KR100312730B1 - 혈전용해능을 갖는 버섯 추출물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 혈전용해능을 갖는 버섯 추출물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 혈전용해효소를 함유하고 있어 혈전 관련 질환의 치료제 및 건강 보조 식품으로 유용하게 사용될 수 있는, 혈전용해능을 가진 3종의 균류(버섯류), 즉 구름버섯(Coriolus versicolor), 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius) 및 장식솔버섯(Tricholomopsis decora)의 추출물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 혈전용해효소를 함유하고 있어 혈전 관련 질환의 치료제 및 건강 보조 식품으로 유용하게 사용될 수 있는, 혈전용해능을 가진 3종의 균류(버섯류), 즉 구름버섯(Coriolus versicolor), 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius) 및 장식솔버섯(Tricholomopsis decora)의 추출물에 관한 것이다.
혈관이 손상을 받아 출혈이 일어나면 혈액이 응고되는 체내 방어시스템이 작동하게 되는데 이 과정은 활성화된 트롬빈(thrombin)에 의해 피브리노겐 (fibrinogen)이 피브린(fibrin)으로 전환됨으로써 유도된다. 이렇게 생성된 혈전 (fibrin clots)은 상처 회복 후 플라스민과 같은 혈전용해효소 (fibrinolytic enzyme)에 의해 용해되는데, 만약 생성된 혈전이 체내에 과도하게 축적되거나 혈전 용해 기작이 원활하게 작동하지 못할 경우에는 혈전증(thrombosis)이 유발되어 인체에 치명적인 손상을 줄 수도 있다. 예를 들어, 뇌혈관에 혈전이 생성되는 뇌혈전증이 일어나면 반신불수가 될 수 있고, 뇌의 미세 혈관이 파열되어 뇌출혈이 일어나면 생명에 치명적인 손상을 일으킬 수 있으며, 혈전에 의해 심장혈관이 막히면 심부전증이나 심장마비가 유발될 수 있다.
현재까지 혈전의 제거를 위한 연구가 계속 진행되어 왔는데, 특히 스트렙토키나제(streptokinase), 유로키나제(urokinase), t-PA(tissue-type plasminogen activator)와 같은 플라스미노겐 활성인자(plasminogen activator)를 정맥주사하여 혈전용해계(fibrinolytic system)를 활성화하는 치료법이 가장 보편적인 방법으로 사용되고 있다. 그러나, 상기 물질들은 전신출혈(systemic haemorrhage)이 유발되는 등 부작용이 크며 가격이 매우 비쌀 뿐만 아니라, 유로키나제를 제외하고는 경구투여가 불가능한 실정이다. 따라서 보다 경제적이고 경구투여가 가능한 혈전증 치료제에 대한 연구가 다양하게 시도되고 있으며, 직접 경구 투여하거나 경구 투여와 혈관 주사를 병용함으로써 혈액 내의 혈전용해능을 증가시킬 수 있는 제제들이 개발되고 있다. 현재, 경구투여가 가능한 혈전제로는 지렁이(Lumbricus lubellus)로부터 분리된 6가지의 혈전용해효소가 알려져 있다.
한편, 광범위한 탐색 기술을 활용하여 자연계의 여러 생물에 존재하는 혈전 용해성 물질을 새로운 혈전 용해제로 개발려는 많은 시도가 이루어졌다.
식물의 경우, 은행잎에서 추출한 성분이 혈류 순환을 원활히 해주는 것으로 알려져 이를 사용한 제품들이 개발되어 상품화되었고, 동물에서도 흡혈박쥐의 침샘조직으로부터 분리한 신규 플라스미노겐 활성인자(plasminogen activator) (Gardell, S.J.,et al., Circulation84, 244-253, 1991)를 비롯하여, 뱀독에서 분리된 살모나제(salmonase)(Chung, K.H. and Kim, D.S.,Thromb. Haemost.65, 953, 1991〕, 거머리에서 분리된 헤멘틴(hementin), 및 지네에서 분리된 피브린 분해효소 (fibrinolytic enzyme)〔Kim, K.Y., Chung, K.H., and Moon, H.M.,Thromb. Haemost.69, 839, 1993) 등이 혈전용해 작용이 있는 것으로 알려 있다.
또한, 미생물에서도 여러가지 혈전 용해 물질이 확인되었는데, 스트렙토키나제가 대료적인 예이며, 그밖에도 1948년에 보고된 스태필로키나제, 아스퍼질러스 오리제에서 발견된 CA-7, 브리노라제, 피브리노리신, 바실러스 속 균주에서 발견된 피브린 분해효소 등이 혈전 용해제로 보고되어 있다.
이 외에도 한국과 일본을 중심으로 한 발효식품에서의 혈전용해효소에 대한 연구는 직접 섭취가 가능한 식품을 대상으로 한다는 점에서 주목할 만하다. 일본의 전통대두 발효식품인 낫토(natto)와 절임식품인 시오카라(Shiokara)에서 혈전용해효소가 존재함이 알려져 생산 균주를 분리하고 효소를 정제하였는데, 이 중 낫토로부터 분리된 낫토키나제(nattokinase)라는 효소는 경구 투여하는 경우에도 생체내의 혈전용해능을 높일 수 있다는 보고가 있어 현재 일본에서는 혈전 용해능을 지닌 건강식품으로서 낫토의 판매량이 급증하고 있다(Sumi, H.,et al.,Experimentia43, 1110, 1997 ; 須見洋行,Bioindustry7, 725, 1990). 우리나라에서도 일본의 낫토와 유사한 콩을 원료로 한 전통발효식품인 청국장에서 혈전용해능을 가진 바실러스(Bacillus)균주를 분리 및 정제하였다. 또한, 본 발명자들은 청국장과 마찬가지로 우리나라의 전통대두 발효식품인 된장으로부터 낫토와 청국장에서 분리한 균주에 비해 2~3배 이상의 높은 혈전용해효소를 생산하는 균주를 분리하고 이들 균주가 생산하는 혈전용해 단백질을 발명하여 특허 출원한 바 있다 (대한민국 특허출원 제 96-75523호).
한편, 버섯은 간단한 요리로 직접 섭취가 가능하며 또한 버섯을 이용한 제품은 부작용이 적고 경구투여가 가능하므로 버섯에 대한 많은 연구가 진행되어 왔다. 그러나, 이는 주로 메탈로엔도펩티다제(metalloendopeptidase)와 항진균 활성에 관한 것으로, 혈전용해에 관한 연구는 보고된 바가 없다.
버섯은 예로부터 식용 및 약용으로 널리 이용되어 왔으며 그 종류 또한 다양하다. 현재 한국산 버섯은 990여종이 분류되어 있으며, 이 중 100여종이 식용 가능한 버섯으로 확인되어 있다. 또한 버섯의 경우 균(fungi) 자체의 직접 섭취가가능하므로 혈전용해효과 면에서 매우 유리하다고 할 수 있다.
이에 본 발명자들은 한국산 버섯 중에서 혈전용해능이 우수한 균주 및 혈전분해효소를 발견하고자 노력한 결과, 구름버섯(Coriolus versicolor), 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius) 및 장식솔버섯(Tricholomopsis decora)의 추출물로부터 혈전용해능이 탁월한 혈전용해성 효소 단백질을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 혈전용해능을 갖는 버섯 추출물을 제공하는 것이다.
도 1은 피브린 플레이트 측정방법(fibrin plate assay)에 따라 플라스민과 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius)의 혈전용해능을 측정한 결과를 나타낸 것이고,
A : 모래밭버섯 추출용액 B : 플라스민 (1.0 NHI 유닛/㎖)
도 2는 피브린을 기질로 사용한 12% SDS-피브린 자이모그래피(zymography) 활성측정법을 통해 버섯 추출액 내의 혈전용해 효소 단백질을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
M : 표준 단백질 a : 구름버섯(Coriolus versicolor)
b : 모래밭버섯 c : 장식솔버섯(Tricholomopsis decora)
본 발명은 혈전용해능을 갖는 버섯 추출물을 제공한다. 이 때 버섯은 구름버섯(Coriolus versicolor), 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius)및 장식솔버섯 (Tricholomopsis decora)인 것이 바람직하다.
또한, 본 발명은 상기 버섯 추출물로부터 분리되고, 분자량이 각각 54 kDa, 61 kDa 및 84 kDa인 혈전용해성 효소 단백질을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 혈전용해성 효소 단백질의 일부 또는 전부를 함유하는 버섯 추출물을 유효 성분으로 하는 혈전 관련 질환 치료제용 약학적 조성물 및 건강보조식품을 제공한다. 이 때, 혈전 관련 질환 치료제는 경구 투여가 가능하며,관상동맥 질환, 맥혈전증 또는 뇌혈관질환을 가진 환자에게 적용할 수 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 혈전용해능을 갖는 버섯 추출물 및 이로부터 분리한 54 kDa, 61 kDa, 84 kDa의 효소 단백질을 제공한다.
본 발명에 사용된 50여종의 한국산 버섯은 전국각지에서 수집하여 실험에 사용하였으며, 이 중 혈전용해능을 갖는 3종의 균류(버섯류), 즉 구름버섯, 모래밭버섯 및 장식솔버섯을 선발하여 혈전용해효소 활성을 측정하고, 기질 특이성을 조사하였다.
본 발명에서는 버섯 추출물의 혈전용해활성을 측정하기 위해, 추출물의 피브린 플레이트 용해 면적을 측정함으로써 혈전 용해의 우수성을 비교하였다. 이 때, 대조군으로는 혈전 용해제로서 잘 알려진 플라스민 1.0 NIH 유닛(unit)/㎖를 사용하였으며, 모래밭버섯의 추출물이 대조군인 플라스민보다 4.71배 높은 혈전 용해능을 나타내었다(도 1). 이는 한국과 일본의 전통대두 발효식품인 청국장(1.84 플라스민 유닛)과 낫토(1.58 플라스민 유닛)에서 분리한 바실러스(Bacillus)균주의 활성보다 훨씬 높은 활성에 해당한다. 또한 본 발명자들에 의해 한국 전통재래식 된장에서 분리한 혈전 용해 균주들의 활성(2-5 플라스민 유닛)과는 비슷한 활성을 나타내었다(대한민국 특허출원 제 96-75523 참조). 그러나, 바실러스 균주들과는 달리 버섯의 경우 직접 섭취가 가능하다는 점에서 더욱 주목할 만하다.
또한, 본 발명의 버섯 추출물 내의 혈전분해능을 갖는 것으로 추정되는 효소단백질을 확인하기 위해, 배양 상등액에 암모늄 설페이트를 처리하여 DEAE-세파실 칼럼 등을 실시함으로써 새로운 효소 단백질을 분리 정제하였으며, 이로부터 약 54 kDa, 61 kDa 및 84 kDa의 분자량을 갖는 효소 단백질을 얻을 수 있었다.
상기에서 분리 정제한 효소 단백질의 활성을 확인하기 위해, 버섯의 추출물을 원심 분리하여 균체를 제거하고 그 상등액을 얻은 다음, 이를 SDS-피브린 자이모그래피(SDS-fibrin zymography) 활성확인법으로 분석하였다. 그 결과, 상기 효소 단백질이 혈전 용해 활성을 가짐을 확인할 수 있었다(도 2).
또한, 본 발명의 효소 단백질을 함유하는 버섯 추출물이 임상적으로 사용하기에 적합한가를 확인하기 위해 그 용혈활성(hemolytic activity)을 검색한 결과, 본 발명의 추출물은 전혀 용혈 활성을 나타내지 않았다.
기존의 혈전 용해제는 경구투여가 거의 불가능한 반면, 본 발명의 버섯 추출물은 임상투여시에 경구 또는 비경구 투여가 모두 가능하다는 이점을 갖는다.
즉, 본 발명의 버섯 추출물은 실제 임상투여 시에 경구 및 비경구의 여러 가지 제형으로 투여될 수 있는데, 제재화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (Calcium carbonate), 수크로스 (Sucrose) 또는 락토오스 (Lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜 (Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔 (witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용 될 수 있다.
본 발명의 버섯 추출물의 유효용량은 10∼1000 mg/kg 이고, 바람직하기로는 50∼100 mg/kg 이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 상세히 설명한다.
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 내용이 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 버섯 추출물의 제조
본 발명에 사용된 50여종의 한국산 버섯은 전국 각지에서 수집하여 실험에 사용하였고, 피브린 플레이트(fibrin plate) 제조에 사용된 피브리노겐 (fibrinogen), 트롬빈(thrombin), 아가로즈(agarose) 및 대조구로 사용된 플라스민과 플라스민에 대한 기질 N-p-Tosyl-Gly-Pro-Lys p-니트로아닐라이드 (nitroanilide) 등은 시그마사 제품을 구입하여 사용하였으며, 그 외 사용된 기타 시약들은 특급시약을 사용하였다.
분류된 50여종의 버섯을 100 g의 동일 무게를 80 % 메탄올에 충분히 잠길 정도로 침적하여 한달 간 실온에서 방치한 다음 추출액을 여과하였다. 여액을 감압 농축하여 분말화 한 후 동일량의 메탄올에 현탁시켜 재여과하였다. 여과한 여액을 5ml가 되도록 농축시켜 버섯 추출물을 제조하였다.
<실시예 2> 혈전용해 활성의 갖는 버섯의 선발 및 활성측정
50 mM 인산완충용액(pH 7.4, 0.15M NaCl 포함)에 피브리노겐을 최종농도 0.3 % 가 되도록 완전히 용해시킨 다음, 이 용액 5 ml에 동량의 2% 아가로즈(agarose)를 첨가하여 혼합하였다. 혼합한 용액에 트롬빈(100 NIH 유닛/ml) 0.1 ml을 첨가하여 충분히 혼합한 후 즉시 플레이트에 붓고 1시간 동안 실온에서 고화시켜 피브린 플레이트를 제조하였다. 활성 측정을 위해 피브린 플레이트에 파스테르 파이펫(pasteur pippet)으로 지름 5 mm의 구멍을 만들어 상기 실시예 1로부터 제조한 50종의 버섯 추출액 20 μl씩을 주입하고 37 ℃에서 12시간 반응시킨 다음 생성된 투명환의 면적을 계산하였다. 이 때 대조구로서는 정제된 혈전 용해효소인 플라스민(1.0 NIH unit/ml)을 사용하였다.
그 결과, 구름버섯, 모래밭버섯 및 장식솔버섯 추출액이 혈전용해활성을 나타냄을 알 수 있었다. 이와 같이 선발된 3종의 버섯 추출액의 피브린 플레이트 상에서의 용해면적을 측정하고, 이를 플라스민(1.0 NIH unit/ml)의 용해면적에 대한 상대적인 비율로 환산함으로써 혈전용해능을 산출하였다(표 1).
| 균류 | 혈전용해능(플라스민 1.0 NIH unit/ml)1) |
| 구름버섯(Coriolus versicolor) | 4.45 |
| 모래밭버섯(Pisolithus tinctoriius) | 4.71 |
| 장식솔버섯(Tricholomopsis decora) | 4.19 |
| 혈전용해능1): 시료의 피브린 분해면적/플라스민의 피브린 분해 면적 |
표 1의 결과로부터 알 수 있듯이, 상기 3종의 버섯 모두가 플라스민 1.0 NIH 유닛 보다 3~4배의 높은 활성을 보였으며, 그 중 모래밭버섯이 가장 높은 활성(4.71 플라스민 unit)을 나타내었다(도 1참조). 이러한 버섯 추출액의 혈전분해활성은 플라스민보다 높은 활성을 보이는 것으로 알려진 바실러스 속 균주의 경우보다도 2-3배 높은 활성이다.
<실시예 3> 혈전용해능 기질특이성 조사
일반적으로 피브린 플레이트는 플라스민 뿐만 아니라 다른 프로테아제 (protease)에 의해서도 쉽게 분해될 수 있어 플라스민에 대한 특이성이 낮다. 따라서, 플라스민에 대한 특이 기질 (chromogenic substrate, T-6140)인 N-p-Tosyl-Gly-Pro-Lys p-니트로아닐라이드(nitroanilide)를 사용하여 각 버섯 추출액의 혈전분해효소에 대한 기질 특이성을 조사하였다.
0.5 mM 기질용액 0.2 ml(20 mM 인산완충용액, pH 7.0)과 상기 실시예 2로부터 동정된 3종 버섯 추출액 (3 ㎍/0.2 ml)을 37 ℃ 수조에 넣고 1분간 반응시킨 후 50 % 초산용액 0.1 ml을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 대조구로서는 정제된 플라스민(1.0 NIH unit/0.2 ml)을 사용하였고, 공시험물(blank)은 추출액 0.2 ml와 인산완충용액 0.2 ml를 측정온도에서 1분간 방치한 후 50 % 초산용액 0.1 ml을 혼합하여 제조하였다. 이렇게 제조된 각각의 시료와 공시험물을 405 nm에서 흡광도를 측정하여 플라스민에 대한 상대적 효소활성을 결정하였다(표 2).
| 균류 | 특이성(플라스민 1.0 NIH unit/ml)2) |
| 구름버섯(Coriolus versicolor) | 0.24 |
| 모래밭버섯(Pisolithus tinctoriius) | 0.99 |
| 장식솔버섯(Tricholomopsis decora) | 1.32 |
| T-61401): 플라스민 특이기질(N-p-Tosyl-Gly-Lys pNa,특이성2)플라스민 NIH 유닛/ml |
표 2의 결과로부터 알 수 있듯이, 구름버섯은 0.24 플라스민 유닛으로 아주 낮은 특이성을 보였고, 모래밭버섯의 경우 0.99 플라스민 유닛의 높은 특이성을 나타내었다. 특히 식용되고 있는 장식솔버섯의 경우 1.32 플라스민 유닛의 가장 높은 피브린 다량체에 대한 효소 특이성을 보였다.
<실시예 4> 혈전용해능을 갖는 효소 단백질의 분리 및 정제
실시예 2에서 동정한 3종 버섯 추출물을 10,000 xg 에서 20분간 원심 분리하여 상등액을 취하고 여기에 암모늄 설페이트를 처리하였다. 이렇게 얻어진 단백질침전물을 탈염시킨 후 DEAE-세파셀(DEAE-Sephacel) 컬럼(시그마제품, 미국)을 통과시켜 새로운 효소 단백질을 분리 정제하고, 표준 단백질과 함께 SDS-PAGE 전기영동을 실시하여 상기 효소 단백질이 분리 정제되었음을 확인하였다.
<실시예 5> 혈전용해능을 갖는 효소 단백질의 확인
피브린을 기질로 사용하는 SDS-피브린 자이모그래피(SDS-fibrin zymography) 활성 확인법에 따라 상기 실시예 4로부터 분리 정제된 효소 단백질의 활성 및 분자량을 확인하였다. 피브리노겐의 농도가 0.12 %(w/v)가 되도록 폴리아크릴아마이드 (polyacrylamide) 용액에 혼합한 후 즉시 트롬빈(1.0 NIH unit)을 첨가하여 제조한 피브린-폴리아크릴아마이드 겔 (fibrin-polyacrylamide gel)에서 실시하였고, 단백질 정량은 소 혈청 알부민 (bovine serum albumin)을 표준으로 로우리(Lowry)의 방법에 따라 수행하였다.
상기 분리 및 정제된 효소 단백질 분획 20 ng을 각 레인(lane)에 로딩(loading)한 후 10 mA의 일정한 전류를 걸어 전기영동을 실시하였다. SDS에 의해 불활성화된 효소를 재활성화하기 위하여 겔을 2.5 % 트리톤(Triton) X-100를 포함한 트리스(Tris) 완충용액(50 mM, pH 7.4)에서 30분간 방치하여 SDS를 제거한 후, 다시 증류수로 트리톤 X-100을 제거하였다. 분획된 단백질의 혈전 용해 활성은 활성 반응 완충용액(200 mM NaCl, 10 mM CaCl2, 0.02 % NaN3가 포함된 30 mM 트리스 완충용액, pH 7.4)에 겔을 침적하여 37 ℃ 배양기에서 12시간 반응을 시켰다.피브린 분해능을 지닌 단백질 분획은 활성염색법에 의해 겔 상의 피브린을 분해하여 코마시 블루(Coomassie blue)로 염색시에 투명대를 형성하므로, 상기 단백질 분획이 혈전 용해 활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
또한, 3종의 버섯 모두에서 분자량이 54, 61 kDa의 공통된 활성을 가지는 단백질을 확인하였으며, 장식솔버섯은 84 kDa의 강한 활성을 가지는 혈전용해효소를 가지고 있음을 확인하였다 (도 2).
<실시예 6> 용혈 활성 측정
본 발명의 균주가 생산하는 새로운 효소 단백질이 용혈 활성(hemolytic activity)이 있는지를 확인하는 시험을 실시하였다.
실시예 1로부터 얻은 버섯 추출물을 플레이트에 놓고 여기에 사람의 혈액을 첨가한 후 배양하였다. 24시간 동안 배양한 후 현미경으로 관찰한 결과, 혈액이 분해되지 않고 그대로 유지되는 것을 알 수 있었으며, 이로부터 본 발명의 버섯 추출물은 용혈 활성이 없는 것으로 판단되었다.
본 발명의 혈전용해능을 갖는 버섯 추출물은 주로 정맥 주사를 통해 투여되는 기존의 혈전용해제와 비교해 볼 때, 경구 투여가 가능하므로 혈관 주사제와 병용하여 사용할 수 있는 이점이 있다.
또한, 본 발명의 버섯 추출물은 용혈 활성을 나타내지 않으므로, 경구 투여약제로 개발할 수 있을 뿐만 아니라 혈전 용해 치료제 및 건강 보조 식품 등으로 널리 이용될 수 있다.
Claims (5)
- 구름버섯(Coriolus versicolor), 모래밭버섯(Pisolithus tinctorius)및 장식솔버섯(Tricholomopsis decora)으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상의 버섯으로부터 메탄올 또는 메탄올과 물의 혼합용매로 추출되는 혈전용해능을 갖는 버섯 추출물.
- 제 1항의 버섯 추출물로부터 분리되고, 분자량이 54 kDa, 61 kDa 또는 84 kDa인 혈전용해성 효소 단백질.
- 제 1항의 버섯 추출물 또는 제 3항의 효소 단백질을 유효 성분으로 함유하는 혈전 관련 질환 치료제용 약학적 조성물.
- 제 4항에 있어서, 혈전 관련 질환은 관상동맥 질환, 맥혈전증 또는 뇌혈관질환인 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
- 제 4항에 있어서, 혈전 관련 질환 치료제는 경구 투여하는 것을 특징으로 하는 약학적 조성물.
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