CN111690634A - 一种溶栓酶的制备及其应用 - Google Patents

一种溶栓酶的制备及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111690634A
CN111690634A CN202010492435.8A CN202010492435A CN111690634A CN 111690634 A CN111690634 A CN 111690634A CN 202010492435 A CN202010492435 A CN 202010492435A CN 111690634 A CN111690634 A CN 111690634A
Authority
CN
China
Prior art keywords
thrombolytic enzyme
apre9912d
thrombolytic
preparation
enzyme
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202010492435.8A
Other languages
English (en)
Inventor
谭正怀
张秀
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Original Assignee
Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS filed Critical Sichuan Academy of Chinese Medicine Sciences SACMS
Priority to CN202010492435.8A priority Critical patent/CN111690634A/zh
Publication of CN111690634A publication Critical patent/CN111690634A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/164—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • A61K38/166—Streptokinase
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • A61P9/10—Drugs for disorders of the cardiovascular system for treating ischaemic or atherosclerotic diseases, e.g. antianginal drugs, coronary vasodilators, drugs for myocardial infarction, retinopathy, cerebrovascula insufficiency, renal arteriosclerosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Abstract

本发明公开了一种溶栓酶的制备及其应用，运用具有纤溶活性贝莱斯芽孢杆菌，采用聚合酶链式反应技术扩增提取基因组DNA，所述AprE9912D基因插入到pDE1表达载体中，利用IPTG诱导大肠杆菌表达粗蛋白产物。经制备纯化工艺后，得到溶栓酶，本发明的溶栓酶可以特异性地、高效溶解血栓，迅速恢复栓塞组织的血供，改善栓塞组织的功能，用于血管栓塞性疾病特别是心、脑血管栓塞疾病的防治，作用显著，获得目标产物的效率高，目标产物比目前现有溶栓酶制剂的活性高。

Description

一种溶栓酶的制备及其应用
技术领域
本发明涉及溶栓酶领域，具体地说，是涉及一种溶栓酶的制备及其应用。
背景技术
根据流行病学研究，我国心脑血管疾病危险因素的发生率和水平不断呈上升趋势。血栓形成是引起心血管疾病的主要原因，包括动脉血栓、静脉血栓和微循环血栓。血栓性疾病是心脑血管疾病的主要病因，也是导致人死亡或致残的主要因素。寻求溶栓药物用于临床治疗具有重要的医学价值。在血栓性疾病治疗中，纤溶酶具有潜在的应用前景。
目前溶栓药物已发展到第四代，第一代以链激酶(SK)和尿激酶(UK)为代表，特点：溶栓能力强；但缺乏溶栓特异性；并将纤维蛋白原降解，使全身纤溶亢进而导致出血，价格便宜；第二代以组织型纤溶酶原激活剂(t-PA)为代表，特点：药物与纤维蛋白原亲和力低，不增加全身纤溶亢进，发挥选择性溶栓作用，体内半衰期短，短时间需要大量用药，价格昂贵，有出血风险等问题；第三代利用基因工程技术、蛋白质技术和单克隆抗体技术对第一代和第二代产品进行改造而制成的新型PA产品。此类药物在特异性、半衰期、溶栓效率等方面进行了改进和提高，但目前大多处于实验阶段。因此需要一种能有效解决上述问题的溶栓酶的制备及其应用。
发明内容
本发明的目的在于提供一种溶栓酶的制备及其应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明包括以下步骤；
A从具有纤溶活性贝莱斯芽孢杆菌9912D提取基因组DNA。
B将所述基因组DNA的AprE9912D基因插入到pDE1表达载体中。
C对所述表达载体进行培养添加IPTG以提高大肠杆菌产生溶栓酶粗制品的能力或效率，然后经提取、分离、纯化获得所述溶栓酶。
进一步地，利用以下引物对来自贝莱斯芽孢杆菌9912D的AprE9912D基因进行扩增：
401：
Figure BDA0002520249300000021
(信号肽开始)
Pro490：
Figure BDA0002520249300000022
(前导肽开始)
722-1：
Figure BDA0002520249300000023
(成熟肽开始)
722-2：
Figure BDA0002520249300000024
进一步地，所述溶栓酶包括可溶性溶栓酶和不可溶溶栓酶，不可溶溶栓酶需通过复性后才具有纤溶活性，所述溶栓酶与复性剂按照体积比为1∶10-50进行添加。
进一步地，在溶栓酶的上清液加入固体硫酸铵按重量比为1∶1-10进行添加后沉淀分离，沉淀再经溶解、透析和凝胶分离后制取得到纯化溶栓酶制剂。
进一步地，所述溶栓酶在心脑血管疾病的应用。
进一步地，所述溶栓酶可以制备成针剂或口服制剂。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明的溶栓酶可以特异性地、高效溶解血栓，迅速恢复栓塞组织的血供，改善栓塞组织的功能，用于血管栓塞性疾病特别是心、脑血管栓塞疾病的防治，作用显著，获得目标产物的效率高，目标产物比目前现有溶栓酶制剂的活性高。
附图说明
图1为溶栓酶的制备中pDE1表达载体中PCR片段插入示意图；
图2溶栓酶的制备中表达载体部分结构的PCR产物插入位置图；
图3溶栓酶的制备中SDS-PAGE分析不可溶蛋白分析条带示意图；
图4溶栓酶的制备中SDS-PAGE分析可溶蛋白分析条带示意图；
图5溶栓酶的制备中SDS-PAGE分析纯化产物分析条带示意图；
具体实施方式
下面根据实施例对本发明作进一步说明，本发明的方式包括但不仅限于以下实施例。
在本实施例子中采用的菌种、载体、培养基分别为，大肠杆菌Trelief 5a-pClone007和BL21(DE3)-pDE1分别用于克隆和过表达。大肠杆菌在LB培养基37℃震荡培养。LB选择培养基加入50μg/ml卡那用于筛选、培养重组大肠杆菌和产重组蛋白。
实验动物购买于四川省中医药科学院动物中心的SPF级的Swiss albino小鼠(18-22g)，合格证：SCXY(川)2018-19.购买于成都达硕实验动物公司的雄性SPF级别的SD大鼠(220-260g)，合格证：SYXK(川)2018-057。
所有动物均在四川省中医科学院动物中心动物屏障系统中按性别圈养。屏障系统室温维持在20±2℃，相对湿度维持在50±10％，光照/暗循环为12小时。自由接近水和食物。在给药前，适应性喂养1-2天。
实验中使用的所有程序都符合四川省中医药科学院试验动物伦理委员会的要求。
统计分析
所有数据均以平均值(x)±标准差值(s)表示。计量资料差异比较采用单因素方差分析，两组间差异有统计学意义，采用student’s T检验。p＜0.05为差异有统计学意义。统计分析采用SPSS统计软件进行。
表达体系建立
利用以下引物对来自贝莱斯芽孢杆菌9912D的AprE9912D基因进行扩增：
401：
Figure BDA0002520249300000041
(信号肽开始)
Pro490：
Figure BDA0002520249300000042
(前导肽开始)
722-1：
Figure BDA0002520249300000043
(成熟肽开始)
722-2：
Figure BDA0002520249300000044
使用1-5TM2x高保真缓冲液(MCLAB，I5HM-200)，在以下条件下进行DNA扩增：预变性98.0℃2min；98.0℃10s，56.0℃15s，72.0℃20s，共35个循环；再延伸72.0℃5min。
将PCR产物1.2kb(401和722-2引物)、1.1kb(Pro490和722-2引物)和0.8kb(722-1和722-2引物)用DNA纯化试剂盒进行纯化，并插入大肠杆菌Trelief5a-pClone007。Trelief5a-pClone007-AprE9912D基因经PCR，酶切，DNA核苷酸测序，NCBI BLAST鉴定。
用高纯度质粒DNA提取试剂盒提取目标pClone007质粒。
设计并使用下列引物(CACC来自pDE1质粒)：
401-pDE1：5’-CACCGTGAGAGGCAAAAAGGTATG-3’：
Pro490-pDE1：5’-CACCCAGGGAAATCAAACGG-3’；
722-1-pDE1：5’-CACCGCGCAGTCCGTGCCTTAC-3；
722-2-pDE1：5’-TTACTGAGCTGCCGCCTGTAC-3’.
扩增的PCR片段插入大肠杆菌BL21(DE3)pDE1，经热休克处理转化。大肠杆菌BL21(DE3)pDE1-AprE9912D基因经PCR、DNA核苷酸测序和NCBI BLAST鉴定。
基因表达
大肠杆菌BL21(DE3)-pDE1 AprE9912D 37℃培养。当扩大培养OD600nm达到0.6-0.8时，添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)0.6mM或1.0mM，在20℃进行诱导培养20h。20h后收集菌体(5000g，10min，4℃)，用磷酸盐缓冲盐水冲洗菌体3次。采用细菌蛋白提取试剂盒提取活性可溶性蛋白，采用一步法提取试剂盒提取细菌不溶性蛋白。用SDS-PAGE分析可溶性及不溶性部分，将不溶性部分重悬于平衡缓冲液(8M尿素，100Mm NaH2PO4，10mm Tris，pH 8.0)中，室温溶解4h。
纯化和复性
AprE9912D产品使用Ni-NTA柱进行纯化。
可溶部分
然后将可溶性部分收集到再生纤维素透析袋10000中，在4℃透析缓冲液中透析16h。透析后，使用Fliter unit 10000NMWL离心浓缩AprE9912D(7000rpm，10min，4℃)。以牛血清白蛋白(BSA)为标准，采用Bradford法在562nm测定蛋白浓度。
不可溶部分
AprE9912D的不可溶部分在体外复性。
添加3mM L-谷胱甘肽还原型和0.3mM L-谷胱甘肽氧化型到不可溶平衡缓冲溶液中，装到再生纤维素透析袋10000中，透析袋放到4℃透析缓冲液中12h，透析比列(50mL∶1L)。每隔12小时，更换透析缓冲液，进行梯度透析，除尿素浓度变化外，其余成分保持不变。透析-复性缓冲液在0.45um微孔过滤前可重复使用。
透析后，使用Fliter Units10000NMWL离心(7000rpm，10min，4℃)浓缩AprE9912D。以牛血清白蛋白(BSA)为标准品，用Bradford法测定562nm处的蛋白浓度。
AprE9912D液体经真空冷冻干燥机干燥成粉末，供以后实验使用。
体外活性分析
纤溶活性测定采用经改进的纤维蛋白平板法。如前所述，纤溶活性表达为U/mg蛋白。
对培养皿进行高压灭菌，使其他溶纤因子失活。依次加入1.5ml 10mg/ml牛肉纤维蛋白原(Solarbio，FB051，中国；在0.1M PBS缓冲液中ph7.4)和112.5ul 1000U/ml凝血酶(Solarbio，T8021，中国)；在0.1M PBS缓冲液中，pH 7.4)到15ml 15g/L琼脂糖溶液中，在90mm的培养皿中制备成平板。为溶解纤维蛋白原，于65℃孵育5min。
在室温下放置30min形成纤维蛋白凝块后，用10ul的枪头在板上开孔。每孔加入AprE9912D酶，37℃孵育16h。用透明圈大小计算纤维蛋白溶解活性。以尿激酶为标准品。
AprE9912D的急性毒性实验
SPF级18-22g瑞士白化病小鼠20只，雌性10只，雄性10只，随机分为两组：对照组和实验组。
给药前，禁食16小时。混合后，经尾静脉给药给小鼠AprE9912D纤溶酶(102.6kU/kg)，对照组给予生理盐水。
在14天内，仔细观察和记录症状和死亡率。分别于第7天和第14天称重，两周后用脱臼法处死未死余下动物，准确称量心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺等脏器的重量。脏器指数按以下公式计算：(组织湿重mg/体重)*10g。
溶栓功能的评价
体外溶解混合动脉血栓
大鼠动脉血在抗凝血管中以180g离心10min。上层为富血小板血浆层，中间层为白细胞层，下层为红细胞层。吸取富含血小板的血浆层3.5ml，边界层0.5ml(分别含白细胞和红细胞)放入5ml离心管中。将ADP(80umol/L)、凝血酶(0.5U/ml)、CaCl2(80mmol/L)加入5ml离心管中混均匀，静置10min。在37℃水浴中孵育5h。混合血栓用0.1M PBS(PH7.4)洗涤3次，4℃保存。使用前，离心(1000rpm，30s)吸出多余的液体。
将混合动脉血栓切成等重血块，随机分为3组，每组6个血块(107-109mg)。分别添加AprE9912D酶或尿激酶9.3U/mg(Solarbio，U8120，China)。轻轻混合后，37℃孵育16h。对照组加入0.5ml生理盐水。
根据质量守恒定律，溶栓率(M)的计算公式为：M＝(M0-M1)/M0。M0：初始血栓的质量；M1：残余血栓的质量。
在动静脉旁路形成血栓模型中抑制血栓活性
雄性SPF级SD大鼠(220-260g)随机分为四组：对照组、尿激酶组和AprE9912D酶口服组、AprE9912D酶注射剂。
麻醉前，尾静脉分别给予尿激酶1000U/kg、AprE9912D酶1000U/kg或等量生理盐水，灌胃AprE9912D酶1000U/kg。动静脉导管由两根7cm长的套管(外径×内径：0.46×0.96mm)与一根10cm长的聚乙烯软管(2X1mm)连接而成，其中包含一条6cm长的4号缝合线。
低分子肝素钠(50U/ml)灌注于动静脉导管内，用水合氯醛缓冲液(400mg/kg，1ml/100g，ip)麻醉后，在左侧颈静脉与右侧颈动脉之间置入动静脉导管。
体外循环维持15分钟，期间血凝块粘附在缝合线上。然后取出缝合线，立即称重。血凝块湿重由之前测定的干6cm线的重量减去得到的值来确定。
血栓率(T)的抑制作用按下式计算：T＝(T0-T1)/T0。T0：对照组血栓质量；T1：药物组血栓质量。
结果
以有纤溶活性的贝莱斯芽孢杆菌9912D为基源。通过基因克隆等手段，表达出一种具有良好溶栓作用的蛋白质。将来自于贝莱斯芽孢杆菌9912D的AprE9912D基因插入到pDE1表达载体中。20℃，0.6mM IPTG诱导后，AprE9912D在大肠杆菌BL21(DE3)表达良好，可溶性部分具有纤溶活性，不溶性部分通过成功的复性方法具有纤溶活性。纯化后的AprE9912D酶分子量为27kDa，比活力为442.6kU/mg。aprE9912D开放阅读框的长度为含有382个氨基酸。通过急性毒性试验评价尾静脉注射液的安全性：最大耐受剂量为102.6kU/kg。AprE9912D酶的溶栓功能检验：在体外，9.3U/mg浓度AprE9912D酶可以在37℃孵育20h溶解混合动脉血栓，溶解率为40.0％；在体内，动静脉旁路血栓形成模型中1000U/kg剂量能够抑制血栓的形成，抑制率为32.9％。说明AprE9912D酶是相对较低毒性的，是一个抗血小板凝集和溶栓的候选药物。
a：孔中10ul上清发酵液；b：孔1-4：10，20，35，40UAprE9912D混合的可溶和不可溶蛋白；
纤溶活性标曲曲线：y＝0.5731x+0.4117 R2＝0.9914 x＝lg(IU)；y＝lg(mm)蛋白浓度标准曲线：y＝0.5894x+0.1173 R2＝0.9987 OD562nm1μ AprE9912D纤溶酶：OD562nm＝0.249632；0.2213mg/ml；2U/μl，442.6mg/kU.
基因表达：AprE9912D，一个纤溶酶基因
参照解淀粉芽孢杆菌DFE基因(NCBI GenBank：DQ132806.1)扩增AprE9912D基因序列，进行引物设计。
如图1所示，在pDE1表达载体中一个1，149bp AprE9912D PCR片段。AprE9912D基因包括信号肽、前导肽、成熟肽。
如图2所示，AprE9912D的扩增中pDE1表达载体部分结构：PCR产物插入位置图；T7启动子控制AprE9912D的表达.Kan筛选基因用于转基因筛选。
Blast使用的是DNAMAN V6软件。AprE9912D(信号肽-成熟肽：40ibp-1549bp)与AprE5-41(237bp-1385bp；NCBI GenBank：JF739176.1；来源：解淀粉芽孢杆菌)。AprE9912D(信号肽-成熟蛋白：401bp-1549bp)与DFE基因(40lbp-1549bp，99.13％)和AprEBS2(172bp-1320bp，NCBI GenBank：MH378165.1，98.69％)高度相似，AprE9912D(信号肽-成熟肽：490bp-1549bp)与纳豆激酶(前肽-成熟蛋白)具有73.73％的同源性；NCBI GenBank：AY219901.1)。
虽然AprE9912D(信号肽成熟：401bp-1549bp)的核苷酸序列扩增与AprE5-41有明显的相似性，但该菌株的鉴定为贝莱斯芽孢杆菌。所以命名为AprE9912D。
在pDE1表达试剂盒中，利用牛痘病毒工快速构建表达载体pDE1-AprE9912D。AprE9912D基因在BL21(DE3)pDF1中表达良好(Fig.3b)，通过SDS-PAGE分析0.6mM或者1.0mMIPTG诱导下培养的可溶和不溶蛋白。在20℃培养的不溶蛋白中观察到一条42kDa的粗条带，如图3所示。
根据AprE9912D蛋白大小的预测，BL21(DE3)pDE1-401、BL21(DE3)pDF1-pro490和BL21(DE3)pDF1-722在20℃培养的可溶蛋白的产物分别为42kDa、38kDa和30kDa带(结果未显示)，如图4所示，为了节省IPTG，选择0.6mM IPTG表达BL21(DE3)pDF1-401和BL21(DE3)pDE1-pro490。纯化后的产物经SDS-PAGE分析。如图5所示，BL21(DE3)pDF1-pro490产物的条带更清晰。
如图3所示，为SDS-PAGE分析不可溶蛋白分析条带，其中泳道BSA，60kDa；泳道蛋白标准品，94，60，45，27，18kDa；泳道1-3，AprE9912D(成熟肽：722bp-1549bp；信号肽-成熟肽：401bp-1549bp和前导肽-成熟肽：490bp-1549bp)的不可溶蛋白。来自纯化产物的一条42kDa条带。
如图4所示，SDS-PAGE分析可溶蛋白分析条带，其中泳道1-2，AprE9912D(信号肽-成熟肽：401bp-1549bp)可溶蛋白；泳道3-4，AprE9912D(前导肽-成熟肽：490bp-1549bp)可溶蛋白；泳道1和3，0.6mM IPTG诱导，泳道2和4，1.0mM IPTG诱导。泳道蛋白标准品，94，60，45，27，18kDa。
如图5所示，SDS-PAGE分析纯化产物分析条带，其中泳道1-2，AprE9912D(成熟肽：722bp-1549bp)纯化产物泳道BSA(60kDa)；lane蛋白标准品，Marker，94，60，45，27，18kDa；泳道3-4，AprE9912D(信号肽-成熟肽：401bp-1549bp)纯化产物；泳道5-6，AprE9912D(前导肽-成熟肽：490bp-1549bp)纯化产物.来自纯化产物的一条27kDa带。
泳道1-2，AprE9912D(成熟肽：722bp-1549bp)纯化产物；泳道BSA(60kDa)；lane蛋白标准品，Marker，94，60，45，27，18kDa；泳道3-4，AprE9912D(信号肽-成熟肽：401bp-1549bp)纯化产物；泳道5-6，AprE9912D(前导肽-成熟肽：490bp-1549bp)纯化产物.来自纯化产物的一条27kDa带。
AprE9912D酶纤溶活性
纯化过程中咪唑起始浓度为20mM，终浓度为300mM。由于咪唑浓度高，纯化产物需要透析。透析后，纤溶平板上见透明圈。BL21(DE3)pDE1-AprE9912D-401和pro490的可溶蛋白在纤溶平板上具有纤溶活性。BL21(DE3)pDE1-AprE9912D-401和pro490的不溶性蛋白经成功复性后也具有纤溶活性，但不溶蛋白的纤溶活性并不优于可溶蛋白(结果未显示)。低温诱导AprE9912D酶的表达，发现AprE9912D的表达大部分由不可溶转变为可溶蛋白。
AprE9912D酶急性毒性实验
2周后，所有小鼠均存活，称体重及器官重量。表1无论雄性小鼠还是雌性小鼠，两组小鼠的体重均无明显差异。表2为心、肝、脾、肾、肺与体重的相关系数，器官指数未见明显差异。特别的是，解剖小鼠时没有发现出血的情况。AprE9912D纤溶酶最大耐受剂量为102.6kU/kg。
表1 AprE9912D纤溶酶对小鼠体重的影响(x±s)
Figure BDA0002520249300000121
N：数目
表2 AprE9912D纤溶酶对小鼠脏器指数的影响(x±s)
Figure BDA0002520249300000122
N：数目r
在体外溶栓效果
在37℃孵育16h条件下，与对照组相比，在9.3U/mg浓度AprE9912D酶可显著降低混合动脉血栓重量。溶栓时间很短。AprE9912D酶的溶栓率为40.0％，见表3。
表3 AprE9912D纤溶酶在体外溶解混合动脉血栓
Figure BDA0002520249300000131
student’s test：*p＞0.05，**p＞0.01，***p＞0.001，与对照相比较
体内溶栓
与对照组相比，1000U/kgAprE9912D酶明显减轻大鼠动静脉旁路血栓形成模型血凝块的湿重。AprE9912D酶的抑制率为32.9％，见表4。
表4在体内AprE9912D纤溶酶对动静脉旁路血栓形成模型的抑制
Figure BDA0002520249300000132
Figure BDA0002520249300000141
student’s test：*p＞0.05，**p＞0.01，料*p＞0.001，与对照组相比较；N：数目
结果表明：该制剂有很强的溶解人纤维蛋白的能力，将人血凝块0.1克放人溶栓剂溶液中，37C保温1小时，可将血块完全溶解。将溶栓制剂给大白鼠口服2-3天后，测定大白鼠血浆优球蛋白溶解时间(ELT)，表示ELT明显缩短，纤溶活性提高41％～51％，对48-65岁人群自顾口服溶栓剂试验结果表明，人血浆中ELT缩短33％-50％，这显示本发明溶栓剂能明显地提高人体的纤溶活性，减少动静脉旁路血栓形成模型血凝块的情况，从而起到防止血栓形成的功效。
上述实施例仅为本发明的优选实施方式之一，不应当用于限制本发明的保护范围，但凡在本发明的主体设计思想和精神上作出的毫无实质意义的改动或润色，其所解决的技术问题仍然与本发明一致的，均应当包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 四川省中医药科学院
<120> 一种溶栓酶的制备及其应用
<141> 2020-07-23
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1149
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis 9912D（贝莱斯芽孢杆菌9912D）
<400> 1
gtgagaggca aaaaggtatg gatcagtttg ctgtttgctt tagcgttaat ctttacgatg 60
gcgttcggca gcacgtctcc tgcccaggcg gcagggaaat caaacgggga aaagaaatac 120
attgtcggat ttaaacagac aatgagcacg atgagcgccg ctaagaaaaa agatgtcatt 180
tctgaaaaag gcgggaaagt gcaaaagcaa ttcaaatatg tagacgcagc ttcagctaca 240
ttaaatgaaa aagctgtaaa agagctgaaa aaagacccta gcgtcgctta cgttgaagaa 300
gatcacgttg cacaggcgta cgcgcagtcc gtgccttacg gcgtatcaca gattaaagcc 360
cctgctctgc actctcaagg cttcactgga tcaaatgtta aagtagcggt tatcgacagc 420
ggtatcgatt cttctcatcc tgatttaaag gtagcaggcg gagccagcat ggttccttct 480
gaaacaaatc ctttccaaga caacaactct cacggaactc acgttgccgg tacagttgcg 540
gctcttaata actcagtcgg tgtattaggc gttgcgccaa gcgcatctct ttacgctgta 600
aaagttctcg gcgctgacgg ttccggccag tacagctgga tcattaacgg aattgagtgg 660
gcgatcgcaa acaatatgga cgttattaac atgagcctcg gcggaccttc tggttctgca 720
gcgttaaaag cggcagttga caaagccgtt tcttccggca tcgtagtcgt tgcggcagcc 780
ggtaacgaag gcacttccgg cggctcaagc acagtgggct atcctggtaa atacccttct 840
gtcattgcgg taggcgctgt taacagcagc aaccaacgag catctttctc aagcgtaggt 900
tctgagcttg atgtcatggc accaggcgtc tctatccaaa gcacgcttcc tggaaacaag 960
tacggcgcgt acaatggtac gtcaatggca tctccgcacg ttgccggagc ggctgctttg 1020
attctttcta agcacccgaa ctggacaaac actcaagtcc gcagcagttt agaaaacacc 1080
actacaaaac ttggtgatgc tttctactac ggaaaagggc tgatcaacgt acaggcggca 1140
gctcagtaa 1149
<210> 2
<211> 32
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis 9912D（贝莱斯芽孢杆菌9912D）
<400> 2
ctgaatccat gggtgagagg caaaaaggta tg 32
<210> 3
<211> 28
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis 9912D（贝莱斯芽孢杆菌9912D）
<400> 3
ctgaatccat ggcagggaaa tcaaacgg 28
<210> 4
<211> 31
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis 9912D（贝莱斯芽孢杆菌9912D）
<400> 4
cgctgaattc atggcgcagt ccgtgcctta c 31
<210> 5
<211> 30
<212> DNA
<213> Bacillus velezensis 9912D（贝莱斯芽孢杆菌9912D）
<400> 5
gtcggatcct tactgagctg ccgcctgtac 30

Claims (6)

1.一种溶栓酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤
A从具有纤溶活性贝莱斯芽孢杆菌9912D提取基因组DNA。
B将所述基因组DNA的AprE9912D基因插入到pDE1表达载体中。
C对所述表达载体进行培养添加IPTG以提高大肠杆菌产生溶栓酶粗制品的能力或效率，然后经提取、分离、纯化获得所述溶栓酶。
2.据权利要求1所述一种溶栓酶的制备方法，其特征在于，利用以下引物对来自贝莱斯芽孢杆菌9912D的AprE9912D基因进行扩增:
Figure FDA0002520249290000011
3.根据权利要求1所述一种溶栓酶的制备方法，其特征在于，培养液经离心分离后，所述溶栓酶包括可溶性溶栓酶和不可溶溶栓酶，不可溶溶栓酶需通过复性后才具有纤溶活性，所述溶栓酶与复性剂按照体积比为1：10-50进行添加。
4.根据权利要求1所述一种溶栓酶的制备方法，其特征在于，在溶栓酶的上清液加入固体硫酸铵按重量比为1：1-10进行添加后沉淀分离，沉淀再经溶解、透析和凝胶分离后制取得到纯化溶栓酶制剂。
5.根据1-4所述一种溶栓酶的制备方法，其特征在于，所述溶栓酶在心脑血管疾病的应用。
6.根据1-5所述一种溶栓酶的制备方法，其特征在于，所述溶栓酶可以制备成针剂或口服制剂。
CN202010492435.8A 2020-06-02 2020-06-02 一种溶栓酶的制备及其应用 Pending CN111690634A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010492435.8A CN111690634A (zh) 2020-06-02 2020-06-02 一种溶栓酶的制备及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010492435.8A CN111690634A (zh) 2020-06-02 2020-06-02 一种溶栓酶的制备及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN111690634A true CN111690634A (zh) 2020-09-22

Family

ID=72479344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010492435.8A Pending CN111690634A (zh) 2020-06-02 2020-06-02 一种溶栓酶的制备及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111690634A (zh)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1478890A (zh) * 2002-08-28 2004-03-03 四川大学 豆豉溶栓酶和编码这种豆豉溶栓酶的多核苷酸
KR20130071345A (ko) * 2011-12-20 2013-06-28 (주)미애부생명과학 혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주, 상기 균주 배양액, 상기 균주가 생산하는 혈전용해 단백질, 그를 포함하는 혈전용해 조성물 및 그 제조방법
CN108034617A (zh) * 2018-01-23 2018-05-15 四川大学 一种贝莱斯芽孢杆菌及其分离筛选方法与应用

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1478890A (zh) * 2002-08-28 2004-03-03 四川大学 豆豉溶栓酶和编码这种豆豉溶栓酶的多核苷酸
KR20130071345A (ko) * 2011-12-20 2013-06-28 (주)미애부생명과학 혈전 용해능을 갖는 신규한 바실러스 속 균주, 상기 균주 배양액, 상기 균주가 생산하는 혈전용해 단백질, 그를 포함하는 혈전용해 조성물 및 그 제조방법
CN108034617A (zh) * 2018-01-23 2018-05-15 四川大学 一种贝莱斯芽孢杆菌及其分离筛选方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PAN,H.-Q ET AL.: "Bacillus velezensis strain 9912D, complete sequence. GenBank: CP017775.1", 《GENBANK》 *
张秀 等: "豆豉AprE9912D血栓溶解酶的制备与活性评价", 《中草药》 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dubey et al. Isolation, production, purification, assay and characterization of fibrinolytic enzymes (Nattokinase, Streptokinase and Urokinase) from bacterial sources
EP0041766B1 (en) New plasminogen activator and pharmaceutical composition having thrombolytic activity
CN100537770C (zh) 酶切范威尔邦德因子(vWF)的蛋白酶
US10894075B2 (en) Gla domains as targeting agents
JPS5896026A (ja) 新規ウロキナ−ゼ誘導体およびその製造法ならびにそれを含有する血栓溶解剤
JPH04505326A (ja) プラスミノーゲン活性化剤とフィブリン断片との血栓ターゲットの錯体
JP2010540432A (ja) ヒト組織型プラスミノーゲンアクチベータの精製方法
US4996050A (en) Fibrinolytic activity enhancer
CN102732548A (zh) 一种表达蛇毒激肽原酶的高效麦胚无细胞蛋白合成系统的建立及应用
US5023078A (en) Plasminogen activator-heparin conjugates
Sumi et al. Urokinase-like plasminogen activator increased in plasma after alcohol drinking
CN111690634A (zh) 一种溶栓酶的制备及其应用
RU2247777C2 (ru) Модифицированный активатор плазминогена урокиназного типа, последовательность днк, рекомбинантная плазмида, штамм-продуцент, способ получения модифицированного активатора плазминогена урокиназного типа и фармацевтическая композиция, обладающая тромболитическим действием
US20060147441A1 (en) Plasminogen fragment having activity to inhibit tumor metastasis and growth and process for preparing same technical field
CN113416724A (zh) 一种组织型纤溶酶原激活剂的重组蛋白及其应用
EP0251806B1 (en) Plasminogen activator production
CN100580082C (zh) 一种重组葡激酶冻干制剂、制备方法和应用
JPS60184026A (ja) 組織プラスミノ−ゲン・アクチベ−タ−の溶解補助方法
CA2141642A1 (en) Thrombocyte-stabilizing factor ix-fragments, their preparation and use and drugs containing these
CN102839145A (zh) 一种表达蛇毒激肽原酶的基因工程菌、其构建方法及应用
KR100419451B1 (ko) 천연물로부터 유래한 혈전용해 단백질
WO2003008594A1 (en) Construction of the plasmid for expressing the thrombus-targeting thrombolytic fusion protein
Zhang et al. Expression, purification and characterization of recombinant plasminogen activator from Gloydius brevicaudus venom in Escherichia coli
JP3806471B2 (ja) 腫瘍転移増殖抑制効果を有するプラスミノーゲン断片および該断片の調製方法
EP0112940A1 (en) Method of producing a tissue plasminogen activator and composition comprising same

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20200922

RJ01 Rejection of invention patent application after publication