KR900002345B1

KR900002345B1 - 정상인의 결장세포로 부터 플라스미노겐 활성인자의 대량 생산방법

Info

Publication number: KR900002345B1
Application number: KR1019870003340A
Authority: KR
Inventors: 토마스 커널리 다니엘; 엠 엔)페더 조셉(엔; 콘스탄티노스 하라카스 니콜라스; 피터 샤우만 존; 존 위트워 아더
Original assignee: 몬산토 캄파니; 아놀드 하베이 콜
Priority date: 1986-04-09
Filing date: 1987-04-08
Publication date: 1990-04-12
Also published as: FI871536A; PT84637A; NO871477D0; ZA872530B; DK178487A; FI871536A0; AU7130287A; EP0241448A3; NO168055B; NO871477L; US5132214A; EP0241448A2; AU590918B2; JPS6322187A; CA1282726C; DK178487D0; ES2002685A4; NO168055C; KR870010182A; PT84637B

Abstract

내용 없음.

Description

정상인의 결장세포로 부터 플라스미노겐 활성인자의 대량 생산방법

제 1 도는 정상인의 결장 세포 t-PA분석 결과를 나타내는 것으로, PA활성도에 대한 비색분석에 있어서 t-PA와 상업적으로 유용한 u-PA를 비교하여 흡광도에 따른 피브리노겐(mg/ml)을 도시한 것.

제 2 도는 환원되고 카르복시메틸화된 정상인의 결장세포 t-PA의 역상 HPLC결과를 나타낸 것.

제 3 도는 환원되고 카르복시메틸화된 보우스 흑색종 t-PA의 역상 HPLC결과를 나타낸 것.

제 4 도는 제 2 도의 분리를 하는동안 얻어진 분획물의 환원된 SDS-PAGE결과(하층판넬 b)와 제 3 도의 분리를 하는 동안 얻어진 분획물의 환원된 SDS-PAGE결과]상층 판넬 a).

제 5 도는 카르복시메틸화된 결장 t-PA A사슬로 부터 얻어진 트립신분해 펩타이드의 역상 HPLC결과를 나타낸 것.

제 6 도는 파르복시메틸화된 보우스-흑색종 t-PA A사슬로 부터 얻어진 트립신분해 펩타이드의 역상 HPLC결과를 나타낸 것.

제 7 도는 카르복시메틸화된 결장 t-PA B사슬로 부터 얻어진 트립신분해 펩타이드의 역상 HPLC결과를 나타낸 것.

제 8 도는 카르복시메틸화된 보우스 흑색종 t-PA B사슬로 부터 얻어진 트립신 분해 펩타이드의 역상 HPLC결과를 나타낸 것.

제 9 도는 실시예2와 표 1 에 대한 콘 A-세파로스 4B분별공정에 관한 크로마토그램.

제 10 도는 실시예2와 표 2 에 대한 콘 A-세파로스 B분별공정에 관한 크로마토그램이다.

본 발명은 혈전 용해제로 유용한 플라스미노겐 활성인자에 관한 것으로, 좀더 구체적으로는 배양된 정상인의 결장세포로 부터 플라스미노겐 활성인자를 대량으로 생산하는 방법에 관한 것이다.

플라스미노겐 활성인자들(PA)은 인체에 광범위하게 분산되어 있는 것으로 조직 추출물로 부터 정제할 수 있음이 알려져 있다. 대표적인 조직원의 예로는 신장과 폐조직이다. 가장 특성을 나타내는 이러한 플라스미노겐 활성인자들은 유로키나아제 형 플라스미노겐 활성인자(u-PA)와 조직형 플라스미노겐 활성인자(t-PA)의 두가지로 대별된다. u-PA와 t-PA는 인간 플라스마내에 ng/ml의 농도로 존재하지만 면역학적으로는 관여하지 않는다. t-PA는 u-PA보다 피브린에 대한 친화력이 높은것이 밝혀진바 있다. 인간의 뇨 및 포유동물의 신장세포에서 분리하여 정제된 u-PA생성물들은 약학적으로 혈전 용해제로서 유용한 것이다. t-PA는 혈액과 조직 추출물내에 매우 낮은 농도로 존재하기 때문에 이와같은 적합한 혈전용해제를 생산하는 방법과 기타 근원들에 대한 연구, 노력이 계속되고 있는 실정이다.

대량으로 t-PA를 생산하는 한가지 방법은 생체외에서 세포배양 조건으로 성장시킨 인간 흑색종[세포의 배양액으로 부터 단백질을 분리하여 안정화된 인간 흑색종] 세포주(BOWES)를 이 목적에 사용하여 왔다. 예를 들면, 1881. 12. 16. 출원공고된 유럽 특히 출원번호 제41,766호 ; Rijken과 Collen의 J. Biol. Chem. 256(13), 7035-7041(1981) ; Kluft et al., Adv. Biotech. Proc.2 Alan R. Liss, Inc., 1983, PP. 97-110등이 있다.

이와같은 세포주로 부터의 유전적 정보 또한 대장균으로 부터 발현시킬 수 있는데 이는 통상적인 재조합 DNA유전자의 접합방법(Splicing methods)을 사용하므로써 그 미생물이 t-PA단백질을 생산하도록 하는 것이다. 이러한 예로서는 1983. 11. 23. 출원공고된 영국특허출원제 2,119,804호 ; Pennica et al., Neture 301, 214-221(1983) ; 과 Vehar et al., Biotech. 2(12), 1051-1057(1984)등이 있다. 보우스 흑색종으로 부터 얻은 이와같은 t-PA물질은 인간에 주입 되어 어느정도의 효과가 있었다. Collen et al., Circulation 70 16, 1012-1017(1984) 참조.

보우스흑색종으로 부터 유래된 t-PA의 분명한 유용성에도 불구하고, 암세포나 또는 암세포로 부터 유래된 유전정보를 사용하므로써 얻어진 물질은 치료의 용도로 사용할 경우에는 투여량이 불명확한 문제점이 있었다. 따라서 암세포들(형질이 전환된 세포들)은 인간의 형질전환성장인자들을 생성할 수 있다는 것이 밝혀졌다. 참고문헌으로써 Delarco와 Todaro, Proc. Natl. Acad. Sci. USA75, 4001-4005(1978) ; 과 Todaro et al., Ibid., 77, 5258-5262(1980)등이 있다. 암세포들로 부터 유래된 극소량의 잔여 DNA가 대장균이나 또는 유전공학적으로 형질전환시킨 세포내에 삽입되어 발현된다 하더라도 이러한 근원으로 부터 얻어진 t-PA를 환자에게 투여될 경우에는 해로운 결과를 야기시키는 가능성이 나타난다. 이러한 위협성은 다양한 정제기술의 사용 및 환자의 적절한 관리감독으로 극소화 시킬 수 있다고 하더라도, 아직까지는 암세포들로 부터 유래되지 않은 t-PA를 직간접적으로 사용하는 것이 바람직한 실정이다. 바이러스성 유전물질이나 또는 종양발생유전자(Oncogene)생성물의 존재 가능성은 형질이 전환된 세포들로 부터 유래된 물질을 치료용으로 사용함에 있어서 중대한 지장을 초래한다.

따라서, 정상인의 세포로 부터 조직형의 플라스미노겐 활성인자를 대량으로 생산하는 것이 가장 바람직한 것이다. 배양된 정상인의 세포를 t-PA의 근원으로 사용한 예로는 미국특허제 4,505,893화와 미국특허 제 4,550,080호가 있다.

상술한 특허에서 다양한 세포근원들에 대하여 연급하고 있다고 하더라도, 공지된 방법으로 실제로 배양된 것은 단지 초기배아(또는 태아)의 신장, 폐, 포피, 피부 및 작은 창자(Flow Laboratories)등이다.

한편, t-PA의 생산을 위하여 정상인의 태아 폐세포를 사용한것은 Brouty-Boye et al., Biotech. 2(12), 1058-1062(1984)에 공지된바 있으며, t-PA근원 물질로써 인간의 자궁조직을 사용한 것은 Rijken 과 Collen, J Biol. Chem. 256(13), 7035-7041(1981)[과 Pohl et al., FEBS Lett 168(1), 29-32(1984)에 공지되었다.

본 발명에 의한 플라스미노겐 활성인자(PA)는 대량 생산에 적합하도록 배양된 정상인의 결장 세포로 부터 얻어진 것이다. 이를 정제하여 얻은 결장 t-PA는 본 발명에서 참조로한 동시 계속 특허출원 제834,080호(1986. 2. 26. 출원)에 언급한 올리고삭카라이드 구조체내의 보우스 흑색종 t-PA와는 화학적으로 상이함을 보인다.

본 발명의 인간 플라스미노겐 활성인자를 생산하기 위한 방법은 생체외에서 정상인의 결장세포를 영양 배지내에서 배양하고, 얻어지는 순화배지(coditioned medium)를 아연 킬레이트-아가로스 일차 친화성 크로마토그래피 처리를 한 다음, (a)콘카나발린 A-아가로스, (b)피브린-셀라이트 와 (c)피브린-아가로스로 구성된 군으로 부터 선택된 물질로 2차 친화성 크로마토그래피 처리를 한후 TSK 3000 SW사이즈 분자 배척 고성능액체 크로마토그래피 및 P-아미노벤즈 아미딘아가로스 친화성 크로마토그래피를 행하고 얻어지는 플라스미노겐 활성인자의 분획물을 회수 하는 것이다.

본 발명을 좀더 구체적으로 설명 한다면, 플라스미노겐 활성인자는 정상인의 결장 섬유아세포주 CCD-18Co에서 분리시키는 것이다. 유로키나아제형 플라스미노겐 활성인자(u-PA)와 조직형 플라스미노겐 활성인자(t-PA)모두는 이 세포주의 배양액들로부터 대량으로 얻을 수 있다. 결장 u-PA는 약 54,000달톤의 분자량을 갖는데 반하여 결장 t-PA는 약 67,000달톤의 분자량을 갖는다. CCD-18Co세포주는 미국 메릴랜드 록크빌 소재 ATCC(American Type Culture Collection)에 기탁된 것으로 기탁번호 ATCC CRS-1459로써 이 세포주는 기탁자의 요구에 의해 일반인이 분양 받을 수 있다.

이 세포주는 20%우태아 혈청과 항생물질이 포함된 CRCM배지내에서 처음 부터 배양한 것으로 CRCM배지는 ATCC에 의하여 개선된 영양 배지이다. 계대배양을 하는 동안에 이 배지를 10%우태아 혈청을 보충한 Earle's BSS(염용액으로 평형된)배지에 비 필수아미노산을 함한 필수 최소배지(Eagle)로 바꾸어 준다. 이러한 세포들은 basal medium Eagle's(BME), Dulbecco's modified Eagle medium(DMEM), medium 199, RPMY 1640 medium등과 같은 이미 잘알려진 세포배양배지에서도 배양할 수 있으며 H.J.Morton, In Vitro 6, 89-108(1970)에 상세히 언급된 바와같은 유사한 세포 배양배지에 배양할 수도 있다.

이러한 통상적인 배양배지는 기지의 아미노산, 무기산, 비타민 호르몬과 탄수화물이 포함된 것으로 배지를 보강하기 위하여 자주 우태아 혈청과 같은 포유류 동물의 혈청을 첨가하기도 한다. 이러한 배지에 사용할 수 있는 바람직한 기타의 성분들로는 락트알부민 가수분해물, 트립토판, 트립토스, 팹톤과 같은 단백질 가수 분해물 및 이들과 유사한 물질들이 있다. 다양한 종류의 여러가지 정상인의 결장섬유아세포주 또한 본발명에 따라 사용할 수 있으므로, 사용할 수 있는 또다른 정상인의 결장섬유아세포주로는 기탁번호가 ATCC CRS-1541인 CCD-112 CoN이 있다.

포유류 동물의 세포를 대규모로 성장시키기 위한 방법들은 잘알려져 있으며, 이들의 방법은 본 발명에서 언급된 결장세포를 배양하는데 사용할 수 있다. 예를들어 이러한 방법들은 Tolbert et al., Biotech. Bioeng. XXIV, 1671-1679(1982) ; Tolbert 와 Feder, Ann. Rept. Ferm Proc., Vol 6, ch, 3, PP. 35-74(1983) ; Harakas, Ibid. Vol. 7, oh. 7, PP, 156-211(1984) ; 및 상기 간행물들이 인용한 참고문헌에 기술되어 있다. 미국특허 제4,166,768호 ; 제4,289,854호 ; 제4,335,215호와 제4,537,860호에 플라스미노겐 활성인자의 생산을 위하여 세포들의 유지 방법 및 대규모로 성장시키기 위한 특히 유익한 방법 및 장치등에 관하여 기술되어 있다. 이들의 특허에 기술된 내용을 본 발명에서 참고로 하였으며 기술되어 있는 방법과 장치는 본 발명의 결장세포를 배양하는데 사용할 수 있다.

결장 세포들은 미국특허 제 4,335,215호에 언급된 바와같이 진탕 마이크로캐리어 부유배양방법을 사용하여 영양배지중에서 37℃의 온도조건으로 배양하는 것이 바람직하며, 적당한 성장기간이 경과 한후에 0.5℃락트알부민 가수분해물이 첨가된 배지를 사용하는 미국 특허 제 4,537,860호에 언급된 정적 유지반응기(static maintenance reactor)내에서 유지시킨다.

소비된 배양배지로 부터 플라스미노겐 활성인자의 정제는 염과 용매 분별방법, 콜로이드성 물질에 의한 흡착, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피, 면역 친화성 크로마토그래피, 전기영동 및 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC)등과 같은 단백질을 분리하기 위한 다양한 공지의 방법등을 사용할 수 있다.

특히 유용한 것으로 알려진 방법으로는 아연 킬레이트-아가로스, P-아미노벤즈아미딘아가로스, 콘카나발린 A-아가로스(Con A-Sepharose

) 피브린 규조토(피브린-셀라이트

) 및 피브린-아가로스(피크림-세파로스)를 사용하는 아피니티 크로마토그래피 ; TSK 3000 SW사이즈 분자배척컬럼을 사용하는 HPLC ; 및 모노클로날항체를 사용하는 면역 친화성 크로마토그래피등이다.

바람직한 방법으로는, 소비된 배양배지를 아연 킬레이트-아가로스 친화성 크로마토그래피 및 콘카나발린 A-아가로스, 피브린-셀라이트, 피브린-아가로스등을 사용하여 친화성 크로마토그래피 처리를 하고 TSK 3000 SW사이즈 분자배척 HPLC처리를 한후 PA활성도로 P-아미노밴즈아미딘 아가로스 친화성 크로마토그래피를 행하는 것이다.

아연 킬레이트-아가로스를 사용하여 친화성 크로마토그래피를 행하면 u-PA와 u-PA가 모두 컬럼에 흡착된다. 용출은 50mM이미다졸로 행하는 것이 바람직하다. 이 과정은 플라스미노겐 활성인자의 고유 활성도를 약 5-10배로 증가 시킨다.

u-PA와 t-PA의 분리는 정제공정 다음에 콘카나발린 A-세파로스, 피브린-셀라이트나 피브린-세파로스를 사용하는 친화성 크로마토그래피로 행하는 것이 바람직하다.

콘 A-세파로스컬럼은 컬럼 평형 완충액과 동일한 체적의 0.4M의 α-D-메틸만노사이드 및 2M의 KSCN의 선형 구배를 이용하여 용리하는 것이 바람직하다.

반면에 u-PA가 아닌 t-PA는 피브린-셀라이트나 또는 피브린-세파로스컬럼에 흡착되기 때문에 0.2M의 아르기닌으로 용리하는 것이 바람직하다.

콘 A-세파로스, 피브린-셀라이트 나 또는 피브린-세파로스 친화성 크로마토그래피로 얻은 t-PA분획물은 TSK 3000 SW사이즈 분자 배척 HKPLC처리후에 P-아미노벤즈 아미딘-아가로스 친화성 크로마토그래피 처리하여 좀더 정제한다.

아연 킬레이트-아가로스는 Rijken과 Collen에 의해 J. Biol. Chem. 256(13), 7035-7041(1981)에 기재된 방법인 이미노디아세트산을 세파로스

4B에 커플링시키고 이 물질을 염화아연(7.3 mM)으로 포화시킨다음, pH 8.0, 0.05M의 EDTA, pH10., 0.05M의 NH₄HCO₃및 물로 재생시킨 후 염화 아연으로 재포화 시켜 제조할 수 있다.

습구슬직경(Wet bead diameter)이 60-140/μ인 구슬형태의 아가로스겔로 구성된 세파로스 6B(미국 뉴우져어지, 피스카타웨이 소재 파마시아 화인 케미칼스, 아이엔씨. 제품)를 세파로스 4B의 대용으로 사용할 수 있다. 킬레이팅 세파로스 6B는 제조원으로부터 완제품으로 구입할 수 있는 것이다.

파마시아 화인 케미칼스, 아이엔씨에서 제조한 콘 A-세파로스도 유사한 유용성을 갖는것으로 이것은 콘카나발린 A를 세파로스 4B에 시아노겐 브로마이드 방법으로 커플링시켜 제조한 것이다. 콘 A-세파로스 4B 또한 완제품으로 파마시아 화인 케미칼스 아이엔씨, 로부터 구입할 수 있다.

파라-아미노벤즈아미딘아가로스는 피어스 케미칼 캄파니에서 제조한 것으로 상업적으로 유용한 것이다.

TSK 3000 SW사이즈 배척 HPLC는 친수성이고 구형인 실리카 컬럼으로 구성된 것으로 제조원으로는 일본의 야마구치 소재 도오요소다 메뉴팩츄어링 컴페니, 리미티드와 미국의 켈리포니아 플레톤 소재 벡크만 라보라토리스가 있다. 적합한 TSK 3000 SW컬럼으로 스페로겔-TSK 3000 SWG(Spherogel-TSK 3000 SWG)로 공극의 크기가 250A ±5%, 입자의 크기가 13+2μ이고 분자량 분별범위는 15,000-150,000이다.

피브린-셀라이트는 셀라이트 필터와 규조토(규조암)인 보조제로 제조된 피브린 친화성 기질(fibrin affinity matrix)로 제조원으로는 미국 콜로라도 덴버소재 만빌리 필드레이션 앤드 미네랄스사이다.

이 기질은 Proc. Natl. Acad. Sci USA 78, 4265-4269(1981)에 기재된 Husain et al. 의 방법으로 제조할 수 있다. 이 제조방법에 의하면, 셀라이트 기질의 표면을 완충액내에서 과잉의 피브리노겐에 노출시킨다음, 피브리노겐이 피브린으로 전환되도록 완충액내에서 트롬빈에 노출시키면, 흡착 표면이 피브린으로 완전히 채워지게 되는 것이다. 피브린-셀라이트상의 친화성 크로마토그래피는 유로키나아제 플라스미노겐 활성인자와 같은 비 피브린 결합 단백질을 제거하는데 사용된다.

피브린-세파로스 친화성 크로마토그래피에 있어서는 피브린의 기질을 셀라이트(규조암)대신에 세파로스(아가로스)상에 형성 시킨다.

면역 친화성 크로마토그래피에 있어서는 플라스미노겐 활성인자에 대한 친화성을 갖는 단일클론항체들을 포리사카라이드 구슬에 부착시킨다음, 크로마토그래피 컬럼에 사용하는 것이다. 세파로스 4B상에 면역화된 보우스 t-PA의 단일 클론항체들은 이러한 크로마토그래피 방법에 유용하다는 것이 밝혀진바 있다.

후술하는 실시예에 사용된 물질과 방법은 다음과 같다.

[물질과 방법]

[일반]

단백질의 측정은 바이오래드 단백질 측정키트를 사용하고 표준품으로는BSA(bovine serum albuminsigma Fraction V)를 사용하는 Anal. Biochem. 72, 248-254(1976)에 기재된 브래드포드의 방법으로 측정하였다.

SDS-PAGE(소듐 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)은 Nature 227, 680-685(1970)에 기재된 라에몰리의 방법으로 하였다.

대조구로는 보우스 멜라노마 t-PA(미국 코네티컷 그린위치 소재 아메리칸 다이그노스리카 인코포레이티드 제조, 고유 활성도는 WHO의 u-PA표준품으로 (스캔) 와u-PA(Abbokinase

,미국 일리노이스 시카고 아보트 라보라토리스사 제조, Mr=33,000, 임상용등급 고유 활성도는 기재되어 있지 않음)를 사용하였다.

감소된 시료들에 대해서는 25mM의 디티오스레이톨을 시료 완충용액에 포함시켰다. 단백질은 겔 중에서 바이오래드키트를 사용하여 코마시 브릴란트 블루 R 250이나 질산은으로 염색 하였다.

표준품(파마시아)의 분자량은, 포스포릴라제 B가 94,000, 보바인 혈청알부민이 67,000, 난알부민이 43,000, 카본 탈수효소가 30,000, 대두트립신 인히비터가 20,000이고 α-락트알부민이 14,400이다.

[HPLC]

Hewlett-Packard 1090 A 액체 크로마토그래피나 모델 450인 조절기, 용매 이송을 위한 모델 114M펌프 2개 및 모델 165인 파장검색기를 부착한 백크만형을 HPLC로 사용하였다.

[PA 점적분석]

ml당 프라그 단위(ploug unit)로 표현되는 활성도는 피브리노겐트롬빈과 플라스미노겐이 포함된 페트리디쉬 내에서 아가로스겔의 표면에 시료 5μ1를 사용하여 측정하였다. 탁한 겔을 PA활성도에 비례하여 지역내에서 맑아졌다.

PA활성도는 Progress in Chemical Fibrinolysis and Thrombosis, Vol.I, ed.에 기재된 하버케이트와 브라크만의 방법 및 Raven Press, New York, 1975, PP. 151-159에 기재된 다비드슨의 방법과 유사한 방법으로 측정한 유로키나아제 표준품과 비교하여 측정하였다.

따라서 t-PA에 대한 측정된 PA활성도를 t-PA WHO 표준품과 비교하기 위해서는 수치들에 상수인 30을 곱하여야 한다. 이것은 t-PA WHO 표준품을 PA분석방법으로 실험하기 위하여 정해진 것이다.

SDS-PAGE 전기영동 오버레이(Overlays)

활성모이에티의 분자량은 Supra에 기재된 라에믈리의 방법을 사용하여 비환원된 SDS-PAGE를 판별한 다음, SDS를 세척한후 폴리아크릴아미드겔을 피브리노겐, 트롬빈, 플라스미노겐, 아가로스겔(점적분석에서 사용된 유사한것)로 증층처리(Overlaying)한다.

분자량은 포함된 표준품으로 부터 계산한다.

활성대역에서의 탁한상태의 아가로스겔은 맑아진다. 이에대한 문현으로는 로스쿠토프와 무소니의 Blood 62(1), 62-68(1983)이 있다.

[PA의 분석]

PA에 대한 컬럼분획물의 일반적인 스크리닝을 하기 위해서는 상술한 바와같은 피브린-점적분석이나 펩타이드 기질 S-2322, D-Val-Gly-Arg-파라니트로아닐라이드(Kabi) 또는 S-2288, D-Ile-Pro-Arg-파라니트로아닐라이드-디하이드로클로라이드(Kabi)를 이용하여 96-웰 마이크로타이터 평판중에서 행하는 직접 비색분석방법을 사용한다. 근거가 되는 문헌으로는 Wallen et al., Eur.J.Biochem. 132, 681-686(1983)이 있다. 플라스민 펩타이드 기질 S-2251에 사용하는 결합분석(Coupled assay)은 t-PA로 플라스미노겐 활성화의 피브리노겐 자극효과를 측정하는데 사용한다. Verheijen et al., Thromb.Heamostas.48. 266-269(1982)참조. 이분석에서는 플라스미노겐(0.25CU단위, Kabi)과 S-2251(0.45mM)을 결장 t-PA 60단위나 또는 상업적으로 유용한 u-PA(Abbott사 제품, Abbokinase

)50단위와 함께 0.1M 포타슘포스페이트, pH7.6, 0.1% BSA 및 0.01% 트윈 80이 포함된 완충용액 200μ1 내에서 항온처리하였다.

실온에서 10분간 유지시킨 후 410nm에서 흡광도를 읽었다. 피브리노겐자극효과를 측정하기 위하여 다양한 양의 피브리노겐을 분석에 사용하였다.

아연 킬레이트-세파로스 크로마토그래피

아연 킬레이트-세파로스 크로마토그래피는 실질적으로 Rijken et al., Supra에 기재된 대로 행하였다.

그렇다하더라도 몇회에 걸쳐서는 PA활성을 결합하기 위하여 회분식방법(batch procedure)과 PA활성도를 회복시키기 위하여 컬럼용리방법을 사용하였다. 이러한 방법은 다음의 상세한 지침에 따라 행하였다.

[수지의 제조]

아연 킬레이팅 세파로스 6B는 다음과 같이 제조하였다 :

ㆍ 무균 H₂O로 채워진 수지를 20%에탄올수용액으로 세척하였다. 자기재 흡인 여과기(Buchner funnel)에서 수지용량의 10배에 상당하는 알코올로 세척하였다.

ㆍ 세파로스 6B수지가 75%정도 부유하도록 물을 채우고 실온에서 하룻밤 로링밀 내에서 회전시켜 탈가스화하였다. 수지를 마그네틱 교반기로 저어줄 경우에는 비이드가 손상을 입기 때문에 저어주지 않았다.

ㆍ 수지를 컬럼상이나 또는 자기재 흡인 여과기상에 채우기 위하여 pH5.0, 농도가 5mg/ml인 무균 ZnCl₂수용액을 사용하였다. 수지를 포화시키기 위해서 수지용량의 약 1.5-2배의 ZnCl₂를 사용하였다. ZnCl₂는 유출액을 10% Na₂Co₃수용액으로 실험하였을때 Zn⁺²을 나타내는 침전물이 생길때까지 수지에 가하였다. 수지를 충전시키는 적합한 방법으로 또다른 방법은 수지의 pH를 5이하로 하고, 수지에, 1-2배량의 ZnCl₂₍pH5.0)를 가한후 4℃에서 2-3시간 회전시키는 것이다. 상등액중 Zn⁺²침전물에 대해서는 미리 확인을한후 어느 경우에서라도 과잉의 Zn⁺²는 무균 밀리 -Q H₂O로 세척하여 제거하여야 하는 것으로 Zn⁺²가 수지에서 완벽하게 세척되었다하는것은 10% Na₂CO₃수용액으로 세척하였을시 유출 H₂O중에 침전물이 존재하지 않는것으로 확인할 수 있다.

ㆍ 다음에 충전시킨 수지를 컬럼완충용액 A(pH7.5인 1.0M Nacl+20mM 트리스-염산+0.01% 트윈 80의 혼합용액)으로 평형시키고 평형에 대한 지시기로는 pH측정기를 사용하였다. 이것은 자기재 흡인 여과기(Buchner funnel)상에서도 용이하게 행할 수 있는 것이다.

[플라스미노겐 활성인자(PA) 활성도결합 :]

[회분식방법]

ㆍ4℃에서 결장세포 배양 순화배지 배양물(CM)리터당 약 35g의 평형된 수지를 사용하였다.

ㆍ미리 첨가하지 않은 경우에는 CM에 0.01%(v/v)트윈 80을 가한다.

ㆍ0.2㎛의 Nalgene 필터로 무균 여과 할 수 있도록 10% 트윈 80수용액을 사용하였다.

ㆍCM ml당 페니실린 100단위와 CM ml당 스트렙토마이신 100㎍을 가하였다.

ㆍ직경이 5.5인치인 스테인레스스티일로된 프로펠라(Fisher Cat.No.14-509-1)를 사용하여 CM을 온화하게 교반하면서 0.1 또는 1N NaOH 나 1N HC1로 pH를 7.5가 되도록 조절하였다.

ㆍCM에 평형된 수지의 적당량을 가하고 CM용기를 4℃의 방으로 옮긴다음, 1.5시간동안 PA활성도의 결합을 행하였다.

ㆍ1.5시간이 경과한후에 교반을 멈추고 수지를 정착시켰다. 정착은 사용용량이 100리터인 배지 용기내에서 CM 100리터에 대하여 약 1.5시간 행하였다.

ㆍ결합되지 않은 CM상등액의 분획물을 가열시킨 탈활성용기(deactivation Vessel)에 펌핑하였다.

ㆍ수지와 간질에 미결합된 CM(interstitial unbound CM)을 10리터 용량의 플라스틱 콘테이너로 이송하였다.

ㆍ수지에 수지용량의 2배인 완충용액을 가하고 5분간 온화하게 저어주었다.

ㆍ5분이 경과한후에 교반을 멈추고 수지를 정착시켰다. 약 10-15분간 수지를 정착시키고 상등액은 탈활성화 탱크로 펌핑하였다.

ㆍ우수한 슬러리를 얻기위하여 수지에 수지의 용량과 동량인 완충용액 A를 가하였다. 이 슬러리를 밀폐된 무균 용기내에서 4℃로 하룻밤 정치시켰다.

[플라스미노겐 활성인자용리 : 컬럼법]

ㆍ수지슬러리를 예를들면 내경이 10cm, 높이가 27-40cm인 크로마토그래피 컬럼에 2-3리터의 수지를 요구하는 CM과 함께 서서히 가하였다. 수지는 정착이 잘되었으며 결합되지 않은 분획물은 시간당 약 2-2.5리터의 흐름속도로 유출시켰다.

ㆍ컬럼은 적어도 베드용량의 2배에 해당하는 완충용액 A로 시간당 1.5-2리터의 속도(내경이 10cm인 컬럼)로 세척하거나 또는 A 280nm에서의 흡광도가 0.2이하일때 까지 세척하였다. 컬럼에서 미 결합된 분획물을 세척하면 수지의 색상이 연적색에서 연갈색으로 변화됨을 알았다.

ㆍ용리 완충용액 B를 가하였다. 완충용액 B는 다음과 같이 제조된 것이다. 20mM의 트리스-염산+1M NaCl+0.01%(v/v) 트윈 80+50mM의 이미다졸, pH7.5

용리된 PA활성도는 갈색과 보라색을 나타내는 색대에 의하여 알 수 있다. 용리된 분획물의 수집을 A 280nm에서 흡광도가 〉 0.4일때 부터 시작하였다. 용리된 분획물의 용량은 컬럼 용량의 약 0.7 내지 0.95배 정도였다. 용리된 분획물의 수집은 A 280nm에서 나타나는 흡광계수와 모든 활성도가 용리됨에 따라 베드의 색상이 연백색을 띨때 중단하였다. 내경이 10cm인 컬럼에 있어서 용리 속도는 시간당 약 2리터이다. NaN₃0.02wt%를 용리된 분획물에 가하고 -35℃ 내지 -40℃로 냉동시켰다. 아연-킬레이트-세파로스 크로마토그래피를 사용하는 또다른 방법으로는, 일반적인 방법은 상술한 바와같이 행하고 PA활성도의 용리 및 결합은 내경이 18cm인 컬럼에 7리터의 아연-킬레이트-세파로스 6B수지를 채우고 컬럼을 조작하면서 계속적으로 행하는 것이다.

콘카나발린 A-세파로스 4B 크로마토그래피

표 1 중의 실시예 2(하기 참조) :

사용된 컬럼 : 내경=2.2cm, 높이=5cm

콘카나발린 A-세파로스 4B의 용량=19cc

0.01M의 포타슘 포스페이트, 1M의 NaCl, 0.01%(v/v) 트윈 80(시그마, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트)의 혼합용액인 pH7.5의 완충용액 C를 컬럼용량의 7배 이상의 양으로하여 시간당 38ml의 속도로 컬럼에 부가하여 컬럼을 평형화 하였다.

아연 킬레이트 크로마토그래피로부터 용리시킨 분획물을 시간당 38ml(10ml/시간/cm²)로 컬럼에 부가한 다음, 단백질이 존재하지 않음을 가르키는 280nm에서의 흡광도가 무시될때까지 컬럼을 완충용액 C로 세척하였다. 이와같은 조건을 얻기 위해서는 컬럼 용량의 3배 내지 4배에 상당하는 완충용액이 항상 요구된다.

150ml 완추용액 C의 선형구배와 2M의 KSCN, 0.4M의 α-D-메틸 만노사이드, 0.01M의 포타슘포스페이트 및 0.01% 트윈 80의 혼합용액의 pH가 7.5인 완충용액의 선형구배를 t-PA활성도의 용리에 사용하였다.

용리속도는 시간당 38ml로 유지시켜 13.4ml의 분획물을 수집하였다. 분획물 188 내지 193을 모아 80ml를 얻었다. 이러한 분별에 대한 크로마토그람을 제 9 도에 도시하였다.

[표 2 중의 실시예 2(하기참조) :]

사용된 컬럼 : 내경 10cm, 높이 6.7cm

콘카나발린 A-세파로스 4B의 용량 : 526cc

0.01M의 포타슘포스페이트, 1M의 NaCl, 0.01%(v/v) 트윈 80(시그마, 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트)의 혼합용액인 pH7.5의 완충용액 C를 컬럼 용량의 7배 이상의 양으로 하여 분당 13.1ml의 속도로 컬럼에 부가하여 컬럼을 평형화 하였다.

아연 킬레이트 크로마토그래피로부터 용리시킨 분획물을 시간당 13.1ml (10 ml/시간/cm²)로 컬럼에 부가한 다음, 단백질이 존재하지 않음을 가르키는 280nm에서 흡광도가 무시될때까지 컬럼을 완충용액 C로 세척하였다. 이와같은 조건을 얻기 위해서는 컬럼용량의 3배 내지 4배에 상당하는 완충용액이 항상 요구된다. 2.7리터 완충용액 C의 선형구배와 2M의 KSCN, 0.4M의 α-D-메틸만노사이드, 0.01M의 포타슘포스페이트 및 0.01% 트윈 80의 혼합용액으로 pH가 7.5인 완충용액의 성형구배를 t-PA활성도의 용리에 사용하였다. 용리속도는 분당 13.1ml로 유지시켜 13ml의 분획물을 수집하였다.

분획물 18 내지 230을 모아 1391ml를 얻었다.

이러한 분별에 대한 크로마토그람을 제 10 도에 도시하였다.

피브린-셀라이트 친화성 크로마토그래피

피브린 친화성수지는 Supra에 기재된 후세인의 방법을 사용하여 제조하였다. 죤스 만빌레 필터-에이드 셀라이트(Johns Manville Filter-Aid Celite, 산에 세척된것이 아님) 20g을 4리터의 밀리-Q워터로 세척하였다. 약 2시간동안 이물질을 정착시킨후 세척수를 제거하였다. 이러한 수세를 3회 반복하였다. 이 액체를 흡인 여과기(Buchner funnel)상에서 셀라이트로 부터 제거한후 여과깔대기 내에서 0.1M NaCl과 1mM의 에틸렌 디아민 테트라 아세트산(EDTA)이 포함된 pH가 7.5인 50mM의 포타슘포스페이트 완충용액 1리터로 세척하였다. 셀라이트를 50ml의 완충용액에 현탁시키고 실온으로 보관하였다.

Kabi피브리노겐 "L급"1.0g을 라이신/아가로스 컬럼에 통과시켜 플라스미노겐을 제거하고 0.3M NaCl이 포함된 pH7.5의 20mM 포타슘포스페이트 완충용액 160ml중에 냉동보관하였다.

피브리노겐을 실온에서 1mM의 수용액으로 하기 위하여 충분한 량의 EDTA에 가하였다. 과잉의 완충용액은 흡인 여과기(Buchner funnel)상에서 셀라이트로 부터 제거하였다. 습케이크(damp cake)를 피브리노겐 용액에 가하였다. 셀라이트는 군집이 없이 잘 현탁되었다. 트롬빈 250단위를 2-3분간 저어주면서 서서히 가하였다. 3-5분이 경과하면 셀라이트는 응결된 우유와 같은 외관을 갖기 시작한다. 총 15분간에 걸쳐서 어려움이 있더라도 계속 저어주었다. 과잉의 완충용액을 과잉의 피브린이 제거될때까지 서서히 가한다음, 흡인 여과기(Buchner funnel)상에서 셀라이트를 세척하였다. 피브린/셀라이트를 0.3mM의 NaCl, 1mM의 EDTA 및 5mM의 엡실론-아미노카프로산이 포함된 pH7.5의 10mM 포타슘포스페이트 완충용액 1리터로 세척하였다.

직경이 1.5cm인 컬럼에 투입한후, 피브린/셀라이트를 상술한 500ml의 완충용액으로 시간당 50ml의 흐름속도로 세척한 다음, 상술한 700ml의 완충용액에 0.2M의 아르기닌을 첨가하여 세척을 행한후 마지막으로 아르기닌-유리 완충용액 500ml로 평형화 하였다. 컬럼의 총 용량은 약 60ml로 사용하기 위하여 미리 4℃에서 보관하였다. 컬럼에 시간당 10ml의 속도로 결장아연-킬레이트 분획물을 부가하고 컬럼을 상술한 완충용액으로 세척한 다음, 시간당 10ml의 속도로 0.2M의 아르기닌이 포함된 상술한 완충용액으로 용리하였다.

[TSK 3000 SW 크로마토그래피]

콘A-세파로스 공정을 거친 시료들을 0.01%(v/v) 트윈 80으로 투석하고 냉동건조시킨다음, 20mM의 소듐포스페이트, pH6.8, 1.6M의 포타슘 티오시아네이트와 0.01%(v/v) 트윈 80을 포함하는 완충용액 2-10ml로 용해하였다. 불용성 물질은 원심분리하여 제거하고 2ml의 시료를 취하여 Spherogel TSK 3000 SWG컬럼(내경 2.1cm, 높이 60cm)에 주입시켰다. HPLC를 사용하여 흐름속도는 분당 5ml로 유지시켰으며, 4ml의 분획물을 폴리스티렌 관으로 부터 수집하였다. 활성도는 비색성 펩타이드기질 S-2322, D-Val-Gly-Arh-파라니트로 아닐라이드(Kabi)를 사용하여 측정하였다.

[P-아미노벤즈아미딘 크로마토그래피]

TSK 3000 SW 공정을 거친 시료들을 0.01%(v/v) 트윈 80으로 투석하고 냉동건조시킨 다음, 5ml의 증류수에 용해하였다. 시료들을 P-아미노벤즈아미딘 아가로스(Pierce)가 들어 있는 컬럼(1.2cm×10cm)에 부하하고 50mM의 트리스-염산, pH8.0, 0.5M의 NaCl과 0.01%(v/v) 트윈 80이 포함된 완충용액으로 분당 0.5ml의 흐름속도로 세척하였다. A280nm에서의 흡광도가 바셀린값을 나타낸 후에 1M의 아르기닌을 포함한 동일한 완충용액으로 용리하기전에 추가로 컬럼 용량의 2배에 상당하는 양으로 컬럼을 세척하였다. t-PA활성도를 측정하기 위하여 기질 S-2322를 사용하여 분획물을 분석하였다.

[결장 t-PA의 정제]

다음의 실시예에서는 본 발명의 배양된 정상인의 결장세포 CCD-18Co에서 대량으로 생산된 t-PA를 분리시키는 것을 좀더 상세하게 설명한다.

[실시예 1]

ATCC로 부터 분양받은 CCD-18Co세포(ATCC CRL-1459)를 37℃에서 10%우태아 혈청을 보충한 고농도의 글루코오스 배지인 Dulbecco사의 MEM배지를 사용하여 75cm²인 T-플라스크에서 성장시켰다. 다음에 성장된 세포들을 코닝 겔리-비이드 마이크로케리어(Corning Geli-Bead micro-carriers)를 사용하는 미국특허 제4,335,215호의 방법에 따라 동일한 배지내에서 대규모 마이크로케이어 현탁 배양으로 배양하였다. 마이크로케리어에 1.5×10¹¹세포가 부착되는 적합한 성장기가 경과된 후 세포들을 0.25-0.5% 락트알부민 가수분해물(LAH)을 보충한 무혈청순화배지를 사용, 미국특허 제4,537,860호에 기재된 SMR(Static main tenance reactor) 내에서 37℃로 보존하였다. SMR 내에서 4개월동안 보관하는 동안에 정제하여 생성물로 할 수 있는 약 1673리터의 조무혈청 순화배지 배양물을 회수할 수 있었다.

[실시예 2]

실시예 1의 순화배지 배양물로 부터 t-PA를 정제하는 방법은 다음과 같다.

하기한 표 1은 일련의 과정을 행함에 있어서 상술한 방법에 따라 정상인의 결장세포(CCD-18Co)로 부터 t-PA가 정제되는 것을 요약 기술한 것이다.

일련의 과정에 있어서, t-PA활성도를 결합시키기 위하여 사용된 아연-킬레이트-세파로스수지의 용량은 3500ml이다. 순화배지 배양물 96,000ml를 용량이 30갈론인 스테인레스스티일 용기에 넣고 저어주었다.

아연-킬레이트-세파로스 크로마토그래피는 다음의 고유조건으로 상술한 바와같이 행하였다(물질과 방법 참조).

ㆍ교반시간=3시간

ㆍ수지 정착소요시간=1.5시간

ㆍ내경 10cm컬럼으로 수지로 부터 PA활성도를 용리하는데 소요되는 시간=2시간

ㆍ수집된 용출액의 용량=2,000ml

콘A-세파로스 크로마토그래피 처리과정은 상술한 바와같다(물질과 방법 참조).

하기한 표 2 는 상술한 방법으로 또다른 일련의 과정을 통하여 정상인의 결장세포(CCD-18Co)로 부터 t-PA가 정제되는 것을 요약 기술한 것이다.

일련의 과정에 있어서, t-PA활성도를 결합 시키기 위하여 직경이 18cm인 컬럼에 사용된 아연-킬레이트-세파로스 수지의 용량은 7리터이다.

결합속도는 시간당 6.2리터로 하였다. 용리속도를 시간당 5리터로 하여 얻어진 용출액의 총량은 13,000ml이었다.

콘A-세파로스 크로마토그래피를 위한 기타의 모든 아연-킬레이트-세파로스컬럼의 조건들과 처리과정은 상술한 바와같다(물질과 방법 참조).

[표 1] CCD-18CO로 부터 t-PA의 정제 요약(DMEM+0.5% LAH가 포함된 SMR 순화배지(CM)사용)

(주) :

a ; WHO t-PA표준품과 비교하여 상수 30을 곱한 피브린 평판 분석값

b ; 프라그 단위

D/L ; 투석과 냉동건조

[표 2] CCD-18Co로 부터 t-PA의 정제 요약(카닌 혈전용해 시험 사용)

정상인의 결장세포(CCD-18Co)로 부터 생산된 t-PA를 상술한 방법으로 정제하여 2마리의 개에 대한 혈전용해실험에 사용 하였다. 주사하기전에 t-PA시료들을 생리적 등상액으로 하기 위하여 투석 하였다. 그런다음, 1M의 아르기닌을 포함하는 P-아미노벤즈아미딘 아가로스로 용리하고 피크를 나타내는 분획물(약 1.5mg/ml단백질)을 0.15M의 NaCl, 0.01% 트윈 80 혼합용액 12-15ml로 희석하고 72시간 동안 pH6.8인 0.3M의 NaCl, 1mM의 소듐포스페이트, 0.01% 트윈 80 혼합용액으로 투석(1 : 40)하였다.

이 투석과정중에 극소량의 단백질 침전물이 관찰되었다. 투석물의 pH는 7.9였다. 다음에 투석된 시료들을 무균 여과하고 4℃에서 8일간 보관하였다. 시료를 무균 0.01% 트윈 80의 동량의 양으로 희석하여 맑은 용액을 얻었다. 4℃에서 2일간 저장한 후에도 침전물이 눈에 띄었다. 무균 여과를 하면서 충분량의 3M 프로린을 가하여 농도가 20mM인 프로린을 얻었다. 4℃에서 수일이 경과된 후에서 침전물은 아직까지 존재하였다.

약 20ml의 0.15M NaCl, 0.01% 트윈 80을 가하고 용액을 무균 여과하여 맑은 시료 129ml를 얻었다.

이러한 개의 혈전 용액 실험에 따라서 1×3mm의 구리코일을 좌전방하행 관상동맥말단(left anterior descending coronary artery distal)을 통하여 첫번째 주 대각선가지 까지 삽입시켜 인공혈전을 유도하였다. 이 과정은 Circulation 69(3), 605-610(1984)에 언급된 Van de werf et al.의 방법으로 행하였다. 코일 부위에서 폐색성 혈전이 형성되었다. 혈관 엑스 촬영으로 응혈이 안정된 상태로 존재함을 확인 하였다. 50ml의 주사 펌프를 사용하여 t-PA용액을 중앙체에 정맥카테타르를 통해 주입하였다. 피보리노겐 t-PA항원, t-PA피브린용해성 활성도의 분석을 위하여 t-PA를 주입하기전에 혈액시료를 취하고 5분간격으로 30분간 t-PA를 주입시켰다. 개에 대한 한가지 실험에서 정상인의 결장 t-PA가 생체내에서 전신용균 상태(Systemic lytic state)가 야기됨이 없는 유효한 혈전 용해제임을 알 수 있었다.

이 실험에서 표 2의 기재와 같이 일련의 과정으로 부터 얻은 t-PA시료물질을 P-아미노벤즈아미딘 아가로스를 사용하는 친화성 크로마토그래피 정제과정을 생략하고 일련의 과정을 2회 행하여 얻은 물질의 추가시료와 함께 개에 연속으로 주입하였다.

또 다른개의 실험에 있어서는 응혈용해현상이 관찰되지 않았다. 그 이유는 확실히 알수는 없으나 몇몇의 인자들은 매우 중요한 것으로 여겨졌다. 첫째로는, 실험의 본질에 따라 개의 종류와 혈전을 상이하게 하여 각 실험에 사용하였다는 것이다. 이 실험에서 개의 트롬빈이 때때로 t-PA처리에 대하여 불확실한 이유로 인하여 저항성을 갖는 다는 것을 알았다.

둘째로는, 개에 대한 실험을 성공적으로 하기 위해서는 t-PA주입을 시작한후 25분간 헤파린을 투여 하였으나 이 실험에서는 헤파린을 투여하지 않았다는 것이다. 헤파린은 Bergmann et al., Science 220, 1181-1183(1983)과 Van de werf et al., Circulation 69(3), 605-610(1984)에 기재된 바와같이 이와같은 실험에서 재폐색현상을 방지하는데 사용되는 것이다. 세째로, 이 실험에서 사용된 t-PA는 용해성을 향상시키기 위하여 산으로 pH를 4로 조절한 것이며 이것은 t-PA가 간성 크리어런스(hepatic clearances)에 좀더 영향을 주는 원인이 될 수도 있다. 그럼으로 개에 대한 양 실험에 있어서, t-PA를 주입함에 따라 미리 주입시킨 수치와 비교하여 피브리노겐의 수준이 현저하게 감소하지 않으므로 t-PA의 피브린 특이성을 나타내는 것이다.

[실시예 3]

본 실시예는 정상인의 결장세포(CCD-18Co)가 54,000의 분자량을 갖는 확실한 효소인 u-PA 또한 생산할 수 있음을 인간 유로키나아제의 폴리클로날항체 및 Methods in Enzymol.104, 아카데믹 프레스, 1984. Part C, PP. 455-460에 기재된 Renart와 Sandoval의 웨스턴 블로트 임뮤노로지칼-일렉트로포레시스 방법(Western blot immunological-electrophoresis technique, electroblotting)에 의하여 보여주는 것이다.

이 방법에 따라 1㎍의 TSK 3000SW로 정제한, 단일 클로날 항체로 정제한 t-PA(실시예 4에서 제조된 것), 아메리칸 다이아크노스티카 흑색종(American Diagnostica melanoma)t-PA t-PA, 칼바이오켐사제조 u-PA, 아보트라보라토리스사 제조 u-PA 및 분자량 표시제(molecular weight marker)를 SDS PAGE에 사용하였다. 단백질들을 활성지(activated paper)상에 블로트하고 1 : 3000으로 희석한 그리인크로스 안티-휴먼 유로키나아제 토끼 혈청(Green Cross anti-hyman urokinase rabbit serum, 미국 캘리포니아 로스엔젤레스 알파 데라페우틱 코로레이셔 판매)으로 반응시켰다. 면역화된 단백질들을 방사선 요오드로 표지된 단백질 A로 표지하였다. 세척한후 방사선으로 표지된 면역화된 종이(radiolabeled immunolabeled paper)를 X-선 필름에 노출시켰다. 일부의 유로키나아제는 X-선 필름상에 검은점으로 나타났다. 유로키나아제는 TSK로 정제된 물질과 유로키나아제 조제물내에서는 나타났으나 단일 클로날 항체로 정제된 t-PA나 아메리칸 디아그노스티카 흑색종 또는 분자량 표시제내에서는 나타나지 않았다.

[실시예 4]

또다른 방법으로 2개의 플라스미노겐 활성인자 분자와 u-PA 및 t-PA를 분리시키기 위하여 콘카나발린 A 세파로스-4B 친화성 크로마토 그래피로 정제하는 대신에 세파로스-4B 기질상에서 면역화된 보우스 t-PA의 단일 클로날 항체들(mCAb's)을 특별하게 사용하여 면역 친화성 크로마토그래피로 정제하였다. mCAb's를 사용하여 결장 t-PA를 정제하는 공정은 다음과 같다.

즉, 겔 1.7ml당 10mg의 IgG를 포함하는 1바이알의 아메리칸 다이아그노스티카 PAM-1/세파로스(보우스 t-PA의 mCAb, 단일가지)를 물로 투석시킨 25ml의 결장 콘카나발린 A분획물을 사용하여 실온에서 4시간 동안 온화하게 저어주었다. 용액을 여과하고 세척한후 소형 컬럼에 투입하였다. PBS와 0.25M의 KSCN으로 세척한후, 보우스 t-PA mCAb제조원인 ADI(미국 코네티컷 그리인워 소재 American Diagnostica Incorporated)의 권고에 따라 PBS중의 1.6M KSCN으로 t-PA를 용리시켰다.

결장 t-PA를 보우스 흑색종중 2개의 가지를 갖는 t-PA의 mCAb(PAM-2, ADI사 제조)를 사용하여 정제하였다. 정제 과정에 있어서 CCD-18Co시료들의 순화배지를 아연-킬레이트 세파로스-6B상에서 크로마토그래피하고 결합된 플라스미노겐 활성인자(u-PA와 t-PA)분획물을 P-아미노벤즈아미딘 아가로스상에서 크로마토그래피한후, u-PA/t-PA복합결합분획물을 좀더 정제하였다.

상기 u-PA/t-PA분획물을 2M의 KSCN으로 용리할시 u-PA는 결합되지 않은 분획물로, t-PA는 결합된 분획물로 분별할 수 있는 PAM-2 mCAb를 사용하여 u-PA 및 t-PA로 분별하였다.

[실시예 5]

또다른 방법으로 u-PA와 t-PA를 분리하는 콘카나발린 A-세파로스 4B 친화성 크로마토그래피 정제를 세파로스 4B상에서 면역화된 t-PA가 특이하게 결합된 피브린을 사용하여 행하였다. 피브린/세파로스 친화성 크로마토그래피는 다음과 같이 행하였다 : 즉, 피브리노겐을 세파로스로 처리한 시아노겐 브로마이드에 부착시키고 과잉으로 활성화된 사이트를 에탄올아민으로 블록킹하였다. 부착된 피브리노겐을 트롬빈을 사용하여 피브린으로 전환시키고 구슬(bead)을 세척한후 1mM EDTA가 포함된 PBS중에 저장하였다.

결장 t-PA 아연-킬레이트 분획물의 시료를 피브린-세파로스-4B 컬럼에 부하하고 결합된 t-PA분획물을 0.1M NaCl, pH7.5인 50mM KHPO4, 1mM EDTA 및 0.2M 아르기닌이 혼합된 완충용액으로 용리하였다.

[결장 t-PA의 특성]

제 1 도는 피브리노겐(mg/ml)을 흡광도에 따라 표시된 비색분석 결과를 나타낸 것이다. 플라스민기질 S-2251을 사용하여 다양한 양의 피브리노겐의 존재하에서 결장 t-PA나 또는 u-PA로 플라스미노겐을 활성화함에 있어 u-PA에 비하여 t-PA의 활성도가 유익한 것을 알았다. 이 결과는 자궁 조직과 배양된 보우스 흑색종 세포들로 부터 유래된 t-PA에 대하여 Hoylaerts, et al J.Biol.Chem.257, 2912-2919(1982)에서 보고한 것과 유사하였다.

본 발명의 t-PA의 비교적 펩타이드구조를 구체적으로 설명하기 위하여 환원되고 카르복시메틸화된 정상인의 결장 t-PA(CCD-18Co)와 보우스 흑색종 t-PA를 각각 역상으로 VYDAC C-4컬럼을 사용하여 HPLC하였다. 이 컬럼은 미국 켈리포니아 헤스페리아 소재 세파레이션스 글부(Separations Group)으로 부터 구입한 것이다. HPLC 용리 프로파일들은 후술하는 제 2 도 내지 제 8 도에 각각 나타내었다.

제 2 도는 환원되고 카르복시메틸화된 결장세포 t-PA의 역상 HPLC 결과를 나타낸 것이다 결장 t-PA(1M의 NH₄HCO₃중 1.1mg)를 냉동 건조하고 카르복시 메틸화 하였다. Pohl et al이 Biochem.23 3701-3707(1984)에 기재한 방법으로 다음과 같이 완화 시켰다. 완충용액을 1M의 NH₄HCO₃로 교환하기 위하여 세파덱스 G-25(PD-10컬럼, 파마시아 제품)상에서 겔여과 하고 시료를 냉동건조한 다음, 0.1% 트리 플루오로아세트산(TFA)1ml로 용해 하였다. 4℃에서 하룻밤 정치시킨 다음, 시료(0.9ml)를 HPLC 컬럼에 부하하였다. HPLC 조건은 다음과 같다. Vydac 214TP456컬럼 (C-4,5μ, 300A, 4.6×250mm) : 실온 ; 1ml/분 ; 용리액의 조성은 0분에서는 10% 아세토니트릴, 0.1% TFA로 하고 100분에서는 60% 아세토니트릴, 0.1% TFA로 하였다. 0.5분에서의 분획물(0.5ml)을 수집하고 용출액을 280nm에서 모니터 하였다.

제 3 도는 환원되고 카르복시메틸화된 보우스 흑색종 t-PA의 역상 HPLC 결과를 나타낸 것이다. 보우스 흑색종 t-PA(아메리칸 다이아그노스티아사 제품, 제품번호 ＃110,1M의 NH₄HCO₃중 약 1mg)을 냉동건조하고 제 2 도에서 사용한 결장 t-PA시료와 병행하여 처리하였다. 그러나 카르복시메틸화된 단백질은 0.1% TFA에 완전히 용해되지 않았기 때문에 HPLC(컬럼에 주입하기 전에 불용성 물질은 원심분리하여 제거하였다.

제 4 도는 제 2 도와 제 3 도의 분리과정을 행하는 동안 얻어진 HPLC분획물들의 환원된 SDS-PAGE 결과를 나타낸 것이다. 여기에서 (a)는 제 3 도의 카르복시메틸화된 보우스 흑색종 t-PA의 크로마토그래피로 얻어진 분획물이고, (b)는 제 2 도의 카르복시메틸화된 결장 t-PA의 크로마토그래피로 얻어진 분획물이다. 다양한 분획물로된 유층(Pool)을 얻은 다음, 각 유층의 40μℓ씩을 겔에 래인(lane)을 달리하여 적용하였다. 래인의 구역은 제 4a 도 및 제 4b 도와 같았으며 각 구역에서의 분획물의 용리시간은 다음과 같이 하였다.

(1) 46.0-47.0분, (2) 47.0-49.5분, (3) 49.5-52.5분, (4) 52.5-57.5분, (5) 57.5-62.5분, (6) 62.5-65.5분, (7) 65.5-68.0분, (8) 68.0-70.0분.

래인 9는 HPLC컬럼에 부하한 시료이고 래인 10은 표준 분자량 (94K, 67K, 43K, 30K, 20K 및 14K)을 포함하는 시료이다. 겔을 쿠마시 블루로 염색하였다.

제 5 도는 카르복시메틸화된 결장 t-PA A 사슬로 부터 얻어진 트립신 분해 펩타이드의 역상 HPLC 결과이다. 제 2 도에서 47.0-52.5분간 용리하므로써 얻어진 분획물(280nm에서의 총합흡광도 : 230mAU)을 수집하고 냉동건조하였다(mAU=밀리흡광도 단위). 냉동 건조시킨 물질을 0.1M의 NH₄HCO₃(0.5ml)로 용해하고 트립신(TPCK처리, 시그마사제품) 4.1㎍을 가하였다. (TPCK=N-토실-L-페닐알라니클로로메틸케톤). 실온에서 12시간을 경과한 후 시료를 냉동 건조하였다. HPLC 컬럼에 주입하기 바로 직전에 시료를 0.1% TFA 0.5ml에 용해하였다. HPLC 조건은 다음과 같다 ; 누클레오실 Cl₈, 5μ, 100A, 4.6×250mm컬럼(Macherey-Nagel Inc.) ; 실온 ; 1ml/분 ; 용리액의 조성은 0분에서는 0%아세토니트릴, 0.1% TFA로 하고 105분에서는 35% 아세토니트릴 0.1% TEA로 하였다. 2.0ml의 분획물(2.0분)을 수집하고 유출액을 215nm에서 모니터 하였다.

제 6 도는 카르복시메틸화된 보우스 흑색종 t-PA A 사슬로 부터 얻어진 트립신 분해 펩타이드의 역상 HPLC 결과이다. 제 3 도에서 47.0-57.5분간 용리하여 얻은 분획물(280nm에서 총합흡광도 151mAU)을 수집하고 냉동건조 하였다. 3.0㎍의 트립신을 소화에 사용한 것을 제외하고는 제 5 도에서와 같이 트립신 처리하고 HPLC하였다.

제 7 도는 카르복시메틸화된 결장 t-PA B 사슬로 부터 얻어진 트립신 분해 펩타이드의 역상 HPLC 결과이다. 제 2 도의 68.0-70.0분의 용리시간에 얻어진 분획물(280nm에서의 총합흡광도 : 107mAU)을 수집하고 냉동건조하였다. 2.1㎍의 트립신을 사용하고 HPLC 용리액의 조성을 0분에서는 0% 아세토니트릴, 0.1% TFA를 사용하고 100분에서는 50% 아세토니트릴, 0.1% TFA를 사용한 것을 제외하고는 제 5 도에 기술된 대로 트립신처리하고 HPLC하였다.

제 8 도는 카르복시메틸화된 보우스-흑색종 t-PA B 사슬로 부터 얻어진 트립신분해 펩타이드의 역상 HPLC 결과이다. 제 3 도에서 68.0-70.0분간 용리하여 얻은 분획물(280nm에서의 총합흡광도 : 66AU)을 수집하고 냉동건조하였다. 1.3㎍의 트립신을 사용하고 HPLC 조성을 제 7 도와 같이 한 것을 제외하고는 제 5 도와 같이 트립신처리하고 HPLC하였다. 제 2 도와 제 3 도에 도시된 각각의 용리액 프로파일에서와 같이 환원하고 카르복시메틸화한 결장 t-PA나 흑색종 t-PA의 역상 HPLC 결과는 양자가 거의 비슷하였다. 이들의 용리액 프로파일의 상이한 부분에 해당하는 분획물을 모아 SDS-PAGE(소디움 도데실 설페이트, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동)에 의하여 분석할 경우에는 I형과 IIA형 사슬을 갖는 혼합물을 포함하면 47-53분 사이에서 피크가 나타나고 B 사슬을 포함하면 68-70분 사이에서 피크가 나타남을 알았다(제 4 도).

단일 사슬 t-PA(Single Chain t-PA)는 흑색종 조제물 보다 결장 물질에서 많은양으로 존재함이 명백하고, 결장종은 63-68분 사이에서 피크를 이루며 용리 되었다.

결장 t-PA의 A 사슬과 B 사슬에 상응하는 분획물(제 2 도) 또는 보우스 흑색종 t-PA(제 3 도)를 트립신으로 소화하고 얻어지는 펩타이드를 HPLC로 분리하였다(제 5 도 내지 제 8 도). 결장과 보우스 흑색종 t-PA에 대한 A 및 B 사슬의 프로파일들은 매우 유사하였으며 B 사슬 프로파일과는 주된 상이점이 없음이 명백하였다(제 7 도 및 제 8 도). 그러나 A 사슬 프로파일은 (1)결장 A 사슬 프로파일내에서 추가된 펩타이드(60.9분에서 용리)가 존재하는 것과 (2) 보우스 흑색종 A 사슬 프로파일 내에 54.5분에서 용리한 펩타이드가 다량 존재하는 것이 상이하였다.

그렇다 하더라도 이와같은 분석에 의하면 결장 t-PA와 흑색종 t-PA는 실제적으로 그들의 아미노산 서열면에서는 유사한 것이라는 일반적인 결론에 도달한다.

본 발명에서 사용한 생물학적으로 활성인 펩타이드의 구조적연구 및 분리하기 위한 HPLC의 사용 및 일반 기술에 대해서는 Hearn et al., High-Performance Liquid Chromatograph of Proteins and Peptides, Academic Press, Inc., 1983과 같은 일반 교과서를 참고하였으며, 보우스 흑색종 PA트립신분해 펩타이드의 역상 HPLC분리 및 단백질 서열 결정에 관해서는 Pohl et al의 Biochemistry 23, 3701-3707(1984)를 참고하였다.

Claims

정상인의 결장세포를 배양배지로 생체외 배양하여 얻어진 순화배지를 아연킬레이트-아가로스를 사용하여 1차 친화성 크로마토 그래피한 다음, 콘카나발린 A-아가로스, 피브린-셀라이트 및 피브린-아가로스로 구성된 군으로 부터 선택된 물질을 사용하여 2차 친화성 크로마토그래피한 후 TSK3000 SW 사이즈 분자 배척 HPLC를 행하고 P-아미노벤젠아미딘아가로스 친화성 크로마토그래피하여 얻어지는 플라스미노겐 활성인자 분획물을 회수함을 특징으로 하는 인간 플라스미노겐 활성인자를 생산하는 방법.
제 1 항에 있어서, 2차 친화성 크로마토그래피는 콘카나발린 A-아가로스를 사용하여 행함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 2차 친화성 크로마토그래피는 피브린-아가로스를 사용하여 행함을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 결장세포는 정상인의 결장섬유아세포인 CCD-18Co(ATCC CRL-1459)임을 특징으로 하는 방법.
제 2 항에 있어서, 결장세포는 정상인의 결장섬유아세포인 CCD-18Co(ATCC CRL-1459)임을 특징으로 하는 방법.
제 3 항에 있어서, 결장세포는 정상인의 결장섬유아세포인 CCD-18Co(ATCC CRL-1459)임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 조직형 플라스미노겐 활성인자를 회수함을 특징으로 하는 방법.
제 4 항에 있어서, 조직형 플라스미노겐 활성인자를 회수함을 특징으로 하는 방법.