JPS62158219A - ヒト由来組織型プラスミノ−ゲン活性化因子、その製造方法及びこれを有効成分とする血栓溶解剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明はプラスミノーゲンを活性化する新規なヒト組織
型プラスミノーゲン活性化因子、その製造方法及びこれ
を有効成分として含有する血栓溶解剤に関する。詳しく
は、ヒト由来の細胞株が生産する新規なヒト組織型プラ
スミノーゲン活性化因子に関する。及びヒト横紋筋肉腫
変異株ＫＹＭ−Ｅの浮遊細胞のクローンであるところの
変異株ＫＹＭ−ＥＳを浮遊撹はん培養により大量に培養
、またはヒト横紋筋肉腫変異株ＫＹＭ−Ｅの接着型細胞
のクローンであるところの変異株ＫＹＭ−ＥＭを接着培
養により大量に培養し、これらの培養液から新規なヒト
）Ｍ織型プラスミノーゲン活性化因子を採取する方法及
びこれらの培養液から新規なモノクローナル抗体を用い
ることによりヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を
製造する方法に関する。

更にこのヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子を有効
成分として含有する血栓溶解剤としての医薬用途に関す
る。

〔従来の技術〕

いわゆるプラスミノーゲン活性化因子は、動物の肺、腎
臓、卵巣細胞等に検出され（文献１）、ヒト由来におい
ては、血液成分、ヒト内皮細胞、ヒト子宮細胞などの正
常組繊細胞等やヒトメラノーマ、乳癌細胞などで生産が
見られるフィブリン溶解物質である（文献２〜８）。

これらのプラスミノーゲン活性化因子は、免疫学的特徴
の差に基づいてウロキナーゼ型のプラスミノーゲン活性
化因子と組織型プラスミノーゲン活性化因子の２つに分
けることができる。

ヒト組織型由来のプラスミノーゲン活性化因子（以下ｔ
−ＰＡと称す）は、ヒトメラノーマセルラインが正常ヒ
ト細胞から単離されたｔ−ＰＡど区別出来ない性質を持
っていることが示されて以来（文献９）、急速に研究が
進んでいる。ｔ−ＰＡのフィブリンを溶解する性質は、
既に市販されている２種の蛋白製剤ウロキナーゼとスト
レプトキナーゼと同様であることが判明している。これ
らの蛋白製剤の効能は、心筋梗塞、冠動脈閉塞、肺塞栓
症、胸部静脈血栓症、およびその他の血栓症におよぶも
のである。これらは不活性前駆体プラスミノーゲンをプ
ラスミンに変換し、このプラスミンが前記症例の原因と
なる血栓を構成するフィブリンを溶解し得る。ｔ−ＰＡ
は、フィブリンに対する高い親和性を有しており、溶解
したいフィブリンと結合しているプラスミノーゲンを優
先的に活性化させる。これに対してウロキナーゼとスト
レプトキナーゼは、優先的に活性化することがない。

この為、生成するプラスミンの多くは血栓に到達する前
に中和されてしまい、これにより有効な血栓溶解能を失
う。更にこれらの化合物は、フィブリンに結合したプラ
スミンよりも循環するプラスミンを生成する為に、循環
している他の血液凝固因子蛋白、例えばフィブリノーゲ
ン、第■因子、第■因子も活性化された蛋白により作用
を受ける。その結果内出血等の副作用の可能性を生じる
。又、ストレプトキナーゼは、強度に免疫原性であり高
抗体価を有する患者には、投与できない。

〔発明が解決しようとする問題点〕

この為、これらの欠点を解消し、フィブリン溶解因子と
して高い活性を有するｔ−ＰＡの必要充分な量を生産す
ることが望まれるようになった。

ｔ−ＰＡは、フィブリンに対する高い親和性を有してい
ることによりフィブリンと結合しているプラスミノーゲ
ンを優先的に活性化させる働きを持っていることから、
血栓溶解能が高く、副作用の少ない血栓溶解剤となり得
る。　・従来、ｔ−ＰＡの産生細胞としては、ヒト内皮
細胞、ヒト子宮細胞などの正常細胞やヒトメラノーマ（
黒色腫）、乳癌細胞などが知られている（文献３〜１１
）。しかしながら、正常組繊細胞では継代数に限界があ
ることから大量生産には不利であるとされており、細胞
光たりのｔ−ＰＡ産生もごく微量である。又腫よう細胞
などからライン化した細胞株、例えばヒトメラノーマセ
ルラインなどにおいても、これまでのところごく微量に
しかｔ−ＰＡは検出されていない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者は、種々の細胞を求めて研究したところヒト横
絞筋肉腫から分離されたＫＹＭ　　１（東京大学医科学
研究所　関口守正氏より譲受、）のクローンにプラスミ
ノーゲン活性化物質を生産する変異株があることを見い
だした。

なお、前記菌株ＫＹＭ−１は（財）発酵研究所にＩＦＯ
：５００５８として寄託（寄託者　明治乳業株式会社）
されている。

そして本発明者は、更に研究を重ねた結果、ＫＹＭ−１
にネオマイシン耐性遺伝子を持つプラスミドｐＳＶ２　
ｎｅｏ（文献１２）とサルウィルスＳＶ４０（Ｓｉｍｉ
ａｎ　Ｖｉｒｕｓ４０）の複製オリジン欠損遺伝子であ
る９ＭＫ１６　（文献１３）をコトランスフエクション
（ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎ）　Ｌ、ネオマイシン
の一種であるＧ４１８　（ＧＩＢＣＯ社）でセレクトし
て得た数多くのクローンの中からｔ−ＰＡの発現レベル
が極めて高い変異株ＫＹＭ−Ｅ　（以下ＫＹＭ−Ｅと称
す）を得た。Ｉ）ＳＶ２　ｎｅｏと９ＭＫ１６について
は図１に示す。ＫＹＭ−Ｅ株は、浮遊型と接着型の性格
を併せ持っており、シャーレで培養すると浮遊状態で増
殖する細胞と底面に接着して増殖する細胞との両方が出
現する。そして更に浮遊性の強いクローン又は接着性の
強いクローンを各々採取し５〜１０回継代を繰り返すと
浮遊撹はん培養に適した細胞株（以下ＫＹＭ−ＥＳと称
す）又は接着培養に適した細胞株（以下ＫＹＭ−ＥＭと
称す）が得られる。

ＫＹＭ−Ｅ株、ＫＹＭ　　ＥＳ株及びＫＹＭ−ＥＭ株の
産生ずるｔ−ＰＡとメラノーマセルライン（Ｒｏｃｋｅ
ｆｅｌｌｅｒ　Ｕｎｉｖ、　Ｄｒ、　Ｄ、　Ｂ、　Ｒ４
ｆｋｉｎより入手）（文献９．１４）から精製したｔ−
ＰＡとを用いて比較研究したところ、作用及び基質特異
性がよく似ていることを見いだした。しかしながらＫＹ
Ｍ−Ｅの産するｔ−ＰＡはＳＤＳポリアクリルアミドゲ
ル電気泳動で同じ位置に一本のバンドを示すものの、メ
ラノーマセルラインの産する１本鎖及び２本鎖のｔ−Ｐ
Ａ　（文献３．９）とは異なる位置にバンドを示した（
図２）。そこで本発明者はＫＹＭ−ＥＳ又ハＫＹＭ−Ｅ
Ｍを用いて新規なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
子を明らかにすると共に、大量生産に有効な培養方法及
び分離精製方法を確立し、更に医薬品として有効な血栓
溶解能を証明することにより本発明に到達した。

本発明の目的は、フィブリン親和性が高いｔ−ＰＡを提
供することにある。更にｔ−ＰＡを分離、精製する方法
、及び得られたｔ−ＰＡを有効成分とする新規な血栓溶
解剤を提供することにある。

１、　新規なヒト由来組織型プラスミノーゲン活性化因
子 本発明のｔ−ＰＡは、コトランスフエクションしたヒト
横紋筋肉腫変異株ＫＹＭ−Ｅ、ＫＹＭＥＳ及びＫＹＭ　
　ＥＭを用いて研究したものであるが、ＳＤＳポリアク
リルアミド電気泳動を用いてＫＹＭ−Ｅ、ＫＹＭ−ＢＳ
及びＫＹＭ−ＥＭ各々を由来とするｔ−ＰＡを比較した
ところ、産生じているｔ−ＰＡは同じ位置にバンドがあ
られれること（図１０）から同一物質と考えられる。そ
の理化学的性質は、従来報告されているヒ＋−ｍ繊細胞
や細胞株のｔ−ＰＡとよく似た物質であり、これ以外の
ヒト由来の細胞からも産生され得る。既に知られている
かずおおくの細胞株を調べたところ、ヒトフィブロサル
コーマＭＢ８３８７（Ｕｎｉｖ、　ｏｆ　Ｃｏ１ｏｒａ
ｄｏ　Ｄｒ、　Ｆ。

Ｔ、ＫＡＯより入手）にも同様のｔ−ＰＡが検出されて
いる。ＫＹＭ−Ｅ由来のｔ−ＰＡの分量は、６２．００
０〜７３．０００の間にバンドを示すが・、従来報告さ
れているｔ−ＰＡ、とくにメラノーマ由来のｔ−ＰＡ　
（文献９に記載のもの及び図２）とは、同一条件の５Ｄ
Ｓ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を用いた比較にお
いて明瞭な差が認められる。

２、　ヒト由来の細胞株 本発明にもちいるヒト横紋筋肉腫変異株ＫＹＭ−Ｅ、Ｋ
ＹＭ−ＥＳ及びＫＹＭ−ＥＭの性質は次の通りである。

１）ＫＹＭ−Ｅの浮遊状態にある細胞もしくはＫＹＭ−
ＢＳは、屈折性に冨む球形を呈している。

２）ＫＹＭ−ＥＳをシャーレで培養した場合、またはフ
ラスコもしくはタンクで攪はん培養した場合、大部分の
細胞が浮遊状態で分裂増殖することができる。

３）ＫＹＭ−ＥＳは、浮遊撹はん培養によって継代培養
ができる。

４）ＫＹＭ−Ｅの接着状態にある細胞もしくはＫＹＭ−
ＥＭは、上皮細胞の形態を呈している。

５）ＫＹＭ　　ＥＭはシャーレで培養した場合、または
マイクロキャリアもしくはローラーボトルで培養した場
合、接着状態で分裂増殖をすることができる。

６）ＫＹＭ−ＥＭは接着培養によって継代培養できる。

７　）１，０００，０００個のＫＹＭ−Ｅ細胞をヌード
マウス皮下またはＡＬＳ投与ハムスター類のうに移植す
ると腫粒を形成する。

８）染色体 ＫＹＭ−Ｅ、ＫＹＭ−ＥＳＳＫＹＭ−ＥＭの染色体数を
細胞遺伝学の常法に従って決定したところ最頻染色体数
は４６．４７でその付近に多少の幅を持つ分布をしめす
。

９）ＫＹＭ−Ｅ、、ＫＹＭ−ＥＳ、ＫＹＭ−ＥＭは、ｔ
−ＰＡを著量生産する。

１０）ＫＹＭ−Ｂ、ＫＹＭ−ＥＳ、ＫＹＭ−ＥＭの産生
ずるｔ−ＰＡの理化学的性質は同一である。

３、培　養 ｔ−ＰＡ生産のために、変異株ＫＹＭ　　ＥＳをシャー
レで培養し適当な細胞数に達した時点で、スピナーフラ
スコまたはタンク（ファーメンタ−）による浮遊撹はん
培養を行なう。変異株ＫＹＭ−ＥＭを用いる場合は、シ
ャレーで培養し適当な細胞数に達した時点で、ローラー
ボトル、マイクロキャリア等による接着培養を行なう。

又ｔ−ＰＡを効率よく生産する為には、ＫＹＭ−ＥＳＳ
ＫＹＭ−ＥＭいずれの細胞も血清添加培地で培養し、細
胞の増殖が定常期に入る時点で無血清培地に交換するの
が望ましい。

使用する培地の例をあげると、血清添加培地としては、
ＲＰ’Ｍ　Ｉ　　（Ｆｌｏ−社）等にヒトトランスフェ
リン、モノエタノールアミン、亜セレン酸を添加したも
の牛胎児血清０．２％１以上添加したもの、無血清培地
としてはＲＰＭＩ、Ｆ１２　（Ｆｌｏ−社）等やその混
合培地にヒトトランスフェリン、モノエタノールアミン
、亜セレン酸等を添加したものをあげることができる。

培養温度、気相条件は、厳密に規定されるものではない
が３６．５±１℃前後、５％程度の炭酸ガスを含有する
空気が適当である。

培養は、細胞が十分生育すれば、培地を連続的に交換す
るか、もしくは５日以内の間隔で培地を交換して約１ケ
月以上にわたってｔ−ＰＡを含有する培地を連続的に取
得する方法が効率的である。又培地供給は栄養条件を充
分にするために、循環方式を用いてもよい。

４、精　製 ｔ−ＰＡの精製には、塩析、アフィニティークロマトグ
ラフィー、分子ふるい等の組み合わせを用いるが、この
うちアフィニティクロマトグラフィーにモノクローナル
抗体を用いるとｔ−ＰＡが非常に高い純度でかつ高い回
収率で得られる。

精製の手順は次の通りである。ｔ−ＰＡ含有培養液を亜
鉛キレートアガロースカラムに負荷し、緩衝液とをもち
いグラジェント溶出する。

活性分画を新規な抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体を結合
したカラムに負荷する。新規な抗を−ＰＡモノクローナ
ル抗体の結合カラムは、Ｍｉｙａｈａｒａらの方法（文
献１５．１６）を用いて調製したヒト横紋筋肉腫変異株
ＫＹＭ−Ｂが産生するｔ−ＰＡに結合する新規なｔ−Ｐ
Ａモノクローナル抗体のｒｇＧ分画を、セファロース４
ＢにＣＮＢｒ活性化法で結合させたカラムに充填するこ
とによって得られる。

その後リン酸緩衝液とチオシアン酸カリウムを含む同緩
衝液でグラジェント溶出する。活性分画を濃縮し、セフ
ァクリールＳ　　２００　（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）で
展開するとｔ−ＰＡ活性を含む分画が得られる。

そのほかの分離、精製の方法例としては、Ｃ。

１１ｅｎらの用いた一般的な方法（文献９）が使用でき
る。培養して得たｔ−ＰＡ含有無血清培地をＰａｒａ　
ｔｈらの方法（文献１７）で調製した亜鉛キレートアガ
ロースカラムに負荷する。その後ＮａＣＬ　　Ｔｗｅｅ
ｎ８０含有トリス緩衝液とイミダゾールを１然加した緩
衝液とをもちいグラジェント溶出する。ｔ−ＰＡ活性は
、イミダゾールのグラジェント部分に認められる。活性
分画を濃縮、透析を行なった後、コンカナバリンＡセフ
ァロースカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）に負荷する。

続いてカリウムチオシアネート及び、α−メチルマンノ
シドを添加したリン酸緩衝液とをもちいグラジェント溶
出する。ｔ−ＰＡ活性は、カリウムチオシアネート及び
α−メチルマンノシドのグラジェント溶出部分に認めら
れる。活性分画を濃縮し、生理食塩水で透析をする。そ
の後透析内液中に白濁沈澱を生じる。ｔ−ＰＡ活性は主
に沈澱部分に認められる。

この沈澱をカリウムチオシアネートを含むリン酸緩衝液
にて溶解し上清液を得る。こうして得られた上清液をセ
ファデックスＧ−２００カラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社
）で展開するとｔ−ＰＡ活性を含有する分画が得られる
。

５、活性測定 合成基質Ｓ−２２８８（第１化学薬品）、フィブリンプ
レート法（Ａｓｔｒｕｐらの方法（文献２１）〕、フフ
ィブリンクロット解時間法（Ｒｉｊｋｅｎらの方法（文
献２２）〕の改良法を必要に応じて使用した。フィブリ
ンクロット溶解時間改良法を代表例として示す。

フィブリンクロットは、２．４■／ｄヒトフイブリノ一
ゲン５００μｇ、０．３■／−ヒトプラスミノーゲン５
０＃ｇ　、　　４ＯＮＩＨＱ位／　ｍｌ　）　ｏ　７ヒ
７を順次添加して形成した。尚、すべての試薬は、０、
１　ＭＮａＣ１，０，２５％ゼラチン含有５０ｍＭリン
酸緩衝液ｐＨ７，７５で希釈した。トロンビンの添加直
後よりストップウォッチを始動し、３７℃で２分間イン
キュベートし、フィブリンクロットを完成させた後、ナ
イロンボール（φ３．２Ｂ）をフィブリンクロットの上
に静置し、ｔ−、ＰＡ溶液を加え、ナイロンボールが、
試験管の底面に到達するまでの時間を測定した。

一方、コントロールとして標準ウロキナーゼ〔国立衛生
試験所より入手（１，０００１，Ｕ、／ｍＯ）を用いて
検量線を作成、ｔ−ＰＡ活性は、ウロキナーゼの国際単
位（Ｉ、Ｕ、）で表示した。

総酵素活性量は検量線から求めたｔ−ＰＡ活性値で表わ
し、総蛋白量はローリ−法により測定した。比活性は総
酵素活性量／総蛋白量で蛋白１可当たりのｔ−ＰＡ活性
で示した。精製度は培養上清を１として精製毎の比活性
の割合で示した。

６、基質特異性試験 Ｒｉｊｉｋｅｎ　ｅｔ、　ａｌ、の方法（文献９）の改
良法により行なった。ｔ−ＰＡとウロキナーゼ液を各々
トロンビンと反応させ、フィブリン塊を形成させた後、
フィブリンに結合もしくは結合しなかったものを各々フ
ィブリンクロット溶解法を用いて測定した。結果を表−
１に示した。

表−１ 本発明物質　　ウロキナーゼ 結合率　８２．２％　　８％ ７、分子量及び純度検定 精製ｔ−ＰＡ標品をＬａｅｍｌｉらの方法（文献２３）
に準じて１０％アクリルアミドを含むＳＤＳポリアクリ
ルアミド電気泳動によって分離した。このようにして得
られたゲルを０ａｋｌｅｙらの方法（文献２３）に準じ
て銀染色を行なった。対象として、ＫＹＭ−Ｅ由来のｔ
−ＰＡとメラノーマ由来のｔ−ＰＡも同時に流した結果
を第２図に示す。

第２図において、■、（Ｅ）は分子量測定に用いた標準
蛋白で、分子量の高い方からウシ血清アルブミン（６６
０００）、卵白アルブミン（４５０００）、カルボニッ
クアンヒドラーゼ（２９０００）である。

■はＫＹＭ−Ｅ由来ｔ−ＰＡ、０はメラノーマ由来１本
鎖ｔ　−Ｐ　Ａ、■はメラノーマ由来２本ｔＪｆ　ｔ　
−Ｐ　Ａを示す。この図から、ＫＹＭ−Ｅ由来ｔ−ＰＡ
のバンド０は前記メラノーマ由来のｔ−ＰＡのバンド０
および０のそれと比較して上方にシフトしており、この
点でＫＹＭ−Ｅ由来のｔ−ＰＡとメラノーマ由来のｔ−
ＰＡとの間に明瞭な差異がか認められる。

第３図に還元型のＫＹＭ−Ｅ由来ｔ−ＰＡ、メラノーマ
由来１本４７４　ｔ　−Ｐ　Ａおよび２末鎖ｔ−ＰＡを
同様に電気泳動にかけた結果を示す。

囚′および（Ｅ）′は分子量測定に用いた標準蛋白で、
分子量の高い方からホスホリラーゼｂ（９７４００）、
ウシ血清アルブミン（６６０００）、卵白アルブミン（
４５０００）、カルボニックアンヒドラーゼ（２９００
０）である。■′はＫＹＭ−Ｅ由来ｔ−ＰＡを還元した
もの、０′はメラノーマ由来１木鎖ｔ−ＰＡを還元した
もの、０′はメラノーマ由来２本鎖ｔ−ＰＡを還元した
ものを示す。

この図から、ＫＹＭ−Ｅ由来ｔ−ＰＡを還元したものの
バンド■′は前記メラノーマ由来のむ−ＰＡを還元した
もののバンド０′および０′のそれと比較して対応部分
の濃度が著しく相違し、この点でもＫＹＭ−Ｅ由来のｔ
−ＰＡとメラノーマ由来のｔ−ＰＡとの間に明瞭な差異
ががあることが認められる。

第１０図にＫＹＭ−Ｅ、ＫＹＭ−ＥＳ、、ＫＹＭ−８Ｍ
由来のｔ−ＰＡを同時に流した図を示す。

王者は同一の位置にバンドを示した。

８、新規なヒト由来組織型プラスミノーゲン活性化因子
の理化学的性質 次に本発明のｔ−ＰＡの理化学的物質を示す。

ａ）分子量 第２図に示すように、ＫＹＭ−８Ｍ由来のｔ−ＰＡはＳ
ＤＳポリアクリルアミド電気泳動で分子量６２．０００
〜７３，０００の間にバンドを示す。一方、ＫＹＭ−８
Ｍ由来のｔ−ＰＡ同時に電気泳動にかけたメラノーマ由
来の一本鎖ｔ−ＰＡと２末鎖ｔ−ＰＡのバンドはＫＹＭ
−８Ｍ由来のｔ−ＰＡのそれと異なっており、ＫＹＭ−
８Ｍ由来のｔ−ＰＡとメラノーマ由来のｔ−ＰＡとが異
なる分子量を有することを示す。第３図にＫＹＭ−Ｅ由
来ｔ−ＰＡ、メラノーマ由来の一本鎖ｔ−ＰＡおよび２
末鎖ｔ−ＰＡ還元型を同時に電気泳動にかけたものを示
す。

還元型においてもＫＹＭ−Ｅ由来ｔ−ＰＡはメラノーマ
由来のｔ−ＰＡと明らかに異なるバンドを示す。

ｂ）作用及び基質特異性 不活性前駆体プラスミノーゲンをプラスミンに変換し、
フィブリンを溶屏する。

Ｒｉｊｋｅｎ　ｅｔ、ａｌ、の方法（文献９）の改良法
により、フィブリンに対する親和性の検討を行ったとこ
ろ、市販の酵素製剤ウロキナーゼと比ベフィブリンに対
する強い親和性を示す。

ウロキナーゼは８％とわずかにフィブリンに結合するに
過ぎないが、本発明物質は８９．２％と殆どが結合し、
ウロキナーゼと比べ高い親和性を示す（表４参照）。

またＳ−２２８８で酵素活性を測定したところ表−２の
値かえられる。

表−２ Ｓ−２２８８でのＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｌｋ　ｐ
ｌｏｔは第４図で示される。

Ｃ）至適ｐＨ 至適ｐＨは、約７〜１１で作用曲線は第５図で示される
。

ｄ）ｐＨ安定性 ３７℃、９０分インキュベートする条件でのｐＨ安定性
は４．５〜１１で、残存活性％は第６図で示される。

ｅ）作用適温の範囲 ３０〜４０℃で作用温度曲線は、第７図で示される。

ｆ）温度耐性 ９０分間の加熱処理で５０℃まではほとんど失活しない
。残存活性は第８図で示される。

ｇ）紫外線吸収スペクトル 第９図に示す通りである。

ｈ）溶剤に対する溶解度 水・リン酸緩衝液などの塩類溶液に対する溶解度は、約
５０μｇ／ｍ！でそれ以上を調整する場合、溶解促進剤
例えばＩ．６Ｍのカリウムチオシアネート等が必要であ
る。

エタノール、エーテルなどの有機溶媒には不？容である
。

ｉ）物質の性状 凍結乾燥品は白色粉末である。

ｊ）呈色反応 ５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動を行ったのち
、ＰＡＳ反応を行うと、糖蛋白質に特有なピンク色の呈
色を示す。また本物質はコンカナバリンＡ−アガロース
樹脂に親和性を示すことからも糖蛋白質であることが示
唆される。

ｋ）等電点 本物質を８Ｍ尿素の存在下でクロマトフオーカシング法
で分析したところ、主成分の等電点はｐＨ７，５〜８．
０である。

６、新規なヒト由来組織型プラスミノーゲン活性化因子
の血栓溶解能 最近ｔ−ＰＡに関する研究が進み組換えＤＮＡ法をもち
いたｔ−ＰＡについて動物実験の他、一部臨床試験の結
果も報告されている（文献１７〜１９）。これによると
ｔ−ＰＡは、コントロールである他の血栓溶解剤に較べ
て有意な治療効果が得られている。本発明のｔ−ＰＡも
また血液中に生した血栓を溶解するのに極めて有効であ
る。

血栓溶解能についてヒトフィブリン塊を５０％溶解させ
るのに必要な濃度（Ｌ、Ｃ：、５０）であられすと本発
明物質はウロキナーゼと比較して約５．５倍の効果をも
つ（実施例２参照）。

本発明のｔ−ＰＡは、血管内、特に血栓を生した部位に
投与することもできるが、通常は静脈内投与するのが適
切である。

組成物の添加物としては、マンニット、アルブミン、ゼ
ラチン、亜硫酸水素ナトリウム等の安定剤、塩化ナトリ
ウム、マンニット、ブドウ糖等の等張引剤が適当である
。

投与量は、患者の体重、年齢、症状、経過等の状態によ
るが、５０μｇ〜５００■の範囲で投与ができる。静脈
内投与の方法としては、注射による投与が望ましいが、
点滴静注、点滴注射も可能である。

〔実施例〕

実施例１ 代表例として、浮遊型変異株ＫＹＭ−ＥＳを用いた培養
の例を示す。培地には、１１当たり重炭酸ナトリウム２
．０ｇ、Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−
２−エタンスルホン酸Ｉ．１９２ｇ、硫酸カナマイシン
９０ｍｇ、ヒトトランスフェリン（Ｓｉｇ＋ｎａ社）１
■、エタノールアミン４．６■、亜セレン酸１３μｇを
含み更に熱不活性化した牛胎児血清（ＧＩＢＣＯ社）最
終濃度０．２５％を加えたＲ　Ｐ　Ｍ　Ｔ−１６４０培
地（Ｆｌｏ−社）・を用いた。

ＫＹＭ−ＥＳ細胞はφ１０ｃ＋ｎのプラスチックシャー
レに接種して、増殖の結果プラスチックシャーレ７枚分
約１００　ＩｎＩの細胞懸濁液が得られた時点で、スピ
ナーフラスコを用いた浮遊培養を開始した。スピナーフ
ラスコのサイズを５００ｍ／。

２１及び８１とし、順次容量を増した。スピナーフラス
コは、浮遊撹はん培養が可能である。

各段階の接種密度は５Ｘ１０’細胞／ｄ程度であって、
５Ｘ１０５細胞／−を超えた時点で植え継ぎをした。無
血清培地への交換は、細胞密度が８１スピナーフラスコ
で８Ｘ１０”細胞／ｄに達した時に行った。その時の培
地は、１７！当たり重炭酸ナトリウム２゜Ｏｇ、Ｎ−ヒ
ドロキシエチルピペラジン−Ｎ′−２−エタンスルホン
酸Ｉ．１９２ｇ、硫酸カナマイシン６０■、ヒトトラン
スフェリン１■、エタノールアミン４．６■、亜セレン
酸１３μｇを含むＲＰ　Ｍ　Ｉ　−１６４０培地である
。

この無血清培地中で浮遊撹はん培養を４日間行ない、こ
れを８回操り返して、ろ過し回収液を得た。

この回収液にＴｗｅｅｎ　８０、ＮａＮ５を各々０．０
１％、０．０２％になるよう添加した。Ｐａｒａｔｈら
の方法で調整した亜鉛キレートアガロースカラム（φ９
ｃｍＸ８ｃｍ）をＩ　ＭＮａＣｅ　、０．０１％Ｔｗｅ
ｅｎ８０．０．０２％ＮａＮｚ含有２０ｍＭ　）リス塩
酸緩衝液ｐＨ７，４で平衡化した後、０．１％塩酸グア
ニジン、２０＋ｎＭε−アミノカプロン酸を添加した回
収液を負荷した。

その後、同緩衝液で洗浄し、続いて、同緩衝液と１００
ｍＭイミダゾールを含む緩衝液ｐＨ７，４とでグラジェ
ント溶出を行ないｔ−ＰＡ活性分画をプールした。

モノクローナル抗体カラムの調整は、Ｍｉｙａｈａｒａ
らの方法を用いて、変異株ＫＹＭ−Ｅが産生する新規な
ｔ−ＰＡに特異的に結合する新規なモノクローナル抗体
のＩｇＧ分画をセファロース４ＢにＣＮＢｒ活性化法で
結合させ、この新規な抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体セ
ファロース４Ｂをカラム（φ５ｃｍＸ２．７ｃｍ）に充
填した。なお、モノクロナール抗体の調整方法は次の通
りである。ＢＡＬＢ／Ｃマウスの腹腔内にＫＹＭ−Ｅ由
来のｔ−ＰＡ抗原を２〜３週間の間隔で３回注射するこ
とによっり免疫したひ臓細胞と、コルセミド処理したミ
エローマ細胞との融合を行った。

得られた細胞コロニーの中から新規なｔ−ＰＡに対する
抗体活性の高いものをセレクトした。

この融合細胞によって新規なモノクロナール抗体が産生
される。

次いでＩ　ＭＮａＣ１，０，０１％Ｔｗｅｅｎ８０．０
．０２％ＮａＮ３含１０ｍＭ’Ｊン酸緩衝液ｐＨ７，５
で平衡化し、プールしたｔ−ＰＡ活性分画を負荷した。

負荷終了後同緩衝液で洗浄し、続いて同緩衝液とＩ．６
Ｍチオシアン酸カリウムを含む緩衝液で溶出した。

活性分画は、限外口過膜（Ａｍｉｃｏｎ社）で濃縮した
。

その後、Ｉ．６Ｍチオシアン酸カリウム、０．０１％Ｔ
ｗｅｅｎ８０含有１０ｍＭリン酸緩衝液で平衡化したセ
ファクリールＳ　−２００（Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）の
カラムで展開した。プールされた活性過分画は、透析チ
ューブに集められ、０．３　ＭＮａＣＩ！　、０．０１
％Ｔｗｅｅｎ８０含有１０ｍＭリン酸緩衝液ｐｌ＋６．
５で４８時間、透析を行った。

以上のようにして、４段階の方法でｔ−ＰＡの精製標品
がえられるが各段階での精製度を、表−３にしめす。総
酵素活性量の定量は、先の基質特異性試験法によった。

尚、初期の新規な抗ｔ−ＰＡモノクローナル抗体の抗原
となるｔ−ＰＡは、本発明者が確立した変異株ＫＹＭ−
Ｅを由来として、一般的な方法である亜塩キレートカラ
ム、イミダゾール緩衝液による溶出、ポリエチレングリ
コールによる透析、フィブリンセファロースカラム（Ｐ
ｈａｒｍａｃｉａ社）、カリウムチオシアネートを含む
緩衝液による溶出、ポリエチレングリコールによる透析
、ゲル口過を連続的に行なうことにより精製した。尚、
総酵素活性量が精製過程で増減しているのは、活性阻害
物質（インヒビター）の存在による影響であ、る。表３
の活性測定は、先の活性測定法によった。

表−３・ 総酵素活性量　総蛋白量　比活性　収率　精製度Ｓ−２
００１７７，５４９２，７３６５０３６，３９５３３６
９，８実施例２ ヒト塩しょうに１％メチレンブルーおよび１ＯＮＩＢ単
位のトロンビンを順次添加し、メチレンブルーで染色さ
れたヒト・フィブリンを形成させた後、フィブリンを生
理食塩にて充分に洗浄し、未結合のメチレンブルーを除
去する。こうして得られたメチレンブルー染色ヒトフィ
ブリン塊を種々のウロキナーゼもしくは、本発明物質が
添加されたヒト血しょうに各々加え、３７℃の恒温槽で
１時間インキュベートする。ウロキナーゼ（国立衛生試
験所より入手）及び本発明物質によって溶解されたフィ
ブリンの重量、あるいは、上清に遊離したメチレンブル
ーの６６０ｎｍの吸光度を測定することによって血栓溶
解能を測定した。上記の測定系においてヒトフィブリン
塊を５０％溶解させるのに必要な酵素濃度（Ｌ。

Ｃ，５０）を測定し、ウロキナーゼとの血栓溶解能を比
較した。表−４にその結果を示す。この試験方法におい
て、本発明物質はウロキナーゼにくらべ約５．５倍の血
栓溶解能を有していた。

表−４ Ｌ、Ｃ，５０Ｒａｔｉ。

本発明物質　　　２９Ｉ．Ｕ、／ｄ　　　　　ｌウロキ
ナーゼ　１６０Ｉ．Ｕ、／ｍＺ　　　　　５．５〔発明
の効果〕 この発明によりフィブリン親和性の高い新規なヒト由来
組織型プラスミノーゲン活性化因子が得られ、そして、
このヒト由来組織型プラスミノーゲン活性化因子をヒト
横縦筋肉腫変異株の培養により高収率で製造することが
でき、更に、このヒト由来組織型プラスミノーゲン活性
化因子を血栓溶解能の優れた副作用の少ない血栓溶解剤
として提供することができた。

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Ｂｉｏｃｈｅｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、Ａｃｔａ５８０１４
０（Ｉ９７９）２３　　　Ｌａｅｍｉｌｉ　　ｅｔ、ａ
ｌ。

Ｎａｔｕｒｅ　　２２７　６８０８（１９７０）２４　
　０ａｋｌｅｙ　ｅｔ、　　ａｌ。

Ａｎａｌ、Ｂｉｏｃｈｅｍ、１０５３６１（１９８０）

【図面の簡単な説明】

第１図は、ｐＳＶ２　ｎｅｏとｐＭＫ　１６を示す。第
２図は、本発明のｔ−ＰＡとメラノーマ由来の１−ＰＡ
を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけた結
果を示す。分子量マーカーとしては、ウシ血清アルブミ
ン、卵白アルブミン、カルボニックアンヒドラーゼを使
用している。第。 ３図は本発明のｔ−ＰＡのメラノーマ由来のｔ−ＰＡの
還元型を電気泳動にかけた結果を示す。 分子量マーカーとしては、ホスホリラーゼｂ１ウシ血清
アルブミン、卵白アルブミン、カルボニックアンヒドラ
ーゼを使用している。第４図は、本発明のｔ−ＰＡのＳ
−２２８８におけるＬｉｎｅｗｅａｖｅｒ−Ｂｕｒｋ　
ｐｌｏｔを示す。第５図は、各ｐｔ＋の作用曲線を示す
。第６図は、各ｐＨの残存活性を示す。第７図は、作用
温度曲線を示す。第８図は、各温度に於ける残存活性を
示す。第９図は、紫外線吸収スペクトルをしめす。第１
０図は、ＫＹＭ−Ｅ、ＫＹＭ−ＥＳ、ＫＹＭ−ＥＭ由来
のｔ−ＰＡを５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
にかけた結果を示す。 代理人　弁理士　平　木　祐　輔 第１　図ｐ　Ｓ　Ｖ２ｎｅｏ及び９ＭＫ１６（Ｐ、５ｏ
ｕｔｈｅｒｎ、Ｐ、Ｂｅｒｇ　　　Ｊ、ＭｏＩ．Ａｐｐ
ｌ、Ｇｅｎｔ、１９８２３（Ｍ、　　Ｂ、　　Ｓｍａｌ
ｌ　　ｅｔ、　　ａｌ、　　　　Ｎａｔｕｒｅ　　　１
９８２）穿２図 シ：’＝”　”’　ｍ　　　　　（Ｃ）’　Ｊ’　６ン
）　　　（Ｆ〕′−ｒＡ　　を口へ　ｔＰ八 質３図 ′　　　■゛　■′０′　　Φ）′　缶）′第ｅ図ｐＨ
安定性 Ｂ素活性（％） Ｈ 第７図作用温度曲線 温度（０ｃ） 卿□□□

Claims (7)

【特許請求の範囲】
1. （１）ヒト由来の細胞株より産生した下記の理化学的性
   質を有する新規なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
   子。 ａ）分子量 ６２，０００から７３，０００の間にバンドを有する。 ｂ）作用及び基質特異性不活性前駆体プラスミノーゲン
   をプラスミンに変換しフィブリンを溶解する。市販の酵
   素製剤ウロキナーゼとくらべフイブリンに対する強い親
   和性を示す。合成基質Ｓ−２２８８でのｋｍは３．６×
   １０＾−＾４Ｍ、Ｖｍａｘ１１６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・Ｉ
   ．Ｕ．である。 ｃ）至適ｐＨ　ｐＨ７−１１ ｄ）安定ｐＨ　ｐＨ４．５−１１ ｅ）作用適温　３０−４５℃ ｆ）温度耐性　９０分の加熱処理で５０℃までは、殆ど
   失活しない。 ｇ）紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍに極大吸収あり。 ｈ）溶剤に対する溶解度水あるいはリン酸緩衝液などの
   塩類溶液に対する溶解度　約５０μｇ／ｍｌ。 それ以上の場合は溶解促進剤等が必要。有機溶媒には不
   溶。 ｉ）物質の性状　凍結乾燥品は白色粉末。 ｊ）呈色反応　ＰＡＳ反応で糖蛋白に特有なピンク色を
   呈す。 ｋ）等電点　ｐＨ７．５−８．０
2. （２）ヒト由来の細胞株がヒト横紋筋肉腫変異株由来の
   細胞であることを特徴とする特許請求範囲第１項記載の
   新規なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子。
3. （３）ヒト由来の細胞株を培養した後、得られた培養液
   から採取・精製することを特徴とする下記の理化学的性
   質を有する新規なヒト組織型プラスミノーゲン活性化因
   子の製造方法。 ａ）分子量 ６２，０００から７３，０００の間にバンドを有する。 ｂ）作用及び基質特異性不活性前駆体プラスミノーゲン
   をプラスミンに変換しフィブリンを溶解する。市販の酵
   素製剤ウロキナーゼとくらべフィブリンに対する強い親
   和性を示す。合成基質Ｓ−２２８８でのｋｍは３．６×
   １０＾−＾４Ｍ、Ｖｍａｘ１１６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・Ｉ
   ．Ｕ．である。 ｃ）至適ｐＨ　ｐＨ７−１１ ｄ）安定ｐＨ　ｐＨ４．５−１１ ｅ）作用適温　３０−４５℃ ｆ）温度耐性　９０分の加熱処理で５０℃までは、殆ど
   失活しない。 ｇ）紫外線吸収スペクトル ２８０ｎｍに極大吸収あり。 ｈ）溶剤に対する溶解度水あるいはリン酸緩衝液などの
   塩類溶液に対する溶解度　約５０μｇ／ｍｌ。それ以上
   の場合には溶解促進剤等が必要。有機溶媒には不溶。 ｉ）物質の性状　凍結乾燥品は白色粉末。 ｊ）呈色反応　ＰＡＳ反応で糖蛋白に特有なピンク色を
   呈す。 ｋ）等電点　ｐＨ７．５−８．０
4. （４）ヒト由来の細胞株が、ヒト横紋筋肉腫変異株ＫＹ
   Ｍ−Ｅの浮遊型細胞のクローンの変異株ＫＹＭ−ＥＳで
   あり、それを浮遊撹はん培養することを特徴とする特許
   請求範囲第３項記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性
   化因子の製造方法。
5. （５）ヒト由来の細胞株が、ヒト横紋筋肉腫変異株ＫＹ
   Ｍ−Ｅの接着型細胞のクローンの変異株ＫＹＭ−ＥＭで
   あり、それを接着培養することを特徴とする特許請求範
   囲第３項記載のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
   の製造方法。
6. （６）ヒト由来の細胞株の培養液から新規なヒト組織型
   プラスミノーゲン活性化因子を含む区分を分取し精製す
   るため、新規のヒト組織型プラスミノーゲン活性化因子
   に特異的に結合する新規なモノクローナル抗体を用いる
   ことを特徴とする特許請求範囲第３項記載のヒト組織型
   プラスミノーゲン活性化因子の製造方法。
7. （７）下記の理化学的性質を有する新規なヒト組織型プ
   ラスミノーゲン活性化因子の有効量を含有する血栓溶解
   剤。 ａ）分子量６２，０００から７３，０００の間にバンド
   を有する。 ｂ）作用及び基質特異性不活性前駆体プラスミノーゲン
   をプラスミンに変換しフィブリンを溶解する。市販の酵
   素製剤ウロキナーゼとくらべフィブリンに対する高い親
   和性を示す、合成基質Ｓ−２２８８でのｋｍは３．６×
   １０＾−＾４Ｍ、Ｖｍａｘ１１６ｐｍｏｌ／ｍｉｎ・Ｉ
   ．Ｕ．である。 ｃ）至適ｐＨ　ｐＨ７−１１ ｄ）安定ｐＨ　ｐＨ４．５−１１ ｅ）作用適温　３０−４５℃ ｆ）温度耐性　９０分の加熱処理で５０℃までは、殆ど
   失活しない。 ｇ）紫外線吸収スペクトル２８０ｎｍに極大吸収あり。 ｈ）溶剤に対する溶解度水あるいはリン酸緩衝液などの
   塩類溶液に対する溶解度　約５０μｇ／ｍｌ。それ以上
   の場合は溶解促進剤等が必要。有機溶媒には不溶。 ｉ）物質の性状　凍結乾燥品は白色粉末。 ｊ）呈色反応　ＰＡＳ反応で糖蛋白に特有なピンク色を
   呈す。 ｋ）等電点　ｐＨ７．５−８．０