JPS60152421A - ヒト胎盤性プラスミノ−ゲン活性化因子、及びそれとヒトプラスミノ−ゲン活性化阻害因子との結合物、及びそれらの製法 - Google Patents
ヒト胎盤性プラスミノ−ゲン活性化因子、及びそれとヒトプラスミノ−ゲン活性化阻害因子との結合物、及びそれらの製法Info
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- JPS60152421A JPS60152421A JP59008515A JP851584A JPS60152421A JP S60152421 A JPS60152421 A JP S60152421A JP 59008515 A JP59008515 A JP 59008515A JP 851584 A JP851584 A JP 851584A JP S60152421 A JPS60152421 A JP S60152421A
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は、ヒトの胎盤から得られるプラスミノーゲン活
性化因子、及びこれとヒトプラスミノーゲン活性化阻害
因子との結合物並びにそれらの製法に係る。
性化因子、及びこれとヒトプラスミノーゲン活性化阻害
因子との結合物並びにそれらの製法に係る。
血栓症の治療剤として、一般につ０キナーゼ、ストレプ
トキナーゼが使用されているが、これらは比較的高価で
あるのみならず大量投与を必要とするためにフィブリノ
ーゲン溶解による出血傾向の発現、及びアナフィラキシ
−ショック等の副作用の発現を伴ない易く、従ってこれ
らに代るべき安全性が高くかつ廉価な薬剤の開発が望ま
れて来た。
トキナーゼが使用されているが、これらは比較的高価で
あるのみならず大量投与を必要とするためにフィブリノ
ーゲン溶解による出血傾向の発現、及びアナフィラキシ
−ショック等の副作用の発現を伴ない易く、従ってこれ
らに代るべき安全性が高くかつ廉価な薬剤の開発が望ま
れて来た。
このような実情に鑑み、本発明者等は抗原性がなく、か
つ比較的少量の投与で有効な薬剤について鋭意研究の結
果、プラスミノーゲン活性化作用を有する因子が、プラ
スミノーゲン活性化阻害因子と結合して、ヒトの胎盤中
に存在していることを見出し、ここに本発明の端緒を開
くに至った。
つ比較的少量の投与で有効な薬剤について鋭意研究の結
果、プラスミノーゲン活性化作用を有する因子が、プラ
スミノーゲン活性化阻害因子と結合して、ヒトの胎盤中
に存在していることを見出し、ここに本発明の端緒を開
くに至った。
ヒト胎盤構成物質中にヒトプラスミノーゲン活性化阻害
因子（以下、ｆｌｆｌ害因子と略す）の存在することは
従来から知られていたが、ヒト胎盤中にはこの阻害因子
の他にヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子（以下、
活性化因子と略す）が存在していて、これら両者が結合
状態にあることについては証明されるには至っていなか
った。然るに、本発明者等の研究により、これら内因子
が結合状態にあって前記結合物を構成していること、並
びに内因子の結合はつ０キナーゼを加えた反応によって
解離して、活性化因子を採取し得ることが見出され、本
発明が完成されるに至った。
因子（以下、ｆｌｆｌ害因子と略す）の存在することは
従来から知られていたが、ヒト胎盤中にはこの阻害因子
の他にヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子（以下、
活性化因子と略す）が存在していて、これら両者が結合
状態にあることについては証明されるには至っていなか
った。然るに、本発明者等の研究により、これら内因子
が結合状態にあって前記結合物を構成していること、並
びに内因子の結合はつ０キナーゼを加えた反応によって
解離して、活性化因子を採取し得ることが見出され、本
発明が完成されるに至った。
従って、本発明の基礎的目的は、ヒトの胎盤から抽出さ
れた、活性化因子とｒ！ｆｌ古因子とが結合した結合物
（以下、結合物と略す）及びその製法を提供することで
ある。
れた、活性化因子とｒ！ｆｌ古因子とが結合した結合物
（以下、結合物と略す）及びその製法を提供することで
ある。
本発明の第２の、但し最も重要な目的は、上記の結合物
から得られる活性化因子及びその製法を提供することで
ある。
から得られる活性化因子及びその製法を提供することで
ある。
胎盤からの結合物の抽出並びに結合物からの活性化因子
の抽出は、蛋白質化学に関して通例行われている各種の
分離方法を含む任意の方法を利用して行なうことが原則
として可能である。例えば、塩、有機溶媒またはポリエ
チレングリコール等を用いる電気泳動法、架橋結合した
デキストラン、架橋結合したまたは架橋結合していない
アガ０−ス、架橋結合したポリアクリルアミド、架橋結
合したポリビニール、またはこれらの混合物を用いるゲ
ル濾過、並びに仕切りまたは吸着／脱着を利用するクロ
ア１−グラフィー操作等を用いることができる。仕切り
クロマトグラフィー操作は、例えばイオン交換、恐水相
互作用、配位子交換又は生物特異的親和性を利用して行
なうこともできる。
の抽出は、蛋白質化学に関して通例行われている各種の
分離方法を含む任意の方法を利用して行なうことが原則
として可能である。例えば、塩、有機溶媒またはポリエ
チレングリコール等を用いる電気泳動法、架橋結合した
デキストラン、架橋結合したまたは架橋結合していない
アガ０−ス、架橋結合したポリアクリルアミド、架橋結
合したポリビニール、またはこれらの混合物を用いるゲ
ル濾過、並びに仕切りまたは吸着／脱着を利用するクロ
ア１−グラフィー操作等を用いることができる。仕切り
クロマトグラフィー操作は、例えばイオン交換、恐水相
互作用、配位子交換又は生物特異的親和性を利用して行
なうこともできる。
吸着／脱着クラマドグラフィー操作は、バッチ式または
カラム式で行なうことができる。これらのクロマトグラ
フィー操作は、グル沖過におけると同様の溶媒を静相と
して用いてもよいが、粒子の内表面または外表面に適当
な基をつけて行なうこともできる。無機塩または有機塩
、有機溶媒、界面活性剤及び／または分離系の１つ以上
に干渉する物質のような添加剤を含有する水性緩衝液を
可動相として用いることもできる。
カラム式で行なうことができる。これらのクロマトグラ
フィー操作は、グル沖過におけると同様の溶媒を静相と
して用いてもよいが、粒子の内表面または外表面に適当
な基をつけて行なうこともできる。無機塩または有機塩
、有機溶媒、界面活性剤及び／または分離系の１つ以上
に干渉する物質のような添加剤を含有する水性緩衝液を
可動相として用いることもできる。
本発明における好ましい実施態様は、ムコ多糖体等の除
去に０Ｍセファデックスが用いられ、活性化因子と阻害
因子とが結合した結合物と阻害因子との分離精製にリジ
ン・セファロース４Ｂ親和クロマトグラフイー操作が行
なわれることである。
去に０Ｍセファデックスが用いられ、活性化因子と阻害
因子とが結合した結合物と阻害因子との分離精製にリジ
ン・セファロース４Ｂ親和クロマトグラフイー操作が行
なわれることである。
そして、本発明における最も重要な好ましい実施態様は
、上記により得た結合物とウロキナーゼ乃至結合型とを
適切時間、適切温度で反応することにより、結合物中の
ｒＩｉ書因子がウロキノ゛−ヒと結合し、この結合反応
が引き金どなって活性化因子を遊離することを利用する
ことである。上記方法で遊離した活性化因子のｔｉ製は
、通常の蛋白質精製法で行なってよいが、好ましくは非
イオン性界面活性剤含有緩衝液で平面化したセファデッ
クスＧ−１５０乃至Ｇ−１００によるグル濾過を用いる
こ、とである。この精製方法により、ウロキナーゼの流
下位置と離れて、ゲルへの吸着／脱着性両分に活性化因
子を得ることができた。上記に記載したところの、本発
明における最も重要な反応操作は、ｒｌｉｌ図書が、活
性化因子よりウロキナーゼに対して強い親和性を有して
いることを利用して、該阻害因子と該活性化因子との結
合を解離させる反応操作である。この反応は、用いる系
に適した３０分から７時間の反応時間数で、４℃から３
７℃の適切温度で行なってよいが、好ましい反応例とし
て、１／８個胎盤由来の結合物と２０万国際単位（以下
、ＩＵと略す）のウロキナーゼを４℃、３時間反応させ
たものから活性化因子が良い収率で得られた。
、上記により得た結合物とウロキナーゼ乃至結合型とを
適切時間、適切温度で反応することにより、結合物中の
ｒＩｉ書因子がウロキノ゛−ヒと結合し、この結合反応
が引き金どなって活性化因子を遊離することを利用する
ことである。上記方法で遊離した活性化因子のｔｉ製は
、通常の蛋白質精製法で行なってよいが、好ましくは非
イオン性界面活性剤含有緩衝液で平面化したセファデッ
クスＧ−１５０乃至Ｇ−１００によるグル濾過を用いる
こ、とである。この精製方法により、ウロキナーゼの流
下位置と離れて、ゲルへの吸着／脱着性両分に活性化因
子を得ることができた。上記に記載したところの、本発
明における最も重要な反応操作は、ｒｌｉｌ図書が、活
性化因子よりウロキナーゼに対して強い親和性を有して
いることを利用して、該阻害因子と該活性化因子との結
合を解離させる反応操作である。この反応は、用いる系
に適した３０分から７時間の反応時間数で、４℃から３
７℃の適切温度で行なってよいが、好ましい反応例とし
て、１／８個胎盤由来の結合物と２０万国際単位（以下
、ＩＵと略す）のウロキナーゼを４℃、３時間反応させ
たものから活性化因子が良い収率で得られた。
なお、ウロキナーゼは、遊離のウロキナーゼのみならず
、ウロキナーゼ・セファ０−ス等の固定型ウロキナーゼ
を用いてもよい。その際は、好ましくは固定型ウロキナ
ーゼを、シリコン被膜付着流のガラスカラムにつめ、そ
こに結合物の水溶液を流す形をとる。このカラムを流ず
際に、適切温度で適切時間、好ましくは４℃、３時間前
後の反応時間の間は、結合物本溶液がカラムの樹脂部分
に入った後、カラム内の流れを停止し反応させることが
必要である。この後、流れを再開し、分画してプラスミ
ノーゲン活性化作用のある両分を集め、固定型ウロキナ
ーゼのカラムがら微量だけ流化している可能性のある３
９２１１１Ｌ、たウロキナーゼと活性化因子とをセファ
デックス・ゲル１１１ｙｆＵにて分画してもよい。
、ウロキナーゼ・セファ０−ス等の固定型ウロキナーゼ
を用いてもよい。その際は、好ましくは固定型ウロキナ
ーゼを、シリコン被膜付着流のガラスカラムにつめ、そ
こに結合物の水溶液を流す形をとる。このカラムを流ず
際に、適切温度で適切時間、好ましくは４℃、３時間前
後の反応時間の間は、結合物本溶液がカラムの樹脂部分
に入った後、カラム内の流れを停止し反応させることが
必要である。この後、流れを再開し、分画してプラスミ
ノーゲン活性化作用のある両分を集め、固定型ウロキナ
ーゼのカラムがら微量だけ流化している可能性のある３
９２１１１Ｌ、たウロキナーゼと活性化因子とをセファ
デックス・ゲル１１１ｙｆＵにて分画してもよい。
これらの精製法を実施する際に、活性化因子はカラムの
ガラス面やゲルに付着する傾向が強く、従って収率の向
上と製品の安定性を高めるために、緩衝液に非イオン性
界面活性剤を添加しておくのが有利である。
ガラス面やゲルに付着する傾向が強く、従って収率の向
上と製品の安定性を高めるために、緩衝液に非イオン性
界面活性剤を添加しておくのが有利である。
こうして得た結合物及び活性化因子をＳＤＳポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動法によって非還元形態において分
子量を調べると、結合物の分子量は、その椙成因子の分
子量の組み合わせにより多岐に渡っていたが、活性化因
子の分子量は約４６゜０００に主バンドを有し、かつ約
２７．０００に副バンドを有していた。活性化因子は、
プラスミノーゲン活性化作用及びプラスミノーゲン含有
フィブリン平板溶解活性に関してウロキナーゼと比較す
る場合に、比活性で３倍以上の活性を有し−Ｃいるが、
つＯキナーゼ基質氷解活性に関してはその比活性がウロ
キナーゼの約１／３であり、しかも、プラスミノーゲン
を含まぬフィブリン平板を溶解することは無かった。尚
、この活性化因子は抗つ０キナーゼ血清と沈降線を示さ
なかった。
ルアミドゲル電気泳動法によって非還元形態において分
子量を調べると、結合物の分子量は、その椙成因子の分
子量の組み合わせにより多岐に渡っていたが、活性化因
子の分子量は約４６゜０００に主バンドを有し、かつ約
２７．０００に副バンドを有していた。活性化因子は、
プラスミノーゲン活性化作用及びプラスミノーゲン含有
フィブリン平板溶解活性に関してウロキナーゼと比較す
る場合に、比活性で３倍以上の活性を有し−Ｃいるが、
つＯキナーゼ基質氷解活性に関してはその比活性がウロ
キナーゼの約１／３であり、しかも、プラスミノーゲン
を含まぬフィブリン平板を溶解することは無かった。尚
、この活性化因子は抗つ０キナーゼ血清と沈降線を示さ
なかった。
これら諸性質に鑑みて、本発明による活性化因子は、従
来、血管内皮細胞から分泌されることが報告されている
血管性プラスミノーゲン活性化因子に近い、高いフィブ
リン溶解性を有しながら、熱に対する安定性がある点や
、試験管内試験での活性半′ｌ！ｃｉＩＩ］が長い点で
、新規な組織性プラスミノ ”−ゲン活性化因子と謂う
ことができる。
来、血管内皮細胞から分泌されることが報告されている
血管性プラスミノーゲン活性化因子に近い、高いフィブ
リン溶解性を有しながら、熱に対する安定性がある点や
、試験管内試験での活性半′ｌ！ｃｉＩＩ］が長い点で
、新規な組織性プラスミノ ”−ゲン活性化因子と謂う
ことができる。
免疫学的な面では、活性化因子とウロキナーゼとは交叉
免疫性が無い。また、活性化因子はウロキナーゼよりも
高いプラスミノーゲン親和性を有することを特徴とする
ものである。よって、活性化因子は固定型プラスミノー
ゲン和性ラムによってもＩｆ製することが可能である。
免疫性が無い。また、活性化因子はウロキナーゼよりも
高いプラスミノーゲン親和性を有することを特徴とする
ものである。よって、活性化因子は固定型プラスミノー
ゲン和性ラムによってもＩｆ製することが可能である。
フィブリン塊及び血栓溶解作用に関する試験管内試験に
よれば、本発明による活性化因子は、ウロキナーゼより
も高いフィブリン溶解性及び血栓溶解性を示し、更にフ
ィブリノーゲン溶解性に関する副作用はウロキナーゼよ
りも低かった。このことは本発明による活性化因子を血
栓症治療剤として用いる場合に、従来のつ０キナーゼよ
りも一層適切であることを示すものである。
よれば、本発明による活性化因子は、ウロキナーゼより
も高いフィブリン溶解性及び血栓溶解性を示し、更にフ
ィブリノーゲン溶解性に関する副作用はウロキナーゼよ
りも低かった。このことは本発明による活性化因子を血
栓症治療剤として用いる場合に、従来のつ０キナーゼよ
りも一層適切であることを示すものである。
本発明による結合物乃至活性化因子は、ヒト胎盤由来の
絨毛細胞または絨毛癌細胞の細胞培養外液に分泌されて
来る。よって、該細胞培養外液または該培ｆ＆１８胞自
体を材料として用いて、本発明にして記載したところの
抽出・精製法にて結合物乃至活性化因子を精製すること
も可能である。
絨毛細胞または絨毛癌細胞の細胞培養外液に分泌されて
来る。よって、該細胞培養外液または該培ｆ＆１８胞自
体を材料として用いて、本発明にして記載したところの
抽出・精製法にて結合物乃至活性化因子を精製すること
も可能である。
本発明による活性化因子は、通常の方法で例えば塩化ナ
トリウム、グルコース、マンニトール、アルブミン等の
添加物を用いて製剤化することができる。剤型としては
静脈又は動脈内注射乃至注入を含む非経口投与型のもの
が一般に適切である。
トリウム、グルコース、マンニトール、アルブミン等の
添加物を用いて製剤化することができる。剤型としては
静脈又は動脈内注射乃至注入を含む非経口投与型のもの
が一般に適切である。
投与量は息部の位置、血栓の程度、症状等に応じて適宜
に設定することができる。
に設定することができる。
本発明を、更に詳柵に下記の実施例によって説明する。
（実施例１）
ヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子とヒトプラスミ
ノーゲン活性化阻害因子との結合物の製造。
ノーゲン活性化阻害因子との結合物の製造。
出産後に剥離排出されたヒ１−の胎盤を直ちに生理食塩
水にて洗浄して凍結保存した。このようにして１すた凍
結胎盤３個（約１５０００＞を裁断し、解剖用鉄にて細
片化した後に、ポリトロン細胞破砕供を用い生理食塩水
３悲中で破砕処理し、次いで４℃で３０分間放置した。
水にて洗浄して凍結保存した。このようにして１すた凍
結胎盤３個（約１５０００＞を裁断し、解剖用鉄にて細
片化した後に、ポリトロン細胞破砕供を用い生理食塩水
３悲中で破砕処理し、次いで４℃で３０分間放置した。
この破砕処理物を遠心分離機に装填し、８００Ｘ（＋で
２０分間処理して大型固形物を除去し、得られる上澄液
に蒸留水を添加して希釈上澄液１７．５Ｑ、を１ｑた。
２０分間処理して大型固形物を除去し、得られる上澄液
に蒸留水を添加して希釈上澄液１７．５Ｑ、を１ｑた。
この希釈上澄液にＩ Ｎ−ＨＣｌを添加してＰＨ３，７
とし、１５分間放置した後にｌＮ−Ｎａ０１−１を添加
してＰＨを７．０に戻した。この間に暗褐色沈澱物が析
出するので、８００Ｘ！７で２０分間遠心処理して該沈
澱物を除去した。この上澄液１７琶に、ＰＨ７を保ちつ
つ、６．４６ｋｏ（５９％飽和〉のＶＡ酸アンモニウム
を添加した。塩析される蛋白質を、ブッフナーロートに
て濾過し、濾紙（東洋Ｎｏ、５Ｂ）上に沈澱物として受
けた。この沈澱物を蒸留水２０ＯｍＱ中に溶解させ、該
溶液を内液とし且つ１００倍容の蒸留水を外液として、
４詩間毎に外液を交換しつつ一夜透析処理した。この透
析処理を完了した内液を４５００Ｘ（＋で４０分間遠心
処理して沈澱を除去した後に、Ｏ，ＯＩＭ’ｆＲＷ １
１１ｊ液（Ｐ Ｈ６、６＞ テ平衡化すセタ’１ｊｌｒ
Ｔｘｆ１３２（ｌの０Ｍセフ１デツクスを投入し、３０
分間攪拌してムコ多糖体等を吸着させ、次いで、１０゜
０００ ｒｐｍで３０分間遠心処理して０Ｍセファデッ
クスを除去した。得たる上澄液を凍結乾燥して乾燥粉末
１７６０ｍ９ （胎盤３個由来）を１９だ。
とし、１５分間放置した後にｌＮ−Ｎａ０１−１を添加
してＰＨを７．０に戻した。この間に暗褐色沈澱物が析
出するので、８００Ｘ！７で２０分間遠心処理して該沈
澱物を除去した。この上澄液１７琶に、ＰＨ７を保ちつ
つ、６．４６ｋｏ（５９％飽和〉のＶＡ酸アンモニウム
を添加した。塩析される蛋白質を、ブッフナーロートに
て濾過し、濾紙（東洋Ｎｏ、５Ｂ）上に沈澱物として受
けた。この沈澱物を蒸留水２０ＯｍＱ中に溶解させ、該
溶液を内液とし且つ１００倍容の蒸留水を外液として、
４詩間毎に外液を交換しつつ一夜透析処理した。この透
析処理を完了した内液を４５００Ｘ（＋で４０分間遠心
処理して沈澱を除去した後に、Ｏ，ＯＩＭ’ｆＲＷ １
１１ｊ液（Ｐ Ｈ６、６＞ テ平衡化すセタ’１ｊｌｒ
Ｔｘｆ１３２（ｌの０Ｍセフ１デツクスを投入し、３０
分間攪拌してムコ多糖体等を吸着させ、次いで、１０゜
０００ ｒｐｍで３０分間遠心処理して０Ｍセファデッ
クスを除去した。得たる上澄液を凍結乾燥して乾燥粉末
１７６０ｍ９ （胎盤３個由来）を１９だ。
１＋＋＋Ｍ−ＥＤＴ−Ａを含有する０、０５Ｍ−ｔ−リ
ス塩酸緩衝液（ＰＨ７，５＞にて平衡化させたリジンセ
ファロース４Ｂカラム（２，Ｏｘ４０ｃｍ）に、上記乾
燥粉末２００＋１１（］ （約１７３個胎盤相当量）を
装填し、該カラムに上記緩衝液を流入させて流出液をフ
ラクション・コレクターで分画採取した。これら各両分
におけるウロキナーゼ活性阻害作用または活性増強作用
を、Ｑｌｔ−Ｇｈｌ−Ａ「リーＭＣＡ水解活性測定法で
観た１００ＩＵのウロキナーゼの活性における減少また
は増加に基き測定した。
ス塩酸緩衝液（ＰＨ７，５＞にて平衡化させたリジンセ
ファロース４Ｂカラム（２，Ｏｘ４０ｃｍ）に、上記乾
燥粉末２００＋１１（］ （約１７３個胎盤相当量）を
装填し、該カラムに上記緩衝液を流入させて流出液をフ
ラクション・コレクターで分画採取した。これら各両分
におけるウロキナーゼ活性阻害作用または活性増強作用
を、Ｑｌｔ−Ｇｈｌ−Ａ「リーＭＣＡ水解活性測定法で
観た１００ＩＵのウロキナーゼの活性における減少また
は増加に基き測定した。
この測定によれば、リジンセファロース４−ＢｊＪラム
からの非吸着画分の蛋白の２３Ｑｎｍにおける吸収の山
の後尾の部分から、ウロキナーゼ活性増強作用の山が出
現し、溶液中に蛋白が微邑なりとも存在する限りこの作
用の現われることが判明した。このウロキナーゼ活性増
強作用を示す全フラクションを合併し、凍結乾燥した処
、１７７０１１１９の塩を含む乾燥粉末が得られた。
からの非吸着画分の蛋白の２３Ｑｎｍにおける吸収の山
の後尾の部分から、ウロキナーゼ活性増強作用の山が出
現し、溶液中に蛋白が微邑なりとも存在する限りこの作
用の現われることが判明した。このウロキナーゼ活性増
強作用を示す全フラクションを合併し、凍結乾燥した処
、１７７０１１１９の塩を含む乾燥粉末が得られた。
（実施例２）
ヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子の単離精製。
実施例１に記載の方法により得た乾燥粉末６５０１１１
（＋（約１／８個胎盤相当吊）を分取し、これに２０万
ＩＵの高分子量ウロキナーゼ（分子量５５．０００）を
添加し、４℃で３時間反応させた後、Ｎａ Ｃ＋を０．
９９６及びトウィーン８０を０゜０１％含有する０、０
１Ｍ燐酸緩衝液（ＰＩ−１７゜２）にて平衡化させたセ
ファデックスＧ−１５０を装填したシリコン被腸付名済
カラム（２，５／７５ｃｍ）によりゲル濾過を行ない、
フラクション・コレクターで分画処理した処、流出位ｆ
ｆ２６０に、新規のね溶活性物質であるヒト胎盤性プラ
スミノーゲン活性化因子の流出することが判明した。
（＋（約１／８個胎盤相当吊）を分取し、これに２０万
ＩＵの高分子量ウロキナーゼ（分子量５５．０００）を
添加し、４℃で３時間反応させた後、Ｎａ Ｃ＋を０．
９９６及びトウィーン８０を０゜０１％含有する０、０
１Ｍ燐酸緩衝液（ＰＩ−１７゜２）にて平衡化させたセ
ファデックスＧ−１５０を装填したシリコン被腸付名済
カラム（２，５／７５ｃｍ）によりゲル濾過を行ない、
フラクション・コレクターで分画処理した処、流出位ｆ
ｆ２６０に、新規のね溶活性物質であるヒト胎盤性プラ
スミノーゲン活性化因子の流出することが判明した。
数回のクロマトグラフィー処理を行なった結果、ヒト胎
盤１個につき、当該活性化因子を約１．５ｍｇ取得する
ことができた。
盤１個につき、当該活性化因子を約１．５ｍｇ取得する
ことができた。
この活性化因子は、抗ウロキナーゼ血清とオフタロニー
法にて沈降線を形成することが無く、またウロキナーゼ
の人工曇質であるＧｌｒ−Ｇｌｙ−Δｒ（Ｊ −Ｍ Ｃ
Ａをウロキナーゼの１／３の比活性にて切断し、プラス
ミノーゲン含有ウシ標準フィブリン平板をウロキナーゼ
の３倍の比活性で溶解させ１こ 。
法にて沈降線を形成することが無く、またウロキナーゼ
の人工曇質であるＧｌｒ−Ｇｌｙ−Δｒ（Ｊ −Ｍ Ｃ
Ａをウロキナーゼの１／３の比活性にて切断し、プラス
ミノーゲン含有ウシ標準フィブリン平板をウロキナーゼ
の３倍の比活性で溶解させ１こ 。
この活性化因子の分子量をＳＤＳ電気泳′動法により測
定した処、約４６．０００に主バンドが、また約２７，
０００に副バンドが存在することが観察された。
定した処、約４６．０００に主バンドが、また約２７，
０００に副バンドが存在することが観察された。
尚、この活性化因子のプラスミノーゲン活性化作用に門
して下記の諸方法により試験した結果は下表に示される
通りであり、これから本発明により得られる活性化因子
は、蛋白質であって、その活性はプラスミノーゲン活性
化及びプラスミノーゲン含有フィブリン平板溶解活性に
関してウロキナーゼの３倍以上であり、またウロキナー
ゼの特異基質を切断する氷解活性に関してウロキナーゼ
の約１／３であることが判明した。
して下記の諸方法により試験した結果は下表に示される
通りであり、これから本発明により得られる活性化因子
は、蛋白質であって、その活性はプラスミノーゲン活性
化及びプラスミノーゲン含有フィブリン平板溶解活性に
関してウロキナーゼの３倍以上であり、またウロキナー
ゼの特異基質を切断する氷解活性に関してウロキナーゼ
の約１／３であることが判明した。
表１） プラスミノーゲン活性化作用試験力トウ等ｒＪ
、 ＢｉｏｃｈｅｍＪ第８８巻、第１８３頁（１９８０
年〉に記載の方法による。
、 ＢｉｏｃｈｅｍＪ第８８巻、第１８３頁（１９８０
年〉に記載の方法による。
Ａ２８０：２８０門における吸収係数
ΔＦ ：螢光光度
表２〉 プラスアミノーゲン含有つシ標準フィブリン平
板溶解試翰Ａｓｔｒｕｐ等［Ａｒｃｌｌ、 ３ｉｏｃｈ
ｃｍ、 ３ｉｏｐｌ＋ｙｓ、 Ｊ第４０巻、第３４６頁
（１９５２年）に記載の方法による。
板溶解試翰Ａｓｔｒｕｐ等［Ａｒｃｌｌ、 ３ｉｏｃｈ
ｃｍ、 ３ｉｏｐｌ＋ｙｓ、 Ｊ第４０巻、第３４６頁
（１９５２年）に記載の方法による。
表３） ウロキナーゼ基質氷解活性試験モリタ等ｒＪ、
３ｉｏｃｂｅｍ、 Ｊ第８２巻、第１４９５頁（１９
７７年）に記載の方法による。
３ｉｏｃｂｅｍ、 Ｊ第８２巻、第１４９５頁（１９
７７年）に記載の方法による。
（実施例３）
ヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子の固定型ウロキ
ナーゼカラムによる精製。
ナーゼカラムによる精製。
実施例１に記載の方法により１りた乾炸粉末２ｇ（約０
．４個胎盤相当最）を分取し、蒸留水４０ｍＱに溶解し
、これを１０Ｑの蒸留水を外液に４℃にて一夜、４時間
毎に外液を替えながら透析した。透析終了後の透析膜内
液をあらかじめ８０万ＩＵのウロキナーゼを結合させて
作成し、０．５ＭＮａ Ｃｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ＰＨ８゜０）で平衡化しておいたウロキナーゼ・アフ
ィゲル１０カラム（０，９ｘ １０ｃｍ）に２１１１．
Ｑ／ｈｒの波速で流入させ、３０時間かけて全ての透析
膜内液をカラム内の固定型ウロキナーゼと反応さゼつつ
、カラムに上述の炭酸Ｎｔ！液を続けて流して流化させ
た液の全てをフラクション・コレクターにて分取（、各
フラクションのプラスミノーゲン活性化作用とプラスミ
ノーゲン含有フィブリン平板溶解活性を測定したのに続
けて、カラムに２ＭＫＳＣＮと０．５ＭＮａ Ｃｌを含
むＯ，′１Ｍ炭ａｍ汚液を流入させ、その際に溶出する
液もフラクション・コレクターにて分取し、各フラクシ
ョンのプラスミノーゲン活性化作用とプラスミノーゲン
含有フィブリン平板溶解活性を測定した。その結果、前
半の２ＭＫＳＣＮを含まぬ緩衝液にて流化させた画分と
、侵半の２ Ｍ Ｋ Ｓ ＣＮを含む緩衝液にて溶出さ
せた両分の双方に、プラスミーゲン活性化作用とプスミ
ノーゲン含有フィブリン平板溶解活性が存在した。
．４個胎盤相当最）を分取し、蒸留水４０ｍＱに溶解し
、これを１０Ｑの蒸留水を外液に４℃にて一夜、４時間
毎に外液を替えながら透析した。透析終了後の透析膜内
液をあらかじめ８０万ＩＵのウロキナーゼを結合させて
作成し、０．５ＭＮａ Ｃｌを含む０．１Ｍ炭酸緩衝液
（ＰＨ８゜０）で平衡化しておいたウロキナーゼ・アフ
ィゲル１０カラム（０，９ｘ １０ｃｍ）に２１１１．
Ｑ／ｈｒの波速で流入させ、３０時間かけて全ての透析
膜内液をカラム内の固定型ウロキナーゼと反応さゼつつ
、カラムに上述の炭酸Ｎｔ！液を続けて流して流化させ
た液の全てをフラクション・コレクターにて分取（、各
フラクションのプラスミノーゲン活性化作用とプラスミ
ノーゲン含有フィブリン平板溶解活性を測定したのに続
けて、カラムに２ＭＫＳＣＮと０．５ＭＮａ Ｃｌを含
むＯ，′１Ｍ炭ａｍ汚液を流入させ、その際に溶出する
液もフラクション・コレクターにて分取し、各フラクシ
ョンのプラスミノーゲン活性化作用とプラスミノーゲン
含有フィブリン平板溶解活性を測定した。その結果、前
半の２ＭＫＳＣＮを含まぬ緩衝液にて流化させた画分と
、侵半の２ Ｍ Ｋ Ｓ ＣＮを含む緩衝液にて溶出さ
せた両分の双方に、プラスミーゲン活性化作用とプスミ
ノーゲン含有フィブリン平板溶解活性が存在した。
これらの両分をそれぞれ別々に集めて凍結乾煙し、透析
を行なって、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で、双方の蛋白質バンドの存在の様態を調べた結果、
２ＭＫＳＣＮを含む緩衝液にて溶出させた両分では、実
施例２の精製物に似た、分子量４６．０００を主バンド
とし、２７゜０００の副バンドを有するバンド・パター
ンであったのに対し、２ Ｍ Ｋ Ｓ ＣＮを含まぬ１
Ｆｄｌｊ液で流化させた両分からは、多種類のその他の
蛋白質バンドが検出された。そこで２ＭＫＳＯＮを含ま
ぬ緩衝液による流下画分を、更にＮａ Ｃ１を０．９％
及びトウィーン８０を０．０１％を含有する０゜０１Ｍ
燐酸！ｉｌｊ液（ＰＨ７，２）にて手話化させたセフ１
デックスＧ−１５０を装眉したシリコン被腔付着済カラ
ム（２，５ｘ７５ｃｍ＞によりゲル濾過を行ない、フラ
クション・コレクターで分画処理した処、流出位瞠３８
５ｍＱ付近のセファデックスゲル吸着／脱着性蛋白質の
位置に、主たるプラスミノーゲン活性化作用が流出し、
ウロキナーゼの流出位置のプラスミノーゲン活性化作用
は微量であった。
を行なって、５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動
法で、双方の蛋白質バンドの存在の様態を調べた結果、
２ＭＫＳＣＮを含む緩衝液にて溶出させた両分では、実
施例２の精製物に似た、分子量４６．０００を主バンド
とし、２７゜０００の副バンドを有するバンド・パター
ンであったのに対し、２ Ｍ Ｋ Ｓ ＣＮを含まぬ１
Ｆｄｌｊ液で流化させた両分からは、多種類のその他の
蛋白質バンドが検出された。そこで２ＭＫＳＯＮを含ま
ぬ緩衝液による流下画分を、更にＮａ Ｃ１を０．９％
及びトウィーン８０を０．０１％を含有する０゜０１Ｍ
燐酸！ｉｌｊ液（ＰＨ７，２）にて手話化させたセフ１
デックスＧ−１５０を装眉したシリコン被腔付着済カラ
ム（２，５ｘ７５ｃｍ＞によりゲル濾過を行ない、フラ
クション・コレクターで分画処理した処、流出位瞠３８
５ｍＱ付近のセファデックスゲル吸着／脱着性蛋白質の
位置に、主たるプラスミノーゲン活性化作用が流出し、
ウロキナーゼの流出位置のプラスミノーゲン活性化作用
は微量であった。
そこで、このセファデックスグル吸着／脱着性蛋白質画
分を染め、凍結乾爆し、透析した後、５ＤＳ−ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動法にて分子量を門べた結果、
実施例２のｖ１製物と同様の分子ｕ４ｅ、ｏｏｏに主バ
ンドを持ち、分子量２７．０００に副バンドを有するバ
ンド・パターンを得た。そして、得られたｍ ＦＪ物の
活性特性は、実施例２に示したｆｆｌ製物の活性特性と
同一であった。
分を染め、凍結乾爆し、透析した後、５ＤＳ−ポリアク
リルアミド・ゲル電気泳動法にて分子量を門べた結果、
実施例２のｖ１製物と同様の分子ｕ４ｅ、ｏｏｏに主バ
ンドを持ち、分子量２７．０００に副バンドを有するバ
ンド・パターンを得た。そして、得られたｍ ＦＪ物の
活性特性は、実施例２に示したｆｆｌ製物の活性特性と
同一であった。
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ヒト胎盤から抽出され、ウロキナーゼと反応す
ることによりヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子を
遊離することを特徴とするタヒト胎盤性プラスミノーゲ
ン活性化因子とヒトプラスミノーゲン活性化阻害因子と
の結合物。 Ｃ） ヒ１−の胎盤を通常の蛋白質精製方法によって精
製することを特徴とする請求範囲第１項記載のヒト胎盤
性プラスミノーゲン活性化因子とヒトプラスミノーゲン
活性化阻害因子との結合物の製法。 （３） ヒト胎盤から抽出され、５Ｏ８−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動法による分子量が非還元形態におい
て、約４６．０００に主バンドを、かつ約２７，０００
に幅バンドを有しており、プラスミノーゲン活性化作用
を有していることを特徴とする、ヒト胎盤性プラスミノ
ーゲン活性化因子。 （４） ヒトの胎盤を通常の蛋白質精製方法によって精
製することを特徴とする請求範囲第３項記載のヒト胎盤
性プラスミノーゲン活性化因子の製法。 ■ ヒトの胎盤を細胞破砕し遠心分離して得た上澄液か
ら蛋白質を塩析採取し、透析処理Ｃ、ムコ多糖を除去し
、分画処理してウロキナーゼ活性増加作用を示す画分を
採取することを特徴とする、ヒト胎盤性プラスミノーゲ
ン活性化因子とヒトプラスミノーゲン活性化阻害因子と
の結合物の製法。 （６） リジンセファロース４Ｂカラムを用いて分画処
理を行うことを特徴とする特許請求の範囲第５項に記載
の製法。。 （７） ヒトの胎盤を細胞破砕し遠心分離して得た上澄
液から蛋白質を塩析採取し、透析処理し、ムコ多糖を除
去し、分画処理してウロキナーゼ活性増加作用を示す両
分を採取して凍結乾燥し、次いでウロキナーゼ・セファ
０−スのごとき固定型ウロキナーゼ乃至遊離のウロキナ
ーゼと反応させることにより、特許請求範囲第３項に記
載のヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子を遊離させ
、通常の蛋白質精製法を用いて、精製採取することを特
徴とする、ヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子の製
法。 （８） 固定型ウロキナーゼのカラム中のウロキナーゼ
乃至Ｔｉ離のウロキナーゼと、特許請求範囲第１項記載
の結合物とを反応させることにより、特許請求範囲第３
項記載のヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因子を遊離
させることを特徴とする特許請求範囲第７項に記載の製
法。 （９） 遊離したヒト胎盤性プラスミノーゲン活性化因
子の精製を、非イオン性界面活性剤含有＃！衝液で平衡
化されたセファデックスＧ−１５０乃至Ｇ−１００カラ
ムを用いた分画処理により行なうことを特徴とする特許
請求範囲第７項又は第８項に記載の製法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59008515A JPS60152421A (ja) | 1984-01-23 | 1984-01-23 | ヒト胎盤性プラスミノ−ゲン活性化因子、及びそれとヒトプラスミノ−ゲン活性化阻害因子との結合物、及びそれらの製法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59008515A JPS60152421A (ja) | 1984-01-23 | 1984-01-23 | ヒト胎盤性プラスミノ−ゲン活性化因子、及びそれとヒトプラスミノ−ゲン活性化阻害因子との結合物、及びそれらの製法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60152421A true JPS60152421A (ja) | 1985-08-10 |
Family
ID=11695270
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59008515A Pending JPS60152421A (ja) | 1984-01-23 | 1984-01-23 | ヒト胎盤性プラスミノ−ゲン活性化因子、及びそれとヒトプラスミノ−ゲン活性化阻害因子との結合物、及びそれらの製法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60152421A (ja) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986003973A1 (en) * | 1985-01-14 | 1986-07-17 | Terumo Kabushiki Kaisha | Fibrinophilic urokinase complex and process for its preparation |
| EP0217341A2 (en) * | 1985-09-30 | 1987-04-08 | Kowa Co. Ltd. | Anticoagulating substance, process for preparing same and anticoagulant comprising same as an effective component |
| JPS62155222A (ja) * | 1985-11-11 | 1987-07-10 | リユ−ベン・リサ−チ・アンド・デベロツプメント・ベ−・ゼツト・ウエ− | 抗血栓医薬組成物 |
| EP0230945A2 (en) * | 1986-01-21 | 1987-08-05 | Kowa Co. Ltd. | Thrombin-binding substance and process for preparing the same |
-
1984
- 1984-01-23 JP JP59008515A patent/JPS60152421A/ja active Pending
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO1986003973A1 (en) * | 1985-01-14 | 1986-07-17 | Terumo Kabushiki Kaisha | Fibrinophilic urokinase complex and process for its preparation |
| EP0217341A2 (en) * | 1985-09-30 | 1987-04-08 | Kowa Co. Ltd. | Anticoagulating substance, process for preparing same and anticoagulant comprising same as an effective component |
| JPS62155222A (ja) * | 1985-11-11 | 1987-07-10 | リユ−ベン・リサ−チ・アンド・デベロツプメント・ベ−・ゼツト・ウエ− | 抗血栓医薬組成物 |
| EP0230945A2 (en) * | 1986-01-21 | 1987-08-05 | Kowa Co. Ltd. | Thrombin-binding substance and process for preparing the same |
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