JP2011519833A - 半減期が延長された第ｉｘ因子コンジュゲート - Google Patents

半減期が延長された第ｉｘ因子コンジュゲート Download PDF

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Abstract

本発明は、生体適合性ポリマー部分を含有するように改変した第IX因子のコンジュゲートに関する。第IX因子コンジュゲートは実質的に第IXa因子混入物を含有しない。第IX因子コンジュゲートは改善された薬物動態学的特性、例えば延長された半減期を有し、それによって投与量節約効果および投与頻度の低減がもたらされる。

Description

１． 技術分野
本発明は第IX因子の生体適合性ポリマーコンジュゲート、第IX因子コンジュゲートを含有する組成物、および第IX因子コンジュゲートによる血友病の治療法に関する。
２． 発明の概要
出願人は、FIXを１つまたはそれ以上の生体適合性ポリマーにコンジュゲートさせて第IXa因子（本明細書ではFIXaと記載する）との効率的な分離を可能にすることによって組換え第IX因子（本明細書ではFIXと記載する）の製造が改善されうることを発見した。改善された製造特性には高純度FIXコンジュゲート製造能も含まれる。
FIXコンジュゲートは、例えば非コンジュゲートFIXに比較して、治療的に有用でありうる。それらの治療的有用性には、限定される訳ではないが循環半減期の延長、免疫原性の低減、より高い活性、より低い必要用量、および別の投与経路（例えば皮下）が可能となることが含まれる。
本明細書で使用する「第IX因子コンジュゲート」または「FIXコンジュゲート」という用語は、生体適合性ポリマー部分を含有させることによって未修飾の第IX因子より改善された薬物動態プロファイルを与えるように修飾した第IX因子を表す。薬物動態プロファイルの改善は、以下のパラメータの１つまたはそれ以上の改善として観察されうる：効力、安定性、曲線化面積、および循環半減期。
ある態様では、本明細書に記載する高純度FIXコンジュゲートは実質的にFIXaを含有しない。Grayら（（Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9)参照により本明細書に組み込まれる）によれば、FIX組成物の混入物を検討する場合、微量のFIXaでも危険な血栓症を引き起こしうる。
本明細書においてFIXおよびFIXコンジュゲートの精製に関して使用する「実質的にFIXaを含有しない」という用語は、FIXaの量が1u FIXa/1000 IU FIX未満であることを表す。低濃度のFIXaはGrayら（Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9）に記載される方法によって測定できる。ある態様では、FIXa混入物の量は0.5u FIXa/1000 IU FIX未満であってもよい。ある態様では、FIXa混入物の量は0.25u FIXa/1000 IU FIX未満であってもよい。ある態様では、FIXa混入物の量は0.1u FIXa/1000 IU FIX未満であってもよい。
FIXを生体適合性ポリマーとコンジュゲートさせることによりFIXコンジュゲートのFIXaからの分離能が向上し、それによって医薬組成物中のFIXの有用性が向上する。更に、生体適合性部分はFIXを分解および抗体反応から保護しうる。FIXコンジュゲートにより循環半減期が延長されうるが、それによって投与量節約効果および投与頻度の低減がもたらされる。特定の態様では、FIXを１つまたはそれ以上のポリエチレングリコール（PEG）部分にコンジュゲートさせる。別の特定の態様では、FIXを１つまたはそれ以上のポリシアル酸部分にコンジュゲートさせる。更に別の特定の態様では、FIXをアルブミンにコンジュゲートさせる。
従って第一の観点では、本発明は１つまたはそれ以上のシステイン残基を介してFIXにコンジュゲートした１つまたはそれ以上の生体適合性ポリマーを特長とする。ある態様では、１つまたはそれ以上のシステイン残基を介して１つまたはそれ以上のPEG部分をFIXにコンジュゲートさせる。
ある態様では、FIXコンジュゲートの生体適合性ポリマー部分は、FIX中でジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基に結合してもよい。従ってPEG含有リンカーはジスルフィド結合を架橋する。特定の態様では、生体適合性ポリマーは以下の式IのようにFIXにコンジュゲートされる：
式中、-S-はいずれもシステイン残基由来であってFIX中でジスルフィド結合を形成し、Qは直接結合できる結合基、アルキレン基（好ましくはC1-10アルキレン基）、または必要により置換されたアリールもしくはヘテロアリール基であり；
アリール基にはフェニル、ベンゾイル、およびナフチル基があり；
好適なヘテロアリール基にはピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン（primidine）、およびプリンがあり；
ポリマーへの結合は加水分解に不安定な結合または不安定でない結合であってもよい。
必要により置換されたアリールまたはヘテロアリール基上に存在してもよい置換基には、例えば以下から選択される１つまたはそれ以上の同一または異なる置換基がある：-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR'CO2R、-NO、-NHOH、-NR'OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR'COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン（例えばフッ素または塩素）、-C≡CR、-C=CR2、および13C=CHR（式中、 RまたはR'はそれぞれ独立して水素原子、アルキル（好ましくはC1-6）基、またはアリール（好ましくはフェニル）基を表す）。電子求引性置換基の存在は特に好ましい。
式Iのある態様では、PEGは以下の式IIのようにFIXにコンジュゲートされる：
実質的にFIXaを含有しないようにFIXのコンジュゲートを製造してもよい。特定の条件下においてFIXおよびFIXaが生体適合性ポリマー基質と反応する速度は異なりうる。理論に拘束される訳ではないが、反応速度の相違はFIXおよびFIXaのサイズの相違（FIXの分子量はFIXaより11kDa大きい）および／またはコンフォメーション構造（conformational structures）の相違に起因しうる。FIXの構造を図１に示すが、これはFIXからFIXaへの活性化の際に切断される活性化ドメインを含んでいる。結果として、コンジュゲートされる側鎖は、FIXまたはFIXaにおいて、ポリマー含有反応体に立体的によりアクセスしやすい可能性があり、アクセスが容易な残基ほどポリマー含有反応体との反応がより迅速となる。最終的に、この反応性の相違により、FIXおよびFIXaの速度論的分離が可能となる。
組換え技術によって生成したFIXは混入物として少量のFIXaを含有してもよい。これらの量は1u FIXa/1000 IU FIX程度のごく少量である場合もある（Grayら,Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4): 675-9）。ある条件下では、FIXコンジュゲート（例えばFIX-PEG）の生成速度はFIXa-PEGの生成速度より速い。この場合、FIXに対して化学量論的量または準化学量論的量のPEG試薬を反応混合物に添加してもよい。この場合、PEG試薬の全量がFIX-PEGコンジュゲートの生成に消費され、FIXaは未反応のままである。FIX-PEGコンジュゲートの特性（例えば分子量および極性）により、当該分野で公知の精製法を用いてFIXaからこれを容易に分離でき、限定されるわけではないがサイズ排除および／またはイオン交換クロマトグラフィーを精製段階で使用してもよい。
ある条件下では、FIXaコンジュゲート（例えばFIXa-PEG）の生成速度がFIX-PEGの生成速度より速い。それらの条件下では、FIXaに対して化学量論的に過剰量のPEG試薬を反応混合物に添加してもよい。この場合、FIXaの全量がFIXa-PEGの生成に消費され、（全量でなければ）ほとんどの量のFIXが未反応で非コンジュゲート状態のままであるように確実にすることが重要である。FIXa-PEGコンジュゲートの特性（例えば分子量および極性）により、当該分野で公知の技術を用いて非コンジュゲートFIXからこれを容易に分離することが可能となる。ある態様では、サイズ排除またはゲルろ過クロマトグラフィーによって非コンジュゲートFIXを精製する。その後、得られた純粋なFIXをPEGにコンジュゲートさせ、純粋なFIX-PEGコンジュゲートを得ることができる。
FIXコンジュゲートは未修飾FIX（すなわち生体適合性ポリマー（例えばPEG）が結合していないFIX）の生物学的活性を１つまたはそれ以上有する。FIXコンジュゲートはin vivoにおいて第XIaまたはVIIa因子および組織因子によって活性化されて、第IXa因子を産生することができる。本明細書に記載するアッセイを用いてFIXコンジュゲートの生物学的活性を測定してもよい。
未修飾のFIXに比較し、本発明のFIXコンジュゲートは薬物動態プロファイルの１つまたはそれ以上のパラメータ（例えば曲線化面積（AUC）、Cmax、クリアランス（CL）、半減期、血漿中滞留時間（plasma residence time）、および生物学的利用能）の向上を示しうる。
本明細書で患者へのペプチド薬物投与に関して使用する「曲線化面積」または「AUC」という用語は、患者の体循環中の薬物濃度を、ゼロから無限大まで変化させた時間の関数として示した曲線下の総面積と定義される。
本明細書で使用する「クリアランス」または「腎クリアランス」という用語は、１分間あたりに排泄される薬物量を含有する血漿の体積として定義される。
本明細書で患者へのペプチド薬物投与に関して使用する「半減期」または「t1/2」という用語は、患者の血漿薬物濃度が半減するのに必要な時間として定義される。複数のクリアランス機構、再分布、および当該分野で公知の他の機構によって、ペプチド薬物に関連する１つより多くの半減期が存在しうる。通常、アルファおよびベータ半減期は、アルファ相が再分布と関連し、ベータ相がクリアランスと関連するように定義される。しかしながら、（大部分が）血流に限局されるタンパク質薬物では、少なくとも２つのクリアランス半減期がありうる。アルファ相およびベータ相半減期に対するPEG化の厳密な影響は、当該分野で公知のように、サイズおよび他のパラメータによって種々である。「半減期」の更なる説明はPharmaceutical Biotechnology（1997, DFA CrommelinおよびRD Sindelar編, Harwood Publishers, Amsterdam, pp 101 120)に記載されている。
本明細書で患者へのペプチド薬物投与に関連して使用する「滞留時間」という用語は、薬物が投与後に患者の体内に残留する平均時間と定義される。
実質的にFIXaを含有しないFIXコンジュゲート含有組成物は、改善された安全性を示す。更に、実質的にFIXaを含有しないFIXコンジュゲート含有組成物は、血栓症を引き起こす可能性が低い。特定の態様では、純粋なFIXコンジュゲートを含有する組成物は、静脈血栓症を引き起こす可能性が低い。別の特定の態様では、純粋なFIXコンジュゲートを含有する組成物は動脈血栓症を引き起こす可能性が低い。
本発明のFIXコンジュゲートは血友病Ｂの治療に有用である。本明細書で使用する「治療する」、「治療すること」、または「の治療」という用語は、被験体の病状の重篤度が低減するか、少なくとも部分的に改善もしくは寛解すること、および／または少なくとも１つの臨床症状に一定の寛解、緩和、もしくは低減が見られること、および／または病状の進行に阻害もしくは遅延が見られること、および／または疾患もしくは疾病の発症の進行（the progression of the onset of）が遅延することを意味する。「治療する」、「治療すること」、または「の治療」という用語は疾病状態（例えば血友病Ｂ）を管理することも意味する。
本発明のFIXコンジュゲートは、血友病Ｂ患者にFIXを提供すること（本明細書に記載する治療的有効量のFIXコンジュゲートおよび組成物を投与することを含む）によってそれらの患者を治療するのに有用である。
本明細書で使用する「治療的に有効な」量とは、被験体に一定の改善または利益がもたらされる量である。あるいはまた、「治療的に有効な」量とは、少なくとも１つの臨床症状がある程度寛解、緩和、および／または低減される量である。本発明の方法で治療できる疾患に関連する臨床症状は当業者に公知である。更に、当業者に認識されるように、被験体に一定の利益がもたらされる限り、治療効果は完全または治癒的でなくてもよい。
特定の態様では、FIXaを含有しないFIXコンジュゲートを含む組成物により、血栓のリスクが低減された（これは平均血栓スコア（mean thrombus score）の低下によって証明される）血友病Ｂの治療法が提供される。
本明細書で使用する「平均血栓スコア」は以下のように定義される。血栓は0-4のスケールでスコアをつけることができる。スコア0は完全な流動性を有する血液を表す；スコア1ではフィブリンの小粒が存在する；スコア2では数個のより大きな血餅が存在する；スコア3では血餅が部分的に閉塞している；そしてスコア4はその部分が円柱状の固体をなっている状態を表す。平均血栓スコアはWesslerら（J. Appl. Physiol. 14:943-946 (1959)）のプロトコルに従い、3またはそれ以上の独立した実験から判定すべきである。
別の特定の態様では、FIXコンジュゲートの改善された特性により、血友病Ｂの予防的治療法が提供される。別の特定の態様では、FIXコンジュゲートを含有する組成物を、外科手術を受ける予定または外科手術後の回復期にある血友病Ｂ患者に投与してもよい。
血友病Ｂ治療のための患者へのFIXコンジュゲート投与は、他の治療薬、例えばトラネキサム酸、アミノカプロン酸、第II因子（プロトロンビン）、および／または第X因子（スチュワート・プラウワー（Stuart Prower）因子）と併せて行ってもよい。
本明細書に記載するFIXコンジュゲートは、医薬的に許容されるキャリアーと共に調製してもよい。本明細書で使用する「医薬的に許容される」という用語は、本発明の製剤に関連して使用する場合、その製剤が、いずれの既知の投与計画によって投与しても被験者に許容できないレベルの刺激を誘引しないことを意味する。刺激の例としてFIXへの過敏症反応がある。
FIXコンジュゲートの半減期が延長されていることにより、医薬組成物は一般に投与されるFIXより低い投与量で効果的に血友病を治療できる可能性がある。本発明の医薬製剤を非経口投与用に調製してもよく、それらには、限定されるわけではないが皮内、皮下、および筋肉内注射、並びに静脈内または骨内注入がある。本発明の医薬製剤は投与経路によって、FIXコンジュゲート（例えばFIX-PEG）および医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、またはキャリアーを含有する溶液、懸濁液、エマルジョンの形態であってもよい。
本発明の医薬組成物は、治療量のFIXコンジュゲートを送達するように調製する。FIXコンジュゲートの用量は国際単位（IU）で表してもよい。本明細書で使用する「国際単位」または「IU」という用語は、世界保健機関国際標準を参照として有効性を表すために割り当てられた数値である。この割り当て値によれば、1 IUの第IX因子活性／kg体重は、健常ヒト血漿プール１ｍL中の第IX因子活性とほぼ等しく、第IX因子の血漿濃度を1%上昇させる。
医薬製剤に含有されるFIXコンジュゲートの用量は1 IUから10,000 IUの範囲であってもよい。ある態様では、FIXコンジュゲートの用量は100 IUから5000 IU、または200 IUから2500 IUである。ある態様では、FIXコンジュゲートの用量は約250 IU、約500 IU、約1000 IU、または約2000 IUである。
FIXコンジュゲートを血友病Ｂを治療するのに十分な量で投与する。本明細書で使用する「十分な量」または特定の結果を得る「ために十分な量」とは、所望の効果を得る（この効果は必要により治療効果である（すなわち、治療的有効量の投与による））のに有効なFIXコンジュゲートの量をいう。例えば「十分な量」または「ために十分な量」は関節血症、出血、消化管出血、および月経過多のリスクを低減するのに有効な量であってもよい。
ある態様では、FIXコンジュゲートの用量は、循環第IX因子活性の濃度が1 IU/kg-150 IU/kgとなるのに十分な量である。別の態様では、循環第IX因子活性の濃度が10 IU/kg-120 IU/kgとなるような量で組成物を投与する。別の態様では、循環第IX因子活性の濃度が20 IU/kg-100 IU/kgとなるような量で組成物を投与する。
本発明のコンジュゲートは未修飾のFIXと同じ方法で使用できる。しかしながらFIXコンジュゲートの改善された特性により、本発明の医薬製剤は非コンジュゲートFIXより少ない頻度で投与できる。例えば、未修飾の組換えFIXの1日1回の代わりに、FIXコンジュゲートは週1回投与をしてもよい。また本発明には投与計画も含まれ、同投与計画ではFIX誘導体を１日２回、1日1回、２、３、もしくは４日に１回、または週１回投与して血友病Ｂを効果的に治療してもよい。投与頻度が少なければ患者の服薬遵守の向上（ひいては治療効果の向上）並びに患者のクォリティーオブライフの向上につながることが期待される。
３． 図面の簡単な説明
アミノ酸配列、構造、および種々のドメインを示す第IX因子の略図である。 マウス血清中の非コンジュゲートFIX-PEGの循環半減期を示す。 マウス血清中の10kDa FIX-PEGの循環半減期を示す。 マウス血清中の20kDa FIX-PEGの循環半減期を示す。
４． 発明の詳細な説明
本発明は、FIXaを実質的に含有しないFIXコンジュゲートを提供するために、１つまたはそれ以上の生体適合性ポリマーにコンジュゲートさせたFIXについて記載する。本明細書に記載するFIXコンジュゲートは、未修飾FIXに比較して改善された生物学的および薬物動態学的特性（限定されるわけではないが、例えば循環半減期または血漿中滞留時間の延長）を有する。更にまた、本明細書に記載するコンジュゲートは抗体応答に対する感受性がより低い。本発明は、それらのコンジュゲートの調製法にも関する。特定の態様では、FIXコンジュゲートはFIX-PEGコンジュゲートである。更に本発明はFIXコンジュゲートを血友病Ｂの治療に用いる方法にも関する。
本発明は特に、生体適合性ポリマーが１つまたはそれ以上のシステイン残基にコンジュゲートしたFIXコンジュゲートに関する。ある態様では、コンジュゲートは、１つまたはそれ以上のPEG基が１つまたはそれ以上のシステイン残基を介してFIXにコンジュゲートしたFIX-PEGコンジュゲートである。特定の態様では、FIX-PEGコンジュゲートは、２つのシステイン残基に同時に結合してPEG中にジスルフィド結合を形成した１つまたはそれ以上のPEG基を含有する。これらのコンジュゲートの生成は、ジスルフィド結合の還元的開裂と、その後の、PEG部分を両方のチオ基に結合させる反応によって行ってもよい。得られるFIXコンジュゲートは、ジスルフィド結合を形成した2つの硫黄に架橋するPEG部分を含有する。
本発明の組成物はFIXaを実質的に含有しないFIX-PEGコンジュゲートを含有する。本発明の組成物は、微量のFIXa混入物を含有するFIX組成物に比較して血栓スコアが低く、従って血栓溶解事象（限定されるわけではないが静脈および／または動脈血栓症など）のリスクが低減される。
本発明はまた、生体適合性ポリマー部分とのコンジュゲーション反応におけるFIXコンジュゲートとFIXaコンジュゲートの生成速度の差異を利用してFIXをFIXaから精製する方法にも関する。これによってFIXおよびFIXaが速度論的に分離される。ある態様では、生体適合性ポリマーはPEGである。
本発明のFIXコンジュゲートは、未修飾のFIXに比較して改善された薬物動態学的プロファイルを有する。
本発明の別の観点は、FIXコンジュゲートおよび医薬的に許容しうる希釈剤、アジュバント、またはキャリアーを含有する医薬組成物を、それを必要としている患者に投与することを含む血友病Ｂの治療法である。本明細書では本発明のFIXコンジュゲートの投与に関して使用する場合、「それを必要とする患者」という用語は血友病Ｂと診断された、および／または第IX因子が欠損している患者を指す。
４．１ 組換え第IX因子
当該分野で公知のいずれの方法で生成した組換え第IX因子も、本発明に従う誘導体化およびコンジュゲーションを意図される。好ましいFIXは以下の特許および文献の１つまたはそれ以上に記載される方法を用いて生成できる（それらの特許および文献はそれぞれ、参照により、本明細書にその全体が記載されるのと同じように本明細書に組み込まれる）：米国特許第5,268,275号、第5,171,569号、第5,888,809号、第6,531,298号；国際特許出願WO 2005/030039、WO 2006/101474、WO 2006/089613；米国特許出願第2003/0220247号、第2005/0271644号、第2006/0121574号、および第2006/0194284号。
ある態様では、FIXは凍結乾燥またはフリーズドライされている。好ましい態様では、FIXは凍結乾燥またはフリーズドライされていない。ある態様では、FIXは抗凍結剤、例えばスクロースまたはトレハロースに暴露される。好ましい態様では、FIXは抗凍結剤、例えばスクロースまたはトレハロースに暴露されていない。
４．２ 第IX因子コンジュゲート
本発明のFIXコンジュゲートは、薬物動態プロファイル(例えばAUC、Cmax、クリアランス（CL）、半減期、血漿中滞留時間、および生物学的利用能)の１つまたはそれ以上のパラメータで、未修飾FIXに比較して改善が見られうる。FIXコンジュゲートはin vivoにおいて未修飾FIXに比較して高い臨床活性を示しうる。本発明のコンジュゲートは改善された有効性および安定性を有しうる。
本明細書に記載するFIXコンジュゲートは、当該分野で公知のクロマトグラフィー法によりFIXaから精製および単離できる。方法には、限定されるわけではないがイオン交換クロマトグラフィーおよびサイズ排除クロマトグラフィーがある。本発明のFIXコンジュゲートは未修飾FIXの生物学的活性の１つまたはそれ以上を有する。FIXのコンジュゲートはin vivoにおいて第XIa因子または第VIIa因子および組織因子によって活性化され、第IXa因子を生成しうる。FIXコンジュゲートの生物学的活性は、本明細書に記載するアッセイを用いて測定してもよい。
本発明に従って修飾するFIXは、天然の供与源(例えばヒト血漿)から入手および単離してもよい。本明細書に従って修飾するFIXは組換え技術によって発現させてもよい。
ある態様では、コンジュゲートのFIX成分は図１に示すヒトFIXと同じ配列を有する。あるいはまた、FIXの配列を１つまたはそれ以上のアミノ酸配列の変更（限定されるわけではないが、例えば挿入、欠失、または置換）を含むように改変または誘導体化してもよい。
FIX-PEGコンジュゲートは、循環半減期および血漿中滞留時間の延長、クリアランスの低下、およびin vivoにおける臨床活性の増加をもたらしうる。FIXの改変は、そのアミノ酸残基（限定されるわけではないが、例えばリジン、ヒスチジン、アルギニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、セリン、システイン）並びにタンパク質のN-末端α-アミノ基およびC-末端カルボキシル基の１つまたはそれ以上を介してポリエチレングリコールポリマーと共有結合させることによって行ってもよい。ポリエチレングリコールポリマー・ユニットは直鎖または分枝鎖であってもよい。
FIX-PEGコンジュゲートは静脈内注射または皮下注射によって送達してもよい。FIX-PEGコンジュゲートは錠剤、カプセル、溶液、または懸濁液として調製し、経口投与してもよい。
本発明のある観点は、PEGがFIXの１つまたはそれ以上のアミノ（amine）基に結合したFIX-PEGコンジュゲートである。本発明の別の観点は、ポリエチレングリコールポリマーがFIXの１つまたはそれ以上のカルボキシル基に結合したFIX-PEGコンジュゲートである。本発明の別の観点は、ポリエチレングリコールポリマーがFIXの１つまたはそれ以上のアルコール基に結合したFIX-PEGコンジュゲートである。特定の態様では、PEG含有部分はシステインのチオール側鎖に結合していてもよい。別の特定の態様では、PEG含有部分は２つのシステイン・チオール基と架橋し、天然のFIX中にジスルフィド結合を形成していてもよい。
本発明の別の観点は、ポリエチレングリコールポリマーがリジン残基に結合したFIX-PEGコンジュゲートである。FIX中のリジンのε-アミノ基は、種々の技術（限定されるわけではないが、例えばアルキル化およびアシル化）によって容易にPEG化できる。
本発明の別の観点は、ポリエチレングリコールポリマーがN-末端α-アミノ基に結合したFIXコンジュゲートである。FIXのN-末端α-アミノ残基は、種々の技術（限定されるわけではないが、例えばN-末端α-アミノ基のアルキル化またはアシル化）によってPEGコンジュゲートを形成できる。
本発明の別の観点は、PEGがコンジュゲートしたシステイン残基を１つまたはそれ以上含有するFIXコンジュゲートである。PEGユニットのシステイン残基へのコンジュゲーションは、ジスルフィド（-S-S-）結合の切断を必要としうる。
ある態様では、１つまたはそれ以上の生体適合性ポリマーは、１つまたはそれ以上のシステイン残基を介してFIXに結合している。特定の態様では、FIXコンジュゲートの生体適合性ポリマー部分は、FIX中にジスルフィド結合を形成する２つのシステイン残基に結合している。別の特定の態様では、PEGポリマーは以下の式に示すようにFIXにコンジュゲートしている：
式中、Qは直接結合できる結合基、アルキレン基（好ましくはC1-10アルキレン基）、または必要により置換されたアリールもしくはヘテロアリール基であり；
アリール基にはフェニルおよびナフチル基があり；
好適なヘテロアリール基にはピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンがあり；
ポリマーへの結合は加水分解に不安定な結合または不安定でない結合であってもよい。
必要により置換されたアリールまたはヘテロアリール基上に存在してもよい置換基には、例えば以下から選択される１つまたはそれ以上の同一または異なる置換基がある：-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR'CO2R、-NO、-NHOH、-NR'OH、-C=N-NHCOR、-C=N-NR'COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、ハロゲン（例えばフッ素または塩素）、-C≡CR、-C=CR2、および13C=CHR（式中、 RまたはR'は独立して水素原子またはアルキル（好ましくはC1-6）もしくはアリール（好ましくはフェニル）基を表す）。電子求引性置換基の存在は特に好ましい。
更に別の特定の態様では、PEGは以下の式のようにFIXにコンジュゲートされる：
FIXとコンジュゲートを形成するポリエチレングリコールポリマーには種々の異なるタイプがある。１つのポリエチレングリコール鎖を含有する直鎖型PEGポリマーがあり、また、分枝型またはマルチアーム型PEGポリマーもある。分枝型ポリエチレングリコールは、互いを一体化する基によって結合された２つまたはそれ以上の独立した直鎖型PEG鎖を含有する。例えば、２つのPEGポリマーがリジン残基によって互いに結合していてもよい。一方の直鎖型PEGがα-アミノ基に結合し、他方のPEG鎖がε-アミノ基に結合する。リジン・コアの残されたカルボキシル基はタンパク質への共有結合に利用可能なままである。直鎖型および分枝型ポリエチレングリコールポリマーはいずれも、種々の分子量のものが市販されている。
本発明のある観点では、FIX-PEGコンジュゲートはFIXに結合する１つまたはそれ以上の直鎖型ポリエチレングリコールポリマーを含有し、各PEGの分子量は約2kDaから約100kDaである。本発明の別の観点では、FIX-PEGコンジュゲートはFIXに結合する1つまたはそれ以上の直鎖型ポリエチレングリコールポリマーを含有し、各直鎖型PEGの分子量は約5kDaから約40kDaである。ある態様では、各直鎖型PEGの分子量は約5kDaから約20kDaである。ある態様では、各直鎖型PEGの分子量は約10kDaである。ある態様では、各直鎖型PEGの分子量は約10kDa未満である。特定の態様では、FIX-PEGコンジュゲートはFIXに結合した1つより多い直鎖型PEGポリマー、例えばFIXに結合した２つ、３つ、または４つの直鎖型PEGポリマーを含有する。ある態様では、FIX-PEGコンジュゲートは２つの直鎖型PEGポリマーを含有し、各直鎖型PEGの分子量は約10kDaである。
本発明のFIX-PEGコンジュゲートはFIXに結合した1つまたはそれ以上の分枝型PEGポリマーを含有してもよく、各分枝型PEGの分子量は約2kDaから約100kDaである。本発明の別の観点では、FIX-PEGコンジュゲートはFIXに結合した1つまたはそれ以上の分枝型ポリエチレングリコールポリマーを含有し、各分枝型FIXの分子量は約5kDaから約40kDaである。ある態様では、各分枝型PEGの分子量は約5kDaから約20kDaである。ある態様では、各分枝型PEGの分子量は約10kDaである。ある態様では、各分枝型PEGの分子量は約10kDa未満である。特定の態様では、FIX-PEGコンジュゲートはFIXに結合した1つより多い分枝型PEGポリマー、例えばFIXに結合した２つ、３つ、または４つの分枝型PEGポリマーを含有する。ある態様では、FIX-PEGコンジュゲートは２つの分枝型PEGポリマーを含有し、各分枝型PEGポリマーの分子量は約10kDaである。
FIX-PEGコンジュゲートは、当該分野で公知のクロマトグラフィー法（限定されるわけではないが、例えばイオン交換およびサイズ排除クロマトグラフィー）を用いて精製してもよい。
４．３ 第IX因子誘導体の生成法
４．３．１ システイン残基のPEG化法
当該分野には、ポリエチレングリコールがコンジュゲートしたシステイン残基またはPEG化されたシステイン残基を生成するための多くの方法が存在する。これらの方法の利点はシステインに選択的であることであり、これは他の側鎖がこれらの方法の影響を受けずに保存されることを意味する。スキーム１ａでは、活性化されたジスルフィド、PEGオルト-ピリジル-ジスルフィドがチオールと反応し、より安定な対称ジスルフィドを形成する。スキーム１ｂでは、マイケル付加反応により、活性化された２重結合へのチオール付加を介してシステイン残基がPEG-マレアミドと反応する。スキーム１ｃでは、PEG-ビニルスルホンの活性化された末端ビニル基上でチオールによるコンジュゲート攻撃が起こるにより、PEG化されたシステイン残基が生成される。式１ｄでは、システインのチオールが求核攻撃によってヨウ素を置換し、PEGがコンジュゲートしたシステイン残基を生ずる。
スキーム２に示す方法を用いて、共に１つのジスルフィド結合を形成する２つのシステイン基を選択的にPEG化してもよい。まず天然のジスルフィド結合を還元する。この結合から得られるチオールのうちの一方が求電子基を求核的に攻撃する（例えばエノンへの1,4-付加）。次いで脱離基（例えばスルホン）が脱離する。この脱離によって第２のエノンが生じた後、残りのチオールによる1,4-付加によってPEG基が結合した架橋ジスルフィドが生成される。
スキーム２に示す方法を用いて、２つまたはそれ以上の独立したPEG部分がコンジュゲートしたFIXコンジュゲートを調製してもよい。例えば第１の天然ジスルフィド結合を当該分野で公知の制御された条件下で還元する。次いでスキーム２に従って第１のPEG部分をそれに結合させる。続いて、第２のジスルフィド結合を、例えば当該分野で公知の、より完全性の高い還元条件下で還元する。その後、再びスキーム２に従って第２のPEG部分をそれに結合させる。必要により、このマルチステップ工程を反復する。
４．３．２ 高純度FIXの生成法
FIXの生体適合性ポリマーへのコンジュゲーションにより、高純度のFIXコンジュゲートを生成する方法が提供される。特に、FIXaの存在下でFIXaコンジュゲートを生成させずにFIXコンジュゲートを生成する方法は非常に有益である。FIXコンジュゲートはクロマトグラフィー法（例えばイオン交換またはサイズ排除クロマトグラフィー）によって容易にFIXaから分離してもよい。
ある態様では、FIX-PEGの生成速度はFIXa-PEGより速い。FIXの選択的コンジュゲーションのための反応を以下のスキーム３に示す。
微量のFIXaの存在下でFIXの反応混合物に化学量論的量のPEG試薬を添加する。別の態様では、反応混合物中のPEG試薬／FIX比は約0.1から約1.5である。別の態様では、PEG試薬／FIX比は約0.1から約1.0である。別の態様では、PEG試薬／FIX比は約1.0から約1.5である。別の態様では、PEG試薬／FIX比は約0.1から約0.5である。別の態様では、PEG試薬／FIX比は約0.5から約0.7である。別の態様では、PEG試薬／FIX比は約0.7から約1.0である。
ある態様では、PEG試薬を一回の添加で反応混合物に加えてもよい。別の態様では、一定時間にわたって徐々にPEG試薬を添加する。約1、2、6、12、18、または24時間にわたってPEG試薬を添加してもよい。反応の進行をモニターしてもよく、それらの方法には、限定されるわけではないが質量分析、高速タンパク質液体クロマトグラフィー（FPLC）、またはドデシル硫酸ポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）がある。FIXaがFIXa-PEGコンジュゲートに変換されないことを確実にすることが重要である。ある態様では、FIXはほぼ定量的にFIX-PEGに変換される。別の態様では、FIXはFIX-PEGに、約80%から90％の変換率、70%から80％の変換率、60%から70％の変換率、50%から60％の変換率、40%から50％の変換率、30%から40％の変換率、30%から40％の変換率、20%から30％の変換率、または10%から20％の変換率で変換される。未反応のFIXを再利用し、更なるコンジュゲーション反応を行ってもよい。
FIX-PEGコンジュゲートをイオンアフィニティーまたはサイズ排除クロマトグラフィーによって反応混合物から容易に分離してもよい。分離段階後、得られるFIX-PEGコンジュゲートが実質的にFIXaを含有しないことを確実にすることが重要である。これはGray ら, Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9に記載される方法または以下の５．３項に記載する方法によって確認できる。
別の態様では、FIXa-PEGコンジュゲートの生成速度はFIX-PEGより速い。その後、本明細書に記載するクロマトグラフィー法によって未反応のFIXをFIXa-PEGコンジュゲートから分離する。純粋なFIX-PEGを生成するために、残存する精製FIXで更にPEG化反応を行ってもよい。このような状況下で精製FIX-PEGを合成しうる方法をスキーム４に示す。
これらの条件下で、FIXaに対して化学量論的に過剰量のPEG試薬を反応混合物に添加してもよい。ある態様では、反応混合物中のPEG試薬／FIXa比は約100から約1000である。別の態様では、PEG試薬／FIX比は約10から約100である。別の態様では、PEG試薬／FIX比は約1.1から約10である。
FIXaの全量がFIXa-PEGの生成に消費されることを確実にすることが重要である。FIXa-PEGコンジュゲートの特性（例えば分子量および極性）により、当該分野で公知の方法を用いてこれを非コンジュゲートFIXから容易に分離できる。ある態様では、サイズ排除またはゲルろ過クロマトグラフィーによって非コンジュゲートFIXを精製する。
４．４ 生物学的活性のアッセイ法
本発明のFIXコンジュゲートは未修飾FIXの生物学的活性の1つまたはそれ以上を有する。本発明の方法に従って調製したFIXコンジュゲートの活性を測定する方法は、当該分野で公知の方法（例えばBiggs（1972, Human Blood Coagulation Haemostasis and Thrombosis (第1版), Oxford, Blackwell, Scientific, pg. 614）に記載される一段階活性化部分トロンボプラスチン時間アッセイ（one stage activated partial thromboplastin time assay））を用いて実施することができる。手短に言えば、本発明の方法に従って調製したFIXコンジュゲートの生物学的活性をアッセイするために、等量の活性化部分トロンボプラスチン試薬、当該分野で公知の静脈切開術によって血友病Ｂ患者から単離したFIX欠損血漿、および標準として正常血漿プール、またはサンプルを用いてアッセイを実施してもよい。このアッセイでは、１ユニットの活性は、１ミリリットルの正常血漿プール中に存在する活性の量と定義される。更に、FIX欠損患者由来血漿の凝固時間を正常にまで低下させるFIXの能力に基づく生物学的活性アッセイを、例えばProctorおよびRapaport（1961, Amer. J. Clin. Path. 36: 212）に記載されるように実施することができる。FIXaが混入していないことを確実にするためのFIXコンジュゲートの生物学的活性も、５．３項に記載するアッセイを用いて測定できる。
４．４．１ 医薬組成物
本発明はFIXコンジュゲートを活性成分として含有する医薬組成物に関する。FIXコンジュゲートは医薬的に許容されるキャリアーと共に調製してもよい。FIXコンジュゲートの延長された半減期の故に、医薬組成物は血友病Ｂを効果的に治療するために一般的に投与される用量より少ない用量のFIXを含有してもよい。本発明の医薬製剤は非経口投与（限定されるわけではないが皮内、皮下、および筋肉内注射、並びに静脈内または骨内注入）用に調製してもよい。本発明の医薬製剤は投与経路によって、FIXコンジュゲート（例えばポリエチレングリコールで化学的に修飾したFIX）および医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、またはキャリアーを含有する溶液、懸濁液、またはエマルジョンの形態であってもよい。
本発明の医薬組成物は治療量のFIXコンジュゲートを送達するように調製してもよい。FIXコンジュゲートの用量は国際単位（IU）で表してもよい。医薬製剤に含有されるFIXコンジュゲートの量は1 IU-10,000 IUの範囲であってもよい。ある態様では、FIXコンジュゲートの量は100 IU-5000 IU、または200 IU-2500 IUの範囲であってもよい。ある態様では、FIXコンジュゲートの量は約250 IU、約500 IU、約1000 IU、または約2000 IUであってもよい。
ある態様では、本発明の医薬組成物は、例えば類似の非コンジュゲートFIX医薬組成物に比較して、有利な免疫原性を示す。ある態様では、本発明の医薬組成物は、類似の非コンジュゲートFIX医薬組成物より実質的に免疫原性が低い、または実質的に免疫原性を示さない。関連する態様では、有利な免疫原性を有するそれらの医薬組成物は、例えば血友病Ｂの治療法において、患者に皮下投与することが可能である。
４．５ 血友病Ｂの治療法
本明細書に記載するFIXコンジュゲートにより、血友病Ｂの治療法が提供される。本発明の医薬組成物は治療量のFIXコンジュゲートを送達するように調製する。ある態様では、FIXコンジュゲートの用量は、被験体中の循環FIX活性の濃度が1 IU/dL-150 IU/dLとなるのに十分な量である。別の態様では、被験体中の循環FIX活性の濃度が10 IU/dL-120 IU/dLとなるような用量で組成物を投与する。別の態様では、被験体中の循環FIX活性の濃度が20 IU/dL-100 IU/dLとなるような用量で組成物を投与する。
ある態様では、FIXコンジュゲートの活性は類似の非コンジュゲートFIXの活性の約100%である。ある態様では、FIXコンジュゲートの活性は類似の非コンジュゲートFIXの活性の約80%、60%、または40%より高い。好ましい態様では、FIXコンジュゲートの活性は類似の非コンジュゲートFIXの活性の約20%より高い。好ましくはないが、活性は20％未満、例えば、10%、5%、または1%であってもよく、それでもなお、非コンジュゲートFIXに比較して有利に使用できる。
FIXコンジュゲートを投与されている患者では、医療従事者によってFIX活性をモニタリングする必要がありうる。本明細書に記載するFIXコンジュゲートを外科手術を受ける、またはその後の回復期にある血友病Ｂ患者に投与してもよい。
更にまた、本明細書に記載するFIXコンジュゲートは、有害な血栓溶解（thrombolytic）事象を誘引しうるFIXa混入物を含有しない。従って、本明細書に記載するFIXコンジュゲートおよびFIXコンジュゲートの製造法では純粋なFIXコンジュゲートが生成され、平均血栓スコアで測定される有害な血栓生成がより起こりにくい。ある態様では、FIXコンジュゲート組成物の平均血栓スコアは３回またはそれ以上の独立した測定の結果で１未満である。別の態様では、３回またはそれ以上の独立した測定結果の平均血栓スコアは0.5未満である。別の態様では、３回またはそれ以上の独立した測定結果の平均血栓スコアは0.3未満である。別の態様では、３回またはそれ以上の独立した測定結果の平均血栓スコアは0.1未満である。更に別の態様では、３回またはそれ以上の独立した測定結果の平均血栓スコアは0である。
ある態様では、FIXコンジュゲートの投与量は、類似する非コンジュゲートFIXで必要な投与量とほぼ同じである。ある態様では、FIXコンジュゲートの投与量は類似する非コンジュゲートFIXで必要な投与量の約2倍、約3倍、約4倍、または約5倍である。
本発明は、FIXコンジュゲートおよび更なる治療薬を、それを必要としている患者に投与することによって血友病Ｂを治療する方法にも関する。更なる治療薬はトラネキサム酸、アミノカプロン酸、第II因子（プロトロンビン）、および／または第X因子（スチュワート・プラウワー因子）の1つまたはそれ以上であってもよい。
FIXコンジュゲートおよび更なる治療薬は、連続的または同時に投与してもよい。連続的に投与する場合、投与の順序はフレキシブルである。例えばFIXコンジュゲートを投与した後、更なる治療薬を投与してもよい。あるいは、更なる治療薬を投与した後、FIXコンジュゲートを投与してもよい。
別個の組成物で投与する場合も１つの組成物で投与する場合も、それぞれの組成物は医薬的に投与に好適であるのが好ましい。更に、別個に投与する場合、FIXコンジュゲートおよび治療薬を同じ、または異なる投与様式で投与してもよい。
ある態様では、本発明のFIXコンジュゲートは類似の非コンジュゲートFIXと実質的に同じ医薬効果を示す。例えばある態様では、本発明のFIXコンジュゲートの投与により、フィブリンによって誘導される正常な凝固（血液凝固）が起こる。
４．５．１ 投与計画
投与計画は、血友病Ｂ患者に本発明のコンジュゲートを１日２回、１日１回、隔日１回、週２回、週１回、隔週１回、または月１回投与することを含む。
医療従事者はFIXコンジュゲート投与を受ける患者のFIX活性をモニタリングし、投与計画を適宜変更してもよい。ある態様では、FIXコンジュゲートの投与直後に患者のFIX活性を測定する。別の態様では、FIXコンジュゲート投与の0.5時間後、1時間後、6時間後、12時間後、または24時間後に患者のFIX活性を測定する。別の態様では、FIXコンジュゲート投与の2日後、4日後、1週間後、2週間後、または3週間後に患者のFIX活性を測定する。
５． 実施例
５．１ FIXコンジュゲートの合成
本発明のFIXコンジュゲートは当該分野で公知の合成法を用いて容易に合成できる。以下の合成例でFIX-PEGコンジュゲートの合成を示す。
５．１．１ 実施例１：ジスルフィド結合架橋によるFIXのPEG化
第IX因子に2-メルカプトエタノール尿素溶液（aqueous urea solution 2-mercaptoethanol）を添加する。10％メチルアミン水溶液を用いて、得られた溶液のpHを8.5に調整する。次いで反応液に窒素を約30分間通気する。更に窒素をパージしつつ、試験管を37℃で加熱する。次いで反応混合物を氷塩水浴中で冷却し、アルゴンパージした冷1N HCl：無水エタノール溶液10mLを反応液に添加する。沈殿が起こり、遠心分離によってこれを単離した後、更なるHCl：無水エタノール混合液で3回、窒素パージした冷ジエチルエーテルで2回洗浄する。各洗浄後、遠心分離で沈殿を単離する。次いで洗浄した沈殿を窒素パージした脱イオン水に溶解し、凍結乾燥して乾燥固体を得る。エルマン試験（タンパク質分子あたりの遊離チオール数が得られる）を用いて、FIXの部分的還元を確認および定量してもよい。
エッペンドルフ中で、部分的に還元されたFIXをアルゴンパージしたpH 8のアンモニア溶液に溶解する。別のエッペンドルフ中で、ポリマーコンジュゲート試薬、すなわちポリ（エチレン）グリコールから誘導したα-メトキシ-ω-4-［2,2-ビス［（p-トリルスルホニル）-メチル］アセチル］ベンズアミドをアンモニア溶液に溶解し、得られた溶液を第IX因子溶液に添加する。PEGのエッペンドルフを新たなアンモニア溶液で洗浄し、これも反応用のエッペンドルフに添加する。次いで、反応用エッペンドルフをアルゴン雰囲気下で閉じ、37℃で約24時間加熱した後、室温まで冷却させる。その後、冷却した反応液をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析する。
５．１．２ 実施例２：FIXa混入物の存在下でのFIX-PEGの選択的生成および精製
FIXaが混入したFIXを含有する反応混合物に、2-メルカプトエタノール尿素溶液を添加する。10%メチルアミン水溶液を用いて、得られた溶液のpHを8.5に調整する。次いで反応液に窒素を約30分間通気する。更に窒素をパージしつつ、試験管を37℃で加熱する。次いで反応混合物を氷塩水浴中で冷却し、アルゴンパージした冷1N HCl：無水エタノール溶液10mL を反応液に添加する。沈殿が起こり、遠心分離によってこれを単離した後、更なるHCl：無水エタノール混合液で3回、窒素パージした冷ジエチルエーテルで2回洗浄する。各洗浄後、遠心分離で沈殿を単離する。次いで洗浄した沈殿を窒素パージした脱イオン水に溶解し、凍結乾燥して乾燥固体を得る。エルマン試験（タンパク質分子あたりの遊離チオール数が得られる）を用いて、FIXの部分的還元を確認および定量してもよい。
エッペンドルフ中で、部分的に還元されたFIXをアルゴンパージしたpH 8のアンモニア溶液に溶解する。別のエッペンドルフ中で、１当量未満のポリマーコンジュゲート試薬、すなわちポリ（エチレン）グリコールから誘導したα-メトキシ-ω-4-［2,2-ビス［（p-トリルスルホニル）-メチル］アセチル］ベンズアミドをアンモニア溶液に溶解し、得られた溶液をFIX溶液に添加する。PEGのエッペンドルフを新たなアンモニア溶液で洗浄し、これも反応用のエッペンドルフに添加する。次いで、反応用エッペンドルフをアルゴン雰囲気下で閉じ、37℃で約24時間加熱した後、室温まで冷却させる。その後、冷却した反応液をドデシル硫酸ナトリウムポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）で分析する。次に、FIX-PEGをサイズ排除クロマトグラフィーによって反応混合物から精製する。
単離した生成物をGray ら, Thromb. Haemost. 1995 Apr; 73(4):675-9に記載される方法または以下の５．３項に記載する方法によって更に分析し、FIXa混入物のレベルを測定してもよい。
５．２ 組換え第IX因子の生成
５．２．１ 実施例３：第IX因子遺伝子でのCHO細胞の第１次トランスフェクション
96ウェルプレート中で、野生型第IX因子遺伝子をCHO細胞に限界希釈でトランスフェクトする。第IX因子遺伝子はCHEF-1プロモーターの制御下にある。細胞を5％血清中で14日間増殖させる。細胞培養液を回収し、第IX因子抗原の総量（μg/mL）を第IX因子ELISA法によって定量する。150以上のクローンを評価し、クローンあたりで生成される第IX因子の総量を測定する。
第IX因子遺伝子でトランスフェクトしたCHO細胞は第IX因子抗原を生成し、これを第IX因子ELISAで検出する。
５．２．２ 実施例４：第IX因子生成CHO細胞のVKGCおよびVKOR遺伝子でのスーパートランスフェクション
第IX因子でトランスフェクトしたCHO細胞中で生成される活性第IX因子のパーセンテージを増加するために、第1次トランスフェクタントをプールし、組織培養液中で拡張培養し、第IX因子の効率的なビタミンK依存性γ-カルボキシル化に重要であると一般的に考えられている酵素のcDNAを含有するベクターでスーパートランスフェクトする。第IX因子生成クローンを撹拌フラスコにプールし、ビタミンK依存性γ-カルボキシラーゼ（VKGC）およびビタミンK依存性エポキシド還元酵素（VKOR）のcDNAでスーパートランスフェクトする。独立してスーパートランスフェクトした細胞を96ウェルプレートで、限界希釈により5％血清中14日間増殖させた。mLあたりで生成される第IX因子抗原の総量を第IX因子ELISAで測定する。活性化第IX因子の量を、APTT凝固アッセイにより、基質として第IX因子欠損血漿、標準として血漿由来第IX因子を用いて測定する。
５．３ FIXコンジュゲートのバイオアッセイ
５．３．１ 実施例５：FIX-PEGおよびFIXaアッセイ
精製FIX-PEG組成物をアッセイし、FIX-PEGの活性並びにFIXaまたはFIXa-PEG混入物の活性を測定する。アッセイは、FIXに関してはSmith, K. J.ら, Blood, 72, 1269-1277 (1988)、FIXa混入に関してはVaradi, K.ら, Thromb. Haemos., 35, 576-585 (1976)に記載されるプロトコルに従って実施する。
５．３．２ 実施例６：in vivoにおけるFIX-PEG組成物の血栓形成アッセイ
本実施例を用いて、実施例２の方法に従って精製したFIXコンジュゲートがFIXa混入による望ましくない凝固を起こすか否かを、in vivoにおけるウェスラーウサギうっ血アッセイ（Wessler Rabbit Stasis Assay）による血栓形成性の測定によって判定する。
Wesslerら, J. Appl. Physiol. 14:943-946 (1959)の方法に従い、in vivoで、分離および結紮したウサギ頸静脈部分にFIX製剤を注射し、うっ血性血栓の形成を評価した。Wesslerらの系の後、血餅のサイズに従ってスコアリングを行った。「＋４」は選択した血管のサイズおよびタイプにおいて血栓形成物質によって通常形成されうる血餅の最大サイズを表し、「＋１」は目視で検出できる最小サイズの血餅である。実験は3回反復し、算術平均を測定した。
５．３．３ 実施例７：精製FIX-PEG組成物中の微量のFIXaおよびFIXa-PEGの検出
TBS/1%ヒトアルブミンで希釈した参照FIXa（25μL）またはTBS/1%ヒトアルブミンに混合した試験FIXの濃度希釈液25μLを96ウェル・マイクロタイタープレートに注入し、37℃とした。等量のヒトFX、ウシ脳リン脂質、および組換えデスルファトヒルジン（desulphatohirudin）を含有するアッセイ試薬を37℃で5分間加温する。次いで、等量ずつの加温した組換えFVIIIおよびCaCl2をアッセイ試薬に添加する。混合直後、この試薬125μLをFIXまたはFIXaサンプルを含むウェルに添加する。37℃で20分間FXaを生成させた後、50μLを100μLのS-2765（Quadratech、英国エプソン市）に添加する。2分間インキュベートした後、50μLの50％酢酸を添加して反応を停止し、吸光波長を測定する。その後、この波長で試験基質の吸光レベルを測定し、試験混合液中のFIXaを定量する。
５．３．４ 実施例８：10kDa FIX-PEGおよび20kDa FIX-PEGと非コンジュゲートFIXの循環半減期の比較
実施例１および２に記載する方法を用いて10kDaのFIX-PEGおよび20kDaのFIX-PEG（それぞれのPEG部分は直鎖である）を調製する。
非コンジュゲートFIX、10kDa FIX-PEG、および20kDa FIX-PEGをFIX欠損マウスに投与し、それぞれの血漿濃度をELISAおよび発色によって、投与の15分後から48時間後まで測定した。平均血漿濃度をそれぞれ図２、３、および4に示す。投与後約15分から約4時間までにわたって測定したところ、10kDaおよび20kDa FIX-PEGの半減期は非コンジュゲートFIXの半減期より約2-2.5倍長かった。投与後約15分から約48時間までにわたる測定では、20kDa FIX-PEGの半減期は非コンジュゲートFIXより約11倍長く、10kDa FIX-PEGの半減期は非コンジュゲートより約8倍長かった。
５．３．５ 実施例９：FIX欠損マウスにおける10kDa FIX-PEGおよび20kDa FIX-PEGの活性
FIX欠損マウスを用いて出血試験を行い、10kDa FIX-PEGおよび20kDa FIX-PEGの活性を試験した。45μg/mL用量に相当する非コンジュゲートFIXをマウスに投与した。マウス尾部を切除し、10kDa FIX-PEGおよび20kDa FIX-PEGをそれぞれ12検体および16検体のマウスに投与した。10kDa FIX-PEG群では12検体中11検体が死亡せず、20kDa FIX-PEG群では16検体中12検体が死亡しなかった。止血が目視で確認された。これは血小板のみによる止血ではなくフィブリン塊の形成によるものである。これらの結果は、10kDa FIX-PEGおよび20kDa FIX-PEGがいずれも活性であることを示している。

Claims (30)

1つまたはそれ以上のポリエチレングリコール基がシステイン残基を介して第IX因子に結合した第IX因子-ポリエチレングリコール（FIX-PEG）コンジュゲート。
1つまたはそれ以上のポリエチレングリコール基が1つまたはそれ以上の還元型システイン・ジスルフィド結合によって第IX因子に結合した第IX因子-ポリエチレングリコール（FIX-PEG）コンジュゲート。
1つまたはそれ以上のPEG含有部分が以下の式のように１つまたはそれ以上のシステイン・ジスルフィド結合を架橋する請求項２記載のFIX-PEGコンジュゲートであり：
式中、R1は直接結合できる結合基、アルキレン基（好ましくはC1-10アルキレン基）、または必要により置換されたアリールもしくはヘテロアリール基であり；
アリール基にはフェニルおよびナフチル基があり；
好適なヘテロアリール基にはピリジン、ピロール、フラン、ピラン、イミダゾール、ピラゾール、オキサゾール、ピリダジン、ピリミジン、およびプリンがあり；
ポリマーへの結合は加水分解に不安定な結合または不安定でない結合であってもよい上記コンジュゲート。
1つまたはそれ以上のPEG含有部分が以下の式のように1つまたはそれ以上のシステイン・ジスルフィド結合を架橋する、請求項３記載のFIX-PEGコンジュゲート。
１つまたはそれ以上のPEG含有部分の分子量が約10kDaである、請求項１、２、３、または４に記載されるFIX-PEGコンジュゲート。
１つのPEG含有部分を有する、請求項１、２、３、４、または５に記載されるFIX-PEGコンジュゲート。
２つのPEG含有部分を有する、請求項１、２、３、４、または５に記載されるFIX-PEGコンジュゲート。
請求項１-７のいずれか一項に記載されるコンジュゲートを含有する組成物であり、医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、またはキャリアーも含有する上記組成物。
組成物が非経口投与用に調製された、請求項８記載の組成物。
皮内、皮下、および筋肉内注射、並びに静脈内または骨内注入に好適な、請求項９記載の組成物。
溶液、懸濁液、またはエマルジョンの形態である、請求項１-７のいずれか一項に記載されるコンジュゲートを含有する組成物。
FIX-PEGコンジュゲートが未修飾FIXより長い半減期を有する、請求項１-７のいずれか一項に記載されるコンジュゲート。
FIX-PEGコンジュゲートが未修飾FIXより高いAUCを有する、請求項１-７のいずれか一項に記載されるコンジュゲート。
FIX-PEGコンジュゲートが未修飾FIXより高い生物学的利用能を有する、請求項１-７のいずれかに記載されるコンジュゲート。
血友病Ｂを治療する方法であり、請求項１-７のいずれか一項に記載されるFIX-PEGコンジュゲートおよび医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、またはキャリアーを含有する医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含む上記方法。
血友病Ｂに罹患した哺乳動物において関節血症、出血、消化管出血、および月経過多のリスクを低減する方法であり、請求項１-７のいずれか一項に記載されるFIX-PEGコンジュゲートおよび医薬的に許容される希釈剤、アジュバント、またはキャリアーを含有する医薬組成物を、それを必要とする患者に投与することを含み、該組成物が実質的に第IXa因子を含有しない上記方法。
３回の独立した測定から得られる組成物の平均血栓スコアが１未満である、請求項１６記載の方法。
３回の独立した測定から得られる組成物の平均血栓スコアが0.5未満である、請求項１６記載の方法。
３回の独立した測定から得られる組成物の平均血栓スコアが0である、請求項１６記載の方法。
組成物を皮下投与する、請求項１５記載の方法。
組成物を静脈内投与する、請求項１５記載の方法。
組成物によって、血栓の発生率が、測定可能な量の第IXa因子を含有する組換え第IX因子の組成物に比較して低下する、請求項１５記載の方法。
組成物を１日１回投与する、請求項１５記載の方法。
組成物を２日に１回投与する、請求項１５記載の方法。
組成物を1 IUから10,000 IUの用量で投与する、請求項１５記載の方法。
組成物を200 IUから2,500 IUの用量で投与する、請求項１５記載の方法。
組成物を約250 IU、約500 IU、約1000 IU、または約2000 IUの用量で投与する、請求項１５記載の方法。
循環第IX因子活性濃度が1 IU/dLから150 IU/dLとなるような用量で組成物を投与する、請求項１５記載の方法。
循環第IX因子活性濃度が10 IU/dLから120 IU/dLとなるような用量で組成物を投与する、請求項１５記載の方法。
循環第IX因子活性濃度が20 IU/dLから100 IU/dLとなるような用量で組成物を投与する、請求項１５記載の方法。
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