ES2792473T3 - Método para purificar proteínas PEGiladas - Google Patents

Abstract

Un método para purificar una proteína PEGilada que comprende cromatografía de intercambio aniónico con un tampón de elución, caracterizado porque dicha cromatografía comprende una etapa de eliminación de impurezas antes de la elución en donde dicha etapa de eliminación de impurezas comprende lavar dicha columna de intercambio aniónico con un tampón ácido a un pH de entre 3,9 y 4,5, en donde la proteína PEGilada se selecciona del grupo que consiste en Factor II (FII), Factor VII (FVII), Factor IX (FIX), Factor X (FX), proteína S y proteína C.

Description

DESCRIPCIÓN

Método para purificar proteínas PEGiladas

Campo de la invención

La invención se refiere a un método para purificar proteínas PEGiladas mediante la eliminación de impurezas de muestras que contienen proteínas PEGiladas, en particular, pero no exclusivamente, factores de coagulación de la sangre dependientes de la vitamina K tal como el Factor IX (FIX), a proteínas purificadas por dicho método y al uso de dichas proteínas purificadas en la terapia, en particular pero no exclusivamente, para el tratamiento de enfermedades aliviadas mediante factores de coagulación de la sangre tales como el tratamiento profiláctico de la hemofilia.

Antecedentes de la invención

La coagulación de la sangre es un proceso que consiste en una interacción compleja de varios componentes o factores de la sangre, que finalmente da lugar a un coágulo de fibrina. En general, los componentes de la sangre que participan en lo que se ha denominado la "cascada" de la coagulación son las proenzimas o zimógenos, proteínas enzimáticamente inactivas que se convierten en enzimas proteolíticas por la acción de un activador, que en sí mismo es un Factor de coagulación activado. Los factores de coagulación que han sufrido tal conversión generalmente se denominan como "factores activos" y se designan mediante la adición de un sufijo "a" en minúsculas (por ejemplo, Factor VIIa).

Se requiere el Factor X activado ("Xa") para convertir la protrombina en trombina, que luego convierte el fibrinógeno en fibrina como una etapa final en la formación de un coágulo de fibrina. Hay dos sistemas, o vías, que promueven la activación del Factor X. La "vía intrínseca" se refiere a aquellas reacciones que conducen a la formación de trombina mediante la utilización de factores presentes solo en el plasma. Una serie de activaciones mediadas por proteasas finalmente genera el Factor IXa, que, junto con el Factor VIIIa, divide el Factor X en Xa. El Factor VIIa y su Cofactor, factor tisular, efectúan una proteólisis idéntica en la "vía extrínseca" de la coagulación de la sangre. El factor tisular es una proteína unida a la membrana y normalmente no circula en el plasma. Sin embargo, al romperse los vasos, puede formar complejos con el Factor VIIa para catalizar la activación del Factor X o la activación del Factor IX en presencia de Ca2+ y fosfolípidos. La importancia relativa de las dos vías de coagulación en la hemostasia aún no está clara.

El Factor IXa (FIXa) es una serina proteasa similar a tripsina que cumple un papel clave en la hemostasia mediante la generación, como parte del complejo de Xasa, de la mayoría del Factor Xa requerido para respaldar una formación de trombina adecuada durante la coagulación (revisado en Hoffman M. y Monroe D. M., III (2001) A cellbased model of hemostasis. Thromb Haemost 85, 958-965). La deficiencia congénita de la actividad del Factor IXa es la causa de la hemofilia B, trastorno hemorrágico ligado al cromosoma X, que afecta aproximadamente a 1: 100 000 hombres. Estos pacientes con hemofilia se tratan actualmente mediante terapia de reemplazo con Factor IX de coagulación recombinante o derivado de plasma.

El Factor IX es un factor de coagulación dependiente de vitamina K con similitudes estructurales al Factor VII, Factor X, y proteína C. La forma de zimógeno circulante, que tiene una vida media en plasma de aproximadamente 18-30 horas, consiste en 415 aminoácidos divididos en cuatro dominios distintos que comprenden un dominio N-terminal rico en ácido Y-carboxiglutámico (Gla), dos dominios EGF y un dominio C-terminal serina proteasa similar a tripsina. La activación del Factor IX ocurre mediante proteólisis limitada en Arg145-Ala146 y Arg180-Val181 liberando un fragmento de 35 aa, el llamado péptido de activación (Schmidt A.E. y Bajaj S.P. (2003) Structure-function relationships in Factor IX and Factor IXa. Trends Cardiovasc Med 13, 39-45). El péptido de activación es fuertemente glicosilado y contiene dos glicanos ligados a N y hasta cuatro glicanos ligados a O.

La prolongación de la vida media circulante de las proteínas puede lograrse mediante la modificación de la estructura nativa de las proteínas. La PEGilación es un método establecido para prolongar la vida media circulante de las proteínas. La glicoPEGilación del Factor IX (FIX) da como resultado diversas especies PEGiladas, tales como especies mono, di y tri-PEGiladas. Tal disposición proporciona, por lo tanto, la posibilidad de formación de diversas especies mono-PEGiladas y di-PEGiladas. Se ha identificado que las formas mono-PEGiladas poseen un perfil farmacológico conveniente y, por lo tanto, se han elegido como el candidato farmacéutico preferido. Por lo tanto, es conveniente aislar las formas mono-PEGiladas de una mezcla de especies PEGiladas y no PEGiladas.

Además de la separación de especies PEGiladas entre sí y de especies no PEGiladas, el proceso de purificación debe proporcionar una reducción suficiente de los reactivos usados en la reacción. Se requiere desarrollar un método que garantice la calidad deseada del producto y será ventajoso desarrollar una sola etapa de purificación que pueda proporcionar una reducción suficiente de las impurezas relacionadas con el proceso (como reactivos de PEGilación, enzimas, derivados de los reactivos), así también impurezas relacionadas con el producto (como especies no PEGiladas).

El documento US 2008/207879 (Baxter Int) describe un proceso de purificación para rFIX que comprende cargar el producto en una columna de intercambio aniónico y lavar la columna con una concentración de sales de más de 200 mM y eluir con un tampón de elución que contiene cationes divalentes.

El documento WO96/40731 se refiere a la purificación de conjugados Alg-mPEG mediante cromatografía de intercambio aniónico.

El documento WO2007/022512 se refiere a la purificación del Factor VIIa-SA-PEG mediante cromatografía de intercambio aniónico.

Resumen de la invención

La presente invención se define por las reivindicaciones. Cualquier tema que quede fuera del alcance de las reclamaciones se proporciona solo a título informativo.

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar una proteína PEGilada que comprende cromatografía de intercambio aniónico con un tampón de elución, caracterizado porque dicha cromatografía comprende una etapa de eliminación de impurezas antes de la elución en donde dicha etapa de eliminación de impurezas comprende lavar dicha columna de intercambio aniónico con un tampón ácido.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 muestra un cromatograma obtenido con el método de purificación de la invención.

Descripción detallada de la invención

De acuerdo con un primer aspecto de la invención, se proporciona un método para purificar una proteína PEGilada que comprende cromatografía de intercambio aniónico con un tampón de elución, caracterizado porque dicha cromatografía comprende una etapa de eliminación de impurezas antes de la elución en donde dicha etapa de eliminación de impurezas comprende lavar dicha columna de intercambio aniónico con un tampón ácido.

El método de purificación de la invención proporciona una serie de ventajas sobre los procesos de purificación descritos anteriormente. Sorprendentemente, se ha descubierto que la proteína PEGilada (por ejemplo, FIX) a pesar del tampón ácido, todavía está unida a la resina durante el lavado. Hasta ahora, el factor de purificación (la relación de la concentración de proteína PEGilada e impurezas) es sorprendentemente alto.

Por ejemplo, el contenido de ST3Gal3 en las fracciones resultantes se redujo significativamente en la presente invención. ST3Gal3 es una enzima de PEGilación usada durante el proceso de GlicoPEGilación. La presencia de tal enzima en las fracciones resultantes es claramente inconveniente porque puede producirse una PEGilación adicional después del proceso de purificación. Además, la enzima residual se considera como una impureza y existe el deseo de reducir la cantidad de enzima residual a niveles muy bajos en las preparaciones farmacéuticas de rFIXa mono-PEGilado.

La etapa de lavado ácido de la invención también proporciona la ventaja de inactivar cualquier virus sensible al pH que pueda estar presente dentro de la muestra.

La invención también proporciona la ventaja adicional de permitir la purificación en una sola etapa cromatográfica. Las proteínas PEGiladas pueden obtenerse por uno de los métodos conocidos en la literatura y conocidos por el experto en la técnica. Los documentos WO 2005/055950 y WO 2006/127896 describen métodos para la PEGilación de FIX donde el grupo PEG está unido enzimáticamente a un grupo glicosilo. La mezcla de reacción de PEGilación sometida a purificación por el método de la invención puede obtenerse por GlicoPEGilación o por otros métodos de PEGilación conocidos.

Aunque la purificación de proteínas PEGiladas constituye un aspecto particular de la invención, el método también se puede aplicar igualmente a la purificación de proteínas que están unidas a polímeros distintos al PEG, tal como el ácido polisiálico.

En una modalidad, el tamaño del grupo PEG unido varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 KD.

En una modalidad, la impureza eliminada por la etapa de lavado ácido es ST3Gal3.

En una modalidad, la etapa de eliminación de impurezas comprende lavar con un tampón ácido a un pH de entre 3,8 y 5,0 (es decir, a un pH de cualquiera de 3,9, 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4, 4,5, 4,6, 4,7, 4,8,4,9 o 5,0), tal como entre 4,0 y 4,5 (es decir, a un pH de uno cualquiera de 4,0, 4,1, 4,2, 4,3, 4,4 o 4,5), por ejemplo, entre 4,0 y 4,4, en particular entre 4,1 y 4,3, la mayoría particularmente 4,1, 4,2 o 4,3. La ventaja de realizar la etapa de eliminación de impurezas a un pH inferior a 4,5 es que la proteína PEGilada se unirá fuertemente a dicho pH debido a la presencia de dominios de unión a Ca2+, por lo tanto, el lavado ácido puede usarse para reducir la concentración de otros contaminantes que tienen un punto isoeléctrico más alto que la proteína PEGilada.

Se apreciará que comprenderá cualquier tampón adecuado capaz de reducir el pH por debajo de aproximadamente 4,5, sin embargo, adecuadamente el tampón no comprenderá un catión divalente. En una modalidad, el tampón ácido comprende acetato de sodio y/o ácido acético. En una modalidad adicional, el tampón ácido comprende 50 mmol de acetato de sodio y 140 mmol de ácido acético. Se apreciará que pueden usarse concentraciones más bajas de acetato de sodio y ácido acético, sin embargo, es importante que la relación entre estos dos componentes se mantenga constante y que la etapa de lavado ácido sea lo suficientemente larga como para reducir el pH a menos de 4,5.

Se apreciará que la etapa de lavado ácido se realiza antes de la elución y después de la aplicación de la muestra a la columna de intercambio aniónico. En una modalidad, se realiza una etapa de equilibrado antes de la etapa de aplicación de la muestra. El beneficio de realizar una etapa de equilibrado es que la proteína PEGilada no unida se lava a través de la columna de intercambio aniónico. En una modalidad adicional, la etapa de equilibrado comprende la aplicación de un tampón de equilibrado a un pH de entre 5 y 7. La ventaja de realizar una etapa de equilibrado a un pH de entre 5 y 7 es que la impureza CMP-NAN sorprendentemente no se une a la columna de intercambio aniónico a tal pH y, por lo tanto, se elimina en el flujo.

En una modalidad, se realiza una segunda etapa de equilibrio antes de la etapa de lavado ácido, aunque se apreciará que tal segunda etapa de equilibrio podría omitirse (por ejemplo, a la etapa de lavado ácido podría seguir directamente la etapa de aplicación de la muestra). La ventaja de realizar una etapa de equilibrado antes de la etapa de lavado ácido es el hecho de que ST3Gal3 se eluye selectivamente en un desplazamiento de pH o gradiente de pH desde las condiciones de equilibrado (por ejemplo, a un pH de entre 5 y 7) y las condiciones de lavado ácido (por ejemplo, en un pH de entre 4 y 4,5). En otra modalidad adicional, la etapa de equilibrado comprende la aplicación de un tampón de equilibrado a un pH de 6, tal como un tampón que contiene histidina a un pH de 6.

En una modalidad, el tampón de equilibrado comprende acetato de sodio y ácido acético. En una modalidad adicional, el tampón de equilibrado comprende ácido acético 10 mM y acetato de sodio 90 mM.

Se apreciará que la muestra PEGilada puede aplicarse a la columna de intercambio aniónico después de la etapa de equilibrio (es decir, después de la etapa de equilibrado pero antes de la etapa de lavado con ácido). La muestra PEGilada también se puede aplicar directamente durante la etapa de lavado ácido a pH 4-4,5, sin embargo, aunque esto dará como resultado una unión significativamente menor de ST3Gal3, también es posible que la capacidad de la columna de intercambio aniónico para unir la muestra PEGilada pueda reducirse.

En una modalidad, se realiza una tercera etapa de equilibrado después de la etapa de lavado ácido pero antes de la elución.

En una modalidad, la proteína PEGilada es una proteína dependiente de la vitamina K, tal como un factor de coagulación de la sangre dependiente de la vitamina K. En una modalidad adicional, el factor de coagulación de la sangre dependiente de vitamina K comprende un factor de coagulación de la sangre que contiene galactosa. En aún una modalidad adicional, el factor de coagulación de la sangre dependiente de vitamina K se selecciona de Factor II (FII), Factor VII (FVII), Factor IX (FIX), Factor X (FX), proteína S y proteína C. En aún una modalidad adicional, el factor de coagulación de la sangre dependiente de vitamina K es Factor IX (FIX) o Factor VII (FVII). En todavía una modalidad adicional, el factor de coagulación de la sangre dependiente de vitamina K es el Factor IX (FIX).

En una modalidad de cualquiera de los aspectos antes mencionados de la invención, el Factor IX se selecciona de cualquiera de los derivados del Factor IX descritos en los documentos WO 03/031464, US 2005/0106658, WO 2004/099231, US 2004/0132640, US 2005/0100982, US 2004/0137557, US 2006/0030521, US 2004/0063911, US 2006/0040856, WO 2005/055950, WO 2006/127896 y WO 2008/119815. En una modalidad adicional, el Factor IX es PEG40k-FIX, como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO 2008/119815.

En una modalidad, donde el Factor IX es PEG40k-FIX, el límite inferior del valor de pH para el tampón ácido de la etapa de eliminación de impurezas es de aproximadamente pH 3,7 - 3,8 dado que PEG40k-FIX eluye a este pH. Se apreciará que la cromatografía de intercambio aniónico puede realizarse de acuerdo con procedimientos conocidos por la persona experta. Los ejemplos de materiales de intercambio aniónico adecuados incluyen: Q-resina, una Amina cuaternaria y resina DEAE, DiEtilAminoEtano. Las resinas de intercambio aniónico están disponibles comercialmente, por ejemplo, Mono Q Source 15Q o 30Q (GE-health care), Poros 20HQ o 50HQ (Applied Biosystems), Toyopearl Q650S (Toso Haas) y otras.

En una modalidad, el material de intercambio aniónico comprende HQ, tal como Poros® HQ, por ejemplo, Poros® 50 HQ. Poros® HQ está disponible en Applied Biosystems y se basa en un grupo funcional de polietilenimina cuaternizada que produce una alta capacidad.

Debe entenderse que los regímenes terapéuticos y profilácticos (preventivos) representan aspectos separados en particular, debe entenderse que la presente descripción proporciona factores de coagulación de la sangre purificada con vidas medias plasmáticas aumentadas que los hacen convenientes para el tratamiento profiláctico de la hemofilia.

La formulación puede comprender, además, un sistema tampón, conservante(s), agente(s) de tonicidad, agente(s) quelante(s), estabilizantes y tensioactivos. En una modalidad la formulación farmacéutica es una formulación acuosa, es decir, una formulación que comprende agua. Tal formulación es típicamente una solución o una suspensión. En una modalidad la formulación farmacéutica es una solución acuosa.

En una modalidad la formulación farmacéutica es una formulación liofilizada, en la que el médico o el paciente añaden solventes y/o diluyentes antes del uso.

En una modalidad la formulación farmacéutica es una formulación seca (por ejemplo, liofilizada o secada por atomización) lista para usar sin ninguna disolución previa.

La invención se describirá ahora con referencia a los siguientes ejemplos.

Ejemplo 1

Purificación de FIX PEGilado

a) Solución de carga

FIX PEGilado intercambiado por tampón más del 95 % puro. El valor de pH en la carga es aproximadamente 6. FIX-concentración es aproximadamente 1 mg/ml. Carga aproximadamente 5 gproducto/Lresina

b) Columna

Poros 50 HQ, 15,7 ml.

c) Tampones

- Tampón de equilibrado: ácido acético 10 mM, acetato de sodio 90 mM, pH ~ 5,7

- Lavado Ácido: Tampón de lavado ácido 5 CV: acetato de sodio 65 mmol/kg, ácido acético: 185 mmol/kg pH -4,3; 5 CV

- Elución: Gradiente lineal de 5 CV de ampón de equilibrado al 100 % a tampón de elución al 100 % (Histidina 10 mM, NaCl 50 mM, CaCl250 mM)

- Regeneración: 3 CV NaCl 1 M

d) Procedimiento

Etapa Tampón CV % de Tampón de elución Aplicación de Equilibrado Tampón de equilibrado 5 0 %

Lavado Tampón de equilibrado 3 0 %

Lavado ácido (=lavado 2) Tampón de lavado ácido 3 0 %

Lavado 3 Tampón de equilibrado 3 0 %

Elución Tampón de elución 5 0...100 %

Regeneración Tampón de regeneración 3 0 %

Velocidad de flujo: 24 CV/h = 6,28 ml/min

Temperatura: 5 °C

Los resultados del procedimiento de purificación cromatográfica se muestran en la Figura 1, que representa el cromatograma obtenido con una señal de UV280nm. El pico marcado con un "1" representa el flujo a través del cual, por ejemplo, se elimina CMP-NAN. El pico marcado con un "2" representa el pico correspondiente a ST3Gal3, es decir, muestra dónde se elimina ST3Gal3 y el pico marcado con "3" representa el pico del producto.

Los resultados de la Figura 1 muestran claramente que el pico del producto está visiblemente separado de las impurezas tales como ST3Gal3 y CMP-Nan, lo que confirma la purificación eficiente proporcionada por el método de la invención.

Además se describe en la presente descripción:

Modalidad 1: Un método para purificar una proteína PEGilada que comprende cromatografía de intercambio aniónico con un tampón de elución, caracterizado porque dicha cromatografía comprende una etapa de eliminación de impurezas antes de la elución en donde dicha etapa de eliminación de impurezas comprende lavar dicha columna de intercambio aniónico con un tampón ácido.

Modalidad 2: El método de la Modalidad 1, en donde el tamaño del grupo PEG unido varía de aproximadamente 2 a aproximadamente 40 KD.

Modalidad 3: El método de la Modalidad 1 o Modalidad 2 en donde la impureza eliminada mediante la etapa de lavado ácido es ST3Gal3.

Modalidad 4: El método de cualquiera de las modalidades anteriores, en donde la etapa de eliminación de impurezas comprende lavar con un tampón ácido a un pH de entre 3,8 y 5,0, 3,9 y 4,8 o 4,0 y 4,5.

Modalidad 5: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 3,9, 4,0 o 4,1.

Modalidad 6: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,2.

Modalidad 7: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,3.

Modalidad 8: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,4.

Modalidad 9: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,5.

Modalidad 10: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,6.

Modalidad 11: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,7.

Modalidad 12: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,8.

Modalidad 13: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 4,9.

Modalidad 14: El método de la Modalidad 4, en donde el pH es 5,0.

Modalidad 15: El método de la Modalidad

donde el pH

está entre 4,0 y 4,4.

Modalidad 16: El método de la Modalidad 4, en donde el pH

está entre 4,1 y 4,3.

Modalidad 17: El método de cualquier Modalidad anterior en donde el tampón ácido no comprende un catión divalente.

Modalidad 18: El método de cualquier Modalidad anterior en donde el tampón ácido comprende acetato de sodio y/o ácido acético.

Modalidad 19: El método de cualquier Modalidad anterior en donde el tampón ácido comprende acetato de sodio 50mmol y ácido acético 140 mmol.

Modalidad 20: El método de cualquier Modalidad anterior en donde se realiza una etapa de equilibrado antes de la etapa de aplicación de la muestra.

Modalidad 21: El método de la Modalidad 20, en donde la etapa de equilibrado comprende la aplicación de un tampón de equilibrado a un pH de entre 5 y 7.

Modalidad 22: El método de la Modalidad 20 o la Modalidad 21, en donde se realiza una segunda etapa de equilibrado antes de la etapa de lavado ácido.

Modalidad 23: El método de cualquiera de las Modalidades 20 a 22, en donde la etapa de equilibrado comprende la aplicación de un tampón de equilibrado a un pH de 6.

Modalidad 24: El método de la Modalidad 23, en donde el tampón de equilibrado es un tampón que contiene histidina a un pH de 6.

Modalidad 25: El método de cualquiera de las Modalidades 21 a 24 en donde el tampón de equilibrado comprende acetato de sodio y ácido acético.

Modalidad 26: El método de cualquiera de las Modalidades 21 a 25, en donde el tampón de equilibrado comprende ácido acético 10 mM y acetato de sodio 90 mM.

Modalidad 27: El método de cualquiera de las Modalidades 22 a 26 en donde se realiza una tercera etapa de equilibrado después de la etapa de lavado ácido pero antes de la elución.

Modalidad 28: El método de cualquier Modalidad anterior en donde la proteína PEGilada es una proteína dependiente de vitamina K.

Modalidad 29: El método de la Modalidad 28, en donde la proteína PEGilada es un factor de coagulación de la sangre dependiente de vitamina K.

Modalidad 30: El método de la Modalidad 28 o la Modalidad 29 en donde la proteína PEGilada es un factor de coagulación de la sangre que contiene galactosa.

Modalidad 31: El método de cualquiera de las Modalidades 28 a 30 en donde la proteína PEGilada es un factor de coagulación de la sangre dependiente de vitamina K seleccionado de Factor II (FII), Factor VII (FVII), Factor IX (FIX), Factor X (FX), proteína S y proteína C.

Modalidad 32: El método de cualquiera de las Modalidades 28 a 31 en donde la proteína PEGilada es el Factor IX (FIX) o Factor VII (FVII).

Modalidad 33: El método de cualquiera de las Modalidades 28 a 32 en donde la proteína PEGilada es el Factor IX (FIX).

Modalidad 34: El método de cualquiera de las Modalidades 28 a 30 en donde la proteína PEGilada es PEG40k-FIX. Modalidad 35: El método de cualquier Modalidad anterior en donde la cromatografía de intercambio aniónico comprende: Q-resina, una Amina cuaternaria y resina DEAE, DiEtilAminoEtano.

Modalidad 36: El método de la Modalidad 35, en donde la resina de intercambio aniónico es Mono Q Source 15Q o 30Q (GE-health care), Poros 20HQ o 50HQ (Applied Biosystems) o Toyopearl Q650S (Toso Haas).

Modalidad 37: El método de la Modalidad 36, en donde el material de intercambio aniónico comprende HQ.

Modalidad 38: El método de la Modalidad 37, en donde el material de intercambio aniónico comprende Poros® HQ. Modalidad 39: El método de la Modalidad 38, en donde el material de intercambio aniónico comprende Poros® 50 HQ.

Modalidad 40: Una proteína PEGilada purificada obtenible por un método como se define en cualquier Modalidad anterior.

Modalidad 41: La proteína FIX PEGilada purificada obtenible por un método como se define en cualquiera de las Modalidades 1 a 39.

Modalidad 42: Una proteína PEGilada purificada como se define en la Modalidad 40 o la Modalidad 41, que está sustancialmente libre de ST3Gal3.

Modalidad 43: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 42 que contiene menos de 100 ng/ml de ST3Gal3.

Modalidad 44: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 43 que está sustancialmente libre de especies multiPEGiladas.

Modalidad 45: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 44 que contiene menos del 20 % de especies multiPEGiladas.

Modalidad 46: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 45 que contiene menos del 15 % de especies multiPEGiladas.

Modalidad 47: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 46 que contiene menos del 10 % de especies multiPEGiladas.

Modalidad 48: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 47 que contiene menos del 5 % de especies multiPEGiladas.

Modalidad 49: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 48 que contiene menos del 3 % de especies multiPEGiladas.

Modalidad 50: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 49 que contiene menos del 2 % de especies multiPEGiladas.

Modalidad 51: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 50 que contiene menos del 1 % de especies multiPEGiladas.

Modalidad 52: Una composición farmacéutica que comprende una proteína PEGilada purificada como se define en la presente descripción como se define en cualquiera de las Modalidades 40 a 51.

Modalidad 53: Una composición farmacéutica que comprende una proteína PEGilada del Factor IX purificada.

Modalidad 54: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 41 a 51 o una composición farmacéutica como se define en la Modalidad 53 para usar en el tratamiento de enfermedades aliviadas mediante la administración de factores de coagulación de la sangre (por ejemplo, FIX), tales como un trastorno hemorrágico, por ejemplo, hemofilia, un enfermedad de la sangre, hemartrosis, hematomas, hemorragia mucocutánea, enfermedad de la sangre hereditaria, trastorno hemorrágico familiar, enfermedad de la sangre familiar o terapia de reemplazo con factor.

Modalidad 55: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 41 a 51 o una composición farmacéutica como se define en la Modalidad 53 para usar en el tratamiento de la hemofilia.

Modalidad 56: Una proteína PEGilada purificada como se define en cualquiera de las Modalidades 41 a 51 o una composición farmacéutica como se define en la Modalidad 53 para usar en el tratamiento de la hemofilia B o enfermedad de Navidad.

Modalidad 57: Un método para tratar la hemofilia que comprende administrar a un paciente una cantidad terapéuticamente efectiva de un factor de coagulación de la sangre purificado como se define en las Modalidades 41 a 51.

Modalidad 58: Uso de un factor de coagulación de la sangre purificado como se define en las Modalidades 41 a 51 en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de la hemofilia.

Claims (10)

REIVINDICACIONES

1. Un método para purificar una proteína PEGilada que comprende cromatografía de intercambio aniónico con un tampón de elución, caracterizado porque dicha cromatografía comprende una etapa de eliminación de impurezas antes de la elución en donde dicha etapa de eliminación de impurezas comprende lavar dicha columna de intercambio aniónico con un tampón ácido a un pH de entre 3,9 y 4,5, en donde la proteína PEGilada se selecciona del grupo que consiste en Factor II (FII), Factor VII (FVII), Factor IX (FIX), Factor X (FX), proteína S y proteína C.

2. El método como se define en la reivindicación 1, en donde dicha impureza es ST3Gal3.

3. El método como se define en la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en donde la etapa de eliminación de impurezas comprende lavar con un tampón ácido a un pH de entre 4,0 y 4,5.

4. El método como se define en la reivindicación 3, en donde la etapa de eliminación de impurezas comprende lavar con un tampón ácido a un pH de entre 4,0 y 4,4.

5. El método como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el tampón ácido comprende acetato de sodio y/o ácido acético, tal como acetato de sodio 50 mmol y ácido acético 140 mmol.

6. El método como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde se realiza una etapa de equilibrado antes de la etapa de lavado ácido.

7. El método como se define en la reivindicación 6, en donde la etapa de equilibrado comprende la aplicación de un tampón de equilibrado a un pH de entre 5 y 7.

8. El método como se define en la reivindicación 6 o la reivindicación 7, en donde el tampón de equilibrado comprende acetato de sodio y ácido acético, tal como ácido acético 10 mM y acetato de sodio 90 mM.

9. El método como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde la proteína PEGilada es Factor VII (FVII) o Factor IX (FIX).

10. El método como se define en cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en donde el material de intercambio aniónico comprende HQ, tal como Poros® HQ, por ejemplo, Poros® 50 HQ.