ES2906118T3 - Método cromatográfico para recolectar factor VII de coagulación sanguínea con alto rendimiento - Google Patents
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Abstract
Un método para purificar factor VII de coagulación sanguínea (Factor VII) y/o factor VII de coagulación sanguínea activado (Factor VII activado) a partir de una fracción obtenida a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado, que comprende las siguientes etapas: (a) una etapa de adsorción de Factor VII y/o Factor VII activado sobre una primera resina de intercambio aniónico fuerte mediante un método por lotes; (b) una etapa de adsorción del Factor VII y/o el Factor VII activado que permanece en una fracción que no experimenta adsorción en la etapa (a) sobre una segunda resina de intercambio aniónico fuerte mediante un método en columna; (c) una etapa de recuperación de Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción de adsorción en las etapas (a) y (b); en donde dichas resinas de intercambio aniónico fuerte de (a) y (b) no reciben ni pierden protones cuando cambia el pH.
Description
DESCRIPCIÓN
Método cromatográfico para recolectar factor VII de coagulación sanguínea con alto rendimiento
Campo técnico
La presente invención se refiere a un método para recolectar factor VII de coagulación sanguínea (Factor VII) y/o factor VII de coagulación sanguínea activado (Factor VII activado) a partir de fracciones obtenidas a partir de plasma con alto rendimiento.
Técnica antecedente
La coagulación de la sangre consiste en procesos de interacciones complejas de varios componentes o factores de la sangre para finalmente generar un coágulo de fibrina. En general, para los componentes de la sangre que participan en la reacción denominada cascada de coagulación de la sangre, existen dos sistemas independientes con los que se relaciona la hemostasia normal, denominándose estos sistemas "vía intrínseca" y "vía extrínseca". La vía intrínseca es una vía de reacción en la que se introduce la formación de trombina a través de aquellos factores que están presentes solo en el plasma. Un fenómeno intermedio de dicha vía es la activación del Factor IX (en lo sucesivo también denominado "FIX") catalizada por el Factor XI activado (en lo sucesivo también denominado "FXIa") e iones de calcio. A continuación, el Factor IX activado (en lo sucesivo, también denominado "FIXa") participa en la activación del Factor X (en lo sucesivo, también denominado "FX") en presencia de Factor VIII activado (en lo sucesivo, también denominado "FVIIIa"), fosfolípidos e iones de calcio.
La vía extrínseca es una vía de reacción en la que intervienen factores plasmáticos y factores presentes en extractos de tejidos. Uno de los factores de coagulación de la sangre, el Factor VII (en lo sucesivo, también denominado "FVII"), después de convertirse en Factor VII activado (en lo sucesivo, también denominado "FVIIa"), participa en la vía extrínseca activando FX a FXa en presencia de factores tisulares e iones de calcio. El FXa convierte a continuación la protrombina en trombina en presencia del Factor V activado (en lo sucesivo también denominado "FVa"), iones de calcio y fosfolípidos. La trombina generada actúa convirtiendo el fibrinógeno en fibrina para cerrar el sitio de la lesión vascular, lo que da como resultado la hemostasia.
Cuando estos factores en la cascada de coagulación de la sangre son deficientes o no funcionan normalmente, la coagulación de la sangre se impide y con frecuencia se muestran síntomas de sangrado. La mayoría de ellos son causados por predisposición genética. Como enfermedades típicas causadas por el trastorno congénito del factor de coagulación, son bien conocidas la hemofilia A con deficiencia de FVIII y la hemofilia B con deficiencia de FIX. Para el tratamiento de pacientes que padecen estas hemofilias, se han desarrollado preparaciones farmacéuticas que comprenden FVIII o FIX para el reemplazo de factores deficientes y se utilizan para el manejo hemostático. Esto se denomina terapia de reemplazo. Sin embargo, como consecuencia de esta terapia, se sabe que se generan anticuerpos (inhibidores) contra FVIII o FIX. Cuando se generan inhibidores, la terapia de reemplazo convencional deja de ser efectiva, lo que dificulta bastante el manejo hemostático de los pacientes.
Para el tratamiento de pacientes con hemofilia que tienen inhibidores, se ha llevado a cabo el tratamiento con producto concentrado de complejo de protrombina activado que se sabe que consiste en una mezcla de enzimas de coagulación activadas, incluido FVIIa, y enzimas de coagulación inertes. En los últimos años, se ha esclarecido que una preparación de un solo ingrediente activo de FVIIa es eficaz para suprimir el sangrado progresivo grave de pacientes con hemofilia que tienen un alto nivel de anticuerpos anti-FVIII en plasma y, por lo tanto, se han utilizado preparaciones de FVIIa (Referencia no relacionada con patentes 1).
El FVII es una glicoproteína de una sola hebra y es uno de los factores de coagulación dependientes de la vitamina K que, además del FVII, consisten en protrombina, FIX, FX, proteína C, proteína S y proteína Z y se denominan familia de la protrombina debido a su alta homología estructural. El FVII se biosintetiza principalmente en el hígado. Se sabe que el FVII está presente en el plasma humano como precursor del FVII, aproximadamente 1 % del cual está presente como FVIIa (Referencia no relacionada con patentes 2). FVII es una proteína fisiológicamente importante que forma un complejo con el Factor Tisular y es responsable de la reacción de iniciación de la coagulación sanguínea. Por otro lado, FVIIa es una glicoproteína de doble hebra formada después de una descomposición restringida en el enlace Arg152-Ile153 de FVII. Se sabe que FVIIa tiene una actividad de coagulación 25 veces mayor que la de FVII y es útil para el tratamiento de pacientes con hemofilia que tienen anticuerpos contra FVIII y FIX para los que hasta ahora se pensaba que el manejo hemostático era difícil como se mencionó anteriormente.
Como se mencionó anteriormente, dado que las preparaciones de FVIIa son eficaces para el tratamiento de pacientes con hemofilia que tienen inhibidores, se han intentado varios métodos para preparar FVII obtenido a partir de plasma. Sin embargo, estos métodos de preparación solo pudieron lograr una purificación parcial de FVII, pero no pudieron tener éxito en el aislamiento de FVII per se como sustancia pura (Referencias no relacionadas con patentes 3 a 5).
Dadas las circunstancias, se informa de que FVII podría prepararse bien mediante un método de purificación que comprendiera el tratamiento de adsorción con cloruro de valio y precipitación por adición de sal con sulfato de amonio, y cromatografía de intercambio iónico y filtración en gel (Referencia no relacionada con patentes 6).
Para una producción a gran escala de producto concentrado de FVII obtenido a partir de plasma humano, se divulga un método para la purificación a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado humano en el que la fracción rica en factor de coagulación dependiente de vitamina K se obtiene primero mediante un tratamiento de intercambio aniónico y, a continuación, los anticuerpos monoclonales específicos de la conformación de FVII, que pueden adsorber FVII en presencia de iones metálicos, se utilizan como inmunoabsorbentes (Referencia no relacionada con patentes 7).
Asimismo, se divulga un método para preparar FVII y/o FVIIa utilizando un absorbente al que se fijan anticuerpos monoclonales específicos de la conformación de FVII humano (Referencia relacionada con patentes 1). Este método, mediante la aplicación de anticuerpos monoclonales contra FVII y/o FVIIa, que distinguen diferencias conformacionales debidas a la presencia y ausencia de unión de cationes metálicos, a la cromatografía inmunoabsorbente, permite la elución y purificación de FVII y/o FVIIa de interés sin la utilización de un desnaturalizante potente.
Adicionalmente, se informa de que FVII podría prepararse bien mediante un método de purificación que comprendiera cromatografía hidrófoba con Fenil-Sefarosa-HP y cromatografía de filtración en gel con XK26/100 Superose 12, después de tratamiento de adsorción con Al(OH)3 y cromatografía de intercambio iónico con TMAE-EMD y el procedimiento de calentamiento de la liofilización (Referencia relacionada con patentes 2).
Técnica anterior
Referencias relacionadas con patentes
Referencia relacionada con patentes 1: JP 03-155797 (Patente Japonesa 2824430)
Referencia relacionada con patentes 2: JP 2002-518411
Referencias no relacionadas con patentes
Referencia no relacionada con patentes 1: Hedner et al., J. Clin. Invest. 71, pág.1836 (1983) Referencia no relacionada con patentes 2: Peter, W., et al., Blood, 80, pág. 25-28, (1992)
Referencia no relacionada con patentes 3: Prydz, J. Scand. J. Clin. Lab. Invest. 1, pág. 101 (1964); Gladhaug, A. et al., Biochim. Biophys. Acta 215, pág. 105, (1970)
Referencia no relacionada con patentes 4: Laake, K. et al., Thromb. Res. 5, pág. 539, (1974); Schiffman, S. et al., Thromb Res. 6, pág. 273 (1975)
Referencia no relacionada con patentes 5: Osterud,B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 74, pág. 5260 (1977)
Referencia no relacionada con patentes 6: Broze, Jr. G. J. et al., J. Biol. Chem. 255, pág. 1242 (1980) Referencia no relacionada con patentes 7: Tomokiyo et al., Vox Sanguinis, 2003, 84, pág. 54-64 Referencia no relacionada con patentes 8: PRODUCTION OF PLASMA PROTEINS FOR THERAPEUTIC USE pág. 68 (2013) de John Wiley & Sons, Inc., Hoboken, Nueva Jersey
Divulgación de la invención
(Problema Técnico que debe resolver la invención)
Con los métodos convencionales descritos anteriormente, aunque se puede obtener un producto concentrado de FVII de alta pureza, un problema importante ha sido una baja tasa de recuperación de producto concentrado de FVII a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado humano. La razón de esto es que el FVII tiene una menor afinidad por un intercambiador de aniones en comparación con otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K similares (Referencia no relacionada con patentes 6) y también que el FVII tiene una concentración extremadamente baja en el plasma humano (Tabla 1; Referencia relacionada con patentes 8). En general, se sabe que el plasma pobre en producto crioprecipitado humano tiene tendencia a solidificarse cuando se somete a una resina de intercambio aniónico fuerte y esta es también una de las razones de la baja tasa de recuperación.
Tabla 1
Concentración de plasma FII FVII FIX FX
|jg/mL 0,4-0,6 3-5 7-10
nM 1100-1250 8-1,2 54-89 120-170
(continuación)
Concentración de plasma Proteína C Proteína S Proteína Z
|jg/mL 3-5 22 1,2-2,9
nM 48-81 285 19-47
Lo que se cree que es la causa de la baja tasa de recuperación es que, cuando el FVII se recupera del plasma humano a través de la adsorción sobre una resina de intercambio aniónico, una porción de FVII podría pasar a una fracción no adsorbida como consecuencia de la competencia con otros factores de coagulación dependientes de la vitamina K que tienen una mayor afinidad por un intercambiador de aniones que la del FVII. De acuerdo con el método de producción a gran escala de la Referencia no relacionada con patentes 7, se aplica plasma pobre en producto crioprecipitado humano a una resina de intercambio aniónico (Q-FF) para adsorber y recolectar factores de coagulación dependientes de vitamina K, incluido FVII, siendo la tasa de recuperación de FVII tan baja como 70%, lo que sugiere que una porción de FVII podría permanecer en una fracción que no experimenta adsorción.
(Medios para resolver los problemas)
Los autores de la presente invención han estudiado seriamente para resolver los problemas anteriores. Como resultado, los autores de la presente invención han descubierto que el FVII y/o el FVIIa de interés se pueden recolectar con una tasa de recuperación de hasta 90% o más dejando que el FVII y/o el FVIIa que no se adsorben sobre una primera resina de intercambio aniónico y permanecen en una fracción que no experimenta adsorción sean adsorbidos sobre una segunda resina de intercambio aniónico para así completar la presente invención.
Por lo tanto, la presente invención proporciona un método cromatográfico para recolectar FVII y/o FVIIa del plasma con una alta tasa de recuperación y específicamente como se define en las reivindicaciones.
Efectos de la divulgación
En la actualidad se divulga un método caracterizado porque, cuando la fracción obtenida a partir de plasma se trata con una resina de intercambio aniónico, el FVII y/o el FVIIa que permanecen en una fracción que no experimenta adsorción se recolectan mediante tratamiento con una segunda resina de intercambio aniónico. Dado que los factores de coagulación dependientes de la vitamina K distintos del FVII se eliminan mediante el primer tratamiento con resina de intercambio aniónico, la concentración de FVII y/o FVIIa en las proteínas presentes en una fracción que no experimenta adsorción aumenta relativamente, lo que permite una recolección eficaz de FVII y/o FVIIa por medio del segundo tratamiento con resina de intercambio aniónico.
Asimismo, de acuerdo con la presente divulgación, se puede suprimir la tendencia a la solidificación en el momento en el que la fracción obtenida a partir de plasma se trata con una resina de intercambio aniónico y se pueden recolectar FVII y/o FVIIa a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado humano con un rendimiento tan alto como 90% o más.
Mejor modo para realizar la divulgación
Una resina de intercambio aniónico como se emplea en el presente documento puede ser una resina de intercambio aniónico fuerte o una resina de intercambio aniónico débil y puede ser una en la que se introduce un grupo de intercambio aniónico en la superficie de una matriz portadora preparada a partir de cualquier material generalmente utilizado en la técnica relevante tal como, por ejemplo, polímeros naturales (celulosa, dextrano, agarosa) y polímeros sintéticos (copolímero de estireno/divinilbenceno, poli(alcohol acrílico), poli(alcohol vinílico, etc.), material inorgánico (gel de sílice, alúmina, zirconia) y similares.
Un grupo de intercambio aniónico incluye, pero no se limita a, material que tiene un grupo de carga positiva seleccionado del grupo que consiste en dietilaminoetilo (DEAE), dimetilaminoetilo (DMAE), dietilaminopropilo (DEAP), polietilenimina (PEI), aminoalquilo cuaternario, trimetilaminoetilo (TMAE), aminoetilo cuaternario (QAE) y amonio cuaternario (Q).
Un grupo de intercambio aniónico incluye fuertes y débiles. Que un grupo de intercambio aniónico sea fuerte o débil no se determina por su fuerza para unirse a una proteína, sino porque su unión con iones sea difícil de cambiar por la variación del pH (fuerte) o sea probable que se vea afectada por la variación del pH (débil).
Un intercambiador de aniones fuerte es aquel en el que la capacidad de intercambio de iones no cambia incluso si cambia el pH. Un intercambiador de aniones fuerte no recibe ni pierde protones cuando cambia el pH y, por lo tanto, mantiene una condición cargada en un amplio intervalo de pH. Como intercambiador de aniones fuertes, se conocen TMAE, QAE, Q, PEI y similares.
Por otro lado, un intercambiador de aniones débil es aquel en el que el grado de disociación de un intercambiador de iones, es decir, la capacidad de intercambio de iones, cambia notablemente según el pH. Un intercambiador de aniones débil recibe o pierde protones cuando cambia el pH y, por lo tanto, la capacidad de intercambio de iones varía según el pH. Como intercambiadores de aniones débiles, se conocen DEAE, DMAE, DEAP y similares.
Una resina de intercambio aniónico disponible comercialmente incluye, por ejemplo, las siguientes:
DEAE-Sephacel (marca registrada), DEAE-Sephadex (marca registrada), DEAE-Sepharose CL6B (marca registrada), DEAE-Sepharose Fast Flow (marca registrada), ANX-Sepharose Fast Flow (marca registrada), QAE-Sephadex (marca registrada), Q-Sepharose Fast Flow (marca registrada), Q-Sepharose High Performance (marca registrada), Q-Sepharose Bid Beads (marca registrada) (todas de GE Healthcare); DEAE-Tris-Acryl (marca registrada), DEAE-Spherodex (marca registrada), Q-Hyper-D (marca registrada) (todas de Sepracor);
Macroprep DEAE (marca registrada), Macroprep Q (marca registrada) (todas de Bio-Rad);
DEAE-Toyopearl (marca registrada), QAE-Toyopearl (marca registrada), Toyopearl Super-Q (marca registrada) (todas de Tosoh);
Proteína PAK DEAE (Waters);
Fractogel EMD-TMa E (marca registrada), Fractogel END-DEAE (marca registrada), Fractogel EMD-DMAE (marca registrada), Liocrospher 1000 TMAE (marca registrada), Licrospher 1000 DEAE (marca registrada) y Licrospher 4000 DMAE (marca registrada) (todas de MERCK-MILLIPo Re ).
Para su uso en el método de acuerdo con la presente divulgación,
la primera y segunda resinas de intercambio aniónico pueden ser iguales o diferentes entre sí. Adicionalmente, se pueden utilizar varios tipos de resinas de intercambio aniónico combinadas dependiendo de la selectividad de las resinas que se vayan a utilizar. Además, una etapa de adsorción a la primera y la segunda resinas de intercambio aniónico utilizadas en la presente divulgación
puede ser un método en columna, un método por lotes o una combinación de ambos métodos.
Un método en columna es aquel en el que se vierte una muestra en un extremo de una columna de un tubo largo (en muchos casos, de vidrio, plástico tal como polipropileno, inoxidable, etc.) en el que se carga una resina de intercambio aniónico. Por otro lado, un método por lotes es aquel en el que se colocan una resina de intercambio aniónico y una muestra en el mismo recipiente y la mezcla se agita durante un período fijo de tiempo. Una vez completada la adsorción, la mezcla se puede cargar en una columna para combinarla con un método en columna. La presente invención se explica con más detalle con los siguientes ejemplos, pero no se limita a los mismos.
Ejemplo 1
Cromatografía en dos etapas: Q-Sepharose Fast Flow (Q-FF; método por lotes) ^ Q-Sepharose Fast Flow (Q-FF; método en columna)
Se aplicó plasma pobre en producto crioprecipitado humano (24 L; cantidad de antígeno FVII: aproximadamente 25 000 U) a una primera resina de intercambio aniónico (gel Q-FF: 0,6 L) (método por lotes) y la fracción que no experimenta adsorción obtenida se aplicó adicionalmente a una segunda resina de intercambio aniónico (Q-FF gel: 1 L) (método en columna). La primera y la segunda resinas de intercambio aniónico se unieron entre sí y se lavaron con tampón de citrato 10 mM (pH 7; 3 L) que comprendía cloruro de sodio 0,2 M y la segunda resina de intercambio aniónico sola se lavó con el mismo tampón (2 L). Después del lavado, la primera y la segunda resinas de intercambio aniónico se unieron de nuevo y la elución se llevó a cabo con tampón de citrato 20 mM (pH 7) que comprendía cloruro de sodio 0,7 M.
Como resultado, la tasa de recuperación de FVII a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado humano (una tasa de recuperación de antígeno FVII) fue de 94 % después del tratamiento con las dos resinas de intercambio aniónico (Tabla 3) para lograr una tasa de recuperación más alta que la de la técnica anterior. (Tabla 2; Referencia no relacionada con patentes 7). Asimismo, la proporción de cantidad de antígeno FVII/cantidad de proteína total (grado de purificación) aumentó suficientemente con respecto a la del plasma humano (Tabla 3).
Tabla 2
Etapa Tasa de recuperación (%) del antígeno FVII
Plasma pobre en producto crioprecipitado 100
Q-FF 70±3,2 (n=50)
Tabla 3
Etapa Proporción de cantidad de antígeno FVII/cantidad de Tasa de recuperación (%) del proteína total (U/mg) antígeno FVII
Plasma pobre en 0,02±0,0006 (n=6) 100
producto crioprecipitado
Q-FF^Q-FF 0,79±0,04 (n=6)
Ejemplo 2
Inmunoadsorción con anticuerpo monoclonal anti-FVII
La fracción de elución de las resinas de intercambio aniónico de dos etapas (Q-FF ^ Q-FF) obtenida en el Ejemplo 1 se aplicó adicionalmente a un anticuerpo monoclonal específico de conformación anti-FVII que puede adsorber FVII en presencia de iones de calcio de acuerdo con el método de la Referencia no relacionada con patentes 7 para purificar FVII. Como resultado, la tasa de recuperación de FVII a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado humano fue de 92% (Tabla 4) para lograr una tasa de recuperación más alta que la del método de la Referencia no relacionada con patentes 7 (Tabla 5).
Tabla 4
Etapa Tasa de recuperación (%) del antígeno FVII Plasma pobre en producto crioprecipitado 100
Gel con mAb inmovilizado 92±11,9 (n=6)
Tabla 5
Etapa Tasa de recuperación (%) del antígeno FVII Plasma pobre en producto crioprecipitado 100
Gel con mAb inmovilizado 60±2,5 (n=50)
Ejemplo 3
Cromatografía en dos etapas: DEAE-Sepharose Fast Flow (DEAE-FF) ^ Q-Sepharose Fast Flow (Q-FF)
Se aplicó plasma pobre en producto crioprecipitado humano (3 L; cantidad de antígeno FVII: aproximadamente 3000 U) a una primera resina de intercambio aniónico (gel DEAE-FF: 84 mL) y la fracción que no experimenta adsorción obtenida se aplicó posteriormente a una segunda resina de intercambio aniónico (gel Q-FF: 135 mL). La primera y la segunda resinas de intercambio aniónico se unieron entre sí y se lavaron con tampón de citrato 10 mM (pH 7; 420 mL) que comprendía cloruro de sodio 0,2 M y la segunda resina de intercambio aniónico sola se lavó con el mismo tampón (270 ml). Después del lavado, la primera y la segunda resinas de intercambio aniónico se unieron de nuevo y la elución se llevó a cabo con tampón de citrato 20 mM (pH 7) que comprendía cloruro de sodio 0,7 M.
Como resultado, la tasa de recuperación de FVII a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado humano (tasa de recuperación de antígeno FVII) fue de 95% después del tratamiento con las dos resinas de intercambio aniónico, logrando una tasa de recuperación más alta que la de la técnica anterior (Tabla 2; Referencia no relacionada con patentes 7). Asimismo, la proporción de cantidad de antígeno FVII/cantidad de proteína total (grado de purificación) aumentó suficientemente con respecto a la del plasma humano (Tabla 6).
Tabla 6
Etapa Proporción de cantidad de antígeno FVII/cantidad Tasa de recuperación (%) del de proteína total (U/mg) antígeno FVII
Plasma pobre en producto 0,02 (n=1) 100
crioprecipitado
DEAE-FF^Q-FF 0,58 (n=1) 95 (n=1)
Comparando las dos resinas de intercambio aniónico para una proporción de cantidad de antígeno FVII/cantidad de proteína total (proporción de la cantidad de antígeno FVII con respecto a la cantidad de factores de coagulación dependientes de vitamina K) de las respectivas fracciones de adsorción cuando el lavado y la elución se realizaron por separado con cada de las dos resinas de intercambio aniónico, la segunda resina de intercambio aniónico (Q-FF) tenía una proporción extremadamente más alta (Tabla 7). Este resultado sugirió que los factores de coagulación dependientes de la vitamina K distintos del FVII se eliminaron mediante el tratamiento con la primera resina de intercambio aniónico (DEAE-FF) para aumentar así relativamente la concentración de FVII en los factores de coagulación dependientes de la vitamina K presentes en una fracción que no experimenta adsorción, para permitir la recolección eficaz de FVII mediante el segundo tratamiento con resina de intercambio aniónico.
Tabla 7
Etapa Cantidad de antígeno Proporción de cantidad de antígeno FVII/cantidad de FVII (U) proteína total (U/mg)
DEAE- fracción de 4 (n=1) 0,004 (n=1)
FF adsorción
Q-FF fracción de 2,159 (n=1) 0,87 (n=1)
adsorción
Aplicabilidad industrial
La presente invención se puede utilizar como un método para recolectar Factor VII y/o Factor VII activado de fracciones obtenidas a partir de plasma.
Claims (10)
1. Un método para purificar factor VII de coagulación sanguínea (Factor VII) y/o factor VII de coagulación sanguínea activado (Factor VII activado) a partir de una fracción obtenida a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado, que comprende las siguientes etapas:
(a) una etapa de adsorción de Factor VII y/o Factor VII activado sobre una primera resina de intercambio aniónico fuerte mediante un método por lotes;
(b) una etapa de adsorción del Factor VII y/o el Factor VII activado que permanece en una fracción que no experimenta adsorción en la etapa (a) sobre una segunda resina de intercambio aniónico fuerte mediante un método en columna;
(c) una etapa de recuperación de Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción de adsorción en las etapas (a) y (b);
en donde dichas resinas de intercambio aniónico fuerte de (a) y (b) no reciben ni pierden protones cuando cambia el pH.
2. El método de la reivindicación 1, en donde las etapas (a) a (c) permiten la recolección de Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción obtenida a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado con un rendimiento de 75% o más.
3. El método de la reivindicación 2, en donde las etapas (a) a (c) permiten la recolección de Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción obtenida a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado con un rendimiento de 90% o más.
4. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde las resinas de intercambio aniónico fuerte de (a) y (b) son una resina con un grupo de carga positiva seleccionado del grupo que consiste en trimetilaminoetilo (TMAE), polietilenimina (PEI), aminoalquilo cuaternario, aminoetilo cuaternario (QAE) y amonio cuaternario (Q).
5. El método de la reivindicación 4, en donde ambas resinas de intercambio aniónico fuerte de (a) y (b) son una resina con amonio cuaternario (Q).
6. Un método para purificar Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción obtenida a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado, que comprende las siguientes etapas:
(d) una etapa de adsorción de Factor VII y/o Factor VII activado sobre una resina de intercambio aniónico débil mediante un método en columna;
(e) una etapa de adsorción de Factor VII y/o Factor VII activado que permanece en una fracción que no experimenta adsorción en la etapa (d) sobre una resina de intercambio aniónico fuerte mediante un método en columna;
(f) una etapa de recuperación de Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción de adsorción en las etapas (d) y (e);
en donde dicha resina de intercambio aniónico débil de (d) recibe o pierde protones cuando cambia el pH; y en donde dicha resina de intercambio aniónico fuerte de (e) no recibe ni pierde protones cuando cambia el pH.
7. El método de la reivindicación 6, en donde las etapas (d) a (f) permiten la recolección de Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción obtenida a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado con un rendimiento de 75% o más.
8. El método de la reivindicación 7, en donde las etapas (d) a (f) permiten la recolección de Factor VII y/o Factor VII activado de una fracción obtenida a partir de plasma pobre en producto crioprecipitado con un rendimiento de 90% o más.
9. El método de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, en donde la resina de intercambio aniónico débil de (d) es una resina con un grupo de carga positiva de dietilaminoetilo (DEAE), dimetilaminoetilo (DMAE) o dietilaminopropilo (DEAP), y la resina de intercambio aniónico fuerte de (e) es una resina con un grupo de carga positiva seleccionado del grupo que consiste en trimetilaminoetilo (TMAE), polietilenimina (PEI), aminoalquilo cuaternario, aminoetilo cuaternario (QAE) y amonio cuaternario (Q).
10. El método de la reivindicación 9, en donde la resina de intercambio aniónico débil de (d) es una resina con dietilaminoetilo (DEAE), y la resina de intercambio aniónico fuerte de (e) es una resina con amonio cuaternario (Q).
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