JP2007217415A - 超高純度FVIIaの治療製剤および治療製剤を得るための方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】少なくとも1000IU/mgタンパク質の純度を有するFVIIaの治療製剤は、前記製剤が非ヒト由来のタンパク質を含まないことを特徴とする。FVIIを得るための方法において、精製は、FrII+III、FrIII、またはCohn分画の相当物から始まり、PEGによる沈殿、クロマトグラフ、およびそれに続く活性化を含む。
【選択図】なし
Description
FVIIを、カルシウムの存在下で活性化する。
II+IIIのフラクションの抽出物を沈殿させて、不純物を含むFVIIのフラクションを得ること:
II+IIIのフラクションの初期懸濁は、5mmol/lリン酸塩と5%ソルビトールとの抽出溶液を用いて実施した。
4%PEG沈殿物から開始し、以下の順次的段階に従ってFVIIのフラクションを得て部分的に精製すること:
1.6%PEGによる沈殿:
4%PEGの沈殿物のフラクションの懸濁は、20〜25℃の温度で、抽出液(0.5mol/lNaOHでpH7.5にした5mmol/lリン酸塩、5mmol/lクエン酸塩、および50mmol/lNaCl)により実施した。再懸濁が完了した後、攪拌しながら2時間保持し、その後、5℃まで冷却し、pHを6.5に調整した。この懸濁液を、5±3℃でpH 6.5の45mmol/lリン酸塩、50mmol/lNaClからなる溶液で希釈し、最終濃度6%(w/w)のPEGが得られるまでPEGを加えた。最後に、深皿で濾過することにより6%PEGの上清を清澄にし、PEGから沈殿物を分離した。このプロセスが完了した後、濾過溶液をFVIIの活性およびそのタンパク質含有量(光学濃度により評価)に関して分析し、0.11IU/AUの比活性を得た。この値は、第1段で説明されている方法により評価した、タンパク質概算値でFVIIの活性(IU/ml)を除算する計算で求められた。
フラクションII+IIIからの6%PEGの清澄化した上清から開始して、APIで20%まで希釈を行い、pHを7.5に調整し、伝導性を低減させた。次いで、QセファロースFF樹脂(すでに平衡化されている)を、得られた溶液に加え、これを、中程度の攪拌をしながら1時間保持した。その後、カラム(FINE LINE FF)への樹脂を含む懸濁液の充填を実施した。充填した後、樹脂を、2〜8℃の温度でpH 7.5に調整した10mmol/lリン酸塩、10mmol/lクエン酸塩、100mmol/lNaClを用いて洗浄した。洗浄が完了したら、溶離液Qをカラム内に注入した。この溶離は、2〜8℃の温度でpH 5.5に調整した10mmol/lリン酸塩、200mmol/lNaClを用いて行った。溶出液Qを評価したところ、FVIIの比活性1.16IU/AUが得られた。
2.5モル/lNaCl、pH 7.0に調整された、温度25±3℃のQセファロース溶出液から始めて、pH 7.0、25±3℃の温度で、10mmol/lリン酸塩、10mmol/lクエン酸塩、2500mmol/lNaClを使用してカラム(オクチル・セファロースFF)を平衡化させた。次に、溶出液をカラム内に注入し、同じ平衡液(25±3℃の温度)で洗浄した。次いで、pH 7.0、25±3℃の温度で10mmol/lリン酸塩、10mmol/lクエン酸塩、500mmol/lNaClを用いて溶離を行った。オクチル溶出液を評価したところ、FVIIの比活性3.79IU/AUという結果が得られた。これからわかるように、この第2段で得られた結果は、清澄化した6%PEG上清における初期値の34倍という3つの段階にわたる比活性の増大を反映している。
NiセファロースHPにおいてMCクロマトグラフィーを使ってオクチル溶出液から始めて、FVIIの純粋フラクションを得ること:
まず、NiセファロースHPカラムを、pH 8.0±0.05に調整した10mmol/lリン酸塩、1モル/lNaClで平衡化した。次いで、オクチル溶出液をカラム内に注入した。これに続いて、2回洗浄を行った。1回目の洗浄は、高伝導性状態(1モル/lNaCl)の下で、続く2回目の洗浄はpHを下げて(6.5)行った。最後に、pH 7.0に調整した10mmol/lリン酸塩、25mmol/lNaClを含む溶液で特異的な溶離を実施した。その結果得られたNi溶出液について分析的評価を実施し、204IU/AUの比活性の結果を得たが、これは、Q溶出液と比較しておよそ54倍の純度の増大を表している。
カルシウムの添加によるFVIIの活性化:
この段階では、FVIIは、Niセファロース溶出液から開始し、カルシウムの添加によりFVIIaに活性化した。これのために、FVIIを含有するフラクションを、50mmol/lトリス、30mmol/lNaCl、および2mmol/lCaCl2の存在下で、20時間、30℃でインキュベートし、FVIIの自動活性化をもたらした。FVIIaの活性に関するこれらの試料の分析的評価は、第1国際FVIIa標準に従ってSTACLOT(登録商標)VIIa−rTFキット(DIAGNOSTICA STAGO)を使用することにより実施した。この方法の原理は、rsTFがFVIIaの補因子としての特異的な機能を持つという事実に基づく。FVIIa、リン脂質、およびカルシウムの存在下でのrsTFは、血漿の血液凝固を生じさせる。このシステムでは、観察された凝固時間は、血漿内に最初に存在するFVIIのレベルに反比例することを示している。rsTFは、FVIIをFVIIaに活性化しないため、試験において存在しているFVIIは、試験に干渉しない。それと平行して、FVIIの活性の評価を、第1段階で説明された方法により実施した。こうして得られた活性化されたフラクション中のFVIIおよびFVIIaの活性の結果から、30.3のIU FVIIa/IU FVIIの比が示された。
Claims (17)
- 少なくとも1000IU/mgタンパク質の純度を有し、非ヒト由来のタンパク質を含まないことを特徴とするFVIIaの治療製剤。
- 純度が少なくとも6000IU/mgタンパク質であることを特徴とする請求項1に記載のFVIIaの治療製剤。
- FVIIaが少なくとも12000IU/mlの濃度で存在することを特徴とする請求項2に記載のFVIIaの治療製剤。
- FVIIaがヒト血漿に由来することを特徴とする請求項1に記載のFVIIaの治療製剤。
- 病原因子を排除する少なくとも1つの段階にかけたことを特徴とする請求項4に記載のFVIIaの治療製剤。
- FVIIを、FrII+III、FrIII、またはCohn分画の相当物から始めて精製し、PEGによる沈殿、クロマトグラフィー、およびその活性化を含むことを特徴とする請求項1乃至4のいずれか1項に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- FrII+III、FrIII、または相当物の懸濁液を、3から7%の間のPEG濃度で沈殿させることを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- FVIIを、イオン交換クロマトグラフィーにより捕捉することを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- クロマトグラフ溶離を、pHの変化により実施することを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- FVIIを、疎水性相互作用クロマトグラフィーにより精製することを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- 前記手順を、アンモニウム塩の非存在下で実施することを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- FVIIの精製の段階を、金属キレート・クロマトグラフィーにより実施することを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- 金属キレート樹脂がNiセファロースHPであることを特徴とする請求項12に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- FVIIを、カルシウムの存在下で活性化することを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- ウイルス除去の少なくとも1つの特定の段階を含むことを特徴とする請求項6に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- ナノ濾過によるウイルス除去の段階を含むことを特徴とする請求項15に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
- 溶媒/界面活性剤を用いた処理によるウイルス除去の段階を含むことを特徴とする請求項15に記載のFVIIaの治療製剤を得るための方法。
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