CN112661863A - 通过连接至促性腺激素羧基端肽来增加多肽的流体动力学体积的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)或其片段用于修饰多肽或其片段从而增加所述多肽或其片段的流体动力学体积的用途。

Description

通过连接至促性腺激素羧基端肽来增加多肽的流体动力学体 积的方法
本申请为申请日为2013年11月20日、申请号为201380066354.X、发明名称为“通过连接至促性腺激素羧基端肽来增加多肽的流体动力学体积的方法”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)用于增加多肽或其片段的流体动力学体积的用途。
背景技术
生物技术产品涵盖了所有治疗药物的大部分，包括单克隆抗体、疫苗、生长因子、激素、细胞因子、凝血因子、融合蛋白、酶和其它蛋白。除了单克隆抗体和疫苗以外，在该列表中的许多具有低于50kDa的分子质量和在几分钟至几小时范围内的短终末半衰期。
蛋白治疗剂的效力主要取决于它们的药代动力学性能，包括它们的血浆半衰期，这会影响分布和排泄。尽管小尺寸会促进组织穿透，这些分子经常从循环中快速地清除。因而，为了在延长的时间段内维持治疗有效浓度，进行输注或频繁施用，或利用向血流中的缓慢吸收而局部地或皮下地施用药物。小尺寸蛋白药物的这些限制已经导致半衰期延长策略的开发和实现，以延长这些重组抗体在血液中的循环并从而改善施用和药代动力学以及药效动力学性能。
本发明采用这样的策略，以便使目标蛋白或其片段(包括肽)的流体动力学尺寸或体积增加特定因数，并由此改善它们的施用、药代动力学以及药效动力学性能。流体动力学体积的这种增加通过利用基于肽的技术来实现，所述技术用于延长蛋白和肽的血清半衰期。该技术是基于使用天然的肽，即人绒毛膜促性腺激素(hCG)的β链的C-端肽(CTP)，该肽会给hCG提供所需的寿命以维持妊娠。黄体生成素(LH)(一种触发排卵的能育性激素)的β链与hCG几乎相同，但是不包括CTP。所以，LH在血液中具有显著更短的半衰期。将预定数目的CTP连接至目标蛋白或肽，会使它们的流体动力学体积增加特定因数并导致改善的性能，所述性能包括目标蛋白或肽的增强的血清半衰期和效能。
发明内容
在一个实施方案中，本发明涉及一种增加目标多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积的方法，所述方法包括：将1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述多肽或其片段，其中将所述1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段会导致每个连接的CTP使所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加约28-53kDa，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种增加多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积的方法，所述方法包括：将1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述多肽或其片段，其中将所述1-10个CTP连接至所述多肽或其片段会导致使所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加一定量，所述量取决于所述CTP所连接的特定多肽或其片段，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。
从下述详细描述实施例和附图将明白本发明的其它特征和优点。但是，应当理解，所述详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
以下附图形成本说明书的部分，并且被包括以进一步证实本公开内容的某些方面，通过参考这些附图中的一个或多个，结合在本文中呈现的具体实施方案的详细描述，可以更好地理解所述方面的发明。
图1显示了6种不同的纯化的CTP修饰的蛋白和它们的对应天然蛋白的SDS-PAGE分析。1.CTP-hGH-CTP-CTP(MOD-4023),2.比奥托品(Biotropin，rhGH),3.大小标志物,4.CTP-EPO-CTP-CTP,5.CTP-CTP-EPO,6.CTP-CTP-EPO-CTP-CTP,7.
Figure BDA0002868439760000021
(rEPO),8.大小标志物,9.APO-A1,10.大小标志物,11.Apo-CTP,12.Apo-CTP-CTP,13.大小标志物。
图2显示了5种不同的纯化的CTP修饰的蛋白和它们的对应天然蛋白的SDS-PAGE分析。1.FIX-CTP-CTP-CTP 2.大小标志物3.FIX-CTP-CTP-CTP-CTP 4.FIX-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP 5.
Figure BDA0002868439760000022
(rFIX)6.大小标志物7.FVIIa-CTP-CTP-CTP 8.FVIIa-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP 9.大小标志物。
图3显示了通过MALDI-TOF测量的、未糖基化的(A)和糖基化的(B)CTP修饰的蛋白的一个CTP拷贝的分子量(kDa)增量。
图4显示了通过SEC-HPLC测量的、糖基化的CTP修饰的蛋白的流体动力学尺寸与它们的对应天然蛋白相比的增量。(A)展示流体动力学尺寸的总增量，而(B)展示每一个拷贝的糖基化的CTP的计算增量。
图5显示了通过SEC-HPLC柱测量的、未糖基化的CTP修饰的蛋白的流体动力学尺寸与它们的对应天然蛋白相比的增量。(A)展示流体动力学尺寸的总增量，而(B)展示每一个拷贝的未糖基化的CTP的计算增量。
具体实施方式
在一个实施方案中，本文提供了一种增加目标多肽或其片段的流体动力学体积或流体动力学尺寸的方法，所述方法包括下述步骤：在所述多肽或其片段的N-端或C-端上将所述多肽或其片段融合至至少一个绒毛膜促性腺激素C-端肽(CTP)。
在一个实施方案中，术语“蛋白”和“多肽”在本文中可互换地使用。在另一个实施方案中，术语“目标多肽或其片段”或“目标蛋白或其片段”包括天然多肽(降解产物、通过合成法合成的多肽或重组多肽)和肽拟似物(通常，通过合成法合成的多肽)、以及作为多肽类似物的类肽和半类肽，在另一个实施方案中，所述多肽类似物具有这样的修饰：所述修饰使得本文中提供的经修饰的多肽当在体内时甚至稳定或更能够穿透进细胞中。此外，该术语也包括目标肽。在另一个实施方案中，本文提供的至少一个CTP肽连接至目标多肽或其片段或本文中提供的目标肽。在另一个实施方案中，当表示蛋白或多肽时，术语“其片段”包括目标蛋白或多肽的截短形式，包括目标肽。
在另一个实施方案中，术语蛋白或多肽的“其片段”表示功能片段(例如，具有与亲本多肽相同的生物活性或与亲本多肽相比增强的活性的片段)。其片段的例子可以包括多肽的变体、或从亲本多肽衍生出的肽。因此，应当理解，术语蛋白或多肽的“其片段”和术语“肽”可以在本文中互换使用。
在一个实施方案中，本文提供了使目标多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积增加至少约28kDa的方法，所述方法包括下述步骤：在所述多肽或其片段的N-端或C-端上将所述多肽或其片段融合至至少一个绒毛膜促性腺激素C-端肽(CTP)。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加目标多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积的方法，所述方法包括：将1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述多肽或其片段，其中将所述1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段会导致增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。在另一个实施方案中，每个连接至所述多肽或其片段的糖基化的CTP使所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加约28-53kDa，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。在另一个实施方案中，每个连接至所述多肽或其片段的未糖基化的CTP使所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加约8.0-22kDa，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。在另一个实施方案中，每个连接至所述多肽或其片段的未糖基化的CTP使所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加约8.1-21.6kDa，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。
在另一个实施方案中，本文提供了一种增加多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积的方法，所述方法包括：将1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述多肽或其片段，其中将所述1-10个CTP连接至所述多肽或其片段会导致使所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加一定量，所述量取决于所述CTP所连接的特定多肽或其片段，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。
在一个实施方案中，所述1-10个CTP连接至所述多肽的N-端。在另一个实施方案中，所述1-10个CTP连接至所述多肽的C-端。在另一个实施方案中，所述1-10个CTP连接至所述多肽的N-端和C-端。在另一个实施方案中，一个CTP连接至所述多肽的N-端且两个CTP连接至所述多肽的C-端。在另一个实施方案中，两个CTP连接至所述多肽的N-端且两个CTP连接至所述多肽的C-端。
在一个实施方案中，术语“流体动力学尺寸”或“流体动力学体积”在本文中可互换地使用，且各自表示分子(例如，蛋白分子)的表观大小，其基于所述分子在水溶液中的扩散。可以处理蛋白在溶液中的扩散或运动以衍生出蛋白的表观大小，其中所述大小由蛋白颗粒的“斯托克斯半径”或“流体动力学半径”给出。蛋白的“流体动力学尺寸”取决于质量和形状(构象)，使得两种具有相同分子质量的蛋白可以基于所述蛋白的总构象而具有不同的流体动力学尺寸。
在另一个实施方案中，所述糖基化的类型是O-糖基化。在另一个实施方案中，所述O-糖基化的类型是通过通过a-糖苷键与蛋白链中的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的GalNAc连接。在另一个实施方案中，所述O-糖基化的类型是与蛋白链中的Ser或Thr残基的N-乙酰基葡萄糖胺(GlcNac)连接。在另一个实施方案中，所述O-糖基化的类型是O-岩藻糖基化、O-甘露糖基化、核心1O-糖基化、核心2O-糖基化或O-葡萄糖基化。在另一个实施方案中，所述O-糖基化是粘蛋白-型O-糖基化。在另一个实施方案中，所述O-糖基化包含与丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、羟赖氨酸或羟脯氨酸侧链的羟基氧连接的O-连接的聚糖。在另一个实施方案中，所述O-糖基化之后添加半乳糖和/或唾液酸，其中在其它实施方案中，在O-糖基化以后向目标蛋白添加至少一个半乳糖分子，和/或添加至少一个唾液酸分子。在另一个实施方案中，添加约1-3个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约1-3个唾液酸分子。在另一个实施方案中，添加约1-5个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约1-5个唾液酸分子。在另一个实施方案中，添加约1-10个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约1-20个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约21-30个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约31-40个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约41-50个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约51-60个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约61-70个半乳糖分子。在另一个实施方案中，添加约1-10个唾液酸分子。在另一个实施方案中，每添加一个半乳糖分子添加2个唾液酸分子。在另一个实施方案中，每个CTP添加约1-5个半乳糖分子。在另一个实施方案中，每个CTP添加约1-10个唾液酸分子。在另一个实施方案中，在每个CTP修饰的多肽或其片段中总计添加约1-60个半乳糖分子和添加约1-120个唾液酸分子。
在另一个实施方案中，本文提供的糖基化的类型是N-糖基化。在另一个实施方案中，N-连接的聚糖连接至天冬酰胺或精氨酸侧链的氮。N-连接的氨基酸共有序列是Asn-任意氨基酸-Ser或Thr，其中任意氨基酸可以不是脯氨酸。
在另一个实施方案中，本文提供了一种增加多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积的方法，所述方法包括：将至少一个未糖基化的绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至目标多肽或其片段的N-端或C-端，其中将至少一个CTP连接至所述多肽或其片段会导致所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加一定量，所述量取决于所述CTP所连接的特定多肽或其片段，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。
在一个实施方案中，糖基化的CTP会增加它所连接或融合的蛋白的流体动力学体积。在另一个实施方案中，未糖基化的CTP会增加它所连接或融合的蛋白的流体动力学体积。
在一个实施方案中，CTP修饰的蛋白(其在所述蛋白的天然部分中含有聚糖)会贡献对一个拷贝的糖基化的CTP的流体动力学体积的较高增量，例如，本文中的实施例3/表5证实，FIX和FVIIa-CTP修饰的蛋白(其在所述蛋白的天然部分中含有聚糖)会贡献对一个拷贝的糖基化的CTP的流体动力学体积的较高增量。
技术人员会明白，当受本发明的说明书指引时，可以将糖基化的CTP和未糖基化的CTP的组合用于增加本文中提供的多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积。可以进行这样的操作，以便使多肽或其片段的流体动力学体积增加至最佳或期望的水平。在一个实施方案中，流体动力学体积的这样的最佳或期望的增加水平与在受试者中增强的保留时间、从受试者的低清除率和目标多肽或其片段的增强的生物活性有关。在一个实施方案中，将1-5个糖基化的CTP和1-5个未糖基化的CTP并行地连接至本文中提供的多肽或其片段。在另一个实施方案中，将糖基化的或未糖基化的CTP肽串联地连接至N-端或C-端，或随机地连接至N-端和C-端。技术人员还会理解，可以使用糖基化的和未糖基化的CTP肽的额外组合，且因此被本发明包括。
在一个实施方案中，术语“连接”及其语法变体表示一个蛋白、多肽或肽与另一个蛋白、多肽或肽的结合。在另一个实施方案中，这样的结合表示目标蛋白、多肽或肽与本文中提供的至少一个CTP肽的结合。在另一个实施方案中，这样的结合表示目标蛋白、多肽或肽与本文中提供的1-10个CTP肽的结合。这样的结合可以通过众多方式实现，所述方式包括、但不限于共价结合、氢结合、离子结合、金属结合、极性共价结合、非共价结合(范德华相互作用、疏水相互作用、氢键合等)、通过使用接头实现的结合等。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加目标多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积的方法，所述方法包括：将至少一个未糖基化的绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述多肽或其片段的N-端或C-端，其中将至少一个CTP连接至所述多肽或其片段会导致所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积增加一定量，所述量取决于所述CTP所连接的特定多肽或其片段，由此增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积。
在另一个实施方案中，使用本领域已知的方法，包括、但不限于基于酶的去糖基化，将本文提供的CTP去糖基化。
技术人员会明白，术语“未糖基化”和“去糖基化”及其语法变体在本文中可互换地使用。
在另一个实施方案中，本文提供了一种针对目标多肽或其片段增加体内生物活性、增加血清半衰期、增加生物利用度、增加效能或扩展曲线下面积(AUC)等(如本文中另外提供的)的方法，所述方法包括下述步骤：将至少一个糖基化的CTP肽与所述多肽或其片段融合，其中将糖基化的CTP肽与所述多肽或其片段融合会导致，与未修饰的多肽或其片段的流体动力学体积相比，所述多肽或其片段的流体动力学体积增加至少约28kDa。
在另一个实施方案中，所述CTP修饰的多肽具有较低体外生物活性，但是该较低活性被延长的半衰期补偿。在另一个实施方案中，所述CTP修饰的多肽具有增加的体外生物活性。
在另一个实施方案中，增加本文中提供的多肽或其片段的流体动力学体积会降低所述多肽或其片段的施用频率。在另一个实施方案中，增加所述多肽或其片段的流体动力学体积也会增加所述多肽或其片段的表观分子量。
在一个实施方案中，使用本领域众所周知的方法，包括、但不限于，尺寸排阻色谱法(SEC)、动态光散射方法(DLS)、沉降速度、沉降平衡离心和分光光度测量检测，确定表观分子量。在另一个实施方案中，使用本领域中可得到的蛋白质组学软件，确定理论分子量。这样的软件包括、但不限于Expasy portal、ProteoIQ、Scaffold 3等。在另一个实施方案中，使用本领域众所周知的方法，包括、但不限于MALDI-TOF，确定实际分子量。
在另一个实施方案中，本文提供了一种使目标多肽或其片段的表观分子量增加至少28kDa的方法。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约1-14kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约15-27kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约28-40.0kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约28-55.0kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约28-70.0kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约28-80.0kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约28-90.0kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约28-100.0kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约41.0-50kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP肽。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约51.0-60kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP肽。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量增加约61.0-70kDa的方法，所述方法包括：向所述多肽或其片段连接至少一个CTP肽。在另一个实施方案中，所述CTP是糖基化的。在另一个实施方案中，所述CTP是未糖基化的CTP。
在一个实施方案中，本文中提供的方法意外地证实，向目标多肽或其片段随后添加糖基化的CTP肽会线性地贡献与CTP肽向所述目标多肽或其片段的先前连接大约相同的表观分子量(参见表4)。
在另一个实施方案中，至少一个糖基化的CTP会为目标蛋白贡献每个糖基化的CTP约28-40kDa。在另一个实施方案中，至少一个糖基化的CTP会为目标蛋白贡献每个糖基化的CTP约28-55kDa，不论连接的CTP的数目如何。
在一个实施方案中，本文提供了一种使目标多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约2倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约3-5倍的方法，所述方法包括下述步骤：将至少一个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约6-10倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约11-20倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约21-30倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段，所述方法包括下述步骤：将至少一个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约31-40倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约41-50倍的方法，所述方法包括下述步骤：将至少一个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约51-60倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约61-70倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约71-80的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约81-90倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，本文提供了一种使多肽或其片段的表观分子量比所述多肽或其片段的理论分子量增加约91-100倍的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，将至少一个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，将1-5个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，将1-15个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，将1-20个CTP肽连接至所述多肽或其片段。在另一个实施方案中，至少一个CTP肽是糖基化的。在另一个实施方案中，至少一个CTP肽是未糖基化的CTP肽。
在另一个实施方案中，增加目标多肽或其片段或目标肽的生物活性、血清半衰期、生物利用度、效能等的方法包括：通过将糖基化的CTP连接至所述多肽或其片段，使目标多肽或其片段的总流体动力学体积与未修饰的多肽或其片段相比增加约28kDa。在另一个实施方案中，增加目标多肽或其片段的生物活性、血清半衰期、生物利用度等的方法包括：通过将本文中提供的CTP连接至所述多肽或其片段，使所述多肽或其片段的总流体动力学体积与未修饰的目标多肽或其片段相比增加约1-10kDa、11-20kDa、21-30kDa、31-40kDa、41-50kDa、51-60kDa、61-70kDa、71-80kDa、81-90kDa、91-100kDa、100-150kDa、151-200kDa、201-400kDa、401-1000kDa或1001-5000kDa。
在另一个实施方案中，在本文提供的方法中，至少一个CTP是糖基化的。在另一个实施方案中，在本文提供的方法中，至少一个CTP为本文中也提供的多肽或其片段贡献每个CTP约28.3-38.7kDa的流体动力学体积。在另一个实施方案中，所述糖基化的CTP贡献每个CTP 28.3-38.7kDa，不论它结合哪种多肽或其片段(参见本文中的实施例3)。在另一个实施方案中，所述糖基化的CTP贡献每个CTP 28.3-38.7kDa，不良与所述多肽连接的CTP肽的数目(参见本文中的实施例3)。在另一个实施方案中，至少一个CTP的贡献是至少20kDa。在另一个实施方案中，至少一个CTP的贡献是至少约20kDa至27.9kDa。在另一个实施方案中，一个CTP的贡献是至少28kDa。在另一个实施方案中，一个CTP的贡献是约28kDa至40kDa。在另一个实施方案中，一个CTP的贡献是约41kDa至50kDa。在另一个实施方案中，一个CTP的贡献是约51kDa至60kDa。
在另一个实施方案中，增加目标多肽或其片段的血清半衰期或增强目标多肽或其片段的效能的方法包括，使所述多肽或其片段的流体动力学体积与未修饰的多肽或其片段相比增加约84kDa。在另一个实施方案中，使流体动力学体积增加约84kDa对应于根据本文提供的方法将多肽或其片段连接至3个糖基化的CTP肽而进行修饰。在另一个实施方案中，在连接至本文中提供的多肽或其片段的3个糖基化的CTP肽中，一个糖基化的CTP肽连接至多肽或其片段的N-端，而2个糖基化的CTP肽串联地连接至多肽或其片段的C-端。
在一个实施方案中，增加目标多肽或其片段的血清半衰期或生物活性的方法包括，使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的多肽或其片段相比增加约84-159kDa。在另一个实施方案中，通过将2个糖基化的CTP肽至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约56-110kDa。在另一个实施方案中，通过将3个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约84-162kDa。在另一个实施方案中，通过将4个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约112-230kDa。在另一个实施方案中，通过将5个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约140-280kDa。在另一个实施方案中，通过将6个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约168-330kDa。在另一个实施方案中，通过将7个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约196-390kDa。在另一个实施方案中，通过将8个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约224-425kDa。在另一个实施方案中，通过将9个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约252-480kDa。在另一个实施方案中，通过将10个糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段，实现使流体动力学尺寸或体积增加约280-330kDa。
在一个实施方案中，本文中提供的方法还包括将未糖基化的CTP连接至目标多肽或其片段。应当理解，可以进行用糖基化的和/或未糖基化的CTP修饰目标多肽或其片段的多种方式。在一个实施方案中，仅用至少一个糖基化的CTP或仅用至少一个未糖基化的CTP修饰目标多肽或其片段。在另一个实施方案中，用至少一个糖基化的CTP和至少一个未糖基化的CTP修饰目标多肽或其片段。在另一个实施方案中，将糖基化的CTP和/或未糖基化的CTP的截短形式用在本文提供的方法中。
在另一个实施方案中，本文提供了一种通过使目标多肽或其片段的流体动力学体积增加特定量来增加目标多肽或其片段的生物活性、血清半衰期、生物利用度、效能等的方法，所述方法包括：将至少一个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述多肽的N-端或C-端，其中将至少一个未糖基化的CTP肽连接至目标多肽或其片段会导致与多肽或其片段的未修饰形式相比增加所述多肽或其片段的流体动力学尺寸或流体动力学体积，且其中特定量取决于未糖基化的CTP所连接的目标多肽或其片段。在另一个实施方案中，当将至少一个未糖基化的CTP连接至目标多肽或其片段时，未糖基化的CTP所连接的目标多肽决定了表观分子量或流体动力学体积的增加量。在另一个实施方案中，当将一个未糖基化的CTP连接至hGH时，所述未糖基化的CTP会给人生长激素(hGH)的流体动力学尺寸或流体动力学体积贡献约8kDa。在另一个实施方案中，当将一个未糖基化的CTP连接至红细胞生成素(EPO)时，未糖基化的CTP会给EPO的流体动力学尺寸或流体动力学体积贡献约16kDa。在另一个实施方案中，当将一个未糖基化的CTP连接至载脂蛋白-A1(APO-A1)时，未糖基化的CTP会给APO-A1的流体动力学尺寸或流体动力学体积贡献约21kDa。在另一个实施方案中，当将一个未糖基化的CTP连接至因子IX(FIX)时，未糖基化的CTP会给FIX的流体动力学尺寸或流体动力学体积贡献约20kDa。在另一个实施方案中，当将一个未糖基化的CTP连接至因子VIIa(FVIIa)时，未糖基化的CTP会给FIX的流体动力学尺寸或流体动力学体积贡献约20kDa。
在一个实施方案中，增加本文中提供的目标多肽或其片段的流体动力学体积的方法会增强多肽的或其片段的生物利用度。
在另一个实施方案中，增加本文中提供的目标多肽或其片段的流体动力学体积的方法会降低目标多肽或其片段的施用频率。
在一个实施方案中，通过本文提供的方法修饰的多肽是细胞因子、单克隆抗体、生长因子、激素、细胞因子、凝血因子、酶等。
在另一个实施方案中，至少一个CTP肽所连接的多肽是促红细胞生成素(EPO)、人生长激素(hGH)、载脂蛋白A1(APO-A1)、因子IIa(FVIIa)、因子IX(FIX)或胃泌酸调节素(OXM)。
在一个实施方案中，至少一个未糖基化的CTP会给EPO贡献约16kDa。在另一个实施方案中，当连接至EPO时，至少一个未糖基化的CTP会给EPO的表观分子量贡献约16kDA。在另一个实施方案中，至少一个未糖基化的CTP会给hGH贡献约8kDa。在另一个实施方案中，当连接至hGH时，至少一个未糖基化的CTP会给hGH的表观分子量贡献约8kDA。在另一个实施方案中，至少一个未糖基化的CTP会给APO-A1贡献约21kDa。在另一个实施方案中，当连接至APO-A1时，至少一个未糖基化的CTP会给APO-A1的表观分子量贡献约21kDA。
在一个实施方案中，所述未糖基化的CTP给所述未糖基化的CTP所连接的每个多肽贡献不同的流体动力学体积。在另一个实施方案中，该差异取决于未糖基化的CTP所结合的多肽或其片段(参见本文中的实施例3)。在另一个实施方案中，所述未糖基化的CTP意外地贡献相同的流体动力学尺寸(对于每个特定多肽上的每个CTP而言)，不论与多肽连接的未糖基化的CTP肽的数目(参见本文中的实施例3)。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加hGH的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的hGH相比增加约28-40kDa。在另一个实施方案中，通过将约2个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约56-80kDa。在另一个实施方案中，通过将约3个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约84-120kDa。在另一个实施方案中，通过将约4个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约112-160kDa。在另一个实施方案中，通过将约5个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约140-200kDa。在另一个实施方案中，通过将约6个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约168-240kDa。在另一个实施方案中，通过将约7个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约196-280kDa。在另一个实施方案中，通过将约8个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约224-320kDa。在另一个实施方案中，通过将约9个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约252-360kDa。在另一个实施方案中，通过将约10个糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约280-400kDa。在另一个实施方案中，将1-10个截短的或部分CTP肽连接至目标多肽或其片段。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加EPO的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的EPO相比增加约28-40kDa。在另一个实施方案中，通过将2个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约56-80kDa。在另一个实施方案中，通过将3个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约84-120kDa。在另一个实施方案中，通过将4个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约112-160kDa。在另一个实施方案中，通过将5个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约140-200kDa。在另一个实施方案中，通过将6个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约168-240kDa。在另一个实施方案中，通过将7个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约196-280kDa。在另一个实施方案中，通过将8个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约224-320kDa。在另一个实施方案中，通过将9个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约252-360kDa。在另一个实施方案中，通过将10个糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约280-400kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加APO-A1的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的APO-A1相比增加约28-40kDa。在另一个实施方案中，通过将2个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约56-80kDa。在另一个实施方案中，通过将3个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约84-120kDa。在另一个实施方案中，通过将4个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约112-160kDa。在另一个实施方案中，通过将5个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约140-200kDa。在另一个实施方案中，通过将6个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约168-240kDa。在另一个实施方案中，通过将7个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约196-280kDa。在另一个实施方案中，通过将8个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约224-320kDa。在另一个实施方案中，通过将9个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约252-360kDa。在另一个实施方案中，通过将10个糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约280-400kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加FIX的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的FIX相比增加约48-53kDa。在另一个实施方案中，通过将2个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约96-106kDa。在另一个实施方案中，通过将3个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约144-159kDa。在另一个实施方案中，通过将4个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约192-212kDa。在另一个实施方案中，通过将5个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约240-265kDa。在另一个实施方案中，通过将6个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约288-318kDa。在另一个实施方案中，通过将7个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约336-371kDa。在另一个实施方案中，通过将8个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约384-424kDa。在另一个实施方案中，通过将9个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约432-530kDa。在另一个实施方案中，通过将10个糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约480-530kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加FVIIa的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的FVIIA相比增加约43-50kDa。在另一个实施方案中，通过将2个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约86-100kDa。在另一个实施方案中，通过将3个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约129-150kDa。在另一个实施方案中，通过将4个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约172-200kDa。在另一个实施方案中，通过将5个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约215-250kDa。在另一个实施方案中，通过将6个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约258-300kDa。在另一个实施方案中，通过将7个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约301-350kDa。在另一个实施方案中，通过将8个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约344-400kDa。在另一个实施方案中，通过将9个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约387-450kDa。在另一个实施方案中，通过将10个糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约430-500kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加hGH的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的hGH相比增加约8kDa。在另一个实施方案中，通过将2个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约16kDa。在另一个实施方案中，通过将3个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约24kDa。在另一个实施方案中，通过将4个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约32kDa。在另一个实施方案中，通过将5个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约40kDa。在另一个实施方案中，通过将6个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约48kDa。在另一个实施方案中，通过将7个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约56kDa。在另一个实施方案中，通过将8个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约64kDa。在另一个实施方案中，通过将9个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约72kDa。在另一个实施方案中，通过将10个未糖基化的CTP肽连接至hGH，实现使流体动力学尺寸或体积增加约80kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加EPO的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的EPO相比增加约16kDa。在另一个实施方案中，通过将2个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约32kDa。在另一个实施方案中，通过将3个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约48kDa。在另一个实施方案中，通过将4个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约16kDa。在另一个实施方案中，通过将5个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约80kDa。在另一个实施方案中，通过将6个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约96kDa。在另一个实施方案中，通过将7个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约112kDa。在另一个实施方案中，通过将8个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约128kDa。在另一个实施方案中，通过将9个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约144kDa。在另一个实施方案中，通过将10个未糖基化的CTP肽连接至EPO，实现使流体动力学尺寸或体积增加约160kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加APO-A1的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的APO-A1相比增加约21kDa。在另一个实施方案中，通过将2个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约42kDa。在另一个实施方案中，通过将3个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约63-120kDa。在另一个实施方案中，通过将4个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约84kDa。在另一个实施方案中，通过将5个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约105kDa。在另一个实施方案中，通过将6个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约126kDa。在另一个实施方案中，通过将7个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约147kDa。在另一个实施方案中，通过将8个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约168kDa。在另一个实施方案中，通过将9个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约189kDa。在另一个实施方案中，通过将10个未糖基化的CTP肽连接至APO-A1，实现使流体动力学尺寸或体积增加约210kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加FIX的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的FIX相比增加约20kDa。在另一个实施方案中，通过将2个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约40kDa。在另一个实施方案中，通过将3个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约60kDa。在另一个实施方案中，通过将4个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约80kDa。在另一个实施方案中，通过将5个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约100kDa。在另一个实施方案中，通过将6个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约120kDa。在另一个实施方案中，通过将7个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约140kDa。在另一个实施方案中，通过将8个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约160kDa。在另一个实施方案中，通过将9个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约180kDa。在另一个实施方案中，通过将10个未糖基化的CTP肽连接至FIX，实现使流体动力学尺寸或体积增加约200kDa。
在一个实施方案中，本文提供了一种增加FVIIa的血清半衰期或生物活性的方法，所述方法包括下述步骤：使多肽或其片段的流体动力学尺寸或体积与未修饰的FVIIA相比增加约20kDa。在另一个实施方案中，通过将2个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约40kDa。在另一个实施方案中，通过将3个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约60kDa。在另一个实施方案中，通过将4个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约80kDa。在另一个实施方案中，通过将5个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约100kDa。在另一个实施方案中，通过将6个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约120kDa。在另一个实施方案中，通过将7个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约140kDa。在另一个实施方案中，通过将8个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约160kDa。在另一个实施方案中，通过将9个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约180kDa。在另一个实施方案中，通过将10个未糖基化的CTP肽连接至FVIIA，实现使流体动力学尺寸或体积增加约200kDa。
在一个实施方案中，所述流体动力学体积会增加生物样品中的目标蛋白的保留时间。在另一个实施方案中，所述流体动力学体积会增加生物样品中的目标蛋白的曲线下面积(AUC)。在另一个实施方案中，所述生物样品是血液、靶组织(例如，关节、CNS)、脑脊液(CSF)、淋巴液或血清。
在另一个实施方案中，增加流体动力学体积会增加本文中提供的目标多肽或其片段的生物利用度。在另一个实施方案中，增加多肽的流体动力学体积也会延长多肽或其片段的血清半衰期。
在另一个实施方案中，增加流体动力学体积会增加多肽的生物活性。
在另一个实施方案中，术语“CTP肽”、“羧基端肽”和“CTP序列”在本文中可互换地使用。在另一个实施方案中，所述羧基端肽是全长CTP。在另一个实施方案中，所述羧基端肽是截短的CTP。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
在另一个实施方案中，将信号肽连接至CTP的氨基端，如在US 7,553,940中所述，其通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中，至少一个CTP经由接头连接至多肽。在另一个实施方案中，所述接头是肽键。在另一个实施方案中，所述融合蛋白形成CTP修饰的多肽。在一个实施方案中，增加多肽或其片段的流体动力学体积的方法包括，将多肽或其片段在所述多肽或其片段的氨基或羧基端上与至少一个CTP肽融合。在另一个实施方案中，将CTP与多肽或其片段重组地融合。在另一个实施方案中，将CTP化学缀合至多肽或其片段。
在一个实施方案中，所述CTP修饰的多肽包含含有少于50个氨基酸的肽和连接至所述肽的N-(氨基)或C-(羧基)端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基端肽。
在一个实施方案中，包含与它们的N-端和/或C-端连接的至少单个CTP的、本发明的经工程改造的目标多肽在生物活性方面至少等同于未CTP修饰的目标多肽。在其它实施方案中，包含与它们的N-端和/或C-端连接的至少一个CTP的、本发明的经工程改造的目标多肽在药理学量度诸如药代动力学和药效动力学方面至少等同于未CTP修饰的目标多肽。
在一个实施方案中，本文中提供的CTP序列包含：DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL(SEQ ID NO:1)。在另一个实施方案中，所述CTP序列包含：SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:2)。在另一个实施方案中，所述CTP序列包含选自在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中所示序列的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CTP序列选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在一个实施方案中，本发明的羧基端肽(CTP)肽包含人绒毛膜促性腺激素的从氨基酸112至位置145的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的CTP序列包含如在SEQ IDNO:2中所示的、人绒毛膜促性腺激素的从氨基酸118至位置145的氨基酸序列。在另一个实施方案中，所述CTP序列也开始于位置112-118之间的任意位置且终止于人绒毛膜促性腺激素的位置145。在另一个实施方案中，所述CTP序列肽具有28、29、30、31、32、33或34个氨基酸的长度且开始于CTP氨基酸序列的位置112、113、114、115、116、117或118。
在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:3的前10个氨基酸。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:3包含下述氨基酸(AA)序列:SSSSKAPPPSLP。
在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前11个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前12个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的前8个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前13个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:2的前14个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的前6个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3的前5个氨基酸。
在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，所述变体与天然CTP相差1-5个保守的氨基酸置换，如在美国专利号5,712,122中所述，其通过引用并入本文。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，所述变体与天然CTP相差1个保守的氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，所述变体与天然CTP相差2个保守的氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，所述变体与天然CTP相差3个保守的氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，所述变体与天然CTP相差4个保守的氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，所述变体与天然CTP相差5个保守的氨基酸置换。
在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少40％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少50％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少60％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少70％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少80％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少90％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少95％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少98％同源性。
在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTP DNA序列或其肽具有至少70％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTP DNA序列或其肽具有至少80％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少90％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少95％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少98％同源性。
在一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列二者都被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的3个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的4个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的5个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的6个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的7个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的8个被截短。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个被截短。在另一个实施方案中，所有绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列都被截短。
在一个实施方案中，本文提供的CTP肽经由接头连接至本文提供的多肽或其片段。在一个实施方案中，1-10个CTP肽经由接头连接至本文提供的多肽或其片段。在一个实施方案中，至少一个CTP经由接头连接至本文提供的多肽或其片段。在另一个实施方案中，所述接头是肽键。
在一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列二者都被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的3个被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的4个被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的5个被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个被糖基化。在另一个实施方案中，所有绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列都被糖基化。
在一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个未被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列二者都未被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个未被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的3个未被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的4个未被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的5个未被糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个未被糖基化。在另一个实施方案中，所有绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列都未被糖基化。
在一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含至少一个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含2个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含3个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含4个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含5个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含6个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含7个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的糖基化的CTP序列包含8个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的CTP序列包含1-4个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的CTP序列包含4-9个糖基化位点。在另一个实施方案中，本发明的CTP序列包含6-12个糖基化位点。
在一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个被完全糖基化。在另一个实施方案中，绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个被部分地糖基化。在一个实施方案中，部分地糖基化指示，至少一个CTP糖基化位点被糖基化。在另一个实施方案中，所述糖基化位点是O-糖基化位点。在另一个实施方案中，所述糖基化位点是N-糖基化位点。
在一个实施方案中，在连接至目标多肽、药物或试剂时允许使用较低剂量方面，所述CTP序列修饰是有利的。在另一个实施方案中，在允许更少剂量的目标多肽、药物或试剂方面，所述CTP序列修饰是有利的。在另一个实施方案中，在施用CTP修饰的目标多肽、药物或试剂时允许安全的长效效应方面，所述CTP序列修饰是有利的。
在另一个实施方案中，对本文中的目标多肽和CTP肽的修饰包括、但不限于C端修饰、多肽键修饰，包括、但不限于，CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH、主链修饰和残基修饰。用于制备肽拟似物化合物的方法是本领域众所周知的，且参见，例如，Quantitative Drug Design,C.A.Ramsden Gd.,第17.2章,F.Choplin Pergamon Press(1992)，其通过引用并入如同在本文中完整地阐述。在下文中提供了在这方面的其它细节。
在另一个实施方案中，在多肽内的多肽键(-CO-NH-)被置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被N-甲基化的键(-N(CH3)-CO-)置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被酮亚甲基键(-CO-CH2-)置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)置换，其中R是任意烷基，例如，甲基亚胺键(-CH2-NH-)。在另一个实施方案中，所述多肽键被羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被烯族双键(-CH＝CH-)置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被反酰胺键(-NH-CO-)置换。在另一个实施方案中，所述多肽键被多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)置换，其中R是天然地存在于碳原子上的“标准”侧链。在另一个实施方案中，这些修饰沿着多肽链发生在任意键处，且在一个实施方案中，同时发生在几个(2-3个键)处。
在一个实施方案中，多肽的天然芳族氨基酸诸如Trp、Tyr和Phe被置换为合成的非天然酸诸如苯基甘氨酸、TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o-甲基-Tyr。在另一个实施方案中，本发明的多肽包括一个或多个修饰的氨基酸或者一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合糖等)。
在一个实施方案中，“氨基酸”或“氨基酸序列”被理解为包括20种天然存在的氨基酸；经常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它罕见氨基酸，包括、但不限于2-氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正-缬氨酸、正-亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方案中，“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
在另一个实施方案中，生化地合成本发明的经工程改造的多肽或肽，诸如通过使用标准的固相技术。在另一个实施方案中，这些生化方法包括排它固相合成法、部分固相合成法、片段缩合法或经典的溶液合成法。
在一个实施方案中，使用重组蛋白技术来制备本发明的经工程改造的目标多肽或其片段。在另一个实施方案中，重组技术由以下文献描述：Bitter等人,(1987)Methods inEnzymol.153:516-544,Studier等人(1990)Methods in Enzymol.185:60-89,Brisson等人(1984)Nature 310:511-514,Takamatsu等人(1987)EMBO J.6:307-311,Coruzzi等人(1984)EMBO J.3:1671-1680和Brogli等人,(1984)Science 224:838-843,Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565和Weissbach&Weissbach,1988,Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,NY,第VIII部分,第421-463页，它们通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中，所述CTP修饰的目标多肽或其片段包含含有少于50个氨基酸的肽和连接至所述多肽的N-端或C-端的至少一个糖基化的和/或未糖基化的绒毛膜促性腺激素羧基端肽。在一个实施方案中，本文中提供的CTP修饰的目标多肽或其片段包含含有少于40个氨基酸的肽和连接至所述多肽的N-端或C-端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基端肽。在另一个实施方案中，本文中提供的CTP修饰的目标多肽或其片段包含含有少于30、20或10个氨基酸的肽。在一个实施方案中，含有少于50个氨基酸的目标多肽或其片段包括本文中提供的肽。在另一个实施方案中，含有少于50个氨基酸的肽是hGH、OXM、EPO、载脂蛋白A1(APO-A1)、干扰素、细胞因子或凝血因子。
在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是EPO。在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是APO。在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是FVIIa。在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是FIX。在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是干扰素。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是hGH。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是OXM。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是GLP-1。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是胰岛素。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是脑啡肽。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是ACTH。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是胰高血糖素。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是胰岛素-样生长因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是表皮生长因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是酸性的或碱性的成纤维细胞生长因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是血小板-衍生的生长因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是粒细胞-CSF。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是巨噬细胞-CSF。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是IL-2。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是IL-3。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是肿瘤坏死因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是LHRH。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是LHRH类似物。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是生长抑素。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是生长激素释放因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是内啡肽。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是肺泡表面活性蛋白。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是利钠因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是粘附素。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是血管生成抑制因子。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是内皮他丁。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是受体肽。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是结合受体的配体。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是抗体。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是抗体片段。在另一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是肽或蛋白，包括任何修饰形式。
在另一个实施方案中，所述目标多肽或其片段另外包含连接在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和/或连接在C-端上的一个CTP氨基酸肽。在另一个实施方案中，所述目标多肽或其片段选自以下列表：胰岛素、Albutein/白蛋白、Activase altiplase/tPA、腺苷脱氨酶、免疫球蛋白、葡糖脑苷脂酶、Leukine-沙格司亭/GM-CSF、G-CSF、Venoglobulin-S/IgG、Proleukin阿地白介素、DNA酶、因子VIII、Helixate、L-天门冬酰胺酶、WinRho SDF Rh I、Retavase retaplase/tPA、因子IX、FSH、球蛋白、纤维蛋白、白介素-11、贝卡普勒明/PDGF、来匹卢定/herudin、TNF、胸腺球蛋白、因子VIIa、干扰素α-2a、干扰素alfa n-1、干扰素α-N3、干扰素β-1b、干扰素γ-1b、白介素-2、HGH或单克隆抗体。
在一个实施方案中，本文中提供的目标多肽或其片段进一步包含信号肽。在另一个实施方案中，所述目标多肽或其片段是生长激素。在另一个实施方案中，所述生长激素进一步包含信号肽。在另一个实施方案中，在表达和分泌以后，从前体工程肽/多肽切掉信号肽，产生成熟的工程肽/多肽。在另一个实施方案中，信号序列包括、但不限于内源性信号序列。
在另一个实施方案中，本发明的多肽和方法提供了另外具有包含下述氨基酸序列的信号肽的生长激素：MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(SEQ ID NO:4)。
在另一个实施方案中，以与未修饰的生长激素相同的方式使用本发明的CTP-修饰的或缀合的生长激素。在另一个实施方案中，本发明的缀合的生长激素具有增加的循环半衰期和血浆停留时间、降低的清除率和增加的体内临床活性。在另一个实施方案中，由于如本文中所述的缀合的生长激素的改善的性能，以比未修饰的生长激素更低的频率施用这些缀合物。在另一个实施方案中，每周1次至每2周1次施用如本文中所述的缀合的生长激素。在另一个实施方案中，每2周1次至每3周1次施用如本文中所述的缀合的生长激素。在另一个实施方案中，每天1次至每周3次施用如本文中所述的缀合的生长激素。在另一个实施方案中，降低的施用频率将导致改善的患者顺应性，从而导致改善的治疗结果以及改善的患者生活质量。在另一个实施方案中，与连接至聚乙二醇的生长激素的常规缀合物相比，已经发现，具有本发明的缀合物的分子量和接头结构的生长激素CTP缀合物具有改善的效能、改善的稳定性、增加的曲线下面积(AUC)水平和增强的循环半衰期。在另一个实施方案中，与连接至聚乙二醇的生长激素的常规缀合物相比，已经发现，有本发明的缀合物的分子量和接头结构的生长激素具有改善的效能、改善的稳定性、增加的AUC水平、增强的循环半衰期。在另一个实施方案中，与连接至聚乙二醇的生长激素的常规缀合物相比，已经发现，具有本发明的缀合物的最佳流体动力学体积的生长激素具有改善的效能、改善的稳定性、增加的AUC水平、增强的循环半衰期。在另一个实施方案中，缀合的生长激素的治疗有效量是体内可测量的预期生物活性所需的缀合物的量。在另一个实施方案中，根据本发明的教导利用的生长激素表现出增加的效能。在另一个实施方案中，CTP序列与生长激素的N-端和C-端的连接导致延长的体内活性。
在另一个实施方案中，所述生长激素是本领域技术人员已知的任意生长激素。在另一个实施方案中，所述生长激素是人生长激素。在另一个实施方案中，生长激素的核苷酸序列和/或氨基酸序列可在基因库数据库中得到。在另一个实施方案中，所述生长激素是在本文中提供的生长激素和/或在基因库数据库中提供的生长激素的同系物。在另一个实施方案中，同系物也表示删除、插入或置换变体，包括其氨基酸置换和它们的生物活性的多肽片段。
在另一个实施方案中，所述生长激素是缺少外显子2、3、4的hGH的变体或它们的任意组合。在另一个实施方案中，所述生长激素包含信号肽。在另一个实施方案中，所述生长激素包含信号切割位点。在另一个实施方案中，包含用本发明的CTP修饰的GH的多肽包含重组GH。
在另一个实施方案中，如本文中所述的生长激素是生长激素(GH)-样细胞因子的超家族的一个成员。在另一个实施方案中，如本文中所述的生长激素是人生长激素(hGH)。在另一个实施方案中，人生长激素包含下述氨基酸序列(Genbank登记号P01241)：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQID NO:5)。
在另一个实施方案中，人生长激素包含下述氨基酸序列：
MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:6)。在另一个实施方案中，人生长激素包含下述氨基酸序列:MFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLA(SEQ ID NO:7)。在另一个实施方案中，hGH包含下述氨基酸序列:MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKVQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:8)。在另一个实施方案中，hGH是置换变体，其中在hGH的位置65中的谷氨酰胺被缬氨酸置换。
在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号AAA72260下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号AAK69708下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号CAA01435下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号CAA01329下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号CAA00380下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号AAA72555下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号NP_000506.2下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号NP_072053.1下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号NP_072054.1下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号NP_072055.1下保藏的基因库氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明的生长激素包含在登记号NP_072056.1下保藏的基因库氨基酸序列。
在另一个实施方案中，编码如本文中所述的生长激素的核酸分子会编码本领域技术人员已知的生长激素的任意氨基酸序列。在另一个实施方案中，编码如本文中所述的生长激素的核酸分子会编码hGH。在另一个实施方案中，所述编码生长激素的核酸分子包含在登记号NM_000515.3下保藏的基因库核酸序列。在另一个实施方案中，所述编码生长激素的核酸分子包含在登记号NM_022559.2下保藏的基因库核酸序列。在另一个实施方案中，所述编码生长激素的核酸分子包含在登记号NM_022560.2下保藏的基因库核酸序列。在另一个实施方案中，所述编码生长激素的核酸分子包含在登记号NM_022561.2下保藏的基因库核酸序列。在另一个实施方案中，所述编码生长激素的核酸分子包含在登记号NM_022562.2下保藏的基因库核酸序列。
在另一个实施方案中，包含本发明的生长激素的多肽包含一个连接至生长激素的C-端的CTP(hGH-CTP)且具有下述氨基酸序列：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:9)。
在另一个实施方案中，包含本发明的生长激素的多肽包含2个串联连接至生长激素的C-端的CTP(hGH-CTP-CTP)且具有下述氨基酸序列:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:10)。
在另一个实施方案中，包含本发明的生长激素的多肽包含2个串联连接至生长激素的C-端的CTP和1个连接至生长激素的N-端的CTP(CTP-hGH-CTP-CTP)且具有下述氨基酸序列：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:11)。
在另一个实施方案中，包含本发明的生长激素的多肽包含2个串联连接至生长激素的C-端的CTP(其中两个CTP中的一个CTP被截短，且另一个CTP连接至生长激素的N-端)(tCTP-hGH-CTP-CTP)且具有下述氨基酸序列:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:12)。
在另一个实施方案中，包含本发明的生长激素的多肽包含一个连接至生长激素的C-端的CTP和一个连接至生长激素的N-端的CTP(CTP-hGH-CTP)且具有下述氨基酸序列：
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:13)。
在另一个实施方案中，包含生长激素和一个CTP的多肽包含下述氨基酸序列:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF(SEQ ID NO:14)。
在另一个实施方案中，编码具有CTP-hGH-CTP的多肽的多核苷酸分子包含下述核酸序列：
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagttccccaccatccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgaggaagcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaacagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatccagaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgcagtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:15)。
在另一个实施方案中，编码具有CTP-hGH-CTP-CTP的多肽的多核苷酸分子包含下述核酸序列:
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccatctctgcccagccccagcagactgccgggccccagcgacacacccattctgccccagttccccaccatccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgaggaagcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaacagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatccagaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgcagtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:16)。
在另一个实施方案中，编码具有CTP-hGH-CTP-CTP的多肽的多核苷酸分子包含下述核酸序列：
tctagaggacatggccaccggcagcaggaccagcctgctgctggccttcggcctgctgtgcctgccatggctgcaggagggcagcgccagctcttcttctaaggctccacccccgagcctgcccttccccaccatccccctgagcaggctgttcgacaacgccatgctgagggctcacaggctgcaccagctggcctttgacacctaccaggagttcgaggaagcctacatccccaaggagcagaagtacagcttcctgcagaacccccagacctccctgtgcttcagcgagagcatccccacccccagcaacagagaggagacccagcagaagagcaacctggagctgctgaggatctccctgctgctgatccagagctggctggagcccgtgcagttcctgagaagcgtgttcgccaacagcctggtgtacggcgccagcgacagcaacgtgtacgacctgctgaaggacctggaggagggcatccagaccctgatgggccggctggaggacggcagccccaggaccggccagatcttcaagcagacctacagcaagttcgacaccaacagccacaacgacgacgccctgctgaagaactacgggctgctgtactgcttcagaaaggacatggacaaggtggagaccttcctgaggatcgtgcagtgcagaagcgtggagggcagctgcggcttcagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:17)。
在另一个实施方案中，本发明的生长激素与已知的生长激素序列具有同源性。在另一个实施方案中，本发明的生长激素与本文中公开的生长激素序列具有同源性。在另一个实施方案中，根据本发明的同源性也包括删除、插入或置换变体，包括其氨基酸置换和它们的生物活性的多肽片段。在一个实施方案中，所述置换变体是这样的变体，其中hGH的位置65处的谷氨酰胺被缬氨酸置换[Gellerfors等人,J Pharm Biomed Anal 1989,7:173-83]。
在一个实施方案中，短语“人生长激素”(hGH)表示表现出hGH活性(即，刺激生长)的多肽，诸如在Genbank登记号P01241中阐述的。
在一个实施方案中，“人生长激素”(hGH)表示表现出hGH活性(即，刺激生长)的多肽，诸如在Genbank登记号P01241中阐述的。在一个实施方案中，本发明的hGH也表示同系物。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与在GenBank登记号P01241中阐述的hGH序列具有至少50％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与在GenBank登记号P01241中阐述的hGH序列具有至少60％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与在GenBank登记号P01241中阐述的hGH序列具有至少70％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与在GenBank登记号P01241中阐述的hGH序列具有至少80％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与在GenBank登记号P01241中阐述的hGH序列具有至少90％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的hGH氨基酸序列与在GenBank登记号P01241中阐述的hGH序列具有至少95％同源性。
在一个实施方案中，本文提供的目标肽是胃泌酸调节素。在另一个实施方案中，胃泌酸调节素(OXM)包含下述氨基酸(AA)序列:HSQGTFTSDYSKYLDSRRAQDFVQWLMNTKRNRNNIA(SEQ ID NO:18)。在另一个实施方案中，OXM由SEQ ID NO:18的氨基酸序列组成。在另一个实施方案中，OXM包含在CAS No.62340-29-8中所示的氨基酸序列或由其组成。
在一个实施方案中，术语胃泌酸调节素进一步包括已知的胃泌酸调节素的同系物。在一个实施方案中，所述同系物是功能同系物。在另一个实施方案中，术语“功能”表示本文中提供的同系物、多肽或其片段具有抑制食欲的能力。该术语也表示本文中提供的同系物、多肽或其片段具有延长另一种蛋白或肽的生物半衰期的能力。在另一个实施方案中，本文中提供的蛋白、肽或同系物的生物半衰期(T1/2)表示所述蛋白、肽或同系物的量的半数被降解或不存在于受试者的生物介质中所用的时间。在另一个实施方案中，所述生物介质是血清、脑脊液、组织、粘膜层等。
在另一个实施方案中，OXM是人OXM或任意哺乳动物OXM。在另一个实施方案中，OXM是也被称作胰高血糖素-37或生物活性的肠高血糖素。在另一个实施方案中，OXM是双多肽或其片段。在另一个实施方案中，OXM是OXM的生物活性片段。在另一个实施方案中，生物活性的OXM从SEQ ID NO:18的氨基酸30延伸至氨基酸37。在另一个实施方案中，生物活性的OXM从SEQ ID NO:18的氨基酸19延伸至氨基酸37。在另一个实施方案中，本发明的OXM对应于从其中删除了2个C-端氨基酸的八肽。在另一个实施方案中，本发明的OXM对应于如本文中所述的、保留OXM活性的SEQ ID NO:18的任意片段。在另一个实施方案中，本发明还包括同系物，例如，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定的、与胃泌酸调节素具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性的多肽。
在其它实施方案中，术语经工程改造的胃泌酸调节素表示成束的胃泌酸调节素的氨基酸序列。在其它实施方案中，术语经工程改造的胃泌酸调节素表示包括它的信号序列或信号肽的胃泌酸调节素的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本文中提供的多肽或其片段包含信号肽或信号序列。
在另一个实施方案中，“信号序列”和“信号肽”在本文中可互换地使用。在另一个实施方案中，“序列”当表示多核苷酸分子时可以表示编码部分。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
在一个实施方案中，本文提供的多肽或目标肽是促红细胞生成素(EPO)。在另一个实施方案中，术语“促红细胞生成素”表示哺乳动物促红细胞生成素。在一个实施方案中，“促红细胞生成素”表示人促红细胞生成素，诸如在GenBank登记号AAA52400中阐述的。
在一个实施方案中，本发明的促红细胞生成素或EPO序列也表示同系物。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的促红细胞生成素氨基酸序列与在GenBank登记号AAA52400中所示的促红细胞生成素序列具有至少50％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的促红细胞生成素氨基酸序列与在GenBank登记号AAA52400中所示的促红细胞生成素序列具有至少60％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的促红细胞生成素氨基酸序列与在GenBank登记号AAA52400中所示的促红细胞生成素序列具有至少70％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的促红细胞生成素氨基酸序列与在GenBank登记号AAA52400中所示的促红细胞生成素序列具有至少80％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的促红细胞生成素氨基酸序列与在GenBank登记号AAA52400中所示的促红细胞生成素序列具有至少90％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的促红细胞生成素氨基酸序列与在GenBank登记号AAA52400中所示的促红细胞生成素序列具有至少95％同源性。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:19中所示的EPO肽，其另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个额外CTP氨基酸肽。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:19中所示的EPO肽：
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:19)。
在另一个实施方案中，所述EPO肽另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个额外CTP氨基酸肽，其用于治疗贫血。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:20中所示的EPO肽，其另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个CTP氨基酸肽：
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:20)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:21中所示的EPO肽，其另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个CTP氨基酸肽:
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:22中所示的EPO肽，其另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个CTP氨基酸肽:
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO:22)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:23中所示的EPO肽，其另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个CTP氨基酸肽:
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO:23)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:24中所示的EPO肽，其另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个CTP氨基酸肽:
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:24)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:25中所示的EPO肽，其另外具有在N-端上的至少一个CTP氨基酸肽和在C-端上的至少一个CTP氨基酸肽:
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO:25)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:26中所示的核酸，其编码EPO肽和在N-端上的一个CTP氨基酸肽和在C-端上的两个CTP氨基酸肽:tctagaggtcatcatggggg tgcacgaatg tcctgcctgg ctgtggcttc tcctgtcccttc tgtcgctc cctctgggcctcccagtcct gggctcctct tcctcaaagg cccctccccc gagccttcca agtccatccc gactcccggggccctcggac accccaatat taccacaagc cccaccacgc ctcatctgtg acagccgagt cctggagaggtacctcttgg aggccaagga ggccgagaat atcacgacgg gctgtgctga acactgcagc ttgaatgagaatatcactgt cccagacacc aaagttaatt tctatgcctg gaagaggatg gaggtcgggc agcaggccgtagaagtctgg cagggcctgg ccctgctgtc ggaagctgtc ctgcggggcc aggccctgtt ggtcaactcttcccagccgt gggagcccct gcagctgcat gtggataaag ccgtcagtgg ccttcgcagc ctcaccactctgcttcgggc tctgggagcc cagaaggaag ccatctcccc tccagatgcg gcctcagctg ctccactccgaacaatcact gctgacactt tccgcaaact cttccgagtc tactccaatt tcctccgggg aaagctgaagctgtacacag gggaggcctg caggacaggg gacagatcct cttcctcaaa ggcccctccc ccgagccttccaagtccatc ccgactcccg gggccctccg acacaccaat cctgccacag agcagctcctctaaggcccctcctccatcc ctgccatccc cctcccggct gcctggcccc tctgacaccc ctatcctgcctcagtgatga aggtcttctg gatccgcggc cgc(SEQ ID NO:26)。在另一个实施方案中，本发明的方法提供了包含SEQ ID NO:66所示的EPO肽的氨基酸序列，其具有在N-端上的两个CTP氨基酸肽：MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDR(SEQ ID NO:66)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:67中所示的核酸序列，其编码EPO肽和在N-端上的两个CTP氨基酸肽:ATGGGCGTGCACGAGTGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGAGCCTGCTGTCCCTGCCTCTGGGCCTGCCTGTGCTGGGCAGCAGCAGCTCTAAGGCCCCTCCACCCAGCCTGCCCAGCCCTTCTAGACTGCCTGGCCCCAGCGACACCCCCATCCTGCCTCAGAGCAGCAGCAGCAAGGCCCCACCACCATCCCTGCCTAGCCCCAGCAGACTGCCAGGCCCTTCCGATACCCCAATCCTGCCCCAGGCCCCTCCCAGACTGATCTGCGACAGCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCAGCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCCGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCCCTGCTGAGCGAGGCCGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTGGTGAACAGCAGCCAGCCCTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAGGCCGTGTCCGGCCTGCGGAGCCTGACCACACTGCTGAGAGCCCTGGGCGCTCAGAAAGAGGCCATCTCTCCCCCTGATGCCGCCTCTGCCGCCCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCCGGAAGCTGTTCCGGGTGTACAGCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCCTGCCGGACCGGCGATAGATAAGCTTGGCGCGCC(SEQ ID NO:67)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:68中所示的EPO肽，其具有在N-端上的两个CTP氨基酸肽和在C-端上的两个CTP氨基酸肽:
MGVHECPAWLWLLLSLLSLPLGLPVLGSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQAPPRLICDSRVLERYLLEAKEAENITTGCAEHCSLNENITVPDTKVNFYAWKRMEVGQQAVEVWQGLALLSEAVLRGQALLVNSSQPWEPLQLHVDKAVSGLRSLTTLLRALGAQKEAISPPDAASAAPLRTITADTFRKLFRVYSNFLRGKLKLYTGEACRTGDRSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:68)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:69中所示的核酸序列，其编码EPO肽和N-端上的两个CTP氨基酸肽和在C-端上的两个CTP氨基酸肽:
ATGGGCGTGCACGAGTGTCCTGCTTGGCTGTGGCTGCTGCTGAGCCTGCTGTCCCTGCCTCTGGGCCTGCCTGTGCTGGGCAGCAGCAGCTCTAAGGCCCCTCCACCCAGCCTGCCCAGCCCTTCTAGACTGCCTGGCCCCAGCGACACCCCCATCCTGCCTCAGAGCAGCAGCAGCAAGGCCCCACCACCATCCCTGCCTAGCCCCAGCAGACTGCCAGGCCCTTCCGATACCCCAATCCTGCCCCAGGCCCCTCCCAGACTGATCTGCGACAGCCGGGTGCTGGAAAGATACCTGCTGGAAGCCAAAGAGGCCGAGAACATCACCACCGGCTGCGCCGAGCACTGCAGCCTGAACGAGAATATCACCGTGCCCGACACCAAAGTGAACTTCTACGCCTGGAAGCGGATGGAAGTGGGCCAGCAGGCCGTGGAAGTGTGGCAGGGACTGGCCCTGCTGAGCGAGGCCGTGCTGAGAGGACAGGCCCTGCTGGTGAACAGCAGCCAGCCCTGGGAGCCCCTGCAGCTGCATGTGGATAAGGCCGTGTCCGGCCTGCGGAGCCTGACCACACTGCTGAGAGCCCTGGGCGCTCAGAAAGAGGCCATCTCTCCCCCTGATGCCGCCTCTGCCGCCCCTCTGAGAACCATCACCGCCGACACCTTCCGGAAGCTGTTCCGGGTGTACAGCAACTTCCTGCGGGGCAAGCTGAAGCTGTACACCGGCGAGGCCTGCCGGACCGGCGATAGAAGCAGCTCCAGCAAGGCTCCACCCCCCAGCCTGCCATCCCCAAGTAGACTGCCCGGGCCCTCTGACACACCTATCCTGCCACAGTCCAGCAGCTCCAAAGCTCCCCCACCATCCCTCCCATCCCCATCCAGACTGCCTGGACCATCCGACACTCCAATTCTGCCTCAGTAAGCTTGGCGCGCC(SEQ ID NO:69)。
在一个实施方案中，“干扰素”表示I型哺乳动物干扰素多肽。在一个实施方案中，“干扰素”表示II型哺乳动物干扰素多肽。在某些实施方案中，利用本领域普通技术人员已知的其它合适的干扰素多肽。在某些实施方案中，所述干扰素是α-干扰素。在某些实施方案中，所述干扰素是β-干扰素。在某些实施方案中，所述干扰素是γ-干扰素。在某些实施方案中，所述干扰素是ω-干扰素。在某些实施方案中，所述干扰素是干扰素亚种。在一个实施方案中，所述干扰素亚种(IFN)是IFN-α2a。在一个实施方案中，所述干扰素亚种(IFN)是IFN-α2b。在一个实施方案中，所述干扰素亚种(IFN)是IFN-β1a。在一个实施方案中，所述干扰素(IFN)亚种是IFN-β1b。
在一个实施方案中，本发明的干扰素表现出干扰素活性，诸如抗病毒或抗增生活性。在某些实施方案中，在下面表1中列出了干扰素的非限制性例子的GenBank登记号。
在一个实施方案中，本发明的干扰素也表示同系物。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的干扰素氨基酸序列与在表1中列出的干扰素序列具有至少50％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的干扰素氨基酸序列与在表1中列出的干扰素序列具有至少60％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的干扰素氨基酸序列与在表1中列出的干扰素序列具有至少70％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的干扰素氨基酸序列与在表1中列出的干扰素序列具有至少80％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的干扰素氨基酸序列与在表1中列出的干扰素序列具有至少90％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的干扰素氨基酸序列与在表1中列出的干扰素序列具有至少95％同源性。在某些实施方案中，根据本发明的同源性也包括删除、插入或置换变体，包括其氨基酸置换和它们的生物活性的多肽片段。在一个实施方案中，干扰素β的位置17中的半胱氨酸被丝氨酸置换。
下面的表1列出了干扰素的例子和它们各自的NCBI序列编号
表1
干扰素名称 NCBI序列编号
干扰素,α1 NP_076918.1
干扰素,α10 NP_002162.1
干扰素,α13 NP_008831.2
干扰素,α14 NP_002163.1
干扰素,α16 NP_002164.1
干扰素,α17 NP_067091.1
干扰素,α2 NP_000596.2
干扰素,α21 NP_002166.1
干扰素,α4 NP_066546.1
干扰素,α5 NP_002160.1
干扰素,α6 NP_066282.1
干扰素,α7 NP_066401.2
干扰素,α8 NP_002161.2
干扰素,β前体 NP_002167.1
干扰素,ε1 NP_795372.1
干扰素,γ NP_000610.2
干扰素,ε NP_064509.1
干扰素,Ω1 NP_002168.1
在另一个实施方案中，在本文中作为肽或作为多肽提供的干扰素(IFN)是I型干扰素。在另一个实施方案中，所述干扰素(IFN)是IFN-α，在另一个实施方案中，所述干扰素(IFN)是IFN-β。在另一个实施方案中，所述干扰素(IFN)是IFN-γ。在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽包含在SEQ ID NO:27中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:28包含下述氨基酸(AA)序列:MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ ID NO:27,人干扰素-β1a)。在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽包含人干扰素β1a(hIFNβ1a)的氨基酸序列。在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽包含在GenBank登记号NP_002167.1中所示的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽由在SEQ ID NO:28中所示的核苷酸序列编码。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:28包含下述核苷酸(NA)序列:
tctagaggacatgaccaacaagtgcctgctgcagatcgccctgctgctgtgcttcagcaccaccgccctgagcatgagctacaacctgctgggcttcctgcagaggtccagcaacttccagtgccagaagctgctgtggcagctgaacggcaggctggaatactgcctgaaggacaggatgaacttcgacatcccagaggaaatcaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgccctgaccatctacgagatgctgcagaacatcttcgccatcttcaggcaggacagcagcagcaccggctggaacgagaccatcgtggagaacctgctggccaacgtgtaccaccagatcaaccacctgaaaaccgtgctggaagagaagctggaaaaggaggacttcaccaggggcaagctgatgagcagcctgcacctgaagaggtactacggcagaatcctgcactacctgaaggccaaggagtacagccactgcgcctggaccatcgtgagggtggagatcctgaggaacttctacttcatcaacaggctgaccggctacctgaggaactgatgagtccgcggccgc(SEQ ID NO:28,人干扰素-β1a)。在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽由人干扰素β1a(hIFNβ1a)的核苷酸(NA)分子编码。在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽由包含GenBank登记号NM_002176所示的核苷酸序列的核苷酸(NA)分子编码。
在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽包含在SEQ ID NO:29中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:29包含下述氨基酸(AA)序列:
TF*LQPFEAFALAQQVVGDTVRVVNMTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ IDNO:29)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的干扰素(IFN)肽由在SEQ ID NO:30中所示的核苷酸序列编码。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:30包含下述核苷酸(NA)序列：
acattctaactgcaacctttcgaagcctttgctctggcacaacaggtagtaggcgacactgttcgtgttgtcaacatgaccaacaagtgtctcctccaaattgctctcctgttgtgcttctccactacagctctttccatgagctacaacttgcttggattcctacaaagaagcagcaattttcagtgtcagaagctcctgtggcaattgaatgggaggcttgaatactgcctcaaggacaggatgaactttgacatccctgaggagattaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgcattgaccatctatgagatgctccagaacatctttgctattttcagacaagattcatctagcactggctggaatgagactattgttgagaacctcctggctaatgtctatcatcagataaaccatctgaagacagtcctggaagaaaaactggagaaagaagatttcaccaggggaaaactcatgagcagtctgcacctgaaaagatattatgggaggattctgcattacctgaaggccaaggagtacagtcactgtgcctggaccatagtcagagtggaaatcctaaggaacttttacttcattaacagacttacaggttacctccgaaactga(SEQ ID NO:30)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和连接至C-端的CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和连接至C-端的至少一个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和连接至N-端的CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和连接至N-端的至少一个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至N-端的至少一个CTP单元和/或连接至C-端的至少一个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至N-端的至少一个CTP单元和串联连接至C-端的两个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至N-端的至少一个CTP单元和连接至C-端的两个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至N-端的一个CTP单元和连接至C-端的至少两个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至N-端的一个CTP单元和至少串联连接至C-端的两个CTP单元。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和至少三个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和三个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含由包含SEQ ID NO:31所示的氨基酸序列的氨基酸序列编码的干扰素(IFN)肽-CTP多肽。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:31包含下述氨基酸(AA)序列：
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRNSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQID NO:31)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的包含干扰素(IFN)肽-和CTP的多肽由SEQID NO:32所示的核酸分子编码。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:32包含下述核苷酸(NA)序列：
tctagaggacatgaccaacaagtgcctgctgcagatcgccctgctgctgtgcttcagcaccaccgccctgagcatgagctacaacctgctgggcttcctgcagaggtccagcaacttccagtgccagaagctgctgtggcagctgaacggcaggctggaatactgcctgaaggacaggatgaacttcgacatcccagaggaaatcaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgccctgaccatctacgagatgctgcagaacatcttcgccatcttcaggcaggacagcagcagcaccggctggaacgagaccatcgtggagaacctgctggccaacgtgtaccaccagatcaaccacctgaaaaccgtgctggaagagaagctggaaaaggaggacttcaccaggggcaagctgatgagcagcctgcacctgaagaggtactacggcagaatcctgcactacctgaaggccaaggagtacagccactgcgcctggaccatcgtgagggtggagatcctgaggaacttctacttcatcaacaggctgaccggctacctgaggaacagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagtgatga(SEQ ID NO:32)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和连接至它的羧基端的两个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含由包含SEQ ID NO:33所示的氨基酸序列的氨基酸序列编码的干扰素(IFN)肽-CTP(x2)。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:33包含下述氨基酸(AA)序列:
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRNSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:33)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的包含干扰素(IFN)肽-和连接至它的羧基端的两个CTP单元的多肽由SEQ ID NO:34所示的核酸分子编码。在另一个实施方案中，SEQ IDNO:34包含下述核苷酸(NA)序列：
tctagaggacatgaccaacaagtgcctgctgcagatcgccctgctgctgtgcttcagcaccaccgccctgagcatgagctacaacctgctgggcttcctgcagaggtccagcaacttccagtgccagaagctgctgtggcagctgaacggcaggctggaatactgcctgaaggacaggatgaacttcgacatcccagaggaaatcaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgccctgaccatctacgagatgctgcagaacatcttcgccatcttcaggcaggacagcagcagcaccggctggaacgagaccatcgtggagaacctgctggccaacgtgtaccaccagatcaaccacctgaaaaccgtgctggaagagaagctggaaaaggaggacttcaccaggggcaagctgatgagcagcctgcacctgaagaggtactacggcagaatcctgcactacctgaaggccaaggagtacagccactgcgcctggaccatcgtgagggtggagatcctgaggaacttctacttcatcaacaggctgaccggctacctgaggaacagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc(SEQ ID NO:34)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至IFN的氨基端的单个CTP单元和连接至IFN的羧基端的两个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至IFN的氨基端的单个CTP单元和串联连接至IFN的羧基端的两个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含(从氨基端至羧基端)：CTP(x1)-干扰素(IFN)肽-CTP(x2)，其包含在SEQ ID NO:365中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:35包含下述氨基酸(AA)序列：
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRNSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:35)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的包含干扰素(IFN)肽、连接至IFN的氨基端的单个CTP单元和连接至IFN的羧基端的两个CTP单元的多肽由SEQ ID NO:36所示的核酸分子编码。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:36包含下述核苷酸(NA)序列：
tctagaggacatgaccaacaagtgcctgctgcagatcgccctgctgctgtgcttcagcaccaccgccctgagcagcagcagctccaaggccccaccccccagcctgcccagccccagcagactgccaggccccagcgacacccccatcctgccccagatgagctacaacctgctgggcttcctgcagaggtccagcaacttccagtgccagaagctgctgtggcagctgaacggcaggctggaatactgcctgaaggacaggatgaacttcgacatcccagaggaaatcaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgccctgaccatctacgagatgctgcagaacatcttcgccatcttcaggcaggacagcagcagcaccggctggaacgagaccatcgtggagaacctgctggccaacgtgtaccaccagatcaaccacctgaaaaccgtgctggaagagaagctggaaaaggaggacttcaccaggggcaagctgatgagcagcctgcacctgaagaggtactacggcagaatcctgcactacctgaaggccaaggagtacagccactgcgcctggaccatcgtgagggtggagatcctgaggaacttctacttcatcaacaggctgaccggctacctgaggaacagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc(SEQ ID NO:36)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至IFN的氨基端的单个CTP和位于IFN编码序列内的单个CTP。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含(从氨基端至羧基端):CTP(x1)-干扰素(IFN)肽(片段1)-CTP-干扰素(IFN)肽(片段2)，其包含SEQ ID NO:37所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:37包含下述氨基酸(AA)序列：
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRNSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ ID NO:37)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的包含干扰素(IFN)肽、连接至IFN的氨基端的单个CTP单元和位于IFN编码序列内的单个CTP单元的多肽由SEQ ID NO:38所示的核酸分子编码。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:38包含下述核苷酸(NA)序列：
tctagaggacatgaccaacaagtgcctgctgcagatcgccctgctgctgtgcttcagcaccaccgccctgagcagcagcagctccaaggccccaccccccagcctgcccagccccagcaggctgccaggccccagcgacacccccatcctgccccagatgagctacaacctgctgggcttcctgcagaggtccagcaacttccagtgccagaaactgctgtggcagctgaacggcaggctggaatactgcctgaaggaccggatgaacttcgacatccccgaagagatcaagcagctgcagcagttccagaaagaggacgccgccctgaccatctacgagatgctgcagaacatcttcgccatcttcaggcaggacagcagcagcaccggctggaacgagaccatcgtggagaacctgctggccaacgtgtaccaccagatcaaccacctgaaaaccgtgctggaagagaagctggaaaaagaggacttcaccaggggcaagctgatgagcagcctgcacctgaagaggtactacggcagaatcctgcactacctgaaggccaaagagtacagccactgcgcctggaccatcgtgagggtggagatcctgcggaacttctacttcatcaacaggctgaccggctacctgaggaacagctccagcagcaaggcccctccaccctccctgccctccccaagcagactgcccggaccctccgacacaccaattctgccacagatgtcctacaatctgctcggatttctgcagcgctcctccaactttcagtgtcagaagctcctctggcagctcaatggccgcctggaatattgtctgaaagacagaatgaattttgacatcccagaggaaattaaacagctccagcagtttcagaaagaagatgctgctctcacaatctatgaaatgctccagaatatctttgcaatctttcgccaggacagctcctccaccgggtggaatgagacaattgtcgagaatctgctcgccaatgtctatcatcagatcaatcacctcaagacagtcctcgaagaaaaactcgaaaaagaagatttcacacgcggcaaactgatgtcctccctgcatctgaagcgctactatgggcgcatcctgcattatctgaaagctaaagaatactcccactgtgcttggacaattgtgcgcgtcgagatcctgagaaacttttatttcattaaccgcctgacaggatacctgcgcaactgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:38)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽和连接至它的氨基端的单个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽–CTP，其包含SEQ ID NO:39所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:39包含下述氨基酸(AA)序列:
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN*(SEQID NO:39)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的包含干扰素(IFN)肽-和连接至它的氨基端的单个CTP的多肽由SEQ ID NO:40所示的核酸分子编码。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:40包含下述核苷酸(NA)序列:
tctagaggacatgaccaacaagtgcctgctgcagatcgccctgctgctgtgcttcagcaccaccgccctgagcagcagcagctccaaggccccaccccccagcctgcccagccccagcaggctgccaggccccagcgacacccccatcctgccccagatgagctacaacctgctgggcttcctgcagaggtccagcaacttccagtgccagaaactgctgtggcagctgaacggcaggctggaatactgcctgaaggaccggatgaacttcgacatccccgaagagatcaagcagctgcagcagttccagaaagaggacgccgccctgaccatctacgagatgctgcagaacatcttcgccatcttcaggcaggacagcagcagcaccggctggaacgagaccatcgtggagaacctgctggccaacgtgtaccaccagatcaaccacctgaaaaccgtgctggaagagaagctggaaaaagaggacttcaccaggggcaagctgatgagcagcctgcacctgaagaggtactacggcagaatcctgcactacctgaaggccaaagagtacagccactgcgcctggaccatcgtgagggtggagatcctgcggaacttctacttcatcaacaggctgaccggctacctgaggaactgatgagtccgcggccgc(SEQID NO:40)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽、连接至它的氨基端的单个CTP单元和连接至它的羧基端的单个CTP单元。在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽包含干扰素(IFN)肽–CTP，其包含在SEQ ID NO:41中所示的氨基酸序列。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:41包含下述氨基酸(AA)序列：
MTNKCLLQIALLLCFSTTALSSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQMSYNLLGFLQRSSNFQCQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRNSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ*(SEQ ID NO:41)。
在另一个实施方案中，如本文中所述的包含干扰素(IFN)肽、连接至它的氨基端的单个CTP单元和连接至它的羧基端的单个CTP单元的多肽由SEQ ID NO:42所示的核酸分子编码。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:42包含下述核苷酸(NA)序列：
tctagaggacatgaccaacaagtgcctgctgcagatcgccctgctgctgtgcttcagcaccaccgccctgagcagcagcagctccaaggccccaccccccagcctgcccagccccagcagactgccaggccccagcgacacccccatcctgccccagatgagctacaacctgctgggcttcctgcagaggtccagcaacttccagtgccagaagctgctgtggcagctgaacggcaggctggaatactgcctgaaggacaggatgaacttcgacatcccagaggaaatcaagcagctgcagcagttccagaaggaggacgccgccctgaccatctacgagatgctgcagaacatcttcgccatcttcaggcaggacagcagcagcaccggctggaacgagaccatcgtggagaacctgctggccaacgtgtaccaccagatcaaccacctgaaaaccgtgctggaagagaagctggaaaaggaggacttcaccaggggcaagctgatgagcagcctgcacctgaagaggtactacggcagaatcctgcactacctgaaggccaaggagtacagccactgcgcctggaccatcgtgagggtggagatcctgaggaacttctacttcatcaacaggctgaccggctacctgaggaacagctccagcagcaaggcccctccaccttccctgcccagtccaagccgactccctgggccctccgatacaccaattctgccacagtgatgaaggtctggatgcggccgc(SEQ ID NO:42)。
在另一个实施方案中，干扰素β肽包含含有下述氨基酸(AA)序列的SEQ ID NO:43：
MSYNLLGFLQRSSNFQSQKLLWQLNGRLEYCLKDRMNFDIPEEIKQLQQFQKEDAALTIYEMLQNIFAIFRQDSSSTGWNETIVENLLANVYHQINHLKTVLEEKLEKEDFTRGKLMSSLHLKRYYGRILHYLKAKEYSHCAWTIVRVEILRNFYFINRLTGYLRN(SEQ ID NO:43)。
在一个实施方案中，本文中提供的多肽或其片段是胰高血糖素-样肽-1。在另一个实施方案中，根据本发明的教导利用胰高血糖素-样肽-1。在另一个实施方案中，CTP序列向“胰高血糖素-样肽-1”的氨基端和羧基端的连接导致增加的效能。在另一个实施方案中，CTP向肽的氨基端和羧基端的连接导致延长的体内活性。在另一个实施方案中，CTP向胰高血糖素-样肽-1的氨基端和羧基端的连接导致延长的体内活性。
在一个实施方案中，“胰高血糖素-样肽-1”(GLP-1)表示哺乳动物多肽。在一个实施方案中，“胰高血糖素-样肽-1”(GLP-1)表示人多肽。在另一个实施方案中，从胰高血糖素前蛋白原(Genbank ID No.NP002045)切下GLP-1，所述前蛋白原具有结合GLP-1受体并引发产生促胰岛素活性的信号转导途径的能力。在一个实施方案中，“促胰岛素活性”表示这样的能力：响应于升高的葡萄糖水平而刺激胰岛素分泌，由此造成细胞的葡萄糖摄取和降低的血糖水平。在某些实施方案中，GLP-1多肽包括、但不限于在美国专利号5,118,666中描述的那些；其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，本发明的GLP-1也表示GLP-1同系物。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的GLP-1氨基酸序列与在Genbank ID No.NP002045中所示的GLP-1序列具有至少50％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的GLP-1氨基酸序列与在Genbank ID No.NP002045中所示的GLP-1序列具有至少60％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的GLP-1氨基酸序列与在Genbank ID No.NP002045中所示的GLP-1序列具有至少70％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的GLP-1氨基酸序列与在Genbank IDNo.NP002045中所示的GLP-1序列具有至少80％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的GLP-1氨基酸序列与在Genbank ID No.NP002045中所示的GLP-1序列具有至少90％同源性。在一个实施方案中，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的，本发明的GLP-1氨基酸序列与在Genbank ID No.NP002045中所示的GLP-1序列具有至少95％同源性。
在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是载脂蛋白。在另一个实施方案中，本文提供的多肽或其片段是载脂蛋白A1(APO-A1)。在另一个实施方案中，所述载脂蛋白在N-端和/或C-端上连接至至少一个CTP肽。在另一个实施方案中，所述载脂蛋白是载脂蛋白AI、载脂蛋白AII、载脂蛋白AIV或类似物或其变体。
在一个实施方案中，由于它们的与胆固醇和其它脂质形成复合物并辅助这些化合物向肝脏的运输的能力，根据本发明的载脂蛋白构建体可以被广泛地视作HDL类似物。
在另一个实施方案中，使用脂质结合测定，可以方便地测量天然载脂蛋白A-I、A-II或A-IV的功能等同物。通过测量在试验生物诸如兔或啮齿类动物诸如小鼠中进行反向胆固醇运输的能力，可以方便地测量CTP修饰的载脂蛋白的在哺乳动物中引起基本上相同的生理学应答的能力。
在一个实施方案中，包含CTP修饰的载脂蛋白的多肽能够象天然载脂蛋白一样好或甚至优于天然载脂蛋白而在体内执行反向胆固醇运输，尽管通过添加至少一个CTP造成了修饰。在另一个实施方案中，在体外，CTP修饰的载脂蛋白具有较低体外生物活性，但是它被延长的半衰期的补偿。在另一个实施方案中，与野生型载脂蛋白的血浆半衰期相比，优选地增加CTP修饰的载脂蛋白的血浆半衰期。在一个实施方案中，所述增加的半衰期是由于载脂蛋白构建体的流体动力学尺寸，其可以降低在肾中的过滤速率。
在一个实施方案中，APO-A1的氨基酸序列是:
DEPPQSPWDRVKDKATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSAGKGLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRGEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQ(SEQ ID NO:44)或其同系物或变体或片段。在一个实施方案中，本发明的方法提供了包含APO-A1肽的氨基酸序列，所述APO-A1肽具有在C-端上的一个CTP氨基酸肽:
MKAAVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:70)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:71中所示的核酸序列，其编码APO-A1肽和在C-端上的一个CTP氨基酸肽:
ATGAAGGCCGCCGTGCTGACCCTGGCCGTGCTGTTTCTGACCGGCTCTCAGGCCCGGCACTTCTGGCAGCAGGACGAGCCTCCCCAGTCCCCCTGGGACAGAGTGAAGGACCTGGCCACCGTGTACGTGGACGTGCTGAAGGACTCCGGCAGAGACTACGTGTCCCAGTTCGAGGGCTCTGCCCTGGGCAAGCAGCTGAACCTGAAGCTGCTGGACAACTGGGACTCCGTGACCTCCACCTTCTCCAAGCTGCGCGAACAGCTGGGACCTGTGACCCAGGAATTCTGGGACAACCTGGAAAAAGAGACAGAGGGCCTGAGACAGGAAATGTCCAAGGACCTGGAAGAGGTCAAAGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAATGGCAGGAAGAGATGGAACTGTACCGGCAGAAGGTGGAACCCCTGCGGGCCGAGCTGCAGGAAGGCGCTAGACAGAAGCTGCACGAACTGCAGGAAAAGCTGTCCCCCCTGGGCGAGGAAATGCGGGACAGAGCCAGAGCCCACGTGGACGCCCTGAGAACCCACCTGGCCCCCTACTCTGACGAGCTGCGGCAGAGGCTGGCCGCCAGACTGGAAGCCCTGAAAGAGAACGGCGGAGCCCGGCTGGCCGAGTACCACGCTAAGGCTACCGAGCACCTGTCCACCCTGTCCGAGAAGGCCAAGCCCGCCCTGGAAGATCTGCGGCAGGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAATCCTTCAAGGTGTCCTTCCTGTCCGCTCTGGAAGAGTACACCAAGAAGCTGAACACCCAGTCCTCCAGCTCCAAGGCCCCTCCACCCTCCCTGCCTAGCCCTAGTAGACTGCCTGGGCCCTCCGACACCCCCATCCTGCCCCAGTGATGAGGATCCGCGGCCGCGAGCTC(SEQ ID NO:71)。
在一个实施方案中，本发明的方法提供了包含APO-A1肽的氨基酸序列，所述APO-A1肽具有在C-端上的2个CTP氨基酸肽：
MKAAVLTLAVLFLTGSQARHFWQQDEPPQSPWDRVKDLATVYVDVLKDSGRDYVSQFEGSALGKQLNLKLLDNWDSVTSTFSKLREQLGPVTQEFWDNLEKETEGLRQEMSKDLEEVKAKVQPYLDDFQKKWQEEMELYRQKVEPLRAELQEGARQKLHELQEKLSPLGEEMRDRARAHVDALRTHLAPYSDELRQRLAARLEALKENGGARLAEYHAKATEHLSTLSEKAKPALEDLRQGLLPVLESFKVSFLSALEEYTKKLNTQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:72)。
在另一个实施方案中，本发明的方法提供了在SEQ ID NO:73中所示的核酸序列，其编码APO-A1肽和在C-端上的2个CTP氨基酸肽:
ATGAAGGCCGCCGTGCTGACCCTGGCCGTGCTGTTTCTGACCGGCTCTCAGGCCCGGCACTTCTGGCAGCAGGACGAGCCTCCCCAGTCCCCCTGGGACAGAGTGAAGGACCTGGCCACCGTGTACGTGGACGTGCTGAAGGACTCCGGCAGAGACTACGTGTCCCAGTTCGAGGGCTCTGCCCTGGGCAAGCAGCTGAACCTGAAGCTGCTGGACAACTGGGACTCCGTGACCTCCACCTTCTCCAAGCTGCGCGAACAGCTGGGACCTGTGACCCAGGAATTCTGGGACAACCTGGAAAAAGAGACAGAGGGCCTGAGACAGGAAATGTCCAAGGACCTGGAAGAGGTCAAAGCCAAGGTGCAGCCCTACCTGGACGACTTCCAGAAGAAATGGCAGGAAGAGATGGAACTGTACCGGCAGAAGGTGGAACCCCTGCGGGCCGAGCTGCAGGAAGGCGCTAGACAGAAGCTGCACGAACTGCAGGAAAAGCTGTCCCCCCTGGGCGAGGAAATGCGGGACAGAGCCAGAGCCCACGTGGACGCCCTGAGAACCCACCTGGCCCCCTACTCTGACGAGCTGCGGCAGAGGCTGGCCGCCAGACTGGAAGCCCTGAAAGAGAACGGCGGAGCCCGGCTGGCCGAGTACCACGCTAAGGCTACCGAGCACCTGTCCACCCTGTCCGAGAAGGCCAAGCCCGCCCTGGAAGATCTGCGGCAGGGCCTGCTGCCCGTGCTGGAATCCTTCAAGGTGTCCTTCCTGTCCGCTCTGGAAGAGTACACCAAGAAGCTGAACACCCAGTCCTCCAGCTCCAAGGCCCCTCCACCCTCCCTGCCTAGCCCTAGTAGACTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCTGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO:73)。
在一个实施方案中，通过添加、置换或删除至少一个氨基酸，可以得到载脂蛋白或其片段的功能等同物。当氨基酸序列包含一个氨基酸对另一个氨基酸的置换时，这样的置换可以是保守的氨基酸置换。SEQ ID NO:44的片段可以包含超过一个这样的置换，例如，2个保守的氨基酸置换，例如3或4个保守的氨基酸置换，诸如5或6个保守的氨基酸置换，例如7或8个保守的氨基酸置换，诸如10-15个保守的氨基酸置换，例如15-25个保守的氨基酸置换，诸如25-75个保守的氨基酸置换，例如75-125个保守的氨基酸置换，诸如125-175个保守的氨基酸置换。置换可以在预定氨基酸的任意一个或多个组内做出。
在另一个实施方案中，载脂蛋白的片段含有脂质结合区域。
如在本发明中使用的“功能等同”是根据通过参考本文中提供的序列的预定片段的对应功能性而建立的一个优选实施方案。
本文中提供的序列的变体的功能等同将被理解为表现出与优选的预定序列逐渐不同的氨基酸序列，如插入、缺失和置换的数目和范围，包括保守置换增加。将该差异测量为优选的预定序列与片段或功能等同物之间的同源性的下降。
在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是细胞因子。在另一个实施方案中，所述细胞因子是红细胞生成素细胞因子。在另一个实施方案中，所述细胞因子是干扰素细胞因子。在另一个实施方案中，所述细胞因子是趋化因子。在另一个实施方案中，所述细胞因子是肿瘤坏死因子细胞因子。在另一个实施方案中，本文中使用的细胞因子包含生物活性和临床效力。在另一个实施方案中，本文中使用的细胞因子是治疗性蛋白。
载脂蛋白的所有片段或功能等同都被包括在本发明范围内，无论它们表现出与载脂蛋白的优选预定序列的同源性程度如何。其原因是，序列SEQ ID NO:44的一些区域最可能是容易突变的，或能够被完全删除，而对得到的片段的结合活性没有任何显著影响。产生SEQ ID NO:44的功能等同变体的方法描述在美国专利号6,897,039中，其通过引用并入本文。
在一个实施方案中，本文提供的目标多肽或其片段是凝血因子。在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是蛋白。在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是肽。在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是多肽。在另一个实施方案中，所述凝血因子是酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是丝氨酸蛋白酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是转谷氨酰胺酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是无活性的酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是本领域技术人员已知的任何凝血因子。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FVIII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FV。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XIII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子X。在另一个实施方案中，所述凝血因子是凝血酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是纤维蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FVIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FVII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FIX。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FX。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FXIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FXII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FXa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FVa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是凝血酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是凝血酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FV。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FXI。在另一个实施方案中，所述凝血因子是vWF。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FVIIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是删除B的结构域FVIII(FVIIIBDD)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FIXa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是前激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FXIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是纤维蛋白原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是血栓调节蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是FII。
在另一个实施方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是维生素K依赖性的糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是维生素K非依赖性的糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组糖蛋白FV。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVI。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FIX。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FX。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXI。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FvW。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FIXa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组纤维蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组凝血酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组凝血酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组前激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是任何已知的重组凝血因子。在另一个实施方案中，所述包含信号肽的凝血因子是任何已知的重组凝血因子。在另一个实施方案中，凝血因子包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连接至N-端的CTP。在另一个实施方案中，所述包含信号肽的凝血因子是任何已知的重组凝血因子。在另一个实施方案中，凝血因子包含至少一个连接至C-端的CTP且不包含连接至N-端的CTP。在另一个实施方案中，包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是经工程改造的凝血因子。在另一个实施方案中，包含至少一个连接至C-端的CTP且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是经工程改造的凝血因子。在另一个实施方案中，包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是缀合的凝血因子。在另一个实施方案中，包含至少一个连接至C-端的CTP且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是缀合的凝血因子。
在另一个实施方案中，所述凝血因子包含与FIX、FVII、因子X、蛋白C和凝血酶原的结构域组构类似或相同的结构域组构。在另一个实施方案中，所述凝血因子被合成为具有N-端前肽的前体。在另一个实施方案中，本文中使用的凝血因子呈无活性的前酶形式。在另一个实施方案中，所述凝血因子是在肝细胞中产生。在另一个实施方案中，所述凝血因子包含γ羧化酶的停泊位点，所述γ羧化酶将谷氨酸(Glu)转化成γ羧基谷氨酸(Gla)。在另一个实施方案中，本文中使用的凝血因子是商购可得的凝血因子。
在另一个实施方案中，因子VII的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPR PGVLLRAPFP(SEQID NO:45)。
在另一个实施方案中，因子VII的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCGR.(SEQ ID NO:46)。
在另一个实施方案中，编码因子VII的核酸序列包含核酸序列:
CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCA
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACGGGCATCGTCAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCAACCGTGGGCCACTTTGGGGTGTACACCAGGGTCTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCCACGCCCAGGAGTCCTCCTGCGAGCCCCATTTCCCTGAGGATGCGGCCGC(SEQ ID NO:47)。
在另一个实施方案中，编码因子VII-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列:
CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCA
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACCGGCATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTACACCAGGGTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCCCAGACCCGGCGTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCTCCCCCTAGCCTGCCCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCAGCGACACCCCCATCCTGCCCCAGTGAGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO:48)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ*(SEQ ID NO:49)。
在另一个实施方案中，编码因子VII-CTP-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列：
CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCA
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCACCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGAGAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAAGGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTGTGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTATATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATGACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACCACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAGACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCTAGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGTGCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTTGTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTCGACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTCAGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCCAGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACCAGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTTCTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAGCTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGCTGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATATCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAAGGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACCGGCATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTACACCAGGGTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCCCAGACCCGGCGTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCTCCCCCTAGCCTGCCCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCAGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO:50)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列：
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO:51)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP-CTP-CTP(3个连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列：
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:52)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP(X4)(4个连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列：
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:53)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP(x5)(5个连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列：
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:54)。
在另一个实施方案中，编码因子IX的核酸序列包含下述核酸序列:
GCGATCGCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTCCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTTGAACGCGGCCGC(SEQ ID NO:55)。
在另一个实施方案中，因子IX的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLT*(SEQ ID NO:56)。
在另一个实施方案中，编码因子IX-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列：
GCGATCGCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTGACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQ ID NO:57)。
在另一个实施方案中，因子IX-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO:58)。
在另一个实施方案中，编码因子IX-CTP-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列：
GCGATCGCCATGCAGCGCGTGAACATGATCATGGCAGAATCACCAGGCCTCATCACCATCTGCCTTTTAGGATATCTACTCAGTGCTGAATGTACAGTTTTTCTTGATCATGAAAACGCCAACAAAATTCTGAATCGGCCAAAGAGGTATAATTCAGGTAAATTGGAAGAGTTTGTTCAAGGGAACCTTGAGAGAGAATGTATGGAAGAAAAGTGTAGTTTTGAAGAAGCACGAGAAGTTTTTGAAAACACTGAAAGAACAACTGAATTTTGGAAGCAGTATGTTGATGGAGATCAGTGTGAGTCCAATCCATGTTTAAATGGCGGCAGTTGCAAGGATGACATTAATTCCTATGAATGTTGGTGTCCCTTTGGATTTGAAGGAAAGAACTGTGAATTAGATGTAACATGTAACATTAAGAATGGCAGATGCGAGCAGTTTTGTAAAAATAGTGCTGATAACAAGGTGGTTTGCTCCTGTACTGAGGGATATCGACTTGCAGAAAACCAGAAGTCCTGTGAACCAGCAGTGCCATTTCCATGTGGAAGAGTTTCTGTTTCACAAACTTCTAAGCTCACCCGTGCTGAGACTGTTTTTCCTGATGTGGACTATGTAAATTCTACTGAAGCTGAAACCATTTTGGATAACATCACTCAAAGCACCCAATCATTTAATGACTTCACTCGAGTTGTTGGTGGAGAAGATGCCAAACCAGGTCAATTCCCTTGGCAGGTTGTTTTGAATGGTAAAGTTGATGCATTCTGTGGAGGCTCTATCGTTAATGAAAAATGGATTGTAACTGCTGCCCACTGTGTTGAAACTGGTGTTAAAATTACAGTTGTCGCAGGTGAACATAATATTGAGGAGACAGAACATACAGAGCAAAAGCGAAATGTGATTCGAATTATTCCTCACCACAACTACAATGCAGCTATTAATAAGTACAACCATGACATTGCCCTTCTGGAACTGGACGAACCCTTAGTGCTAAACAGCTACGTTACACCTATTTGCATTGCTACAAGGAATACACGAACATCTTCCTCAAATTTGGATCTGGCTATGTAAGTGGCTGGGGAAGAGTCTTCCACAAAGGGAGATCAGCTTTAGTTCTTCAGTACCTTAGAGTTCCACTTGTTGACCGAGCCACATGTCTTCGATCTACAAAGTTCACCATCTATAACAACATGTTCTGTGCTGGCTTCCATGAAGGAGGTAGAGATTCATGTCAAGGAGATAGTGGGGGACCCCATGTTACTGAAGTGGAAGGGACCAGTTTCTTAACTGGAATTATTAGCTGGGGTGAAGAGTGTGCAATGAAAGGCAAATATGGAATATATACCAAGGTATCCCGGTATGTCAACTGGATTAAGGAAAAAACAAAGCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCTGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAGTGATGAAGGTCTGGATCCGCGGCCGC(SEQID NO:59)。
在另一个实施方案中，因子IX-CTP-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPG QFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQID NO:60)。
在另一个实施方案中，因子IX-CTP(x3)(3个连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:61)。
在另一个实施方案中，因子IX-CTP(x4)(4个连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:62)。
在另一个实施方案中，因子IX-CTP(x5)(5个连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSVSQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO:63)。
在另一个实施方案中，将弗林蛋白酶加给表达本发明的凝血因子-CTP的细胞。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶会增加细胞中本发明的凝血因子-CTP的生产效率。在另一个实施方案中，将弗林蛋白酶与包含本发明的凝血因子-CTP的编码序列的载体共转染。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶由单独的载体编码。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶和凝血因子-CTP由一个载体编码。在另一个实施方案中，将弗林蛋白酶的编码序列插入pCI-DHFR中。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶的编码序列被工程改造进pCI-dhfr/smaI+NotI、弗林蛋白酶/AsisI F.I.+NotI中。
在另一个实施方案中，编码弗林蛋白酶的核酸序列包含下述核酸序列:
tctagagtcgacccCGCCATGGAGCTGAGGCCCTGGTTGCTATGGGTGGTAGCAGCAACA
GGAACCTTGGTCCTGCTAGCAGCTGATGCTCAGGGCCAGAAGGTCTTCACCAACACGTGGGCTGTGCGCATCCCTGGAGGCCCAGCGGTGGCCAACAGTGTGGCACGGAAGCATGGGTTCCTCAACCTGGGCCAGATCTTCGGGGACTATTACCACTTCTGGCATCGAGGAGTGACGAAGCGGTCCCTGTCGCCTCACCGCCCGCGGCACAGCCGGCTGCAGAGGGAGCCTCAAGTACAGTGGCTGGAACAGCAGGTGGCAAAGCGACGGACTAAACGGGACGTGTACCAGGAGCCCACAGACCCCAAGTTTCCTCAGCAGTGGTACCTGTCTGGTGTCACTCAGCGGGACCTGAATGTGAAGGCGGCCTGGGCGCAGGGCTACACAGGGCACGGCATTGTGGTCTCCATTCTGGACGATGGCATCGAGAAGAACCACCCGGACTTGGCAGGCAATTATGATCCTGGGGCCAGTTTTGATGTCAATGACCAGGACCCTGACCCCCAGCCTCGGTACACACAGATGAATGACAACAGGCACGGCACACGGTGTGCGGGGGAAGTGGCTGCGGTGGCCAACAACGGTGTCTGTGGTGTAGGTGTGGCCTACAACGCCCGCATTGGAGGGGTGCGCATGCTGGATGGCGAGGTGACAGATGCAGTGGAGGCACGCTCGCTGGGCCTGAACCCCAACCACATCCACATCTACAGTGCCAGCTGGGGCCCCGAGGATGACGGCAAGACAGTGGATGGGCCAGCCCGCCTCGCCGAGGAGGCCTTCTTCCGTGGGGTTAGCCAGGGCCGAGGGGGGCTGGGCTCCATCTTTGTCTGGGCCTCGGGGAACGGGGGCCGGGAACATGACAGCTGCAACTGCGACGGCTACACCAACAGTATCTACACGCTGTCCATCAGCAGCGCCACGCAGTTTGGCAACGTGCCGTGGTACAGCGAGGCCTGCTCGTCCACACTGGCCACGACCTACAGCAGTGGCAACCAGAATGAGAAGCAGATCGTGACGACTGACTTGCGGCAGAAGTGCACGGAGTCTCACACGGGCACCTCAGCCTCTGCCCCCTTAGCAGCCGGCATCATTGCTCTCACCCTGGAGGCCAATAAGAACCTCACATGGCGGGACATGCAACACCTGGTGGTACAGACCTCGAAGCCAGCCCACCTCAATGCCAACGACTGGGCCACCAATGGTGTGGGCCGGAAAGTGAGCCACTCATATGGCTACGGGCTTTTGGACGCAGGCGCCATGGTGGCCCTGGCCCAGAATTGGACCACAGTGGCCCCCCAGCGGAAGTGCATCATCGACATCCTCACCGAGCCCAAAGACATCGGGAAACGGCTCGAGGTGCGGAAGACCGTGACCGCGTGCCTGGGCGAGCCCAACCACATCACTCGGCTGGAGCACGCTCAGGCGCGGCTCACCCTGTCCTATAATCGCCGTGGCGACCTGGCCATCCACCTGGTCAGCCCCATGGGCACCCGCTCCACCCTGCTGGCAGCCAGGCCACATGACTACTCCGCAGATGGGTTTAATGACTGGGCCTTCATGACAACTCATTCCTGGGATGAGGATCCCTCTGGCGAGTGGGTCCTAGAGATTGAAAACACCAGCGAAGCCAACAACTATGGGACGCTGACCAAGTTCACCCTCGTACTCTATGGCACCGCCCCTGAGGGGCTGCCCGTACCTCCAGAAAGCAGTGGCTGCAAGACCCTCACGTCCAGTCAGGCCTGTGTGGTGTGCGAGGAAGGCTTCTCCCTGCACCAGAAGAGCTGTGTCCAGCACTGCCCTCCAGGCTTCGCCCCCCAAGTCCTCGATACGCACTATAGCACCGAGAATGACGTGGAGACCATCCGGGCCAGCGTCTGCGCCCCCTGCCACGCCTCATGTGCCACATGCCAGGGGCCGGCCCTGACAGACTGCCTCAGCTGCCCCAGCCACGCCTCCTTGGACCCTGTGGAGCAGACTTGCTCCCGGCAAAGCCAGAGCAGCCGAGAGTCCCCGCCACAGCAGCAGCCACCTCGGCTGCCCCCGGAGGTGGAGGCGGGGCAACGGCTGCGGGCAGGGCTGCTGCCCTCACACCTGCCTGAGGTGGTGGCCGGCCTCAGCTGCGCCTTCATCGTGCTGGTCTTCGTCACTGTCTTCCTGGTCCTGCAGCTGCGCTCTGGCTTTAGTTTTCGGGGGGTGAAGGTGTACACCATGGACCGTGGCCTCATCTCCTACAAGGGGCTGCCCCCTGAAGCCTGGCAGGAGGAGTGCCCGTCTGACTCAGAAGAGGACGAGGGCCGGGGCGAGAGGACCGCCTTTATCAAAGACCAGAGCGCCCTCTGAACGCGGCCGC(SEQ ID NO:64)。
在另一个实施方案中，弗林蛋白酶的氨基酸序列包含下述氨基酸序列:
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIGGVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPARLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHLNANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRKCIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYNRRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDEDPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCKTLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL*(SEQ ID NO:65)。
在某些实施方案中，术语凝血因子进一步包括具有凝固活性的已知凝血因子的同系物。在某些实施方案中，根据本发明的同源性也包括删除、插入或置换变体，包括其氨基酸置换和它们的生物活性的多肽片段。
在另一个实施方案中，本发明包括具有凝固活性的凝血因子的同系物。在另一个实施方案中，本发明包括具有凝固活性的、如本文中所述的凝血因子的同系物。在另一个实施方案中，同系物，例如，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的、与凝血因子具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或更多而言99％同源性的多肽。
在另一个实施方案中，本发明包括弗林蛋白酶的同系物。在另一个实施方案中，同系物，例如，如使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数所确定的、与弗林蛋白酶具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％或更多而言99％同源性的多肽。
在一个实施方案中，本文中提供的多肽或其片段的同系物也表示其缺失、插入或置换变体，包括氨基酸置换，和它们的生物活性的多肽片段。
在另一个实施方案中，将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽连接至本文中提供的肽或多肽的C-端。在另一个实施方案中，将4个绒毛膜促性腺激素羧基端肽连接至本文中提供的肽或多肽的C-端。在另一个实施方案中，将5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽连接至本文中提供的肽或多肽的C-端。在另一个实施方案中，将1-10个CTP连接至本文中提供的肽或多肽的氨基端或C-端。在另一个实施方案中，将1-10个CTP连接至本文中提供的多肽或其片段的N-端。在另一个实施方案中，将1-10个CTP连接至本文中提供的多肽或其片段的C-端。
应当理解，包含如本文中所述的要素或步骤的本发明的组合物和方法在另一个实施方案中可以由那些要素或步骤组成，或在另一个实施方案中基本上由那些要素或步骤组成。在另一个实施方案中，如制药工业中已知的，术语“包含”表示包括指定的活性剂，诸如CTP修饰的多肽或其片段，以及包括其它活性剂和药学上或生理上可接受的载体、赋形剂、软化剂、稳定剂等。在另一个实施方案中，术语”基本上由……组成”表示这样的组合物：其唯一活性成分是指定的活性成分，但是，可以包括用于使制剂稳定、防腐等、却不直接涉入指定的活性成分的治疗效果的其它化合物。在另一个实施方案中，术语”基本上由……组成”可以表示促进活性成分的释放的组分。在另一个实施方案中，术语“由……组成”表示含有活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。
在一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至至少一个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端或C-端。
在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至1-3个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至1-5个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至1-10个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至2-3个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至2-5个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至2-10个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至3-5个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至3-8个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至3-10个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至6-10个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至1个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，本文中提供的方法包括连接至2、3、4、5、6、7、8、9或10个促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽或其片段，所述CTP连接在所述多肽或其片段的N-端和/或C-端。在另一个实施方案中，所述CTP肽串联地连接在所述多肽或其片段的任一侧(N-端或C-端)上。
在一个实施方案中，本文提供了包含本文中提供的多核苷酸的表达载体。在另一个实施方案中，本文提供了包含所述表达载体的细胞。在另一个实施方案中，本文提供了包含所述表达载体的组合物。
在另一个实施方案中，本发明提供了包含如本文中所述的细胞的组合物。在另一个实施方案中，所述细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是原核细胞。
在一个实施方案中，在多肽或其片段的C-端末端处的CTP序列会提供增强的针对多肽或其片段的降解的保护。在另一个实施方案中，在多肽或其片段的C-端末端处的CTP序列会提供增强的针对清除的保护。在另一个实施方案中，在多肽或其片段的C-端末端处的CTP序列会提供延长的清除时间。在另一个实施方案中，在多肽或其片段的C-端末端处的CTP序列会增强它的Cmax。在另一个实施方案中，在多肽或其片段的C-端末端处的CTP序列会增强它的Tmax。在另一个实施方案中，在多肽或其片段的C-端末端处的CTP序列会延长它的T1/2。在另一个实施方案中，在多肽或其片段的C-端末端处的CTP序列会延长它的AUC。
在另一个实施方案中，以与未修饰的多肽或其片段相同的方式使用本发明的缀合的多肽或其片段。在另一个实施方案中，以与未修饰的多肽或其片段相同的方式使用本发明的多肽或其片段。在另一个实施方案中，本发明的多肽或其片段具有增加的循环半衰期和血浆停留时间、降低的清除率和增加的体内临床活性。在另一个实施方案中，由于本文中提供的多肽或其片段的提高的性能，以比多肽或其片段更低地频率施用该缀合物。
在另一个实施方案中，降低的施用频率会导致改善的治疗策略，其在一个实施方案中导致改善的患者顺应性，从而导致改善的治疗结果以及改善的患者生活质量。在另一个实施方案中，与常规缀合物相比，具有本文中另外提供的流体动力学体积的、本文中提供的缀合物具有改善的体内效能、改善的稳定性、升高的AUC水平和增强的循环半衰期。
在另一个实施方案中，本发明进一步提供了一种包含CTP修饰的多肽的药物组合物，所述多肽包含连接至多肽或其片段的N-端的一个糖基化的促性腺素羧基端肽(CTP)和连接至多肽或其片段的C-端的两个糖基化的CTP。
在另一个实施方案中，应当理解，糖基化的CTP和未糖基化的CTP的组合可以用于修饰本文中另外提供的目标多肽或其片段。这样的组合可以包括，例如，连接至多肽或其片段的N-端的至少一个未糖基化的CTP和连接至多肽或其片段的C-端的至少一个糖基化的CTP，反之亦然。此外，且在另一个实施方案中，也预见到连接至相同端(N-端或C-端)的至少一个糖基化的CTP和至少一个未糖基化的CTP的组合。这些组合还可以包括糖基化的和/或未糖基化的CTP的截短体。这样的组合可以由本文中提供的发明指导的技术人员确定，从而达到目标多肽或其片段的最佳流体动力学体积或流体动力学尺寸。结果，具有最佳流体动力学体积的目标多肽或其片段可以具有最佳期望的特征，即，改善的效能、改善的稳定性、升高的AUC水平、增强的生物利用度和增强的循环半衰期。
在一个实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的本文中提供的CTP修饰的目标多肽或其片段。在另一个实施方案中，根据诸如以下因素确定CTP修饰的多肽或其片段的治疗有效量：要治疗的特定病症、要治疗的患者的状况、以及组合物中的其它成分。在另一个实施方案中，通过添加或除去糖基化的和/或未糖基化的CTP肽以便达到最佳流体动力学体积，最佳地调节CTP修饰的多肽或其片段的治疗效果。应当理解，在这样做时，技术人员可以达到具有最佳治疗效果的CTP修饰的多肽或其片段。
在一个实施方案中，本文中提供的CTP修饰的多肽或其片段具有治疗用途。在另一个实施方案中，本文中提供的CTP修饰的多肽或其片段具有预防用途。
在一个实施方案中，当关于本文提供的方法使用时，术语“减少、减小、降低等”表示从先前测量的或确定的水平或从正常水平下降100％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低89-99％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低79-88％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低69-78％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低59-68％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低49-58％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低39-48％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低29-38％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低19-28％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低9-18％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低5-8％。在另一个实施方案中，所述降低是从先前确定的水平降低1-4％。
在一个实施方案中，适合与本发明一起使用的组织特异性启动子包括在一个或多个特定细胞群体中起作用的序列，例子包括、但不限于：启动子诸如肝特异性的白蛋白的启动子[Pinkert等人,(1987)Genes Dev.1:268-277]，淋巴样特异性的启动子[Calame等人,(1988)Adv.Immunol.43:235-275]；尤其是T-细胞受体[Winoto等人,(1989)EMBO J.8:729-733]和免疫球蛋白的启动子；[Banerji等人(1983)Cell 33729-740]，神经元特异性的启动子诸如神经丝启动子[Byrne等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86:5473-5477]，胰腺特异性的启动子[Edlunch等人(1985)Science 230:912-916]或乳腺特异性的启动子诸如乳清启动子(美国专利号4,873,316和欧洲申请公开号264,166)。适合与本发明一起使用的诱导型启动子包括、例如四环素诱导型启动子(Srour,M.A.,等人,2003.Thromb.Haemost.90:398-405)。
在一个实施方案中，短语“多核苷酸分子”表示单链或双链核酸序列，其是分离的并且以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或组合的多核苷酸序列(例如上述形式的组合)的形式提供。
在一个实施方案中，“互补多核苷酸序列”表示这样的序列：其源自使用逆转录酶或任意其它RNA依赖性的DNA聚合酶对信使RNA的逆转录。在一个实施方案中，随后可以在体内或在体外使用DNA聚合酶扩增所述序列。
在一个实施方案中，“基因组多核苷酸序列”表示这样的序列：其衍生自染色体且因此它代表染色体的一个连续部分。
在一个实施方案中，“组合的多核苷酸序列”表示这样的序列：其为至少部分互补的和至少部分基因组的。在一个实施方案中，组合的序列可以包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列，以及插入二者之间的一些内含子序列。在一个实施方案中，所述内含子序列可以具有任何来源，包括其它基因，且通常包括保守剪接的信号序列。在一个实施方案中，内含子序列包括顺式起作用的表达调节元件。
在一个实施方案中，使用PCR技术或本领域技术人员已知的任何其它方法或规程来制备本发明的多核苷酸。在另一个实施方案中，所述规程包括连接两个不同的DNA序列(参见，例如，“Current Protocols in Molecular Biology”,eds.Ausubel等人,JohnWiley&Sons,1992)。
在一个实施方案中，将编码本文提供的经工程改造的目标多肽或其片段的、本发明的多核苷酸插入表达载体(即，核酸构建体)中，以实现重组肽/多肽的表达。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括额外序列，所述额外序列使得该载体适合于在原核生物中复制和整合。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括额外序列，所述额外序列使得该载体适合于在真核生物中复制和整合。在另一个实施方案中，本发明的表达载体包括穿梭载体，所述穿梭载体使得该载体适合于在原核生物和真核生物二者中复制和整合。在另一个实施方案中，克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如，启动子、增强子)以及转录和翻译终止子(例如，聚腺苷酰化信号)。
在一个实施方案中，多种原核或真核细胞可以用作宿主表达系统来表达本文中提供的CTP修饰的多肽或其片段。在另一个实施方案中，这些包括、但不限于：微生物，诸如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒,CaMV；烟草花叶病毒,TMV)感染的或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(诸如Ti质粒)转化的植物细胞系统。
在一个实施方案中，使用非细菌表达系统(例如，哺乳动物表达系统诸如CHO细胞)来表达本文中提供的多肽或其片段。在另一个实施方案中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸的表达载体是pCI-dhfrr载体。根据一个实施方案，将pCI-dhfrr载体的构建描述在下面的实施例的材料和方法中。
在一个实施方案中，在本发明的细菌系统中，根据表达的多肽的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。在一个实施方案中，需要大量的多肽。在一个实施方案中，指导蛋白产物的高水平表达的载体，可能是作为与疏水信号序列的融合体，所述疏水信号序列指导表达产物进入细菌周质或培养基中，在这些地方的蛋白产物易于被纯化是期望的。在一个实施方案中，用特异性切割位点工程改造的某些融合蛋白以辅助多肽的回收。在一个实施方案中，适合于这种操作的载体包括、但不限于pET系列的大肠杆菌表达载体[Studier等人,Methods in Enzymol.185:60-89(1990)]。
在一个实施方案中，使用酵母表达系统。在一个实施方案中，许多含有组成型或诱导型启动子的载体可以用于酵母中，如在美国专利申请号:5,932,447中公开的，其通过引用整体并入本文。在另一个实施方案中，使用促进外源DNA序列整合进酵母染色体中的载体。
在一个实施方案中，本发明的表达载体可以进一步包括额外多核苷酸序列，其允许例如从单一mRNA翻译几种蛋白，诸如内核糖体进入位点(IRES)和用于启动子嵌合多肽的基因组整合的序列。
在一个实施方案中，哺乳动物表达载体包括、但不限于：pcDNA3、pcDNA3.1(±)、pGL3、pZeoSV2(±)、pSecTag2、pDisplay、pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81，它们可得自Invitrogen；pCI，其可得自Promega；pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV，它们可得自Strategene；pTRES，其可得自Clontech，和它们的衍生物。
在一个实施方案中，在本发明中使用含有来自真核病毒(诸如逆转录病毒)的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在另一个实施方案中，衍生自牛乳头状瘤病毒载体包括pBV-1MTHA，衍生自Epstein Bar病毒载体包括pHEBO和p2O5。其它示例性的载体包括pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE和允许蛋白在启动子指导下表达的任何其它载体，所述启动子是SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或经证实在真核细胞中有效表达的其它启动子。
在一个实施方案中，重组病毒载体可用于在体内表达本发明的肽/多肽，因为它们会提供优点诸如横向感染和靶向特异性。在一个实施方案中，横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，是单个受感染细胞产生许多后代病毒颗粒及其出芽和感染相邻细胞的过程。在一个实施方案中，结果是，大面积被迅速感染，其中大部分最初未被原始病毒颗粒感染。在一个实施方案中，产生不能横向传播的病毒载体。在一个实施方案中，如果希望的目的是将指定基因仅导入局限数目的靶细胞中，该特性可以是有用的。
在一个实施方案中，可以使用不同方法将本发明的表达载体导入细胞中。这样的方法通常描述在：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSprings Harbor Laboratory,New York(1989,1992),Ausubel等人,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang等人,Somatic Gene Therapy,CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega等人,Gene Targeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of Molecular Cloning Vectorsand Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa等人[Biotechniques 4(6):504-512,1986]，且包括、例如，稳定的或瞬时的转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，关于正-负选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992，通过引用并入本文。
在一个实施方案中，通过病毒感染导入核酸会提供胜过其它方法(诸如脂转染和电穿孔)的几个优点，因为由于病毒的感染性质可以获得更高的转染效率。
应当理解，本文中提供的经工程改造的多肽或其片段还可以从核酸构建体表达，所述核酸构建体采用任意合适的施用模式(例如，皮下施用、口服施用、鼻内施用、静脉内(intra-venal)施用或体内基因治疗)施用给个体。在一个实施方案中，通过适当的基因递送媒介物/方法(转染、转导、同源重组等)和必要的表达系统将所述核酸构建体导入合适的细胞中，然后将修饰的细胞培养扩增并返回所述个体(即，离体基因治疗)。
在一个实施方案中，使用植物表达载体。在一个实施方案中，多肽编码序列的表达由许多启动子驱动。在另一个实施方案中，使用病毒启动子诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson等人,Nature 310:511-514(1984)]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等人,EMBO J.6:307-311(1987)]。在另一个实施方案中，使用植物启动子，例如，RUBISCO的小亚基[Coruzzi等人,EMBO J.3:1671-1680(1984)；和Brogli等人,Science 224:838-843(1984)]或热激启动子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人,Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一个实施方案中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和技术人员众所周知的其它技术，将构建体导入植物细胞中。参见，例如，Weissbach&Weissbach[Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,NY,Section VIII,第421-463页(1988)]。本发明还可以使用本领域众所周知的其它表达系统诸如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统。
应当理解，除了含有插入的编码序列(其编码多肽)的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括经工程改造以优化表达的多肽的稳定性、产生、纯化、产量或活性的序列。
在一个实施方案中，将转化的细胞在有效条件下培养，所述条件允许重组的经工程改造的胃泌酸调节素肽以较高量表达。在另一个实施方案中，有效培养条件包括、但不限于允许蛋白产生的有效的培养基、生物反应器、温度、pH和氧条件。在一个实施方案中，有效培养基表示在其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在另一个实施方案中，培养基通常包括水溶液，其具有可同化的碳、氮和磷酸盐来源，和合适的盐、矿物质、金属和其它营养物诸如维生素。可以将本发明的细胞在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定平板和培养皿中培养。在另一个实施方案中，在适合重组细胞的温度、pH和氧含量条件下进行培养。在另一个实施方案中，培养条件的确定属于本领域普通技术人员的专业技术。
在一个实施方案中，根据用于生产的载体和宿主系统，得到的多肽或其片段，或在另一个实施方案中，在发生CTP的糖基化的重组细胞内表达的、得到的本文提供的CTP修饰的多肽或其片段，被分泌进发酵培养基中，或保留在哺乳动物细胞的外表面上。
在一个实施方案中，在预定的培养时间之后，实现重组多肽或其片段的回收。
在一个实施方案中，短语“回收重组的经工程改造的多肽或其片段”表示收集含有多肽或其片段的全部发酵培养基，且不一定暗示额外的分离或纯化步骤。在另一个实施方案中，进行本领域众所周知的额外的分离或纯化步骤，以便回收重组的经工程改造的多肽或其片段。
在一个实施方案中，使用多种标准的蛋白纯化技术来纯化本文提供的经工程改造的多肽或其片段或其变体，所述技术是例如，但不限于，亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法、色谱聚焦和差别增溶。
为了促进回收，可以将表达的编码序列工程改造成编码本文中提供的多肽或其片段和融合的可切割的部分。此外，可以设计融合蛋白，使得所述多肽可以通过亲和色谱法容易地分离；例如，通过固定化在对可切割的部分特异性的柱上。将切割位点工程改造在经工程改造的多肽或其片段和可切割的部分之间，并且通过用在此位点特异性地切割融合蛋白的合适酶或试剂处理，可以从色谱柱释放多肽[例如，参见Booth等人,Immunol.Lett.19:65-70(1988)；和Gardella等人,J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)]。
在一个实施方案中，以“基本上纯的”形式回收本文提供的经工程改造的肽或多肽。
在一个实施方案中，短语“基本上纯的”表示允许蛋白在本文描述的应用中有效使用的纯度。
也可以使用体外表达系统合成本文中提供的经工程改造的多肽或其片段。在另一个实施方案中，体外合成方法是本领域众所周知的，所述系统的组分是商购可得的。
在一个实施方案中，合成和纯化重组的经工程改造的多肽或其片段；可以在体内或在体外测定它们的治疗效果。使用本领域技术人员已知的各种测定法，可以确定本发明的重组的经工程改造的多肽或其片段的结合活性。
在另一个实施方案中，可以将本发明的多肽或其片段提供给个体本身。在一个实施方案中，可以将本文提供的经工程改造的多肽或其片段作为药物组合物的一部分提供给个体，所述多肽或其片段在所述药物组合物中与药学上可接受的载体混合。
在另一个实施方案中，“药物组合物”表示一种或多种本文描述的活性成分与其它化学组分(诸如生理学上合适的载体和赋形剂)的制品。药物组合物的目的是便于将化合物施用给生物体。
在另一个实施方案中，“活性成分”表示引起生物学效应的目标多肽序列。
在另一个实施方案中，在本文中可互换地使用的短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”表示对生物体不引起显著刺激且不废除所施用的化合物的生物活性和性能的载体或稀释剂。佐剂被包含在这些短语下。在一个实施方案中，在药学上可接受的载体中包含的成分之一可以是例如聚乙二醇(PEG)，即在有机和水性介质中均具有宽溶解度范围的生物相容的聚合物(Mutter等人(1979))。
在另一个实施方案中，术语“赋形剂”表示加入药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。在一个实施方案中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物的配制和施用技术参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences”,MackPublishing Co.,Easton,PA,最新版，其通过引用并入本文。
本发明预见到剂量范围的各个实施方案。在一个实施方案中，本文中提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量是在0.005-100mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.005-5mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.01-50mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-20mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-10mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.01-5mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.001-0.01mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.001-0.1mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-5mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.5-50mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.2-15mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.8-65mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在1-50mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-10mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在8-15mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在10-20mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在20-40mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在60-120mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在12-40mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在40-60mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在50-100mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在1-60mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在15-25mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-10mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在55-65mg/天的范围内。
在另一个实施方案中，所述剂量是在50-500mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在50-150mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在100-200mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在150-250mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在200-300mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在250-400mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在300-500mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在350-500mg/天的范围内。
在一个实施方案中，所述剂量是20mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是30mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是40mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是50mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是0.01mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是0.1mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是1mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是0.530mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是0.05mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是50mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是10mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是20-70mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是5mg/天。
在一个实施方案中，CTP修饰的多肽或其片段的剂量是1-5mg/天。在一个实施方案中，CTP修饰的多肽或其片段的剂量是1-3mg/天。在另一个实施方案中，CTP修饰的多肽或其片段的剂量是2mg/天。
在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/2天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/3天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/4天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/5天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/6天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/周。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/9天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/11天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/14天。
在另一个实施方案中，所述CTP修饰的多肽或其片段剂量是10-50mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/2天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/3天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/4天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/5天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/6天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/周。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/9天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/11天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/14天。
在另一个实施方案中，所述剂量可以给出为mg/kg或单位/kg。在另一个实施方案中，本文中提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量，在一个实施方案中，是在0.005-100mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.005-5mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.01-50mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-20mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-10mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.01-5mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.001-0.01mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.001-0.1mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-5mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.5-50mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.2-15mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.8-65mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在1-50mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-10mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在8-15mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在10-20mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在20-40mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在60-120mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在12-40mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在40-60mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在50-100mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在1-60mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在15-25mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-10mg/kg或单位/kg的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在55-65mg/kg或单位/kg的范围内。
在另一个实施方案中，将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽配制成鼻内剂型。在另一个实施方案中，将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽配制成可注射剂型。在另一个实施方案中，以在0.0001mg至0.6mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.001mg至0.005mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.005mg至0.01mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.01mg至0.3mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.2mg至0.6mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，本文提供的多肽或其片段是在它的氨基端上不具有CTP。
在另一个实施方案中，以在0.2mg至2mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在2mg至6mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在4mg至10mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在5mg至15mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。
在另一个实施方案中，以在0.2mg至2mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在2mg至6mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在4mg至10mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在5mg至15mg范围内的剂量将包含本文提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。
在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的多肽或其片段所施用的激动剂的量的65％。在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的多肽或其片段所施用的激动剂的量的55％。在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的多肽或其片段所施用的激动剂的量的45％。在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的多肽或其片段所施用的激动剂的量的10％。在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的多肽或其片段所施用的激动剂的量的25％。在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的多肽或其片段所施用的激动剂的量的35％。在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的多肽或其片段所施用的激动剂的量的75％。在另一个实施方案中，本文提供的CTP修饰的多肽或其片段的剂量使得，它含有使用未CTP修饰的激动剂所施用的激动剂的量的100％。但是，即使所述剂量含有与未CTP修饰的多肽或其片段相同量的激动剂，它对于受试者仍然是有利的，因为它将以更低的频率施用，这是由于它与正常激动剂相比增加的半衰期。
在另一个实施方案中，本文提供的缀合的多肽或其片段的治疗有效量是在每天1次施用的50-500IU/千克体重之间。在另一个实施方案中，缀合的多肽或其片段的治疗有效量是每天1次施用的150-250IU/千克体重。在另一个实施方案中，以对于通过多种方式施用给人患者而言有效的强度，配制包含缀合的多肽或其片段的药物组合物。
在一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环多肽或其片段的活性达到20-30IU/dL的量，施用包含本文提供的多肽或其片段的CTP修饰的多肽。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环多肽或其片段的活性达到25-50IU/dL的量，施用包含本文提供的多肽或其片段的CTP修饰的多肽。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环多肽或其片段的活性达到50-100IU/dL的量，施用包含本文提供的多肽或其片段的CTP修饰的多肽在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环多肽或其片段的活性达到100-200IU/dL的量，施用包含本文提供的多肽或其片段的CTP修饰的多肽。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环多肽或其片段的活性达到10-50IU/dL的量，施用包含本文提供的多肽或其片段的CTP修饰的多肽。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环多肽或其片段的活性达到20-100IU/dL的量，施用包含本文提供的多肽或其片段的CTP修饰的多肽
在一个实施方案中，每周1次地将本文提供的CTP修饰的多肽或其片段施用给受试者。在另一个实施方案中，每周2次地将本文提供的CTP修饰的多肽或其片段施用给受试者。在另一个实施方案中，每两星期1次地(每2周1次地)将本文提供的CTP修饰的多肽或其片段施用给受试者。在另一个实施方案中，每个月2次地将本文提供的CTP修饰的多肽或其片段施用给受试者。在另一个实施方案中，每个月1次地将本文提供的CTP修饰的多肽或其片段施用给受试者。在另一个实施方案中，每天1次地将本文提供的CTP修饰的多肽或其片段施用给受试者。在另一个实施方案中，每2天1次地将本文提供的CTP修饰的多肽或其片段施用给受试者。在另一个实施方案中，每3天1次地将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。
在另一个实施方案中，每4天1次地将包含多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每5天1次地将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每6天1次地将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每7-14天1次地将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每10-20天1次地将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每5-15天1次地将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每15-30天1次地将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括增加患者的顺应性，所述患者罹患需要本文中提供的多肽或其片段疗法的慢性疾病。在另一个实施方案中，通过使CTP修饰的多肽或其片段的流体动力学尺寸增加本文中提供的因数。在另一个实施方案中，本发明的方法能够降低多肽或其片段的施用频率。
在另一个实施方案中，术语顺应性包括坚持。在另一个实施方案中，本发明的方法包括如下增加需要治疗的患者的顺应性：使多肽或其片段的流体动力学尺寸增加本文中提供的因数或增量，其导致降低所述多肽或其片段的施用频率。在另一个实施方案中，由于CTP修饰和流体动力学尺寸随后增加本文中提供的因数或增量(这使得所述多肽或其片段更稳定)，实现本文提供的多肽或其片段的施用频率的下降。在另一个实施方案中，由于CTP修饰和流体动力学尺寸随后增加本文中提供的因数或增量(这会增加所述多肽或其片段的半衰期(T1/2))，实现本文提供的多肽或其片段的施用频率的下降。在另一个实施方案中，通过使多肽或其片段的流体动力学尺寸增加本文中提供的因数或增量(这导致增加本文中提供的多肽或其片段的清除时间或降低清除率)，实现本文提供的多肽或其片段的施用频率的下降。
在另一个实施方案中，通过使多肽或其片段的流体动力学尺寸增加本文中提供的因数或增量(这导致增加多肽或其片段的AUC测量)，实现本文提供的多肽或其片段的施用频率的下降。
在一个实施方案中，口服施用包括单位剂型，包括片剂、胶囊剂、锭剂、咀嚼片剂、混悬液、乳剂等。这样的单位剂型包含安全且有效量的期望的本文提供的多肽或其片段，在一个实施方案中，其中的每一种是约0.7或3.5mg至约280mg/70kg，或在另一个实施方案中，约0.5或10mg至约210mg/70kg。适合于制备用于口服施用的单位剂型的药学上可接受的载体是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，片剂通常包含常规药学上相容的佐剂如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂诸如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂诸如淀粉、海藻酸和交联羧甲纤维素(croscarmelose)；润滑剂诸如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石粉。在一个实施方案中，助流剂诸如二氧化硅可以用于改善粉末混合物的流动特性。在一个实施方案中，为了外观，可以加入着色剂诸如FD&C染料。甜味剂和矫味剂，诸如阿司帕坦、糖精、薄荷醇、薄荷和果味矫味剂，是咀嚼片剂的有用佐剂。胶囊剂通常包含以上公开的一种或多种固体稀释剂。在另一个实施方案中，载体组分的选择取决于后续考虑事项，如味道、成本和贮存稳定性，其对于本发明的目的而言不是关键性的，且可以由本领域技术人员容易地选择。
在一个实施方案中，口服剂型包含预定义的释放特性。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含延长释放片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含缓释片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含立即释放片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，如本领域技术人员已知的，根据药物活性成分的期望释放特性配制所述口服剂型。
在另一个实施方案中，口服组合物包含液体溶液、乳剂、混悬液等。在另一个实施方案中，适合于制备这样的组合物的药学上可接受的载体是本领域众所周知的。在另一个实施方案中，液体口服组合物包含约0.001％至约0.933％的一种或多种期望的化合物，或在另一个实施方案中，约0.01％至约10％。
在一个实施方案中，用于本发明的方法中的组合物包含溶液或乳剂，在另一个实施方案中，其为包含安全且有效量的本发明化合物和任选的意图用于局部鼻内施用的其它化合物的水溶液或乳剂。在另一个实施方案中，所述组合物包含约0.001％至约10.0％(w/v)的主题化合物，更优选约00.1％至约2.0％，其用于通过鼻内途径全身性递送所述化合物。
在另一个实施方案中，将包含多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽注射进肌肉中(肌肉内注射)。在另一个实施方案中，将包含多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽注射在皮肤下面(皮下注射)。在另一个实施方案中，将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽注射进肌肉中。在另一个实施方案中，将包含本文中提供的多肽或其片段和至少一个CTP单元的多肽注射进皮肤中。在另一个实施方案中，通过全身施用来施用如本文中所述的本文中提供的多肽或其片段。在另一个实施方案中，通过静脉内注射来施用如本文中所述的本文中提供的多肽或其片段。在另一个实施方案中，施用可以是胃肠外的、肺的、口服的、局部的、真皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、经鼻的、眼内的、眼的、硬膜外的、含服的、直肠的、透粘膜的、肠或胃肠外的递送，包括骨髓内注射以及鞘内或直接心室内施用。
在另一个实施方案中，以局部方式而不是全身性方式施用制剂，例如，通过将制剂直接注射进患者身体的特定区域中。
在一个实施方案中，所述施用途径可以是肠内的。在另一个实施方案中，所述途径可以是结膜的、透皮的、真皮内的、动脉内的、阴道的、直肠的、肿瘤内的、经癌灶(parcanceral)、透粘膜的、肌肉内的、血管内的、心室内的、颅内的、鼻内的、舌下的或它们的组合。
在另一个实施方案中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制剂来施用所述药物组合物。在另一个实施方案中，液体制剂包括溶液、混悬液、分散体、乳剂、油等。在一个实施方案中，静脉内地施用所述药物组合物，并因此将其配制成适合于静脉内施用的形式。在另一个实施方案中，动脉内地施用所述药物组合物，并因此将其配制成适合于动脉内施用的形式。在另一个实施方案中，肌内地施用所述药物组合物，并因此将其配制成适合于肌肉内施用的形式。
此外，且在另一个实施方案中，将所述药物组合物局部施用于身体表面，并因此将其配制成适合于局部施用的形式。合适的局部制剂包括凝胶、软膏剂、乳膏剂、洗剂、滴剂等。对于局部施用，将本发明的化合物与一种或多种额外的适当治疗剂组合，制备，和作为在有或无药用载体的生理上可接受的稀释剂中的溶液、混悬液或乳剂来施用。
在一个实施方案中，通过本领域众所周知的的方法来制备本发明的药物组合物，例如，借助于常规混合、溶解、粒化、做糖衣丸、磨细、乳化、包封、截留或冻干过程制备。
在一个实施方案中，使用促进将所述活性成分加工成可在药学上使用的制品的一种或多种生理上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)，以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。在一个实施方案中，制剂取决于选择的施用途径。
在一个实施方案中，在水溶液中配制本发明的注射剂。在一个实施方案中，在生理上相容的缓冲液(诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)中配制本发明的注射剂。在另一个实施方案中，对于透粘膜施用，在所述制剂中使用适合要透过的屏障的穿透剂。所述穿透剂在本领域内是公知的。
在一个实施方案中，将本文所述的制品配制为用于胃肠外施用，例如，通过快速推注或连续输注。在另一个实施方案中，注射用制剂呈单位剂型，例如在安瓿中或在多剂量容器中，任选具有加入的防腐剂。在另一个实施方案中，组合物是在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂，且含有配制剂诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
在另一个实施方案中，所述组合物还包含：防腐剂，诸如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，诸如依地酸钠等；缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张度剂诸如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂诸如抗坏血酸、乙酰基胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，诸如聚合物，包括纤维素及其衍生物；和聚乙烯醇以及根据需要调节这些水性组合物的pH的酸和碱。在另一个实施方案中，所述组合物还包含局部麻醉剂或其它活性物。所述组合物可以用作喷雾剂、合剂(mist)、滴剂等。
在一个实施方案中，用于胃肠外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制品的水溶液。另外，可以将活性成分的混悬液制备成适当的基于油或水的注射混悬液。在另一个实施方案中，合适的亲脂溶剂或媒介物包括：脂肪油诸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。在某些实施方案中，水性注射混悬液含有增加所述混悬液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。在另一个实施方案中，所述混悬液还含有合适的稳定剂或增加活性成分的可溶性以允许制备高浓缩溶液的试剂。
在另一个实施方案中，可以在囊泡、特别是在脂质体中递送所述活性化合物(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat等人,in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez-Berestein和Fidler(编),Liss,New York,第353-365页(1989)；Lopez-Berestein,文献同上,第317-327页；J.E.Diederichs等人,Pharm./nd.56(1994)267-275)。
在另一个实施方案中，将在控释系统中递送的药物组合物配制成用于静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它施用模式。在一个实施方案中，使用泵(参见Langer,出处同上；Sefton,CRC Crit.Ref.Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等人,Surgery 88:507(1980)；Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574(1989)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料。在另一个实施方案中，可以将控释系统置于治疗靶标(即，脑)的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,in Medical Applications ofControlled Release,出处同上,第2卷,第115-138页(1984)。在Langer的综述(Science249:1527-1533(1990))中讨论了其它控释系统。
在另一个实施方案中，所述活性成分是呈粉末形式，其用于在使用之前用合适的媒介物(例如，无菌的、无热原的基于水的溶液)构建。在某些实施方案中，将组合物配制用于雾化和吸入施用。在另一个实施方案中，将组合物包含在具有附带的雾化装置的容器中。
在一个实施方案中，使用例如常规栓剂基质诸如可可脂或其它甘油酯，将本发明的制品配制成直肠组合物诸如栓剂或保留灌肠剂。
在一个实施方案中，适用于用在本发明的上下文中的药物组合物包括这样的组合物：其中含有有效地实现预期目的的量的活性成分。在另一个实施方案中，治疗有效量是指有效地预防、减轻或改善疾病征状或延长接受治疗的受试者的生存时间的活性成分的量。
在一个实施方案中，治疗有效量的确定完全是在本领域技术人员的能力范围内。
可以充当药学上可接受的载体或其组分的物质的一些例子是：糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石粉；固体润滑剂，诸如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇诸如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，诸如吐温TM商标乳化剂；润湿剂，诸如月桂基硫酸钠；着色剂；矫味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等张盐水；和磷酸盐缓冲溶液。要与所述化合物联合使用的药学上可接受的载体的选择基本上取决于要施用所述化合物的方式。在一个实施方案中，如果要注射主题化合物，那么所述药学上可接受的载体是含有血液相容的助悬剂的无菌生理盐水，其pH已经被调节至约7.4。
另外，所述组合物还包含：粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)，崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、淀粉羟乙酸钠)，不同pH和离子浓度的缓冲液(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，用于防止吸收至表面的添加剂诸如白蛋白或明胶，去污剂(例如，吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐)，蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)，渗透增强剂、增溶剂(例如，甘油、聚乙烯甘油)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁羟茴香醚)，稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)，增粘剂(例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)，甜味剂(例如阿司帕坦、柠檬酸)，防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)，润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)，助流剂(例如胶体二氧化硅)，塑化剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)，乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)，聚合物包衣剂(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)，包衣剂和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬液的载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨醇和水。对于混悬液而言，典型的助悬剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维素(例如AvicelTM、RC-591)、黄蓍胶和海藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚氧化乙烯脱水山梨糖醇(例如聚山梨酯80)。典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一个实施方案中，口服液体组合物还含有上面公开的一种或多种组分诸如甜味剂、矫味剂和着色剂。
所述组合物还包括将活性物质掺入在高分子化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸(polglycolic acid)、水凝胶等)的微粒制品的内部或表面上，或掺入在脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、血影(erythrocyte ghosts)或原生质球上。这样的组合物将影响物理状态、可溶性、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包被的微粒组合物，以及偶联至针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体的化合物或偶联至组织特异性受体的配体的化合物。
在一个实施方案中，通过共价连接水溶性聚合物来修饰化合物，所述水溶性聚合物是诸如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸。在另一个实施方案中，与相应的未修饰的化合物相比，所述修饰的化合物在静脉内注射之后表现出在血液中实质上更长的半衰期。在一个实施方案中，修饰也会增加所述化合物在水溶液中的可溶性，消除聚集，增强所述化合物的物理和化学稳定性，并极大地降低所述化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施方案中，通过与未修饰的化合物相比以更低频率或更低剂量施用这样的聚合物-化合物加合物，实现期望的体内生物活性。
最初可以从体外测定估算有效量或剂量的制品。在一个实施方案中，可以在动物模型中配制剂量，且这样的信息可以用来更准确地确定在人类中有用的剂量。
在一个实施方案中，通过标准制药规程在体外、在细胞培养物或实验动物中可以确定本文描述的活性成分的毒性和治疗效果。在一个实施方案中，可以将得自这些体外和细胞培养测定和动物研究的数据用于配置人用的剂量范围。在一个实施方案中，剂量随采用的剂型和利用的施用途径而变化。在一个实施方案中，精确的制剂、施用途径和剂量可以由个别医师考虑到患者的状况来选择[参见例如，Fingl,等人,(1975)“ThePharmacological Basis of Therapeutics”,第1章第1页]。
在一个实施方案中，取决于要治疗的病症的严重程度和应答性，给药可以是单次或多次给药，疗程持续几天至几周，或直到实现治愈或达到疾病状态的减轻。
在一个实施方案中，组合物的施用量当然取决于治疗的受试者、疾病严重程度、施用方式、处方医师的判断等。
在一个实施方案中，还制备组合物，包括在相容的药用载体中配制的本发明制品，其置于适当的容器中，并标示指定的病症的治疗。
在另一个实施方案中，如本文中所述的多肽或其片段或其变体(CTP修饰的)形式是与以下物质组合的低压冻干的(即，冷冻干燥的)制品：复合的有机赋形剂和稳定剂诸如非离子表面活性剂(即，表面活性剂)、各种糖、有机多元醇和/或人血清白蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含在无菌注射用水中制备的、低压冻干的本文中提供的多肽或其片段。在另一个实施方案中，药物组合物包含在注射用无菌PBS中低压冻干的本文中提供的多肽或其片段。在另一个实施方案中，药物组合物包含在注射用无菌0.9％NaCl中低压冻干的本文中提供的多肽或其片段。
在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段和复合载体诸如人血清白蛋白、多元醇、糖和阴离子表面活性稳定剂。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含CTP-多肽或其片段和乳糖酸和乙酸盐/甘氨酸缓冲液。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段和增加干扰素成分在水中的可溶性的氨基酸(诸如精氨酸或谷氨酸)。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含低压冻干的如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段和甘氨酸或人血清白蛋白(HSA)、缓冲剂(例如乙酸盐)和等渗剂(例如NaCl)。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含低压冻干的如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段、和磷酸盐缓冲液、甘氨酸和HSA。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物当置于具有约4至7.2之间的pH的缓冲溶液中时是稳定的。在另一个实施方案中，包含CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物是在具有约4至8.5之间的pH的缓冲溶液中。在另一个实施方案中，包含CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物是在具有约6至7之间的pH的缓冲溶液中。在另一个实施方案中，包含CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物是在具有约6.5的pH的缓冲溶液中。在另一个实施方案中，用作为稳定剂的氨基酸且在某些情况下用盐(如果所述氨基酸不含有带电荷的侧链)来稳定包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物是这样的液体组合物：其包含约0.3重量％至5重量％之间的稳定剂，所述稳定剂是氨基酸。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物提供了给药准确度和产品安全性。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物提供了用于可注射施用中的生物学上有活性的、稳定的液体制剂。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含未低压冻干的如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段。
在另一个实施方案中，包含本文中提供的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物提供了这样的液体制剂：其允许以液体状态长期贮存，从而促进在施用之前的贮存和运输。
在另一个实施方案中，包含本文中提供的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含固体脂质作为基体材料。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的可注射药物组合物包含固体脂质作为基体材料。在另一个实施方案中，如Speiser(Speiser等人,Pharm.Res.8(1991)47-54)所述通过喷雾冷凝来生产脂质微粒，随后将脂质纳米球用于口服施用(Speiser EP 0167825(1990))。在另一个实施方案中,使用的脂质被身体较好地耐受(例如由存在于胃肠外营养物的乳剂中的脂肪酸组成的甘油酯)。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含高分子微粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含纳米颗粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含脂质体。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含脂质乳剂。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含微球。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含含有两亲脂质的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的CTP修饰的多肽或其片段的药物组合物包含含有药物、脂质基质和表面活性剂的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，所述脂质基质具有为至少50％(w/w)的甘油单酯含量。
在一个实施方案中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置中，诸如FDA批准的试剂盒，其包含一个或更多个含有活性成分的单位剂型。在一个实施方案中，所述包装例如包含金属或塑料箔，诸如泡罩包。在一个实施方案中，所述包装或分配器装置伴有施用说明书。在一个实施方案中，所述包装或分配器伴有与容器有关的公告，所述公告采用管理药物的制备、使用或销售的政府机构指定的形式，所述公告反映了所述机构对所述组合物的形式或人或兽施用的批准。在一个实施方案中，所述公告是由美国食品和药品管理局批准的关于处方药的标签或经批准的产品插页。
在一个实施方案中，应当理解，本文提供的多肽或其片段可以与额外活性剂一起提供给个体，以实现与用每种药剂自身治疗相比改善的治疗效果。在另一个实施方案中，采取措施(例如互补药剂的施用和选择)来避免与联合治疗有关的不利副作用。
在一个实施方案中，术语“约”是指以定量方式加或减5％，或在另一个实施方案中加或减10％，或在另一个实施方案中加或减15％，或在另一个实施方案中加或减20％。
在一个实施方案中，术语”受试者”表示需要治疗病症或其后遗症或者易感病症或其后遗症的哺乳动物，包括人.受试者可以包括狗、猫、猪、牛、绵羊、山羊、马、大鼠和小鼠和人类。术语”受试者”不排除在所有方面正常的个体。
本领域普通技术人员在检查下述实施例以后，会明白本发明的其它目标、优点和新颖的特征，所述实施例无意成为限制性的。另外，上文描述的和在下面的权利要求书部分中要求保护的本发明的不同实施方案和方面中的每一个，都可以得到下述实施例的实验支持。
实施例
材料和方法：
不同的CTP修饰的蛋白的生产
将人生长激素(hGH)、促红细胞生成素(EPO)、APO-A1、因子IX和因子VII的DNA编码区与CTP肽的DNA序列连接。将CTP肽以单个拷贝或串联地融合至N-端和/或C-端，如在表2中所详述的。在能够适当构建O-聚糖的CHO细胞系中转染和表达经工程改造的质粒，这在增加蛋白的流体动力学体积中起关键作用(参见表5)。根据为每种蛋白独特地开发的定制方法纯化不同的蛋白，如下面所详述的：
CTP-EPO-CTP-CTP:将澄清的收获物加载到Blue Sepharose柱上。将洗脱的产物稀释并加载到Q Sepharose柱上。通过使用Amicon离心装置(30kDa截止)进行超滤，处理从QSepharose柱洗脱的级分，并透析。将浓缩的和透析的级分加载到Phenyl Sepharose柱上。通过使用Amicon离心装置(30kDa截止)进行超滤，处理从Phenyl Sepharose洗脱的级分，并在PBS pH 7中透析。
CTP-CTP-EPO和CTP-CTP-EPO-CTP-CTP:将澄清的收获物加载到DEAE Sepharose柱上并洗脱。将洗脱的级分用硫酸铵调节并加载到Phenyl Sepharose HS柱上。将Phenyl洗脱物浓缩和透析。接下来的2个柱处于穿流模式：Hydroxyapatite I型40μ和SP Sepharose。将终产物浓缩、透析并在-20℃保存。
APO-CTP和APO-CTP-CTP:用亲和柱(Capture Select Apo,Bac)纯化这2种APO蛋白形式。将澄清的收获物用PBS进行1:1稀释，并从柱洗脱。将洗脱物浓缩并在PBS中透析，并在-80℃保存。
CTP-hGH-CTP-CTP:使用UFDF1过滤澄清的收获物。完成病毒灭活。第一个色谱法是阴离子交换色谱法,DEAE Sepharose FF。第二个色谱法的树脂是Phenyl Sepharose。将第二个色谱法的洗脱液合并物在UFDF-2中渗滤并浓缩。UFDF-2步骤之后是另外2个处于穿流模式的色谱法：Ceramic Hydroxyapatite I型40μM和SP Sepharose FF。进行纳米过滤。将产物溶液浓缩至41±1mg/mL并透析。
FIX-CTP-CTP-CTP:将Tris-HCl(pH 9)加入澄清的收获物中。使用阴离子交换Q柱，进行第一个色谱柱。下一个柱是Heparin Hyper D。将洗脱的级分调至10mM磷酸钠的终浓度，具有6.8的最终pH。在CHT树脂上进行最后一个色谱法步骤。将洗脱的级分浓缩并在TBSpH 7.5中透析。
FIX-CTP-CTP-CTP-CTP:将澄清的收获物浓缩并透析。唯一的色谱法步骤是亲和色谱法，固定化的榴莲凝素。将洗脱的产物浓缩并在TBS pH 7.5中透析。
FIX-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP:将澄清的收获物浓缩并透析。唯一的色谱法步骤是亲和色谱法，固定化的榴莲凝素。将洗脱的产物浓缩并在TBS pH 7.5中透析。
APOA1-CTP-CTP:将澄清的收获物浓缩并透析。使用阴离子交换色谱法DEAESepharose FF柱进行第一个色谱法。在固定化的榴莲凝素树脂上进行第二个色谱法步骤。将洗脱液渗滤，并用UFDF-2在TBS(pH 7.4)中浓缩。
APOA1-CTP:使用亲和色谱法,Capture-Select APO-AI柱进行第一个色谱法。在固定化的榴莲凝素树脂上进行第二个色谱法步骤。将洗脱液渗滤，并用UFDF-2在TBS(pH7.4)中浓缩。
APOA1:将稀释的收获物加载到亲和色谱法,Capture-Select APO-AI上。将洗脱液渗滤并用UFDF-2在TBS(pH 7.4)中浓缩。
FVIIa-CTP-CTP-CTP:将澄清的收获物浓缩并透析。完成病毒灭活。使用亲和柱VIISelect进行第一个色谱法。将洗脱的级分在加载到下一个柱-Ceramic Hydroxyapatite(CHT)上之前进行稀释。将CHT洗脱液加载到Phenyl Sepharose柱上。将洗脱液渗滤，并在阴离子交换色谱柱上活化。然后将柱洗涤，并将产物洗脱。进行纳米过滤。
FVIIa-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP:将澄清的收获物浓缩并透析。使用亲和柱VIISelect进行第一个色谱法。将洗脱的级分加载到下一个柱-Ceramic Hydroxyapatite(CHT)上。将柱洗涤，并将产物洗脱。将CHT洗脱液加载到Phenyl Sepharose柱上。将洗脱液渗滤并浓缩。在阴离子交换色谱柱上活化因子VII。然后将柱洗涤，并将产物洗脱。
表2:CTP修饰的蛋白的简要描述
质粒简要描述
CTP-hGH-CTP-CTP(MOD-4023)
CTP-CTP-EPO
CTP-EPO-CTP-CTP
CTP-CTP-EPO-CTP-CTP
APO-CTP
APO-CTP-CTP
FIX-CTP-CTP-CTP
FIX-CTP-CTP-CTP-CTP
FIX-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP
FVIIa-CTP-CTP-CTP
FVIIa-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP
CTP修饰的蛋白的去糖基化
使用Glyko唾液酸酶A(目录号PZ PZGK80040,Prozyme)、O-聚糖酶(目录号PZPZGK80090,Prozyme)和N-聚糖酶(目录号PZGKE-5006A,Prozyme)，进行CTP修饰的蛋白的去糖基化。将蛋白用唾液酸酶A消化2h(在37℃)，随后用O-聚糖酶消化，并在需要时用N-聚糖酶消化过夜。
通过MALDI-TOF确定分子量
使用REFLEX-IV模型(Bruker Daltonics,Bremen,德国)，通过MALDI-TOF技术测量CTP修饰的蛋白的分子量(Mw)。基质辅助的激光解吸/电离-飞行时间质谱法(MALDI-TOFMS)是这样的技术：其中用激光脉冲照射紫外线吸收基质和生物分子如蛋白或肽的共沉淀物。电离的生物分子在电场中加速并进入飞行管。在该管中飞行期间，不同的分子根据它们的质荷比发生分离，并在不同的时间到达检测器。以此方式，每个分子产生可以转化成分子量的独特信号。该方法被用于表征具有在400-350,000Da之间的分子质量的不同蛋白和肽。它是一种非常灵敏的方法，它允许以0.1-0.01％的准确度检测低(10-15-10-18摩尔)量的样品。在Analytical Research Services Unit(Ben-Gurion University,Beer-Sheva,以色列)进行测量。
使用SEC柱通过HPLC分析流体动力学尺寸
对于hGH、Epo和Apo天然和有关的CTP-修饰的蛋白而言使用TSKgel G2000SW SEC柱(目录号08540,TosoHaas)，或对于因子IX和因子VII天然和有关的CTP修饰的蛋白而言使用TSKgel G3000WXL SEC柱(目录号08541,TosoHaas)，通过HPLC(Dionex UltiMate 3000)测量蛋白的流体动力学尺寸。使用H Mw校准试剂盒(目录号151-1901,BioRad)测量蛋白大小。将结果拟合至对数拟合(y＝a*ln X+b)，并计算不同蛋白的流体动力学尺寸。
结果
实施例1:不同的CTP修饰的蛋白的生产。
将11种不同的CTP修饰的蛋白在CHO细胞系中转染和表达。根据上述的方法纯化各种收获物。纯化的蛋白显示在图1和2中。
实施例2:通过MALDI-TOF方法分析分子量
使用MALDI-TOF技术确定不同的糖基化的和未糖基化的CTP修饰的蛋白的分子量，并与它们的对应天然蛋白(没有与CTP融合的完整蛋白，即，对于hGH而言为比奥托品，对于Epo、ApoAI而言为
Figure BDA0002868439760000822
对于因子IX而言为
Figure BDA0002868439760000823
和对于FVIIa而言为
Figure BDA0002868439760000824
)的分子量进行对比(表3)。基于蛋白的氨基酸序列，所有天然的和未糖基化的蛋白的测量的Mw与理论分子量较好地一致。计算每个拷贝的未糖基化的和糖基化的CTP实现的分子量的增量，并分别描绘在图3A和3B中。如下计算一个拷贝的CTP对分子量的贡献：首先，通过将天然蛋白的测量的或理论的(在天然hGH的情况下)分子量从它们的对应CTP修饰的蛋白的测量分子量减去，计算分子量的增量。然后，将计算的增量除以每种蛋白的CTP拷贝的数目。例如，MOD-4023(在N-端与一个拷贝的CTP融合且在C-端与2个拷贝的串联CTP融合的hGH)具有38,128的分子量，而天然hGH具有22,000的理论分子量。这两种蛋白之间的差异是16.13kDa，这意味着，每个糖基化的CTP的贡献是5.4kDa(16.13除以3个拷贝的CTP)。在所有测量的蛋白中一个拷贝的未糖基化的CTP的平均贡献是2.76kDa±0.103(图3A，表3)。该结果与单个CTP的理论分子量(其为2.78kDa)一致。糖基化的CTP为分子量贡献4.76kDa±0.422的平均值(图3B，表3)，在各种测量的蛋白之间没有显著差异。
表3：未糖基化的和糖基化的CTP修饰的蛋白和它们的对应天然蛋白的MALDI-TOF结果。ND–未测定。
Figure BDA0002868439760000821
Figure BDA0002868439760000831
实施例3:通过HPLC方法分析流体动力学尺寸
流体动力学体积是影响蛋白在穿过尺寸排阻柱时的保留时间(RT)的主要参数。因此，使用HMw凝胶过滤校准试剂盒(目录号151-1901,BioRad)，通过SEC柱计算蛋白大小。在SEC TSK 2000和TSK 3000柱中测量标准物的保留时间，并计算每个柱的％相对误差(％RE)，以便确定分析方法的精确度。计算校准蛋白的观察分子量的％RE，并与校准蛋白的已知和预期分子量进行对比。用于校正曲线的计算分子量的结果和％RE呈现在表4a(对于TSK2000SEC柱)中和表4b(对于TSK 3000SEC柱)中。结果表明，％RE较低或等于20％(≤20％)，从而指示蛋白的确定分子量的宽范围的高精确度。
表4a:使用TSK 2000的H Mw校正曲线结果和计算的％RE。通过使用的市售的试剂盒(H Mw校准试剂盒BioRad目录号151-1901)，提供校正曲线蛋白的预期分子量。
标准蛋白 预期分子量 R.T. 观察的分子量 ％RE
γ-球蛋白 158,000 15.535 155279.16 -1.72
卵白蛋白 44,000 18.535 52924.39 20.28
肌球蛋白 17,000 22.315 13635.14 -19.79
维生素B12 1,350 28.61 1424.88 5.55
表4b:使用TSK 3000柱的H Mw校正曲线结果和计算的％RE。通过使用的市售的试剂盒(H Mw校准试剂盒BioRad目录号151-1901)，提供校正曲线蛋白的预期分子量。
Figure BDA0002868439760000832
Figure BDA0002868439760000841
为了确定糖基化的CTP对CTP修饰的蛋白的流体动力学体积的贡献，通过SEC柱分析了各种CTP修饰的蛋白，并计算它们的流体动力学尺寸。与它们的CTP修饰的对应蛋白平行地分析对应的重组蛋白：比奥托品(rhGH)、
Figure BDA0002868439760000842
(rEPO)、ApoAI、
Figure BDA0002868439760000843
(rFIX)和
Figure BDA0002868439760000844
(rFVIIa)，以便计算糖基化的CTP对蛋白的共享(表5,图4)。图4A呈现了通过SEC柱测量的、CTP修饰的蛋白相对于天然蛋白的流体动力学尺寸的总增量。
表5:CTP修饰的蛋白和它们的对应天然蛋白的一个拷贝的CTP的SEC-HPLC结果和计算的增量.
Figure BDA0002868439760000845
通过将天然蛋白的测量流体动力学尺寸从它们的对应CTP修饰的蛋白的测量流体动力学尺寸减去，计算一个拷贝的糖基化的CTP的分子量的增量。然后，将计算的增量除以每种蛋白的CTP拷贝的数目。计算的一个拷贝的糖基化的CTP对不同蛋白的分子量的贡献呈现在图4B中。各种蛋白表现出每个拷贝的糖基化的CTP在29kDa至53kDa之间的范围内的增量。
有趣地和意外地，与其它测量的蛋白相比，一个拷贝的糖基化的CTP对FIX和FVIIa的贡献显著高于43-53kDa(每个拷贝的CTP)的贡献(表5)。如通过MALDI-TOF测量的，每一个拷贝的糖基化的CTP的流体动力学尺寸的增量远远高于每一个拷贝的糖基化的CTP对分子量的4.76kDa的计算贡献。所述方法之间的计算分子量的差异源自以下事实：尽管MALDI-TOF是在测量蛋白的实际分子量，SEC-HPLC测量结果受蛋白的流体动力学体积影响，从而提示，糖基化的CTP正在显著增加它所连接的蛋白的流体动力学体积。与通过MALDI-TOF测量的每个CTP的计算贡献相比，流体动力学体积的量级是约6-11倍。值得指出的是，对于hGH和CTP修饰的EPO变体(约30kDa)而言，CTP对被修饰的蛋白的流体动力学尺寸的贡献较低，但是对于FIX和FVII-CTP修饰的变体而言稍高，并且令人惊讶地不受添加至特定蛋白的CTP的数目影响。
另外，通过SEC-HPLC确定了未糖基化的CTP对蛋白的分子量的贡献(表6,图5A和5B)。如下进行去糖基化：将蛋白与唾液酸酶A(除去唾液酸)一起在37℃温育2h，随后添加O-聚糖酶(以除去O-聚糖)。在
Figure BDA0002868439760000851
(rEPO)、
Figure BDA0002868439760000852
(rFIX)、
Figure BDA0002868439760000853
(rFVII)和它们的对应的CTP修饰的蛋白(它们含有N-聚糖)的情况下，加入N-聚糖酶进行过夜消化以除去N-聚糖。计算未糖基化的CTP对各种蛋白的流体动力学尺寸或体积的贡献，并与它们的对应天然蛋白进行对比，即，如下计算未糖基化的CTP修饰的多肽对流体动力学体积的贡献：将未糖基化的CTP修饰的多肽的流体动力学体积与未糖基化的对应天然蛋白的流体动力学体积进行对比。例如，对于EPO，从
Figure BDA0002868439760000854
除去N-和O-聚糖，并计算CTP修饰的Epo变体的流体动力学体积的增加和对比它们的分子量)。
图5A描绘了完整蛋白的流体动力学尺寸的增量，而图5B描绘了一个拷贝的未糖基化的CTP修饰的蛋白的贡献。值得注意的是，与对应的天然蛋白相比，未糖基化的CTP会增加CTP修饰的蛋白的流体动力学尺寸。一个拷贝的未糖基化的CTP的计算贡献在不同蛋白之间是不同的，每一个拷贝的未糖基化的CTP的计算贡献是在8kDa至21kDa范围内(表6)。考虑到CTP(其由28个氨基酸组成)的理论分子量是2.78kDa和测量的分子量(通过MALDI-TOF)也是约2.76kDa，这些结果提示，未糖基化的CTP对分子量的贡献高于预期值。此外，且如关于糖基化的CTP类似地观察到的，对于未糖基化的CTP，也观察到流体动力学体积远远高于预期值。总之，将CTP连接至蛋白会导致流体动力学体积的增加，这可归因于CTP主链和CTP聚糖。
还观察到，添加至特定蛋白的CTP的数目不会影响它们的流体动力学尺寸的贡献。对于Apo、FIX和FVII(其具有在蛋白的C-端中的CTP拷贝)，观察到未糖基化的CTP的最显著的增量。这种在C-端添加CTP会导致对流体动力学体积的较高贡献的发现是意外的。有趣地和意外地，Apo、FIX和FVIIa CTP-修饰的蛋白的一个拷贝的未糖基化的CTP的贡献是非常类似的，且测量为～20kDa(表6)，但是凝血因子的糖基化的CTP的贡献显著高于Apo糖基化的CTP(表5)。
表6:未糖基化的CTP修饰的蛋白和它们的对应天然蛋白的一个拷贝的CTP的SEC-HPLC结果和计算的增量.
Figure BDA0002868439760000861
该研究表明，一个拷贝的糖基化的CTP会为流体动力学体积贡献至少28(kDa)，而分子量的增量是4.76(kDa)0.422，如分别使用SEC-HPLC和MALDI-TOF所确定的。CTP修饰的蛋白的流体动力学体积的该意外量级可能是观察到的延长的血清半衰期和CTP修饰的蛋白的生物活性的增强的原因。未糖基化的CTP会为流体动力学体积贡献至少8(kDa)，而分子量增量是2.76(kDa)0.103。令人感兴趣的是，通过MALDI-TOF测量的未糖基化的和糖基化的CTP肽的分子量在所有蛋白之间是类似的。此外，通过SEC-HPLC测量的糖基化的和未糖基化的CTP肽修饰的蛋白的流体动力学体积是不同的。这些发现提示，尽管当在不同位置与不同蛋白融合时，CTP肽的分子量是类似的，但是它会造成它所连接的不同蛋白的流体动力学体积的意外增加，如通过SEC柱测量结果所证实的。
已经参考附图描述了本发明的优选实施方案，应当理解，本发明不限于精确的实施方案，并且本领域技术人员可以在本发明中做出各种变化和修改，而不脱离如在所附权利要求中限定的本发明的范围或精神。
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<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP序列
<400> 1
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP序列
<400> 2
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的CTP序列
<400> 3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH信号肽
<400> 4
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala
20 25
<210> 5
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 5
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210 215
<210> 6
<211> 192
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH序列
<400> 6
Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe
20 25 30
Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn
35 40 45
Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn
50 55 60
Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser
65 70 75 80
Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser
85 90 95
Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr
100 105 110
Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg
115 120 125
Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr
130 135 140
Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn
145 150 155 160
Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr
165 170 175
Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 7
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH序列
<400> 7
Met Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu
1 5 10 15
Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala
20 25
<210> 8
<211> 217
<212> PRT
<213> 智人
<400> 8
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Val Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210 215
<210> 9
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH-CTP
<400> 9
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
210 215 220
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
225 230 235 240
Pro Ile Leu Pro Gln
245
<210> 10
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> hGH-CTP-CTP
<400> 10
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
210 215 220
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
225 230 235 240
Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260 265 270
Gln
<210> 11
<211> 301
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-hGH-CTP-CTP
<400> 11
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180 185 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260 265 270
Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
275 280 285
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
290 295 300
<210> 12
<211> 285
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 截短的-CTP-hGH-CTP-CTP
<400> 12
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
35 40 45
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
50 55 60
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
65 70 75 80
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
85 90 95
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
100 105 110
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
115 120 125
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
130 135 140
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
145 150 155 160
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
165 170 175
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
180 185 190
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
195 200 205
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
210 215 220
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
225 230 235 240
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
245 250 255
Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
260 265 270
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
275 280 285
<210> 13
<211> 273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-hGH-CTP
<400> 13
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180 185 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260 265 270
Gln
<210> 14
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GH-CTP
<400> 14
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180 185 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe
245
<210> 15
<211> 853
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-hGH-CTP
<400> 15
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg 60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct 120
gcccagcccc agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac 180
catccccctg agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct 240
ggcctttgac acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag 300
cttcctgcag aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa 360
cagagaggag acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat 420
ccagagctgg ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta 480
cggcgccagc gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac 540
cctgatgggc cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta 600
cagcaagttc gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct 660
gtactgcttc agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag 720
aagcgtggag ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc 780
ctccccaagc aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgcctcagt gatgaaggtc 840
tggatgcggc cgc 853
<210> 16
<211> 937
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-hGH-CTP-CTP
<400> 16
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg 60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct 120
gcccagcccc agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac 180
catccccctg agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct 240
ggcctttgac acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag 300
cttcctgcag aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa 360
cagagaggag acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat 420
ccagagctgg ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta 480
cggcgccagc gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac 540
cctgatgggc cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta 600
cagcaagttc gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct 660
gtactgcttc agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag 720
aagcgtggag ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc 780
ctccccaagc aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgccacaga gcagctcctc 840
taaggcccct cctccatccc tgccatcccc ctcccggctg cctggcccct ctgacacccc 900
tatcctgcct cagtgatgaa ggtctggatg cggccgc 937
<210> 17
<211> 889
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-hGH-CTP-CTP
<400> 17
tctagaggac atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg 60
cctgccatgg ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccgagcct 120
gcccttcccc accatccccc tgagcaggct gttcgacaac gccatgctga gggctcacag 180
gctgcaccag ctggcctttg acacctacca ggagttcgag gaagcctaca tccccaagga 240
gcagaagtac agcttcctgc agaaccccca gacctccctg tgcttcagcg agagcatccc 300
cacccccagc aacagagagg agacccagca gaagagcaac ctggagctgc tgaggatctc 360
cctgctgctg atccagagct ggctggagcc cgtgcagttc ctgagaagcg tgttcgccaa 420
cagcctggtg tacggcgcca gcgacagcaa cgtgtacgac ctgctgaagg acctggagga 480
gggcatccag accctgatgg gccggctgga ggacggcagc cccaggaccg gccagatctt 540
caagcagacc tacagcaagt tcgacaccaa cagccacaac gacgacgccc tgctgaagaa 600
ctacgggctg ctgtactgct tcagaaagga catggacaag gtggagacct tcctgaggat 660
cgtgcagtgc agaagcgtgg agggcagctg cggcttcagc tccagcagca aggcccctcc 720
cccgagcctg ccctccccaa gcaggctgcc tgggccctcc gacacaccaa tcctgccaca 780
gagcagctcc tctaaggccc ctcctccatc cctgccatcc ccctcccggc tgcctggccc 840
ctctgacacc cctatcctgc ctcagtgatg aaggtctgga tgcggccgc 889
<210> 18
<211> 37
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胃泌酸调节素
<400> 18
His Ser Gln Gly Thr Phe Thr Ser Asp Tyr Ser Lys Tyr Leu Asp Ser
1 5 10 15
Arg Arg Ala Gln Asp Phe Val Gln Trp Leu Met Asn Thr Lys Arg Asn
20 25 30
Arg Asn Asn Ile Ala
35
<210> 19
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPO肽
<400> 19
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
195 200 205
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
210 215 220
<210> 20
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPO-CTP-CTP
<400> 20
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
195 200 205
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser
210 215 220
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
225 230 235 240
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
245
<210> 21
<211> 277
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-EPO-CTP-CTP
<400> 21
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20 25 30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35 40 45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser
50 55 60
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile
65 70 75 80
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val
85 90 95
Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly
100 105 110
Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
115 120 125
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu
130 135 140
Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu
145 150 155 160
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro
165 170 175
Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr
180 185 190
Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu
195 200 205
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Ser Ser Ser
210 215 220
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
225 230 235 240
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
245 250 255
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
260 265 270
Pro Ile Leu Pro Gln
275
<210> 22
<211> 387
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPO-CTP
<400> 22
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
195 200 205
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro
210 215 220
Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala
225 230 235 240
Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu
245 250 255
Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp
260 265 270
Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu
275 280 285
Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn
290 295 300
Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val
305 310 315 320
Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln
325 330 335
Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg
340 345 350
Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn
355 360 365
Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr
370 375 380
Gly Asp Arg
385
<210> 23
<211> 221
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-EPO
<400> 23
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20 25 30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35 40 45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser
50 55 60
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile
65 70 75 80
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val
85 90 95
Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly
100 105 110
Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
115 120 125
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu
130 135 140
Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu
145 150 155 160
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro
165 170 175
Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr
180 185 190
Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu
195 200 205
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg
210 215 220
<210> 24
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-EPO-CTP
<400> 24
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20 25 30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35 40 45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser
50 55 60
Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile
65 70 75 80
Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val
85 90 95
Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly
100 105 110
Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala
115 120 125
Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu
130 135 140
Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu
145 150 155 160
Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro
165 170 175
Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr
180 185 190
Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu
195 200 205
Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Ser Ser Ser
210 215 220
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
225 230 235 240
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
245
<210> 25
<211> 193
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPO
<400> 25
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ala Pro Pro Arg Leu
20 25 30
Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu
35 40 45
Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu
50 55 60
Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg
65 70 75 80
Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu
85 90 95
Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser
100 105 110
Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly
115 120 125
Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu
130 135 140
Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile
145 150 155 160
Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu
165 170 175
Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp
180 185 190
Arg
<210> 26
<211> 873
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPO-CTP-CTP
<400> 26
tctagaggtc atcatggggg tgcacgaatg tcctgcctgg ctgtggcttc tcctgtccct 60
tctgtcgctc cctctgggcc tcccagtcct gggctcctct tcctcaaagg cccctccccc 120
gagccttcca agtccatccc gactcccggg gccctcggac accccaatat taccacaagc 180
cccaccacgc ctcatctgtg acagccgagt cctggagagg tacctcttgg aggccaagga 240
ggccgagaat atcacgacgg gctgtgctga acactgcagc ttgaatgaga atatcactgt 300
cccagacacc aaagttaatt tctatgcctg gaagaggatg gaggtcgggc agcaggccgt 360
agaagtctgg cagggcctgg ccctgctgtc ggaagctgtc ctgcggggcc aggccctgtt 420
ggtcaactct tcccagccgt gggagcccct gcagctgcat gtggataaag ccgtcagtgg 480
ccttcgcagc ctcaccactc tgcttcgggc tctgggagcc cagaaggaag ccatctcccc 540
tccagatgcg gcctcagctg ctccactccg aacaatcact gctgacactt tccgcaaact 600
cttccgagtc tactccaatt tcctccgggg aaagctgaag ctgtacacag gggaggcctg 660
caggacaggg gacagatcct cttcctcaaa ggcccctccc ccgagccttc caagtccatc 720
ccgactcccg gggccctccg acacaccaat cctgccacag agcagctcct ctaaggcccc 780
tcctccatcc ctgccatccc cctcccggct gcctggcccc tctgacaccc ctatcctgcc 840
tcagtgatga aggtcttctg gatccgcggc cgc 873
<210> 27
<211> 187
<212> PRT
<213> 智人
<400> 27
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
180 185
<210> 28
<211> 589
<212> DNA
<213> 智人
<400> 28
tctagaggac atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac 60
caccgccctg agcatgagct acaacctgct gggcttcctg cagaggtcca gcaacttcca 120
gtgccagaag ctgctgtggc agctgaacgg caggctggaa tactgcctga aggacaggat 180
gaacttcgac atcccagagg aaatcaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc 240
cctgaccatc tacgagatgc tgcagaacat cttcgccatc ttcaggcagg acagcagcag 300
caccggctgg aacgagacca tcgtggagaa cctgctggcc aacgtgtacc accagatcaa 360
ccacctgaaa accgtgctgg aagagaagct ggaaaaggag gacttcacca ggggcaagct 420
gatgagcagc ctgcacctga agaggtacta cggcagaatc ctgcactacc tgaaggccaa 480
ggagtacagc cactgcgcct ggaccatcgt gagggtggag atcctgagga acttctactt 540
catcaacagg ctgaccggct acctgaggaa ctgatgagtc cgcggccgc 589
<210> 29
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 干扰素
<400> 29
Thr Phe Leu Gln Pro Phe Glu Ala Phe Ala Leu Ala Gln Gln Val Val
1 5 10 15
Gly Asp Thr Val Arg Val Val Asn Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln
20 25 30
Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr
35 40 45
Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys
50 55 60
Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg
65 70 75 80
Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln
85 90 95
Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe
100 105 110
Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile
115 120 125
Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys
130 135 140
Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys
145 150 155 160
Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His
165 170 175
Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg
180 185 190
Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr
195 200 205
Leu Arg Asn
210
<210> 30
<211> 639
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 干扰素
<400> 30
acattctaac tgcaaccttt cgaagccttt gctctggcac aacaggtagt aggcgacact 60
gttcgtgttg tcaacatgac caacaagtgt ctcctccaaa ttgctctcct gttgtgcttc 120
tccactacag ctctttccat gagctacaac ttgcttggat tcctacaaag aagcagcaat 180
tttcagtgtc agaagctcct gtggcaattg aatgggaggc ttgaatactg cctcaaggac 240
aggatgaact ttgacatccc tgaggagatt aagcagctgc agcagttcca gaaggaggac 300
gccgcattga ccatctatga gatgctccag aacatctttg ctattttcag acaagattca 360
tctagcactg gctggaatga gactattgtt gagaacctcc tggctaatgt ctatcatcag 420
ataaaccatc tgaagacagt cctggaagaa aaactggaga aagaagattt caccagggga 480
aaactcatga gcagtctgca cctgaaaaga tattatggga ggattctgca ttacctgaag 540
gccaaggagt acagtcactg tgcctggacc atagtcagag tggaaatcct aaggaacttt 600
tacttcatta acagacttac aggttacctc cgaaactga 639
<210> 31
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-CTP
<400> 31
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Ser Ser Ser Ser Lys
180 185 190
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
195 200 205
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
210 215
<210> 32
<211> 661
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-CTP
<400> 32
tctagaggac atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac 60
caccgccctg agcatgagct acaacctgct gggcttcctg cagaggtcca gcaacttcca 120
gtgccagaag ctgctgtggc agctgaacgg caggctggaa tactgcctga aggacaggat 180
gaacttcgac atcccagagg aaatcaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc 240
cctgaccatc tacgagatgc tgcagaacat cttcgccatc ttcaggcagg acagcagcag 300
caccggctgg aacgagacca tcgtggagaa cctgctggcc aacgtgtacc accagatcaa 360
ccacctgaaa accgtgctgg aagagaagct ggaaaaggag gacttcacca ggggcaagct 420
gatgagcagc ctgcacctga agaggtacta cggcagaatc ctgcactacc tgaaggccaa 480
ggagtacagc cactgcgcct ggaccatcgt gagggtggag atcctgagga acttctactt 540
catcaacagg ctgaccggct acctgaggaa cagctccagc agcaaggccc ctccaccttc 600
cctgcccagt ccaagccgac tccctgggcc ctccgataca ccaattctgc cacagtgatg 660
a 661
<210> 33
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-CTP-CTP
<400> 33
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg
20 25 30
Ser Ser Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg
35 40 45
Leu Glu Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu
50 55 60
Ile Lys Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile
65 70 75 80
Tyr Glu Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser
85 90 95
Ser Thr Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val
100 105 110
Tyr His Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu
115 120 125
Lys Glu Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys
130 135 140
Arg Tyr Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser
145 150 155 160
His Cys Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr
165 170 175
Phe Ile Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Ser Ser Ser Ser Lys
180 185 190
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
195 200 205
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
210 215 220
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
225 230 235 240
Leu Pro Gln
<210> 34
<211> 765
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-CTP-CTP
<400> 34
tctagaggac atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac 60
caccgccctg agcatgagct acaacctgct gggcttcctg cagaggtcca gcaacttcca 120
gtgccagaag ctgctgtggc agctgaacgg caggctggaa tactgcctga aggacaggat 180
gaacttcgac atcccagagg aaatcaagca gctgcagcag ttccagaagg aggacgccgc 240
cctgaccatc tacgagatgc tgcagaacat cttcgccatc ttcaggcagg acagcagcag 300
caccggctgg aacgagacca tcgtggagaa cctgctggcc aacgtgtacc accagatcaa 360
ccacctgaaa accgtgctgg aagagaagct ggaaaaggag gacttcacca ggggcaagct 420
gatgagcagc ctgcacctga agaggtacta cggcagaatc ctgcactacc tgaaggccaa 480
ggagtacagc cactgcgcct ggaccatcgt gagggtggag atcctgagga acttctactt 540
catcaacagg ctgaccggct acctgaggaa cagctccagc agcaaggccc ctccaccttc 600
cctgcccagt ccaagccgac tccctgggcc ctccgacaca ccaatcctgc cacagagcag 660
ctcctctaag gcccctcctc catccctgcc atccccctcc cggctgcctg gcccctctga 720
cacccctatc ctgcctcagt gatgaaggtc tggatccgcg gccgc 765
<210> 35
<211> 271
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN-CTP-CTP
<400> 35
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
20 25 30
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
35 40 45
Gln Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe
50 55 60
Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys
65 70 75 80
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu
85 90 95
Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu
100 105 110
Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp
115 120 125
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile
130 135 140
Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe
145 150 155 160
Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly
165 170 175
Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp
180 185 190
Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg
195 200 205
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
210 215 220
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
225 230 235 240
Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser
245 250 255
Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
260 265 270
<210> 36
<211> 849
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN-CTP-CTP
<400> 36
tctagaggac atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac 60
caccgccctg agcagcagca gctccaaggc cccacccccc agcctgccca gccccagcag 120
actgccaggc cccagcgaca cccccatcct gccccagatg agctacaacc tgctgggctt 180
cctgcagagg tccagcaact tccagtgcca gaagctgctg tggcagctga acggcaggct 240
ggaatactgc ctgaaggaca ggatgaactt cgacatccca gaggaaatca agcagctgca 300
gcagttccag aaggaggacg ccgccctgac catctacgag atgctgcaga acatcttcgc 360
catcttcagg caggacagca gcagcaccgg ctggaacgag accatcgtgg agaacctgct 420
ggccaacgtg taccaccaga tcaaccacct gaaaaccgtg ctggaagaga agctggaaaa 480
ggaggacttc accaggggca agctgatgag cagcctgcac ctgaagaggt actacggcag 540
aatcctgcac tacctgaagg ccaaggagta cagccactgc gcctggacca tcgtgagggt 600
ggagatcctg aggaacttct acttcatcaa caggctgacc ggctacctga ggaacagctc 660
cagcagcaag gcccctccac cttccctgcc cagtccaagc cgactccctg ggccctccga 720
cacaccaatc ctgccacaga gcagctcctc taaggcccct cctccatccc tgccatcccc 780
ctcccggctg cctggcccct ctgacacccc tatcctgcct cagtgatgaa ggtctggatc 840
cgcggccgc 849
<210> 37
<211> 409
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN(CTP)
<400> 37
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
20 25 30
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
35 40 45
Gln Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe
50 55 60
Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys
65 70 75 80
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu
85 90 95
Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu
100 105 110
Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp
115 120 125
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile
130 135 140
Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe
145 150 155 160
Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly
165 170 175
Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp
180 185 190
Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg
195 200 205
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
210 215 220
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
225 230 235 240
Leu Pro Gln Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser
245 250 255
Asn Phe Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu
260 265 270
Tyr Cys Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys
275 280 285
Gln Leu Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu
290 295 300
Met Leu Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr
305 310 315 320
Gly Trp Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His
325 330 335
Gln Ile Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu
340 345 350
Asp Phe Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr
355 360 365
Tyr Gly Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys
370 375 380
Ala Trp Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile
385 390 395 400
Asn Arg Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
405
<210> 38
<211> 1261
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN(CTP)
<400> 38
tctagaggac atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac 60
caccgccctg agcagcagca gctccaaggc cccacccccc agcctgccca gccccagcag 120
gctgccaggc cccagcgaca cccccatcct gccccagatg agctacaacc tgctgggctt 180
cctgcagagg tccagcaact tccagtgcca gaaactgctg tggcagctga acggcaggct 240
ggaatactgc ctgaaggacc ggatgaactt cgacatcccc gaagagatca agcagctgca 300
gcagttccag aaagaggacg ccgccctgac catctacgag atgctgcaga acatcttcgc 360
catcttcagg caggacagca gcagcaccgg ctggaacgag accatcgtgg agaacctgct 420
ggccaacgtg taccaccaga tcaaccacct gaaaaccgtg ctggaagaga agctggaaaa 480
agaggacttc accaggggca agctgatgag cagcctgcac ctgaagaggt actacggcag 540
aatcctgcac tacctgaagg ccaaagagta cagccactgc gcctggacca tcgtgagggt 600
ggagatcctg cggaacttct acttcatcaa caggctgacc ggctacctga ggaacagctc 660
cagcagcaag gcccctccac cctccctgcc ctccccaagc agactgcccg gaccctccga 720
cacaccaatt ctgccacaga tgtcctacaa tctgctcgga tttctgcagc gctcctccaa 780
ctttcagtgt cagaagctcc tctggcagct caatggccgc ctggaatatt gtctgaaaga 840
cagaatgaat tttgacatcc cagaggaaat taaacagctc cagcagtttc agaaagaaga 900
tgctgctctc acaatctatg aaatgctcca gaatatcttt gcaatctttc gccaggacag 960
ctcctccacc gggtggaatg agacaattgt cgagaatctg ctcgccaatg tctatcatca 1020
gatcaatcac ctcaagacag tcctcgaaga aaaactcgaa aaagaagatt tcacacgcgg 1080
caaactgatg tcctccctgc atctgaagcg ctactatggg cgcatcctgc attatctgaa 1140
agctaaagaa tactcccact gtgcttggac aattgtgcgc gtcgagatcc tgagaaactt 1200
ttatttcatt aaccgcctga caggatacct gcgcaactga tgaaggtctg gatgcggccg 1260
c 1261
<210> 39
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN
<400> 39
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
20 25 30
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
35 40 45
Gln Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe
50 55 60
Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys
65 70 75 80
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu
85 90 95
Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu
100 105 110
Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp
115 120 125
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile
130 135 140
Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe
145 150 155 160
Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly
165 170 175
Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp
180 185 190
Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg
195 200 205
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
210 215
<210> 40
<211> 673
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN
<400> 40
tctagaggac atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac 60
caccgccctg agcagcagca gctccaaggc cccacccccc agcctgccca gccccagcag 120
gctgccaggc cccagcgaca cccccatcct gccccagatg agctacaacc tgctgggctt 180
cctgcagagg tccagcaact tccagtgcca gaaactgctg tggcagctga acggcaggct 240
ggaatactgc ctgaaggacc ggatgaactt cgacatcccc gaagagatca agcagctgca 300
gcagttccag aaagaggacg ccgccctgac catctacgag atgctgcaga acatcttcgc 360
catcttcagg caggacagca gcagcaccgg ctggaacgag accatcgtgg agaacctgct 420
ggccaacgtg taccaccaga tcaaccacct gaaaaccgtg ctggaagaga agctggaaaa 480
agaggacttc accaggggca agctgatgag cagcctgcac ctgaagaggt actacggcag 540
aatcctgcac tacctgaagg ccaaagagta cagccactgc gcctggacca tcgtgagggt 600
ggagatcctg cggaacttct acttcatcaa caggctgacc ggctacctga ggaactgatg 660
agtccgcggc cgc 673
<210> 41
<211> 243
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN-CTP
<400> 41
Met Thr Asn Lys Cys Leu Leu Gln Ile Ala Leu Leu Leu Cys Phe Ser
1 5 10 15
Thr Thr Ala Leu Ser Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
20 25 30
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
35 40 45
Gln Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe
50 55 60
Gln Cys Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys
65 70 75 80
Leu Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu
85 90 95
Gln Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu
100 105 110
Gln Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp
115 120 125
Asn Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile
130 135 140
Asn His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe
145 150 155 160
Thr Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly
165 170 175
Arg Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp
180 185 190
Thr Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg
195 200 205
Leu Thr Gly Tyr Leu Arg Asn Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
210 215 220
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
225 230 235 240
Leu Pro Gln
<210> 42
<211> 763
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-IFN-CTP
<400> 42
tctagaggac atgaccaaca agtgcctgct gcagatcgcc ctgctgctgt gcttcagcac 60
caccgccctg agcagcagca gctccaaggc cccacccccc agcctgccca gccccagcag 120
actgccaggc cccagcgaca cccccatcct gccccagatg agctacaacc tgctgggctt 180
cctgcagagg tccagcaact tccagtgcca gaagctgctg tggcagctga acggcaggct 240
ggaatactgc ctgaaggaca ggatgaactt cgacatccca gaggaaatca agcagctgca 300
gcagttccag aaggaggacg ccgccctgac catctacgag atgctgcaga acatcttcgc 360
catcttcagg caggacagca gcagcaccgg ctggaacgag accatcgtgg agaacctgct 420
ggccaacgtg taccaccaga tcaaccacct gaaaaccgtg ctggaagaga agctggaaaa 480
ggaggacttc accaggggca agctgatgag cagcctgcac ctgaagaggt actacggcag 540
aatcctgcac tacctgaagg ccaaggagta cagccactgc gcctggacca tcgtgagggt 600
ggagatcctg aggaacttct acttcatcaa caggctgacc ggctacctga ggaacagctc 660
cagcagcaag gcccctccac cttccctgcc cagtccaagc cgactccctg ggccctccga 720
tacaccaatt ctgccacagt gatgaaggtc tggatgcggc cgc 763
<210> 43
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IFN-β
<400> 43
Met Ser Tyr Asn Leu Leu Gly Phe Leu Gln Arg Ser Ser Asn Phe Gln
1 5 10 15
Ser Gln Lys Leu Leu Trp Gln Leu Asn Gly Arg Leu Glu Tyr Cys Leu
20 25 30
Lys Asp Arg Met Asn Phe Asp Ile Pro Glu Glu Ile Lys Gln Leu Gln
35 40 45
Gln Phe Gln Lys Glu Asp Ala Ala Leu Thr Ile Tyr Glu Met Leu Gln
50 55 60
Asn Ile Phe Ala Ile Phe Arg Gln Asp Ser Ser Ser Thr Gly Trp Asn
65 70 75 80
Glu Thr Ile Val Glu Asn Leu Leu Ala Asn Val Tyr His Gln Ile Asn
85 90 95
His Leu Lys Thr Val Leu Glu Glu Lys Leu Glu Lys Glu Asp Phe Thr
100 105 110
Arg Gly Lys Leu Met Ser Ser Leu His Leu Lys Arg Tyr Tyr Gly Arg
115 120 125
Ile Leu His Tyr Leu Lys Ala Lys Glu Tyr Ser His Cys Ala Trp Thr
130 135 140
Ile Val Arg Val Glu Ile Leu Arg Asn Phe Tyr Phe Ile Asn Arg Leu
145 150 155 160
Thr Gly Tyr Leu Arg Asn
165
<210> 44
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> APO-A1
<400> 44
Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp Asp Arg Val Lys Asp Lys Ala Thr
1 5 10 15
Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln
20 25 30
Phe Glu Gly Ser Ala Gly Lys Gly Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn
35 40 45
Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly
50 55 60
Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly
65 70 75 80
Leu Arg Gly Glu Met Ser Lys Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val
85 90 95
Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu
100 105 110
Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly
115 120 125
Ala Arg Gln Lys Leu His Glu Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly
130 135 140
Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr
145 150 155 160
His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg
165 170 175
Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His
180 185 190
Ala Lys Ala Thr Glu His Leu Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro
195 200 205
Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe
210 215 220
Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn
225 230 235 240
Thr Gln
<210> 45
<211> 444
<212> PRT
<213> 智人
<400> 45
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro
435 440
<210> 46
<211> 448
<212> PRT
<213> 智人
<400> 46
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Cys Gly Arg
435 440 445
<210> 47
<211> 1356
<212> DNA
<213> 智人
<400> 47
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacg 1200
ggcatcgtca gctggggcca gggctgcgca accgtgggcc actttggggt gtacaccagg 1260
gtctcccagt acatcgagtg gctgcaaaag ctcatgcgct cagagccacg cccaggagtc 1320
ctcctgcgag ccccatttcc ctgaggatgc ggccgc 1356
<210> 48
<211> 1442
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VII-CTP
<400> 48
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380
cctagcagac tgcctgggcc cagcgacacc cccatcctgc cccagtgagg atccgcggcc 1440
gc 1442
<210> 49
<211> 472
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VII-CTP
<400> 49
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro
450 455 460
Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
465 470
<210> 50
<211> 1535
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VII-CTP-CTP
<400> 50
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
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gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
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cctagcagac tgcctgggcc ctccgacaca ccaatcctgc cacagagcag ctcctctaag 1440
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ctgcctcagt gatgaaggtc tggatccgcg gccgc 1535
<210> 51
<211> 500
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VII-CTP-CTP
<400> 51
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
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Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
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Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
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Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
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Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
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500
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VII-CTP-CTP-CTP
<400> 52
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
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Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
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Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
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Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
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Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
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275 280 285
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VII-CTP-CTP-CTP-CTP
<400> 53
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1 5 10 15
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子VII-CTP-CTP-CTP-CTP
<400> 54
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1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
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65 70 75 80
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100 105 110
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115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
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165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
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275 280 285
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290 295 300
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385 390 395 400
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Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
485 490 495
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<212> DNA
<213> 智人
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atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg 840
tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc 900
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ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt tgcattgctg 1020
acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa 1080
gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttctccagta ccttagagtt ccacttgttg 1140
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gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc catgttactg 1260
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aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa 1380
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<400> 56
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130 135 140
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145 150 155 160
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165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
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195 200 205
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225 230 235 240
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245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
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290 295 300
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305 310 315 320
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340 345 350
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355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
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435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 57
<211> 1502
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 因子IX-CTP
<400> 57
gcgatcgcca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat caccaggcct catcaccatc 60
tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacagttt ttcttgatca tgaaaacgcc 120
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tttgaaaaca ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt 300
gagtccaatc catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt 360
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aatggcagat gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt 480
actgagggat atcgacttgc agaaaaccag aagtcctgtg aaccagcagt gccatttcca 540
tgtggaagag tttctgtttc acaaacttct aagctcaccc gtgctgagac tgtttttcct 600
gatgtggact atgtaaattc tactgaagct gaaaccattt tggataacat cactcaaagc 660
acccaatcat ttaatgactt cactcgagtt gttggtggag aagatgccaa accaggtcaa 720
ttcccttggc aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt 780
aatgaaaaat ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt 840
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cttctggaac tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct 1020
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cttctggaac tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct 1020
acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa 1080
gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg 1140
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485 490 495
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515 520 525
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530 535 540
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gacttgcggc agaagtgcac ggagtctcac acgggcacct cagcctctgc ccccttagca 1140
gccggcatca ttgctctcac cctggaggcc aataagaacc tcacatggcg ggacatgcaa 1200
cacctggtgg tacagacctc gaagccagcc cacctcaatg ccaacgactg ggccaccaat 1260
ggtgtgggcc ggaaagtgag ccactcatat ggctacgggc ttttggacgc aggcgccatg 1320
gtggccctgg cccagaattg gaccacagtg gccccccagc ggaagtgcat catcgacatc 1380
ctcaccgagc ccaaagacat cgggaaacgg ctcgaggtgc ggaagaccgt gaccgcgtgc 1440
ctgggcgagc ccaaccacat cactcggctg gagcacgctc aggcgcggct caccctgtcc 1500
tataatcgcc gtggcgacct ggccatccac ctggtcagcc ccatgggcac ccgctccacc 1560
ctgctggcag ccaggccaca tgactactcc gcagatgggt ttaatgactg ggccttcatg 1620
acaactcatt cctgggatga ggatccctct ggcgagtggg tcctagagat tgaaaacacc 1680
agcgaagcca acaactatgg gacgctgacc aagttcaccc tcgtactcta tggcaccgcc 1740
cctgaggggc tgcccgtacc tccagaaagc agtggctgca agaccctcac gtccagtcag 1800
gcctgtgtgg tgtgcgagga aggcttctcc ctgcaccaga agagctgtgt ccagcactgc 1860
cctccaggct tcgcccccca agtcctcgat acgcactata gcaccgagaa tgacgtggag 1920
accatccggg ccagcgtctg cgccccctgc cacgcctcat gtgccacatg ccaggggccg 1980
gccctgacag actgcctcag ctgccccagc cacgcctcct tggaccctgt ggagcagact 2040
tgctcccggc aaagccagag cagccgagag tccccgccac agcagcagcc acctcggctg 2100
cccccggagg tggaggcggg gcaacggctg cgggcagggc tgctgccctc acacctgcct 2160
gaggtggtgg ccggcctcag ctgcgccttc atcgtgctgg tcttcgtcac tgtcttcctg 2220
gtcctgcagc tgcgctctgg ctttagtttt cggggggtga aggtgtacac catggaccgt 2280
ggcctcatct cctacaaggg gctgccccct gaagcctggc aggaggagtg cccgtctgac 2340
tcagaagagg acgagggccg gggcgagagg accgccttta tcaaagacca gagcgccctc 2400
tgaacgcggc cgc 2413
<210> 65
<211> 794
<212> PRT
<213> 智人
<400> 65
Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn
20 25 30
Thr Trp Ala Val Arg Ile Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val
35 40 45
Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe Gly Asp Tyr
50 55 60
Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His
65 70 75 80
Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gln Arg Glu Pro Gln Val Gln Trp Leu
85 90 95
Glu Gln Gln Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val Tyr Gln Glu
100 105 110
Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gln Gln Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr
115 120 125
Gln Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gln Gly Tyr Thr Gly
130 135 140
His Gly Ile Val Val Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Lys Asn His
145 150 155 160
Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn
165 170 175
Asp Gln Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr Gln Met Asn Asp Asn
180 185 190
Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn Asn
195 200 205
Gly Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asn Ala Arg Ile Gly Gly Val
210 215 220
Arg Met Leu Asp Gly Glu Val Thr Asp Ala Val Glu Ala Arg Ser Leu
225 230 235 240
Gly Leu Asn Pro Asn His Ile His Ile Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro
245 250 255
Glu Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Glu Glu
260 265 270
Ala Phe Phe Arg Gly Val Ser Gln Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ser Ile
275 280 285
Phe Val Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Arg Glu His Asp Ser Cys Asn
290 295 300
Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile Ser Ser Ala
305 310 315 320
Thr Gln Phe Gly Asn Val Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys Ser Ser Thr
325 330 335
Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Gln Asn Glu Lys Gln Ile Val
340 345 350
Thr Thr Asp Leu Arg Gln Lys Cys Thr Glu Ser His Thr Gly Thr Ser
355 360 365
Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Ile Ile Ala Leu Thr Leu Glu Ala
370 375 380
Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His Leu Val Val Gln Thr
385 390 395 400
Ser Lys Pro Ala His Leu Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr Asn Gly Val
405 410 415
Gly Arg Lys Val Ser His Ser Tyr Gly Tyr Gly Leu Leu Asp Ala Gly
420 425 430
Ala Met Val Ala Leu Ala Gln Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gln Arg
435 440 445
Lys Cys Ile Ile Asp Ile Leu Thr Glu Pro Lys Asp Ile Gly Lys Arg
450 455 460
Leu Glu Val Arg Lys Thr Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu Pro Asn His
465 470 475 480
Ile Thr Arg Leu Glu His Ala Gln Ala Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ile His Leu Val Ser Pro Met Gly Thr Arg
500 505 510
Ser Thr Leu Leu Ala Ala Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala Asp Gly Phe
515 520 525
Asn Asp Trp Ala Phe Met Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser
530 535 540
Gly Glu Trp Val Leu Glu Ile Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr
545 550 555 560
Gly Thr Leu Thr Lys Phe Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu
565 570 575
Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser
580 585 590
Ser Gln Ala Cys Val Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu His Gln Lys
595 600 605
Ser Cys Val Gln His Cys Pro Pro Gly Phe Ala Pro Gln Val Leu Asp
610 615 620
Thr His Tyr Ser Thr Glu Asn Asp Val Glu Thr Ile Arg Ala Ser Val
625 630 635 640
Cys Ala Pro Cys His Ala Ser Cys Ala Thr Cys Gln Gly Pro Ala Leu
645 650 655
Thr Asp Cys Leu Ser Cys Pro Ser His Ala Ser Leu Asp Pro Val Glu
660 665 670
Gln Thr Cys Ser Arg Gln Ser Gln Ser Ser Arg Glu Ser Pro Pro Gln
675 680 685
Gln Gln Pro Pro Arg Leu Pro Pro Glu Val Glu Ala Gly Gln Arg Leu
690 695 700
Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ser His Leu Pro Glu Val Val Ala Gly Leu
705 710 715 720
Ser Cys Ala Phe Ile Val Leu Val Phe Val Thr Val Phe Leu Val Leu
725 730 735
Gln Leu Arg Ser Gly Phe Ser Phe Arg Gly Val Lys Val Tyr Thr Met
740 745 750
Asp Arg Gly Leu Ile Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Pro Glu Ala Trp Gln
755 760 765
Glu Glu Cys Pro Ser Asp Ser Glu Glu Asp Glu Gly Arg Gly Glu Arg
770 775 780
Thr Ala Phe Ile Lys Asp Gln Ser Ala Leu
785 790
<210> 66
<211> 249
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-CTP-EPO
<400> 66
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20 25 30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35 40 45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
50 55 60
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
65 70 75 80
Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu
85 90 95
Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys
100 105 110
Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys
115 120 125
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val
130 135 140
Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly
145 150 155 160
Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu
165 170 175
His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala
195 200 205
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu
210 215 220
Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr
225 230 235 240
Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg
245
<210> 67
<211> 762
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-CTP-EPO
<400> 67
atgggcgtgc acgagtgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgagcctgct gtccctgcct 60
ctgggcctgc ctgtgctggg cagcagcagc tctaaggccc ctccacccag cctgcccagc 120
ccttctagac tgcctggccc cagcgacacc cccatcctgc ctcagagcag cagcagcaag 180
gccccaccac catccctgcc tagccccagc agactgccag gcccttccga taccccaatc 240
ctgccccagg cccctcccag actgatctgc gacagccggg tgctggaaag atacctgctg 300
gaagccaaag aggccgagaa catcaccacc ggctgcgccg agcactgcag cctgaacgag 360
aatatcaccg tgcccgacac caaagtgaac ttctacgcct ggaagcggat ggaagtgggc 420
cagcaggccg tggaagtgtg gcagggactg gccctgctga gcgaggccgt gctgagagga 480
caggccctgc tggtgaacag cagccagccc tgggagcccc tgcagctgca tgtggataag 540
gccgtgtccg gcctgcggag cctgaccaca ctgctgagag ccctgggcgc tcagaaagag 600
gccatctctc cccctgatgc cgcctctgcc gcccctctga gaaccatcac cgccgacacc 660
ttccggaagc tgttccgggt gtacagcaac ttcctgcggg gcaagctgaa gctgtacacc 720
ggcgaggcct gccggaccgg cgatagataa gcttggcgcg cc 762
<210> 68
<211> 305
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-CTP-EPO-CTP-CTP
<400> 68
Met Gly Val His Glu Cys Pro Ala Trp Leu Trp Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Leu Ser Leu Pro Leu Gly Leu Pro Val Leu Gly Ser Ser Ser Ser Lys
20 25 30
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
35 40 45
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
50 55 60
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
65 70 75 80
Leu Pro Gln Ala Pro Pro Arg Leu Ile Cys Asp Ser Arg Val Leu Glu
85 90 95
Arg Tyr Leu Leu Glu Ala Lys Glu Ala Glu Asn Ile Thr Thr Gly Cys
100 105 110
Ala Glu His Cys Ser Leu Asn Glu Asn Ile Thr Val Pro Asp Thr Lys
115 120 125
Val Asn Phe Tyr Ala Trp Lys Arg Met Glu Val Gly Gln Gln Ala Val
130 135 140
Glu Val Trp Gln Gly Leu Ala Leu Leu Ser Glu Ala Val Leu Arg Gly
145 150 155 160
Gln Ala Leu Leu Val Asn Ser Ser Gln Pro Trp Glu Pro Leu Gln Leu
165 170 175
His Val Asp Lys Ala Val Ser Gly Leu Arg Ser Leu Thr Thr Leu Leu
180 185 190
Arg Ala Leu Gly Ala Gln Lys Glu Ala Ile Ser Pro Pro Asp Ala Ala
195 200 205
Ser Ala Ala Pro Leu Arg Thr Ile Thr Ala Asp Thr Phe Arg Lys Leu
210 215 220
Phe Arg Val Tyr Ser Asn Phe Leu Arg Gly Lys Leu Lys Leu Tyr Thr
225 230 235 240
Gly Glu Ala Cys Arg Thr Gly Asp Arg Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
245 250 255
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
260 265 270
Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
275 280 285
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
290 295 300
Gln
305
<210> 69
<211> 930
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> CTP-CTP-EPO-CTP-CTP
<400> 69
atgggcgtgc acgagtgtcc tgcttggctg tggctgctgc tgagcctgct gtccctgcct 60
ctgggcctgc ctgtgctggg cagcagcagc tctaaggccc ctccacccag cctgcccagc 120
ccttctagac tgcctggccc cagcgacacc cccatcctgc ctcagagcag cagcagcaag 180
gccccaccac catccctgcc tagccccagc agactgccag gcccttccga taccccaatc 240
ctgccccagg cccctcccag actgatctgc gacagccggg tgctggaaag atacctgctg 300
gaagccaaag aggccgagaa catcaccacc ggctgcgccg agcactgcag cctgaacgag 360
aatatcaccg tgcccgacac caaagtgaac ttctacgcct ggaagcggat ggaagtgggc 420
cagcaggccg tggaagtgtg gcagggactg gccctgctga gcgaggccgt gctgagagga 480
caggccctgc tggtgaacag cagccagccc tgggagcccc tgcagctgca tgtggataag 540
gccgtgtccg gcctgcggag cctgaccaca ctgctgagag ccctgggcgc tcagaaagag 600
gccatctctc cccctgatgc cgcctctgcc gcccctctga gaaccatcac cgccgacacc 660
ttccggaagc tgttccgggt gtacagcaac ttcctgcggg gcaagctgaa gctgtacacc 720
ggcgaggcct gccggaccgg cgatagaagc agctccagca aggctccacc ccccagcctg 780
ccatccccaa gtagactgcc cgggccctct gacacaccta tcctgccaca gtccagcagc 840
tccaaagctc ccccaccatc cctcccatcc ccatccagac tgcctggacc atccgacact 900
ccaattctgc ctcagtaagc ttggcgcgcc 930
<210> 70
<211> 295
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> APO-A1-CTP
<400> 70
Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser
1 5 10 15
Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp
20 25 30
Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp
35 40 45
Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys
50 55 60
Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr
65 70 75 80
Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp
85 90 95
Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys
100 105 110
Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe
115 120 125
Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu
130 135 140
Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu
145 150 155 160
Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala
165 170 175
Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp
180 185 190
Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn
195 200 205
Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu
210 215 220
Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln
225 230 235 240
Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala
245 250 255
Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln Ser Ser Ser Ser Lys
260 265 270
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
275 280 285
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
290 295
<210> 71
<211> 911
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APO-A1-CTP
<400> 71
atgaaggccg ccgtgctgac cctggccgtg ctgtttctga ccggctctca ggcccggcac 60
ttctggcagc aggacgagcc tccccagtcc ccctgggaca gagtgaagga cctggccacc 120
gtgtacgtgg acgtgctgaa ggactccggc agagactacg tgtcccagtt cgagggctct 180
gccctgggca agcagctgaa cctgaagctg ctggacaact gggactccgt gacctccacc 240
ttctccaagc tgcgcgaaca gctgggacct gtgacccagg aattctggga caacctggaa 300
aaagagacag agggcctgag acaggaaatg tccaaggacc tggaagaggt caaagccaag 360
gtgcagccct acctggacga cttccagaag aaatggcagg aagagatgga actgtaccgg 420
cagaaggtgg aacccctgcg ggccgagctg caggaaggcg ctagacagaa gctgcacgaa 480
ctgcaggaaa agctgtcccc cctgggcgag gaaatgcggg acagagccag agcccacgtg 540
gacgccctga gaacccacct ggccccctac tctgacgagc tgcggcagag gctggccgcc 600
agactggaag ccctgaaaga gaacggcgga gcccggctgg ccgagtacca cgctaaggct 660
accgagcacc tgtccaccct gtccgagaag gccaagcccg ccctggaaga tctgcggcag 720
ggcctgctgc ccgtgctgga atccttcaag gtgtccttcc tgtccgctct ggaagagtac 780
accaagaagc tgaacaccca gtcctccagc tccaaggccc ctccaccctc cctgcctagc 840
cctagtagac tgcctgggcc ctccgacacc cccatcctgc cccagtgatg aggatccgcg 900
gccgcgagct c 911
<210> 72
<211> 323
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> APO-A1-CTP-CTP
<400> 72
Met Lys Ala Ala Val Leu Thr Leu Ala Val Leu Phe Leu Thr Gly Ser
1 5 10 15
Gln Ala Arg His Phe Trp Gln Gln Asp Glu Pro Pro Gln Ser Pro Trp
20 25 30
Asp Arg Val Lys Asp Leu Ala Thr Val Tyr Val Asp Val Leu Lys Asp
35 40 45
Ser Gly Arg Asp Tyr Val Ser Gln Phe Glu Gly Ser Ala Leu Gly Lys
50 55 60
Gln Leu Asn Leu Lys Leu Leu Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr
65 70 75 80
Phe Ser Lys Leu Arg Glu Gln Leu Gly Pro Val Thr Gln Glu Phe Trp
85 90 95
Asp Asn Leu Glu Lys Glu Thr Glu Gly Leu Arg Gln Glu Met Ser Lys
100 105 110
Asp Leu Glu Glu Val Lys Ala Lys Val Gln Pro Tyr Leu Asp Asp Phe
115 120 125
Gln Lys Lys Trp Gln Glu Glu Met Glu Leu Tyr Arg Gln Lys Val Glu
130 135 140
Pro Leu Arg Ala Glu Leu Gln Glu Gly Ala Arg Gln Lys Leu His Glu
145 150 155 160
Leu Gln Glu Lys Leu Ser Pro Leu Gly Glu Glu Met Arg Asp Arg Ala
165 170 175
Arg Ala His Val Asp Ala Leu Arg Thr His Leu Ala Pro Tyr Ser Asp
180 185 190
Glu Leu Arg Gln Arg Leu Ala Ala Arg Leu Glu Ala Leu Lys Glu Asn
195 200 205
Gly Gly Ala Arg Leu Ala Glu Tyr His Ala Lys Ala Thr Glu His Leu
210 215 220
Ser Thr Leu Ser Glu Lys Ala Lys Pro Ala Leu Glu Asp Leu Arg Gln
225 230 235 240
Gly Leu Leu Pro Val Leu Glu Ser Phe Lys Val Ser Phe Leu Ser Ala
245 250 255
Leu Glu Glu Tyr Thr Lys Lys Leu Asn Thr Gln Ser Ser Ser Ser Lys
260 265 270
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
275 280 285
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
290 295 300
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
305 310 315 320
Leu Pro Gln
<210> 73
<211> 995
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> APO-A1-CTP-CTP
<400> 73
atgaaggccg ccgtgctgac cctggccgtg ctgtttctga ccggctctca ggcccggcac 60
ttctggcagc aggacgagcc tccccagtcc ccctgggaca gagtgaagga cctggccacc 120
gtgtacgtgg acgtgctgaa ggactccggc agagactacg tgtcccagtt cgagggctct 180
gccctgggca agcagctgaa cctgaagctg ctggacaact gggactccgt gacctccacc 240
ttctccaagc tgcgcgaaca gctgggacct gtgacccagg aattctggga caacctggaa 300
aaagagacag agggcctgag acaggaaatg tccaaggacc tggaagaggt caaagccaag 360
gtgcagccct acctggacga cttccagaag aaatggcagg aagagatgga actgtaccgg 420
cagaaggtgg aacccctgcg ggccgagctg caggaaggcg ctagacagaa gctgcacgaa 480
ctgcaggaaa agctgtcccc cctgggcgag gaaatgcggg acagagccag agcccacgtg 540
gacgccctga gaacccacct ggccccctac tctgacgagc tgcggcagag gctggccgcc 600
agactggaag ccctgaaaga gaacggcgga gcccggctgg ccgagtacca cgctaaggct 660
accgagcacc tgtccaccct gtccgagaag gccaagcccg ccctggaaga tctgcggcag 720
ggcctgctgc ccgtgctgga atccttcaag gtgtccttcc tgtccgctct ggaagagtac 780
accaagaagc tgaacaccca gtcctccagc tccaaggccc ctccaccctc cctgcctagc 840
cctagtagac tgcctgggcc ctccgacaca ccaatcctgc cacagagcag ctcctctaag 900
gcccctcctc catccctgcc atccccctcc cggctgcctg gcccctctga cacccctatc 960
ctgcctcagt gatgaaggtc tggatccgcg gccgc 995

Claims (16)

1.一种增加重组人生长激素(hGH)多肽的流体动力学尺寸或流体动力学体积的方法，所述方法包括：
(a)将1个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)单元重组连接至所述hGH的氨基末端，且将2个CTP单元重组连接至所述hGH的羧基末端；和
(b)在宿主细胞中表达所述重组CTP修饰的多肽，其中表达包括糖基化所述CTP单元；
其中所述CTP修饰的多肽可选地包括连接至所述CTP修饰的多肽的氨基末端的信号肽，且
其中所述糖基化的CTP单元递增地增加所述hGH的流体动力学尺寸，每个所述糖基化的CTP单元递增约28-53kDa。
2.根据权利要求1所述的方法，其中编码所述hGH的DNA连接至编码CTP肽的DNA序列。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述编码所述hGH的DNA编码SEQ ID NO:5至SEQ IDNO:8中任一项的氨基酸序列。
4.根据权利要求1-3中的任一项所述的方法，其中所述CTP单元中的至少一个的氨基酸序列选自由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成的组。
5.根据权利要求1-4中的任一项所述的方法，其中所述CTP单元中的至少一个的氨基酸序列被截短，且包括SEQ ID NO:3的前10个氨基酸(SSSSKAPPPS)。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述CTP修饰的多肽包括前体CTP修饰的hGH，其中所述氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述CTP修饰的多肽包括成熟CTP修饰的hGH，其中所述氨基酸序列如SEQ ID NO:11的氨基酸27-301所示。
8.根据权利要求1-7中的任一项所述的方法，其中所述糖基化是O-糖基化。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述O-糖基化是通过α-糖苷键连接至蛋白链中的丝氨酸(Ser)或苏氨酸(Thr)的GalNAc。
10.根据权利要求8-9中的任一项所述的方法，其中所述O-糖基化是核心1糖基化、O-岩藻糖基化、O-甘露糖基化或O-糖基化。
11.根据权利要求8-10中的任一项所述的方法，其中所述O-糖基化之后添加1-60个半乳糖分子；或者所述O-糖基化之后添加1-120个唾液酸分子；或者它们的组合。
12.根据权利要求1-11中的任一项所述的方法，其中增加所述流体动力学尺寸或体积增加所述多肽的生物利用度。
13.根据权利要求1-12中的任一项所述的方法，其中所述CTP单元中的至少一个经由接头连接至所述多肽，且所述接头是肽键。
14.根据权利要求1-13中的任一项所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。
15.一种增加多肽的表观分子量的方法，所述方法包括下述步骤：根据权利要求1-14中的任一项增加流体动力学体积。
16.一种增加多肽的血清半衰期的方法，所述方法通过根据权利要求1-14中的任一项的包括增加所述多肽的流体动力学体积的方法进行。
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