KR100419451B1 - 천연물로부터 유래한 혈전용해 단백질 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 멸치 발효액을 35∼45 용량% 에탄올로 침출시킨 후, 원심분리하여 상층액을 회수한 후, 70∼80 용량% 에탄올로 추출한 후 원심분리시켜 침전물을 회수하고, 상기 침전물을 Tris-HCl 완충액으로 투석한 후, 이를 DEAE-Sephadex 음이온 교환 컬럼으로 단백질을 흡착시킨 후, 염화나트륨으로 용출하고, Tris-HCl 완충액으로 투석 동결 건조된 단백질을 Tris-HCl 완충액에 녹여, 세파덱스 젤 여과 컬럼을 통해 수득된 N-말단 아미노산 서열이 Ile-Val-Gly-Gly-Glu-Glu-Ala-Thr-Ala-
Asn-Ser-Thr이고 분자량이 약 28kD인 혈전용해 단백질을 제공하는 것이다.
Description
본 발명은 멸치 발효액으로부터 추출 분리 정제한 혈전용해 단백질 및 그의 추출 정제 방법에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 멸치 발효액을 35∼45 용량% 에탄올로 침출시킨 후 원심분리하여 상층액을 회수한 후, 70∼80 용량% 에탄올로 추출한 후 원심분리시켜 침전물을 회수하고, 이를 음이온 교환 컬럼으로 여과시킨후, 세파덱스 젤 여과를 통해 수득된 분자량 약 28kD의 혈전용해 단백질 및 그의 제조 방법에 관한 것이다.
혈전은 여러 가지 복합적 반응에 의해 활성화된 트롬빈(thrombin)에 의해 피브리노겐(fibrinogen)으로부터 전환된 피브린(fibrin)이 혈액중의 혈소판(platelet) 및 적혈구와 중합체를 이룬 것으로서 혈액응고, 혈관 울체(venous stasis) 혹은 혈관 벽의 손상 등이 혈전생성의 중요한 요인이 될 수 있다.
이를 좀더 자세히 살펴보면, 노인이나 비만인 환자에게는 특히 장시간 자세를 바꾸지 않거나(immobilization) 또는 한자리에 누워있는 등으로 인한 혈관 울체나 수술과정 중에 흔히 경험하는 고 혈액응고 상태(hypercoagulable state)가 혈전을 유발하게 되며, 상처 특히 하체부 골절의 경우 장시간 누워있음으로 인한 혈전유발이 우려된다. 이밖에도 울혈성 심부전(congestive heart failure), 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 심근경색(myocardial infarction)등을 가진 환자의 경우 혈전증에 대한 위험이 증가한다. 췌장암, 후두암, 위암, 전립선암의 경우 역시 혈전을 일으키는 전구체(procoagulant substances)의 증가로 인해 혈전증에 대한 위험이 증가한다.
혈액응고 인자의 활성 증가는 특히 임산부나 경구 피임제를 복용하는 여성들에게서 흔히 볼 수 있으며, 빈도는 낮지만 특이한 혈액병이나 유전적인 요인에 의한 응고인자의 활성에 기인한 혈전생성이 알려져 있다.
이렇게 형성된 혈전은 때로는 작은 조각으로 균열되어(색전, emboli) 혈전이 생성된 부위에서 체내의 다른 부위로 혈액을 따라 운반되는데 특히 정맥내에 생성된 혈전이 폐로 운반될 경우 폐색전증(pulmonary embolism)을 일으킨다. 심방세동에서 심방수축력의 저하는 혈액의 정체 현상을 일으키게되고, 이는 혈전생성을 야기시키며 이 경우 특히 생성된 혈전의 파편이 뇌로 운반될 경우 뇌색전(뇌졸증)을 유발할 수 있다.
혈전증은 주로 50대 이상에서 빈번하며, 전체인구의 2∼5% 정도가 정맥 혈전색전증(venous thrombombolism)을 경험한다. 그리고, 폐색전은 현재 산모의 사망요인 중 가장 중요한 인자로 꼽히고 있다.
혈액은 생체 내에서 응고와 그 용해가 항상 적절한 평형을 유지하여 정상적으로 순환되는 동안에는 혈전이 형성되지 않는다. 그러나, 여러 가지 원인으로 이 균형이 깨져 혈전이 형성되면, 혈관을 막게 되므로 혈액의 순환이 방해되어 조직으로의 영양분 및 산소 공급이 중단되게 된다. 이러한 혈전으로 야기되는 혈관계 질환의 예방 및 치료를 위한 노력은 혈전의 생성을 막는 항 혈액응고제의 개발과 이미 생성된 혈전을 용해시키는 혈전용해제의 개발로 집중되어 왔다.
생성된 혈전(thrombus)은 혈액 중에 존재하는 세린계 단백질 분해 효소인 플라스미노겐 활성화 인자(plasminogen activator)에 의해 플라스미노겐(plasminogen, 불활성 프로효소)으로부터 활성화된 플라스민(plasmin, 활성효소)에 의해 용해된다.
그러나, 플라스민(plasmin)은 피브리노겐에 대해서도 높은 분해활성을 가지고 있기 때문에, 단독으로 혈액 내에 과량 존재할 경우 출혈의 위험성이 있게된다.
현재까지 보고된 인체 내의 플라스미노겐 활성화인자로는 tPA (tissue- type plasminogen activator)와 uPA(urokinase-type plasminogen activator)가 있다 [참조: Rijken, D.C.et al, J. Lab. Clin. Med. 97:477-486 (1981)].
tPA는 혈전이 생성된 부위의 내피세포(endothelial cell)에서 분비되며, uPA는 대부분 신장에서 생성되어 전구체 상태(pro-urokinase, UK)로 혈액 내에 존재하고 있으며, 이 플라스미노겐 활성인자는 PAI(plasminogen activator inhibitor)에 의해 활성이 조절되고 있다.
유로키나제(urokinase)는 요(urine) 또는 신장세포 및 특정한 암세포의 배양액 등에서 분리된 당단백질로서 피브린을 용해할 수 있는 기능이 있기 때문에, 일찍부터 생리적인 혈전용해제로서 치료에 사용되어져 왔고, 심정맥 혈전(deep-vein thrombosis), 관상폐색(coronary obstructions)등에도 사용되어 왔으나, 피브린에 대한 특이성이 없어 전신 출혈을 일으킬 수 있어 부작용이 많이 나타난다. 즉, 유로키나제는 피브린용해 과정에서 비특이적인 전신성(systemic) 플라스미노겐 활성 및 피브리노겐의 분해에 관여하며, 여러 가지 혈액응고 단백질을 분해하는 문제점을 가지고 있다 [참고: Ducket, F.Fibrinolytics and Antifibrinolytics pp209-237 (Markwadt, F., ed.)(1978); Voger, G.Fibrinolytics and Antifibrinolyticspp179-207 (Markwadt, F., ed.)(1978)].
인체 자궁 조직 등 여러 조직에서 분리된 tPA는 혈액 내 약 5ng/㎖ 농도로 존재하며, PAI-I과 복합체를 이루거나 자유형(free form)으로 존재하는데, 내피세포나 간세포 수용체에 의해 빠르게 제거된다. 혈중 내 반감기가 5∼8분으로 매우 짧아 장기간 정맥으로 주사해야 하며, 고역가를 투여함으로 가격이 비싼 편이다. 그 외 사용되고 있는 혈전 용해제로는 스트렙토키나제(Streptokinase(SK)), 단일 사슬 유로키나제형 플라스미노겐 활성인자(Single chain urokinase type plasminogen activator(SCUPA))라고 부르는 프로유로키나제(prourokinase(pro-UK)
), 아니실레이티드 플라스미노겐-스트렙토키나제 활성인자 컴플렉스(Anisylated plasminogen-streptokinase activator complex(APSAC))등이 있다.
SK는 세균인Streptococcus haemolytics에 의하여 생산되는 물질로서 일종의플라스미노겐 활성인자이다. SCUPA는 사람의 신장세포에 존재하는 물질로서 혈전과는 친화성이 있는 편이나 혈중에서 그 반감기가 매우 짧으며 고가이다. 그리고, 주로 사람의 혈장단백에 많이 존재하는 APSAC는 세균인Streptococcus haemolytics에서 생산하기도 한다. APSAC는 혈전과의 친화력은 강하나 SK와 마찬가지로 출혈의 부작용이 있다.
tPA는 유로키나제나 SK보다 혈전에 선택적으로 작용하는데, 이는 tPA가 피브린-플라스미노겐 중합체(fibrin-plasminogen complex)에 결합하여 플라스미노겐을 플라스민으로 전환시키는 선택적 혈전용해 효능에 기인한다.
유로키나제는 플라스미노겐에 직접적으로 작용하여 그 활성을 높여 혈전용해능을 보이며 SK는 플라스미노겐과 중합체를 형성한 후 그 활성을 높여 혈전용해능을 보인다. SK는 또한 혈액중의 피브리노겐에도 작용하여 전신항혈액응고 효능(systemic anti-coagulation)도 보인다.
유로키나제와 SK는 혈전색전(thromboemboli) 뿐만 아니라 지혈전(hemostatic plugs)역시 용해시킴으로써 출혈(hemorrhage)을 유발할 가능성이 있다. 특히, 수술 혹은 간, 신장의 생검(biopsy)후 10일 내에는 유로키나제나 SK의 투여는 수술부위에서의 출혈 위험 때문에 금지하고 있다. 또한, 최근의 연구에 따르면 tPA등 플라스미노겐 활성화인자(plasminogen activator)가 자극독성(excitotoxicity)에 의한 신경세포(neuronal injury)손상을 초래할 수 있음이 밝혀졌다.
신경세포사멸(neuronal death)의 주요원인인 자극독성(excitotoxicity)은 tPA등에 의해 플라스미노겐(plasminogen)으로부터 활성화된 플라스민(plasmin)의 직접작용에 의해 발현되어지는 것으로 사료된다[참고: Y. F. Yang, etal., Nature Med., 4, 228(1998), A. D. Rogove and S. E. Tsirka, Curr. Biol., 8, 19(1998), I. L. Chen and S. Strickland, Cell, 91, 917(1997)].
본 발명자들은 멸치 발효액에서 새로운 혈전용해 단백질을 발견하였으며, 이 새로운 혈전용해 단백질의 혈전용해 기전은 기존의 플라스미노겐 활성화인자(plasminogen activator)들과는 달리 혈전에 직접적으로 작용하여 혈전용해능을 보이는 것으로 사료된다.
한편, 본 발명과 유사하게 천연물에서 추출한 단백질을 혈전용해제로 사용하는 것이 개시된 바 있다. 이 중 대한민국 특허공개 제2000-30981호 "버섯으로부터 유래한 혈전용해효소 및 그 제조방법"에서는 송이버섯인 트리코로마속 버섯 균사체로부터 폴리펩타이드를 추출하여 혈전용해제로 사용하는 것을 개시하고 있다. 그러나 상기에 개시된 폴리펩타이드의 경우 혈전용해 효과가 충분한 것으로 사료되지 않는다.
또한, 미국특허 제5,750,650호에서는 발효식품인 나토(Natto)에서 추출 분리된 분자량 31,000 정도의 폴리펩타이드를 혈전용해제로 사용하는 것이 개시되어 있으나 이 역시 충분한 혈전용해 효과를 기대하기는 어려운 것이었다.
따라서 본 발명은 기존의 플라스미노겐 활성화인자(plasminogen activator, PA)보다 혈전 용해 특이성이 우월하며, 뇌세포 파괴부작용(Y.H. Kim, J.H. Park, and S.H. HongScience,284: 647∼650 (1999))이 감소한 신규 혈전용해제를 개발한 것이다.
따라서 본 발명은 새로운 혈전용해 단백질의 추출 및 정제 방법을 발명하였으며, 혈전용해 단백질의 활성을 동물의 혈중에서 실험 입증함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 혈전증에 사용되고있는 기존의 혈전용해제(유로키나제, 조직 플라스미노겐 활성화인자, 스트렙토키나제)가 가지고 있는 짧은 혈중 반감기, 혈전에 대한 낮은 특이성, 신경세포 손상등 부작용 및 고가의 생산단가 등을 개선시킨 것으로, 멸치 발효액으로부터 새로운 혈전용해 단백질의 추출 및 정제를 시도한 결과, 새로운 N-말단 아미노산 서열을 갖는 신규혈전용해제를 제공하는 것이다.
도 1은 멸치 발효액으로부터 본 발명의 혈전용해 단백질을 추출 분리 정제하는 과정을 보여주는 공정도이다.
도 2는 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질의 전기영동 사진이다.
도 3은 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질의 활성을 트리스 완충액(20mM Tris-HCl, pH8.0)에서 유로키나제(urokinase)와 비교한 사진이다.
도 4는 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질의 활성을 쥐의 혈장에서 유로키나제(urokinase)와 비교한 사진이다.
도 5는 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질의 pH에 대한 안정성과 활성에 미치는 pH의 영향을 보여주는 그래프이다.
-●-는 pH 안정성을 측정한 결과이며, -○-는 최적 pH값을 측정한 결과이다.
도 6은 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질의 온도에 대한 안정성과 활성에 미치는 온도의 영향을 보여주는 그래프이다.
-●-는 최적 활성온도의 측정 결과이며, -○-는 온도 안정성을 측정한 결과이다.
도 7은 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질과 유로키나제(urokinase)를 플라스미노겐이 불활성화된 피브린 플레이트(fibrin plate)에서 혈전용해 활성을 비교한 사진이다.
도 8은 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질을 쥐에게 경구투여한 후 혈액 내 혈전용해능의 변화를 시간에 따라 피브린 플레이트에서 측정한 그래프이다.
-●-는 본 발명의 혈전용해 단백질의 활성을 나타낸 것이며, -○-는 대조군에서의 활성을 나타낸 것이다.
도 9는 멸치 발효액으로부터 추출된 본 발명의 혈전용해 단백질과 유로키나제(urokinase)를 쥐에게 정맥 주사한 후 혈액 내 혈전용해능의 변화를 시간에 따라 피브린 플레이트(fibrin plate)에서 측정한 그래프이다.
-●-는 실험군의 활성을 나타낸 것이며, -○-는 유로키나제(urokinase) 투여군에서의 활성을 나타낸 것이다.
따라서 본 발명의 목적은 멸치 발효액을 35∼45 용량% 에탄올로 침출시킨 후, 원심분리하여 상층액을 회수한 후, 70∼80 용량% 에탄올로 추출한 후 원심분리시켜 침전물을 회수하고, 상기 침전물을 Tris-HCl 완충액으로 투석한 후, 이를 DEAE-Sephadex 음이온 교환 컬럼으로 단백질을 흡착시킨 후, 염화나트륨으로 용출하고, Tris-HCl 완충액으로 투석 동결 건조된 단백질을 Tris-HCl 완충액에 녹여, 세파덱스 젤 여과 컬럼을 통해 수득된 N-말단 아미노산 서열이 Ile-Val-Gly-Gly-Glu-Glu-Ala-Thr-Ala-Asn-Ser-Thr이고 분자량이 약 28kD인 혈전용해 단백질을 제공하는 것이다.
상기 Tris-HCl 완충액은 18∼22mM의 pH 7.0∼8.0의 Tris-HCl 완충액이고, 상기 DEAE-Sephadex 음이온 교환 컬럼은 DEAE-Sephadex A-50 컬럼이고 상기 세파덱스 젤 여과 컬럼은 Sephadex G-75 젤 여과 컬럼임을 특징으로 하고, 최적 pH가 7.5∼8.5이고 pH 4.0∼10.0까지 범위에서 70% 이상의 안정성을 나타내며, 최적 온도가 38∼42℃이고 20℃∼40℃ 범위에서의 안정성을 나타냄을 특징으로 한다.
또한 본 발명은 상기 혈전용해 단백질을 유효량 함유하는 경구 또는 비경구용 혈전용해 제제 또는 혈전용해 단백질을 유효량 함유하는 혈전 방지 건강식품을 제공하는 것이다.
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 멸치 발효액에 70∼100% 에탄올을 35∼45 용량%되게 넣고 -22∼-18℃에서 4∼8시간 보관 후 8,000∼12,000 rpm(2∼6℃)에서 8∼12분간 원심분리하고 상층액을 수거한 후 90∼100% 에탄올을 70∼80 용량%되게 넣고 -22∼-18℃에서 4∼8시간 보관 후 8,000∼12,000 rpm(2∼6℃)에서 8∼12분간 원심분리하고 침전물을 수거한다. 상기에서 얻은 침전물을 18∼22mM Tris-HCl 완충액(pH 7∼8)으로 15∼21시간 투석 후, DEAE-Sephadex A-50 음이온 교환 컬럼에 단백질을 흡착시킨 후 0.2∼0.4M NaCl로 용출한다. 그 후, 18∼22mM Tris-HCl 완충액(pH 7∼8)으로 15∼21시간 투석하고 동결 건조한다. 동결 건조한 단백질을 18∼22mM Tris-HCl 완충액(pH 7∼8)으로 녹인 후 Sephadex G-75 젤 여과 컬럼으로 혈전용해능이 있는 새로운 혈전용해 단백질을 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 혈전용해 단백질의 N-말단의 아미노산 서열을 조사하였다.
펩타이드 서열 결정기(ABI 476A, Perkin-elmer, U.S.A)를 이용하여 N-말단의 아미노산을 조사해본 결과 Ile-Val-Gly-Gly-Glu-Glu-Ala-Thr-Ala-Asn-Ser-Thr이었다. 이는 지금까지 보고된 혈전용해 단백질과의 N-말단 아미노산 서열을 비교하여 보면 본 발명의 단백질은 기존의 혈전용해 단백질과 상이한 N-말단 아미노산 서열을 갖고 있음을 발견하였고 따라서 신규 단백질임을 확인하였다.
참고로 기존의 혈전용해 단백질의 N-말단 아미노산 서열을 살펴보면 유로키나제는 SNELHQVPSNCD이고, tPA는 GARSYQVICRDE이고, 스트렙토키나제는 IAGYEWLLDRPS이고, Lumbrokinase F-Ⅲ-2는 IVGGIEARPYEF이고, Lumbrokinase F-I-0는 VVGGSDTTIGQY이다.
본 발명의 혈전용해 단백질 3000 IU를 swine gastric mucin이 함유된 생리식염수(saline) 0.5㎖에 녹여 생후 4주의 쥐(평균체중 140g) 15마리에 각각 경구 투여하였고 쥐 5마리는 대조군으로서 혈전용해 단백질이 함유되지 않은 생리식염수(saline, swine gastric mucin만을 함유) 0.5㎖를 경구투여 하였다.
투여 직전과 투여 후 1, 2, 3, 4시간에 쥐 3마리씩에서 심장으로부터 채혈하여 혈액 내에서의 혈전용해 단백질의 활성을 측정하였다. 이렇게 수집된 혈액에 3.8% 구연산(citric acid)을 혈액과 10 : 1(v/v, 혈액 : 구연산)이 되게 가하여 원심분리(3,000 rpm, 30min, 4℃)하여 상층 액을 회수한 후 피브린 플레이트에서 투명 환의 넓이를 측정하였다.
이 실험을 통해 멸치 발효액으로부터 추출, 정제한 혈전용해 단백질이 쥐에게 경구투여 후 혈액으로 흡수되어 그 활성을 유지하고 있음을 알 수 있었다.
한편, 동일한 피브린 플레이트 방법에서 유로키나제 100,000 IU를 상기의 방법으로 쥐에 경구 투여한 실험에서는 모든 시간별(투여직전, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 24시간)에서 채취한 혈중에서 혈전 용해 효능을 감지할 수 없었다.
따라서, 혈전증의 예방을 위해 본 발명의 혈전용해 단백질의 경구투여 의약품 및 건강 식품으로의 개발이 가능한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이러한 실시예들로 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
(실시예 1) 혈전용해 단백질의 추출 및 정제
본 발명에 따라 멸치 발효액으로부터 혈전용해효소를 추출 정제하는 방법을 도 1에 표시하였다. 도 1에서 표시한 바와 같이, 멸치 발효액에 100% 에탄올을 40%되게 넣고 -20℃에서 6시간 보관 후 10,000 rpm(4℃)에서 10분간 원심분리하고 상층 액을 수거한 후 100% 에탄올을 75%되게 넣고 -20℃에서 6시간 보관 후 10,000 rpm(4℃)에서 10분간 원심분리하고 침전물을 수거한다. 상기에서 얻은 침전물을20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 18시간 투석 후, DEAE-Sephadex A-50 음이온 교환 컬럼에 단백질을 흡착시킨 후 0.3M NaCl로 용출한다. 그 후, 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 18시간 투석하고 동결 건조한다. 동결 건조한 단백질을 20mM Tris-HCl 완충액(pH 7.5)으로 녹인 후 Sephadex G-75 젤 여과 컬럼으로 단일 단백질로 정제하였다.
(실시예 2) 분자량 측정
실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질을 10% SDS-PAGE로 전기 영동하여 분석한 결과(lane B), 그 분자량은 약 28kD으로 확인되었으며, 전기영동 사진을 도 2에 나타내었다. 분자량 표준 물질(lane A)로는 포스포릴라제b(phospharylase b, 97.4 kD), 소혈청알부민(bovine serum albumin, 66.2 kD), 난알부민(ovalbumin, 45kD), 카본산 안하이드라제(carbonic anhydrase, 31 kD), 대두 트립신 억제물질(soybean trypsin inhibitor, 21.5 kD) 및 라이소자임(lysozyme, 14.4kD)을 사용하였다.
(실시예 3) 혈전용해 활성의 측정
혈전용해의 활성 정도를 측정하기 위하여 Astrup(Astrup, T. and Mullertz, S., :Arch, Biochem. 40: 346, 1952)등의 방법에 따라 피브린(fibrin)을 기질로하는 피브린 플레이트(fibrin plate) 법을 사용하였다. 즉, 0.06%의 피브리노겐(fibrinogen) 용액 10㎖를 petri dish에 넣고 borate saline 완충액(pH 7.8)에 녹인 트롬빈(thrombin) 용액(40 units/㎖)을 총 20 units되게 가하여 균일하게 혼합되도록 잘 흔들어 준다. 서서히 피브리노겐(fibrinogen)이 피브린(fibrin)으로 되면서 굳어지는데 이 플레이트를 실온에서 30분간 방치한 후 측정할 시료를 플레이트에 얹고 37℃ 항온기에 방치한 후 시간별로 반응시켜 피브린(fibrin)이 분해되어 생기는 투명한 환(circle)의 넓이를 측정하여 시료의 혈전용해 활성을 측정하였다. 본 발명에 사용된 활성단위(IU)는 유로키나제(urokinase)를 사용하여 표준 곡선(standard curve)를 작성한 후 유로키나제 1 IU와 본 발명의 혈전용해 단백질 1 IU를 동일한 활성으로 나타내었다.
유로키나제(urokinase)(A)와 실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질(B) 각각 1 IU, 10 IU, 50 IU를 20mM Tris-HCl(pH 8.0)완충액에 섞어 상기의 방법으로 만든 피브린 플레이트에서 피브린 분해 형태를 측정하였다(도 3 참조). 그리고 쥐의 심장에서 채혈한 혈액에 3.8% 구연산(citric acid)을 혈액부피의 10분의 1되게 섞은 후 원심분리(3,000 rpm, 30분, 4℃)하여 회수한 쥐의 혈장에 유로키나제(urokinase)(A)와 실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질(B) 10 IU, 50 IU를 섞어 상기의 방법으로 만든 피브린 플레이트에서 피브린 분해 형태를 측정하였다(도 4 참조).
(실시예 4) 혈전용해 단백질의 최적 활성 pH 측정
혈전용해 단백질의 최적 pH를 측정하기 위하여 실시예 1에서 정제한 혈전용해 단백질분말 500 IU를 0.5㎖ 증류수에 녹이고 pH 4(0.05M 구연산염 완충액), pH 5(0.05M 초산 완충액), pH 6과 7(0.05M 인산 완충액), pH 8과 9(0.05M 트리스 완충액) 혹은 pH 10(0.05M 탄산 완충액)의 완충액 0.5㎖에 섞어, 37℃에서 2시간 방치시킨 후, 0.1㎖를 피브린 플레이트에 놓아서 피브린이 분해되어 생긴 환의 넓이를 측정하여 최적 활성 pH를 측정하였다.
도 5에서 -○-는 최적 활성 pH값을 측정한 결과이며, 가장 넓은 환을 보인 pH를 최적 활성 pH로 정했으며, 이때의 환의 넓이를 100%로 보아 다른 pH에서의 환의 넓이를 상대적으로 표시하였다. 실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질은 pH 8에서 최적 활성을 나타냄을 알 수 있었다.
(실시예 5) 혈전용해 단백질의 pH 안정성 측정
혈전용해 단백질의 pH 안정성을 측정하기 위하여 실시예 1에서 정제된 단백질을 실시예 4에서와 동일한 pH4∼10의 완충액에 섞어 37℃에서 2시간 동안 방치시킨 후 그 완충액을 pH 8의 트리스 완충액(20mM Tris-HCl)으로 교환하고 4℃에서 24시간 방치시켰다. 그 후 37℃에서 다시 2시간 방치시킨 후, 0.1㎖를 피브린 플레이트에 놓아서 피브린이 분해되어 생긴 환의 넓이를 측정하여 pH 안정성을 추정하였다. 가장 큰 환을 보인 pH를 pH 안정성 100%로 하고 각각의 pH에 대한 단백질의 안정성을 환의 넓이에 따라 상대적으로 측정하였다.
도 5에서 -●-는 pH에 안정성을 측정한 결과이며 실시예 1에서 정제된 단백질은 pH 8에서 가장 우수한 안정성을 보였으며, 넓은 범위의 pH(pH 4∼10)에서 70% 이상의 활성을 유지하였다.
(실시예 6) 혈전용해 단백질의 최적 활성 온도 측정
혈전용해 단백질의 최적 활성 온도를 측정하기 위하여 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 0.1㎖에 녹아있는 실시예 1에서 정제된 단백질 용액 50 IU를 피브린 플레이트에 놓아서 20, 30, 40, 50, 60, 70℃에서 2시간 방치시킨 후 피브린이 분해된 환의 넓이를 측정하여 최적 활성 온도를 측정하였다.
도 6에서 -●-는 최적 활성 온도의 측정 결과이며, 본 발명의 단백질은 약 40℃ 의 온도에서 최고 활성을 보이며, 40∼50℃의 온도 범위에서 최적 활성온도에서의 활성의 80% 이상의 활성을 유지하였다.
(실시예 7) 혈전용해 단백질의 온도 안정성 측정
혈전용해 단백질의 최적 활성 온도를 측정하기 위하여 20mM Tris-HCl 완충액(pH 8.0) 0.1㎖에 녹아있는 실시예 1에서 정제된 단백질 용액 50 IU를 20, 30, 40, 50, 60, 70℃에서 30분간 방치한 후 0.1㎖를 피브린 플레이트에 놓아서 37℃에서 2시간 방치한 후 피브린이 분해된 환의 넓이를 측정하여 온도 안정성을 평가하였다.
도 6에서 -○-는 온도 안정성을 측정한 결과이며, 20∼40℃에서 단백질 활성의 손실이 거의 없었으며, 이때의 피브린 플레이트의 환의 넓이에 기인한 열 안정성을 100%로 하였을 때 각 온도별 안정도를 환의 넓이에 따라 상대적으로 나타내었다. 도 6의 결과로부터, 본 발명의 단백질은 약 20∼40℃ 온도 범위에서 안정한 반면 50℃를 초과하면 단백질 활성이 급격히 감소하는 것을 알 수 있었다.
(실시예 8) 금속이온에 대한 혈전용해 단백질 활성의 영향
각종 금속이온을 최종농도가 0.1mM, 0.5mM, 1.0mM이 되도록 혈전용해 단백질 100 IU가 녹아있는 완충액(20mM Tris-HCl, pH 8.0) 0.2㎖에 첨가한 후 37℃에서 30분간 전처리 하였다. 그 후 단백질 50 IU, 0.1㎖를 피브린 플레이트에 놓아서 피브린이 분해된 환의 넓이를 측정하여 금속이온에 대한 혈전용해 단백질 활성의 영향을 측정하였다.
표 1에서 나타난 바와 같이 실시예 1에서 추출 정제한 단백질의 혈전용해 효능에 대한 억제 정도는 각 금속 이온마다 다르며, 금속 이온의 농도에 관계됨을 알 수 있었다. 조사된 금속이온 중 수은이 가장 강력한 단백질에 의한 혈전용해 효능에 대한 억제효과를 보였다.
| 금속이온 | 농도(mM) | 상대 활성(%) |
| Control | 0 | 100 |
| Ca2+ | 0.1 | 90 |
| 0.5 | 84 | |
| 1.0 | 77 | |
| Mg2+ | 0.1 | 92 |
| 0.5 | 85 | |
| 1.0 | 85 | |
| Cu2+ | 0.1 | 92 |
| 0.5 | 70 | |
| 1.0 | 57 | |
| Zn2+ | 0.1 | 90 |
| 0.5 | 68 | |
| 1.0 | 57 | |
| Co2+ | 0.1 | 87 |
| 0.5 | 87 | |
| 1.0 | 77 | |
| Mn2+ | 0.1 | 90 |
| 0.5 | 84 | |
| 1.0 | 71 | |
| Hg2+ | 0.1 | 78 |
| 0.5 | 0 | |
| 1.0 | 0 |
(실시예 9) N-말단 아미노산 서열 분석
펩타이드 서열 결정기(ABI 476A, Perkin-elmer, U.S.A)를 이용하여 실시예 1에서 추출 정제한 N-말단의 아미노산을 조사해 본 결과 Ile-Val-Gly-Gly-Glu-Glu-Ala-Thr-Ala-Asn-Ser-Thr이었다.
지금까지 보고된 혈전용해 단백질과의 N-말단 아미노산 서열을 비교한 결과, 본 발명의 단백질은 기존의 혈전용해 단백질과 상이한 N-말단 아미노산 서열을 갖고 있고, 따라서 신규 단백질임을 알 수 있었다(표 2 참조).
| 혈전용해 단백질 | N-말단 아미노산 서열 |
| 멸치 발효 액 유래의 혈전용해 단백질 | IVGGEEATANST |
| Urokinase | SNELHQVPSNCD |
| tPA | GARSYQVICRDE |
| Streptokinase | IAGYEWLLDRPS |
| Lumbrokinase F-Ⅲ-2 | IVGGIEARPYEF |
| Lumbrokinase F-I-0 | VVGGSDTTIGQY |
(실시예 10) 프라스미노겐이 불활성화된 피브린 플레이트에서 멸치 발효액으로부터 분리, 정제한 혈전용해 단백질과 유로키나제(urokinase)의 혈전용해능 측정
실시예 1의 방법으로 제조한 혈전용해 단백질과 유로키나제(각각 50IU, 100㎕)를 80℃에서 30분 동안 전처리된 피브린 플레이트(A)와 전처리되지 않은 피브린플레이트(B)에 놓아서 37℃에서 2시간 방치시킨 후 피브린이 분해된 환의 넓이를 측정하여 혈전용해 효능을 비교하였다.
도 7에서 나타난 바와 같이 열처리에 의해 플라스미노겐이 불활성화된 경우(A) 본 발명의 단백질(a)은 현저한 혈전용해효능을 보이는 반면 유로키나제(b)는 그 혈전용해 작용을 보이지 않았다. 전처리가 없는 대조군(B)에서는 본 발명의 단백질(a)과 유로키나제(b) 모두 비슷한 효능을 보였다.
이 실험을 통해 본 발명의 단백질의 혈전용해 기전이 기존에 알려진 tPA나 유로키나제 등의 혈전용해 기전으로 알려진 플라스미노겐 활성화에 의한 것이 아니라, 혈전에 직접적인 작용에 의한 것임을 알 수 있었다.
(실시예 11) 쥐에 경구 투여 후 혈전용해 단백질의 혈액 중 혈전용해능 측정
실시예 1의 방법으로 제조한 혈전용해 단백질 3000 IU를 swine gastric mucin이 함유된 생리식염수(saline) 0.5㎖에 녹여 생후 4주의 쥐(평균체중 140g) 15마리에 각각 경구 투여하였다. 따로이 쥐 5마리는 대조군으로서 혈전용해 단백질이 함유되지 않은 생리식염수(saline, swine gastric mucin만을 함유) 0.5㎖를 경구투여 하였다. 투여 직전과 투여 후 1, 2, 3, 4시간에 쥐 3마리씩(대조군의 경우 1마리씩)에서 심장으로부터 채혈하여 혈액 내에서의 혈전용해 단백질의 활성을 피브린 플레이트에서 측정하였다. 이렇게 수집된 혈액에 3.8% 구연산(citric acid)을 혈액과 10 : 1(v/v, 혈액 : 구연산)이 되게 가하여 원심분리(3,000 rpm, 30min, 4℃)하여 상층 액을 회수한 후 피브린 플레이트에서 투명 환의 넓이를 측정하였다.
그 결과를 도 8에 나타내었으며 -○-는 대조군의 활성을, -●-는 실험군의 활성을 나타내었다. 이 실험을 통해 멸치 발효액으로부터 추출, 정제한 혈전용해 단백질이 쥐에게 경구투여 후 혈액으로 흡수되어 그 활성을 유지하고 있음을 알 수 있었다.
한편, 동일한 피브린 플레이트 방법에서 유로키나제 100,000 IU를 상기의 방법으로 쥐에 경구 투여한 실험에서는 모든 시간별(투여직전, 1, 2, 3, 4, 5, 7, 24시간)에서 채취한 혈중에서 혈전 용해 효능을 감지할 수 없었다. 따라서, 혈전증의 예방을 위해 본 발명의 혈전용해 단백질의 경구투여 의약품 및 건강 식품으로의 개발이 가능하다고 사료되었다.
(실시예 12) 쥐에 정맥 주사 후 혈전용해 단백질의 혈액 중 혈전 용해능 측정
쥐의 대퇴부 정맥에 유로키나제 혹은 실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질을 18,000 IU 주사 후 대퇴부 동맥으로부터 유로키나제의 경우 20, 40, 60, 80, 100, 120, 150, 180초 그리고 실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질의 경우 20, 60, 100, 140, 180, 300, 420, 600초에 채혈하였다. 이렇게 수집된 혈액에 3.8% 구연산(citric acid)을 혈액과 10 : 1(v/v, 혈액 : 구연산)이 되게 가하여 원심분리(3,000 rpm, 30min, 4℃)하여 상층 액을 회수한 후 피브린 플레이트에서 투명 환의 넓이를 측정하였다.
그 결과를 도 9에 나타내었으며 -○-는 유로키나제의 활성을, -●-는 실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질의 활성을 나타내었다.
이 실험으로부터 실시예 1에서 정제된 혈전용해 단백질의 혈전용해능이 유로키나제와 동일 약효 투여량 투여시 유로키나제의 그것보다 우수하였으며 혈중에서의 작용시간 역시 긴 것으로 나타났다.
(실시예 13) 혈전용해 단백질의 급성독성
실시예 1에서 추출, 정제한 혈전용해 단백질의 급성독성을 알아보기 위해 3마리를 1군으로 하여 생쥐에 혈전용해 단백질을 4,000,000 IU/㎏, 1,000,000 IU/㎏, 400,000 IU/㎏ 및 100,000 IU/㎏의 용량으로 복강내 주사하고, 주사한 다음 날부터 죽은 마우스의 수 및 육안으로 이상 여부를 30일간 관찰하였다. 표 3에 나타난 바와 같이 투여 후 30일 동안 죽은 생쥐는 없었으며, 가시적인 관찰에 의하면 정상적인 건강상태를 보여 주었다.
| 혈전용해 단백질 용량 | 4,000,000 IU/㎏ | 1,000,000 IU/㎏ | 400,000 IU/㎏ | 100,000 IU/㎏ |
| 투여 30일간죽은 마우스의 수 | 0 | 0 | 0 | 0 |
본 발명의 효과는 상기 혈전용해 단백질을 이용하여 혈전증(뇌혈전증, 뇌경색, 말초동, 정맥폐색증, 급성심근경색, 폐색전증 등)의 치료 및 예방을 위한 의약품 및 식품의 개발에 있다.
Claims (5)
- a) 멸치 발효액을 35~45 용량% 에탄올로 침출시킨 후, 원심분리하여 상층액을 회수하고, 70~80 용량% 에탄올로 추출한 후 원심분리시켜 침전물을 회수하는 단계;b) 상기 침전물을 Tris-HCl 완충액으로 투석하고, 이를 DEAE-Sephadex 음이온 교환 컬럼으로 단백질을 흡착시키는 단계;c) 상기 흡착된 단백질을 염화나트륨으로 용출하는 단계;d) 상기 용출된 단백질을 Tris-HCl 완충액으로 투석하고 동결 건조하는 단계; 및e) 상기 동결 건조된 단백질을 Tris-HCl 완충액에 녹이고, 세파덱스 젤 여과 컬럼을 통해 혈전용해 단백질을 수득하는 단계를 거쳐 수득되고, N말단 아미노산 서열이 Ile-Val-Gly-Gly-Glu-Glu-Ala-Thr-Ala-Asn-Ser-Thr이고 분자량이 약 28kD인 혈전용해 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 Tris-HCl 완충액은 pH 7.0~8.0의 18~22mM Tris-HCl 완충액이고, 상기 DEAE-Sephadex 음이온 교환 컬럼은 DEAE-Sephadex A-50 컬럼이며, 상기 세파덱스 젤 여과 컬럼은 Sephadex G-75 젤 여과 컬럼임을 특징으로 하는 혈전용해 단백질.
- 제1항에 있어서, 상기 혈전용해 단백질은 최적 pH가 7.5~8.5이고, pH 4.0~10.0 범위에서 70% 이상의 안정성을 나타내며, 최적 온도는 38~42℃이고, 20℃~40℃ 범위에서 안정성을 나타내는 것을 특징으로 하는 혈전용해 단백질.
- 제 1항의 혈전용해 단백질을 유효량 함유하는 경구 또는 비경구용 혈전용해 제제
- 제 1항의 혈전용해 단백질을 유효량 함유하는 혈전 방지 건강식품
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