JPH01500563A - 精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 精製方法 本発明は精製方法に関し、とくにヒト組織プラスミノーゲンアクティベーター（ ｔＰＡ）の精製方法に関する。この方法は但洟えＤＮＡ技術によって製造された ｔＰＡの精製への適用乞とくに考慮したものであるか、必ずしもそれに限定さｎ るものではない。

ｔＰＡは生体の血中および各種組織中に見出される酵素（したがって蛋白質）で ある。それ（・−生体において健全な血液循環系を維持するためＱ）過程に関与 している。とくにｔＰＡは凝血形成の調整に関与する。

血液凝固はそαり基盤となるフィブリン塊が沈層することによって形成さする。

しかしなから、フィブリンは、酵素前駆体プラスミノ−ピンと連透している。プ ラスミノーゲンが后住比されると酵素ゾラスミノーケ９ンが生成し、これが凝血 中リフイブリンに作用し、凝血を溶解させる（血栓溶解ン。

プラスミノーゲンに作用してそれをプラスミンに活性ｆヒできる屏素としては通 常６種が利用されている。

第一はストレプトキナーゼで、各種連鎖球耐株から誘導される喜累である。スト レプトキナーゼは血栓溶解剤として用いらｔてきたが、プラスミノ−ダンが循環 していても凝血中に結合していても活性化し、抗原性であるという欠点がある。

第一の欠点は、標的とする凝血からｕｎた生体の部分に抑制不能な出血を生じる 場合があること、第二の欠点（工、ストレプトキナーゼの作用の有効凹を低下さ せまた望ましくない臨状症状を導く好ましくない免疫学的反応を生じる可能性が あることである。

第二のプラスミノ−ダンアクティベーター；マ、七ｎが最初ヒトの尿から単離さ ねたことより、一般にウロキナーゼとして知らＣている。最近になって、組織培 養系から単離さｎろようになり、また組換えＤＮＡ技術によって製造されるよう になった。ウロキナーゼ（１ヒト起源なので抗原性はない。しかしなから、備環 および結合両プ２スミノーｒ７を活性ｆヒし、シ１こかって上述したような間− を招くという欠点がある。

第三のプラスミノーゲンアクティベーターはｔＰＡで、こｒもヒトで抗原性は示 さない。しかもｔＰＡはフィブリノ−ダンにきわめて特異的に結合し、したがっ て凝血に結合したゾラスミノーケ９ンにほぼもっばら作用する。丁なわち、ｔＰ Ａは高度に：ｆｆ異的な血栓溶解剤という利点がある。こしは丁でに、腎移植を 受けた患者Ｑ）皿栓の治療にａ末的に使用さねている（　Ｗ８ｉｍａｒほか：　 Ｔｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、　ｉ　９８１年１１月７日号、１０１８〜１０１９頁） 。

１９７０年代の後半まではｔＰＡはヒト組織から、たとえばヒト子宮組織から、 少量単離できるのみであつ１こ。すなわち、その愛用が有利なことはきわめて明 白であつ二にもかかわらず、それを市販供給できるだけの址製造することは不可 能であった。

１９８１年には、特定の黒色腫細胞系（バラニス黒色腫細胞系として知られてい る）が大量のｔＰＡを分泌することが発見さｎ１コ（Ｒｌｊｋｅｎ　＆　Ｃｏ１ １ｅｎ　：　Ｊ。

Ｂ１１１、ｃｈｅｚ、、　７０３５〜７０４１　、１９８１　＞、すなわち、こ の細胞系を培養し、その上澄液を収穫することによって大量のｔＰＡ？０：製造 することが可能になつ　ムニ　。

さらに最近になって、ｔＰＡを徂換え技術の使用によって製造することが提案さ れるようになった。１ことえば、Ｐｅａｎｉｃａらは、Ｅ、Ｃ０１ｉ中へのｔＰ Ａ遺伝子のクローニングおよびその発現を開示しているしく　ｐｅ＝ｐｉｃａは カニ　Ｎａｔｕｒｅ　、　３Ｑ　ｉ　：　２１４〜２２１゜１９８３）、またＧ Ｂ−Ａ−２１１９８０４号（Ｇｅｎｅｎｔｅｃｈ　）には、ｔＰＡ遺伝子の原核 および真核両細胞系へのクローニングおよびその発現が開示さｎている。

丁なわち、現在では、市販できる敢のｔＰＡが利用可能になっている。しかしま １こ、各国り規制機関が臨床用ｔＰＡにめる要求に合致させるためには、ｔＰＡ をほぼ完全に精製する必要がある。黒色腫細胞の培養によってｔＰＡを製造した 場合、培養メジウムの成分および黒色腫によって通常産生されている他のヒトタ ンパク質からの分離が必要になる。同様に組臭え技術によって製造したｔＰＡの 場合には、培養メジウムの成分およびｔＰＡの発現に用いた宿主細、砲が通常産 生する池のタンパク質からの分離が必要である。

たとえば黒色腫細胞系＝１こは組換えＤＮＡ技術によって通常に産生されたｔＰ Ａは、一本領タンパク質であることが知られている。しかしながら、これはその 後、２本領σクジスルフィド結合したタンパク質に切断される。この切断ｉ：、 ｔＰＡの製造後それを処理している間に自発的に生じる。

ヒトでＣυ臨床試験から、一本領型は動脈内の閉基の除去により有効との証拠が 現在得られている（　Ｇａｒａｂｅｄｉａｎ、　Ｈ，Ｄ、ほか：　ＪＡＣＣ，９ ：　３　、５９９〜６０７．１９８７参照）。したがって、精製したｔＰＡは一 本鎖型であることが好ましい。精製後、それが一本領型で使用できるのが好まし い。

一本領、二本鎖両分子とも、分子量が約３．０００ダルトン異なる２種の変異体 がある。この差は多分、分子中の４個のグリコジル比認識部位中の１１固（Ａｓ ｎ−１８４）Ｋおけるグリコジルｆヒの程度の差によるものと思われる。

さらに、ｔＰＡの画一本領型にはＮ末端配列変異体がある（　ＪＯｒｎＶａｌｌ 、　Ｈ，ほか：　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ、、　１５６　：１．４７〜５０．１９８ ３参照）。バラエル細胞上澄液から精製された物質には、以下の２種のＮ末端配 列Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ａ−Ｒ−３−Ｙ−Ｑ−Ｖ−工Ｈ２Ｎ−３−Ｙ−Ｑ−Ｖ−ニー の約５０：５Ｑ混合物がある。

多数のｆＲ１製操作が丁でに知られている。しかしながら、工業的製造方法に使 用するには、複雑すぎる、収率が低すぎる、小規模でのみ可能等の欠点がある。

さらに、一部にはｔＰＡの二本鎖型への切断を促進するものがあることも知らｎ でいる。たとえば、ケ９ル亀気泳動は効率αつよい、−工８樗製方法を与えるが 、ペレパラテイブｒル電気泳動は時間がかかり、低収率で、きわめて高価につく 。

ＤＥ−Ａ−３２２２０８４号（Ｂａ７ｅｒ　）には、ｔＰＡを、クロマトグラフ ィーメジウムたとえばセファロース４３に結合させた抗−ｔＰＡモノクローナル 抗体を用いたアフィニティークロマトグラフィーで精製することが提案さＣてい る。しかしながら、平衡ｆヒや浴出援衝履の詳紀は示さｎていない。たとえば、 黒色腫細胞系培養液の上漬をこのような方法で処理し、精製ｔＰＡ　ｔａ：製造 するが意図さしていて、　ｔＰＡの収率は９０％と高い旨述べられているが、一 本鎖と二本鎖型の比は与えらｎていない。

アフィニティークロマトグラフィーを用いたのでは、本発明に関して以下に特定 する至適条件下でも、工業的方法として確立させるのに十分な純度のｔＰＡを十 分良好な収率で製造することはできないことが明らかにさｎだ。

丁べてのｔＰＡ稍製操咋に共通な問題は、一般にｔＰＡが、保存したりあるいは 移したりする容器とくにガラス容器に著しく付着性のことである。したがって処 理の間にかなりの物質のロスがある。しかも純粋なｔＰＡを高濃度に＠液中に維 持することは一般に困難である。

約１〜／−の濃度で、ｔＰＡは析出する傾向がある。これは、高濃度の溶液が望 ましい治療分野においては有用ではない。

ｔＰＡを、補助剤たとえば１Ｍ炭酸水素アンモニウム、リジン、アルギニン、そ の他のアミノ酸または地のアミンを添り口して溶液として保持することも提案さ れている。これらはまた、ｔＰＡの安定性の維持にも有効と考えられる。しかし ながら、補助剤は治療関係においては容認さねないものもあるのがこの提案の欠 点である。したがって、許容さしない可能性のある補助剤の使用乞必要としない 、高濃度、安定７ｊｔＰＡ浴液の製造が望まれている。

本発明は、ａ）高置に隘イオン性σノクロマトグラフイーメジウム上イオン交険 クロマトグラフィ一工程、およびｂ）　ｔＰＡを含有する母液上アフィニティー クロマトグラフィ一工程、を実施することからなるｔＰＡの精製方法を提供する 。

精製工程はすべて、ｔｐＡや使用したクロマドグ２フイーメゾウムの性質に悪影 響を与えないで、できる限り低い−で行うのが好ましい。−役にＰＨは４より低 く丁べきではない。；−＜べきことにこσフような低−で、ｔＰＡの、保存安定 性も１〜／−より高い濃度での溶液安定性も保持さＣることが明らかにさｎｒｓ 。

少なくとも後半の精製工程、好ましくは全！Ｗ製工程を、約０．０１％の界面活 性剤好ましくは非イオン界面活性剤の存在下に行５　ｖ）が有利である。とくに 適当な界面活性剤は、治療幻に許容さｔろことが知らねているツイーン■８０で ある。このような界面活性剤は、精製ま１こは保存容器へ付層するｔ？ＡＩ）倉 を減少させる。

好ましくは、不発明のガニは、 ｔＰＡを富有する母液を、イオン強度２５　ｍｓまたは七ｔ′Ｌ以下、ＰＨ４〜 ７の緩衝液で平衡化した高度に非イオン性のクコマドグラフィーメジウムに適用 し、ｔＰＡ乞高度に非イオン性のクロマトグラフィーメジウムから高イオン強度 緩衝液で浴出し、高度に非イオン性のクロマトグラフィーメジウムからの溶出液 乞、クロマトグラフィー材料に共有結合した抗−ｔＰＡ抗体からなり仇体へのｔ ＰＡの結合を実質釣に妨否しない緩衝液で〒衡ｒじしたアフィニティークコマド グラフィーメジウムに適用し、ついでｔＰＡｇアフィニティークロマトグラフィ ーメジウムから、抗体ｇ、、）ｔＰＡへの結合を破壊する緩衝液で溶出すること から構成さＣる。

ｔＰＡを富有する母（はｔＰＡ分泌細、唯１ことえばバラニス黒色腫ａｔ胞の培 養液グツ上澄液であってもよい。また、母ｇは、組換えＤＮＡ技術によりｔＰＡ を発現、分泌できるように形質転換された真核細胞系の培養液の上筐液であって もよい。

母液は必要に応じて、細＠または細胞層を除去して澄明ｆヒできる。

澄明比は、たとえば、遠心分離または濾過によって行わＣる。しかしながら、澄 明比はそれがｔＰＡの収率に悪影響を与えるよ５な方法、たとえば限外濾過によ って行って（＝ならない。限外濾過は、とくに、ｔＰＡの収率な有意に低下させ ることか明らかにさねている。

必要な場合は、母液をたとえば親水注衝脂言浸ガラス穢推フィルター、たとえば ｇａＩＦ３ｔｏｎ　ＬＰ　−２００−５０−８０カートリツジフイルメー（これ は、公称の孔径０．２２　ｔ１ｍクククコエチレンおよびクコシリケートガラス 繊維フィルターである）を用いた濾過により澄明比する。

母液を製造するために細胞を培養した溶液には、アプロチニンのようなセリンプ ロテアーゼインヒビターを添卯し、ｔＰＡの酵素的分解を阻止するのが有利であ る。こＱ）ようなインヒビターを使用する場合は、母液（１）Ｐ［（を少なくと も初期の精製工程においては、インヒビターの活性を維持するためにｉ（を４以 上にすることが必要になる。一本領ｐｔＡを得るのに好ましいアプロチニンのレ ベルは母液中１０〜１００に工σ／−であることが明らかにさしている。

母液は、それが製造されたのち、できるだけ速やかに処理することも、きわめて 有利である。以下の笑３例に示すよ５に、母液の手早い処理で、均一なｔＰＡの 予期に反した高収率が達成される。

高度に陰イオン性のクコマドグラフィーメジウム（ＨＡＣ：Ｍ）は便ｔヒ型なの で、メジウムの圧縮がなく速やかな流速を達成できるので有利である。硬ｒヒＨ ＡＣＭは本技術分野においてよく知らしている。

ＨＡＣ！Ｍ上の非イオン基は、本技術分野に２いて公知の任意のもの、たとえば カルボキシレート、サルフェート、スルホネート、スルホプロぎルまたはホスフ ェート基を使用できろ。好ましい非イオン基はスルホネート基である。

とくに適当なＨＡＣＭはＰｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、から市販されているＳ− ３ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　Ｆｌｏｗである。これは、高度架橋ビーズ比ア ガロースマトリックスからなり、それに−Ｃ！Ｈ２−８Ｏ３Ｎａ　（スルホネー ト〕基が結合している。

（ざ明１ヒ）母液Ｑり適用後、ＨＡＣ！Ｍは平衡ｒヒ緩衝液で洗浄するのが有利 である。

ＨＡＯＭ平衡ｒヒ緩衝液の絹は４〜７、好ましくは約６またはそれ以下とするｃ Ｉ）か好ましい。−が低すぎると、望ましくないタンパク質がメジウムに結合し 、−万一が高子ぎろとｔＰＡがメジウムに十分駄付層しないことが明らかにされ ている。

ＨＡＯＭｖ−衡緩衝液のイオン強度は使用した−に合わせて調整する必要がある 。ＰＨを高くｆ　ｒＬｌｌ、イオン強度は低くなければならない。１ことえはｐ Ｈ６，２の場合はｉ　Ｑ　ｍＳを越えないイオン強度が適当である。ｐＨ４では 、イオン強度は約２５　ｍｓまで上げることができる。

ＨＡＯＭｏ、ｌ平衡ｆヒに使用する緩衝液は５　［］　ｍＭ酢酸塩、０．０１％ ツイーン８０からなりｐＨ６，０に調整されたものが好ましい。

しかしながら、本技術分野の熟練者によれば、上に特定した緩衝液のＰＨおよび そのイオン強度の範囲内で、他の緩衝剤γことえばリン酸塩もしくトエクエン酸 塩緩衝剤ま１こはその混合物を適宜使用できること、またイオン強度調整剤たと えば塩１ヒナトリウムまたは塩ｒヒカリウムなＨＡＣＭ緩衝剤に添卯できること は容易に理解できるとおりである。

ＨＡＣＭからｔＰＡ　’ｌ’浴出するのに使用する高イオン強度緩衝液は、５３ 　ｍＭ酢酸塩、０．０１ツイーン８０および５００　ｍＭ塩ｒヒナトリウムから なり、−を６．０に調整したものが好ましい。

しかしなからこり場合も、平衡ｒヒ緩Ｉ＠液と同様、他の緩衝剤およびイオン強 度調整剤を使用できることは自明である。こｎらの試剤は〒衡ｒヒ後衝液に使用 しｔこ試剤と適合性のあるものを選ぶことが好ましい。

ＨＡＣＭ溶出緩＠液のイオン強度は５　Ｑ　ｚＭ酢酸塩および２００　ｍＭ好ま しくは２５０　ｍｕ塩化ナトリウムを言みＰｌ″Ｉ６・０に調整した溶液のそれ 以上であることが好ましく、好ましい溶出緩衝液のそｔと同一またはそれ以上で あることが有利である。しかしながら、緩衝液のイオン強度がｔＰＡに悪影響を 与えるほど高くないことが保証されねｌ”ｌ’ならない。

アフィニティークロマトグラフィーメゾウム（ＡＯＭ）は、モノクローナル抗− ｔＰＡ抗体たとえばＤＥ−Ａ−３２２２０８４に開示されている種類の抗体が、 適当なりロマトグラフィー材料に共有結合しているものが好ましい。しかしなが ら、抗体にはポリクローナル抗−ｔＰＡ抗体も使用できる。

Ａ　ＣＭの調製方法は本技術分野においてよく知らｎていて、これらの公知方法 の任意のひとつが使用できる。抗−ｔＰＡ抗体は、たとえば”Ａｆｆｉｎｉｔｙ 　Ｃｈｒｏｍａ−ｔｏｇｒａｐｈｙ、　Ｐｒ１ｎｃｉｐｌｅｓ　ａｎｄ　Ｍｅｔ ｈｏｄｓ″１１〜１８頁（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔｄ、刊、同社から入手でき るンに記載されているように、シアノーケ９ンブロミド活注比ｃｖ浸用により、 クロマトグラフィー材Ｈに結合させるのが便利である。

ＡＣＭｃりｇ造に適当なりロマトグラフィー材料は本技術分野においてよく知ら れていて、本技術分野の熟練者であれば適当なものｔ容易に選択できる。クロマ トグラフィー材料はＨＡＯＭに関連して上述したと同じ理由で硬ｒヒ材料である ことが好ましい。

ＡＣＭの製造にとくに適当なりロマトグ２フィー材料は、架橋アガロースポリマ ーからなる半硬化材料の５ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＣＬ４３　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ より販売）である。

ＡＯＭは、これにＨＡＧ！Ｍ溶出液を適用したのち平衡緩衝液で洗浄するのが有 利である。

ＡＯＭ平衡緩衝緩衝−およびイオン強度は、ｔＰＡの抗体への結合を容易にする ように調整すべきであり、とくにイオン強度がこの結合を妨害するほど高くまた 低くならないように注意する。

ＡＯＭ平衡緩衝液のよ（１５〜１ｏであることが好ましく、５〜７であることが 有利であり、約５．５であることがと（に好ましい。

ＡＣＭ平衡緩衝液はイオン強度を高くすることが好ましい。たとえば、１１００ Ｉｎ食塩を含有する溶液のそれと等しいかそれ以上である。これはＡＯＭへの望 ましくないタンパク質の非特異的結合の発生を低下させる場合がある。

ＡＣＭ′Ｘｆ−衡緩ｗａｉｔ　１００　ｍＭ酢酸塩、２０　Ｑ　ｍＭ食塩２よび ０．０１％ツイ−ｙ８０Ｙｉｉｒ有り、、ｐ）（Ｙ５．５に調整されたものが好 ましい。

ＨＡＯＭ緩衝液と同僚、本技術分封の熟練者には、ＡＯＭ平衡緩衝液に地の緩衝 剤およびイオン強度調整剤を使用できることは自明である。

ＡＣＭ溶出緩衝液はｔＰＡの抗体への結合を、両者に悪影響を与えることな（容 易に分裂できるものでなければならない。

Ａ　ＯＭ上の抗体とそり基質の間の結合を分裂できる緩衝液は多種存在し、こし らの任意の緩衝液が使用できる。たとえば、緩衝液は著しく高いまたは著しく低 いＰＨまたはイオン強に？もっていてもよい。ま１こ、この緩衝液は、カオトロ ピック塩、たとえば塩ｆヒマグネシウム、カリウムチオシアネートまたはヨウ比 カリウムを含有させてもよく、あるいはタンパク変性剤たとえば尿素もしくはグ アニジンを添加することもできる。

さらに、この緩衝液には、プロパツールまたはエチレングリコールのような分裂 溶ばを卯えてもよい。

ＡＣＭ溶出緩ｆＪｊＩ液は低−緩衝液で、たとえば５ＱｎＭ酢酸塩、０．０１％ ツイーン８ｏおよび食塩２ｏｏＩＩＩＭを言有し、−を６．５に調整したものが 好ましい。このような低ｐＨｃｖ　使用によっても屑くべきことに、ｔＰＡの安 定性に関しては何の間呟も生じない。別法として、ＡＣＭ婚出緩衝液はカオトロ ピック塩を含有させてもよ（，１ことえげ５Ｍ垣比マグネシウム、２０鮨Ｔｒｉ ｓを７７０え、塩酸でｐＨ６，２に調整する。

ＡＣＭ＋衡比緩＠液の嚇合と同様、ＡＯＭ浴出暖衝緩衝液緩衝剤およびイオン強 度調整剤を様々に変化させることかできる。

ＡｃＭ＝出は、低分子！排除限界を有するｒル濾過クロマトグラフィーを用い、 緩衝液又喚を行う。このようなメジウムとしては、５ｓｐｈａｄｅｘ　Ｇ　−２ ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｌｔ４．より販売）がとくに適当である。ｒル濾過ク ロマトグラフィーメジウムは５　Ｑ　ｍＭ酢酸塩、０．０１％ツイーン８０で平 衡比し、Ｆ１１″１４．０に調整するのが有利である。

デル濾過工程からの溶出液は、好ましくは膜濃縮システムたとえばＭｉｌｌｉｐ ｏｒｅ　Ｍｉｎｉｔａｎ　システム”＆用いて濃縮するのが有利である。

上述の処理工程の丁べてを実施するにあたっては、クロマトグラフィーメジウム および装置にプロテアーゼが夾雑しないようにできる限りの注意を払うことが必 要である。

緩責液又俟工程は、ｔＰＡを静脈注射、凍結または凍結乾燥に適した緩衝液中に 置く１こめに使用することもできる。

本発明の方法は、迅速にまたｔＰＡ（１）実質的な分解がなく実施できるもので あって、室温で行うことができる。従来技術では通常４℃で行われのに比べ、溶 液の粘度の項７ＪＯ、戚回時間の延長のような問題を回避することができ、有利 である。

本発明の方法を使用丁れば、ｔＰＡを簡単な２工程のｎｌ製方法で、二本鎖型へ の分解をほとんど伴うことなく、完全に純粋に工莱旧規頂での精製が可能になる 。

さらに本発明の方法は、実質的に純粋な、実質的に１種のＮ末端配列のみを有す る実質的に一本鎖のみのｔＰＡを与える。このようなｔＰＡが本発明の第二の態 様である。本発明の別の態様は、上述のｔ　ＰＡ　′ｌｔｓ好ましくは界面活性 剤を言有する低ＰＨ緩衝液中に含む安定、濃厚なｔＰＡ溶液を提供する。

本発明を次に例示の目的で、図面を参照しながら説明するが、これはいかなる意 味においても本発明を限定するものではない。

第１図は、ｎ製の進行のモニタリングに夏用した、一連のドデシル詭酸ナトリウ ム（ＳＤｓ　）７〜１５％ポリアクリルアミド勾配デルを示す。レーン１は分子 量マーカー、レーン２は母液、レーン３はＨＡＣ：！Ｍからの溶出液、レーン４ および５はＡＣＭからの溶出液、レーン６から９は緩衝液変換カラムからの溶出 液、レーン１０〜１１は第二の緩衝液交交カラムからの溶出液である。

第２図は、生成物の純度を示すために使用した一連のＳＤ！３７〜１５％ポリア クリルアミドｒルを示す。

レーン１および５は分子量マーカー、レーｙ２．３および４１ｉそれぞれ６．１ ２および１８μｇを負荷した場合の緩衝液交換カラムからの溶出液である。

いずれの場合も、サンプルはデルに適用する以前に還元し、アルキル「ヒした。

第１図のデルには、各レーンともタンパク質１５μｇｋ負荷した。

処理を容易にするため、ＡＣＭ精裏工裡は２段階に、ま１こ緩衝版交換はレーン ６〜９に示すように４段階に実施した。緩衝液交換物質はついで、レーン１０〜 １３に示すように、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ　Ｍｉｎｉｔａｎシステム上４段階に濃 上巳段階。

以下に記載の精製方法中、クロマトグラフィ一段階の操作は、慣用の方法で溶出 液の２８０　ｎｒｎにおける吸収を観察することによってモニタリングした。溶 出は、タンパク質の溶出を示すピークが完全に溶出してしまうまで雌伏した。ｔ ＰＡの活性は、丁べての段階で、ｃｅｄｅｒｈｏｌｍ−Ｗｉｌｌｉａｍｓ、　ｓ 、　Ａ、　、　Ｈｏｕｌｂｒｏｏｋ、　Ｓ、　。

Ｐｏｒｔｓｒ、　Ｎ、　Ｗ、　、　Ｍａｒｓｈａｌｌ、　Ｊ、　Ｍ、　＆　０ｈ ｉｓｓｉｃ、　Ｌ　：　ｉｎ″Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ　ｏ：　Ｐｌ ａｓｍｉｎｏｇ９ｎ　ＡｃｔｉｖａｔｏｒｓＳｅＣｒｅｔｆ３６　ｂ７　ｎｕｍ ａｎ　Ｍａｌｉｇｎａｎｔ　Ｃｅ１ｌＳｌ　ｉｎ　Ｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆ　Ｍ ｅｔａｓｔａｓｉｓ　：　Ｐｒｏｂｌｅｍｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｓｐｓｃｔｓ″。

１９８５　、　Ｈｅ１ｌｚａｎ、に、＆　Ｅｃｃｌｅｓ、　Ｓ、編、　Ｔａ７１ ＯｒＦｒａｎｔｉｃ、　ＬｏｎａＯｎに記載のフイプリンアが−ルアッセイで測 定した。タンパク質含量は慣用のタンパク質定ｉｌ−伝を用いて評価した。

ｔＰＡを発現し分易できるラット細胞系をＧＢ−Ｂ−２１１９８０４に記載の方 法と同様の組換えＤＮＡ技術によって製造した。これをアプロチニン５０に工Ｕ ／ｍＪを言有する標準培養メジウム中、発酵器を用いて培養し、ｔＰＡおよびア プロチニンを言有する母液を製造した。

以下の全操作では、すべてｃｖ装置およびクロマトグラフィーメジウムをプロテ アーゼの夾雑を生じないように注意深（処理した。

発酵器からの不純なｔＰＡを包含する母液２００／を集め、Ｂａ１ｓｔｏｎ　Ｌ Ｐ−２００７イｋｊ’　−ヲ通り、　テロちに澄明比し、イオン強度２５　ｍｓ 以下に希釈し、塩酸で−を６０に調整した。澄明化した母液はグラムのオーダー のｔＰＡを含有した。

Ｓ−８ｅｐｈａｒｏｓｅ　Ｆａｓｔ　ｐｌｏｗの８１！カラムを、５ＱｍＭ酢酸 塩、ｏ、ｏｉ％ツイーン８０を言有し−を６．０に調整した緩衝液で平衡ｒヒし た。澄明ｆヒした母ｇ、を平衡化カラムに直ちに適用し、ついで非結合タンパク ｉ−ｆべてか溶出するまで（溶出緩衝液の２８０　ｎｍにおける吸収で判定）平 衡化メジウムで洗浄し１こ。

洗浄後、５　Ｑ　ｍＭ酢酸塩、０．０１％ツイーン８０および５００　ｍＭ塩化 ナトリウムを言有しｐＨ６，０に調整した緩衝液を用いて、ｔＰＡの溶出が完了 するまで、カラムを浴出した。

溶出液は適用したｔＰＡの８７％を含有し、その純度は約３０％、タンパク質１ ｍｇあたりのｔＰＡ活住（Ｕ／■）、比活性は３Ｘ１０３単位であった。

モノクローナル抗体Ｍ　Ａ　Ｏｉ　Ｑ　（Ｃｕｌｔｕｒｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｓＤ ｉＶｉ８１０ｎ　Ｏｆ　Ｃｅ１ｌｔｅｃｈ　Ｌｉｍ１ｔｅｄより供給さレタン３ ｙをシフ／−１”：ｙプロミド活注比６ｅｐｈａｒｏｓｅ　ＯＬ　４　Ｂ１１に 結合させて、アフィニティークロマトグラフィーカラムを調製した。モノクロー ナル抗体ＭＡＣｉＱはｔｐａＫ特異的である。アフィニティークロマトグラフィ ーカラムは１００　ｍＭ酢酸塩％　２００　ｍＭ塩化ナトリウム、０．０１％ツ イーン８ｏを言有しｐＨ５，５に調整した緩衝液で平衡比した。

５−３ｓ、ｐｈａｒｏｓｅカラムからの溶出液を直ちにアフィニティークロマト グラフィーカラムに適用し、これを次にも早タンパク質が溶出しなくなるまでア フィニティークロマトグラフィー平衡緩衝液で洗浄した。ついで５　Ｑ　ｍＭ酢 酸塩、０．０１％ツイーン８ｏおよび２００ｍＭ塩化ナトリウムを含有し、−を ３．５に調整した緩衝液を用いて、丁べてのタンパク質が溶出するまで溶出して 、カラムからｔＰＡ　Ｙ溶出した。

アフィニティークロマトグラフィー溶出液は適用したｔＰＡの８６％を含有し、 これは実質的に純粋で、比活性は１００ｘＩＤ３Ｕ／■以上であった。

アフィニティークロマトグラフィー溶出液’ｖ、５０ｍＭ酢酸塩、０．０１％ツ イーン８０を言有し−を４．０に調整した緩衝液で平衡比した２、２　ｔ　８ｅ ｐｈａｄｅｘＧ２５−Ｍｒデル過カラムに適用した。ＡＣＭ溶出緩衝液σ）成分 を含まない緩衝液でｔＰＡｆｉｒ：浴出させ、その成分はカラム上に残した。適 用しｒ、−ｔＰＡの８８％を、実質的に純粋な形、比活性１１０ｘｌＣ１３Ｕ／ ｑとして言む緩衝液を還果した。ｔＰＡはＭ１１１ｐＯｒθＭｉｎｉｔａｎシス テムを適用してさらに濃縮した。

本発明の方法によれば、室温において行われた簡単な操作でかなりの量の実質的 に純粋なｔＰＡが製造できることを示している。この方法で’）ａ収率は６７％ であった。このガニは、市販に使用するだげ０）ｔＰＡを製造する規模でも容易 に操作できる。

精製の進行は、結果を第１図に示し１こＳＤＳポリアクリルアミドｒル電気泳動 （５ＤＳ−ＰＡＣ）Ｅ　）から明らかである。第１図は７．５％〜１５％勾配５ ＤＳ−ＰＡＧＥ（還元型）を示し、各レーンは次のとおりである。

１、分子量マーカー ２、組織培養　いずｎもタンパク質 ３．５−ｓｅｐｈａｒｏｓｅＦ、Ｆ、溶出液　１５μｇを負荷４、免疫ｙ！裏１ 溶出液 ５、免疫精製２溶出液 ６．０２５１ ７、Ｃ）２５２　２種の免役精製溶出液を０２５８．０２５３　カラム（４ｍｉ ｎｓＧ２５９．０２５４　１〜４）上緩衝液交俟し、つぃ１Ｑ、　Ｃ）２５　ｃ Ｏｎｃ、１　でｕｉｎｉｔａｎ系（４ｃｙｃｌｅｓｌｌ、Ｇ２５　ｃｏｎｃ、２ 　Ｇ２５ＣＯｎ０．　１〜４　）上で１２、Ｇ２５　Ｃｏｎｅ、３　ｄａした。

１３、　Ｇ２５　ｃｏｎｃ、４ こｎから、と（にレーン６〜１３から、この方法で製造さｎたｔＰＡは主として 一本鎖型で二本鎖型Ｉ工きわめて微量にしか言まれでいないことがわかる。これ はさらに第２図に示し一ケ９ルによっても確認される。

高度な負荷を行ったレーン４でも、きわめて微量の二本鎖型しか観察されない。

一本鎖ｔＰＡのサンプルを、ピーグル犬を用い、体重１ｋｇあ１こ９０．０５〜 ０．４　ｗのレベ／ｌ／　テｉｎ　ＶｉＶｏ　７　ッセイを行ったが、完全に活 性であることが明らかにされた。

さらに、界面活性剤を含有する低ｐｉ（緩衝液中に１■／−以上の濃度でｔＰＡ を含む溶液でも、沈殿を生じないし、保存に安定で、また容器の壁にｔＰＡを付 層させることもできなかった。

アミノ酸分析、酵素活性、フィブリン結合活性およびＮ末端解析により、本発明 の方法の生成物は、池の物質を全く交雑していないｔＰＡであることが明らかに さｎた。

とくに、本発明の方法の生成物のＮ末端解析では、その９４％が以下のＮ末端配 列 ５Ｈ２−Ｇ−Ａ−ｉ−ｓ−ｙ−Ｑ−ｖ−ｚ（￥なわち完全なアミノ葭配タリ〕を 有し、残りの６％のみが次のＮ末端配列 ＮＨ２−８−Ｙ−Ｑ−Ｖ−工 を示し１こ。

対照として、上述し１こと同じ発酵を行い、生成物ｔＰＡを慣用の操作に従い、 慣用のＰＨ、イオン強度で分離した。精製をできる眠り速やかに行うためＣｔ） 特別な注意はしなかつ１こ。この対照英検で得られ１こ生成物は、王として一本 鎖型”ＣＰＡであった。しかしながら、Ｎ末端配列が異なる様々の種類を包んで いた。その分布は次のとおりであった。

Ｎ：（２−Ｇ−ｈ−Ｒ−ｓ−ｘ−ｏ、−ｖ−工５８％ＮＨ２−Ｒ−８−Ｙ−Ｑ− Ｖ−工　１８％ＮＨ２−３−Ｙ−Ｑ−Ｖ−工　１２％ ＮＨ２−Ｙ−Ｑ−Ｖ−工　１１％ 以上のように、本発明の方法によれば、高度に均一な、高度に純粋な、一本領ｔ ＰＡが製造できることが明らかであり、これは本願出願前公知のどの方法によっ ても製造できなかったものである。

本発明の方法を以上、純粋に例示のみの目的で記述したが、添付の請求の範囲に 定義された本発明の範囲から逸脱することなく、細部に他の改変および１参飾が 可能なことは自明のとおりである。

手続補正書は式） ％式％ １、事件の表示 ＰＣ’ｒ／ＧＢ８７１００４９８ ２−発明の名称 精製方法 ３−補正をする者 事件との関係　特許出願人 氏名（名称） セルチック　リミテッド ４−代理人 居　所　〒１００東京都千代田区大手町二丁百２番１号６、補正により増加する 請求項の数 ７−補正の対象 明細書及び請求の範囲翻訳文 明細書及び請求の範囲翻訳文の浄Ｍ（内容に変更なし）国際調査報告 ｍｍｍ＊ｍ　ｍｅｅ＋ｍａｗｓ　１１１１．　ＰＣＴ／ＧＢ　８７１００４９８ 　−２−に◇ｚ：（：ＯＴＨＥ　：％’：：Ｌ’ＪＡＴ：ＣＮＡ＋　５ＺＡＦ、 ＳＦ、Ｒ二？ＣＲＴ　ＣＮＥ：’−Ａ−０１６３７５１１ｉ／１２／８５　Ｎｏ ｒ、ｅＥ：’−Ａ−０１９６２２６　０１／ｎｏ／８６　Ｊ？−Ａ−６Ｌ２２Ｌ ！２９　０１７ｎｏ／Ｅ１６

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 （１）ｔＰＡを含有する母液に、ａ）高度に陰イオン性のクロマトグラフイーメ ジウム上でのイオン交換クロマトグラフィー工程、およびｂ）アフイニティーク ロマトグラフイー工程を実施することを特徴とするｔＰＡの精製方法 （２）精製操作の全段階で界面活性剤を存在させる請求の範囲第１項に記載の方 法 （３）界面活性剤は０．０１％ツイーン８０である請求の範囲第２項に記載の方 法 （４）精製操作に用いられる緩衝液のｐＨは可能な限り低く維持する請求の範囲 第１項から第３項までのいずれかに記載の方法 （５）母液にはアプロチニンのようなセリンプロテアーゼインヒビターを加える 請求の範囲第１項から第４項までのいずれかに記載の方法 （６）ｔＰＡを含有する母液を、イオン強度２５ｍｓまたはそれ以下、ｐＨは４ 〜７の緩衝液で平衡化した高度に陰イオン性のクロマトグラフイーメジウム（Ｈ ＡＣＭ）に適用し、高度に陰イオン性のクロマトグラフイーメジウムからｔＰＡ をイオン強度の高い緩衝液で溶出し、高度に陰イオン性のクロマトグラフイーメ ジウムからの溶出液を、クロマトグラフイ−材料に抗−ｔＰＡ抗体を共有結合さ せてなりｔＰＡの抗体への結合を妨害しない緩衝液で平衡化したアフイニテイー クロマトグラフイーメジウム（ＡＣＭ）に適用し、アフイニテイークロマトグラ フイーメジウムからｔＰＡをｔＰＡへの抗体の結合を分裂する緩衝液で溶出する 請求の範囲第１項から第５項までのいずれかに記載の方法（７）母液は、組換え ＤＮＡ技術によつてｔＰＡを発現し分泌できるように形質転換された真核生物細 胞系の培養液からの上澄液である請求の範囲第１項から第６項までのいずれかに 記載の方法 （８）母液はＨＡＣＭへの適用前に澄明化する請求の範囲第７項に記載の方法 （９）ＨＡＣＭ平衡化緩衝液のｐＨは４〜７、好ましくは約６またはそれ以下で ある請求の範囲第１項から第８項までのいずれかに記載の方法 （１０）ＨＡＣＭ溶出緩衝液のイオン強度は、５０ｍＭ酢酸塩および２００ｍＭ 塩化ナトリウムを含有し、ｐＨを６．０に調整した溶液のそれ以上である請求の 範囲第１項から第９項までのいずれかに記載の方法（１１）ＡＣＭはクロマトグ ラフイ−材料にモノクローナル抗体が結合したものである請求の範囲第１項から 第１０項までのいずれかに記載の方法 （１２）ＡＣＭ平衡化緩衝液は、１００ｍＭ塩化ナトリウムを含有する溶液のイ オン強度と等しいかまたは大きいイオン強度を有する請求の範囲第１項から第１ １項までのいずれかに記載の方法 （１３）ＡＣＭ平衡化緩衝液のｐＨは５〜７である請求の範囲第１項から第１２ 項までのいずれかに記載の方法（１４）ＡＣＭ溶出緩衝液は約３．５またはそれ 以下のｐＨを有する請求の範囲第１項から第１３項までのいずれかに記載の方法 （１５）ＡＣＭ溶出液は、低分子量排除限界を有するゲル濾過クロマトグラフイ ーメジウム（ＧＦＣＭ）を用い緩衝液交換を行う請求の範囲第１項から第１４項 までのいずれかに記載の方法 （１６）ＧＦＣＭはｐＨ４．０に調整した５０ｍＭ酢酸塩で平衡化する請求の範 囲第１５項に記載の方伝（１７）ＧＦＣＭの溶出液を濃縮する請求の範囲第１５ 項または第１６項のいずれかに記載の方法（１８）室温で実施する請求の範囲第 １項から第１７項までのいずれかに記載の方法 （１９）母液は捕集後直ちに処理し、各工程は可能な限り速やかに実施する請求 の範囲第１項から第１８項までのいずれかに記載の方法 （２０）例に記載したと実質的に等しいｔＰＡの精製方法 （２１）実質的にただ１個のＮ末端を有する実質的に一本鎖のみのｔＰＡからな るｔＰＡプレパレーシヨン（２２）Ｎ末端配列 Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ａ−Ｒ−Ｓ−Ｙ−Ｑ−Ｖ−Ｉを有する請求の範囲第２１項に記載の ｔＰＡプレパレーシヨン （２３）医薬として用いられる請求の範囲第２１項または第２２項に記載のｔＰ Ａプレパレーシヨン（２４）低ｐＨ緩衝液中、高濃度のｔＰＡ安定溶液（２５） ｔＰＡは請求の範囲第１項から第２０項までのいずれかに記載の方法で製造され るかまたは請求の範囲第２１項から第２３項までのいずれかに記載のｔＰＡであ る請求の範囲第２４項に記載の溶液発明の詳細な説明