CN102046205A - 具有延长的半衰期的因子ix缀合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及经修饰的包含生物相容性聚合物部分的因子IX的缀合物。所述因子IX缀合物基本上无因子IXa污染。因子IX缀合物具有改善的药物动力学性质，例如增加的半衰期，这导致剂量节约和更低频率的施用。

Description

具有延长的半衰期的因子IX缀合物
1.发明领域
本发明涉及因子IX的生物相容性聚合物缀合物、含有因子IX缀合物的组合物以及使用因子IX缀合物治疗血友病的方法。
2.发明概述
本申请者已确定重组因子IX(在本文中称为FIX)的制备可通过将FIX缀合至一个或多个生物相容性聚合物以使可将FIX与因子IXa(在本文中称为FIXa)有效分离来增强。增强的制备性质还包括产生高纯度FIX缀合物的能力。
FIX缀合物可以提供治疗益处，例如，当与未缀合的FIX相比时。此类治疗益处包括但不限于增加的循环半衰期、减少的免疫原性、更高的活性、更低的剂量需要以及允许可选择的施用途径(例如，皮下施用)。
如本文中所使用的，术语“因子IX缀合物”或“FIX缀合物”是指经修饰包含生物相容性聚合物的部分(该部分导致与未修饰因子IX相比改善的药物动力学特性(pharmacokinetic profile))的因子IX。药物动力学特性的改善可被观察为一个或多个下列参数的改善：效力(potency)、稳定性、曲线下面积和循环半衰期。
在特定的实施方案中，本文中所描述的高纯度FIX缀合物基本上不含FIXa。考虑到FIX组合物的污染物，根据Gray等人Thromb.Haemost.1995 Apr；73(4)：675-9)(通过引用合并入本文)，甚至痕量的FIXa可导致危险的血栓形成。
如本文中所使用的，术语“基本上不含FIXa的”在纯化FIX和FIX缀合物的上下文中，是指低于1u FIXa/1000 IU FIX的FIXa的量。按照Gray等人Thromb.Haemost.1995 Apr；73(4)：675-9中描述的技术可测量小浓度的FIXa。在一些实施方案中，FIXa污染物的量可低于0.5 u FIXa/1000IU FIX。在一些实施方案中，FIXa污染物的量可低物于0.25u FIXa/1000IU FIX。在一些实施方案中，FIXa的量可低于0.1u FIXa/1000IU FIX。
具有生物相容性聚合物的缀合FIX增强FIX缀合物与FIXa的可分离性，从而增强药物组合物中FIX的利用。此外，生物相容性部分可保护FIX免受降解和抗体应答。FIX缀合物可具有延长的循环半衰期，这可导致剂量节约效应(dose-sparing effect)和更少的施用频率。在特定的实施方案中，将FIX缀合至一个或多个聚乙二醇(PEG)部分。在另一个特定的实施方案，将FIX缀合至一个或多个多聚唾液酸部分。在另一个特定的实施方案中，将FIX缀合至白蛋白。
因此在第一方面，本发明表征了通过一个或多个半胱氨酸残基缀合至FIX的一个或多个生物相容性聚合物。在实施方案中，通过一个或多个半胱氨酸残基将一个或多个PEG部分缀合至FIX。
在一个实施方案中，可将FIX缀合物的生物相容性聚合物部分结合至在FIX上形成二硫键的两个半胱氨酸残基。因此，含有PEG的连接体桥接二硫键。在特定的实施方案中，按照通式I将生物相容性聚合物缀合至FIX：
Figure BPA00001259738000021
其中这两个-S-都来自在FIX上形成二硫键的半胱氨酸残基，其中Q代表可以是直键、亚烃基(优选C1-10亚烃基)或任选地取代的芳基或杂芳基的连接基团；
其中芳基包括苯基、苯酰基和萘基；
其中合适的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；
其中可通过针对水解不稳定的键或通过非不稳定性键(non-labilebond)的方式来连接聚合物。
可存在于任选地取代的芳基或杂芳基上的取代基包括例如选自-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR′CO2R、-NO、-NHOH、-NR′OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N--NR′COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素例如氟或氯、-C≡CR、-C＝CR2及13C＝CHR的一个或多个相同的或不同的取代基，其中各R或R′独立地表示氢原子或烷基(优选C1-6)或芳基(优选苯基)。吸电子取代基的存在是特别优选的。
在式I的一个实施方案中，根据通式II将PEG缀合至FIX：
Figure BPA00001259738000031
可这样制备FIX的缀合物以使它们基本上不含FIXa。在某些条件下，FIX和FIXa与生物相容性聚合物物质反应的速率可以不同。不受理论束缚，反应速率的差异可归因于FIX与FIXa的不同大小(FIX具有比FIXa大11kDa的分子量)和/或不同构象结构。FIX的结构示于图1，其包括在FIX被活化成FIXa时被切割的激活结构域。作为结果，FIX或FIXa中待缀合的残基侧链在空间上可更容易触及含有聚合物的反应物，以及更容易触及的残基将与含有聚合物的反应物更快地反应。反应性的该差异最终允许FIX与FIXa的动态分离。
重组产生的FIX可包含少量的FIXa作为污染物。有时这些量可以极小，在1u FIXa/1000IU FIX(Gray等人Thromb.Haemost.1995Apr；73(4)：675-9)的数量级。在一些条件下，FIX缀合物例如FIX-PEG的形成速率可以比FIXa-PEG的形成速率快。在该情况下，可向反应混合物中加入相对于FIX化学计量或亚化学计量的量的PEG试剂。在该情况下，在FIX-PEG的形成中耗尽所有PEG试剂，同时FIXa保持未反应。FIX-PEG缀合物的性质例如分子量和极性使得其能够通过使用本领域内已知的纯化技术容易地与FIXa分离，包括但不限于，可在纯化步骤中使用大小排阻和/或离子交换色谱法。
在一些条件下，FIXa缀合物例如FIXa-PEG的形成速率比FIX-PEG的形成速率快。在这些条件下，可向反应混合物中加入相对于FIXa化学计量过量的PEG。在该情况下，重要的是确保在FIXa-PEG的形成中耗尽所有FIXa，同时大部分FIX(若非所有FIX)以其未缀合的状态保持未反应。FIXa-PEG缀合物的性质例如分子量和极性使得其能够通过使用本领域内已知的技术容易地与未缀合的FIX分离。在一个实施方案中，利用大小排阻色谱法或凝胶过滤色谱法纯化未缀合的FIX。然后将所得的纯FIX缀合至PEG，这可产生纯FIX-PEG缀合物。
FIX缀合物具有未修饰的FIX(即，不具有生物相容性聚合物例如连接的PEG的FIX)的一种或多种生物学活性。通过因子XIa或VIIa和组织因子(tissue factor)可体内活化FIX缀合物以产生因子IXa。FIX缀合物的生物学活性可使用本文中所描述的测定来确定。
与未修饰的FIX相比，本发明的FIX缀合物可显示药物动力学特性的一个或多个参数的改善，包括与未修饰的FIX相比的曲线下面积(AUC)、Cmax、清除率(CL)、半衰期、血浆驻留时间和生物利用度。
如本文中所使用的，在给患者施用肽药物的上下文中的“曲线下面积”或“AUC”，定义为描述作为从0至无穷的时间的函数的患者中全身性循环中的药物浓度的曲线下的总面积。
如本文中所使用的，术语“清除”或“肾清除率”定义为含有每分钟排除的药物量的血浆体积。
如本文中所使用的，术语“半衰期”或“t1/2”在给患者施用肽药物的上下文中，定义为患者中药物的血浆浓度减少一半所需的时间。取决于多种清除机制、重新分配和本领域内已知的其他机制，存在多个与肽药物相关的半衰期。通常，这样定义α和β半衰期以使α相与重新分配相关，并且β相与清除相关。然而，对于大部分限制于血流中的蛋白质药物，可存在至少两个清除半衰期。PEG化对α相和β相半衰期的精确影响将视大小和其他参数不同而变化，这在本领域内是众所周知的。“半衰期”的进一步解释见于PharmaceuticalBiotechnology(1997，DFA Crommelin和RDSindelar，eds.，HarwoodPublishers，Amsterdam，pp 101120)中。
如本文中所使用的，术语“驻留时间”在给患者施用肽药物的上下文中，定义为给药后药物在患者体内停留的平均时间。
基本上不含FIXa的含有FIX缀合物的组合物显示改善的安全性。此外，基本上不含FIXa的包含FIX缀合物的组合物不太可能导致血栓形成。在特定的实施方案中，包含纯FIX缀合物的组合物不太可能导致静脉血栓形成。在另一个特定的实施方案中，含有纯FIX缀合物的组合物不太可能导致动脉血栓形成。
本发明的FIX缀合物用于治疗血友病B。如本文中所使用的，术语“治疗”、“进行治疗”或“的治疗”意指减轻或至少部分地改善或缓解被施用者的病症的严重度和/或达得至少一种临床症状的一定程度的缓和、缓解或减轻和/或抑制或延迟病症的进展和/或延迟疾病或病症的发作的进展。术语“治疗”、“进行治疗”或“的治疗”还表示控制疾病状态例如血友病B。
本发明的FIX缀合物用于通过给血友病B患者提供FIX来治疗此类患者，其包括施用治疗有效量的本文中所描述的FIX缀合物和组合物。
如本文中所使用的，“治疗有效”量，是为被施用者提供一定程度改善或益处的量。可选择地表示，“治疗有效”量是提供至少一种临床症状的缓和、缓解和/或减轻的量。与可通过本发明的方法治疗的病症相关的临床症状对于本领域技术人员来说是熟知的。此外，本领域技术人员将理解只要能给被施用者提供一定的益处，治疗效果不必是完全的或治愈的。
在特定的实施方案中，由不含FIXa的FIX缀合物组成的组合物提供了具有减少的血栓形成风险(如由平均血栓评分的减少证明的)的治疗血友病B的方法。
如本文中所使用的，“平均血栓评分”是如下定义的。可按0至4的评分等级对血栓打分。为0的评分表示完全流体的血液；小血纤蛋白点的存在被评分为1分，几块较大的凝块被评为2分；产生部分阻塞的凝块被评为3分，以及为4的评分表示区段的实体阻塞。应当按照来自Wessler等人，J.Appl.Physiol.14：943-946(1959)的方案，根据3个或更多个独立的实验确定平均血栓评分。
在另一个特定的实施方案中，FIX缀合物的改善的性质提供了用于预防性治疗血友病B的方法。在另一个特定的实施方案中，可给正在经历手术过程或正在从手术过程恢复的血友病B患者施用包含FIX缀合物的组合物。
可将FIX缀合物与其他治疗剂例如氨甲环酸、氨基己酸、因子II(凝血酶原)和/或因子X(Stuart Prower因子)组合给患者施用以治疗血友病B。
可用药学上可接受的载体配制本文中所描述的FIX缀合物。如本文中所使用的，术语“药学上可接受的”，当用于指本发明的配制剂时，表示配制剂在通过任何已知的施用方案对其施用配制剂的被施用者中不导致不可接受的刺激水平。刺激的实例包括对FIX的超敏反应。
归因于增加的FIX缀合物半衰期，药物组合物可包含比通常施用以有效地治疗血友病的剂量更低的剂量的FIX。本发明的药物配制剂可配制用于胃肠外施用，包括但不限于皮内、皮下和肌内注射以及静脉内或骨内输注。取决于施用途径，本发明的药物配制剂可采用包含FIX缀合物例如FIX-PEG和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体的溶液、悬浮液、乳剂的形式。
配制本发明的药物组合物来递送治疗剂量的FIX缀合物。FIX缀合物的剂量可以以国际单位(IU)表示。如本文中所使用的，术语“国际单位”或“IU”是指参考世界卫生组织国际标准的效价分配(potencyassignment)。根据该分配，每千克体重1个IU的因子IX活性大约相当于1mL混合的正常人血浆中因子IX的活性，并且使因子IX的血浆浓度增加1％。
药物配制剂中包含的FIX缀合物的剂量可在1 IU至10,000IU的范围内。在某些实施方案中，FIX缀合物的剂量可在100IU至5000IU，或200IU至2500IU的范围内。在某些实施方案，FIX缀合物的剂量可以是大约250IU、大约500IU、大约1000IU或大约2000IU。
以足以治疗血友病B的量施用FIX缀合物。如本文中所使用的，“足够的量”或“足够的量用以”达到特定的结果是指有效地产生期望效果的FIX缀合物的量，所述效果任选地是治疗效果(即，通过治疗有效量的施用)。例如，“足够的量”或“足够的量用以”可以是有效地减小关节积血(hemarthrosis)、大出血、消化道出血和月经过多的风险的量。
在某些实施方案中，FIX缀合物的剂量是充足的，这样使得循环性因子IX活性的浓度是1IU/kg至150IU/kg。在另一个实施方案中，以使循环性因子IX活性的浓度是10IU/kg至120IU/kg的剂量施用所述组合物。在另一个实施方案中，以使循环性因子IX活性的浓度是20IU/kg至100IU/kg的剂量施用所述组合物。
可以以与未修饰的FIX相同的方式使用本发明的缀合物。然而，归因于FIX缀合物的改善的性质，可以以比未缀合的FIX更低的频率施用本发明的药物配制剂。例如，可每周1次而非对于未修饰的重组FIX而言每天1次地施用FIX缀合物。本发明还包括给药方案，其中可每天2次，每天1次，每2、3或4天1次，每周1次施用FIX衍生物以有效地治疗血友病B。预期减少的施用频率导致提高的患者依从性，从而导致提高的治疗结果以及提高的患者生活质量。
3.附图概述
图1是显示氨基酸序列、结构和不同结构域的因子IX的图示表征。
图2举例说明小鼠血清中未缀合的FIX-PEG的循环半衰期。
图3举例说明小鼠血清中10kDa FIX-PEG的循环半衰期。
图4举例说明小鼠血清中20kDa FIX-PEG的循环半衰期。
4.发明详述
本发明描述了缀合至一个或多个生物相容性聚合物以提供基本上不含FIXa的FIX缀合物的FIX。本文中所描述的FIX缀合物还具有改善的生物学和药物动力学性质包括，但不限于，与未修饰的FIX相比增加的循环半衰期或血浆驻留时间。此外，本文中所描述的缀合物对抗体应答不太易感。本发明还涉及制备此类缀合物的方法。在特定的实施方案中，FIX缀合物是FIX-PEG缀合物。本发明还涉及使用FIX缀合物治疗血友病B的方法。
本发明特别地涉及其中将生物相容性聚合物缀合至一个或多个半胱氨酸残基的FIX缀合物。在一个实施方案中，缀合物是其中将一个或多个PEG基团通过一个或多个半胱氨酸残基缀合至FIX的FIX-PEG缀合物。在特定的实施方案中，FIX-PEG缀合物包含一个或多个PEG基团，所述一个或多个PEG基团同时结合至在PEG上形成二硫键的两个半胱氨酸残基。此类缀合物可通过二硫键的还原性断裂，然后进行其中使PEG部分结合两个巯基的反应来产生。所得的FIX缀合物包含桥接曾形成二硫键的两个硫的PEG部分。
本发明的组合物包含基本上不含FIXa的FIX-PEG缀合物。与包含痕量FIXa污染物的组合物FIX相比，本发明的组合物具有降低的血栓评分，从而减少了溶栓事件(thrombolytic event)的风险，包括但不限于静脉和/或动脉血栓形成。
本发明还涉及通过在与生物相容性聚合部分的缀合反应中利用FIX缀合物相比FIXa缀合物的不同形成速率来去除FIXa以纯化FIX的方法。这导致FIX与FIXa的动态分离。在一个实施方案中，生物相容性聚合物是PEG。
本发明的FIX缀合物具有与未修饰的FIX相比改善的药物动力学特性。
本发明的另一个方面是治疗血友病B的方法，其包括给有此需要的患者施用包含FIX缀合物和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体的药物组合物。如本文中所使用的，当提及本发明的FIX缀合物的施用时，术语“有此需要的患者”是指经诊断患有血友病B和/或因子IX缺乏的患者。
4.1重组因子IX
根据本发明，计划将通过本领域内已知的任何方法产生的重组因子IX进行衍生和缀合。可使用一个或多个下列专利和公开案(各自通过引用合并入本文就如在同本文中以其全文所示的一样)中所示的方法产生优选的FIX：美国专利5,268,275、5,171,569、5,888,809、6,531,298；国际申请公开案WO 2005/030039、WO 2006/101474、WO2006/089613；美国申请公开案2003/0220247、2005/0271644、2006/0121574和2006/0194284。
在一些实施方案中，已将FIX冷冻干燥或冻干。在优选实施方案中，未将FIX冷冻干燥或冻干。在一些实施方案中，已将FIX暴露于冷冻保护剂，例如蔗糖或海藻糖。在优选实施方案中，未曾将FIX暴露于冷冻保护剂，例如蔗糖或海藻糖。
4.2因子IX缀合物
与未修饰的FIX相比，本发明的FIX缀合物可显示与未修饰的FIX相比，药物动力特性的一个或多个参数包括AUC、Cmax、清除率(CL)、半衰期、血浆驻留时间和生物利用度的改善。FIX缀合物可具有与未修饰的FIX相比增加的体内临床活性。本发明的缀合物可具有提高的效力和稳定性。
可通过本领域内已知的色谱方法去除FIXa以纯化和分离本文中所描述的FIX缀合物。该方法包括但不限于离子交换色谱法和大小排阻色谱法。本发明的FIX缀合物具有未修饰的FIX的一种或多种生物学活性。通过因子XIa或VIIa和组织因子体内活化FIX的缀合物以产生因子IXa。可使用本文中所描述的检测来测定FIX缀合物的生物学活性。
可从天然来源例如人血浆获得和分离有待根据本发明修饰的FIX。可重组表达有待根据本发明修饰的FIX。
在一个实施方案中，缀合物的FIX成分具有图1中确定的鉴定为人FIX的序列。可选择地，可修饰或衍生FIX的序列以包括氨基酸序列的一个或多个改变，包括但不限于插入、缺失或置换。
FIX-PEG缀合物可导致增加的循环半衰期和血浆驻留时间、减少的清除率以及增加的体内临床活性。可通过经由一个或多个FIX的氨基酸残基共价结合聚乙二醇聚合物来修饰FIX，所述残基包括但不限于赖氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、半胱氨酸以及蛋白质的N末端α-氨基和C-末端羧基。聚乙二醇聚合物单位可以是线性的或支化的。
可通过注射静脉内或皮下递送FIX-PEG缀合物。还可将FIX-PEG缀合物配制于片剂、胶囊、溶液或悬浮液中以用于口服施用。
本发明的一个方面是FIX-PEG缀合物，其中将PEG结合至FIX的一个或多个胺基。本发明的另一个方面是FIX-PEG缀合物，其中将聚乙二醇聚合物结合至FIX的一个或多个羧基。本发明的另一个方面是FIX-PEG缀合物，其中将聚乙二醇结合至FIX的一个或多个醇基。在特定的实施方案中，将含PEG的部分可与半胱氨酸巯基侧链结合。在另一个特定的实施方案，含PEG的部分可桥接在天然FIX上形成二硫键的两个半胱氨酸巯基。
本发明的另一个方面是FIX-PEG缀合物，其中将聚乙二醇聚合物结合至赖氨酸残基。通过多种技术包括但不限于烷基化或酰化作用可容易地PEG化FIX中的赖氨酸的ε氨基。
本发明的另一方面是FIX缀合物，其中将聚乙二醇聚合物结合至N末端α-氨基。通过多种技术包括但不限于N末端α氨基的烷基化或酰化作用FIX的N末端α氨基残基可形成PEG缀合物。
本发明的另一方面是包含一个或多个PEG缀合的半胱氨酸残基的FIX缀合物。PEG单位至半胱氨酸残基上的缀合可需要二硫(-S-S-)键的断裂。
在一个实施方案中，将一个或多个生物相容性聚合物通过一个或多个半胱氨酸残基连接至FIX。在特定的实施方案中，将FIX缀合物的生物相容性聚合物部分结合至在FIX上形成二硫键的两个半胱氨酸残基。在另一个特定的实施方案中，按照下列通式将PEG聚合物缀合至FIX：
Figure BPA00001259738000111
其中Q代表可以是直键、亚烃基(优选C1-10亚烃基)或任选地取代的芳基或杂芳基的连接基团；
其中芳基包括苯基和萘基；
其中合适的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；
其中可通过针对水解不稳定的键或通过非不稳定性键来连接聚合物。
可存在于任选地取代的芳基或杂芳基上的取代基包括例如选自-CN、-NO2、-CO2R、-COH、-CH2OH、-COR、-OR、-OCOR、-OCO2R、-SR、-SOR、-SO2R、-NHCOR、-NRCOR、-NHCO2R、-NR′CO2R、-NO、-NHOH、-NR′OH、-C＝N-NHCOR、-C＝N-NR′COR、-N+R3、-N+H3、-N+HR2、-N+H2R、卤素例如氟或氯、-C≡CR、-C＝CR2及13C＝CHR的一个或多个相同的或不同的取代基，其中各R或R′独立地表示卤素原子或烷基(优选C1-6)或芳基(优选苯基)基团。吸电子取代基的存在是特别优选的。
在另一个特定实施方案中，按照下列通式将PEG缀合至FIX：
Figure BPA00001259738000112
存在几种不同类型的可与FIX形成缀合物的聚乙二醇聚合物。存在包含单个聚乙二醇链的线性PEG聚合物，以及存在支化或多臂的PEG聚合物。支化的聚乙二醇包含通过统一基团(unifying group)连接在一起的2个或更多个分开的线性PEG链。例如，两个PEG聚合物可通过赖氨酸残基连接在一起。一个线性PEG链结合至α氨基，而另一个PEG链结合至ε氨基。剩下的赖氨酸核心羧基留以用于共价连接蛋白质。线性和支化的聚乙二醇聚合物均可以一系列分子量商购获得。
在本发明的一个方面，FIX-PEG缀合物包含一个或多个结合至FIX的线性聚乙二醇聚合物，其中各PEG具有大约2kDa至大约100kDa的分子量。在本发明的另一个方面，FIX-PEG缀合物包含一个或多个结合至FIX的线性聚乙二醇聚合物，其中各线性PEG具有大约5kDa至大约40kDa的分子量。在某些实施方案中，各线性PEG具有大约5kDa至大约20kDa的分子量。在某些实施方案中，各线性PEG具有为大约10kDa的分子量。在某些实施方案中，各线性PEG具有低于大约10kDa的分子量。在特定的实施方案中，FIX-PEG缀合物包含多个结合至FIX的线性PEG聚合物，例如2、3或4个结合至FIX的线性PEG聚合物。在一些实施方案中，FIX-PEG缀合物包含两个线性PEG聚合物，其中各线性PEG具有大约10kDa的分子量。
本发明的FIX-PEG缀合物可包含一个或多个结合至FIX的支化PEG聚合物，其中各支化的PEG具有大约2kDa至大约100kDa的分子量。在本发明的另一方面，FIX-PEG缀合物包含一个或多个结合至FIX的支化聚乙二醇聚合物，其中各支化的FIX具有大约5kDa至大约40kDa的分子量。在某些实施方案中，各支化的PEG具有大约5kDa至大约20kDa的分子量。在某些实施方案中，各支化的PEG具有为大约10kDa的分子量。在某些实施方案中，各支化的PEG具有低于大约10kDa的分子量。在特定的实施方案中，所述FIX-PEG缀合物包含多个结合至FIX的支化PEG聚合物，例如2、3或4个结合至FIX的支化PEG聚合物。在一些实施方案中，FIX-PEG缀合物包含2个支化的PEG聚合物，其中各支化的PEG具有大约10kDa的分子量。
通过本领域内已知的色谱方法包括但不限于离子交换色谱法和大小排阻色谱法可纯化FIX-PEG缀合物。
4.3产生因子IX衍生物的方法
4.3.1用于半胱氨酸残基的PEG化的技术
在本领域中存在许多用于形成聚乙二醇缀合的或PEG化的半胱氨酸残基的方法。这些技术的有利方面是它们对于半胱氨酸是选择性的，其意指其他侧链保持不受这些方法的影响。在方案1a中，活化的二硫化物PEG邻-吡啶基-二硫醚(PEG ortho-pyridyl-disulphide)与巯基反应，从而形成更稳定的对称二硫化物。在方案1b中，通过在Michael加成反应中向活化的双键加入巯基，半胱氨酸残基与PEG马来酰胺反应。在方案1c中，通过巯基在PEG-乙烯基砜的活化的末端乙烯基上的缀合物攻击，产生PEG化的半胱氨酸残基。在方案1d中，半胱氨酸巯基通过亲核攻击取代碘来产生PEG缀合的半胱酸残基。
方案1
Figure BPA00001259738000131
通过使用方案2中显示的技术也可选择性地PEG化一起形成二硫键的2个半胱氨酸基团。首先还原天然二硫键。所得的来自该键的巯基中的一个可亲核攻击亲电基基团，例如1，4加成至烯酮。之后，离去基团例如砜脱离。随后消除第二个烯酮，然后利用剩下的巯基进行的1，4加成导致具有附着PEG基团的桥接的硫化物。
方案2
方案2中显示的技术还可用于制备具有2个或更多个缀合至其上的独立PEG部分的FIX缀合物。例如，在本领域内熟知的受控条件下还原第一天然二硫键。然后按照方案2将第一PEG部分连接至其。随后，例如在本领域内熟知的更完全的还原条件下还原第二个二硫键。然后再次按照方案2将第二PEG部分连接至其。必要时可重复该多步骤方法。
4.3.2产生高度纯化的FIX的方法
FIX至生物相容性聚合物的缀合提供了籍以产生高度纯化的FIX缀合物的方法。特别地，在FIXa存在的情况下形成FIX缀合物同时不形成FIXa缀合物的方法是特别有利的。可利用色谱方法例如离子交换色谱法或大小排阻色谱法容易地将FIX的缀合物与FIXa分离。
在一个实施方案中，FIX-PEG的形成速率以比FIXa-PEG更快的速率发生。用于FIX的选择性缀合的反应示于下面的方案3中。
方案3
Figure BPA00001259738000142
在痕量的FIXa存在的情况下，向FIX的反应混合物中加入化学计量的量的PEG试剂。在一个实施方案中，反应混合物中PEG-试剂/FIX的比率是大约0.1至大约1.5。在另一个实施方案中，PEG-试剂/FIX的比率是大约0.1至大约1.0。在另一个实施方案中，PEG-试剂/FIX的比率是大约1.0至大约1.5。在另一个实施方案中，PEG-试剂/FIX的比率是大约0.1至大约0.5。在另一个实施方案中，PEG-试剂/FIX的比率是大约0.5至大约0.7。在另一个实施方案中，PEG-试剂/FIX的比率是大约0.7至大约1.0。
在一个实施方案中，可单批次向反应混合物中加入PEG试剂。在另一个实施方案中，可在一段时间内缓慢地加入PEG试剂。可在直至大约1、2、6、12、18或24小时的时期内加入PEG试剂。可通过方法包括但不限于质谱法、快速蛋白液相色谱法(FPLC)或十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)监控反应的进程。重要的是确保FIXa不被转化成FIXa-PEG缀合物。在一个实施方案中，FIX几乎被定量地转化成FIX-PEG。在另一个实施方案中，FIX以大约80％至90％的转化率、70％至80％的转化率、60％至70％的转化率、50％至60％的转化率、40％至50％的转化率、30％至40％的转化率、30％至40％的转化率、20％至30％的转化率或10％至20％的转化率转化成FIX-PEG。可再循环未反应的FIX，使之经历额外的缀合反应。
可通过离子亲和色谱法或大小排阻色谱法容易地将FIX-PEG缀合物与反应混合物分离。在分离步骤后，重要的是确保所得的FIX-PEG缀合物基本上不含FIXa。这可通过Gray等人Thromb.Haemost.1995Apr；73(4)：675-9中描述的方法或下文中章节5.3中的方法来确认。
在另一个实施方案中，FIXa-PEG缀合物的形成速率比FIX-PEG的快。然后利用本文中所描述的色谱方法将未反应FIX与FIXa-PEG缀合物分离。为了产生纯FIX-PEG，剩余的纯化的FIX可经历进一步PEG化反应。方案4显示在该环境下如何合成纯化的FIX-PEG。
方案4
Figure BPA00001259738000151
在这些条件下，可向反应混合物中加入相对于FIXa化学计量过量的PEG试剂。在一个实施方案中，反应混合物中PEG-试剂/FIXa的比率是大约100至大约1000。在另一个实施方案中，PEG-试剂/FIX的比率是大约10至大约100。在另一个实施方案中，PEG-试剂/FIX的比率是大约1.1至大约10。
重要的是确保所有FIXa在FIXa-PEG的形成中被耗尽。FIXa-PEG缀合物的性质例如分子量和极性使得其能够通过使用本领域内已知的技术容易地与未缀合的FIX分离。在一个实施方案中，利用排阻色谱法或凝胶过滤色谱法来纯化未缀合的FIX。
4.4测定生物学活性的方法
本发明的FIX缀合物具有未修饰的FIX的一种或多种生物学活性。用于确定按照本发明的方法制备的FIX缀合物的活性的方法可以使用本领域内熟知的方法诸如描述于例如Biggs(1972，Human BloodCoagulation Haemostasis and Thrombosis(第1版)，Oxford，Blackwell，Scientific，pg.614)的一步活化的部分促凝血酶原激酶时间测定法进行。简而言之，为了检测按照本发明的方法产生的FIX缀合物的生物学活性，可使用等体积的活化的部分促凝血酶原激酶试剂，使用本领域内熟知的无菌放血技术从血友病B患者分离的FIX缺陷型血浆，和正常混合血浆作为标准，或样品进行测定。在该检测中，1个单位的活性定义为存在于1毫升正常混合血浆中的活性的那个量。此外，基于FIX将来自FIX缺陷患者的血浆的凝血时间减少至正常的能力的生物活性的检测可以如例如Proctor和Rapaport(1961，Amer.J.Clin.Path.36：212)中描述的进行。同样地可使用章节5.3中描述的检测法确定FIX缀合物的生物学活性以确保不存在FIXa污染。
4.4.1药物组合物
本发明涉及包含FIX缀合物作为活性成分的药物组合物。可用药学上可接受的载体配制FIX制剂。归因于增加的FIX缀合物的半衰期，药物组合物可包含比通常施用以有效地治疗血友病B的剂量更低的剂量的FIX。可配制本发明的药物配制剂来进行胃肠外施用，包括但不限于皮内、皮下和肌内注射以及静脉内或骨内输注。取决于施用途径，本发明的药物配制剂可采用包含FIX缀合物例如用聚乙二醇化学修饰的FIX和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体的溶液、悬浮液、乳剂的形式。
配制本发明的药物组合物来递送治疗剂量的FIX缀合物。可以用国际单位(IU)来表示FIX缀合物的剂量。药物配制剂中包含的FIX缀合物的剂量可在1IU至10,000IU的范围内。在某些实施方案中，FIX缀合物的剂量可在100IU至5000IU或200IU至2500IU的范围内。在某些实施方案中，FIX缀合物的剂量可以是大约250IU、大约500IU、1000IU或大约2000IU。
在一些实施方案中，本发明的药物组合物展示例如与未缀合的FIX的类似药物组合物相比有利的免疫原性特性。在某些实施方案中，本发明的药物组合物的免疫原性显著低于未缀合的FIX的类似药物组合物，或基本上无免疫原性。在相关实施方案中，例如在治疗血友病B的方法中，能够将具有有利的免疫原性特性的此类药物组合物皮下施用给患者。
4.5治疗血友病B的方法
本文中描述的FIX缀合物提供了治疗血友病B的方法。配制本发明的药物组合物来递送治疗剂量的FIX缀合物。在某些实施方案中，FIX缀合物的剂量足以使被施用者中循环FIX活性的浓度是1IU/dL至150IU/dL。在另一个实施方案中，所述组合物以使被施用者中循环FIX活性的浓度是10IU/dL至120IU/dL的剂量施用。在另一个实施方案中，所述组合物以使被施用者中循环FIX活性的浓度是20IU/dL至100IU/dL的剂量施用。
在一些实施方案中，FIX缀合物的活性是大约100％的类似的未缀合FIX的活性。在一些实施方案中，FIX缀合物的活性高于大约80％、60％或40％的类似的未缀合FIX的活性。在优选实施方案中，FIX缀合物的活性高于大约20％的类似的未缀合FIX的活性。虽然不是优选的，但活性可低于20％例如10％、5％或甚至1％并且与非缀合FIX相比仍然可被有利地使用。
对于接受FIX缀合物的患者，它们的FIX活性可能需要由专业医生来监控。还可将本文中所描述的FIX缀合物施用于正在经历或正在从手术过程恢复的血友病B患者。
此外，本文中所描述的FIX缀合物无来自FIXa的污染，该污染可导致不利的溶栓事件(adverse thrombolytic incident)。因此，本文中所描述的FIX缀合物和制备FIX缀合物的方法产生了不太可能引起不利的血栓形成(如由平均血栓评分确定的)的纯FIX缀合物。在一个实施方案中，FIX缀合物组合物的平均血栓评分在3个或更多个独立的测量后低于1。在另一个实施方案中，平均血栓评分在3个或更多个独立测量后低于0.5。在另一个实施方案中，平均血栓评分在3个或更多个独立测量后低于0.3。在另一个实施方案中，平均血栓评分在3个或更多个独立测量后低于0.1。在另一个实施方案中，平均血栓评分在3个或更多个独立测量后为0。
在一些实施方案中，FIX缀合物的施用剂量与类似的未缀合FIX所必需的剂量大致相同。在一些实施方案中，FIX缀合物的施用剂量是类似的未缀合FIX所必需的剂量的大约2倍、大约3倍、大约4倍或大约5倍。
本发明还涉及通过给有此需要的患者施用FIX缀合物和另外的治疗剂来治疗血友病B的方法。另外的治疗剂可以是氨甲环酸、氨基己酸、因子II(凝血酶原)和/或因子X(Stuart Prower因子)的一种或多种。
可相继地或同时施用FIX缀合物和另外的治疗剂。如果相继施用，则施用的顺序是可变的。例如，可在施用另外的治疗剂之前施用FIX缀合物。可选择地，可在施用FIX缀合物之前施用另外的治疗剂。
无论以分开的组合物还是以一个组合物施用它们，各组合物优选在药学上适合于施用。此外，FIX缀合物和治疗剂，如果分开施用，可通过相同或不同的施用模式来施用。
在某些实施方案中，本发明的FIX缀合物展示基本上与类似的未缀合FIX相同的药理作用。例如，在一些实施方案中，本发明的FIX缀合物的施用导致正常血纤蛋白诱导的血凝，表明凝血作用。
4.5.1给药方案
给药方案包括每天2次、每天1次、每2天1次、每周2次、每周1次、每2周1次或每月1次给血友病B患者施用本发明的缀合物。
专业医生可监控接受FIX缀合物的被施用者中FIX的活性，并且相应地改变剂量方案。在一个实施方案中，在施用FIX缀合物后立即测定被施用者中FIX的活性。在另一个实施方案中，在施用FIX缀合物后0.5小时、1小时、6小时、12小时或24小时测定被施用者的FIX活性。在另一个实施方案中，在施用FIX缀合物后2天、4天、1周、2周或3周后测定被施用者中FIX的活性。
5.实施例
5.1 FIX缀合物的合成
可使用本领域内已知的合成方法容易地合成本发明的FIX缀合物。下列合成实施例演示了FIX-PEG缀合物的合成。
5.1.1实施例1：通过二硫键桥接进行的FIX的PEG化
向因子IX中加入2-巯基乙醇尿素水溶液。使用10％的甲胺水溶液将所得溶液的pH调整至pH 8.5。然后向反应溶液中吹入氮气进行大约30分钟。仍然在用氮气吹洗的情况下将试管在37℃下加热。然后在冰-盐水浴中冷却反应混合物，向反应溶液中加入10mL氩气吹洗的1N HCl：无水乙醇的冰冷溶液。沉淀产生，通过离心分离沉淀，然后用另外的HCl：无水乙醇混合物洗涤3次，用氮气吹洗的冰冷二乙醚洗涤2次。在每一次洗涤后，通过离心分离沉淀。然后将洗涤的沉淀溶解于氮气吹洗的去离子水中并且冷冻干燥以提供干燥固体。可使用Ellman检测确认和定量FIX的部分还原，所述检测给出每蛋白质分子游离巯基的数目。
在eppendorf中，将部分还原的FIX溶解在氮气吹洗的pH 8氨溶液中。在分开的eppendorf中，将从聚乙二醇衍生的聚合物缀合试剂α-甲氧基-ω-4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺也溶解在氨溶液中，然后将所得的溶液加至因子IX溶液中。用新配制的氨溶液清洗PEG eppendorf，然后也将其加入至主反应eppendorf中。然后在氩气下密封反应eppendorf，将其在37℃下加热大约24小时，然后让其冷冻至室温。然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析冷却的反应溶液。
5.1.2实施例2：在FIXa污染物存在的情况下进行的FIX-PEG的 选择性形成和纯化
向FIXa污染的含有FIX的反应混合物中加入2-巯基乙醇尿素水溶液。使用10％的甲胺水溶液将所得溶液的pH调整至pH 8.5。然后向反应溶液中吹入氮气进行大约30分钟。仍然用氮气进行吹洗，将试管在37℃下加热。然后在冰-盐水浴中冷却反应混合物，向反应溶液中加入10mL氩气吹洗的1N HCl：无水乙醇的冰冷溶液。沉淀产生，通过离心分离沉淀，然后用另外的HCl：无水乙醇混合物洗涤3次，用氮气吹洗的冰冷二乙醚洗涤2次。在每一次洗涤后，通过离心分离沉淀。然后将清洗的沉淀溶解于氮气吹洗的去离子水中并且进行冷冻干燥以提供干燥固体。可使用Ellman检测确认和定量FIX的部分还原，所述检测给出每蛋白质分子游离巯基的数目。
在eppendorf中，将部分还原的FIX溶解在氮气吹洗的pH 8氨溶液中。在分开的eppendorf中，将少于1个当量的从聚乙二醇衍生的聚合物缀合试剂α-甲氧基-ω-4-[2，2-双[(对甲苯磺酰基)-甲基]乙酰基]苯甲酰胺也溶解在氨溶液中，然后将所得的溶液加至FIX溶液中。用新配制的氨溶液清洗PEG eppendorf，然后也将其加入至主反应eppendorf中。然后在氩气下密封反应eppendorf，将其在37℃下加热大约24小时，然后让其冷冻至室温。然后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析冷却的反应溶液。然后通过大小排阻色谱法从反应混合物纯化FIX-PEG。
可利用由Gray等人Thromb.Haemost.1995Apr；73(4)：675-9或下文中章节5.3中提供的方法进一步分析分离的产物以测定FIXa污染物的水平。
5.2重组因子IX的产生
5.2.1实施例3：用因子IX基因进行的CHO细胞的初次转染
将野生型因子IX基因转染入有限稀释于96孔板中的CHO细胞。因子IX基因处于CHEF-1启动子控制之下。让细胞在5％血清中生长14天。收获细胞培养基，利用因子IX ELISA法定量每mL以μg表示的因子IX抗原的总量。估计150多个克隆，然后测定每克隆产生的因子IX的总量。
使用因子IX基因转染的CHO细胞产生因子IX抗原，其可通过因子IX ELISA来检测。
5.2.2实施例4：使用VKGC和VKOR基因进行的因子IX产生性CHO 细胞的超级转染(Supertransfection)
为了增加因子XI转染的CHO细胞中产生的活性因子IX的百分比，将初级转染子(primary transfectant)混合，在组织培养中扩增，然后用含有通常被认为对于因子IX的有效维生素K依赖性γ羧化作用是非常重要的酶的cDNA的载体进行超级转染。将产生因子IX的克隆在摇瓶中混合，用维生素K依赖性γ羧化酶(VKGC)和维生素K依赖性环氧还原酶(VKOR)的cDNA对其进行超级转染。通过在96孔板中有限稀释将单个地超级转染的细胞在5％血清中培养14天。使用因子IXELISA测量每mL产生的因子IX抗原的总量。使用因子IX缺陷型血浆作为底物以及血浆衍生的(plasma-derived)因子IX作为标准利用APTT凝血检测法(APTT clotting assay)测量活性因子IX的量。
5.3FIX缀合物的生物检测
5.3.1实施例5：FIX-PEG和FIXa的检测
检测纯化的FIX-PEG组合物以测定FIX-PEG活性以及任何污染性FIXa或FIXa-PEG的活性。按照Smith，K.J.等人，Blood，72，1269-1277(1988)针对FIX和Varadi，K.等人，Thromb.Haemos.，35，576-585(1976)针对FIXa污染描述的方案进行检测。
5.3.2实施例6：FIX-PEG组合物体内血栓形成性检测 (Thrombogenicity Assay)
本实施例用于确定按照实施例2的方法纯化的FIX缀合物是否因FIXa而引起不期望的凝血，如就血栓形成性通过体内Wessler RabbitStasis测量。
按照Wessler等人，J.Appl.Physiol.14：943-946(1959)的方法将FIX制剂体内注射入分离的兔颈静脉的连接部分以估量停滞性血栓(stasist hrombi)的形成。
根据凝块的大小按照Wessler，等人的系统进行评分，其中+4凝块表示通常可在所选择的血管大小和类型中用形成血栓的材料产生凝块的最大尺寸，+1是可被目测检测的最小的此类凝块。重复实验3次，测定算术平均值。
5.3.3实施例7：纯化的FIX-PEG组合物中痕量FIXa和FIXa-PEG 的检测
将使用TBS/1％人白蛋白稀释的参照FIXa(25μL)或25μL的TBS/1％人白蛋白中的受试FIX浓度稀释物于37℃下置于96孔微量滴定板中。将含有等体积人FX、牛脑磷脂和重组脱硫水蛭素(desulphatohirudin)于37℃下温热5分钟。然后向检测试剂中加入等体积的温热的重组FVIII和CaCl2。在混合后立即将125μL该试剂加入至含有FIX或FIXa样品的孔中。于37℃下20分钟的FXa产生后，将50μL转移至100μL S-2765(Quadratech Epsom UK)中。在2分钟的温育后，通过加入50μL的50％的乙酸终止反应，记录吸收波长。然后在该波长上进行受试底物的吸收水平测量以测定受试混合物中FIXa的量。
5.3.4实施例8：10kDa FIX-PEG和20kDa FIX-PEG与未缀合的 FIX的循环半衰期的比较
使用实施例1和2中所示的方法制备10kDa FIX-PEG和20kDaFIX-PEG(其中各自的PEG部分是线性的)。
给FIX缺陷型小鼠施用未缀合的FIX、10kDa FIX-PEG和20kDaFIX-PEG，在施用后15分钟至48小时，使用ELISA并显色地测量各自的血浆浓度。平均血浆浓度分别示于图2、3和4中。当在施用后大约15分钟至大约4小时的时段内测量时，10kDa和20kDa FIX-PEG的半衰期是未缀合的FIX的半衰期的大约2-2.5倍。当在施用后大约15分钟至48小时的时期中测量时，20kDa PEG-FIX的半衰期是未缀合的FIX的半衰期的大约11倍，10kDa PEG-FIX的半衰期是未缀合的FIX的半衰期的大约8倍。
5.3.5实施例9：FIX缺陷型小鼠中10kDa FIX-PEG和20kDa FIX-PEG的活性
通过使用FIX缺陷型小鼠进行出血研究(bleed-out study)来检查10kDa FIX-PEG和20kDa FIX-PEG的活性。给小鼠施用45μg/mL剂量的未缀合FIX的当量。剪掉小鼠尾巴，并且将10kDa FIX-PEG和20kDa FIX-PEG分别施用至12和16只小鼠。10kDa FIX-PEG组中的12只小鼠中有11只免于死亡，20kDa FIX-PEG组中的16只小鼠中有12只小鼠免于死亡。与只有血小板参与的止血不同，通过目测检查观察到出血的停止是由于血纤蛋白结块的形成而引起的。这些结果表明10kDa FIX-PEG和20kDa FIX-PEG都具有活性。

Claims (30)

1.因子IX-聚乙二醇(FIX-PEG)缀合物，其中一个或多个聚乙二醇基团通过半胱氨酸残基被连接至因子IX。
2.因子IX-聚乙二醇(FIX-PEG)缀合物，其中一个或多个聚乙二醇基团通过一个或多个还原的半胱氨酸二硫键结合至因子IX。
3.权利要求2的FIX-PEG缀合物，其中一个或多个含有PEG的部分按照下式桥接一个或多个半胱氨酸二硫键：
Figure FPA00001259737900011
其中R1代表可以是直键、亚烃基(优选C1-10亚烃基)或任选地取代的芳基或杂芳基的连接基团；
其中芳基包括苯基和萘基；
其中合适的杂芳基包括吡啶、吡咯、呋喃、吡喃、咪唑、吡唑、噁唑、哒嗪、嘧啶和嘌呤；
其中可通过针对水解不稳定的键或通过非不稳定性键的方式连接至聚合物。
4.权利要求3的FIX-PEG缀合物，其中所述一个或多个含有PEG的部分按照下式桥接一个或多个半胱氨酸二硫键：
5.权利要求1、2、3或4的FIX-PEG缀合物，其中所述一个或多个含有PEG的部分具有大约10kDa的分子量。
6.权利要求1、2、3、4或5的FIX-PEG缀合物，其具有1个含PEG的部分。
7.权利要求1、2、3、4或5的FIX-PEG缀合物，具有2个含PEG的部分。
8.包含权利要求1至7的任一项的缀合物的组合物，其中所述组合物还包含药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
9.权利要求8的组合物，其中组合物已被配制用于胃肠外施用。
10.权利要求9的组合物，其适合用于皮内、皮下和肌内注射以及静脉内或骨内输注。
11.包含权利要求1至7的任一项的缀合物的组合物，其采用溶液、悬浮液或乳剂的形式。
12.权利要求1至7的任一项的缀合物，其中与未修饰的FIX相比，所述FIX-PEG缀合物具有更长的半衰期。
13.权利要求1至7的任一项的缀合物，其中与未修饰的FIX相比，所述FIX-PEG缀合物具有更高的AUC。
14.权利要求1至7的任一项的缀合物，其中与未修饰的FIX相比，所述FIX-PEG缀合物具有更高的生物利用度。
15.用于治疗血友病B的方法，其包括给有此需要的患者施用药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至7的任一项的FIX-PEG缀合物和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体。
16.减少具有血友病B的哺乳动物中关节积血、大出血、消化道出血和月经过多的风险的方法，其包括给有此需要的患者施用药物组合物，所述药物组合物包含权利要求1至7的任一项的FIX-PEG缀合物和药学上可接受的稀释剂、佐剂或载体，其中组合物基本上不含因子IXa。
17.权利要求16的方法，其中组合物的平均血栓评分在3个独立的实验后小于1。
18.权利要求16的方法，其中组合物的平均血栓评分在3个独立的实验后小于0.5。
19.权利要求16的方法，其中组合物的平均血栓评分在3个独立的实验后为0。
20.权利要求15的方法，其中皮下施用所述组合物。
21.权利要求15的方法，其中静脉内施用所述组合物。
22.权利要求15的方法，其中与包含可测的量的因子IXa的重组因子IX的组合物相比，所述组合物导致减少的血栓形成发生率。
23.权利要求15的方法，其中每天1次施用所述组合物。
24.权利要求15的方法，其中每2天1次施用所述组合物。
25.权利要求15的方法，其中以1IU至10,000IU的剂量施用所述组合物。
26.权利要求15的方法，其中以200IU至2500IU的剂量施用所述组合物。
27.权利要求15的方法，其中以大约250IU、大约500IU、大约1000IU或大约2000IU的剂量施用所述组合物。
28.权利要求15的方法，其中以使循环性因子IX活性的浓度为1IU/dL至150IU/dL的剂量施用所述组合物。
29.权利要求15的方法，其中以使循环性因子IX活性的浓度为10IU/dL至120IU/dL的剂量施用所述组合物。
30.权利要求15的方法，其中以使循环性因子IX活性的浓度为20IU/dL至100IU/dL的剂量施用所述组合物。
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