Bglll-fragmenttiin (nukleotidit 117-2091), joka oli muodostettu yhdistämällä yllä kuvatut Bglll-Narl-, Narl-Sall- ja Bglll-Sall-fragmentit.
25 Ligaation ja transformaation jälkeen täyspituinen kohdun TPA-geeni reunustavine Sall-alueineen kloonattiin pUC9-vektorissa. Tätä pUC9-uTPA-plasmidia käytettiin välittäjänä ekspressiovektorien jatkokonstruoinnissa.
Hiivan ekspressiovektorit 30 On mahdollista valmistaa sellaisia hiivan ekspres- siovektoreita, joissa hiivan promoottori- ja signaalisek-venssi edeltävät kypsää proteiinia koodaavaa uTPA-cDNA-aluetta (ja josta puuttuu uTPA:n signaalialue) tai vaihtoehtoisesti vektorissa voi olla hiivan promoottori-, mut-35 ta ei hiivan signaalialuetta, jolloin uTPA-cDNA koodaa 10 ”723 epäkypsää proteiinia, jossa TPA:n signaalialue on mukana. Toisin sanoen signaalisekvenssi voi olla peräisin joko hiivasta tai uTPAssta. Paitsi että alla kuvatut nimenomaiset vektorit ilmentävät pikemminkin aktiivista uTPA:ta 5 kuin muita proteiineja, ne valmistettiin käyttämällä samanlaisia menetelmiä kuin ne, joita Lemontt et ai. ovat kuvanneet US-patenttihakemuksissa 636 365 ja 629 202, jotka liitetään tähän viitteinä. Siksi ainoastaan vektorien rakenne esitetään, ei niiden konstruoinnin yksityiskohtia. 10 Hiivan signaalin sisältävä vektori
Viitaten kuvioon 3, hiivan ekspressiovektori pYBDT-6 koostuu seuraavista DNA-fragmenteista (alkaen ainoasta BamHI-kohdasta ja siirtyen vastapäivään):
Bam-Bglll, sisältäen hiivan PH05-promoottori- ja 15 signaalisekvenssin ja 9 emäsparia synteettistä DNA:ta, joka koodaa Gly(-6), Ala(-5), Arg(-4), kuten kuviossa 1 on esitetty, tämä fragmentti on pituudeltaan noin 0,6 ke.
Bglll-Sall, sisältäen yllä kuvatun kohtuperäisen TPAsn cDNA:n; tämä fragmentti koodaa kypsää proteiinia ja 20 sisältää lisäksi noin 0,4 ke 3'-kääntymätöntä aluetta; tämä fragmentti on noin 1,975 ke:n pituinen.
SalI-(SalI/XhoI), sisältäen TRPI-"pääte"-alueen, joka alunperin oli TRPI-geenin Hindlll-Bglll-fragmentti; tämä fragmentti on noin 0,240 ke:n pituinen.
25 (SalI/XhoI)-XhoI, sisältäen TRPI-geenin EcoRI-
Bglll-fragmentin.
XhoI-XhoI; tämä on AMPR- ja ORI-alueet sisältävä pBR322-fragmentti; tämä noin 2,1 ke:n fragmentti vastaa karkeasti pBR322-kartan aluetta kohdasta 2246 kohtaan 30 4361.
XhoI-BamHI; tämä fragmentti on 2 mikronin renkaan noin 2,2 ke:n EcoRI-fragmentti, ”B"-muotoa.
TPA-signaalin sisältävä vektori
Viitaten kuvioon 4, hiivan ekspressiovektori 35 pYBDT-10 on identtinen pYBDT-6:n kanssa kahta fragmenttia n 9 7 2 3 lukuunottamatta s 1) BamHI-Bglll-fragmentin sijasta pYBDT-10:ssä on BamHI-Sall, sisältäen PH05-promoottorialueen, johon 3'-in-sertiokohta on Sali-kytketty; tämä fragmentti on noin 0,52 5 ke pitkä.
2) Bglll-Sall-fragmentin sijasta pYBDT-10:ssä on Sali-Sali, joka sisältää epäkypsää proteiinia koodaavan kohdun TPA:n cDNA:n, signaalialue mukaan lukien.
Nisäkässolujen ekspressiovektorit 10 Hiivan ekspressiovektoreiden lisäksi voidaan tehdä nisäkässolujen ekspressiovektoreita ihmisen kohdun TPA:n valmistusta varten. Kuten hiivan ollessa kyseessä, erilaisia lisä-DNA-fragmentteja voidaan käyttää kohdun TPA: n DNA:n kopioinnin ja kääntämisen, samoin kuin isäntäsolun 15 transformaation aikaansaamiseksi.
Nyt kuvataan ne erityiset ekspressiovektorit, joita käytetään valmistettaessa ihmisen kohdun TPA:ta viljellyissä nisäkässoluissa. Kuvattuja vektoreita säilytetään E. colin kannassa RF322 ennen niiden käyttöä isäntä-nisä-20 kässolujen transformoinnissa.
Plasmidi CL2 8-uTPA-BPV
Viitaten kuvioon 5, nisäkässolun ekspressiovektori CL28-uTPA-BPV, jonka uTPA-geeni on hiiren metallotioneii-ni-(MT)promoottorin säätelyn alaisena ja jonka isäntäsolut 25 transformoituvat härän papilloomaviruksella (BPV), konst ruoidaan seuraavasti.
Kaksi lähtöplasmidia ovat pUC9-uTPA (joka sisältää TPA-geenin; kuvattu yllä) ja pCL28-Xho, pCL28:n johdannainen [kuvattu pJYmmT(E):nä Hamerin et ai. artikkelissa, J. 30 Mol. Applied Gen. 1, (1983) 273], josta SV40-DNA on poistettu ja jossa Xhol-restriktiokohta Bglll-kohdan sijasta on lähellä MT-promoottoria.
Plasmidia pUC9-uTPA digestoitiin Sali:11a ja uTPA-geenin sisältävä 2098 ep:n fragmentti insertoitiin CL28-35 Xho:n Xhol-kohtaan, jolloin muodostui pCL28-uTPA, jossa “! 0 7 0 7 12 o 'J / Zö uTPA-geeni on MT-promoottorin ja MT-rakennegeenin välissä.
Seuraavassa vaiheessa koko BPV-genomin sisältävää plasmidia pB2-2 digestoitiin BamHI:llä ja Sall:llä, jolloin saatiin koko BPV-genomin ja alueen pBR322:n DNA:sta 5 sisältävä fragmentti. Tämä fragmentti insertoitiin BamHI-ja Sall-digestiolla linearisoituun pCL28-uTPA:han, jolloin saatiin plasmidi pCL28-uTPA-BPV.
Plasmidi pBMTH-uTPA
Viitaten kuvioon 6, nisäkässolun ekspressiovektori 10 BMTH valmistettiin käyttäen yllä kuvattua CL28-uTPA:ta ja Dean Hamerilta, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, saatua pBMTHI:stä. Plasmidi pBMTHI sisältää MT-rakennegeenin ja MT-promoottorin, jota reunustaa toisella puolella 69 % BPV:n transformointialueesta ja toisella 15 puolella loput 39 % BPVsstä.
pBMTHI:n MT-geenin sisältävä HindIII-fragmentti poistettiin ja korvattiin pCL28-uTPA:n Hindlll-fragmentil-la, joka sisältää uTPA-geenin MT-geenin insertoituna, jolloin saatiin plasmidi pBMTH-uTPA.
20 Plasmidi pCAT
Viitaten kuvioon 7, plasmidi pUPA372 (kohdun TPA-cDNA-plasmidi, joka sisältää uTPA-sekvenssejä 372 ep:stä lähtien ja loppusekvenssin kuten kuviossa 1 on esitetty) katkaistiin BglII:lla ja EcoRI:llä ja liitettiin viruspe-25 räiseen Bcll:llä ja EcoRI:llä pilkottuun SV40-DNA:han. Ligaatioseos kloonattiin pBR322:n EcoRI-kohtaan, jolloin saatiin plasmidi pTPA-A.
uTPA:n kopiointisuunnan muuttamiseksi plasmidi pCL28-uTPA (kuvio 5) katkaistiin HindIII:lla ja liitettiin 30 uudelleen yhteen liuoksen DNA-konsentraation ollessa suu ri. Valikoinnin ja EcoRI ja BamHI-pilkkomisen jälkeen se-lektoitiin yhdistelmäplasmidi pCL28XTH3.
Sekä pTPA-A:ta että pCL28XTH3:a digestoitiin Smal:llä ja BamHI:llä ja liitettiin yhteen, jolloin saa-35 tiin CL28XTH3A, jossa 237 ep:n SV40-DNA-fragmentti korvaa 13 S9723 pCL28XTH3:n 1,5 ke:n metallotioneiinifragmentin. Tässä rakenteessa uTPA:n ilmentyminen riippuu MT-promoottorin käytöstä ja uTPA-geenistä alaspäin (MT-rakennegeenin tultua hävitetyksi) SV40-aikaisista poly-A-signaalisekvensseistä 5 ainoastaan.
Plasmidit pCL28XTH3A ja pB2-2 (kuvattu yllä) katkaistiin BamHIillä ja Sall:llä ja pB2-2:n BPV-DNA inser-toitiin BamHI-Sall-fragmenttina. Tulokseksi saatu rakenne on pCAT.
10 Nisäkässolujen transformointi pCL28-uTPA-BPV- eli pBMTH-uTPA-plasmidi-DNA vietiin hiiren C127-soluihin käyttäen Wiglerin et ai.
(1977), Cell 11, 223, transfektiotekniikan muunnelmaa seuraavasti .
15 5 pg DNA:ta lisättiin 0,5 ml:aan 240 mM CaCl2-liuos- ta, jossa oli 10 pg lohen maidin DNA:ta kantajana. Tämän liuoksen annettiin kuplia yhtä suureen tilavuuteen 2xHBS:ää (280 mM NaCl, 20 mM Hepes-puskuria ja 1,5 mM nat-riumfosfaattia), jonka pH oli 7,1. Kalsiumfosfaatin annet-20 tiin muodostua 30 minuutin ajan huoneen lämpötilassa ja 5 x 105 C127-solua maljattiin 24 tuntia ennen transfek-tiota. Kalsiumfosfaattisaostuman muodostuessa solujen kasvualusta vaihdettiin. Kalsiumfosfaattisaostuma lisättiin soluihin ja seosta inkuboitiin 6-8 h ajan 37 °C:ssa. DNA 25 poistettiin ja soluja käsiteltiin 20 % glyserolia sisältävällä fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella (PBS), (pH 7), 1-2 minuutin ajan huoneen lämpötilassa. Solut pestiin PBS-liuoksella ja 10 ml Dulbeccon modifioitua mediumia, joka sisälsi 10 % vasikkasikiön seerumia (MA Biologi-30 cals), penisilliiniä/streptomysiiniä ja 10 mM glutamiinia (GIBCO) lisättiin. Alusta vaihdettiin 24 h myöhemmin ja joka 3. - 4. päivä sen jälkeen. Pesäkkeitä voitiin havaita 14-21 päivän kuluttua ja ne eristettiin kloonausrengasme-netelmällä 21 päivän kuluttua. Pesäkkeet hajotettiin ana-35 lyysiä varten.
'\ -λ Π Λ 7 14 ~ ^ / Ζ
Transformoituja soluja viljeltiin konventionaalisia menetelmiä käyttäen ja uTPA korjattiin talteen jatkuvasti viljelyalustasta konventionaalisia menetelmiä käyttäen.
Transformoidut pCL28-uTPA-BPV- eli pBMTH-uTPA 5 -plasmidia sisältävät solut voivat säilyä jopa 60 päivää konfluentissa soluviljelmässä, jos alusta vaihdetaan joka 24. - 28. tunti. Solut kahdentuvat jatkuvasti pullossa tai pyörivässä pullossa ollen kasvuominaisuuksiltaan transformoitujen solujen kaltaisia. Transformoidut C127-solut, 10 jotka sisältävät pCAT-plasmidia, säilyvät soluviljelmässä lyhyemmän ajan, mutta tuottavat uTPA:ta nopeammin.
Voimakkaan, uTPA:n tuotantoa BPV-vektorissa säätelevän metallotioneiinipromoottorin (joka mahdollistaa DNA:n kopioluvun amplifikaation) ja BPVsllä transformoi-15 tujen solujen jatkuvan kasvun ominaisuuksien yhdistelmä tarjoaa optimaalisen systeemin uTPA:n tuotannon laajentamiseen.
Hiivasolujen transformaatio
Isäntä-hiivasolut (Saccharomyces cerevisiae) trans-20 formoitiin käyttäen hiivan ekspressiovektoreita tavallis ten menetelmien mukaan, yleisesti Beggs'in Nature 275 (1978) 104-109, kuvaamaan tapaan. Isäntäsoluissa on trpl-mutaatio, joka aiheuttaa tryptofaaniauksotrofian, kun taas plasmideissa on toiminnallinen TRPI-geeni. Transformantit 25 selektoidaan siten tryptofaaniprototrofeina. Transformoi tuja isäntä-hiivasoluja viljeltiin normaalilla hiivan vil-jelyalustalla käyttäen yleisesti Botsteinin ja Davisin luvussa "Principles and Practice of Recombinant DNA Research with Yeast", teoksessa "The Molecular Biology of 30 the Yeast Saccharomyces: Metabolism and Gene Expression", ss. 607-636, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY 1982, kuvaamaa menetelmää.
Sen sijaan, että isäntä-hiivasolujen transformoin-tiin käytettäisiin rengasplasmideja pYBDT-6 ja pYBDT-10, 35 nämä vektorit voidaan linearisoida ennen transformaatiota r. r *7 f'. 7 15 j / 7 Z 0 käyttäen pBR322-sekvenssin poistavaa XhoI:tä ja käyttää linearisoitua vektoria transformaatioon; rengas muotoutuu uudelleen isäntä-hiivasolussa. Tämän menettelytavan potentiaalisena etuna on kaikkien vektorin kopiolukua mahdolli-5 sesti pienentävien tai muuten uTPAsn ilmentymistä häiritsevien bakteeriperäisten sekvenssien eliminointi.
uTPA:n uutto ia puhdistus kasvualustasta
Hiivan aktiivinen kohdun TPA kerätään talteen uutteista, jotka on valmistettu hajottamalla solut mekaani-10 sesti lasihelmiä käyttäen. Yhdistelmä-nisäkässolujen tuottama aktiivinen kohdun TPA kerätään talteen isäntäsolujen viljelyalustasta. Aktiivisen uTPArn puhdistukseen solu-uutteista tai viljelyalustasta kuuluu yleisesti seuraavat vaiheet: 1) neste-neste-uutto tai alustava suodatusvaihe; 15 2) hydrofobinen affiniteettikromatografia; 3) vasta-aine- affiniteettikromatografia; ja 4) geelisuodatuskromatogra-fia. Yksityiskohtaisemmin nämä vaiheet suoritetaan seuraavasti.
Neste-neste-uutto 20 Ensimmäinen vaihe voi olla neste-neste-uutto tai, edullisemmin, alustava suodatusvaihe. Yleisesti neste-neste-uutto tehdään yhdistämällä viljelyalusta kahden vesiliukoisen polymeeriyhdisteen, esimerkiksi dekstraanin (Dextron) ja polyetyleeniglykolin kanssa, jolloin muodos-25 tuu kaksi kerrosta, joista toinen heitetään pois. (Neste-neste-uutto on tunnettu proteiiniuuttomenetelmä, jota on kuvattu esimerkiksi artikkelissa Johansson et ai., Eur. J. Biochem. 33 (1978) 379-386).
Neste-neste-uuttovaiheessa on edullista laimentaa 30 seerumitonta tai seerumia sisältävää uTPAsta 0,1 %:iin (v/v) saakka sisältävää alustaa Tween 80:llä ja lisätä sitten jauhemaista dekstraania (Dextron) ja loppukonsent-raatioon 4 % (40 g/1).
Dekstraania (Dextron) sekoitetaan, kunnes se liuke-35 nee ja sitten lisätään polyetyleeniglykoli (PEG) 6000:tta s g 7 o i 16 S 1 loppukonsentraatioon 12 % (120 g/1). Liuosta sekoitetaan hyvin ja sentrifugoidaan 200 ml:n pulloissa kierrosnopeu-della 1200 min"1 jäähdytetyssä international-tyyppisessä sentrifugissa 10 minuutin ajan faasien erottamiseksi.
5 Ylempi faasi dekantoidaan ja alempi dekstraanifaasi kerätään. Alkuperäisestä uTPA-aktiivisuudesta saadaan talteen 75 % ja alkuperäisestä proteiinimäärästä noin 40 %. Liuos konsentroituu 6-kertaisesti ja sen tilavuus pienenee yli 50 %. Neste-neste-uuttomenettely on tehokas huolimatta 10 siitä, että mukana on solujätteitä ja kompleksisia kasvutekijöitä, esimerkiksi epidermaalista kasvutekijää, trans-ferriiniä ja insuliinia, joita on usein seerumia sisältävissä kasvualustoissa.
On havaittu, että vaikka edellä kuvattua neste-nes-15 te-uuttovaihetta voidaan käyttää, voidaan myös ilmastoitu väliaine ensin selkeyttää, ennen seuraavaa hydrofobista affiniteettikromatografiavaihetta, yksinkertaisemmalla tavalla viemällä ilmastoitu väliaine 3 mikronin profiili-suotimen läpi. Saadulle kirkkaalle väliaineelle suorite-20 taan sitten, ilman konsentrointivaihetta, hydrofobinen af-finiteettikromatografiakäsittely, kuten seuraavassa esitetään.
Hydrofobinen affiniteettikromatografia Tässä vaiheessa edellä saadussa materiaalissa oleva 25 uTPA sidotaan väriaineeseen, esimerkiksi Trisacrylblue (LKB), Macrosorb Blue tai CM Affi-Gel -blue (Bio-Rad), joka pystyy sitomaan uTPAsn, mutta ei eräitä muita vilje-lyalustan proteiineja. [Affi-Gel-blue-väriainetta on käytetty erilaisessa, ihmisen neuroblastoomasolulinjasta 30 eristetyn plasminogeeniaktivaattorin puhdistusmenetelmässä (NH2 )2S04-saostuksen ja p-aminobentsaminidiini-Sepharose-kromatografiän yhteydessä; Biochim. Biophys. Acta 704 (1980) 450-460).
Tämä vaihe on edullista suorittaa seuraavasti. Jos . 35 ensimmäisessä vaiheessa suoritettiin neste-neste-uutto, 17 "9725 edellisestä vaiheesta saadun dekstraanifaasin tilavuus kaksinkertaistetaan lisäämällä vettä viskositeetin pienentämiseksi. Muuten suodatettua kirkasta väliainetta käytetään ilman laimentamista tai konsentrointia. Viisikymmentä 5 ml fosfaatilla puskuroidulla 0,1 % Tween:iä sisältävällä suolaliuoksella, pH 7,2, tasapainotettua Trisacryl blue (LKB) -matriisia lisätään litraan liuosta. Liuosta sekoitetaan varovasti 4 °C:ssa 2 tunnin ajan ja pestään sitten yhtenä eränä fosfaatilla puskuroidulla suolaliuoksella, 10 joka sisältää 0,1 % Tween:iä, pH 7,2, ja liuoksella, joka sisältää 0,5 M NaCl:a, 0,02 M fosfaattia, 0,01 % Tween:iä, pH 7,2. TPA-pitoinen materiaali kaadetaan sitten geelisuo-datuskolonniin kuormituskertoimen ollessa 50 % ja ajetaan kolonnin läpi lineaarisella nopeudella 85 cm/h. Materiaali 15 eluoidaan Tris-acryl blue-matriisista liuoksella, jossa on 3,0 M KSCN:a, 0,02 M fosfaattia, 0,01 % Tween:iä, pH 7,2.
Liuos konsentroituu tässä vaiheessa nelinkertaisesti edellisiin vaiheisiin verrattuna. Tämä uTPA:n sitominen suoraan dekstraanifaasista mahdollistaa myös nopean suola-20 konsentraation muutoksen ja puhdistaa uTPA:ta.
Yllä esitetyssä eluutiovaiheessa voidaan käyttää 3 M KSCNsn sijasta muita suoloja, esimerkiksi NaCl:a. NaCl-gradientti 0,15:stä 3,0:aan M esimerkiksi puhdistaa paremmin, mutta konsentraation kustannuksella.
25 Kuten yllä on mainittu, Trisacryl blue:n lisäksi voidaan käyttää myös muita matriiseja tässä vaiheessa. Yksi esimerkki on CM Affi-Gel blue (BioRad), joka sitoo uTPAsn yhtä hyvin ja josta uTPA eluoituu samaan tapaan kuin Trisacryl blue-matriisista.
30 Reagenssien konsentraatioita voidaan muunnella yllä esitettyjen kahden puhdistusvaiheen jokaisessa kohdassa. Neste-neste-uuttovaiheessa käytettyjä dekstraani- ja PEG-konsentraatioita voidaan esimerkiksi muuttaa niin, että uTPA-aktiivisuus siirtyy (ylempään) PEG-faasiin (alemman) 35 dekstraanifaasin sijasta; tällöin dekantoitu materiaali ib 89725 säästettäisiin ja alempi faasi heitettäisiin pois.
Affiniteettikromatografia
Seuraavana, pääasiallisena puhdistusvaiheena on kiinteään kantaja-affiniteettikromatografiakolonniin immo-5 bilisoitujen anti-TPA-vasta-aineiden käyttöön perustuva affiniteettikromatografia. Joko polyklonaalisia tai mono-klonaalisia, konventionaalisin menetelmin valmistettuja anti-TPA-vasta-aineita voidaan käyttää.
Affiniteettikromatografiavaihe on edullista tehdä 10 seuraavasti. Trisacryl-matriisista eluoitua materiaalia dialysoidaan 1,0 M NaCl:a, 0,01 % Tween:iä, 0,02 M fosfaattia sisältävää liuosta (pH 7,4) vastaan KSCN:n poistamiseksi. Materiaali steriilisuodatetaan sitten 0,22 mikronin suotimen läpi. Eluantin annetaan sitten kulkea hyvin 15 hitaasti, 4 °C:ssa kaiken eluentin sisältämän uTPA-aktii-visuuden sitomaan pystyvän monoklonaalisen anti-TPA-vasta-aine - Sepharose-matriisin yli (vasta-aine saatiin tri Keld Dano'lta, University Copenhagen, Inst. PathiAnatomy, monoklonaaliset anti-TPA-vasta-aineet on kaupallisesti 20 saatavissa, Bioscott Ltd, Scotland, tai American Diagnos-tica). Vasta-aine liitetään CNBr-aktivoituun Sepharose'en, 5 mg vasta-ainetta/ml hartsia, 100 ml:n pylväässä. Vasta-ainematriisi esitasapainotetaan liuoksessa, joka sisältää 0,1 M Tris-puskuria, 0,1 % Triton X-lOOta, pH 8,0, pestään 25 liuoksella, joka sisältää 1,0 M NaClsa, 0,1 % Triton X-100:a, 0,05 M Tris-puskuria, pH 8,0 ja eluoidaan liuoksella, joka sisältää 3,0 M NH4SCN 0,1 % Triton X-100:a, 0,05 M Tris-puskuria, pH 8,0. (Triton X-100 voidaan viimeisessä vaiheessa korvata Tween-80:lla samanlaisin tuloksin). Elu-30 ointi suoritetaan lineaarisella nopeudella 12 cm/h, jolloin saanto on yli 90 %.
Yhden ml fraktioita kerätään ja pääosa uTPA-aktii-visuudesta eluoituu ensimmäisiin 3seen 4sään kolonnitila-vuuteen.
35 uTPAsta sisältävä materiaali voidaan panna vasta- 19 S9723 aine - Sepharose-matriisiin suolakonsentraation ollessa jopa 1,5 M NaCl:a vaikuttamatta sitomistehokkuuteen. uTPA voidaan eluoida alentamalla pH:ta noin 2,5:een esimerkiksi 0,1 M glysiinillä 3 M NH2SCN:n sijasta, mutta on edullisem-5 paa käyttää NH2SCN:a, koska se mahdollistaa uTPAsn talteenoton pienemmässä tilavuudessa, koska neutralointia ei tarvita. NH2SCN pitää proteiinin lisäksi stabiloivammassa ympäristössä.
Vasta-aine -affiniteetti-vaiheen jälkeen voidaan 10 suorittaa hydrofobinen eli viimeistely-HPLC-vaihe tuotteen puhtausasteen kohottamiseksi yli 97 %:n.
Geelisuodatuskromatoqrafia Tässä vaiheessa poistetaan ne vähäiset suurimole-kyyliset epäpuhtaudet, jotka ovat immunoaffiniteettipyl-15 vään eluaatissa läsnä. Geeliaffiniteettipylväs täytetään Toyopearl TSK :11a ja eluoidaan 0,01 M fosfaatti-1,6 M NH4SCN-liuoksella ja seurataan A280 ja aktiivisuus. Huippuja vastaavat fraktiot analysoidaan edelleen geelielektrofo-reesilla, jonka jälkeen suoritetaan hopeavärjäys. Vali-20 tuille kootuille fraktioille suoritetaan Western blots-analyysi.
Puhdistuksen tarkkailu
Puhdistusta tarkkaillaan koko yllä esitetyn menettelyn ajan seuraavasti. Kunkin vaiheen fraktioista otet-25 tuja näytteitä laimennetaan liuoksella, joka sisältää 0,5 M NaCl:a, 0,01 % Tween:iä, 0,02 M fosfaattia, pH 7,4, ja niiden amidolyyttinen aktiivisuus määritetään S2251-kromo-geenisella substraatilla, joka on kytketty ihmisen plas-minogeeniaktivaattoriin fibrinogeenin mukanaollessa (ku-30 vattu artikkelissa Campbell et ai., Clin. Chem. 28 (1982) 1125-1128). dh20:lla laimennettujen näytteiden adsorbanssi 280 nm:ssa mitattiin. Puhdistusta seurataan myös ei-pel-kistävällä ja pelkistävällä SDS-polyakryyliamidigeelielek-troforeesilla.
35 Vasta-aine - Sepharose-kolonnista talteenotetussa 20 -9723 puhdistetussa uTPA:ssa on havaittavissa alle 3 %:n kontaminaatio SDS-PAGE-elektroforeesissa. Pelkistävissä olosuhteissa havaitaan jonkin verran 2-ketjuista TPA:ta (aktivoitu muoto; yksiketjuinen on edullinen muoto). 2-ketjui-5 sen yhdisteen muodostuminen voidaan estää lisäämällä Apro-tinin'ia puhdistusvaiheissa käytettyihin puskureihin.
Kohdun TPA:n ia kohdun TPA:n cDNA;n karakterisointi
Kuten yllä on mainittu, kuviossa 1 on esitetty kohdun TPAsn cDNA:n nukleotidisekvenssi cDNA:n koodaaman koh-10 dun TPA:n päätellyn aminohapposekvenssin ohella. Alustava preprosekvenssi vastaa aminohappoja -38:sta -l:een. Aminohappoja +1, -3 ja -6 edeltävät pystyviivat kuviossa 1 osoittavat katkeamiskohdat. Mahdolliset glykosylaatiokoh-dat on merkitty "CH0":lla Asn-tähteisiin. Plasmiinin kat-15 kaisukohta (josta yksiketjuinen uTPA muuntuu 2-ketjuisek-si) on osoitettu nuolella. Aktiivisessa keskuksessa sijaitseva seriiniproteaasien säilyvä sekvenssi on alleviivattu.
Kuvio 1 on esitetty yllä mainitussa Goeddelin et 20 ai. eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 0 093 619 kuvatun Bowesin melanoomasolujen ja kohdun TPA:n cDNA-nukleo-tidisekvenssien väliset erot. Kohdat, joissa Bowesin DNAssta puuttuu nukleotidi, joka on kohdun cDNA:ssa, on merkitty "X":llä. Kohdat, joissa kohdun cDNA:sta puuttuvat 25 nukleotidit ovat Bowesin DNAsssa, on osoitettu "/":llä, jota seuraavat puuttuvat nukleotidit.
Osittain ia ei lainkaan qlvkosvloidut TPAit
Keksintö koskee, kuten edellä mainittiin, yhdis-telmä-DNA:11a tuotetun ihmisen uTPAsn lisäksi ekspressio-30 vektorin koodaamia TPA-molekyylejä, jotka tuotettuina isäntänisäkässolussa, eivät ole täydellisesti glykosyloi-tuneet.
Kuten kuviossa 8 esitetään, on ihmisen luonnollinen TPA N-glykosyloitu molekyyli kolmessa asparagiiniryhmässä 35 (asemissa 120, 187 ja 451). N-atomin kautta tapahtuvan 2i -9 72 5 glykosylaation signaali on Asn-X-(Ser tai Thr). Glykosy-laation estämiseksi yhdessä tai useammassa asemassa korvataan TPA:ta koodaavan DNA-molekyylin (asparagiinia koodaa-va) AAC- tai AAT-kodoni (glutamiinia koodaavalla) CAA-ko-5 donilla näissä asemissa. Nämä mutanttikohdat (A, B ja C kuviossa 8) muodostettiin, kuten alla kuvataan tarkemmin, in vitro mutageneesilla yhteensopimattomia alukkeita TCGGTGACTGTTCCTTTGAAGTAAATGTTGT, CAACGCGCTGCTTTGCCAGTTGGT-GCA, ja vastaavasti GTAGGCTGACCCTTGGCCCAAAGTAGCA käyttäen. 10 Myös mutantit A+B, A+C ja A+B+C muodostettiin käyt täen mutantin A yksisäikeistä DNA:ta templaattina. Rekombinoivat mutantit B ja C muodostivat mutantin B+C. Näin kaikki seitsemän mahdollista yhdistelmää ei lainkaan tai osittain glykolysoiduista ihmisen TPA-mutanteista on muo-15 dostettu.
Paikkaspesifinen mutageneesi
In vitro paikkaspesifinen mutageneesi suoritettiin käyttäen muunnelmaa Smith et ai.'in, Gene 8 (1979) 81-87, 99-106, kuvaamasta menetelmästä, kuten seuraavassa esite-20 tään.
Edellä kuvatut yhteensopimattomat oligonukleotidi-alukkeet valmistettiin Applied Biosystems automated synt-hesizer-laitteessa tavanomaisia menetelmiä käyttäen.
Ihmisen uTPAsta koodaava DNA kloonattiin faagiin 25 Ml3mpl8 (Pharmacia tai New England Biolabs). Yksisäikeistä faagi-DNA:ta, joka sisältää TPA-säikeen, käytettiin oli-gonukleotidiohjatun mutageneesin templaattina. Jokainen yhteensopimaton oligonukleotidialuke liitettiin templaat-tiin 65 °C:ssa, 10 min ja sen jälkeen huoneen lämpötilassa 30 10 min reaktioseoksessa, jossa oli 20 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 50 mM NaCl, 1 mM ditiotreitolia, 0,2 p-moolia yksisäikeistä mpl8-TPA-DNA:ta, ja 20 p-moolia 5'-fosfory-loitua yhteensopimatonta oligonukleotidia. Reaktioseokseen lisättiin sitten yhtä suuri tilavuus PE-puskuria, jossa 35 oli 30 mM Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM MgCl2, 2 mM merkapto- 22 2 ό etanolia, 1 mM dATPrta, dCTPsta, dGTPsta ja dTTPita, sekä 1 mM ATP:ta. Alukkeen pidentäminen suoritettiin lisäämällä 5-10 yksikköä DNA-polymeraasin Klenow-fragmenttia ja 3-4 yksikköä T4-ligaasia ja inkuboimalla 16 °C:ssa yön yli.
5 Reaktioseos laimennettiin ja sitä käytettiin kompe tenttien JMl05-solujen transformointiin. Faagipesäkkeet seulottiin in situ mutageenisella oligonukleotidipesäke-hybridisaatiolla käyttäen 32P-leimattua yhteensopimatonta aluketta haluttujen mutanttien seulomiseksi; menetelmä pe-10 rustuu siihen, että haluttu mutantti vastaa täysin aluketta, kun taas luonnollinen DNA sisältää yhden tai useamman yhteensopimattoman kohdan. Sopivissa hybridisaatio-olosuh-teissa näin ollen yhteensopimattoman alukkeen ja mutantin välinen hybridisaatioaste on suurempi kuin luonnollisen 15 DNA:n ja mutantin, ja tämän eron perusteella halutut mu-tantit valitaan.
Oletetut mutantit eristettiin ja karakterisoitiin restriktioendonukleaasihajotuksella ja DNA-sekventoinnil-la. Halutut mutantit kloonattiin ja ekspressoitiin pCL28-20 BPV -järjestelmällä, jota edellä kuvattiin luonnollisella uTPAslla, poistamalla sopivien Ml3mpl8-TPA-mutanttien replikoiva muoto liittämällä tämä DNA pCL28-BPV-ekspressio-vektoriin ja transformoimalla hiiren C127-soluja vektori-DNA:11a. Transformantit eristettiin ja seulottiin TPA:n 25 muodostuksen suhteen ELISA-analyysiä käyttäen. Suurin osa tuotetusta TPAssta erittyy viljelyalustaan, näin helpottaen puhdistusta.
Osittaisen tai kokonaan puuttuvan glykosylaation vaikutus TPA-molekyylien puoliintumisaikaan määritettiin 30 mittaamalla TPA-molekyylien puoliintumisajat ja vertaamalla ne toisiinsa sekä täydellisesti glykosyloidun TPA: n tunnettuun puoliintumisaikaan.
Puoliintumisajat mitattiin kaniineissa ottamalla niistä verinäytteet injektion jälkeen eri ajankohtina ja 35 mittaamalla läsnäolevan TPA:n aktiivisuus ja määrä käyt- ,·) Γκ f r 7 ° ? / z w 23 täen fibriinilevykoetta ja vastaavasti ELISA-analyysiä. Täydellisesti glykosyloidun TPA:n in vivo puhdistuma maksan kautta kiertäneestä verestä on hyvin nopea; biologinen puoliintumisaika on noin 2 minuuttia (Thromb. Haemostas. 5 46 (1981) 658). Tämän takia TPAsta ei yleensä annostella injektiona vaan suuren määrän infuusiona 3 tunnin kuluessa. Pitempi puoliintumisaika voi sallia injektiokäsittelyn mieluummin kuin infuusiokäsittelyn, koska hyytymän hajottamiseen tarvitaan pienempi määrä.
10 Talletteet
Seuraavat talletukset on tehty kokoelmaan Agricultural Research Culture Collection (NRRL), Peoria, IL, tai kokoelmaan American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD: 15 pYBDT-6, jota säilytetään E. colissa, NRRL:n talletusnume-ro B-15883, 19.9.1984; pYBDT-10, jota säilytetään E. colissa, NRRL:n talletusnu-mero B-15884, 19.9.1984; pCAT:llä transformoituja hiiren C127-soluja, ATCC:n talle-20 tusnumero CRL8625, 28.9.1984.
Käyttö
Keksinnön mukainen uTPA sekoitetaan farmaseuttisesti hyväksyttävään kantaja-aineeseen, esimerkiksi suolaliuokseen, ja annetaan suun kautta tai suonensisäisesti 25 tai injektoidaan sairaisiin valtimoihin tai sydämeen.
Lääkkeen antotapa on yleispiirteiltään sama, jota käytetään kahta yleisesti käytettyä verihyytymiä hajottavaa entsyymiä, streptokinaasia ja urokinaasia annettaessa.
Claims (8)
- 24 g 7 o z
- 1. Yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että se koodaa ihmisen aktiivista kudosplasminogeeni- 5 aktivaattoria (TPA:ta), joka eroaa luonnossa esiintyvästä TPAssta, joka sisältää kuviossa 1 esitetyn aminohapposekvenssin, siinä, että ainakin yksi luonnossa esiintyvän DNA-molekyylin N-atomin välityksellä sidotun glykosylaati-on Asn-X-(Ser tai Thr)-signaalia koodaavan DNA-sekvenssin 10 kuviossa asemassa 114, 181 tai 445 esitetyistä aspara- giinikodoneista on paikkaspesifisellä mutageneesillä korvattu glutamiinikodonilla, joka kodonin korvaus estää gly-kosylaation signaalissa.
- 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen yhdistelmä-DNA- 15 molekyyli, tunnettu siitä, että yksi DNA-sekvenssin asparagiinikodoni on korvattu glutamiinikodonilla.
- 3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen yhdistelmä-DNA-molekyyli, tunnettu siitä, että kaksi DNA-sekvenssin asparagiinikodonia on korvattu glutamiinikodonilla.
- 4. Patenttivaatimuksen 3 mukainen yhdistelmä-DNA- molekyyli, tunnettu siitä, että kaikki kolme DNA-sekvenssin asparagiinikodonia on korvattu glutamiinikodonilla.
- 5. Menetelmä ihmisen aktiivi-TPA:n tuottamiseksi, 25 josta puuttuu yksi, kaksi tai kaikki kolme ihmisen luonnossa esiintyvän TPA:n N-atomin välityksellä sitoutunutta hiilihydraattiryhmää, tunnettu siitä, että hiiren solu transformoidaan patenttivaatimuksen 1 mukaisella yh-distelmä-DNA-molekyyIillä, hiiren solut viljellään vilje- 30 lyalustassa olosuhteissa, joissa DNA-molekyyli ekspressoi- tuu tuottamaan TPAsta, ja TPA eristetään soluista tai vil-jelyalustasta.
- 6. Hiiren solu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patenttivaatimuksen 1 mukaisella yhdistelmä-
- 35 DNA-molekyyIillä. O c . r\ r~f r> 7 Zb Λ / <£ 3
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US65677084A | 1984-10-01 | 1984-10-01 | |
| US65677084 | 1984-10-01 |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI853761A0 FI853761A0 (fi) | 1985-09-30 |
| FI853761L FI853761L (fi) | 1986-04-02 |
| FI89723B FI89723B (fi) | 1993-07-30 |
| FI89723C true FI89723C (fi) | 1993-11-10 |
Family
ID=24634490
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI853761A FI89723C (fi) | 1984-10-01 | 1985-09-30 | Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell |
Country Status (14)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5344773A (fi) |
| EP (1) | EP0178105B1 (fi) |
| JP (1) | JPS61149094A (fi) |
| AT (1) | ATE151111T1 (fi) |
| AU (1) | AU599576B2 (fi) |
| DE (1) | DE3588149T2 (fi) |
| DK (1) | DK175327B1 (fi) |
| ES (3) | ES8702945A1 (fi) |
| FI (1) | FI89723C (fi) |
| IE (1) | IE81135B1 (fi) |
| NO (1) | NO175158C (fi) |
| NZ (1) | NZ213647A (fi) |
| PT (1) | PT81231B (fi) |
| ZA (1) | ZA857574B (fi) |
Families Citing this family (35)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0143081B1 (en) * | 1983-11-21 | 1989-08-23 | Ciba-Geigy Ag | Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast |
| US5073494A (en) * | 1985-04-22 | 1991-12-17 | Genentech, Inc. | Human tissue plasminogen activator substituted at position 275 or at positions 275 and 277 |
| GB8528321D0 (en) * | 1985-11-18 | 1985-12-24 | Ciba Geigy Ag | Modified fibrinolytic agents |
| JP2581668B2 (ja) * | 1985-11-27 | 1997-02-12 | 三井東圧化学株式会社 | ヒト正常細胞由来のヒト組織プラスミノ−ゲン活性化因子をコ−ドする新しいｄｎａ配列とそれを含むベクタ−及び細胞 |
| AU605124B2 (en) * | 1985-12-23 | 1991-01-10 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Novel peptide plasminogen activators |
| US5837518A (en) * | 1986-01-31 | 1998-11-17 | Genetics Institute, Inc. | Thrombolytic proteins |
| JP2527454B2 (ja) * | 1986-01-31 | 1996-08-21 | ジェネティックス・インスチチュ−ト・インコ−ポレ−テッド | 新しい血栓溶解タンパク質 |
| US5258298A (en) * | 1986-01-31 | 1993-11-02 | Genetics Institute, Inc. | Deletion and glycosylation mutant of human tissue plasminogen activator |
| US5589361A (en) * | 1986-03-18 | 1996-12-31 | Genentech, Inc. | Human tissue-type plasminogen activator variant |
| IE81073B1 (en) * | 1986-03-18 | 2000-01-12 | Genentech Inc | Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation |
| ATE141646T1 (de) | 1986-04-09 | 1996-09-15 | Genzyme Corp | Genetisch transformierte tiere, die ein gewünschtes protein in milch absondern |
| US5047241A (en) * | 1986-07-11 | 1991-09-10 | American Home Products Corporation | Tris-Kringle plasminogen activator with novel K2 insert |
| JPH01500563A (ja) * | 1986-07-16 | 1989-03-01 | セルテック リミテッド | 精製方法 |
| US5580559A (en) * | 1986-12-05 | 1996-12-03 | Ciba-Geigy Corporation | Hybrid plasminogen activator |
| US5242819A (en) * | 1986-12-05 | 1993-09-07 | Ciba-Geigy Corporation | DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase |
| EP0276846A3 (en) * | 1987-01-29 | 1989-07-26 | Zymogenetics, Inc. | Colony-stimulating factor derivatives |
| US5376547A (en) * | 1987-01-30 | 1994-12-27 | American Home Products Corporation | Des-epidermal growth factor plasminogen activators |
| JPH084501B2 (ja) * | 1987-03-20 | 1996-01-24 | エーザイ株式会社 | 糖鎖に関する変異ｔＰＡ |
| EP0292009A1 (en) * | 1987-05-22 | 1988-11-23 | Zymogenetics, Inc. | Fibrinolytic proteins |
| AU1668988A (en) * | 1987-06-03 | 1988-12-08 | Smithkline Beckman Corporation | Purification of tpa |
| US6682733B1 (en) * | 1987-06-18 | 2004-01-27 | Roche Diagnostics, Gmbh | Fibrinolytic enzymes |
| DE3726019A1 (de) * | 1987-08-05 | 1989-02-16 | Boehringer Mannheim Gmbh | Verfahren zur abtrennung und reinigung von t-pa |
| US4963357A (en) * | 1987-10-09 | 1990-10-16 | Monsanto Company | Tissue plasminogen activator modified by the substitution of Arg for Cys at position 73, methods and pharmaceutical compositions therefor |
| US5100666A (en) * | 1987-10-09 | 1992-03-31 | Monsanto Company | Modified tissue plasminogen activator K2K2SP |
| US5244676A (en) * | 1987-10-09 | 1993-09-14 | Monsanto Company | Modified tissue plasminogen activator with modified glycosylation site |
| US5037752A (en) * | 1987-10-09 | 1991-08-06 | Monsanto Company | Modified tissue plasminogen activator substituted at cysteine-73 and lysine-277 |
| US5270198A (en) * | 1988-05-20 | 1993-12-14 | Genentech, Inc. | DNA molecules encoding variants of tissue plasminogen activators, vectors, and host cells |
| US5665583A (en) * | 1988-08-12 | 1997-09-09 | Arch Dev Corp | Methods and materials relating to IMPDH and GMP production |
| US5714145A (en) * | 1988-09-02 | 1998-02-03 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties |
| US5262170A (en) * | 1988-09-02 | 1993-11-16 | Genentech, Inc. | Tissue plasminogen activator having zymogenic or fibrin specific properties and substituted at amino acid positions 296-299, DNA molecules encoding them, vectors, and host cells |
| US5070021A (en) * | 1989-01-10 | 1991-12-03 | Monsanto Company | Method of modifying oligosaccharide structure of tissue plasminogen activator |
| US5268273A (en) * | 1990-12-14 | 1993-12-07 | Phillips Petroleum Company | Pichia pastoris acid phosphatase gene, gene regions, signal sequence and expression vectors comprising same |
| AU664469B2 (en) * | 1992-06-03 | 1995-11-16 | Genentech Inc. | Tissue plasminogen activator glycosylation variants with improved therapeutic properties |
| US7299805B2 (en) * | 2002-06-07 | 2007-11-27 | Marctec, Llc | Scaffold and method for implanting cells |
| EP2948167A4 (en) | 2013-01-22 | 2016-10-19 | Univ Tennessee Res Foundation | TISSUE CLASMINE ACTIVATOR ANTIBODIES AND METHOD OF USE THEREOF |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4370417A (en) * | 1980-04-03 | 1983-01-25 | Abbott Laboratories | Recombinant deoxyribonucleic acid which codes for plasminogen activator |
| US4419446A (en) * | 1980-12-31 | 1983-12-06 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Recombinant DNA process utilizing a papilloma virus DNA as a vector |
| MX197183A (es) * | 1982-05-05 | 1994-02-28 | Genentech Inc | Activador de plasminogeno de tejido humano |
| IL68561A (en) * | 1982-05-05 | 1991-01-31 | Genentech Inc | Preparation of polypeptide with human tissue plasminogen activator function,processes for making it,and dna and transformed cell intermediates thereof |
| EP0125254A1 (en) * | 1982-10-28 | 1984-11-21 | Beecham Group Plc | Enzyme derivatives and their use in the treatment of thrombosis |
| AU554862B2 (en) * | 1982-12-14 | 1986-09-04 | Implico B.V. | Plasminogen activator isolated by affinity chromatography |
| AU572108B2 (en) * | 1983-01-19 | 1988-05-05 | Genentech Inc. | Human tpa production using vectors coding for dhfr protein |
| EP0143081B1 (en) * | 1983-11-21 | 1989-08-23 | Ciba-Geigy Ag | Synthesis of tissue plasminogen activator(tpa) by yeast |
| US4753879A (en) * | 1984-08-27 | 1988-06-28 | Biogen N.V. | Modified tissue plasminogen activators |
| GB8528321D0 (en) * | 1985-11-18 | 1985-12-24 | Ciba Geigy Ag | Modified fibrinolytic agents |
| AU605124B2 (en) * | 1985-12-23 | 1991-01-10 | Behringwerke Aktiengesellschaft | Novel peptide plasminogen activators |
| IE81073B1 (en) * | 1986-03-18 | 2000-01-12 | Genentech Inc | Modified human tissue-type plasminogen activator and its preparation |
-
1985
- 1985-09-30 DK DK198504415A patent/DK175327B1/da not_active IP Right Cessation
- 1985-09-30 EP EP85306957A patent/EP0178105B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-30 DE DE3588149T patent/DE3588149T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1985-09-30 NO NO853851A patent/NO175158C/no not_active IP Right Cessation
- 1985-09-30 NZ NZ213647A patent/NZ213647A/xx unknown
- 1985-09-30 IE IE239485A patent/IE81135B1/en not_active IP Right Cessation
- 1985-09-30 ES ES547416A patent/ES8702945A1/es not_active Expired
- 1985-09-30 AT AT85306957T patent/ATE151111T1/de not_active IP Right Cessation
- 1985-09-30 FI FI853761A patent/FI89723C/fi not_active IP Right Cessation
- 1985-10-01 JP JP60216313A patent/JPS61149094A/ja active Pending
- 1985-10-01 ZA ZA857574A patent/ZA857574B/xx unknown
- 1985-10-01 AU AU48148/85A patent/AU599576B2/en not_active Expired
- 1985-10-01 PT PT81231A patent/PT81231B/pt unknown
- 1985-10-01 US US06/782,686 patent/US5344773A/en not_active Expired - Lifetime
-
1986
- 1986-04-28 ES ES554449A patent/ES8706726A1/es not_active Expired
- 1986-04-28 ES ES554450A patent/ES8801306A1/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| NO853851L (no) | 1986-04-02 |
| ES554449A0 (es) | 1987-07-01 |
| AU599576B2 (en) | 1990-07-26 |
| IE852394L (en) | 1986-04-01 |
| NO175158C (no) | 1994-09-07 |
| DK441585D0 (da) | 1985-09-30 |
| ES8702945A1 (es) | 1987-01-16 |
| IE81135B1 (en) | 2000-03-22 |
| EP0178105A3 (en) | 1988-11-17 |
| NO175158B (no) | 1994-05-30 |
| EP0178105B1 (en) | 1997-04-02 |
| US5344773A (en) | 1994-09-06 |
| AU4814885A (en) | 1986-04-10 |
| PT81231B (pt) | 1987-10-20 |
| ES547416A0 (es) | 1987-01-16 |
| ES8801306A1 (es) | 1988-01-01 |
| ZA857574B (en) | 1986-06-25 |
| DK175327B1 (da) | 2004-08-23 |
| DE3588149T2 (de) | 1997-10-09 |
| JPS61149094A (ja) | 1986-07-07 |
| ES554450A0 (es) | 1988-01-01 |
| NZ213647A (en) | 1989-05-29 |
| FI89723B (fi) | 1993-07-30 |
| ES8706726A1 (es) | 1987-07-01 |
| FI853761A0 (fi) | 1985-09-30 |
| ATE151111T1 (de) | 1997-04-15 |
| PT81231A (en) | 1985-11-01 |
| EP0178105A2 (en) | 1986-04-16 |
| DK441585A (da) | 1986-04-02 |
| FI853761L (fi) | 1986-04-02 |
| DE3588149D1 (de) | 1997-05-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| FI89723C (fi) | Foerfarande foer framstaellning av vaevnadsplasminogenaktivator, kodande rekombinant-dna daerav och en transformanscell | |
| US5278049A (en) | Recombinant molecule encoding human protease nexin | |
| FI104734B (fi) | Menetelmä plasminogeenin valmistamiseksi | |
| EP0235162B1 (en) | Cdna and gene for human angiogenin (angiogenesis factor) and methods of expression | |
| DE3689386T2 (de) | Proteaseresistente Urokinase-Zusammensetzung, deren Herstellung und Verwendung. | |
| WO1986006408A1 (en) | HIGH YIElD PRODUCTION OF ACTIVE FACTOR IX | |
| JP2645237B2 (ja) | ハイブリッドプラスミノーゲンアクチベータをコードする遺伝子 | |
| JPS62111690A (ja) | ヒト―プロテインｃをコードする遺伝子 | |
| WO1989000192A1 (en) | Production of kallikrein | |
| US7163817B2 (en) | Clot-specific streptokinase proteins possessing altered plasminogen activation characteristics and a process for their preparation | |
| JP2739892B2 (ja) | 活性なヒトｔｐａをコードする組換えｄｎａ分子 | |
| JPH05506354A (ja) | 端が切り取られた軽鎖を有する活性プロテインｃ | |
| US5242819A (en) | DNA molecules encoding hybrid proteins of tissue plasminogen activator and urokinase | |
| US5580559A (en) | Hybrid plasminogen activator | |
| Collen et al. | K1K2Pu, a recombinant t-PA/u-PA Chimera with increased thrombolytic potency, consisting of amino acids 1 to 3 and 87 to 274 of human tissue-type plasminogen activator (t-PA) and amino acids 138 to 411 of human single chain urokinase-type plasminogen activator (scu-PA). Purification in centigram quantities and conditioning for use in man | |
| JP2518832B2 (ja) | 変形された組織プラスミノ−ゲンアクチベ−タ− | |
| AU619803B2 (en) | Rearranged tissue plasminogen activators and method for producing same | |
| JPS62289199A (ja) | ヒトプロテインｓ | |
| JPH022338A (ja) | 真核細肪中での同時発現 | |
| JPH02273179A (ja) | 新規な血栓溶解蛋白質，その製造法および該蛋白質からなる医薬 | |
| SI8810195A (sl) | Hibridni proteini |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG | Patent granted |
Owner name: GENZYME CORPORATION |
|
| BB | Publication of examined application | ||
| FG | Patent granted |
Owner name: GENZYME CORPORATION |
|
| MA | Patent expired |