JPH07100033B2 - フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体とその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明はフィブリン親和性ウロキ
ナーゼ複合体、その製法および血栓溶解剤に関する。詳
述すると本発明は、フィブリンに対する親和性が高く、
優れた血栓溶解能を示すフィブリン親和性ウロキナーゼ
複合体、ヒトの尿からのフィブリン親和性ウロキナーゼ
複合体の製法並びにこのフィブリン親和性ウロキナーゼ
複合体を含有する血栓溶解剤に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】ウロキナーゼは尿中で発見されたプラス
ミノーゲン活性化因子の一つで、腎臓で生合成されて尿
中に排泄される。その作用はプラスミノーゲンに特異的
でプラスミノーゲン分子内のアルギニン−バリン（Ａｒ
ｇ−Ｖａｌ）結合を切断してプラスミンとする活性を有
する。周知のようにプラスミンは血中に形成されたフィ
ブリン塊を溶解させる作用を有する。すなわち繊維素溶
解現象を起こすゆえに、ウロキナーゼは血栓溶解剤とし
て脳血管閉塞、心筋梗塞、肺栓塞等の血栓症の治療及び
制癌剤（マイトマイシンＣ（商品名）など）との併用療
法に広く用いられている。またこのウロキナーゼは胃腸
管からの吸収が悪いために静脈注射又は静脈内点滴注射
することにより投与されている。

【０００３】しかしながら、生体内に投与されたウロキ
ナーゼは血中のプラスミノーゲンを活性化してプラスミ
ンを生成する一方、血中に存在する各種の阻害物質によ
り急速に阻害を受ける。特にプラスミンの生成に対して
血中に大量に産生されてくるα_２−プラスミンインヒビ
ター等の抗プラスミンなどは、ウロキナーゼにより活性
化されたプラスミンと複合体を形成することにより間接
的にウロキナーゼを失活させる。またウロキナーゼ自体
の血中半減期も約１５分と比較的短い。

【０００４】このため生体内に投与された際のウロキナ
ーゼの繊維素溶解持続時間は十分なものではない。さら
にウロキナーゼはフィブリンに対する親和性が低いため
にフィブリン塊の近接部位でプラスミノーゲンを活性化
してプラスミンを生成することがなかなか困難であり、
血中のフィブリンを効果的に溶解することができなかっ
た。従って、所望の血栓溶解能を発揮させるためには血
中濃度をある閾値以上に上げる必要があり、今日の大量
投与療法へと進展してきた。しかし、必ずしも十分な臨
床的効果を上げるものではない。

【０００５】また最近、フィブリンに対する親和性の高
い血栓溶解剤として、組織型アクチベータ（ｔ−ＰＡ）
および一本鎖ウロキナーゼの利用も考えられており、こ
れらは上記のウロキナーゼよりも高い臨床的効果を与え
ることが予想されているが、臨床的効果の高い成分の比
活性が比較的低く、また安定性が低いという不都合があ
る。更に精製収率が低く、殊に組織型アクチベータの場
合、ヒトの組織を原料とするために、その製造に要する
コストが極めて高いという問題がある。

【０００６】

【発明が解決しょうとする課題】従って、本発明は生体
内における安定性が高くかつフィブリンに対する親和性
の高いウロキナーゼ複合体、その製法および血栓溶解剤
を提供することを目的とする。本発明はまた、経静脈的
または経口的に投与し得る血栓溶解剤として臨床的効果
が高くしかも安定なフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体およびヒトの尿からこのフィブリン親和性ウロキナー
ゼ複合体の収率の高い製法を提供することを目的とす
る。

【０００７】

【課題を解決するための手段】上記諸目的は、フィブリ
ン親和性ウロキナーゼ複合体により達成される。この複
合体はミカエリス定数Ｋｍが７４μＭ、Ｓ−２４４４使
用合成基質法による最大速度Ｖｍａｘが０．５７×１０
^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃａｔが３．８ｓｅｃ^−１、そ
してＫｃａｔ／Ｋｍが０．０５１μＭ／ｓｅｃ^−１、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が９７５００±３０００
である。

【０００８】上記諸目的は、ヒトの尿を任意の順序でフ
ィブリン親和性クロマトグラフィーおよびリジン親和性
クロマトグラフィーにかけ、フィブリン親和性クロマト
グラフィーにおいて親和吸着され、かつリジン親和クロ
マトグラフィーにおいて吸着されない分画を取り出すこ
とを特徴とするフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体の
製法により達成される。ここに得られるフィブリン親和
性ウロキナーゼ複合体含有分画は物理的分離法により単
離精製される。

【０００９】本発明は、ヒトの尿をフィブリン親和性ク
ロマトグラフィーにかけて得られる吸着分画を、次いで
リジン親和性クロマトグラフィーにかけて非吸着分画を
取り出すものであるフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体の製法を示すものである。本発明はまた、ヒトの尿を
リジン親和性クロマトグラフィーにかけて得られる非吸
着分画を、次いでフィブリン親和性クロマトグラフィー
にかけて得られる吸着分画を取り出すものであるフィブ
リン親和性ウロキナーゼ複合体の製法を示すものであ
る。

【００１０】本発明はさらに、ヒトの尿は予め濾過され
て沈殿物を取り除かれたものであるフィブリン親和性複
合体の製法を示すものである。また、本発明は、フィブ
リン親和性クロマトグラフィーには、フィブリン−セラ
イトカラムまたはフィブリン−アガロースカラムが用い
られるものであるフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体
の製法を示すものである。さらに本発明は、リジン親和
性クロマトグラフィーにはリジン−アガロースカラムが
用いられるものであるフィブリン親和性ウロキナーゼ複
合体の製法を示すものである。

【００１１】さらに本発明は、親和性クロマトグラフィ
ーにより得られる分画は物理的分離法にかけられる前に
濃縮されるものであるフィブリン親和性ウロキナーゼ複
合体の製法を示すものである。また本発明は、物理的分
離法による単離はゲル濾過法または電気泳動法によって
行われるものであるフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体の製法を示すものである。

【００１２】さらに、上記諸目的はフィブリン親和性ウ
ロキナーゼ複合体を含有することを特徴とする血栓溶解
剤により達成される。この複合体はミカエリス定数Ｋｍ
が７４μＭ、Ｓ−２４４４使用合成基質法による最大速
度Ｖｍａｘが０．５７×１０^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃ
ａｔが３．８ｓｅｃ^−１、そしてＫｃａｔ／Ｋｍが０．
０５１μＭ／ｓｅｃ^−１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分
子量が９７５００±３０００である。

【００１３】本発明は、薬学的に許容しうる賦型剤を適
当量含有するものである血栓溶解剤を示すものである。
本発明は更に、静脈内投与形態を有するものである血栓
溶解剤を示すものである。本発明は又、注射剤または点
滴剤の形態を有するものである血栓溶解剤を示すもので
ある。本発明は更に、経口投与形態を有するものである
血栓溶解剤を示すものである。本発明は更に、カプセル
剤、錠剤、丸剤、顆粒剤、細粒剤又は散剤の形態を有す
るものである血栓溶解剤を示すものである。本発明はさ
らにまた、腸溶性のものである血栓溶解剤を示すもので
ある。

【００１４】本発明において用いられる「ウロキナーゼ
複合体」なる用語は、ミカエリス定数Ｋｍが７４μＭ、
Ｓ−２４４４使用合成基質法による最大速度Ｖｍａｘが
０．５７×１０^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃａｔが３．８
ｓｅｃ^−１、そしてＫｃａｔ／Ｋｍが０．０５１μＭ／
ｓｅｃ^−１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が９７５
００±３０００である特性を有する複合体を意味する。
本発明において用いられる「親和吸着」または「吸着」
なる用語は、相互に生化学的特異性のある親和力を有す
る物質の一方よりなる吸着体に他方の物質が該生化学的
親和力をもって吸着した状態を意味する。したがって、
特に物理的吸着、化学的吸着などと「吸着」という言葉
を修飾しない限り、「吸着」という用語は上記の意味で
解されるべきである。

【００１５】以下、本発明を実施態様に基づきより詳細
に説明する。本発明はヒトの新鮮な尿中には一般的なウ
ロキナーゼとは別に、プラスミノーゲンに対して活性化
因子（アクチベータ）として働き、且つフィブリンに対
して親和性を有する高分子量物質が存在するという発見
に基づくものであり、該物質を単離し、その本体を明ら
かにすることに成功して完成されるに至った。後述する
ような方法を用いてヒト尿中より単離した本発明に係る
該高分子量物質に対して、免疫電気泳動を行うと、高分
子ウロキナーゼ（分子量約５３０００〜５５０００）お
よび低分子ウロキナーゼ（分子量約３１０００〜３３０
００）に対する抗血清に対して沈降線を形成する。この
ことからウロキナーゼと共通の抗原性を有することが明
らかである。

【００１６】即ち、本発明のフィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体は、ミカエリス定数Ｋｍが７４μＭ、Ｓ−２
４４４使用合成基質法による最大速度Ｖｍａｘが０．５
７×１０^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃａｔが３．８ｓｅｃ
^−１、そしてＫｃａｔ／Ｋｍが０．０５１μＭ／ｓｅｃ
^−１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が９７５００±
３０００であることを特徴とするものである。

【００１７】本発明のフィブリン親和性ウロキナーゼ複
合体は、通常のウロキナーゼと同様にプラスミノーゲン
アクチベーターとして働き、プラスミノーゲンのＡｒｇ
−Ｖａｌ結合部位を加水分解してプラスミンのＨ鎖（分
子量５５０００）、Ｌ鎖（分子量２６０００）及び分解
断片（分子量８０００）を生じさせる。該フィブリン親
和性ウロキナーゼ複合体のプラスミノーゲンアクチベー
ターとしての比活性は、通常のウロキナーゼ（分子量５
３０００−５５０００の高分子量ウロキナーゼ及び分子
量３１０００−３３０００の低分子量ウロキナーゼ）の
約１／３−１／４程度である。

【００１８】しかしながら、該フィブリン親和性ウロキ
ナーゼ複合体は、通常のウロキナーゼよりもフィブリン
に対する親和性が高く、フィブリンへの親和性が認めら
れる一本鎖ウロキナーゼと同等かそれ以上の親和性を有
し、さらにα_２−プラスミンインヒビター、セリンプロ
テアーゼインヒビターなどのような通常のウロキナーゼ
に対して阻害性を示し、失活させてしまうような物質の
存在下においてもこれらの影響を受けることなく安定で
ある。 従って、生体内に投与された場合に、従来の血
栓溶解剤と比較してその繊維素溶解能は高く、また繊維
素溶解持続時間も長いために、極めて優れた臨床的効果
が期待される。

【００１９】本発明のフィブリン親和性ウロキナーゼ複
合体は、室温あるいは−２０℃の条件下で長時間（約半
年間）放置されると分解を受けて分子量が５００００〜
６００００程度の物質へと変化してしまう。したがっ
て、本発明のフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体の保
存方法としては、−２０℃以下の温度、好ましくは−４
０〜−８０℃で凍結して保存するか、もしくは凍結乾燥
して保存する。凍結乾燥にあっては一般的な条件で行っ
てよく、例えば−４０−−８０℃で凍結し、０．３Ｔｏ
ｒｒ以下の減圧下で氷を昇華させる。

【００２０】本発明のフィブリン親和性ウロキナーゼ複
合体を血栓溶解剤として使用する場合には、該フィブリ
ン親和性ウロキナーゼ複合体を単独又は有効成分の１つ
としてそのまま、あるいは該フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体を適当量含有する希釈物として用いることが
できる。この場合該フィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体の安定化のために市販のウロキナーゼ製剤に加えられ
ているアルブミン、マンニット、ゼラチン、その他公知
の薬学的に許容しうる賦型剤を添加することは何等差し
支えない。投与量は一般に成人１日量約１万−１２万
Ｉ．Ｕ．であり、好ましくは３万−６万Ｉ．Ｕ．であ
る。また、必要により１−３回に分けて投与するのがよ
い。

【００２１】また、この血栓溶解剤の生体への投与経路
としては、静脈内注射、静脈内点滴注射および経口投与
等が用いられる。血栓溶解剤の形態もこれに応じたもの
とされ、例えば、静脈内投与系においては注射剤、点滴
剤などに、また経口投与系においてはカプセル剤、錠
剤、丸薬、顆粒剤、細粒剤または散剤などとして調製さ
れる。

【００２２】本発明のフィブリン親和性ウロキナーゼ複
合体は生体外的にも得られるが、ヒトの尿を原料として
以下の方法により単離することで、優れた性能を有する
フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体を高純度でかつ収
率高く、また比較的簡単に低コストで得ることができ
る。

【００２３】即ち、ヒトの尿をフィブリン親和性クロマ
トグラフィーおよびリジン親和性クロマトグラフィーに
かけ、フィブリン親和性クロマトグラフィーにおいて親
和吸着されかつリジン親和性クロマトグラフィーにおい
て吸着されない分画を取り出し、さらにこの分画中に含
まれるミカエリス定数Ｋｍが７４μＭ、Ｓ−２４４４使
用合成基質法による最大速度Ｖｍａｘが０．５７×１０
^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃａｔが３．８ｓｅｃ^−１，Ｋ
ｃａｔ／Ｋｍが０．０５１μＭ／ｓｅｃ^−１，ＳＤＳ−
ＰＡＧＥ法による分子量が９７５００±３０００の物質
を物理的分離方法により単離する新規な方法を用いるの
である。

【００２４】この方法において、フィブリン親和性クロ
マトグラフィーとリジン親和性クロマトグラフィーを行
う順序は任意である。すなわち、（１）ヒトの尿をフィ
ブリン親和性クロマトグラフィーにかけて得られる吸着
分画を続いてリジン親和性クロマトグラフィーにかけて
得られる非吸着分画を取り出す工程を採用しても、或い
は（２）ヒトの尿をリジン親和性クロマトグラフィーに
かけて得られる非吸着分画を続いてフィブリン親和性ク
ロマトグラフィーにかけて得られる吸着分画を取り出す
工程を採用してもよい。

【００２５】しかしながら収率の点から見ると、後者の
順序によるものが有利である。ここでは、その一実施態
様として前者の順序による場合を例にとり本発明による
フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体の製法をより具体
的に説明する。原料となるヒトの尿としては新鮮なもの
が用いられる。好ましくは、尿を親和性クロマトグラフ
ィーにかける前に濾過して尿中に含まれる沈殿物を除去
することが望ましい。

【００２６】次に、尿はフィブリン親和性クロマトグラ
フィーにかけられる。用いられるカラムとしては、例え
ば、スロンボーシス リサーチ、第２巻、第１３７−１
５４頁、１９７３年、ペルガモン プレス インコーポ
レーレッド［Ｔｈｒｏｍｂｏｓｉｓ Ｒｅｓｅａｃｈ，
Ｖｏｌ．２，ｐｐ．１３７−１５４，１９７３，Ｐｅｒ
ｇａｍｏｎ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．］に記載されたディ
ー．エル．ヘーンとエフ．アール．マチアス［Ｄ．Ｌ．
Ｈｅｅｎｅ ａｎｄ Ｆ．Ｒ．Ｍａｔｔｈｉａｓ］の報
告において調製されるようなフィブリン（モノマー）−
アガロースゲルカラムや、プロスィーディング オブ
ザ ナショナル アカデミィー オブサイエンスィーズ
オブ ザ ユナイテッド ステート オブ アメリ
カ、第７８巻、第７号、第４２６５−４２６９頁、１９
８１年７月、バイオケミストリー［Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，Ｖｏｌ．７８，Ｎｏ．
７，ｐｐ．４２６５−４２６９，Ｊｕｌｙ １９８１，
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ］に記載されたエス．ソーカ
ット．ヒューセインら［Ｓ．Ｓｈａｕｋａｔ Ｈｕｓａ
ｉｎ ｅｔ．ａｌ．］の報告において調整されるような
フィブリン−セライト^Ｒ（Ｃｅｌｉｔｅ^Ｒ （商標）．
ＳｉＯ_２を骨格とするケイソウ土製品）カラムなどが用
いられる。

【００２７】尿が、例えば塩化ナトリウムを含有するリ
ン酸緩衝液で平衡化された上記のようなフィブリン−セ
ファロースカラムに流されると、尿中に含まれるウロキ
ナーゼはフィブリンに対しては親和性を示さないため、
カラムに吸着されないが、フィブリン親和性ウロキナー
ゼ複合体は、フィブリンに対する特異的な親和力によっ
て強く吸着される。カラムに吸着したフィブリン親和性
ウロキナーゼ複合体は、０．５Ｍ塩化ナトリウム溶液で
も溶出されず、０．２Ｍアルギニン溶液や６Ｍ尿素溶液
などで溶出されてくる。

【００２８】従って、吸着カラムを、たとえば０．５Ｍ
塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡを含有する０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を洗浄液に用いて洗浄し、
カラムに付着している未吸着物質や単に物理的に吸着し
ている物質を除去した後、該吸着カラムを例えば１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび０．２Ｍアルギニンを含有する０．０１
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を溶出液に用いて処理
し、吸着物質を溶出する。このようにして得られる吸着
分画には、フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体のほ
か、尿中に存在しているフィブリンに特異的な親和性を
示す他の物質、例えばプラスミン、プラスミノーゲン、
組織型アクチベータ、一本鎖ウロキナーゼなどが含まれ
ている。

【００２９】次に、フィブリン親和性クロマトグラフィ
ーの吸着分画は、さらにリジン親和性クロマトグラフィ
−にかけられる。カラムとしては、ディー．ジー．デッ
チとイー．ティ．マーツスによるサイエンス、第１７０
巻第１０９５頁（１９７０年）［Ｄ．Ｇ．Ｄｅｕｔｓｃ
ｈ ａｎｄ Ｅ．Ｔ．Ｍｅｒｔｚ，Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｖ
ｏｌ１７０ ｐｐ．１０９５（１９７０）］に記載され
ているようなリジン−アガロースゲルカラムなどが用い
られる。

【００３０】前記分画が、例えば塩化ナトリウムを含有
するリン酸緩衝液で平衡化されたリジン−アガロースゲ
ルカラムに流されると、該分画中に含まれていたプラス
ミノーゲン、プラスミン、組織型アクチベータなどはリ
ジンに対して親和性を示すために吸着されるが、フィブ
リン親和性ウロキナーゼ複合体、一本鎖ウロキナーゼな
どは親和性を示さないため吸着されない。

【００３１】なお、ウロキナーゼは、リジンやアルギニ
ンのメチルエステルなどを加水分解するエステラーゼ活
性を持っており、そのためかリジン−アガロースゲルに
親和性を示す。従ってフィブリン親和性クロマトグラフ
ィーにより先にリジン親和性クロマトグラフィーが行わ
れる場合、尿中に存在するウロキナーゼは、リジン親和
性クロマトグラフィーの吸着分画中に含まれることにな
る。

【００３２】リジン親和性クロマトグラフィーにおいて
リジン−アガロースゲルカラムを通過した非吸着分画、
即ち、フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体含有分画が
集められ、次の工程へと運ばれる。尿をリジン親和性ク
ロマトグラフィーにかけ、得られた非吸着分画を続いて
フィブリン親和性クロマトグラフィーにかけ吸着分画を
得た場合にも該吸着分画は同様のフィブリン親和性ウロ
キナーゼ複合体含有分画となっている。得られた分画
は、好ましくはポリエチレングリコール等の除水剤を用
いてあるいは凍結乾燥されて濃縮される。

【００３３】このフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体
含有分画はさらに物理的分離法によって処理され、フィ
ブリン親和性ウロキナーゼ複合体が単離される。用いら
れる物理的分離法としては、該分画中に含まれるフィブ
リン親和性ウロキナーゼが高分子量物質であり、これに
対して一本鎖ウロキナーゼなどの非目的物質が比較的低
分子量物質であるため、この物理的性質の差を利用する
ものが好ましく、例えばゲル濾過法、電気泳動法などが
用いられる。電気泳動法としては分離用ゲル電気泳動
（プレパラティブゲルエレクトロホレーシスシステム）
を用いるか、或いはＳＤＳ−ＰＡＧＥ後、蛋白回収装置
を用い単離物質を回収する方法がとられている。

【００３４】以下、本発明を実施例により更に具体的に
説明するが、本発明はこれらにより制限されるものでは
ない。

【００３５】［実施例１］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体の尿よりの単離（Ｉ） 新鮮なヒト尿４ｌを低温条件下（４℃）で集め、濾紙
（東洋濾紙Ｎｏ．２）を用いて吸引濾過を行った。濾過
された尿を予め０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）
をもって平衡化されたリジン−セファロースカラム（ゲ
ル容量２０ｍｌ）に添加し、リジン−セファロースカラ
ムを通過した分画を集める。次いでこの分画をフィブリ
ンセファロースカラム（ゲル容量４０ｍｌ，０．０１Ｍ
リン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化）に添加し、この
カラムを０．５Ｍ塩化ナトリウム、１ｍＭＥＤＴＡを含
有する０．０１Ｍリン酸緩衝液、（ｐＨ７．６）で十分
洗浄し、その後、１ｍＭＥＤＴＡ、０．２Ｍアルギニン
を含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）を用
いてこのカラムに吸着している蛋白質分を溶出させた。
最後にこの溶出分画をポリエチレングリコールで濃縮
し、得られた濃縮分画（２ｍｌ）をセファデックスＧ−
１００（ファルマシア製）（ゲル容量２．０×９０ｍ
ｌ、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平衡化）
に添加し、０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７，６）でゲ
ル濾過を行った。フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体
は前半部分に主要ピークを示して溶出し（分子量９７５
００±３０００の位置）、後半部分に僅かながら一本鎖
ウロキナーゼが溶出されてきた。得られたフィブリン親
和性ウロキナーゼ複合体は０．５１ｍｇであった。

【００３６】［実施例２］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体の単離（ＩＩ） 新鮮なヒト尿４ｌを低温条件下（４℃）で集め濾紙（東
洋濾紙Ｎｏ．２）を用いて吸引濾過を行った。濾過され
た尿を予め０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で平
衡化されたフィブリン−セファロースカラム（ゲル容量
４０ｍｌ）に添加し、このカラムを０．５Ｍ塩化ナトリ
ウム、１ｍＭＥＤＴＡを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝
液（ｐＨ７．６）で十分洗浄し、その後、１ｍＭＥＤＴ
Ａ、０．２Ｍアルギニンを含有する０．０１Ｍリン酸緩
衝液（ｐＨ７．６）を用いてこのカラムに吸着している
蛋白質分を溶出させた。次にこの溶出分画を予め０．０
１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）をもって平衡化された
リジン−セファロースカラム（ゲル容量２０ｍｌ）に添
加し、リジン−セファロースカラムを通過した分画を集
める。最後にこの非吸着分画をポリエチレングリコール
で濃縮し、得られた濃縮分画（２ｍｌ）をセファデック
スＧ−１００（ゲル容量２．０×９０ｍｌ、０．０１Ｍ
リン酸緩衝液ｐＨ７．６で平衡化）に添加し、０．０１
Ｍリン酸緩衝液ｐＨ７．６でゲル濾過を行った。フィブ
リン親和性ウロキナーゼ複合体は前半部分に主要ピーク
を示して溶出し（分子量９７５００±３０００の位
置）、後半部分に僅かながら１本鎖ウロキナーゼが溶出
された。得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体
は０．３２ｍｇであった。

【００３７】［実施例３］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体の確認 実施例３．１ 免疫電気泳動法 １％アガロース含有０．０５Ｍベロナール緩衝液（ｐＨ
８．６、μ＝０．０６）を用いて、アガロースゲルの厚
さが約１ｍｍとなるようにガラス平板上に、電気泳動用
ゲルを作製した。ゲル上に１０μｌ用のサンプル添加用
スポットを作製しこれにサンプル１０μｌを添加する。
電気泳動用緩衝液として、同じく０．０５Ｍ、ベロナー
ル緩衝液（ｐＨ８．６、μ＝０．０６）を準備し、アガ
ロースゲルの両端が、濾紙を通して泳動用緩衝液に浸る
ようにした。電気泳動は１５０Ｖの定電圧で約２時間行
った。泳動したサンプルの側部に、泳動方向と平行にゲ
ル上に溝を作製し、これに抗血清を満たし、３７℃のイ
ンキュベーター中で一夜放置した。翌日泳動サンプルと
抗体との沈降線形成を目視あるいはイムノビュアー下で
観察した。この結果より、実施例１および実施例２で得
られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体がウロキナ
ーゼと共通の抗原性を有することが確認された。

【００３８】実施例３．２ ザイモグラフィー 実施例１で得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体の０．０１Ｍリン酸緩衝液を、１０％ＳＤＳ（ドデシ
ル硫酸ナトリウム）、５０％グリセリンを含有する０．
５Ｍトリス緩衝液と等量混合し、ＳＤＳ化したのち０．
１％ＳＤＳを含有する０．０２５Ｍトリス−０．１９Ｍ
グリシン緩衝液（ｐＨ８．３）を電気泳動用緩衝液とし
てＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲルスラブ電気泳動法
（１０％ゲル、サイズ１４×１４×０．２ｃｍ）にて８
ｍＡで約１６時間、４℃条件で電気泳動した。電気泳動
後、ゲルを２．５％トリトンＸ−１００（ｔｒｉｔｏｎ
Ｘ−１００）溶液中に１時間浸し、その後水洗してＳ
ＤＳを取り除いた。ゲルの付着水分を濾紙で除き、プラ
スミノーゲン含有フィブリン平板上にのせ、３７℃で約
１５時間インキュベーションした。この結果分子量９７
５００±３０００の位置に溶解窓が認められた。

【００３９】なお、本実験において用いられたプラスミ
ノーゲン含有フィグリン平板は以下に記載の方法により
調製された。 プラスミノーゲン含有フィブリン平板の作製 ４５℃に保温した１０Ｕ／ｍｌトロンビン溶液［（０．
８５％塩化ナトリウムを含有する５ｍＭ リン酸緩衝液
（ｐＨ７．２）］１０ｍｌに、２５ｍｇ／ｍｌ寒天溶液
［（０．８５％塩化ナトリウムを含有する５ｍＭリン緩
衝液（ｐＨ７．２）］２０ｍｌ，５００ＣＵ（カゼイン
ユニット）／ｍｌプラスミノーゲン溶液［（０、８５％
塩化ナトリウムを含有する５ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ
７．２）］１００μｌを加えて混和した。さらに０．４
％フィブリノーゲン［ボビン、タイプ２（第一化学薬品
製）］溶液（０．８５％塩化ナトリウムを含有する５ｍ
Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．２）１０ｍｌを加え，静かに
撹拌均一とし、角型シャーレ（栄研・２２５×７５×１
５ｍｍ）に注ぎ込み，室温にて放冷・固化させた。ここ
で得られたプラスミノーゲン含有フィブリン平板はフィ
ブリン濃度０．１％、プラスミノーゲン濃度１．２５Ｃ
Ｕ／ｍｌである。

【００４０】［実施例４］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体の酵素学的定数測定 実施例１で得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体の酵素学的定数の測定は合成基質Ｓ−２４４４（スウ
ェーデンＫＡＢＩ社製）を用い、１４．２μｇ／ｍｌお
よび８．０μｇ／ｍｌの濃度で０．３８Ｍ塩化ナトリウ
ムを含有する０．０５Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ８．
８）を用いて３７℃において１５分間反応させた。比較
のためウロキナーゼの酵素学的定数を同条件下で測定し
た。その結果を第１表に示す。

【００４１】

【表１】

【００４２】またフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体
は、合成基質Ｓ−２２５１を加水分解せず、プラスミノ
ーゲンを含有しないフィブリン平板を溶解しない。しか
しながらプラスミノーゲン含有フィブリン平板を溶解し
た。

【００４３】［実施例５］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体の保存性 実施例１および２で得たフィブリン親和性ウロキナーゼ
複合体の保存安定性を調べるため種々の温度条件下（室
温、−２０℃、−４０℃、−８０℃）に保ち、分子量の
変化を調べた。なお、分子量は実施例３．２と同様にし
てスラブ電気泳動後、プラスミノーゲン含有フィブリン
平板にのせ、フィブリン分解活性を調べることにより測
定した。この結果室温および−２０℃に保存されたもの
は約半年後に分子量が約５００００に減少した。

【００４４】［実施例６］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体の血中安定性（生体外） 実施例１で得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体およびウロキナーゼを生体外（ｉｎ ｖｉｔｒｏ）で
ヒト血漿にそれぞれ４０ＩＵ／ｍｌとなるように添加
し、３７℃で経時的にサンプリングし、プラスミノーゲ
ン含有フィブリン平板を用いて残存プラスミノーゲンア
クチベータ活性を測定した。その結果を第１図に示す。
この結果ウロキナーゼが１００分後に６７％、８時間後
に４６％の残存活性であったのに対し、フィブリン親和
性ウロキナーゼ複合体の場合は１００分後に８３％、８
時間後に７３％の残存活性を保持していた。なお、ウロ
キナーゼは４０時間後においても３４％の残存活性を示
したがこの活性の大部分はウロキナーゼが血漿中に存在
していたフィブリン親和性物質と形成した複合体による
ものであることがザイモグラフィーの結果から明らかに
なった。

【００４５】［実施例７］ セリン・プロテアーゼ・イ
ンヒビター（ＤＦＰ）に対する感受性 セリン・プロテアーゼ・インヒビターのウロキナーゼお
よびフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体に対する影響
を以下のようにして調べた。

【００４６】１）尿中 ヒト新鮮尿（排泄２４時間以内）２００ｍｌを水（脱イ
オン水）に対して一夜透析後、ポリエチレングリコール
で約１００倍に濃縮し、これをウロキナーゼ親和性セフ
ァロース（１ｍｌ容）に通した。１Ｍ塩化ナトリウムを
含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．６）で非吸
着物質を除去後、０．１７Ｍグリシン−塩酸緩衝液（ｐ
Ｈ２．３）で溶出し、この溶出液を０．５Ｍ炭酸緩衝液
（ｐＨ９．５）で直ちに中和した。この調整液２５μｌ
にＤＦＰを２５ｍＭとなるように添加し、３７℃で１時
間処理した。これを前述の方法でザイモグラフィーを行
った。

【００４７】２）血漿中 ヒト血漿５００μｌにウロキナーゼを９単位添加し、３
７℃で２０分間インキュベートした。０．０１Ｍリン酸
緩衝液（ｐＨ７．６）で５倍容に希釈後、ウロキナーゼ
親和性セファロース（０．１ｍｌ容）に通した。０．５
Ｍ塩化ナトリウムを含有する０．０１Ｍリン酸緩衝液
（ｐＨ７．６）で非吸着物質を除去後、０．１７Ｍグリ
シン−塩酸緩衝液（ｐＨ２．３）で溶出し、この溶出液
を０．５Ｍ炭酸緩衝液（ｐＨ９．５）で直ちに中和し
た。この調整液１００μｌにＤＦＰを１０ｍＭとなるよ
うに添加し、３７℃で２０分間処理した。これを前述の
方法でザイモグラフィーを行った。

【００４８】その結果、尿中および血漿中の遊離ウロキ
ナーゼ（分子量３３０００の低分子ウロキナーゼ：およ
び分子量５５０００の高分子ウロキナーゼ）がセリンプ
ロテアーゼインヒビターにより活性が阻害されるに対
し、フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体はなんら阻害
されないことが明らかとなった。この理由としては、ウ
ロキナーゼ複合体においてはウロキナーゼ分子表面に露
出しているセリン活性基がフィブリン親和性物質と結合
することにより保護されるような分子構造となるためと
考えられる。

【００４９】［実施例８］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体のラットにおける投与後の血中持続性 ウロキナーゼおよび実施例１で得られたフィブリン親和
性ウロキナーゼ複合体を用い、ラットへ静脈注射画の血
中半減期を比較した。ウロキナーゼおよびフィブリン親
和性ウロキナーゼ複合体をそれぞれ１０，０００単位／
０．５ｍｌ（生理食塩水）づつ、体重２００−２５０ｇ
のウィスター系雄性ラットの尾静脈内へ投与した。投与
後、下大静脈よりアプロチニン（５０ＫＩＥ／ｍｌ）を
含む３．８％クエン酸（１／１０量）にて採血し、４℃
下、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離し、血漿を得
た。血漿中のウロキナーゼ活性は合成基質Ｓ−２４４４
にて測定した。その結果を第２図に示した。ウロキナー
ゼは血中半減期が約３分であるに対して、本発明のフィ
ブリン親和性ウロキナーゼ複合体は約１６分であり、血
中での持続性に優れていることが確認された。それぞれ
の値は３匹の平均値で示した。

【００５０】［実施例９］ フィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体のビーグル犬における血中持続性 ウロキナーゼおよび実施例１で得られたフィブリン親和
性ウロキナーゼ複合体を用い、ビーグル犬へ静脈投与後
の血中半減期を比較した。ウロキナーゼおよびフィブリ
ン親和性ウロキナーゼ複合体をそれぞれ６０，０００単
位／５ｍｌ（生理食塩水）づつ、体重約１０ｋｇのビー
グル犬の右後肢静脈内へ投与した。投与後、前腕静脈よ
り実施例８と同様にアプロチニン含有クエン酸にて採血
し、血漿中のウロキナーゼ活性を合成基質Ｓ−２４４４
にて測定した。 その結果を第３図に示した。ウロキナ
ーゼは血中半減期が約１３分であるに対し、本発明のフ
ィブリン親和性ウロキナーゼ複合体は約４５分であり、
血中での持続性に優れていることが確認された。それぞ
れの値は３頭の平均値で示した。

【００５１】［実施例１０］ フィブリン親和性ウロキ
ナーゼ複合体の急性毒性 ウィスター系雄性ラット（７週令）を用いて、静脈内投
与による急性毒性試験を行った。本発明に係わるフィブ
リン親和性ウロキナーゼ複合体を１×１０^６Ｉ．Ｕ．／
ｋｇ、７日間投与したが死亡例は認められないため、Ｌ
Ｄ_５０値は１×１０^６Ｉ．Ｕ．／ｋｇ以上であり、高い
安全性が確認された。

【００５２】［実施例１１］ 注射剤の製造（Ｉ） 実施例１で得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体２４，０００単位に精製ゼラチン１０ｍｇ、マンニト
ール１００ｍｇを加え、メンブランフィルターを用いて
無菌的に濾過した。濾液を滅菌済みのバイアル瓶に分注
し、−６０℃で１時間予備凍結し、２５℃、０．１Ｔｏ
ｒｒで２４時間凍結乾燥し、凍結乾燥注射剤を製造し
た。

【００５３】［実施例１２］ 注射剤の製造（ＩＩ） 実施例１で得られたフィブリン親相性ウロキナーゼ複合
体６０，０００単位にヒト血清アルブミン２０ｍｇ，マ
ンニトール２００ｍｇを加え、実施例１１と同様に操作
し凍結乾燥注射剤を製造した。

【００５４】［実施例１３］ カプセル製剤の製造 実施例１で得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体を凍結乾燥し、その３０，０００単位にコーンスター
チ１００ｍｇ、乳糖１２０ｍｇ、軽質無水ケイ酸１ｍｇ
を加えて混合した後２号ゼラチン硬カプセルに充填し
た。このカプセルにヒドロキシプロピルメチルセルロー
スフタレートの腸溶性被膜を施して腸溶性カプセル製剤
を製造した。

【００５５】［実施例１４］ 錠剤の製造 実施例１で得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体を凍結乾燥し、その６０，０００単位に乳糖１００ｍ
ｇ、コーンスターチ３０ｍｇ、タルク８０ｍｇ、ステア
リン酸マグネシウム２ｍｇを加えて混合した後打錠し
た。この錠剤に実施例１３と同様に腸溶性被膜を施して
腸溶剤を製造した。

【００５６】［実施例１５］ フィブリン親和性ウロキ
ナーゼ複合体のビーグル犬における薬効持続性 市販注射用ウロキナーゼ製剤および実施例１３で得たフ
ィブリン親和性ウロキナーゼ複合体腸溶性カプセル製剤
を用いてビーグル犬へ経腸投与あるいは静脈注射後の薬
効持続性を比較した。市販注射用ウロキナーゼ製剤およ
びフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体腸溶性カプセル
製剤をそれぞれ６０，０００単位づつ、体重約１０ｋｇ
のビーグル犬の十二指腸内へ投与した。別に市販注射用
ウロキナーゼ製剤は静脈内への投与も行った。 投与
後、前腕静脈より３．８％クエン酸（１／１０量）にて
採血し、４℃下、３０００ｒｐｍにて１０分間遠心分離
し血漿を得た。血漿中のα_２−プラスミンインヒビター
量（α_２−ＰＩ量）を合成基質Ｓ−２２５１を用いて測
定した。その結果を第４図に示した。市販注射用ウロキ
ナーゼ製剤を十二指腸へ投与した場合には、ほとんど吸
収されず、α_２ＰＩ量は低下しなかった。また、静脈内
投与した場合には急速な低下が認められたが、速やかに
回復してしまい持続性に欠けた。一方、フィブリン親和
性ウロキナーゼ複合体腸溶性カプセル製剤を投与した場
合には、１時間後に最大６０％まで低下し、８時間以上
持続した。

【００５７】［実施例１６］ フィブリン親和性ウロキ
ナーゼ複合体抗血清製造法 実施例１で得られたフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体をフロイントの完全アジュバンドと等量づつ混和し、
家兎に１−２ｍｌ注射して免疫を行う。４週間後に同様
の操作を行って追加免疫を獲得させる。その後、２−３
週間後に、採血してフィブリン親和性ウロキナーゼ複合
体に対する抗血清を得た。この家兎抗血清を用いること
で、尿中のフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体の抗原
量および血中のフィブリン親和性複合体の抗原量をロー
レル法または１次免疫拡散法で測定することができる。

【００５８】

【発明の総括】本発明によるフィブリン親和性ウロキナ
ーゼ複合体はその分子量が９７５００±３０００である
ことを特徴とするものであり、フィブリンに対する親和
性が高く、また血中における安定性が良好であるため、
プラスミノーゲンに対するアクチベータとして高い効率
を有し、優れた繊維素溶解能を発現するためにその臨床
的効果は極めて高い。

【００５９】また本発明のフィブリン親和性ウロキナー
ゼ複合体の製法は、ヒトの尿をフィブリン親和性クロマ
トグラフィーおよびリジン親和性クロマトグラフィーに
かけて、フィブリン親和性クロマトグラフィーにおいて
親和吸着されかつリジン親和性クロマトグラフィーにお
いて吸着されない分画を取り出し、さらにこの分画中に
含まれるミカエリス定数Ｋｍが７４μＭ、Ｓ−２４４４
使用合成基質法による最大速度Ｖｍａｘが０．５７×１
０^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃａｔが３．８ｓｅｃ^−１、
Ｋｃａｔ／Ｋｍが０．０５１μＭ／ｓｅｃ^−１、ＳＤＳ
−ＰＡＧＥ法による分子量が９７５００±３０００であ
る物質を物理的分離法により単離することを特徴とする
ものであるから、フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体
を高純度かつ高収率で経済的にしかも大量に精製するこ
とができ、血栓症の治療に対して大きな貢献をすること
ができる。

【００６０】またヒトの尿が予め濾過されて沈殿物を取
り除かれているものであり、フィブリン親和性クロマト
グラフィーには、フィブリンセライトカラムまたはフィ
ブリンアガロースカラムが用いられ、リジン親和性クロ
マトグラフィーにはリジンアガロースカラムが用いら
れ、親和性クロマトグラフィーにより得られる分画は物
理的分離法にかけられる前に濃縮され、さらに物理的分
離法はゲル濾過法または電気泳動法である場合にはより
高純度および高収率で経済的にしかも大量に精製するこ
とができる。

【００６１】さらに本発明の血栓溶解剤はミカエリス定
数Ｋｍが７４μＭ、Ｓ−２４４４使用合成基質法による
最大速度Ｖｍａｘが０．５７×１０^−９ｍｏｌ／ｍｉ
ｎ、Ｋｃａｔが３．８ｓｅｃ^−１、Ｋｃａｔ／Ｋｍが
０．０５１μＭ／ｓｅｃ^−１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法によ
る分子量が９７５００±３０００であるフィブリン親和
性ウロキナーゼ複合体を含有することを特徴とするもの
であり、上記したように優れた繊維素溶解能を有するフ
ィブリン親和性ウロキナーゼ複合体を有効成分として含
有するために脳血栓閉塞、心筋梗塞、肺栓塞等の血栓症
の治療に好適に用いられることができ、またその投与経
路も静脈内、経口等を用いることができる。またフィブ
リン親和性ウロキナーゼ複合体に対する抗血清を用いて
尿中のフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体抗原量が測
定可能になるに伴い様々な病態と疾患との関連が解明で
き、さらにウロキナーゼ治療中や組織型プラスミノーゲ
ンアクチベータ治療中にフィブリン親和性ウロキナーゼ
複合体の血中濃度を監視することにより、一層効果的な
治療が実現可能となることも期待できる。

【００６２】

【発明の効果】本発明の複合体は良好な安定性とフィブ
リン親和性を有し、フィブリン溶解能においても優れて
おり、また、簡便な方法によって製造することができ
る。

【図面の簡単な説明】

【図１】フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体とウロキ
ナーゼのヒト血漿中における残存プラスミノーゲンアク
チベータ活性の経時変化を示すグラフである。

【図２】フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体とウロキ
ナーゼをラットに投与した場合の血中持続性を示すグラ
フである。

【図３】フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体とウロキ
ナーゼをビーグル犬に投与した場合の血中持続性を示す
グラフである。

【図４】フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体腸溶性カ
プセル製剤と市販注射用ウロキナーゼ製剤をビーグル犬
に投与した場合の薬効持続性を示すグラフである。

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ミカエリス定数Ｋｍが７４μＭ、Ｓ−２
   ４４４使用合成基質法による最大速度Ｖｍａｘが０．５
   ７×１０^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃａｔが３．８ｓｅｃ
   ^−１、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が９７５００±
   ３０００であるフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体。
2. 【請求項２】 ヒトの尿をフィブリン親和性クロマトグ
   ラフィーおよびリジン親和性クロマトグラフィーにか
   け、フィブリン親和性クロマトグラフィーにおいて親和
   吸着され、かつリジン親和性クロマトグラフィーにおい
   て吸着されない分画を取り出し、更にこの分画中に含ま
   れる、ミカエリス定数Ｋｍが７４μＭ、Ｓ−２４４４使
   用合成基質法による最大速度Ｖｍａｘが０．５７×１０
   ^−９ｍｏｌ／ｍｉｎ、Ｋｃａｔが３．８ｓｅｃ^−１、Ｓ
   ＤＳ−ＰＡＧＥ法による分子量が９７５００±３０００
   である複合体からなる物質を単離することを特徴とする
   フィブリン親和性ウロキナーゼ複合体の製造方法。
3. 【請求項３】 ヒトの尿をフィブリン親和性クロマトグ
   ラフィーにかけ、得られる吸着分画を続いてリジン親和
   性クロマトグラフィーにかけて、得られる非吸着分画を
   取り出すものである請求項２に記載のフィブリン親和性
   ウロキナーゼ複合体の製造方法。
4. 【請求項４】 ヒトの尿をリジン親和性クロマトグラフ
   ィーにかけ、得られる非吸着分画を続いてフィブリン親
   和性クロマトグラフィーにかけて、得られる吸着分画を
   取り出すものである請求項２に記載のフィブリン親和性
   ウロキナーゼ複合体の製造方法。
5. 【請求項５】 ヒトの尿は、予め濾過されて沈殿物をと
   り除かれているものである請求項２に記載のフィブリン
   親和性ウロキナーゼ複合体の製造方法。
6. 【請求項６】 フィブリン親和性クロマトグラフィーに
   は、フィブリン−セライトカラム又はフィブリン−アガ
   ロースカラムが用いられるものである請求項２−４のい
   ずれかに記載のフィブリン親和性ウロキナーゼ複合体の
   製造方法。
7. 【請求項７】 リジン親和性クロマトグラフィーには、
   リジン−アガロースカラムが用いられるものである請求
   項２−４のいずれかに記載のフィブリン親和性ウロキナ
   ーゼ複合体の製造方法。
8. 【請求項８】 親和性クロマトグラフィーにより得られ
   る分画は、物理的分離法にかけられる前に濃縮されるも
   のである請求項２に記載のフィブリン親和性ウロキナー
   ゼ複合体の製造方法。
9. 【請求項９】 物理的分離法は、ゲル濾過法又は電気泳
   動法である請求項２に記載のフィブリン親和性ウロキナ
   ーゼ複合体の製造方法。