KR19980072202A - 순수한 룸보로키나제의 대량 정제방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 순수한 룸부로키나제의 대량 정제방법에 관한 것으로, 지렁이 분말을 물에 녹이고, 55∼60℃에서 1∼2시간 열처리하여 다른 단백질들을 침전제거한 후, 황산암모늄으로 침전시켜 룸부로키나제를 농축한후, 이를 이온교환성 컬럼크로마토그래피와 결합성 컬럼크로마토그래피의 두종류의 컬럼을 이용하여 순수한 룸부로키나제를 분리, 정제하는 방법이다.

본 발명은 공정이 간단하고 빠르며, 경비가 적게 들고 대량으로 룸부로키나제를 얻을 수 있다는 장점이 있다.

Description

순수한 룸보로키나제의 대량 정제방법

본 발명은 지렁이로부터 순수한 룸부로키나제(Lumbrokinase)를 대량적으로 정제하는 방법에 관한 것으로 복잡하고 까다로운 룸부로키나제의 정제방법을 개선하여 간단하고 빠르며, 경비가 적게 들면서 대량으로 가장 혈전용해능이 높은 효소만을 정제하는 방법에 관한 것이다.

생활수준 및 식생활의 향상으로 증가일로에 있는 여러성인병들 중의 하나가 이상혈류관계 질환이다. 특히, 심근경색, 뇌출혈등은 혈류관계 질병 중에서 이상혈전 형성으로 야기되며 매우 급격한 증가추세에 있는 질환으로 현대사회에 여러가지 심각한 사회적, 경제적 문제를 일으키고 있다. 지금까지 임상적으로 주로 사용되고 있는 혈전용해제로는 유로키나제(urokinase), 스트렙토키나제(streptokinase), 조직형프라스미노겐 활성인자(tissue-type plasminogen activator)등으로 전세계적으로 상당량 소비되고 있다. 그러나, 이들 혈전용해제는 혈전의 주성분인 피브린(fibrin)을 직접 용해하지 않고, 대신 혈액 내에 이미 존재하고 있는 프라스미노겐(plasminogen)을 프라스민(plasmin)으로 활성화시킨 다음 이 프라스민(plasmin)으로 하여금 혈전을 용해시키는 방법으로 혈전을 용해한다. 따라서, 과다한 프라스민(plasmin)이 형성되어 자칫 혈관벽까지 용해하여 종종 전신출혈증으로 진전되게 하여 많은 사람의 생명을 위협하기도 한다. 그러므로, 이러한 문제를 근복적으로 해결하기 위해서는 혈전만을 특이적으로 용해하는 혈전용해제의 개발이 시급하다.

룸부로키나제(Lumbrokinase)는 지렁이 추출물에서 얻을 수 있는 혈전용해제로 프라스미노겐(plasminogen)을 프라스민(plasmin)으로 활성화시키지 않고 대신 피브린(fibrin)만을 선택적으로 분해하는 능력이 탁월하다. 혈전형성에 관여하지 않는 알부민(albumin)이나 카제인(casein)과 같은 단백질은 잘 분해하지 않는다는 것은 혈액용 혈전용해제로 매우 적절함을 보여준다. 룸부로키나제는 현재, (1)인공 신장기를 우레탄으로 만들 때, 혈전생성 방지용 표면처리제로 사용되고 있으며, (2)지렁이를 갈아 상층액 만을 건조하여 만든 분말제제는 경구용 혈전용해제로 사용되고 있다.

중국에서는 수천년 전부터 지렁이를 여러가지 질병을 치료하는 목적으로 사용하여 왔다. 특히, 이 지렁이는 이상혈전생성으로 인한 질병에 매우 효과가 있음은 여러 한방관련 서적에 언급되어 있다(중약대사전 : 강소신의학원편, 2112, 1980년, 한약임상응용 : 488-489, 이상인 : 본초학, 학림사, 제2판 1981년 pp321 참조). 이러한 배경하에 일본의 미하라(Mihara)등은 1983년 연구를 시작한 이래 1991년 최초로 지렁이(Lumbricus rubellus)에서 혈전용해능이 있는 단백질분해효소를 정제하기에 이르렀다(일본공개특허 소 58-148824, 59-63184, 59-184131, 64-75431호등 참조). 그러나, 이들의 정제방법은 다음과 같이 매우 복잡하다.

(1)먼저, 지렁이 가루(1 kg)를 10 liter의 생리식염수(0.1% NaN₃포함)에 72시간 동안 녹인다.

(2) 90분 동안 원심분리(26,500g) 한다.

(3)상층액을 모은 다음 여기에 60%되게 황산암모늄(ammonium sulfate)을 넣어 녹인다. 침전된 단백질을 다시 원심분리하여 수집한다.

(4)침전된 단백질을 20 mM, pH 7.4인 인산완충용액에 다시 녹인다.

(5)녹은 지렁이 단백질을 세파덱스 G-200 겔여과(Sephadex G-200 gel filtration) 크로마토그래피로 분리한다.

(6)혈전용해능이 있는 분획만을 모은 후, 이를 다시 디이에이이-셀룰로스(DEAE-cellulose) 크로마토그래피로 분리한다. 이때 컬럼은 미리 10 mM, pH 8.0인 인산완충용액으로 채워지도록 한다. 단백질이 분리, 유리되어 나오도록 하기 위해 0-100 mM NaCl용액(10 mM, pH 8.0의 인산완충용액 내에 포함)으로 컬럼에 넣어 주었다.

(7)다시 혈전용해능이 있는 분획만을 모은후, 벤즈아미딘-세팔로스 친화성컬럼(banzamidine-Sepharose affinity column) 크로마토그래피에 넣어 주었다. 이 컬럼은 이미 20 mM, pH 7.5인 인산완충용액으로 채워주었다. 이 컬럼에 결합된 단백질은 0.5 M arginine과 1 M urea가 함유된 인산완충용액을 컬럼에 서서히 부어주어 분리된 분획을 수집하였다.

(8)이때, 종류가 다른 단백질분해효소를 정제할 때는 토요펄 HW-55 컬럼(Toyopearl HW-55 column)이라는 크로마토그래피컬럼을 사용할 수도 있다.

(9)벤즈아미딘-세팔로스친화성컬럼(Banxamidine-Sepharose affinity column)에 결합되어 알기닌(arginine)처리로 칼럼에서 떨어져 나온 단백질은 다시 세파덱스 G-75 겔여과 컬럼(Sephadex G-75 gel filtration column)을 통해 최종적으로 분리를 하였다.

이처럼 일본 미하라씨의 분리, 정제방법은 지렁이에서 혈전용해능을 가진 룸부로키나제를 분리하기 위해서는, 최소한 4-5개의 컬럼크로마토그래피를 수행하여야 한다. 경비도 문제이거니와 너무나 복잡다단계이어서 분리하는데 걸리는 시간만도 최소한 2주일 이상 꼬박 실험을 수행하여야만 가능하다는 결점이 있다.

최근에는, 국내에서도 룸부로키나제 분리정제방법을 새로이 개발하였는데(국내특허공보, 공고번호 제92-8369호 참조), 여기에는 지렁이 현탁액을 원심분리하고 얻은 상층액에 황산암모니움을 넣어 단백질을 침전시키고 다시 원심분리하였다. 가라앉은 단백질을 인산완충용액에 녹이고 이를 분자량 10,000달톤 이상의 차단막을 이용하여 한외여과를 수행하였다. 이 차단막에 걸려 빠져 나가지 못한 10,000 달톤 이상 짜리 분획에서 전체의 94.4%에 이르는 단백질 분해효소를 얻었다. 이를 음이온교환수지컬럼(DEAE-Sepharose CL-6B)에 통과시키고 완충용액으로 충분히 씻어준 다음 염화나트륨 250 mM 농도, 다음에는 500 mM 농도의 용액으로 단백질 분해효소를 떨어뜨려 회수하였다. 이 방법은 일본에서 발표(일본특허공개공보 소 64-75431호)한 방법에 비해 상당히 간단하며 시간과 비용이 절감된다는 것은 사실이다. 그러나 이방법은 원하는 한 종류의 룸부로키나제를 정제율 99% 이상 올려 순수하게 분리하는 것이 아니고 지렁이 체내에 있는 최소 5가지 이상의 서로 다른 단백질 분해효소를 한꺼번에 혼합정제하는 방법이라고 볼 수 있다. 더구나, 분자량 차이에 의해 분리하는데 쓰이는 한외여과시 차단막은 사용할 때마다 갈아주어야 하기 때문에 번거롭고 비용이 비싸며, 음이온교환수지컬럼크로마트그래피 후에 단백질 샘플에 섞여 있는 과도한 양의 염화나트륨을 제거하기 위한 스파이럴 막 카트릿지(spiral membrane cartridges)가 상당한 고가이어서 제조원가에 미치는 영향은 무시할 수 없다.

본 발명은 상기와 같은 종래 정제방법을 되도록 개선하여 간단하고 빠르며, 경비가 적게 들면서, 대량으로 가장 혈전용해성이 높은 순수한 룸부로키나제만을 정제하는 방법을 안출하고자 하는 것이다.

도 1은 전기영동법에 의한 지렁이 단백질과 순수 정제된 룸부로키나제의 분리단계별 전기영동사진으로,

1번 줄 : 분자량 표준단백질, 위에서부터 97.4, 66.2, 45, 31, 21.5 kDa의 분자량을 갖는 단백질이 분리되어 보임.

2번 줄 : 지렁이 분쇄액에 존재하는 여러 단백질

3번 줄 : 열처리한 후, 상층액에 존재하는 지렁이 단백질

4번 줄 : 30∼60% 황산암모니움 처리 후, 침전된 지렁이 단백질

5번 줄 : 4번줄의 단백질을 투석한 후의 지렁이 단백질

6번 줄 : DEAE 이온교환성 컬럼크로마토그래피에서 빠져나온 단백질

7번 줄 : Benzamidine affinity 컬럼크로마토그래피에서 결합되지 않고 그냥 빠져나온 지렁이 단백질

8번 줄 : Benzamidine affinity 컬럼크토그래피에서 결합된 후, arginine에 의해 떨어져 나온 정제된 룸부로키나제이다.

도 2는 정제된 룸부로키나제의 열과 pH에 대한 안정성 관련 그래프로서, 25℃(○), 45℃(○), 65℃(△), 78℃(▲)의 열처리온도의 경우이다.

도 3은 룸부로키나제의 기질 단백질에 대한 특이성을 확인하기 위하여 단백질 분해능을 비교실험한 것으로, (A)는 아조알부민을, (B)는 아조카제인을 분해시키는 량을 나타낸 그래프로 표시한 것으로 룸부로키나제(●), 트립신(○), 프라스민(△), 유로키나제(▲)의 경우이다.

본 발명의 순수한 룸부로키나제의 대량 정제방법을 요약하면, 지렁이 분말을 물에 녹이고, 55∼60℃에서 1∼2시간 열처리하여 침전시켜 룸부로키나제외 다른 단백질들을 제거한후, 황산암모늄으로 침전시켜 룸부로키나제를 농축한후, 이를 이온교환성컬럼크로마토그래피와 결합성컬럼크로마토그래피의 두종류의 컬럼을 이용하여 순수한 룸부로키나제만을 분리정제하는 방법이다.

본 발명의 정제방법을 좀더 구체적으로 설명하면 다음과 같다.

(1)먼저 지렁이 분말을 분말부피의 4∼5배 정도되는 트리스(Tris) 완충용액(10 mM Tris-HCl,145 mM NaCl, 0.01% NaN₃, pH 7.4)에 용해시키고, 원심분리하여 상층액 만을 수집한다.

(2)50∼55℃에서 1∼2시간 동안 상층액을 열처리하여 룸부로키나제외 다른 단백질을 침전, 원심분리하여 제거하고 다시 상층액만을 수집한다.

(3)최종농도가 60%가 되게 황산암모늄(ammonoum sulfate)을 가하여 단백질을 침전시킨후, 침전된 단백질을 완충용액(50 mM Tris-HCl, pH 8.)에 용해시키고, 이를 같은 완충용해에서 12∼24시간 동안 투석하여 황산암모니움을 제거한다.

(4)디이에이이-세파덱스 A25(DEAE-Sephadex A25)를 이용한 이온교환크로마토그래피를 수행한다. 이때, NaCl은 0∼500 mM까지의 농도기울기를 갖도록 하여 결합한 단백질을 분리시킨다.

(5)혈전용해능이 있는 분획을 모아 벤즈아미딘컬럼(benzamidine- immobilized affinity column)에 넣어 룸부로키나제를 결합시키고, 컬럼을 깨끗이 완충용액으로 씻은후, 100∼200 mM(100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM)까지의 농도기울기를 갖는 알기닌(arginine)용액으로 룸부로키나제를 분리시킨다.

(6)분리된 룸부로키나제는 과도한 알기닌(arginine)을 제거하기 위해 100 mM 트리스염산(Tris-HCl. pH 7.4)의 완충용액에 10시간 최종으로 투석하여 순수한 룸부로키나제를 얻는다.

본 발명의 정제방법에 따르면, 약 4-5일 내에 룸부로키나제를 분리정제할 수 있으며 두개의 컬럼크로마토그래피만을 사용하므로 매우 경제적이다. 여기서 우리는 열처리(55∼60℃, 1∼2시간)를 하는데 그 이유는 룸부로키나제는 이 온도에서 거의 95% 이상 안정하므로 상대적으로 열에 약한 다른 단백질 분해효소를 사멸시킬 수 있어 복잡한 공정을 거칠 필요가 없어 매우 효율적이며 또한 혼합된 다른 단백질이 열에 의해 변성되어 침전시켜 제거될 수 있기 때문에 고순도, 고수율을 유지시킬 수 있는 장점이 있다. 또한 본 발명공정중 마지막 정제단계인 벤즈아미딘친화컬럼(benzamidine affirity colum) 크로마토그래피를 사용할 때, 다단계 농도기울기를 갖는 알기닌(arginine)를 사용하여 분자량에 의해 분리하는 세파덱스 G-75 겔여과(Sephadex G--75 gel filtration) 칼럼크로마토그래피를 다시 사용할 필요가 없다는 특장점이 있다.

본 발명에 따른 실시예를 하기에 상세히 기술하였다.

먼저 지렁이 약 1.5 kg 정도를 지렁이 사육농장에서 얻은후, 이를 알루미늄호일 위에 펼쳐놓는다. 여기에 탁상용 전기램프를 30분 정도 켜놓으면 지렁이는 몸안의 배설물을 토함과 동시에 서로 엉켜 쉽게 지렁이 몸체만을 분리할 수 있게된다. 다음에는 이 지렁이를 수돗물에 담구어 깨끗이 씻어준다. 이때, 지렁이 몸체의 직경보다 1/4정도 작은 체를 사용하여 지렁이 체에 먼저 담고 물을 위에서 쏟아부으면 쉽게 지렁이를 씻어줄 수 있다. 일단 지렁이 체내와 밖의 오물을 제거한 후에는 전체 지렁이의 부피의 1배 정도가 되는 10 mM Tris-HCl. 0.01% NaN₃, pH 7.4되는 완충용액을 넣고 섞은후 고속 옴니믹서(omni-mixer)로 약 15,000 rpm으로 30초간 6회를 반복하여 분쇄하였다. 이 지렁이 분쇄액을 상온(21도)에서 약 70시간 교반하여 주었다. 이를 원심분리(20도, 15,000 rpm, 20분)하여 상층액만을 수집하였다. 이 상층액을 55℃에서 약 1시간 동안 열처리하여 열에 약한 다른 단백질분해효소 및 혼합되어 있는 단백질의 변성을 일으켰다. 침전된 단백질을 다시 원심분리(20도, 15,000 rpm, 20분)하여 제거하고 이 용액을 얼음에 채운후, 교반하면서 서서히 황산암모니움을 최종농도가 60%가 되게 넣어주었다. 침전된 단백질을 원심분리(4℃, 15,000 rpm, 30분)하여 수집하였다. 이를 다시 50 mM Tris-HCl, pH 8.0의 완충용액(50 ml)에 녹이고 이를 같은 완충용액에 대하여 투석하였다. 투석은 4℃에서 실시하였고, 약 2 liter의 완충용액을 4회 사용하여 황산암모니움을 제거하였다. 이를 DEAE Sephadex A25 컬럼(5cm×100cm)에 통과시켰다. 이후, 이 컬럼에 결합하지 않은 단백질 및 기타 물질들을 완충용액으로 씻어 주었다. 더 이상 단백질이 빠져 나오지 않음을 확인한 후, 염화나트륨 0 mM에서 500mM까지의 연속 농도기울기를 갖는 완충용액을 컬럼 속에 넣어 주어 컬럼에 부착되어 있던 단백질들을 떼어 내었다. 분획을 받아 각 분획 속의 혈전용해능을 피브린 용해능으로 측정, 활성이 있는 분획만을 모았다. 모아진 피브린용해 활성을 갖는 분획들은 다시 완충용액에 대하여 투석을 12시간 실시하여 과도한 염화나트륨을 제거하였다. 이 단백질용액을 두번째 컬럼인 Benzamidine Sepharose 6B 컬럼(2cm×15cm)에 에 넣어 원하는 룸부로키나제가 결합하도록 하였다. 이 컬럼의 부피에 약 3배가 되는 300 mM 염화나트륨을 포함한 완충용액(20 mM Tris-HCl, pH 8.0)으로 씻어준 후, 룸부로키나제를 100 mM, 125 mM, 150 mM, 200 mM의 농도가 되게끔 알기닌(arginine)을 넣은 20 mM sodium acetate 완충용액으로 룸부로키나제를 컬럼에서 차례로 떨어져 나오게 하였다.

이렇게 하여 얻은 효소를 전기영동하여 순수하게 분리됨을 확인할 수 있었다(도 1 참조). 1.5 ㎏의 지렁이에서 이 방법을 통해 34,000 달톤의 분자량을 갖는 룸부로키나제 효소 약 250 ㎎을 순수정제하여 얻었다.

본 발명의 실시예에 따른 각 분리과정에서의 룸부로키나제의 효소정제도를 포함한 특이적 활성도를 측정하여 하기 표 1에 기재하였다.

^*피브린용해능(mm/50 mg of protein) : 50 mg의 단백질을 피브린 판에 떨어뜨린후, 섭씨 37도에서 2시간 동안 반응시켜 형성된 투명한 원형의 직경을 mm로 표시함.^**

특이적활성도(specific activity) : 피브린 판에 단백질 용액을 떨어뜨린 후, 섭씨 37도에서 2시간 반응시켰을 때, 피브린이 녹아 형성된 투명한 원형의 면적이 100㎟일때를 1 unit로 정함.^***

정제도 : 단백질 1mg에 들어있는 특이적 효소활성도가 아직 분리과정을 거치지 않은 용액에 비해 몇배나 증가되었는가를 표시함. 마지막 과정에서 얻은 룸부로키나제의 효소 정제도는 약 8배 정도로 비교적 낮은 수치인데 이는 지렁이 단백질중에 상당한 양이 단백질 분해효소로 이루어졌음을 반영한다.

[실험예 1]

룸부로키나제의 안정성 실험

실시예 1에 따라 제조된 룸부로키나제에 대하여 수소이온농도(pH)와 열(온도)에 따른 안정성 실험을 한 결과 도 2와 같았다. pH 2에서 pH 11까지 여러 완충용액에 룸부로키나제를 녹인 후, 이를 25℃(○), 45℃(●). 65℃(△), 그리고 78℃(▲)에서 1시간동안 열처리한후, 남아있는 룸부로키나제의 효소활성도를 피브린 판에서 시행한후, 말갛게 용해된 면적을 계산하였다. 도 2에서 볼 수 있는 바와같이 25℃에서 45℃까지는 pH 2에서 pH 11까지 거의 효소활성도의 차이가 없으며, 상온에서 6개월정도 보관하여도 효소활성도가 단지 10∼15%정도 떨어지는 높은 안정성을 보이고 있는바, 이 효소를 분리정제하고 실제 임상에 사용할때까지의 유통기간이 길거나 제제면에서 특별한 조치가없어도 된다는 실용성을 갖고 있음이 입증되었다.

[실험예 2]

룸부로키나제의 효능실험

실시예 1에 따라 제조된 룸부로키나제의 기질단백질에 대한 특이적 조사실험을 한 결과 도 3에 나타내었는바, 정제된 룸부로키나제(●)와 트립신(○), 프라스민(△), 유로키나제(▲)를 각기 피브린 판에서 똑같은 용해활성도를 갖도록 농도를 맞춘다음, 각각의 효소에 아조알부민(도 3a), 아조카제인(도 3b)의 기질물질을 넣어 37℃에서 15분 혹은 30분 배양하였을 때 분해되는 양을 조사하였다.

도 3에서 볼수 있는 바와 같이, 보통의 소화효소인 트립신(trypsin), 혈전용해제로 현재 많이 사용되고 있는 유로키나제(urokinase), 실제 사람체내에서 혈전을 용해하는 효소인 프라스민(plasmin), 본 발명에 따른 룸부로키나제등 4종류의 단백질 분해효소를 사용하여 피브린을 용해하는 능력을 미리 똑같이 서로 맞춘 다음, 혈전형성과 별상관이 없는 알부민(albumin)이나 카제인(casein) 단백질을 분해하는 능력을 비교실험한 것으로, 순수정제한 룸부로키나제는 그 분해양상이 프라스민과 매우 비슷하여 알부민이나 카제인과 같은 혈전과 무관한 단백질은 잘 분해하지 않는 성질을 갖고 있음을 볼때, 룸부로키나제는 혈전형성에 관여하는 피브린은 잘 용해하는 반면, 다른 단백질은 상대적으로 잘 분해하지 못하는 기질특이성이 강함을 뜻하는 것이어서 혈전용해제로서의 완전조건을 갖고 있음이 확인되었다.

일본에서 개발한 종래방법은 최소한 4개의 칼럼크로마토그래피를 거쳐야 비로소 정제된 룸부로키나제를 얻을 수 있고, 최근 국내특허공고 제92-8369호에서 시행한 방법은 지렁이 내의 여러종류의 혈전용해효소가 서로 섞인 상태에서 분리하는 방법이라고 할 때, 본 발명의 분리정제방법은 지렁이의 체내에서 존재하는 여러 형의 혈전용해효소 중에서 가장 혈전용해능이 높고, 그 양이 풍부하며, 또 상당한 안정성을 보이는 룸부로키나제만을 매우 높은 정제도를 갖고 분리하는 방법이다. 또한 이 방법은 기존의 방법보다 훨씬 간단하며, 시간과 비용이 절약된다는 장점을 갖추고 있어 산업적으로 매우 유용한 발명이라 할 수 있다.

Claims (1)

1)지렁이 분말을 분말부피의 4-5배량의 트리스완충용액에 용해시키고 원심분리하여 상층액을 수집한후,

2)50∼55℃에서 1∼2시간동안 상층액을 열처리하여 룸부로키나제외 다른 단백질을 침전, 원심분리하여 제거하고 다시 상층액을 수집한 다음,

3)최종농도가 60%되게 황산암묘늄을 가하여 단백질을 침전시킨후, 침전된 단백질을 트리스완충용액에 용해시키고 12-24시간 동안 투석하여 황산암모니움을 제거하고,

4)디이에이-세파덱스 A25(DEAE-Sephadex A25)를 이용한 이온교환크로마토그래피를 행하여, 0∼500mM까지의 농도기울기를 갖는 NaCl용액으로 결합한 단백질을 분리시킨후,

5)혈전용해능이 있는 분획을 모아 벤즈아미딘-고정능컬럼(benzamidine- immobilitzed affinify column)에 넣어 룸부로키나제를 결합시키고, 100∼200 mM까지의 농도기울기는 갖는 알기닌(arginine)용액으로 룸부로키나제를 분리시킨 다음,

6)룸부로키나제에 혼합된 과도의 알기닌(arginine)을 트리스 완충액으로 처리하여 제거함을 특징으로 하는, 순수한 룸부로키나제의 정제방법.