JP5037331B2 - 出血性障害の処置のための第ixa因子 - Google Patents

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Description

本願は、2004年3月19日に出願された米国仮特許出願第60/554,726号に対する優先権を主張する。
(発明の分野)
本発明は、第IXa因子を含む薬学的調製物による、血液凝固病理の処置に関する。
(発明の背景)
血液凝固は、一連の相互依存的な生化学的反応に依存する、複雑かつ動的な生物学的プロセスである。その一連の各工程において、活性プロテアーゼが、不活性な前駆体から生成される。新たに生成されたプロテアーゼの各々は、次々に、その基質である別の前駆体プロテアーゼに作用し、カスケード反応を生成する。このカスケードは、最終的に、安定な血塊を生成するのに十分活性なトロンビンをもたらす。
このカスケードの終末部分は、血小板のリン脂質膜上で起こる。この表面上で、第IXa因子(第XIa因子または第VIIa因子により活性化される(図1に図示される))は、その補因子である第VIII因子の存在下で、第X因子を第Xa因子に活性化する。第Xa因子は、プロトロンビンをトロンビンへ活性化し、このトロンビンが次いでフィブリノーゲンを活性化して、フィブリンの血塊を形成する。第IXa因子単独ではインビトロで第X因子を緩やかにしか活性化し得ないので、第VIII因子の具体的な役割は、第IXa因子の、第X因子の触媒作用を強化することである(非特許文献1)。
最も一般的な血液凝固病理である血友病Aは、罹患した個体の血液において循環第VIII因子レベルの減少に導く、X連鎖遺伝性欠損である。濃縮された第VIII因子調製物は、そのような個体を処置し、その個体の循環第VIII因子レベルを機能レベルまで回復させるのに使用される。しかし、これらの患者の約20%では、阻害性の同種抗体が第VIII因子に対して産生され、この処置の有効性を妨げている。
第VIII因子置換療法に不応性になった患者の処置としては、免疫寛容誘導(immune tolerance induction)(ITI)、ブタ第VIII因子での置換療法、および凝固において第VIII因子処置に対する必要性をバイパスするといわれている種々の調製物が挙げられる。これらのバイパス調製物としては、組み換え第VIIa因子、プロトロンビン複合体濃縮物(Prothrombin Complex Concentrate)および活性化プロトロンビン複合体濃縮物(aPCC)が挙げられる。
aPCCの治療的に有効な基質は、以下の因子の種々の組み合わせであると推測されている:トロンビン、第VIIa因子、第IXa因子、第Xa因子、第XIa因子、第XIIa因子、プロトロンビン/第Xa因子複合体。しかし、aPCCに対する正確なインビボでの作用機序は、なお議論の余地がある。
van Dieijenら、J Biol Chem.1981年4月10日;256(7):p.3433−42
(発明の要旨)
本発明は、第IXa因子が濃縮された調製物を投与することにより、被験体における出血性障害を処置するための方法を提供する。本発明における使用のための第IXa因子は、組み換え技術により産生された第IX因子をタンパク質分解で活性化することにより、産生され得る。第IX因子をコードするcDNAは、単離、特徴付け、および発現ベクターへのクローニングがされている。例えば、Chooら、Nature 299:178−180(1982);Fairら、Blood 64:194−204(1984)およびKurachiら、Proc.Nat.Acad.Sci.USA 79:6461−6464(1982)を参照のこと。組み換え第IX因子は、米国特許第4,770,999号(Kaufmannら、Sep.13,1988;これは本明細書中に参考として援用される)に記載されるように、組み換え技術により産生されている。本発明はまた、コーン画分IV.1ペースト(Cohn Fraction IV.1 paste)のような血漿画分から第IXa因子を調製および単離するための方法も提供する。これは、現存する手順の改変として、第IXa因子への第IX因子の変換を意図的に触媒し、アニオン交換工程を導入して(米国特許第3,560,475号および同第4,286,056号に記載される)、存在する不純物から第IXa因子を選択的に精製することによって達成される。第IXa因子が濃縮されたこの調製物は、第VIII因子欠損マウス(fviii−/−マウス)の第VIII因子の出血表現型を補正し得る。従って、その調製物は、血友病に関連する出血性障害の処置における臨床的有用性を有する。さらに、本発明のさらなる有用性は、その調製物が出発物質のAutoplex−Tからプレカリクレン(PKA)活性を除去することである。
(発明の詳細な説明)
本発明は、出血性障害を有する患者を、濃縮第IXa因子を含む薬学的調製物を投与することによって処置する方法を提供する。この調製物は、検出可能なPKA活性を含まない。驚くべきことに、その第IXa因子は、内在性第VIII因子を有さないかまたは不活性である内在性形態の第VIII因子を有する被験体において、凝固を開始させる。
第IXa因子を濃縮させるために、米国特許第4,770,999号(これは本明細書中に参考として援用される)に提供されるように、出発物質は、組み換え技術により産生された第IX因子であり得る。簡単に述べると、114μg/ml(2μM)の組み換え第IX因子を、5mM CaClを含む7.4のTris緩衝化生理食塩水中の2.4μg/ml(30nM)の第XIa因子と、37℃でインキュベートする。この反応により、37℃で2時間消化させる。あるいは、114μg/ml(2μM)の組み換え第IX因子を、5mM Ca2およびZhongら、Proc Natl Acad Sci USA.1994 Apr 26;91(9):3574−8から適応した1mMを含むTris緩衝化生理食塩水中の第VIIa因子および組織因子の両方(1μg/ml(20nm))と、37℃でインキュベートする。さらに、両方の活性化反応においてアリコートを回収し、等量の2×還元SDS−PAGEサンプル緩衝液に加え、10%ポリアクリルアミドゲル上で分離して、第IX因子が定量的に第IXa因子に変換することを確実にする。活性化第IX因子の調製物を、哺乳動物被験体への投与に適した個々のアリコート中のヘパリン化クエン酸生理食塩水中に希釈する。所望される場合、触媒である第XIa因子またはTF/第VIIa因子は、Wojcikら、Biochem.J.(1997)323(629−636)に記載されるように、抗第IX因子:Mg(II)IgG−Sepharose 4Bカラム(ゲル1ml当たり1mgのIgG)を使用して第IXa因子を選択的に精製することによって除去され得る。結合した第IXa因子を、50mM Tris酢酸EDTA(pH7.5)、150mM NaCl、10mMベンズアミジンおよび10mM EDTAを含む緩衝液によってカラムから溶出する。溶出した第IXa因子を、続いてヘパリン化クエン酸生理食塩水を含む緩衝液に透析し、哺乳動物被験体への投与に適した濃度へ等分する。
第IXa因子濃縮物を作製するために、出発物質はまた、コーンの血漿画分IV−1沈殿物であり得る。この沈殿物を、米国特許第3,560,475号に記載されるように、約20℃で生理食塩水中10%重量/体積の濃度に溶解し、次いで三塩基リン酸カルシウム上への吸収によって部分的に精製する。
この三塩基リン酸カルシウムによって溶出される物質を、米国特許第3,560,475号にて議論されるように、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿によってさらに精製および濃縮する。得られた沈殿を、米国特許第4,286,056号に記載されるように、0.2Mクエン酸ナトリウム溶液に溶解し、pHを調節する。
0.5mg/mlの濃度のシリカが、第XI因子を第XIa因子へ活性化するのに使用される。第XI因子は、画分IV.1ペーストの成分である。第XIa因子は、ペースト中の第IX因子を、第IXa因子に活性化する。
活性化第IXa因子を含むバルク溶液を、次いで、Q−セファロース樹脂上でさらに精製および濃縮する。フロースルー(flow through)を廃棄し、結合したタンパク質を、増加するNaCl濃度勾配でクエン酸ナトリウム溶液を使用して溶出する。溶離液画分の適切な試験を、次いで実施する。最も高濃度の第IXa因子を含む画分をプールする。このQ−セファロース画分は、第IXa因子について濃縮されており、かつPKA活性を欠いている。
本発明は、aPCC(Autoplex−T)の生化学的特徴付けの後に行われた。この特徴付けにより、Autoplex−Tが予想外に高濃度の活性化第IX因子(1ml当たり20μg〜50μg)を含むことが明らかになった。さらに、活性化第IX因子の濃度は、Autoplex−Tの第8因子補正単位活性(FECU)と相関する(図2)。このFECU活性アッセイは、Autoplex調製物が第VIII因子欠損血漿をいかに早く凝固するかを測定する(米国特許第4,286,056号に記載される)。Autoplex−T産物はAutoplex−Tの臨床的有用性(すなわち、凝固において第VIII因子をバイパスする能力)を模倣すると考えられているので、このアッセイはAutoplex−T産物の効力を決めるのに使用される。
図2および図3は、Autoplex−Tの複数の製造ロットにおいて、第IX因子が第IXa因子に活性化されることを実証する。Autoplexの第IXa因子含量とFECU活性との間の相関は、第IXa因子がAutoplexの活性な薬学的成分であり得ることを示唆する。図4は、精製された第IXa因子が、用量依存的な様式で第VIII因子欠損血漿の凝固時間を補正することを実証する。これは、上記の考え方と一致する。この仮定を評価するために、本発明者らは、アニオン交換クロマトグラフィー工程:Q−セファロースを使用して、Autoplex−Tから第IXa因子の精製調製物を調製した(図5Aおよび図5B)。次いで、本発明者らは、fviii−/−遺伝子を欠損するマウスにおける出血研究を使用して、この調製物の生物学的有効性を比較した。その結果(表3および表4)は、精製された第IXa因子調製物が、これらの血友病マウスの出血表現型をレスキューし得ることを示す。
Autoplex−Tは、第XII因子のタンパク質分解フラグメントである第XIIa因子βの存在に起因して、顕著な量のプレカリクレン活性を含む。PKA活性は、重大な臨床的症状(例えば、疼痛および低血圧)と関連するため、Autoplex−Tの望ましくない特性であるというレッテルを貼られている。本発明のさらなる有用性は、Q−セファロースカラム上での第IXa因子の精製が、調製物からPKA活性を実質的に除去することである(表1)。
以下の実施例は、第IXa因子のこのような調製物の初期単離およびそれが出血性障害を処置するのに効果的であることの実証を示す。
(実施例I)
十分量の画分(コーン画分IV−1沈殿物)を0.9%生理食塩水に懸濁して、10%溶液(w/v)を作製した。この溶液は、米国特許第3,560,475号および同4,286,056号に記載されるような代表的な様式で製造された。pHを、1Nの水酸化ナトリウムで7.2に調節し、沈殿物を生じさせた。遠心分離の後で、リン酸カルシウムを上清に加えた。この溶液を、混合し、遠心分離して、リン酸カルシウム吸着沈殿物を回収した。この沈殿物を、0.1Mのクエン酸ナトリウム中に、懸濁したIV−1ペーストの容量の4%に匹敵する容量で、再懸濁した。この懸濁液を、遠心分離し、そして凝固因子を含有する上清を回収した。
(実施例II)
この上清を、上述のアリコートを用いたS−2222ペプチドベース色素生産性アッセイによって測定される場合に、約0.02U/mlの第Xla因子レベルに達すると規定された時間の間、0.5g/Lのシリカを用いて調節した。活性化を、1.5μフィルタを通す混合物の濾過によって止めた。
(実施例III)
実施例IIからの生成物を、ポリエチレングリコール(PEG)沈殿によって、さらに精製した。最初に、この溶液を、平均分子量4000のPEG固体を添加することによって、5%(w/v)PEGにした。この懸濁液を遠心分離し、この上清のpHを、1Nの塩酸で5.2に調節し、次いでさらなるPEG固体を添加することにより20%(w/v)PEG溶液にした。この懸濁液を遠心分離し、この沈殿物を、0.72%の塩化ナトリウムおよび1ml当たり1.5単位のヘパリンを含有する0.02Mのクエン酸ナトリウム溶液中に溶解し(以後、ヘパリン化クエン酸生理食塩水を呼ぶ)、そしてpHを7.0に調節した。この物質の効力を、23FECU単位/mlであると決定した。
FECUアッセイにおいて、1単位のFECUを、1:20で希釈した活性化プロトロンビン複合体の量として規定し、これは、等量の第VIII欠損血漿、または第VIII因子インヒビターを含有する血漿を加える際に、凝固時間(エラグ酸活性化した部分トロンボプラスチン時間)を35秒間(正常)に補正する。
(実施例IV)
滅菌カラムを、Q−Sepharose Fast FlowTM(Amersham Biosciences)でパック(packed)した。このカラムを、0.025MのNaClを含有する滅菌ヘパリン化クエン酸生理食塩水を用いて平衡化した。実施例IIIからの生成物の適用の後で、上記カラムを、同じ緩衝液で洗浄した。第IXa因子を、0.025〜0.25Mまで増加する量のNaClを含有する、ヘパリン化クエン酸生理食塩水を用いて溶出した。サンプルを、溶出の間中、間隔を空けて採取し、そして、免疫ブロット法によって決定されるような、最高濃度の第IXa因子を有するサンプルをプールした。次いで、このプールを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水(pH7.0)中に希釈し、クロマトグラフィーの間、濃度における増加を制御した。バルクの少量のアリコートを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水で希釈し、そして第VIII因子補正活性について試験し、どの希釈が、効力レベルを23FECU/mlまで下げるかを決定した。調製物中の活性化された第IXa因子の量を、免疫ブロット法によって決定し(図4b)、そしてAutoplex−Tの調製物に類似することを示した。
カリクレイン(血漿カリクレイン)は、キニノーゲンをキニンへと変換することに関与する酵素である。これは、次々と低血圧を促進し得、そして患者において望まれない症状に関連し得る。プレカリクレイン活性化因子(PKA)は、プレカリクレインをカリクレインへ変換する酵素である。PKAアッセイのための標準物質として使用されるCBER参照は、PKAの成分として第XIIa因子βを列挙する(CBER Laboratory of Standards and Testing DMPQ/CBER/FDA Product Informatiom Circular for Reference Prekallikrein Activator(PKA)ロット番号3、印刷年月日;1999年3月31日)。プレカリクレイン活性化因子(PKA)の濃度を、Autoplex−T中で測定し、そして精製された第IXa因子調製物を色素非産生アッセイ(Tankersleyら; Blood,62(2):448−456,1983)を使用して測定した。
表1は、PKA活性がQセファロース工程の導入によって調製物から除去されることを示す。PKA活性を、Center for Biologics Evaluation and Research Standard(CBER)の百分率で表す。結果は、出発物質における大部分のPKA活性が、Qセファロース溶出液中に回収されないことを示す。
(実施例V)
以下に、fviii−/−マウスにおいて出血および凝固を評価する実験プロトコルを説明する。試験サンプルのアリコートを、ヘパリン化クエン酸生理食塩水中で、−70℃まで凍結させ、そして急速に解凍して使用した。fviii−/−マウスの5群を、第IXa因子かまたは抗インヒビター血液凝固複合体(Autoplex−T)のいずれかを、増加する投与量で注射した。第IXa因子群を、以下の活性化IX因子の投与量で注射した(0.002μg/g、0.01μg/g、0.02μg/g、0.13μg/g、または0.26μg/g)。Autoplex−T群を、ポジティブコントロールとして、0.01FECU/g、0.075FECU/g、または0.150FECU/gで注射した。5匹のfviii−/−マウスを、滅菌ヘパリン化クエン酸生理食塩水で注射した。すべてのマウスについて30分間以上のインキュベーション期間の後、外側尾静脈出血研究を実施した。具体的には、切開を外側尾静脈上で行い、そして流出された血液の量を、30分間の期間の間、収集した。この期間の最後において、血液が大量に失われることによる死亡を防ぐために、創傷を焼灼した。加えて、14匹のfviii−/−マウスの1群に、何も処置をしないで切開を行い、そして特定の時点において収集された血液量を、測定した。
これらの調製物の止血効力の評価は、出血が原因による死亡したマウスを測定することによって、最もよく評価される。所定の期間内で失血量を記録することにより止血を測定する方法は、表3の結果に実証されるように、出血速度がマウスごとに大きく変動することに悩まされる。しかし、不要なマウスの死亡を避けるために、本発明者らは、各処置群において必ずしもすべてのマウスが、失血が記録された30分間の枠内で出血が止まるわけではないという理解とともに、これらの調製物で処置された個々のマウスにおける止血の明確な証拠を探すためのアッセイを設計した。
表3の結果から理解され得るように、第VIII因子欠損マウスは、その尾に切開がなされる際に出血する。各マウスから収集された血液量は、可変であり、そして65μl〜400μlの範囲である。
表3の血友病のマウスとは対照的に、外側尾静脈出血を、表4に示されるように野生型マウスに実施した場合、それらは、低い収集血液量(0〜80μl)で示されているように、血塊を形成することが可能である。
第IXa因子を、3つの低い投与量にて、特定のfviii−/−マウスの出血表現型を補正することが可能であった。これらの3投与量における15匹のマウスのうちの4匹において、失血量は、65μlの下限範囲よりも低く、かつ野生型において測定された失血量(0〜80μl)と一致した。これらの例は、出血が第IXa因子調製物によって効果的に止められていることの明確な証拠を提供する。同様に、15匹のうちの3匹について、Autoplex−Tは、野生型レベルまで止血を回復することが可能であった。この研究を実施した技術者はまた、失血アッセイでは止血の証拠を示さなかったAutoplex処置マウスおよび第IXa因子処置マウスにおいて、部分的止血栓が形成されたことを注目した。従って、これらの結果は、第IXa因子が、市販製品のAutoplex−Tと同様のインビボでの効力を有することを示す。
興味深いことに、第IXa因子のより高い投与量およびAutoplex−Tの最高の投与量のうちの2つにおいて、出血が増加したように見え、これらの試薬が散在性血管内凝固(DIC)を生じることと一致した。DICは高投与量のバイパス治療のよく認識された合併症であるので、このことは驚くべきことではない。
これらの結果は、第IXa因子が出血障害の処置において生物学的効力を有するという明確な証拠を提供する:第IXa因子は、特定のマウスにおいて野生型レベルまで出血を減少し、そしてその効力範囲は、現在市販されているバイパス治療剤のAutoplex−Tに匹敵した。第IXa因子は、処置されたマウスの体重(g)あたり、0.002μgと0.02μgとの間で、治療的に活性である。これらの結果に基づいて、第IXa因子を、体重1kg当たり2mgと20mgの間で、患者に投与し得た。
本開示が与えられると、当業者は、自然に本発明のさらなる実施形態を考える。そして、上記の請求項は、本発明の範囲を限定することを意図しない。
図1は、第IX因子の、第XIa因子およびカルシウムまたは第VIIa因子−組織因子による活性化を示す。これは、アルギニン(Arg)アラニン(Ala)結合の切断および第IXa因子の不活性中間体である第IXα因子の形成をもたらす。第二の結合であるArg180−バリン181(Val)の切断は、第IX因子の活性形態(第IXa因子と呼ばれる)である第IXαβ因子の形成および約10kDaのペプチドフラグメントの放出をもたらす(図は、Royal A McGrawら、Clinics in Haematology−Vol 14.2 June 1985から改変した)。その後の図において使用された免疫ブロット実験は、特定の調製物においてタンパク質を分離するために、ドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS−PAGE)を用いる。これらのゲルが還元条件下で泳動された場合、ヘテロ二量体を一緒に保持しているジスルフィド結合が破壊され、第IX因子の重鎖および軽鎖が別個の種として分離する。例えば、第IXαβ因子の場合、その重鎖および軽鎖は、それぞれ約30kDaおよび約20kDaに分離する。このストラテジーにおいて、触媒性酵素の濃度は第IX因子よりも有意に低く、これはその触媒性酵素の、さらなるクロマトグラフ(例えば、第IX因子に対するモノクローナルアフィニティーカラム)によるその後の除去を容易にする。 図2Aは、第IX因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を使用する、特定のAutoplex−T調製物における活性化第IX因子の量を測定する免疫ブロットである。示された量の精製された活性化第IXa因子をゲルにロードした。各Autoplex−T調製物の5μlを、各レーンにロードした。従って、2839B065および2839B055における活性化第IX因子のおよその濃度は、およそ20ng/μlと50ng/μlとの間にある。各Autoplex−T調製物(ロット番号 2839B065、2839B055、2839B053)に対する第8因子補正単位(Factor Eight Correction Unit)(FECU)は、適切なレーンの下に示される。これらの結果はまた、活性化第IX因子の量がFECU効力と正に相関することも示す。 図3は、最小の受容可能な効力よりも大きい効力(1ml当たり6FECU単位よりも大きい)を有する、2002年および2003年に生産されたAutoplex−T製造ロットのパネルを使用する、第IX因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる免疫ブロットである。各Autoplex−T調製物に対する第8因子補正単位(FECU)は、適切なレーンの下に示される。全ての場合において、第IX因子は、第IXa因子へ活性化されている。 図4Aおよび図4Bは、FECU凝固アッセイにおける精製された活性化第IX因子の用量応答を示す。この実験において、増加する量の第XIa因子(1ml当たり0ng、10ng、20ng、30ng、50ngおよび75ng)が、FECU凝固アッセイにおいて引き続いて使用された活性化第IXa因子の量を制御するために使用される。図4Aは、クマシーブルー染色されたSDS−PAGEゲルである。これは、第XIa因子の濃度が増加すると、より活性化された第IX因子が産生されることを示す。第IXaおよび第IX因子の精製された標準が、比較のために同じゲル上で分離された。図4B。消化物の各アリコートを、次いで、第VIII因子欠損血漿の活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイによって分析する。加えられた第XIa因子(0〜75ng/ml)の量は、この実験においては有意なFECU活性を有さない。これらの結果は、活性化第IX因子が、第VIII因子のバイパス活性を有する。 図5Aは、Autoplex−T調製物から第IXa因子を精製するための精製スキームを示す図である。図5Bは、免疫ブロット(第IX因子の重鎖に特異的なモノクローナル抗体を用いる)により、プールされたQ−セファロース溶出液における活性化第IX因子の濃度がAutoplex−T調製物と類似していることを示す。

Claims (6)

  1. 出血している被験体を処置するための組成物であって、該組成物は、
    少なくとも10%の第IXa因子(mg/総タンパク質mg)含有し、ただし、該組成物は第VIII因子を含まず、かつ第VIII因子を含む第2組成物と同じ処置レジメにおいて同時に、同時で別々に、または順次に投与されるためのものではなく、ここで、該第IXa因子は第IX因子の活性形態であり、そしてさらに、該組成物が、プレカリクレイン活性化因子の活性を有さない
    組成物。
  2. 前記出血、前記被験体の血液中の第VIII因子インヒビターの存在によって引き起こされる、請求項1に記載の組成物。
  3. 前記出血、前記被験体の血液中の内在性第VIII因子活性の非存在によって引き起こされる、請求項1に記載の組成物。
  4. 前記出血、前記被験体の血液中の内在性第IX因子活性の非存在によって引き起こされる、請求項1に記載の組成物。
  5. 前記第IXa因子が、組み換え技術により産生された第IX因子のタンパク質分解活性化によって産生される、請求項1に記載の組成物。
  6. 第IXa因子を含み、かつプレカリクレン活性を有さない薬学的調製物を作製する方法であって、該方法は、以下:
    a)コーン画分IV−1のペーストを溶解する工程;
    b)該コーン画分IV−1に含まれる凝固因子を、リン酸カルシウム上に吸着する工程;
    c)該リン酸カルシウムから該凝固因子を溶出し、第一の溶出液を形成する工程;
    d)該第一の溶出液をアニオン交換樹脂に加え、それにより第IXa因子を該樹脂に吸着し、プレカリクレン活性を有する不純物を廃棄画分へ流出させる工程;ならびに
    e)該第IXa因子を該樹脂から溶出および回収する工程、
    を包含する、方法。
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