ES2665319T3 - Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para producir los mismos - Google Patents
Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para producir los mismos Download PDFInfo
- Publication number
- ES2665319T3 ES2665319T3 ES13749077.7T ES13749077T ES2665319T3 ES 2665319 T3 ES2665319 T3 ES 2665319T3 ES 13749077 T ES13749077 T ES 13749077T ES 2665319 T3 ES2665319 T3 ES 2665319T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- ctp
- fix
- coagulation factor
- fvii
- modified
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 title claims abstract description 329
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 title claims abstract description 327
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 327
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 80
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims abstract description 342
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims abstract description 327
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims abstract description 319
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 246
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 229
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 171
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims abstract description 161
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims abstract description 111
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims abstract description 107
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims abstract description 102
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 claims abstract description 95
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 claims abstract description 93
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims abstract description 22
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 claims abstract description 21
- 101710128947 Tricarboxylate transport protein, mitochondrial Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 9
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 54
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 50
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 49
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 46
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 43
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 43
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 43
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 35
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 34
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims description 21
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 claims description 16
- 238000005304 joining Methods 0.000 claims description 15
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 claims description 14
- 230000035602 clotting Effects 0.000 claims description 13
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 13
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 13
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 13
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 claims description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 9
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 8
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 3
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 375
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 375
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 363
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 156
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 75
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 75
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 74
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 71
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 66
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 65
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 63
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 61
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 57
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 57
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 44
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 42
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 36
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 33
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 32
- 108010048049 Factor IXa Proteins 0.000 description 30
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 29
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 28
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 28
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 28
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 28
- 239000000047 product Substances 0.000 description 27
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 24
- 229940031422 benefix Drugs 0.000 description 23
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 22
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 22
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 21
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 20
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 20
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 19
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 18
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 17
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 17
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 16
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 16
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 16
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 16
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 16
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 16
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 16
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 16
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 15
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 15
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 15
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 15
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 15
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 15
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 15
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 14
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 14
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 14
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 13
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 13
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 13
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 13
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 13
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 12
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 12
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 12
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 12
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 12
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 12
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 12
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 12
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 12
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 11
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 11
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 11
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 11
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 11
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 11
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 11
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 10
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 10
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 10
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 10
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 10
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 10
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 10
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 10
- 229940112216 novoseven Drugs 0.000 description 10
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 10
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 10
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 9
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 9
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 9
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 9
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 9
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 9
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 9
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 9
- 229940012426 factor x Drugs 0.000 description 9
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 9
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 9
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 9
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 9
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 9
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 8
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 8
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 8
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 8
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 8
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 8
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 7
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 7
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 7
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 7
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N (2S)-6-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-4-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-5-amino-2-[[(2S)-1-[(2S,3R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-1-[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-amino-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]propanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]acetyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-sulfanylpropanoyl]amino]-4-methylsulfanylbutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]pyrrolidine-2-carbonyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(1H-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-hydroxybutanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-carboxypropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-methylbutanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-4-oxobutanoyl]amino]-5-carbamimidamidopentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoyl]amino]-4-carboxybutanoyl]amino]-5-oxopentanoyl]amino]hexanoic acid Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](Cc1cnc[nH]1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](Cc1c[nH]c2ccccc12)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PGOHTUIFYSHAQG-LJSDBVFPSA-N 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 6
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 6
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 6
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 6
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 6
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 6
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 6
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 6
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 6
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- -1 mists Substances 0.000 description 6
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 6
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 6
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 6
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 6
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 6
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 6
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 6
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 6
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 5
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 5
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 5
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 5
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 5
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 5
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 5
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 5
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 5
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 5
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 5
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 5
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 5
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 5
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 5
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000012453 sprague-dawley rat model Methods 0.000 description 5
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 4
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 4
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 4
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 4
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 4
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 4
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 4
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 4
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 4
- 229940105774 coagulation factor ix Drugs 0.000 description 4
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 4
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 4
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 4
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 229960004667 ethyl cellulose Drugs 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 125000000291 glutamic acid group Chemical class N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 4
- 230000006623 intrinsic pathway Effects 0.000 description 4
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 4
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 4
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 4
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 4
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 4
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 4
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 4
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 3
- 241001120659 Furina Species 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 3
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 3
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 3
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 3
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 3
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 3
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 3
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 3
- 239000007910 chewable tablet Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007820 coagulation assay Methods 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 238000012272 crop production Methods 0.000 description 3
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 3
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 3
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 3
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 3
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 3
- 230000002439 hemostatic effect Effects 0.000 description 3
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 229940071676 hydroxypropylcellulose Drugs 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 3
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 3
- NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N nitrofurantoin Chemical compound O1C([N+](=O)[O-])=CC=C1\C=N\N1C(=O)NC(=O)C1 NXFQHRVNIOXGAQ-YCRREMRBSA-N 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 3
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 3
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 3
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 229940068953 recombinant fviia Drugs 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 3
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 3
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 3
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 3
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- YMBIICKZNSTXJA-VKHMYHEASA-N (2s)-2-(carboxyamino)pentanedioic acid Chemical class OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(O)=O YMBIICKZNSTXJA-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 2
- 241000416162 Astragalus gummifer Species 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 2
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000659413 Homo sapiens Tricarboxylate transport protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 2
- 101000621427 Homo sapiens Wiskott-Aldrich syndrome protein Proteins 0.000 description 2
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 2
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 2
- 102000017975 Protein C Human genes 0.000 description 2
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 2
- 201000000839 Vitamin K Deficiency Bleeding Diseases 0.000 description 2
- 206010047634 Vitamin K deficiency Diseases 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- 208000013633 acquired hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 2
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 2
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 2
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N diethyl phthalate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 2
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 102000035122 glycosylated proteins Human genes 0.000 description 2
- 108091005608 glycosylated proteins Proteins 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 2
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 2
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 2
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 2
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 2
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 230000000873 masking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 2
- 238000010172 mouse model Methods 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 2
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 2
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 2
- 238000009117 preventive therapy Methods 0.000 description 2
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 2
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 2
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 2
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 2
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 2
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 2
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 2
- 235000010487 tragacanth Nutrition 0.000 description 2
- 239000000196 tragacanth Substances 0.000 description 2
- 229940116362 tragacanth Drugs 0.000 description 2
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 208000016794 vitamin K deficiency hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 2
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- SBQSMJWMEQRETE-HVYQYDHPSA-N (2r)-2-amino-3-[[(2r)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]-4-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C(C(=O)C)SSC[C@H](N)C(O)=O SBQSMJWMEQRETE-HVYQYDHPSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2,1-benzoxaborole Chemical compound C1=CC=C2B(O)OCC2=C1 XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 10043-66-0 Chemical compound [131I][131I] PNDPGZBMCMUPRI-HVTJNCQCSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 3-bromoimidazo[1,2-a]pyridine-6-carbonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CN2C(Br)=CN=C21 UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 101800001401 Activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 102400000069 Activation peptide Human genes 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408682 Caenorhabditis elegans pmt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000016519 Coagulation factor VII Human genes 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 208000034656 Contusions Diseases 0.000 description 1
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010051055 Deep vein thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 208000027219 Deficiency disease Diseases 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 206010016077 Factor IX deficiency Diseases 0.000 description 1
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 1
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 1
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 1
- 208000012671 Gastrointestinal haemorrhages Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N L-2-aminopentanoic acid Chemical compound CCC[C@H](N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 150000008575 L-amino acids Chemical class 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N L-norVal-OH Natural products CCCC(N)C(O)=O SNDPXSYFESPGGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 240000007472 Leucaena leucocephala Species 0.000 description 1
- 235000010643 Leucaena leucocephala Nutrition 0.000 description 1
- 235000006679 Mentha X verticillata Nutrition 0.000 description 1
- 235000002899 Mentha suaveolens Nutrition 0.000 description 1
- 235000001636 Mentha x rotundifolia Nutrition 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 108010056902 Mononine Proteins 0.000 description 1
- 206010028309 Muscle haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 108010043958 Peptoids Proteins 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 206010051297 Soft tissue haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N Technetium-99 Chemical compound [99Tc] GKLVYJBZJHMRIY-OUBTZVSYSA-N 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 240000006474 Theobroma bicolor Species 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- DOOTYTYQINUNNV-UHFFFAOYSA-N Triethyl citrate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)(C(=O)OCC)CC(=O)OCC DOOTYTYQINUNNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 206010047249 Venous thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 101710133062 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 102100038182 Vitamin K-dependent gamma-carboxylase Human genes 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 210000001766 X chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000000443 aerosol Substances 0.000 description 1
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000010100 anticoagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003698 antivitamin K Substances 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 239000002585 base Substances 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 208000015322 bone marrow disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 1
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N carboxyglutamic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000000701 coagulant Substances 0.000 description 1
- 229940105772 coagulation factor vii Drugs 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 239000000599 controlled substance Substances 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 229960000913 crospovidone Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 1
- 230000009429 distress Effects 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 1
- 239000003974 emollient agent Substances 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010944 ethyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001761 ethyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 229960000301 factor viii Drugs 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000011152 fibreglass Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 1
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 1
- 239000008369 fruit flavor Substances 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 108010013113 glutamyl carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 238000005469 granulation Methods 0.000 description 1
- 230000003179 granulation Effects 0.000 description 1
- 230000035876 healing Effects 0.000 description 1
- 208000002085 hemarthrosis Diseases 0.000 description 1
- 208000031169 hemorrhagic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N indium-111 Chemical compound [111In] APFVFJFRJDLVQX-AHCXROLUSA-N 0.000 description 1
- 229940055742 indium-111 Drugs 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000007917 intracranial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 230000002601 intratumoral effect Effects 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O isodesmosine Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC[N+]1=CC(CCC(N)C(O)=O)=CC(CCC(N)C(O)=O)=C1CCCC(N)C(O)=O RGXCTRIQQODGIZ-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 235000015110 jellies Nutrition 0.000 description 1
- 239000008274 jelly Substances 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 229940099563 lactobionic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 239000006194 liquid suspension Substances 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 229960005015 local anesthetics Drugs 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 1
- 210000003563 lymphoid tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000008368 mint flavor Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 229940090053 mononine Drugs 0.000 description 1
- 210000004400 mucous membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000008012 organic excipient Substances 0.000 description 1
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 235000016236 parenteral nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000006320 pegylation Effects 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 1
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920001987 poloxamine Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 1
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 1
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 1
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008742 procoagulation Effects 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 230000001012 protector Effects 0.000 description 1
- 238000012514 protein characterization Methods 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 125000005629 sialic acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M sodium bisulfate Chemical compound [Na+].OS([O-])(=O)=O WBHQBSYUUJJSRZ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000342 sodium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940037001 sodium edetate Drugs 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 230000019635 sulfation Effects 0.000 description 1
- 238000005670 sulfation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 230000002459 sustained effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001069 triethyl citrate Substances 0.000 description 1
- VMYFZRTXGLUXMZ-UHFFFAOYSA-N triethyl citrate Natural products CCOC(=O)C(O)(C(=O)OCC)C(=O)OCC VMYFZRTXGLUXMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013769 triethyl citrate Nutrition 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 1
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229940041603 vitamin k 3 Drugs 0.000 description 1
- 229940019333 vitamin k antagonists Drugs 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Immunology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
Abstract
Un factor de coagulación modificado con péptido del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es: un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o de los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31; un polipéptido del factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25; o un factor VIIa activado (FVIIa) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25.
Description
Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para producir los mismos
Campo de la invención 5
Se describen polipéptidos que comprenden al menos un péptido del carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica unido al carboxilo terminal de un factor de coagulación, y polinucleótidos que codifican los mismos. Se describen, además, composiciones farmacéuticas que comprenden los polipéptidos y polinucleótidos de la invención, métodos para producir las mismas, y los usos médicos de estas. 10
Antecedentes de la invención
El desarrollo de la terapia de reemplazo con factores de coagulación ha transformado las vidas de muchos individuos con hemofilia. La hemofilia es un grupo de trastornos genéticos hereditarios que deteriora la capacidad 15 del cuerpo para controlar la formación de coágulos o coagulación de la sangre. Los pacientes con hemofilia no producen cantidades adecuadas de proteínas del Factor VIII o el Factor IX, que son necesarias para una eficaz coagulación de la sangre. En los pacientes hemofílicos graves incluso una lesión pequeña puede dar como resultado una pérdida de sangre que se prolonga durante días o semanas, y puede no ocurrir la curación completa, lo que conduce a un posible daño permanente y debilitante de las articulaciones y otros órganos, y a la muerte prematura. 20
Un tipo de hemofilia, la hemofilia B, es un trastorno hemorrágico unido al cromosoma X provocado por una mutación en el gen del Factor IX (FIX), que resulta en una deficiencia de la actividad procoagulante del FIX. Los pacientes con hemofilia B tienen hemorragias espontáneas en el tejido blando y hemartrosis recurrentes que frecuentemente conducen a una artropía paralizante. El tratamiento actual para estos pacientes incluye una administración 25 intravenosa del FIX recombinante. Sin embargo los aspectos de costo y aclaramiento relativamente rápido del FIX de la circulación hacen que el desarrollo de un FIX de acción prolongada sea una tarea desafiante.
La disponibilidad comercial del FVIII y el FIX ha conducido a un mejor control de los episodios de hemorragias con peligro para la vida. Muchos pacientes reciben terapia profiláctica, que reduce el riesgo de hemorragia y sus 30 complicaciones asociadas. Sin embargo, una proporción significativa de pacientes (10-30 %) desarrollan anticuerpos inhibitorios contra FVIII y FIX administrados de manera exógena. La administración del FVIIa, que es un producto de derivación, puede inducir homeostasis y proporcionar un tratamiento eficaz para los pacientes con Ac inhibitorios.
El FVIIa recombinante (NovoSeven®) está disponible comercialmente y se aprobó en 1996 para el tratamiento de 35 episodios de hemorragia en los pacientes de hemofilia con inhibidores. Sin embargo, el rFVIIa se aclara rápidamente con un tiempo de vida media terminal de 2,5 horas. Como resultado, los pacientes generalmente requieren infusiones múltiples y frecuentes (2-3 dosis administradas en intervalos de 2-3 horas) para lograr la homeostasis adecuada después de un sangrado ligero a moderado. En consecuencia, existe mucho interés en el desarrollo de una forma de acción prolongada del FVIIa que prolongaría la duración de la actividad hemostática después de una 40 dosis única y permitiría una dosificación mucho menos frecuente. Un FVIIa de acción prolongada aumentaría, además, la factibilidad de una terapia profiláctica a largo plazo.
Actualmente se desarrollan diversas tecnologías para prolongar el tiempo de vida media del FVIIa. Sin embargo, el reto es lograr una prolongación del tiempo de vida media de esta proteína a la vez que se conserve su actividad 45 biológica y asegurar que las modificaciones no induzcan una inmunogenicidad significativa.
Fares y otros, (1992) PNAS 89: 4304-4308, describen la fusión de 1 o 2 copias del péptido C-terminal (CTP) de la subunidad β de la gonadotropina coriónica (CGβ) a la subunidad β de la folitropina. Fares y otros señalaron que el enfoque descrito allí quot;requiere que el sitio activo no esté en el extremo carboxilo de la moléculaquot;. Fares y otros no 50 mencionan a los factores de coagulación modificados con CTP.
Fares y otros, (2010) Endocrinology 151(9):4410-4412, describen la fusión del péptido del carboxilo terminal (CTP) de la subunidad β de la gonadotropina coriónica humana (hCG) a una hormona de crecimiento en patrones estructurales que incluyen unir unidades de CTP al extremo N-terminal de la hormona de crecimiento. Fares y 55 otros no mencionan a los factores de coagulación modificados con CTP.
Fares y otros, (2011) International J. Cell Bio. 9(11): 2021-2027, describen la fusión de CTP a la eritropoyetina en patrones estructurales que incluyen unir péptidos del carboxilo terminal (CTP) de unidades de la subunidad β de la gonadotropina coriónica humana a la secuencia codificante de la eritropoyetina (EPO). Por ejemplo, Fares y 60 otros describen una EPO modificada con CTP que tiene un CTP unido al extremo N-terminal de la EPO y dos CTP unidos al extremo C-terminal de la EPO. Fares y otros no mencionan a los factores de coagulación modificados con CTP.
El documento WO 93/06844 describe la quot;extensión en tándem con el péptido del carboxilo terminal (CTP) de la 65 gonadotropina coriónica humanaquot;. Por ejemplo, el documento WO 93/06844 describe el aumento de la estabilidad biológica de la hormona foliculoestimulante (FSH) que contiene la extensión de dos unidades de CTP C-terminal de su subunidad β. El documento WO 93/06844 no menciona a los factores de coagulación modificados con CTP.
Konterman (2011) Current Opinion in Biotechnology 22(6):868-876, proporciona una revisión de los métodos para prolongar el tiempo de vida media en suero de los agentes terapéuticos proteicos. Konterman enumera métodos que 5 incluyen PEGilación, N-glicosilación, fusión de la albúmina a una proteína diana, y fusión de la porción Fc de un anticuerpo a una proteína diana. Konterman no describe la unión de péptidos del carboxilo terminal (CTP) a una proteína o péptido de interés.
La solicitud de patente de Estados Unidos núm. 2010/0317585 se refiere a un género de factores de coagulación 10 modificados que se modifican por la presencia de uno a cinco CTP de gonadotropina unidos al extremo C-terminal.
Resumen de la invención
La invención proporciona un factor de coagulación modificado con el péptido del carboxilo terminal de la 15 gonadotropina coriónica (CTP), que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es:
un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o de los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31;
un polipéptido del factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la 20 sec. con núm. de ident.: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25; o
un factor VIIa activado (FVIIa) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25.
En una modalidad, al menos un CTP está glicosilado. 25
En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FIX modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o de los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31.
30 En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FVII modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25, o en donde el factor de coagulación modificado con CTP es un FVIIa modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25.
35 En otra modalidad, la invención proporciona un polinucleótido que codifica al factor de coagulación modificado con CTP. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico de dicho polinucleótido es como se expone en la sec. con núm. de ident.: 30. En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico de dicho polinucleótido es como se expone en la sec. con núm. de ident.: 24.
40 En una modalidad, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el factor de coagulación modificado con CTP, o el polinucleótido, y un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, la invención proporciona el factor de coagulación modificado con CTP o la composición farmacéutica, para usar como un medicamento. 45
En otra modalidad, la invención proporciona el factor de coagulación modificado con CTP o la composición farmacéutica, para usar en la prevención o el tratamiento de un trastorno de la coagulación de la sangre o de la formación de coágulos en un sujeto. En una modalidad, el trastorno de coagulación de la sangre o de formación de coágulos es la hemofilia. 50
En otra modalidad, la invención proporciona el factor de coagulación modificado con CTP o la composición farmacéutica, para usar en la prevención o el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre o de formación de coágulos en un sujeto mediante administración subcutánea.
55 En otra modalidad de la invención, el sujeto es un niño.
En una modalidad, la invención proporciona un método para prolongar el tiempo de vida media biológica de un factor de coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del 60 carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa, para producir así un factor de coagulación modificado con CTP en donde el factor de coagulación tiene un tiempo de vida media biológica prolongado.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un factor de 65 coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa, para producir así un factor de coagulación modificado con CTP en donde el factor de coagulación tiene una área bajo la curva (AUC) mejorada.
5 En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir la frecuencia de dosificación de un factor de coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa, para producir así un factor de coagulación modificado con CTP en donde el factor de coagulación tiene una reducción de la 10 frecuencia de dosificación.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para reducir la velocidad de aclaramiento de un factor de coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo 15 terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa en donde el factor de coagulación tiene una reducción de la velocidad de aclaramiento.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir el factor de coagulación modificado con CTP que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo 20 terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o del FVIIa, para producir así el factor de coagulación modificado con CTP.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción 25 detallada, ejemplos y figuras. Debe comprenderse, sin embargo, que la descripción detallada y los ejemplos específicos aunque indican modalidades preferidas de la invención se proporcionan a manera de ilustración solamente, ya que diversos cambios y modificaciones dentro del alcance de la invención serán evidentes para los expertos en la técnica a partir de esta descripción detallada.
30
Breve descripción de las figuras
Figura 1A. Presenta un gráfico de barras que muestra las células de cosechas limitadas, diluidas, transfectadas y seleccionadas con variantes de FIX-CTP y FIX-CTP-CTP en presencia de vitamina K3 a 5 µg/ml. El nivel de FIX se cuantificó mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. núm. FIX-AG RUO), y 35 la concentración de proteínas calculada (µg/ml) es el promedio de dos ejecuciones independientes. La Figura 1B muestra fotomicrografías de un gel de SDS-PAGE del reconocimiento con Ac para FIX; la fotomicrografía A representa el reconocimiento de un anticuerpo anti-FIX en una transferencia Western; la fotomicrografía B representa el reconocimiento de un anticuerpo anti-y carboxilación en una transferencia Western. El carril 1 en A-B se cargó con una muestra que contenía FIX recombinante, el carril 2 en A-B se cargó con una muestra que contenía 40 cosechas de FIX-CTP. El carril 3 en A-B se cargó con una muestra que contenía una cosecha de FIX-(CTP)2.
Figura 2. Presenta un gráfico que muestra la actividad cromogénica comparativa de cosechas de FIX-CTP y FIX-(CTP)2 (medida mediante la concentración EC50.) en comparación con rhFIX (American Diagnostics).
45
Figura 3. Presenta un gráfico que muestra el perfil PK de rhFIX, de la cosecha de FIX-CTP-CTP y de la cosecha de FIX-CTP.
Figura 4. Presenta un gráfico de barras que muestra el nivel del antígeno FIX en las cosechas de FIX-CTP y las cosechas de FIX-CTP-CTP y la proteína purificada FIX-CTP-CTP según se determinó mediante el uso del estuche 50 de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; cat. núm. FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada (µg/ml) es el promedio de dos ejecuciones independientes.
Figura 5. Muestra fotomicrografías de geles de SDS-PAGE del reconocimiento con Ac para FIX. La fotomicrografía A representa una tinción con azul de Coomassie; la fotomicrografía B representa el reconocimiento de un anticuerpo 55 anti-FIX en una transferencia Western; la fotomicrografía C representa el reconocimiento de un anticuerpo anti-y carboxilación en una transferencia Western. El carril 1 en A-C se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2. El carril 2 en A-C se cargó con una muestra que contenía FIX-(CTP)2 no unido. El carril 3 en A-C se cargó con una muestra que contenía un a elución concentrada de FIX-(CTP)2.
60
Figura 6. Presenta un gráfico que muestra la actividad cromogénica de FIX-(CTP)2 (concentración de la muestra/D.O.) en comparación con el plasma mezclado normal humano y rhFIX (American Diagnostics).
Figura 7. Presenta un gráfico que muestra el perfil PK de FIX-CTP-CTP purificado, rhFIX, cosecha de FIX-CTP-CTP, y cosecha de FIX-CTP. 65
Figura 8. Muestra transferencias Western con anticuerpos anti-CTP y anti-gamma carboxilación del FIX fusionado a tres, cuatro o cinco CTP. Las cosechas de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica). 5
Figura 9. Muestra una detección con azul de Coomassie de FIX-CTP3, FIX-CTP4, y FIX-CTP5. Después de un proceso de purificación con la utilización de una columna de jacalina (purificación por inmunoafinidad de las proteínas glicosiladas), FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El gel de SDS-PAGE se tiñó mediante el 10 colorante azul de Coomassie para la detección de las muestras.
Figura 10. Muestra la actividad cromogénica del FIX. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 completamente purificados (columna HA) frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, que está disponible 15 comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas las muestras se diluyeron en serie y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano.
Figura 11. Muestra el perfil farmacocinético (PK) comparativo de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5. La concentración 20 del FIX en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de Elisa para FIX humano (Affinity Biologicals). Se calculó el perfil farmacocinético y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo. Los tiempos de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0.
Figura 12. Muestra el análisis de FIX-CTP3 por SDS-PAGE - Coomassie SDS-PAGE. La proteína enriquecida γ-25 carboxilada FIX-CTP3, rhFIX y rFIXa (FIX activado) se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis del SDS-PAGE y Coomassie se realizó mediante la tinción del gel con el reactivo azul de Commasie (800 ng de proteína) (figura 12A). Se realizó una inmunotransferencia Western mediante el uso de 100 ng de proteína con Ac policlonal anti-FIX humano (figura 12B), anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics Cat #499, 3570) (figura 12C), Ac 30 policlonal anti-propéptido de FIX (figura 12D), y Ac policlonal anti-CTP (figura 12E).
Figura 13: Muestra la actividad cromogénica de FIX-CTP3. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FIX-CTP3 y de la proteína enriquecida γ-carboxilada FIX-CTP3, frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible 35 comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). La cosecha de FIX-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano.
Figura 14: Muestra el tiempo de coagulación de manera comparativa. Se realizó un ensayo de aPTT (tiempo de 40 trombina parcial activada) in vitro que comparó la actividad de coagulación del FIX-CTP3 con BeneFIX. Las proteínas se diluyeron en serie y se adicionaron al plasma agotado de FIX humano, y se evaluó el tiempo de coagulación.
Figura 15. Muestra el perfil PK comparativo de FIX-CTP3. La concentración del FIX se cuantificó mediante el uso de 45 estuches de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo.
Figura 16. Muestra los parámetros del perfil de actividad. En paralelo al muestreo de PK, los animales deficientes del FIX administrados con BeneFIX® o FIX-CTP3, las muestras plasmáticas citratadas, se evaluaron en cuanto a su 50 actividad de coagulación mediante el ensayo de aPTT, que se tradujo a % de actividad. El % de actividad en cada punto de muestreo se calculó como el tiempo de coagulación actual/tiempo de coagulación del plasma mezclado de ratones normales * 100.
Figura 17. Muestra los parámetros de un primer reto de sangrado. Los ratones deficientes de FIX se administraron 55 con una única inyección intravenosa de 100 UI/Kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se comprimió ligeramente 48 horas después de la dosificación y se evaluaron el tiempo de sangrado por la vena de la cola (TVBT) y la intensidad del sangrado (DO de hemoglobina). Un segundo reto de sangrado se realizó 15 minutos después de alcanzar la homeostasis, y se midieron los mismos parámetros.
60
Figura 18. Muestra los parámetros de un segundo reto de sangrado. Una vez que el primer sangrado descrito en la leyenda de la figura 19 se detuvo espontánea o manualmente, un segundo reto de sangrado se realizó 15 minutos después del primero, y se volvieron a medir el tiempo y la intensidad del sangrado.
Figura 19. Muestra un diagrama que ilustra la construcción de rFVII-CTP (A), la construcción de rFVII-CTP-CTP (B), 65 la construcción de rFIX-CTP (C), y la construcción de rFIX-CTP-CTP (D).
Figura 20A. Presenta un gráfico de barras que muestra cosechas de células limitadas diluidas transfectadas con clones y seleccionadas con variantes de FVII-CTP en presencia de vitamina K3 a 5 µg/ml. El nivel de FVII se cuantificó mediante el uso de ELISA para FVII (AssayPro).
Figura 20B. Presenta un gráfico de barras que muestra cosechas de células limitadas, diluidas, transfectadas y 5 seleccionadas con variantes de FVII-CTP en presencia de 5 µg de vitamina K3.actividad. La actividad de FVII se cuantificó mediante el uso de un ensayo de actividad cromogénica de FVII (AssayPro).
Figura 20C. Presenta un gráfico de barras que muestra cosechas de células limitadas diluidas transfectadas y seleccionadas con variantes de FVII-CTP en presencia de 5 µg de vitamina K3. La actividad específica del FVII se 10 calculó para cada versión mediante la división del valor de la actividad por la concentración de FVII de la cosecha.
Figura 20D. Presenta un gráfico que muestra el perfil PK de FVII, las cosechas de FVII-CTP-CTP y FVII-CTP.
Figura 21. Muestra transferencias Western del FVII fusionado a tres, cuatro y cinco CTP, detectado mediante el uso 15 de anticuerpos anti-FVII, anti-CTP y anti-gamma carboxilación. Las cosechas de FVII-CTP3, FVII-CTP4, y FVII-CTP5 se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso de Ac anti-FVII, Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica).
20
Figura 22. Muestra la actividad de FVII - actividad cromogénica. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVII-CTP3, FVII-CTP4 y FVII-CTP5 purificados en HA (fracción altamente gamma carboxilada) frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Todas las muestras se diluyeron en serie y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia 25 que consistió en plasma normal humano.
Figura 23. Muestra un primer perfil farmacocinético (PK) comparativo-FVII 3, 4 y 5 CTP. FVII-CTP3, FVII-CTP4 y FVII-CTP5 (grupos A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por tratamiento) en una dosis de 250 µg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se 30 extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. FVII-CTP5 demostró un perfil superior en comparación con las otras dos versiones.
Figura 24. Muestra un segundo perfil PK comparativo-FVII 3, 4 y 5 CTP. FVII-CTP3, FVII-CTP4 y FVII-CTP5 después 35 de la selección del FVII y el proceso de purificación en HA (grupos A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (tres ratas por sustancia) en una dosis de 29,45 µg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital a las 0,083, 0,5, 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. 40
Figura 25. Muestra un diagrama esquemático del proceso de purificación de FVII-CTP3. El lote 31 se produjo para el estudio de PK/PD. El lote 38 se produjo para el estudio de supervivencia.
Figura 26. Muestra un SDS -PAGE y transferencia Western de FVII Final y FVIIa. Se cargaron 10 µg (lote 31) o 5 µg 45 (lote 38) en cada carril de SDS-PAGE teñido con Coomassie. Se cargó 1 µg de proteína en cada carril de la transferencia Western. 1. Polipéptido FVII-CTP3; 2. Cadena pesada, que incluye 3x CTP; 3. Cadena ligera. Los tres anticuerpos detectaron FVII. La cadena pesada de FVIIa se detectó mediante α-CTP, y la cadena ligera se detecta tanto con α-FVII como con α-Gla.
50
Figura 27. Muestra que la actividad cromogénica de FVII-CTP3 aumenta como resultado de la purificación en una columna de hidroxiapatita (HA) cerámica. Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FVII-CTP3, de las fracciones durante el proceso, y del FVII-CTP3 purificado frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). La cosecha de FVII-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie y la potencia se evaluó 55 mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia de plasma normal humano.
Figura 28. Muestra el perfil PK de FVIIa-CTP3 frente a NovoSeven® en ratones deficientes de FVIII. FVIIa-CTP3 se produjo después de la selección de FVII, el proceso de purificación en HA y la activación. FVIIa-CTP3 o 60 NovoSeven® se administró en una única inyección intravenosa a los ratones hemofílicos FVIII-/-. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital a las 0,083, 0,5, 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis, y se estableció un perfil PK basado en la actividad de coagulación del FVIIa mediante el uso de un estuche comercial STACLOT. 65
Figura 29. Muestra que se produjo FVIIa-CTP3 después de la selección de FVII, el proceso de purificación en HA y la activación. FVIIa-CTP3 o NovoSeven® se administró en una única inyección intravenosa a los ratones hemofílicos FVIII-/-. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital a las 0,083, 0,5, 2, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Los parámetros de generación de trombina se evaluaron durante el 5 experimento de PK, y se evaluaron parámetros como la cantidad máxima hasta el pico, la cantidad de trombina hasta un punto de tiempo y la velocidad de generación de trombina.
Figura 30. Muestra las curvas de supervivencia de los ratones hemofílicos después del corte de la vena de la cola (TVT). El TVT se realizó (A) a los 15 min, (B) 24 horas o (C) 48 horas después de la administración. La 10 supervivencia de los ratones se observó durante 24 horas después del TVT y se registró en cada hora durante las primeras 12 horas, y después de 24 horas. La Figura 33D resume la supervivencia de los ratones según se registró 24 horas después del TVT. Los datos del grupo control (vehículo) es la suma de los 3 experimentos con 5 ratones/experimento.
15
Figura 31. Muestra las inmunotransferencias de FVII - 3- CTP y FVII- 5 CTP. A) con transferencia para GLA. B) con transferencia para FVIIa. C) con transferencia para CTP.
Figura 32. Muestra un perfil PK comparativo-FVII 3 y 5 CTP- a partir de la purificación en columna Select y HA (FVIIS frente a FVII HA). 20
Figura 33. Muestra un perfil PK comparativo-FVII 3 y 5 CTP-El segundo estudio (IV frente a SC).
Figura 34. Muestra las curvas de supervivencia de los ratones hemofílicos después del corte de la vena de la cola (TVT). El TVT se realizó 12 horas después de la administración SC. La supervivencia de los ratones se observó 25 durante 24 horas después del TVT y se registró en cada hora durante las primeras 12 horas, y después de 24 horas.
Figura 35. Muestra el perfil PK de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración IV o SC. A) muestra la administración IV; B) muestra la administración SC.
30
Figura 36. Muestra el perfil PK de MOD-5014 (Clon 61 #75, #81) frente a NovoSeven® después de una sola administración SC.
Descripción detallada de la invención
35
En una modalidad, la presente invención proporciona factores de coagulación de acción prolongada y métodos para producir y usar los mismos. Los factores de coagulación de acción prolongada comprenden tres péptidos del carboxilo terminal (CTP, referidos además como unidades CTP) de la gonadotropina coriónica humana (hCG). En otra modalidad, el CTP actúa como un protector contra la degradación de un factor de coagulación. En otra modalidad, el CTP aumenta la Cmáx de un factor de coagulación. En otra modalidad, el CTP aumenta el Tmáx de un 40 factor de coagulación. En otra modalidad, el CTP aumenta el tiempo de vida media en circulación de un factor de coagulación. Se describe que los CTP mejoran la potencia de los factores de coagulación.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para prolongar el tiempo de vida media biológica de un factor de coagulación, que comprende la etapa de unir tres CTP al carboxilo terminal del factor de coagulación, para 45 prolongar así el tiempo de vida media biológica del factor de coagulación. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para prolongar el tiempo de vida media en circulación de un factor de coagulación. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para aumentar el tiempo de vida media de un factor de coagulación. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para prolongar el tiempo de vida media de un factor de coagulación. 50
El factor de coagulación VII (FVII) es una glicoproteína de 444 aminoácidos (50 KDa) secretada por los hepatocitos al torrente sanguíneo como una proenzima inactiva. Tras un daño tisular y exposición a la sangre circulante, el FVII forma un complejo con el factor tisular (TF) que es una verdadera proteína receptora del FVII y se expresa por diversas células localizadas en las capas más profundas de la pared del vaso. La formación de este complejo FVII-55 TF conduce a la activación del FVII. El FVII activado (FVIIa) inicia la vía de coagulación extrínseca mediante la activación del Factor IX y el Factor X.
FVII pertenece a un grupo de glicoproteínas dependientes de la vitamina K, asociadas con el sistema de coagulación. Además del FVII, este grupo consiste en el Factor IX, el Factor X, la Proteína C y la protrombina. Estas 60 proteínas tienen similares organizaciones de los dominios y se sintetizan como precursores con un propéptido N-terminal seguido por una secuencia de aminoácidos madura. El propéptido contiene un sitio de entrada para la gammacarboxilasa que convierte ácidos glutámicos (Glu) en ácidos gamma carboxi glutámicos (Gla). Este dominio es seguido por dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico (EGF), una región de conexión (CR) y un dominio C-terminal de serina proteasa. Antes de la secreción, el propéptido del FVII se escinde para formar una 65 glicoproteína del FVII, zimógeno monocatenario de 406 aminoácidos. Después de la secreción, la proteína puede activarse como un heterodímero de dos cadenas unidas por enlaces disulfuro, FVIIa, mediante escisión en la CR. La concentración plasmática del FVII es 10 nM y aproximadamente el 1 % circula en la forma activa en los individuos saludables.
El factor IX (FIX) es una glicoproteína de 415 aminoácidos (55 KDa); pertenece a un grupo de glicoproteínas 5 dependientes de la vitamina K, asociadas con el sistema de coagulación. El FIX tiene una organización de los dominios similar al factor FVII, el Factor X, la Proteína C y la protrombina que se sintetizan como precursores con un propéptido N-terminal seguido por una secuencia de aminoácidos madura.
El FIX se secreta como una molécula monocatenaria que experimenta complejas modificaciones 10 postranscripcionales, muchas de las cuales son críticas para sus propiedades bioquímicas y farmacocinéticas. Entre todas las modificaciones postranscripcionales, 12 residuos de ácido glutámico cerca del amino terminal del FIX que se gamma carboxilan mediante la gamma carboxilasa dependiente de la vitamina K son las más cruciales. La carboxilación es necesaria para la interacción del FIX con las superficies fosfolipídicas y para una actividad óptima del FIX. El propéptido amino terminal sirve como un sitio de reconocimiento para la gamma carboxilasa y por lo 15 tanto, después de la gamma carboxilación, se escinde por la serina proteasa del aparato de Golgi conocida como enzima de escisión de aminoácidos básicos apareados (PACE/Furina). Otras cuatro modificaciones postranscripcionales podrían ocurrir en el aparato de Golgi: sulfación de la tirosina 155, fosforilación de la serina 158, O-glicosilación en Ser 63 y en 61 y finalmente, N-glicosilación en Asn 157 y 16, pero se demostró que no son necesarias para la actividad adecuada del FIX. 20
El FIX circula en el plasma (concentración promedio de 5 µg/ml) como un zimógeno inactivo monocatenario. Tras la escisión proteolítica en dos enlaces peptídicos: Arg 145 y Arg 180 mediante uno o dos activadores fisiológicos, el complejo FVIIa-TF o FIXa, el péptido de activación se elimina, lo que convierte al FIX en una enzima completamente activa que consiste en una cadena ligera y pesada que se mantienen unidas mediante un único enlace disulfuro. La 25 cadena ligera N-terminal contiene el ácido gamma carboxiglutámico no catalítico (Gla) y dos dominios similares al factor de crecimiento epidérmico, mientras que la cadena pesada C-terminal contiene el dominio catalítico de la molécula, similar a la tripsina. El FIXa solo se caracteriza por poca actividad catalítica. Sin embargo cuando está en forma de complejos con FVIII, su actividad proteolítica aumenta en 4-5 órdenes de magnitud hacia su sustrato natural FX. 30
En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para prolongar el tiempo de vida media biológica o mejorar el área bajo la curva (AUC) de un factor de coagulación, que comprende la etapa de unir tres CTP al carboxilo terminal del factor de coagulación, para prolongar así el tiempo de vida media biológica o mejorar el AUC del factor de coagulación. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para prolongar el tiempo de 35 vida media biológica o un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) del FIX, que comprende la etapa de unir tres CTP al carboxilo terminal del FIX, para prolongar así el tiempo de vida media biológica o mejorar el AUC del FIX. En otra modalidad, en la presente se proporciona un método para prolongar el tiempo de vida media biológica o un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) del FVII o FVIIa, que comprende la etapa de unir tres CTP al carboxilo terminal del FVII o FVIIa, para prolongar así el tiempo de vida media biológica o mejorar el AUC del FVII o 40 FVIIa.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para prolongar el tiempo de vida media biológica de un polipéptido del factor IX (FIX), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para prolongar así el tiempo de vida 45 media biológica de dicho polipéptido del FIX. En otra modalidad, la presente invención proporciona además un método para prolongar el tiempo de vida media biológica de un polipéptido del factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para prolongar así el tiempo de vida media biológica de dicho polipéptido de FVIIa.
50 En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un polipéptido del factor IX (FIX), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para mejorar así el AUC de dicho polipéptido del FIX. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un polipéptido del factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo 55 terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para mejorar así el AUC de dicho polipéptido de FVIIa.
En otra modalidad, un factor de coagulación de la invención es una proteína. En otra modalidad, un factor de coagulación de la invención es un péptido. En otra modalidad, un factor de coagulación de la invención es un 60 polipéptido. En otra modalidad, el factor de coagulación es una enzima. Se describe que el factor de coagulación es una serina proteasa. Se describe que el factor de coagulación es una glicoproteína. Se describe que el factor de coagulación es una transglutaminasa. Se describe que el factor de coagulación es un zimógeno inactivo.
En una modalidad, el factor de coagulación es el Factor VIIa (FVIIa). En otra modalidad, el factor de coagulación es 65 el Factor VII (FVII). En otra modalidad, el factor de coagulación es el Factor IX (FIX). En otra modalidad, el factor de coagulación es el Factor IXa (FIXa).
En una modalidad de la invención, el factor de coagulación es una glicoproteína. Se describe que el factor de coagulación es una glicoproteína dependiente de la vitamina K.
5 En otra modalidad de la invención, el factor de coagulación es una proteína recombinante. En otra modalidad de la invención, el factor de coagulación es una glicoproteína recombinante. En otra modalidad, el factor de coagulación comprende un péptido señal.
En otra modalidad de la invención, el factor de coagulación comprende tres repeticiones de CTP unidas al extremo 10 C-terminal y sin CTP unidos al extremo N-terminal.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en un polipéptido del FIX y tres péptidos del carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina, unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX modificado con CTP. 15
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP que consiste en un polipéptido de FVIIa y tres péptidos del carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina, unidos al carboxilo terminal de dicho FVIIa.
20 En otra modalidad, el factor de coagulación se sintetiza como un precursor con un propéptido N-terminal. En otra modalidad, el factor de coagulación como se usa en la presente está en una forma proenzimática inactiva. En otra modalidad, el factor de coagulación se produce en hepatocitos. En otra modalidad, el factor de coagulación comprende un sitio de entrada para la gammacarboxilasa que convierte ácidos glutámicos (Glu) en ácidos gamma carboxi glutámicos (Gla). En otra modalidad, el factor de coagulación como se usa en la presente es un factor de 25 coagulación disponible comercialmente.
En una modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
30
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
5
Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: 10
Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: 5
10 Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
5
En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-CTP-CTP-CTP (unido al carboxilo 10 terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor VII-CTP-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: 5
10 Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-(CTP)4 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-(CTP)4 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
5
Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor VII-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) 10 comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor VII-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
5
En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX comprende la siguiente secuencia de 10 ácido nucleico:
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor IX comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
5
Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
Se describe, además, que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: 5
Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: 10
Se describe, además, que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-CTP-CTP (unido al carboxilo terminal) 5 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-(CTP)3 (unido al carboxilo terminal) 10 comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)3 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: 5
Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-(CTP)4 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: 10
Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP) Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP) Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)
5
Se describe que la secuencia de ácido nucleico que codifica al Factor IX-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
10
Se describe que la secuencia de aminoácidos del Factor IX-(CTP)5 (unido al carboxilo terminal) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos: 5
En otra modalidad, puede añadirse furina a una célula que expresa el factor de coagulación-CTP de la invención. Se describe que la furina aumenta la eficiencia de la producción de un factor de coagulación-CTP de la invención en 10 una célula. En otra modalidad, la furina se cotransfecta con el vector que comprende la secuencia codificante del factor de coagulación-CTP de la invención. En otra modalidad, la furina está codificada por un vector separado. En otra modalidad, la furina y un factor de coagulación-CTP están codificados por un vector. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se inserta en pCI-DHFR. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se modifica genéticamente en pCI-dhfr/smaI+NotI, Furina/AsisI F.I.+NotI. 15
La secuencia de ácido nucleico que codifica la furina comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico: La secuencia de aminoácidos de furina comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
En una modalidad, el término factor de coagulación incluye además un homólogo del factor de coagulación que tiene actividad coagulante. En algunas modalidades, la homología de acuerdo con la presente descripción abarca, 5 además, variantes de deleción, inserción o sustitución, que incluye una sustitución de aminoácidos, de estos y fragmentos polipeptídicos biológicamente activos de estos. En una modalidad, la variante comprende sustituciones conservadoras, o deleciones, inserciones o sustituciones que no alteran significativamente la estructura tridimensional del factor de coagulación. En otra modalidad, la deleción, inserción o sustitución no altera la función de interés del factor de coagulación, que en una modalidad, es la unión a una pareja de unión en particular. 10
En otra modalidad, la descripción incluye un homólogo de un factor de coagulación que tiene unión funcional. En otra modalidad, los homólogos, por ejemplo, son polipéptidos que son al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 87 %, al menos 89 %, al menos 91 %, al menos 93 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 %, o al menos 99 % homólogos al factor de coagulación según se determina mediante 15 el uso del programa informático BlastP del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI) mediante el uso de parámetros predeterminados.
En otra modalidad, en la presente se proporciona un polipéptido que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal del factor de coagulación. 20
Debe entenderse que las composiciones y los métodos de la presente invención que comprenden los elementos o etapas como se describen en la presente pueden consistir en esos elementos o etapas, o consisten en esos elementos o etapas. En algunas modalidades, el término quot;comprenderquot; se refiere a la inclusión del agente activo indicado, tal como el factor de coagulación modificado con CTP, así como a la inclusión de otros agentes activos, y 25 portadores, excipientes, emolientes, estabilizadores farmacéuticamente aceptables, etcétera, como se conocen en la industria farmacéutica. En algunas modalidades, el término quot;que consiste esencialmente enquot; se refiere a una composición, cuyo único ingrediente activo es el ingrediente activo indicado, sin embargo, pueden incluirse otros compuestos que son para estabilizar, preservar, etcétera, la formulación, pero no están implicados directamente en el efecto terapéutico del ingrediente activo indicado. En algunas modalidades, el término quot;que consiste 30 esencialmente enquot; puede referirse a componentes que facilitan la liberación del ingrediente activo. En algunas modalidades, el término quot;que consistequot; se refiere a una composición, que contiene el ingrediente activo y un vehículo o excipiente farmacéuticamente aceptables.
En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que consiste en un factor de coagulación que no tiene 35 CTP en su amino terminal. En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que consiste en un factor de coagulación que carece de un CTP en su amino terminal. En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido que consiste en un factor de coagulación que tiene tres CTP en su carboxilo terminal como se describe en la presente y no tiene CTP en su amino terminal.
40 En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido como se describió anteriormente.
En otra modalidad, la presente invención proporciona además una composición que comprende un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del factor IX (FIX) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX. 5
En otra modalidad, la presente invención proporciona además un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa.
10 En una modalidad, la presente invención proporciona un factor de coagulación recombinante como se describió anteriormente. En una modalidad, la presente invención proporciona un factor de coagulación modificado genéticamente como se describió anteriormente. En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente como se describió anteriormente se refiere como un factor de coagulación modificado con CTP.
15 En una modalidad, los CTP que se unen al carboxilo terminal del factor de coagulación se unen en tándem al carboxilo terminal.
En una modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene una actividad biológica equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP. 20 En otra modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene medidas farmacológicas equivalentes o mejoradas en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene una farmacocinética equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente como se describe en la presente tiene una 25 farmacodinámica equivalente o mejorada en comparación con el factor de coagulación sin modificación con CTP.
En una modalidad, la presente invención proporciona un factor de coagulación modificado con CTP para usar en la prevención o el tratamiento de un trastorno de coagulación o de formación de coágulos. En otra modalidad, la invención proporciona un factor de coagulación modificado con CTP para usar en la prevención o el tratamiento de 30 hemofilia en un sujeto, que comprende administrar un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención. En otra modalidad, la invención proporciona un factor de coagulación modificado con CTP para usar en la prevención y el tratamiento de hemofilia en un sujeto, que comprende administrar al sujeto el factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención. En otra modalidad, la invención proporciona un factor de coagulación modificado con CTP para usar en la prevención o el tratamiento de hemofilia en un sujeto, que comprende 35 administrar al sujeto por vía subcutánea el factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención. En otra modalidad, la invención proporciona un Factor VII modificado con CTP para usar en el tratamiento de la hemofilia en un sujeto, que comprende administrar un Factor VII modificado con CTP de la presente invención.
En otra modalidad, la invención proporciona un Factor IX modificado con CTP para usar en el tratamiento de la 40 hemofilia en un sujeto, que comprende administrar un Factor IX modificado con CTP de la invención. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia B. En otra modalidad, la hemofilia B se conoce como deficiencia del factor IX o enfermedad de Christmas. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia grave, que en una modalidad, describe la hemofilia en la cual los niveles del factor de coagulación son 0-1 %. En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia moderada, que en una modalidad, describe la hemofilia en la cual los niveles del factor de coagulación son 1-5 %. 45 En otra modalidad, la hemofilia es hemofilia ligera, que en una modalidad, describe la hemofilia en la cual los niveles del factor de coagulación son 5-50 %.
En otra modalidad, la invención proporciona un factor IX modificado con CTP (FIX) para usar en la prevención o el tratamiento de un trastorno de coagulación o de formación de coágulos en un sujeto, que comprende administrar a 50 dicho sujeto, el polipéptido del FIX modificado con CTP que comprende un polipéptido del FIX y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para así prevenir o tratar un trastorno de coagulación o de formación de coágulos en dicho sujeto. En otra modalidad, la invención proporciona un Factor VII modificado con CTP (FVII) para usar en la prevención o el tratamiento de un trastorno de coagulación o de formación de coágulos en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto, un 55 polipéptido del FVII modificado con CTP que comprende un polipéptido del FVII y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FVII, para así prevenir o tratar un trastorno de coagulación o de formación de coágulos en dicho sujeto.
En otra modalidad, la invención proporciona un FIX modificado con CTP para usar en la prevención o el tratamiento 60 de hemofilia en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto, el polipéptido del FIX modificado con CTP que comprende un polipéptido del FIX y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para así prevenir o tratar la hemofilia en dicho sujeto. En otra modalidad, la invención proporciona un Factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP para usar en la prevención o el tratamiento de hemofilia en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto, un polipéptido del FVIIa modificado 65 con CTP que comprende un polipéptido de FVIIa y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para así prevenir o tratar la hemofilia en dicho sujeto.
La solicitud describe un método para tratar la hemofilia en un sujeto que comprende administrar a dicho sujeto uno o más factores de coagulación modificados con CTP como se describe en la presente. Por lo tanto, la solicitud describe un método para tratar la hemofilia en un sujeto, que comprende administrar a dicho sujeto, un polipéptido 5 del factor IX (FIX) modificado con CTP que comprende un polipéptido del FIX y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX y un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP que comprende un polipéptido de FVIIa y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para así tratar la hemofilia en dicho sujeto. En una modalidad, el FIX modificado con CTP y el FVIIa modificado con CTP se 10 administran en la misma composición al mismo tiempo. En otra modalidad, el FIX modificado con CTP y el FVIIa modificado con CTP se administran en composiciones separadas al mismo tiempo. En otra modalidad, el FIX modificado con CTP y el FVIIa modificado con CTP se administran en composiciones separadas en momentos diferentes.
15 En otra modalidad, la invención proporciona un polipéptido del factor IX modificado con CTP (FIX) o del factor VII modificado con CTP que comprende un polipéptido del FIX o FVII y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal del polipéptido de dicho FIX o de dicho FVII para usar en la prevención o el tratamiento de la hemofilia en un sujeto, mediante la administración a dicho sujeto, por vía subcutánea o intravenosa, de dicho FIX modificado con CTP o dicho FVII modificado con CTP, para así prevenir o 20 tratar la hemofilia en dicho sujeto.
En algunas modalidades, en la presente se proporciona un factor de coagulación modificado con CTP que comprende tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del factor de coagulación, en donde la secuencia de dicho factor de coagulación modificado con 25 CTP se selecciona del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident.: 25, los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25, la sec. con núm. de ident.: 31, o los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31, para usar en la prevención o el tratamiento de la hemofilia en un sujeto.
En una modalidad de la invención, se proporciona un Factor VII modificado con CTP o un factor VII activado (FVIIa) 30 modificado con CTP que comprende tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FVII para usar en la prevención o el tratamiento de una hemofilia en un sujeto mediante la administración al sujeto, por vía subcutánea, de dicho factor VII modificado con CTP o dicho factor VIIa modificado con CTP, en donde la secuencia de dicho FVII modificado con CTP se selecciona del grupo que consiste en la sec. con núm. de ident.: 25 o los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25. 35
En otras modalidades, el factor de coagulación modificado genéticamente es para usar en el tratamiento de pacientes con hemofilia B. En una modalidad, el factor de coagulación IX que comprende 3 CTP en tándem en su carboxilo terminal es para usar en el tratamiento de pacientes con hemofilia B. En otras modalidades, el factor de coagulación modificado genéticamente puede reducir la cantidad de infusiones necesarias para un paciente, reducir 40 las dosis necesarias para un paciente, o una combinación de estas.
En una modalidad, el factor de coagulación IX que comprende 3 CTP en tándem en su carboxilo terminal muestra un mejor perfil PK a la vez que mantiene su actividad de coagulación frente a la cosecha de FIX-CTP-CTP, la cosecha de FIX-CTP o rhFIX. En una modalidad, el tiempo de vida media de eliminación de rFIX-CTP3 es de 2,5 a 4 veces 45 mayor que para rFIX en ratas y en ratones deficientes de FIX. En la presente se describe que la administración de rFIX-CTP3 prolongó significativamente el efecto de procoagulación en ratones deficientes de FIX durante al menos 76 horas después de la dosificación. En la presente se describe además que la administración de rFIX-CTP3 produjo un mayor pico de actividad que rFIX en ratones deficientes de FIX. Se describe, además, que el factor de coagulación IX que comprende 2 CTP en tándem en su carboxilo terminal muestra un mejor perfil PK a la vez que 50 mantiene su actividad de coagulación frente a la cosecha de FIX-CTP o rhFIX y que el factor de coagulación IX que comprende 2 CTP en tándem en su carboxilo terminal muestra un aumento de 3 veces en el tiempo de vida media y un AUC 4,5 veces mayor en comparación con rhFIX.
En otra modalidad de la invención, la administración SC da como resultado una mayor biodisponibilidad del FVII 55 modificado con CTP en comparación con el FVII recombinante. Se describe que el tiempo de vida media es más prolongado y la biodisponibilidad (AUC SC/AUC IV) es mayor después de la administración SC de FVIIa-CTP3 y 5 en comparación con la administración SC de NovoSeven®. Se describe que MOD-5014 y MOD-5019 inyectados por vía subcutánea muestran una mejor supervivencia de los ratones en comparación con el FVII recombinante (NovoSeven®) (véase el Ejemplo 8 más adelante). 60
En otra modalidad, los términos quot;péptido CTPquot;, quot;péptido del carboxilo terminalquot; y quot;secuencia de CTPquot; se usan indistintamente en la presente. En otra modalidad, el péptido del carboxilo terminal es un CTP de longitud completa.
En otra modalidad, un péptido señal puede unirse al amino terminal del CTP, como se describe en el documento US 65 7,553,940.
En otras modalidades, el término factor de coagulación modificado genéticamente se refiere a la secuencia de aminoácidos de un factor de coagulación maduro. En otras modalidades, el término factor de coagulación modificado genéticamente se refiere a la secuencia de aminoácidos del factor de coagulación que incluye su secuencia señal o péptido señal. 5
En otra modalidad, quot;secuencia señalquot; y quot;péptido señalquot; se usan indistintamente en la presente. En otra modalidad, quot;secuenciaquot; cuando hace referencia a una molécula polinucleotídica puede referirse a una parte codificante.
En otra modalidad, un factor de coagulación modificado genéticamente que comprende al menos un CTP como se 10 describe en la presente tiene una mayor actividad biológica in vivo en comparación con el mismo factor de coagulación sin al menos un CTP. En una modalidad, la actividad biológica mejorada se deriva del tiempo de vida media más prolongado del factor de coagulación modificado genéticamente a la vez que mantiene al menos alguna actividad biológica. En otra modalidad, la actividad biológica mejorada se deriva de la actividad biológica mejorada que resulta de la modificación con CTP. En otra modalidad, la actividad biológica mejorada se deriva tanto de un 15 tiempo de vida media más prolongado como de una mejor funcionalidad del factor de coagulación modificado con CTP.
Como se describe en la presente, al menos una secuencia CTP en el extremo carboxilo terminal del factor de coagulación proporciona mayor protección contra la degradación de un factor de coagulación, proporciona mayor 20 protección contra el aclaramiento, proporciona un tiempo de aclaramiento prolongado, aumenta su Cmáx, aumenta su Tmáx, y/o prolonga su T½.
En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de esta invención se usa de la misma manera que un factor de coagulación conjugado no modificado. En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de esta invención 25 tiene un mayor tiempo de vida media en circulación y tiempo de residencia en el plasma, menor aclaramiento, y una actividad clínica in vivo aumentada. En otra modalidad, debido a las propiedades mejoradas del factor de coagulación conjugado como se describe en la presente, este conjugado se administra menos frecuentemente que la forma no modificada del mismo factor de coagulación.
30 En otra modalidad, una disminución en la frecuencia de administración dará como resultado una mejor estrategia de tratamiento, que en una modalidad, conducirá a una mayor satisfacción del paciente lo que conduce a mejores resultados del tratamiento, así como una mejor calidad de vida del paciente. En otra modalidad, en comparación con los conjugados convencionales de factores de coagulación, se ha encontrado que los conjugados que tienen el peso molecular y la estructura de enlazador de los conjugados de esta invención tienen una mejor potencia, mejor 35 estabilidad, elevados niveles de AUC, y mayor tiempo de vida media en circulación.
En otra modalidad, en la presente se proporciona una composición que comprende un factor de coagulación conjugado de la invención como se describe en la presente. En otra modalidad, en la presente se proporciona una composición farmacéutica que comprende el factor de coagulación conjugado. En otra modalidad, en la presente se 40 proporciona una composición farmacéutica que comprende una cantidad con eficacia terapéutica del factor de coagulación conjugado. En una modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de un factor de coagulación conjugado se determina de acuerdo con factores como la afección específica que se trata, la afección del paciente que se trata, así como los otros ingredientes en la composición.
45 En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de la invención como se describe en la presente es útil en el tratamiento de sujetos que padecen hemofilia. En otra modalidad, el factor de coagulación conjugado es útil en la terapia profiláctica de la hemofilia para reducir así el riesgo de hemorragia y complicaciones asociadas. En otra modalidad, el factor de coagulación conjugado es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemofilia a la vez que reduce el riesgo de desarrollar anticuerpos inhibitorios contra los factores de coagulación administrados de 50 manera exógena. En otra modalidad, el factor de coagulación conjugado es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemofilia para inducir así la homeostasis.
En una modalidad, un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención tiene usos terapéuticos. En otra modalidad, un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención tiene usos profilácticos. 55
En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de la invención es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemorragia excesiva o hematomas o que tienen un prolongado tiempo de protrombina (PT) o tiempo de tromboplastina parcial (PTT). En otra modalidad, un factor de coagulación conjugado de la invención es útil en el tratamiento de sujetos que tienen una afección adquirida que provoca hemorragias, como la deficiencia de vitamina 60 K o enfermedad hepática. En una modalidad, el factor de coagulación conjugado es útil en el tratamiento de sujetos que tienen deficiencias en factores de coagulación que se adquieren (debido a otras enfermedades) o se heredan, ligeras o graves, permanentes o temporales. En otra modalidad, el factor de coagulación conjugado es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemofilia A. En otra modalidad, el factor de coagulación conjugado es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de hemofilia B. Se describe, además, que el factor de coagulación conjugado 65 de la invención es útil en el tratamiento de sujetos que tienen deficiencias adquiridas debido a enfermedades crónicas, como una enfermedad hepática o cáncer; a una afección aguda como la coagulación intravascular diseminada (DIC), que utiliza factores de coagulación a una velocidad rápida; o a una deficiencia de la vitamina K o un tratamiento con un antagonista de la vitamina K como la warfarina (la producción de los factores II, VII, IX y X requiere de vitamina K). Se describe, además, que un factor de coagulación conjugado de la invención es útil en el tratamiento de sujetos que padecen de una enfermedad que provoca desequilibrios en la coagulación tales como 5 pero sin limitarse a: una enfermedad hepática, uremia, un cáncer, un trastorno de la médula ósea, una exposición al veneno de serpiente, una deficiencia de vitamina K, una terapia anticoagulante, una ingestión accidental del anticoagulante warfarina, múltiples transfusiones de sangre (las unidades almacenadas de sangre pierden algunos de sus factores de coagulación), o una combinación de estos. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP puede ser para usar en el tratamiento de la trombosis venosa profunda en un sujeto mediante la 10 administración de un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención. En una modalidad, la invención proporciona un factor de coagulación modificado con CTP para usar en la prevención de una hemorragia no controlada en un sujeto con hemofilia mediante la administración al sujeto del factor de coagulación modificado con CTP. En otra modalidad, la invención proporciona un factor de coagulación modificado con CTP para usar en la prevención de episodios de hemorragia en un sujeto con hemofilia mediante la administración al sujeto del factor de 15 coagulación modificado con CTP. En otra modalidad, la presente invención proporciona un factor de coagulación modificado con CTP para usar en el control de episodios de hemorragia en un sujeto con hemofilia B (deficiencia congénita del factor IX).
En otra modalidad, las composiciones y usos médicos descritos en la presente son para el tratamiento de episodios 20 de hemorragia en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para FVIII o FIX y en pacientes con hemofilia adquirida; prevención de hemorragia en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con hemofilia A o B con inhibidores para FVIII o FIX y en pacientes con hemofilia adquirida; tratamiento de episodios de hemorragia en pacientes con deficiencia congénita del FVII y prevención de hemorragia en intervenciones quirúrgicas o procedimientos invasivos en pacientes con deficiencia congénita del FVII. En otra modalidad, las 25 composiciones descritas en la presente son para usar en el tratamiento o prevención de hemorragias en los músculos o hemorragias en las articulaciones o para proporcionar tratamiento terapéutico o profiláctico de epistaxis y hemorragia en las encías, hemorragia de membranas mucosas, o hemorragia en el sistema nervioso central, proporcionar tratamiento terapéutico o profiláctico de hemorragia gastrointestinal o cerebral, proporcionar tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrados ligeros de baja frecuencia, proporcionar tratamiento terapéutico o profiláctico 30 de sangrados moderados de baja frecuencia, proporcionar tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrados ligeros de alta frecuencia, o proporcionar tratamiento terapéutico o profiláctico de sangrados moderados de alta frecuencia.
En una modalidad, las composiciones y usos médicos de la presente invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemofilia asintomática. En otra modalidad, las composiciones y usos de la invención proporcionan 35 tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemofilia ligera a moderada. En otra modalidad, las composiciones y usos de la invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemofilia grave.
En una modalidad, las composiciones y usos médicos de la presente invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de la hemorragia, que en una modalidad, es una hemorragia incontrolable y, en otra modalidad, 40 hemorragia intracerebral. En otra modalidad, las composiciones y usos de la presente invención proporcionan tratamiento terapéutico o profiláctico de coagulopatías neonatales; enfermedad hepática grave; procedimientos quirúrgicos de alto riesgo; pérdida de sangre por trauma; trasplante de médula ósea; trombocitopenias y trastornos de la función plaquetaria; reversión urgente de la anticoagulación oral; deficiencias congénitas de los factores V, VII, X, y XI; enfermedad de von Willebrand, o enfermedad de von Willebrand con inhibidores del factor de von 45 Willebrand.
En una modalidad, un factor de coagulación modificado con CTP de la invención es para usar en el tratamiento de la hemofilia o una enfermedad relacionada como se describe en la presente en un sujeto. En una modalidad, el sujeto es un ser humano. En otra modalidad, el sujeto es un animal domesticado. En otra modalidad, el sujeto es un 50 mamífero. En otra modalidad, el sujeto es un animal de granja. En otra modalidad, el sujeto es un mono. En otra modalidad, el sujeto es un caballo. En otra modalidad, el sujeto es una vaca. En otra modalidad, el sujeto es un ratón. En otra modalidad, el sujeto es una rata. En otra modalidad, el sujeto es un canino. En otra modalidad el sujeto es un felino. En otra modalidad, el sujeto es bovino, ovino, porcino, equino, murino o cervino. En una modalidad, el sujeto es macho. En otra modalidad el sujeto es hembra. En una modalidad, el sujeto es un niño, en 55 otra modalidad, un adolescente, en otra modalidad, un adulto o, en otra modalidad, un sujeto anciano. En otra modalidad, el sujeto es un sujeto pediátrico, en otra modalidad, un sujeto geriátrico.
Un [(CTP)ngt;1-factor de coagulación] como se describe en la presente puede comprender un factor de coagulación de longitud completa o un fragmento activo de este conectado por medio de un enlace peptídico en su carboxilo 60 terminal a al menos una unidad de CTP, sin CTP en su amino terminal. Un [(CTP)ngt;1-factor de coagulación] como se describe en la presente puede comprender, además, un factor de coagulación o un fragmento activo de este conectado por medio de un enlace peptídico a al menos una unidad de CTP que se conecta a una unidad de CTP adicional por medio de un enlace peptídico sin CTP en su amino terminal. En otra modalidad, una molécula de ácido nucleico codifica un factor de coagulación modificado genéticamente que comprende al menos un CTP unido a su 65 extremo C-terminal y sin CTP en su amino terminal.
En otra modalidad, el CTP se une al factor de coagulación por medio de un enlazador. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia CTP al factor de coagulación es un enlace covalente. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia CTP al factor de coagulación es un enlace peptídico. En otra modalidad, el enlazador que conecta la secuencia CTP al factor de coagulación es un enlace peptídico sustituido. En otra 5 modalidad, la secuencia CTP comprende: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (sec. con núm. de ident.: 1). En otra modalidad, la secuencia CTP comprende: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (sec. con núm. de ident.: 2). En otra modalidad, la secuencia CTP comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias expuestas en la sec. con núm. de ident.: 1 y la sec. con núm. de ident.: 2.
10 En otra modalidad, el péptido del carboxilo terminal (CTP) de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido 112 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la sec. con núm. de ident.: 1. En otra modalidad, la secuencia CTP de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos a partir del aminoácido 118 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se expone en la sec. con núm. de ident.: 2. En otra modalidad, la secuencia CTP además comienza a partir de 15 cualquier posición entre las posiciones 112-118 y termina en la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana. En algunas modalidades, la secuencia del péptido CTP es de 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 aminoácidos de longitud y comienza en la posición 112, 113, 114, 115, 116, 117 o 118 de la secuencia de aminoácidos del CTP.
En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo 20 por 1-5 sustituciones de aminoácidos conservadoras como se describe en la patente de EE.UU. núm. 5,712,122. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 1 sustitución de aminoácidos conservadora. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 2 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 3 25 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 4 sustituciones de aminoácidos conservadoras. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante del CTP de la gonadotropina coriónica que difiere del CTP nativo por 5 sustituciones de aminoácidos conservadoras.
30 En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 70 %, o al menos 80 %, o al menos 90 %, o al menos 95 %, o al menos 98 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido de este.
En otra modalidad, el polinucleótido que codifica al péptido CTP de la presente invención es al menos 70 %, o al 35 menos 80 %, o al menos 90 %, o al menos 95 %, o al menos 98 % homólogo a la secuencia de ADN del CTP nativo o un fragmento codificante del péptido de esta.
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica puede estar truncada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están 40 truncadas. En otra modalidad, las 3 secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están truncadas. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 3. La sec. con núm. de ident.: 3 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLP.
En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4. La 45 sec. con núm. de ident.: 4 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 11 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o los primeros 12 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4. En una modalidad, el CTP truncado comprende los 50 primeros 8 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o la sec. con núm. de ident.: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 13 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o los primeros 14 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 6 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o la sec. con núm. de ident.: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 5 aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 4 o la sec. con núm. de ident.: 3. 55
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica está glicosilada. En otra modalidad, 2 de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están glicosiladas. En otra modalidad, las 3 secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están glicosiladas. 60
En una modalidad, la secuencia CTP de la presente invención comprende al menos un sitio de glicosilación. En una modalidad, la secuencia CTP comprende 2 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia CTP comprende 3 sitios de glicosilación. En una modalidad, la secuencia CTP comprende 4 sitios de glicosilación. En una modalidad, una o más de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están completamente 65 glicosiladas. En otra modalidad, una o más de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotropina coriónica están parcialmente glicosiladas. En una modalidad, parcialmente glicosilado indica que uno de los sitios de glicosilación del CTP está glicosilado. En otra modalidad, dos de los sitios de glicosilación del CTP están glicosilados. En otra modalidad, tres de los sitios de glicosilación del CTP están glicosilados.
En algunas modalidades, la modificación de la secuencia del CTP es ventajosa porque permite el uso de menores 5 dosificaciones. En algunas modalidades, la modificación de la secuencia del CTP es ventajosa porque permite menos dosificaciones. En algunas modalidades, la modificación de la secuencia del CTP es ventajosa porque permite un efecto seguro, de acción prolongada.
En algunas modalidades, quot;polipéptidoquot;, quot;factor de coagulación modificado genéticamentequot; o quot;proteínaquot; como se usan 10 en la presente, abarca polipéptidos nativos (productos de degradación, polipéptidos sintetizados sintéticamente o polipéptidos recombinantes) y peptidomiméticos (típicamente, polipéptidos sintetizados sintéticamente), así como peptoides y semipeptoides que son análogos de polipéptidos, que tienen, en algunas modalidades, modificaciones que hacen que los polipéptidos que comprenden un factor de coagulación sean incluso más estables mientras están en un cuerpo o más capaces de penetrar a las células. 15
Como se usa en la presente, los términos quot;aminoácidoquot; o quot;secuencia de aminoácidosquot; se entiende que incluyen los 20 aminoácidos de origen natural; los aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero sin limitarse a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, nor-valina, nor-leucina y ornitina. En una 20 modalidad, quot;aminoácidoquot; incluye D- y L-aminoácidos.
En algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención se utilizan en agentes terapéuticos que requieren que los polipéptidos que comprenden un factor de coagulación estén en una forma soluble. En algunas modalidades, los polipéptidos de la presente invención incluyen uno o más aminoácidos polares naturales o no naturales, que 25 incluyen pero sin limitarse a serina y treonina que son capaces de aumentar la solubilidad del polipéptido debido a su cadena lateral que contiene hidroxilo.
En algunas modalidades, los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención se sintetizan bioquímicamente tal como mediante el uso de técnicas estándar en fase sólida. En algunas modalidades, 30 estos métodos bioquímicos incluyen síntesis exclusiva en fase sólida, síntesis parcial en fase sólida, condensación de fragmentos, o síntesis clásica en solución.
En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para generar los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención. En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas 35 recombinantes para la generación de polipéptidos relativamente largos (por ejemplo, más largos que 18-25 aminoácidos). En algunas modalidades, se usan técnicas de proteínas recombinantes para la generación de grandes cantidades de los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención. En algunas modalidades, las técnicas recombinantes se describen por Bitter y otros, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier y otros (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson y otros (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu y 40 otros (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi y otros (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli y otros, (1984) Science 224:838-843, Gurley y otros (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach y Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421-463.
En una modalidad, la invención proporciona una molécula polinucleotídica que consiste en la porción codificante de 45 un gen que codifica un polipéptido que comprende un factor de coagulación y péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina unidos al carboxilo terminal del factor de coagulación, como se describió anteriormente.
En una modalidad, la invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido que consiste en un factor de coagulación y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina unidos al carboxilo terminal del factor de 50 coagulación, como se describió anteriormente. En una modalidad, el polinucleótido es una secuencia de polinucleótido. En una modalidad, el polinucleótido es una molécula polinucleotídica.
En la presente se describe un vector de expresión que comprende una molécula polinucleotídica. El vector de expresión puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un 55 polipéptido del factor IX (FIX) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX. El vector de expresión puede comprender un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa.
60 Se describe, además, una célula que comprende el vector de expresión como se describe en la presente. La célula puede comprender un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del factor IX (FIX) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX. La célula puede comprender un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del 65 factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa.
Se describe, además, una composición que comprende el vector de expresión descrito en la presente. La composición puede comprender un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido 5 modificado con CTP que consiste en un polipéptido del factor IX (FIX) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX. La composición puede comprender un vector de expresión que comprende un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa. 10
También se describe una composición que comprende la célula como se describe en la presente. La célula puede ser una célula eucariota, o una célula procariota.
En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir un polipéptido del factor IX (FIX) modificado 15 con CTP, que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para producir así un polipéptido del FIX modificado con CTP. En otra modalidad, la invención proporciona un método para producir un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP, que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para producir así un polipéptido del FVIIa modificado con CTP. 20
En otra modalidad, los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención pueden sintetizarse mediante el uso de una molécula polinucleotídica que codifica un polipéptido de la presente invención. En algunas modalidades, la molécula polinucleotídica que codifica al factor de coagulación modificado genéticamente se liga a un vector de expresión, que comprende un control de la transcripción de una secuencia 25 reguladora en cis (por ejemplo, secuencia promotora). En algunas modalidades, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión constitutiva de un factor de coagulación modificado genéticamente, o para dirigir la expresión con especificidad tisular, o para dirigir la expresión inducible de los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención como se describe en la presente.
30 Los promotores de especificidad tisular, adecuados para usar con la presente invención, incluyen secuencias que son funcionales en una o más poblaciones celulares específicas. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, promotores tales como el de la albúmina que es específico del hígado [Pinkert y otros, (1987) Genes Dev. 1:268-277], promotores específicos de tejido linfoide [Calame y otros, (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; en particular promotores de receptores de células T [Winoto y otros, (1989) EMBO J. 8:729-733] e inmunoglobulinas; [Banerji y 35 otros (1983) Cell 33729-740], promotores específicos de neuronas tal como el promotor de neurofilamentos [Byrne y otros (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 86:5473-5477], promotores específicos de páncreas [Edlunch y otros (1985) Science 230:912-916] o promotores específicos de glándulas mamarias tal como el promotor del suero de leche (patente de EE.UU. núm. 4,873,316 y publicación de patente europea núm. 264,166). Los promotores inducibles adecuados para usar con la presente invención incluyen, por ejemplo, el promotor inducible por 40 tetraciclina (Srour, M.A., y otros, 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
En una modalidad, la frase quot;una molécula polinucleotídicaquot; se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que se aísla y se proporciona en la forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótido complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótido genómica y/o una secuencia de 45 polinucleótido compuesta (por ejemplo, una combinación de lo anterior).
En una modalidad, después de la expresión y la secreción, los péptidos señal se escinden de los factores de coagulación modificados genéticamente precursores lo que resulta en los factores de coagulación modificados genéticamente maduros. 50
En algunas modalidades, los polinucleótidos de la presente invención pueden prepararse mediante el uso de técnicas de PCR, o cualquier otro método o procedimiento conocido por un experto en la técnica. En algunas modalidades, el procedimiento implica la ligadura de dos secuencias de ADN diferentes (véase, por ejemplo, quot;Current Protocols in Molecular Biologyquot;, eds. Ausubel y otros, John Wiley & Sons, 1992). 55
En una modalidad, los polinucleótidos que codifican los factores de coagulación modificados genéticamente se insertan en los vectores de expresión (es decir, una construcción de ácido nucleico) para permitir la expresión del polipéptido recombinante. En una modalidad, el vector de expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en procariotas. En otra modalidad, el vector de 60 expresión incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en eucariotas. En una modalidad, el vector de expresión incluye un vector lanzadera que hace que este vector sea adecuado para la replicación y la integración en procariotas y eucariotas. En algunas modalidades, los vectores de clonación comprenden secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de 65 poliadenilación).
Puede usarse una variedad de células procariotas o eucariotas como sistemas de expresión en un huésped para expresar los factores de coagulación de la presente invención. Estas incluyen, pero no se limitan a, microorganismos, tales como bacterias transformadas con un ADN de bacteriófago recombinante, ADN plasmídico o vector de expresión de ADN cósmido que contiene la secuencia codificante del polipéptido; levadura transformada 5 con vectores de expresión recombinante en levaduras que contienen la secuencia codificante del polipéptido; sistemas de células vegetales infectadas con vectores de expresión recombinantes en virus (por ejemplo, virus del mosaico de la coliflor, CaMV; virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformadas con vectores de expresión plasmídicos recombinantes, como el plásmido Ti, que contiene la secuencia codificante del polipéptido.
10 En algunas modalidades, se usan sistemas de expresión no bacterianos (por ejemplo sistemas de expresión en mamíferos, como las células CHO) para expresar los factores de coagulación de la presente invención. En una modalidad, el vector de expresión usado para expresar los polinucleótidos de la presente invención en células de mamífero es el vector pCI-DHFR que comprende un promotor de CMV y un gen de resistencia a la neomicina. La construcción del vector pCI-dhfr se describe, de acuerdo con una modalidad, en el ejemplo 1. 15
En los sistemas bacterianos puede seleccionarse ventajosamente una serie de vectores de expresión en dependencia del uso previsto para el polipéptido expresado. En una modalidad, se desean grandes cantidades de polipéptido. Pueden ser convenientes los vectores que dirigen la expresión de altos niveles del producto proteico, posiblemente como una fusión con una secuencia señal hidrofóbica, que dirige el producto expresado hacia el 20 periplasma de las bacterias o el medio de cultivo donde el producto proteico se purifica fácilmente. Ciertas proteínas de fusión se modifican genéticamente con un sitio de escisión específico para ayudar a recuperar el polipéptido. Los vectores que pueden adaptarse a dicha manipulación incluyen, pero no se limitan a, la serie pET de los vectores de expresión de E. coli [Studier y otros, Methods in Enzymol. 185:60-89 (1990)].
25 En una modalidad, se usan sistemas de expresión en levaduras. Una serie de vectores que contienen promotores constitutivos o inducibles puede usarse en levaduras como se describe en la solicitud de patente de EE.UU. núm.: 5,932,447. También pueden usarse los vectores que promueven la integración de secuencias de ADN foráneo en el cromosoma de levadura.
30 El vector de expresión puede incluir, además, secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de numerosas proteínas a partir de un único ARNm tal como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y secuencias para la integración genómica del promotor-polipéptido quimérico.
Los vectores de expresión adecuados para mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, 35 pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que están disponibles de Invitrogen, pCI que está disponible de Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV que están disponibles de Strategene, pTRES que está disponible de Clontech, y sus derivados.
En la presente invención se usan vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus de eucariotas 40 tal como los retrovirus. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. Se describe, además, que los vectores derivados del virus de papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO y p205. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMT010/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus, y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor del virus de tumor mamario murino, 45 promotor del virus del sarcoma de Rous, promotor de la polihedrina, u otros promotores que han demostrado su eficacia para la expresión en células eucariotas.
En algunas modalidades, los vectores virales recombinantes son útiles para la expresión in vivo de los factores de coagulación de la presente invención ya que ofrecen ventajas tales como la infección lateral y la especificidad 50 dirigida. En una modalidad, los vectores virales se producen de manera que no son capaces de propagarse lateralmente; esta característica puede ser útil si el propósito deseado es introducir un gen específico solamente en un número localizado de células diana.
Pueden usarse diversos métodos para introducir el vector de expresión a las células. Dichos métodos se describen 55 generalmente en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y otros, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega y otros, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y otros [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por 60 ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véase las patentes de EE.UU. núms. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positiva-negativa.
Se apreciará que aparte de contener los elementos necesarios para la transcripción y la traducción de la secuencia 65 codificante insertada (que codifica al polipéptido), la construcción de expresión de la presente invención puede incluir, además, secuencias modificadas genéticamente para optimizar la estabilidad, la producción, la purificación, el rendimiento o la actividad del polipéptido expresado.
En algunas modalidades, las células transformadas se cultivan en condiciones eficaces, que permitan la expresión de grandes cantidades de factores de coagulación recombinantes modificados genéticamente. En algunas 5 modalidades, las condiciones de cultivo eficaces incluyen, pero no se limitan a, medios eficaces, condiciones del biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una modalidad, un medio eficaz se refiere a cualquier medio en el cual se cultiva una célula para producir el polipéptido recombinante de la presente invención. En algunas modalidades, un medio típicamente incluye una solución acuosa que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes adecuados, como las 10 vitaminas. En algunas modalidades, las células pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. En algunas modalidades, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno adecuados para una célula recombinante. La determinación de las condiciones de cultivo está dentro de la experiencia de un experto en la técnica.
15 En dependencia del sistema de vector y huésped usado para la producción, los factores de coagulación modificados genéticamente resultantes de la presente invención lo mismo permanecen dentro de la célula recombinante, se secretan hacia el medio de fermentación, se secretan hacia un espacio entre dos membranas celulares, tal como el espacio periplasmático en E. coli; o son retenidos en la superficie externa de una membrana celular o viral.
20 En una modalidad, después de un tiempo predeterminado en cultivo, se lleva a cabo la recuperación del factor de coagulación recombinante modificado genéticamente. La frase quot;recuperar el factor de coagulación recombinante modificado genéticamentequot; que se usa en la presente puede referirse a recolectar todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no necesariamente implica etapas adicionales de separación o purificación.
25 En una modalidad, los factores de coagulación modificados genéticamente de la presente invención se purifican mediante el uso de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero sin limitarse a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía por interacciones hidrofóbicas, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial. 30
En una modalidad, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede modificarse genéticamente para codificar el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención y un resto escindible fusionado. En una modalidad, una proteína de fusión puede diseñarse de manera que el polipéptido se pueda aislar fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, mediante inmovilización en una columna 35 específica para el resto escindible. En una modalidad, un sitio de escisión se modifica genéticamente entre el factor de coagulación modificado genéticamente y el resto escindible y el polipéptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante el tratamiento con una enzima o agente adecuados que escindan específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, véase Booth y otros, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella y otros, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)]. 40
En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención se recupera en una forma quot;sustancialmente puraquot;. En una modalidad, la frase quot;sustancialmente puraquot; se refiere a una pureza que permite el uso eficaz de la proteína en las aplicaciones descritas en la presente.
45 En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención puede sintetizarse, además, mediante el uso de sistemas de expresión in vitro. En una modalidad, los métodos de síntesis in vitro se conocen bien en la técnica y los componentes del sistema están disponibles comercialmente.
En algunas modalidades, los factores de coagulación recombinantes modificados genéticamente se sintetizan y 50 purifican; su eficacia terapéutica puede analizarse in vivo o in vitro. En una modalidad, las actividades de unión de los factores de coagulación recombinantes modificados genéticamente de la presente invención pueden determinarse mediante el uso de diversos ensayos como conoce el experto en la técnica.
En la presente se describe que el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención puede 55 proporcionarse al individuo per se. En una modalidad, el factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención puede proporcionarse al individuo como parte de una composición farmacéutica donde se mezcla con un portador farmacéuticamente aceptable.
En otra modalidad, una quot;composición farmacéuticaquot; se refiere a una preparación de uno o más de los ingredientes 60 activos descritos en la presente con otros componentes químicos como los portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
En otra modalidad, quot;ingrediente activoquot; se refiere a la secuencia polipeptídica de interés, que es responsable del 65 efecto biológico.
La descripción proporciona preparaciones combinadas donde quot;una preparación combinadaquot; define especialmente un quot;estuche de partesquot; en el sentido de que las parejas de combinación como se definió anteriormente pueden dosificarse independientemente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades características de las parejas de combinación, es decir, de manera simultánea, concurrente, separada o secuencial. Las partes del 5 estuche de partes pueden administrarse después, por ejemplo, simultánea o cronológicamente escalonadas, o sea, en puntos de tiempo diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del estuche de partes. La relación de las cantidades totales de las parejas de combinación puede administrarse en la preparación combinada. La preparación combinada puede variarse, por ejemplo, para hacer frente a las necesidades de una subpoblación de pacientes que se va a tratar o a las necesidades del paciente individual en el cual las diferentes 10 necesidades pueden deberse a una enfermedad en particular, a la severidad de una enfermedad, la edad, el sexo, o el peso corporal como puede realizar fácilmente un experto en la técnica.
En otra modalidad, las frases quot;portador fisiológicamente aceptablequot; y quot;portador farmacéuticamente aceptablequot; que se usan indistintamente se refieren a un portador o un diluyente que no provoca una irritación significativa a un 15 organismo y no anula la actividad biológica ni las propiedades del compuesto administrado. En estas frases se incluye un adyuvante. En una modalidad, uno de los ingredientes incluidos en el portador farmacéuticamente aceptable puede ser por ejemplo polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio intervalo de solubilidad tanto en medios orgánicos como acuosos (Mutter y otros (1979)).
20 En otra modalidad, quot;excipientequot; se refiere a una sustancia inerte que se añade a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. En una modalidad, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, diversos azúcares y tipos de almidón, derivados celulósicos, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
25 Las técnicas para la formulación y la administración de fármacos se encuentran en quot;Remington's Pharmaceutical Sciences,quot; Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Esta invención contempla varias modalidades de los intervalos de dosificación. La dosificación del factor de coagulación modificado genéticamente de la presente invención, en una modalidad, está en el intervalo de 0,005-30 100 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,005-5 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,01-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,1-20 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,1-10 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,01-5 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,001-0,01 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,001-0,1 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en 35 el intervalo de 0,1-5 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,5-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,2-15 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 0,8-65 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 1-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 5-10 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 8-15 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 10-20 mg/día. En otra modalidad, la dosificación 40 está en el intervalo de 20-40 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 60-120 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 12-40 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 40-60 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 50-100 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 1-60 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 15-25 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en el intervalo de 5-10 mg/día. En otra modalidad, la 45 dosificación está en el intervalo de 55-65 mg/día.
En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 50-500 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 50-150 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 100-200 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 150-250 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un 50 intervalo de 200-300 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 250-400 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 300-500 mg/día. En otra modalidad, la dosificación está en un intervalo de 350-500 mg/día.
En una modalidad, la dosificación es 20 mg/día. En una modalidad, la dosificación es 30 mg/día. En una modalidad, 55 la dosificación es 40 mg/día. En una modalidad, la dosificación es 50 mg/día. En una modalidad, la dosificación es 0,01 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 0,1 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 1 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 0,530 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 0,05 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 10 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 20-70 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 5 mg/día. 60
En una modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es 1-5 mg/día. En una modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es 1-3 mg/día. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es 2 mg/día.
65 En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/2 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/3 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/4 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/5 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/6 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/semana. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/9 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/11 días. En otra modalidad, la dosificación es 1-90 mg/14 días.
5 En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación es 10-50 mg/día. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/2 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/3 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/4 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 microgramos mg/5 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/6 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/semana. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/9 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 mg/11 días. En otra modalidad, la dosificación es 10-50 10 mg/14 días.
En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención se formula en una forma de dosificación intranasal. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se formula en una forma de dosificación inyectable. En otra modalidad, un 15 polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,0001 mg a 0,6 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,001 mg a 0,005 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,005 mg a 0,01 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de 20 coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,01 mg a 0,3 mg. En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,2 mg a 0,6 mg. En otra modalidad, el factor de coagulación está libre de CTP en su amino terminal.
25 Se describe que un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 1-100 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 10-80 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 20-60 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 10-50 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 40-80 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 10-30 microgramos, o en una dosis en el intervalo de 30-60 microgramos. 30
En otra modalidad, un polipéptido que comprende el factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención se administra a un sujeto en una dosis en el intervalo de 0,2 mg a 2 mg, o en una dosis en el intervalo de 2 mg a 6 mg, o en una dosis en el intervalo de 4 mg a 10 mg, o en una dosis en el intervalo de 5 mg y 15 mg.
35 En una modalidad, la dosificación del FIX modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FIX administrado en la dosificación recomendada del FIX recombinante (por ejemplo, Benefix®, Wyeth o Mononine®, CSL Behring) a los pacientes durante el mismo periodo de tiempo. En otra modalidad, la dosificación del FVIIa modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FVIIa administrado en la dosificación recomendada del FVIIa recombinante (por ejemplo, NovoSeven®) a los pacientes durante el mismo periodo de tiempo. En otra 40 modalidad, la dosificación del FVII modificado con CTP comprende el 50 % de la cantidad de FVII administrado en la dosificación recomendada del FVII recombinante a los pacientes durante el mismo periodo de tiempo. Por ejemplo, si NovoSeven® se administra a una dosis de 90 mcg/kg cada dos horas a un paciente pre- o postoperativamente (es decir, 7,65 mg cada dos horas o 45,9 mg en seis dosis en un periodo de 12 horas, para un paciente de 85 kg), un factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención puede administrarse a una dosis que es el 50 % 45 de la dosis de FVIIa recombinante en 12 horas de un paciente (es decir, a una dosis de 23 mg administrados una vez en un periodo de 12 horas).
En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 45 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación 50 con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 10 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 25 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con 55 CTP es de manera que contiene el 35 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 75 % de la cantidad del factor de coagulación que se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. En otra modalidad, la dosificación del factor de coagulación modificado con CTP es de manera que contiene el 100 % de la cantidad del factor de coagulación que 60 se administra cuando se usa el factor de coagulación sin modificación con CTP. Sin embargo, incluso si la dosificación contiene la misma cantidad del factor de coagulación (por ejemplo FIX) que el factor de coagulación sin modificación con CTP, todavía es ventajosa para los sujetos en el hecho de que se administrará menos frecuentemente debido a su mayor tiempo de vida media en comparación con los factores de coagulación recombinantes. 65
En otra modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de un factor de coagulación conjugado está entre 50-500 UI por kg de peso corporal administrada una vez al día a una vez a la semana para FIX o 10 µg/Kg-500 µg/Kg para FVIIa. En otra modalidad, una cantidad con eficacia terapéutica de un factor de coagulación conjugado es 150-250 UI por kg de peso corporal, administrada una vez al día. En otra modalidad, una composición farmacéutica que 5 comprende un factor de coagulación conjugado se formula a una concentración eficaz para la administración mediante diversos medios a un paciente humano.
En una modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 20-30 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX 10 circulante a 25-50 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 50-100 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 100-200 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 10-50 UI/dl en un sujeto. En otra modalidad, FIX se administra en una cantidad eficaz para llevar la actividad del Factor IX circulante a 20-100 UI/dl en 15 un sujeto.
En una modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto semanalmente. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto dos veces a la semana. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto bisemanalmente (una vez cada 20 dos semanas). En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto dos veces al mes. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto una vez al mes. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto diariamente. En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP se administra a un sujeto cada dos días.
25 En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP de la presente invención se administra a un sujeto una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, una vez cada 7-14 días, una vez cada 10-20 días, una vez cada 5-15 días, o una vez cada 15-30 días.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir la frecuencia de dosificación de un 30 polipéptido del factor IX (FIX), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para así reducir la frecuencia de dosificación de dicho polipéptido del FIX. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir la frecuencia de dosificación de un polipéptido del factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido de 35 FVIIa, para así reducir la frecuencia de dosificación de dicho polipéptido de FVIIa.
Se describe que los métodos de la invención dan como resultado aumentar la satisfacción en el uso de la terapia con factores de coagulación. El término satisfacción comprende adherencia. Se describe, además, que la invención aumenta la satisfacción de los pacientes con necesidad de una terapia con factores de coagulación mediante la 40 reducción de la frecuencia de administración del factor de coagulación. Se describe, además, que la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra debido a las modificaciones con CTP que hacen que el factor de coagulación modificado con CTP sea más estable. Se describe, además, que la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar el T½ del factor de coagulación. Se describe, además, que la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se 45 logra como resultado de aumentar el tiempo de aclaramiento o reducir la velocidad de aclaramiento del factor de coagulación.
En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir la velocidad de aclaramiento de un polipéptido del factor IX (FIX), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la 50 gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX, para así reducir la velocidad de aclaramiento de dicho polipéptido del FIX. En otra modalidad, la presente invención proporciona un método para reducir la velocidad de aclaramiento de un polipéptido del factor VIIa (FVIIa), que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa, para así reducir la velocidad de aclaramiento de dicho polipéptido de FVIIa. 55
En otra modalidad, la reducción en la frecuencia de administración del factor de coagulación se logra como resultado de aumentar la medida de AUC del factor de coagulación.
En una modalidad de la invención, en la presente se proporciona un método para reducir la frecuencia de 60 dosificación de un factor de coagulación, que comprende la etapa de unir tres CTP al carboxilo terminal del factor de coagulación, para así reducir la frecuencia de dosificación del factor de coagulación.
En otra modalidad, la presente invención muestra que las composiciones proporcionadas en la presente sorprendentemente se absorben más eficazmente hacia el torrente sanguíneo después de la administración SC 65 (véase los ejemplos 7-9 en la presente). La posibilidad de administrar el FVIIa por vía subcutánea constituye una ventaja ya que puede usarse para aplicaciones profilácticas. Además es mucho más fácil que los pacientes se inyecten ellos mismos las inyecciones subcutáneas, y son una ventaja cuando los pacientes son muy jóvenes y sus venas son pequeñas y difíciles de encontrar.
La administración oral, en una modalidad, comprende una forma de dosificación unitaria que comprende tabletas, 5 cápsulas, pastillas, tabletas masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Dichas formas de dosificación unitaria comprenden una cantidad segura y eficaz del factor de coagulación deseado de la invención, cada una de las cuales es, en una modalidad, de aproximadamente 0,7 o 3,5 mg a aproximadamente 280 mg/70 kg, o en otra modalidad, aproximadamente 0,5 o 10 mg a aproximadamente 210 mg/70 kg. Los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de las formas de dosificación unitaria para la administración peroral se 10 conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, las tabletas comprenden típicamente adyuvantes farmacéuticamente compatibles convencionales como diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes como almidón, gelatina y sacarosa; desintegrantes como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. En una modalidad, los deslizantes como el dióxido de silicio pueden usarse para mejorar las características de flujo de la mezcla en 15 polvo. En una modalidad, pueden añadirse agentes colorantes, tal como los colorantes FD&C para la apariencia. Los agentes edulcorantes y saborizantes, tales como aspartamo, sacarina, mentol, menta y saborizantes de frutas, son adyuvantes útiles para las tabletas masticables. Típicamente las cápsulas comprenden uno o más diluyentes sólidos descritos anteriormente. En algunas modalidades, la selección de los componentes portadores depende de consideraciones secundarias como el gusto, el costo y la estabilidad en almacenaje, que no son críticos para los 20 propósitos de esta invención, y puede realizarse fácilmente por un experto en la técnica.
En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende un perfil de liberación predefinido. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende tabletas, cápsulas, pastillas o tabletas masticables de liberación prolongada. En una modalidad, la forma de dosificación oral de la presente invención comprende tabletas, cápsulas, pastillas o 25 tabletas masticables de liberación lenta. En una modalidad, la forma de dosificación oral comprende tabletas, cápsulas, pastillas o tabletas masticables de liberación inmediata. En una modalidad, la forma de dosificación oral se formula de acuerdo con el perfil de liberación deseado del ingrediente activo farmacéutico como conoce un experto en la técnica.
30 Las composiciones perorales, en algunas modalidades, comprenden soluciones, emulsiones, suspensiones líquidas, y similares. En algunas modalidades, los portadores farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de tales composiciones se conocen bien en la técnica. En algunas modalidades, las composiciones orales líquidas comprenden de aproximadamente 0,001 % a aproximadamente 0,933 % del compuesto o compuestos deseados, o en otra modalidad, de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10 %. 35
En algunas modalidades, las composiciones para uso médico de esta invención comprenden soluciones o emulsiones, que pueden ser soluciones o emulsiones acuosas que comprenden una cantidad segura y eficaz de los compuestos de la presente invención y opcionalmente, otros compuestos, previstos para una administración intranasal tópica. En algunas modalidades, las composiciones h comprenden de aproximadamente 0,001 % a 40 aproximadamente 10,0 % en p/v de un compuesto objetivo, con mayor preferencia de aproximadamente 00,1 % a aproximadamente 2,0, que se usa para la administración sistémica de los compuestos mediante la vía intranasal.
En otra modalidad, el factor de coagulación modificado con CTP puede inyectarse en el músculo (inyección intramuscular), o puede inyectarse debajo de la piel (inyección subcutánea), o inyectarse en la piel, o administrarse 45 por medio de administración sistémica, o administrarse por inyección intravenosa. En otra modalidad, la administración puede ser administración parenteral, pulmonar, oral, tópica, intradérmica, intramuscular, intraperitoneal, intravenosa, subcutánea, intranasal, transnasal, intraocular, oftálmica, epidural, bucal, rectal, transmucosal, intestinal o parenteral, que incluye inyecciones intramedulares así como administración intratecal o intraventricular directa. 50
En otra modalidad, la preparación se administra de una manera local en lugar de sistémica, por ejemplo, por medio de la inyección de la preparación directamente en una región específica del cuerpo de un paciente.
En una modalidad, la vía de administración puede ser enteral. En otra modalidad, la vía puede ser conjuntival, 55 transdérmica, intradérmica, intraarterial, vaginal, rectal, intratumoral, paracanceral, transmucosal, intramuscular, intravascular, intraventricular, intracraneal, intranasal, sublingual, o una combinación de estas.
En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por inyección intravenosa, intraarterial, o intramuscular de una preparación líquida. En algunas modalidades, las formulaciones líquidas incluyen soluciones, 60 suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. En una modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intravenosa, y se formulan por lo tanto en una forma adecuada para la administración intravenosa. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intraarterial y por lo tanto se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. En otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran por vía intramuscular, y se formulan por lo tanto en una forma adecuada para la 65 administración intramuscular.
Además, en otra modalidad, las composiciones farmacéuticas se administran de manera tópica a las superficies corporales, y se formulan por lo tanto en una forma adecuada para la administración tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, los compuestos de la presente invención se combinan con un agente o agentes terapéuticos adecuados adicionales, 5 preparados y aplicados como soluciones, suspensiones o emulsiones en un diluyente fisiológicamente aceptable con o sin un portador farmacéutico.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas de la presente invención se fabrican mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de procesos convencionales de mezclado, disolución, granulación, 10 producción de grajeas, levigación, emulsión, encapsulado, atrapamiento o liofilización.
En una modalidad, las composiciones farmacéuticas para usar de acuerdo con la presente invención se formulan de una manera convencional mediante el uso de uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en las preparaciones, las cuales 15 pueden usarse farmacéuticamente. En una modalidad, la formulación depende de la vía de administración escogida.
En una modalidad, los inyectables de la invención se formulan en soluciones acuosas. En una modalidad, los inyectables de la invención se formulan en tampones fisiológicamente compatibles como solución de Hank, solución de Ringer, o tampón de solución salina fisiológica. En algunas modalidades, para la administración transmucosal, en la formulación se usan penetrantes adecuados para la barrera que se va a penetrar. Dichos penetrantes 20 generalmente se conocen en la técnica.
En una modalidad, las preparaciones descritas en la presente se formulan para una administración parenteral, por ejemplo, mediante inyección por bolo o infusión continua. En algunas modalidades, las formulaciones para inyección se presentan en forma de dosificación unitaria, por ejemplo, en ampollas o en recipientes de múltiples dosis con 25 opcionalmente, un conservante adicionado. En algunas modalidades, las composiciones son suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos aceitosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilizantes y/o dispersantes.
Las composiciones comprenden, además, conservantes, tales como cloruro de benzalconio y timerosal y similares; 30 agentes quelantes, como edetato de sodio y otros; tampones como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; agentes de ajuste de la viscosidad, tales como polímeros, que incluyen celulosa y derivados de esta; y polivinil alcohol y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según se necesite. Las composiciones pueden comprender, además, anestésicos locales u 35 otros activos. Las composiciones pueden usarse como aerosoles, neblinas, gotas y similares.
En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas para la administración parenteral incluyen soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Adicionalmente, las suspensiones de los ingredientes activos, en algunas modalidades, se preparan como suspensiones adecuadas para inyección basadas en aceite o 40 agua. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados incluyen, en algunas modalidades, aceites grasos como aceite de sésamo, o ésteres sintéticos de ácidos grasos como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección contienen, en algunas modalidades, sustancias, que aumentan la viscosidad de la suspensión, tal como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. En otra modalidad, la suspensión contiene, además, estabilizadores o agentes adecuados que aumentan la solubilidad de los ingredientes activos 45 para permitir la preparación de soluciones muy concentradas.
En otra modalidad, el compuesto activo puede administrarse en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat y otros, en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez- Berestein y Fidler (eds.), Liss, Nueva York, pp. 353-365 (1989); Lopez-Berestein, ibid., pp. 317-50 327; J. E. Diederichs y al., Pharm./nd. 56 (1994) 267- 275).
En otra modalidad, la composición farmacéutica suministrada en un sistema de liberación controlada se formula para la infusión intravenosa, bomba osmótica implantable, parche transdérmico, liposomas, u otros modos de administración. En una modalidad, se usa una bomba (véase Langer, más arriba; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. 55 Eng. 14:201 (1987); Buchwald y otros, Surgery 88:507 (1980); Saudek y otros, N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). En otra modalidad, pueden usarse materiales poliméricos. Aún en otra modalidad, un sistema de liberación controlada puede colocarse próximo al blanco terapéutico, por ejemplo, el cerebro, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase por ejemplo, Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, más arriba, vol. 2, pp. 115-138 (1984). Otros sistemas de liberación controlada se analizan en la revisión de Langer (Science 249: 1527-1533 60 (1990).
En algunas modalidades, el ingrediente activo está en forma de polvo para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, solución a base de agua, estéril, libre de pirógenos, antes del uso. Las composiciones se formulan, en algunas modalidades, para la administración por atomización e inhalación. En otra modalidad, las 65 composiciones están contenidas en un contenedor con medios de atomización adheridos.
En una modalidad, la preparación de la presente invención se formula en composiciones rectales tal como supositorios o enemas de retención, mediante el uso, por ejemplo, de bases convencionales de supositorios tal como manteca de cacao u otros glicéridos.
5 En algunas modalidades, las composiciones farmacéuticas adecuadas para usar en el contexto de la presente invención incluyen composiciones en donde los ingredientes activos se contienen en una cantidad eficaz para lograr el propósito deseado. En algunas modalidades, una cantidad con eficacia terapéutica significa una cantidad de ingredientes activos eficaces para usar en la prevención, alivio o mejoría de los síntomas de una enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se trata. 10
En una modalidad, la determinación de una cantidad con eficacia terapéutica está dentro de la habilidad de los expertos en la técnica.
Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como portadores farmacéuticamente aceptables o componentes 15 de estos son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa, y metilcelulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, tales como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como aceite de maní, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de theobroma; polioles tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; 20 ácido algínico; emulsionantes, tales como los emulsionantes de la marca Tween™; agentes humectantes, tales como lauril sulfato de sodio; agentes colorantes; agentes saborizantes; agentes de formación de tabletas, estabilizadores; antioxidantes; conservantes; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; y soluciones tampón de fosfato. La elección de un portador farmacéuticamente aceptable para usarse junto con el compuesto se determina básicamente por la manera en que el compuesto se va a administrar. Si el compuesto objetivo es para 25 inyectar, en una modalidad, el portador farmacéuticamente aceptable es solución salina fisiológica, estéril, con un agente de suspensión compatible con la sangre, cuyo pH se ha ajustado a aproximadamente 7,4.
Adicionalmente, las composiciones pueden comprender además aglutinantes (por ejemplo acacia, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma de guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropil metil celulosa, povidona), 30 agentes desintegrantes (por ejemplo almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa sódica, crospovidona, goma de guar, glicolato de almidón sódico), tampones (por ejemplo, Tris-HCl, acetato, fosfato) de varios pH y fuerza iónica, aditivos tales como albúmina o gelatina para prevenir la absorción a superficies, detergentes (por ejemplo, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de proteasas, tensoactivos (por ejemplo, lauril sulfato de sodio), potenciadores de la permeación, agentes solubilizantes 35 (por ejemplo, glicerol, glicerol de polietileno), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metabisulfito sódico, hidroxianisol butilado), estabilizantes (por ejemplo, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetil celulosa), agentes que aumentan la viscosidad (por ejemplo, carbómero, dióxido de silicio coloidal, etilcelulosa, goma de guar), edulcorantes (por ejemplo aspartamo, ácido cítrico), conservantes (por ejemplo, timerosal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, lauril sulfato de sodio), 40 adyuvantes de flujo (por ejemplo, dióxido de silicio coloidal), plastificantes (por ejemplo ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (por ejemplo carbómero, hidroxipropilcelulosa, laurilsulfato sódico), recubrimientos de polímeros (por ejemplo, poloxámeros o poloxaminas), agentes de recubrimiento y formadores de película (por ejemplo etilcelulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
45 Los componentes típicos de los portadores para jarabes, elíxires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metil celulosa, carboximetilcelulosa sódica, celulosa (por ejemplo Avicel™, RC-591), tragacanto y alginato de sodio; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y sorbitán de óxido de polietileno (por ejemplo polisorbato 80). Los conservantes típicos incluyen metil parabeno y benzoato de sodio. En otra 50 modalidad, las composiciones líquidas perorales contienen, además, uno o más componentes tales como edulcorantes, agentes saborizantes y colorantes descritos anteriormente.
En algunas modalidades, la preparación de una cantidad o dosis eficaz puede estimarse inicialmente a partir de ensayos in vitro. En una modalidad, una dosis puede formularse en modelos animales y dicha información puede 55 usarse para determinar con mayor precisión las dosis útiles en los seres humanos.
En una modalidad, la toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritas en la presente puede determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales experimentales. En una modalidad, los datos obtenidos a partir de estos ensayos in vitro y en cultivo celular y 60 estudios en animales pueden usarse para formular un intervalo de dosificación para usar en el ser humano. En una modalidad, las dosificaciones varían en dependencia de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y dosificación puede ser elegida por el médico individual teniendo en cuenta la afección del paciente. (Ver, por ejemplo Fingl y otros, 1975, en quot;The Pharmacological Basis of Therapeuticsquot;, C. 1 p.1]. 65
En dependencia de la severidad y la capacidad de respuesta de la afección que se va a tratar, la dosificación puede ser de una única administración o una pluralidad de ellas, donde un curso de tratamiento puede durar de varios días a varias semanas o hasta que se logre la cura o la diminución del estado de la enfermedad.
5 La cantidad de una composición que se va a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto que se trata, la severidad de la afección, la manera de administración, el criterio del médico responsable, etcétera.
En una modalidad, las composiciones que incluyen la preparación de la presente invención formulada en un portador farmacéutico compatible se preparan, además, colocadas en un contenedor adecuado, y marcado para el 10 tratamiento de una afección indicada.
En otra modalidad, un factor de coagulación como se describe en la presente es una preparación liofilizada (es decir, secada por congelación) en combinación con excipientes orgánicos complejos y estabilizadores tales como agentes tensoactivos no iónicos (es decir, surfactantes), diversos azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina sérica humana. 15 En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en agua estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en PBS estéril para inyección. En otra modalidad, una composición farmacéutica comprende un factor de coagulación liofilizado como se describe en NaCl al 0,9 % estéril para inyección. 20
En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende el factor de coagulación modificado con CTP como se describe en la presente y portadores complejos como albúmina sérica humana, polioles, azúcares y agentes estabilizantes tensoactivos aniónicos. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende el factor de coagulación modificado con CTP como se describe en la presente y ácido lactobiónico y un tampón de 25 acetato/glicina. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende el factor de coagulación modificado con CTP como se describe en la presente y aminoácidos, tal como arginina o glutamato que aumentan la solubilidad de las composiciones de interferón en agua. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación modificado con CTP, liofilizado, como se describe en la presente y glicina o albúmina sérica humana (HSA), un tampón (por ejemplo acetato) y un agente isotónico (por ejemplo NaCl). En otra modalidad, la composición 30 farmacéutica comprende un factor de coagulación modificado con CTP, liofilizado, como se describe en la presente y tampón fosfato, glicina y HSA.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente se estabiliza cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH entre aproximadamente 4 y 35 7,2. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH entre aproximadamente 4 y 8,5. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH entre aproximadamente 6 y 7. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación está en una solución tamponada que tiene un pH de aproximadamente 6,5. En otra modalidad, la composición farmacéutica que 40 comprende un factor de coagulación como se describe en la presente se estabiliza con un aminoácido como un agente estabilizante y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral cargada).
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente es una composición líquida que comprende un agente estabilizante entre aproximadamente 0,3 % y 5 % en 45 peso el cual es un aminoácido.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente proporciona precisión de la dosificación y seguridad del producto. En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente proporciona una formulación 50 líquida, estable, biológicamente activa, para usar en aplicaciones inyectables. En otra modalidad, la composición farmacéutica comprende un factor de coagulación no liofilizado como se describe en la presente.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente proporciona una formulación líquida que permite el almacenamiento durante un periodo de tiempo largo en 55 un estado líquido que facilita el almacenamiento y el envío antes de su administración.
En otra modalidad, la composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente comprende lípidos sólidos como material de matriz. En otra modalidad, la composición farmacéutica inyectable que comprende un factor de coagulación como se describe en la presente comprende lípidos sólidos 60 como material de matriz. En otra modalidad, la producción de micropartículas de lípidos mediante congelación por pulverización se describió por Speiser (Speiser y al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) seguido por nanogránulos de lípidos para la administración peroral (Speiser EP 0167825 (1990)). En otra modalidad, los lípidos que se usan se toleran bien por el cuerpo (por ejemplo glicéridos compuestos de ácidos grasos que están presentes en las emulsiones para la nutrición parenteral). 65
Las composiciones de la presente invención pueden presentarse en un envase o dispositivo dispensador, tal como un estuche aprobado por la FDA, que contiene una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. En una modalidad, el envase, por ejemplo, comprende una lámina de metal o plástico, tal como un blíster. En una modalidad, el envase o dispositivo dispensador se acompaña de instrucciones para la 5 administración. En una modalidad, el envase o dispensador incluye un aviso asociado con el contenedor en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, el uso o la venta de los productos farmacéuticos, dicho aviso es reflejo de la aprobación por la agencia de la forma de las composiciones o la administración humana o veterinaria. Dicho aviso, en una modalidad, es el etiquetado aprobado por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos para los fármacos controlados, o el prospecto 10 del producto aprobado.
Se apreciará que los factores de coagulación modificados con CTP de la presente invención pueden proporcionarse al individuo con agentes activos adicionales para lograr un mejor efecto terapéutico en comparación con el tratamiento con cada agente por sí mismo. En una modalidad, se toman medidas (por ejemplo, la dosificación y la 15 selección del agente complementario) para evitar los efectos secundarios adversos que se asocian con las terapias de combinación.
En la presente se describe un método para tratar la hemofilia en un sujeto, que comprende administrar un polipéptido del factor VIIa (FVIIa) modificado con CTP que comprende un polipéptido de FVIIa y tres péptidos del 20 carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido de FVIIa a dicho sujeto, para así tratar la hemofilia en dicho sujeto.
En una modalidad, la presente invención proporciona un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en un polipéptido del FIX y tres péptidos del carboxilo terminal (CTP) de la gonadotropina, unidos al 25 carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX modificado con CTP. En una modalidad, al menos un CTP se une a dicho polipéptido del FIX por medio de un enlazador. En una modalidad, dicho enlazador es un enlace peptídico.
En una modalidad, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el polipéptido del FIX modificado con CTP. 30
En una modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica un polipéptido modificado con CTP que consiste en un polipéptido del factor IX (FIX) y tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina (CTP) unidos al carboxilo terminal de dicho polipéptido del FIX. En otra modalidad, la presente invención proporciona un polinucleótido, en donde la secuencia de dicho polinucleótido es como se expone en la sec. con núm. de ident.: 35 30. Como se conoce generalmente en la técnica, los péptidos y proteínas modificados de la invención pueden acoplarse a marcajes, fármacos, agentes de direccionamiento, portadores, soportes sólidos y similares, en dependencia de la aplicación deseada. Las formas marcadas de los agentes biológicos modificados pueden usarse para seguir su destino metabólico; los marcajes adecuados para este propósito incluyen, especialmente, marcajes con radioisótopos tales como yodo 131, tecnecio 99, indio 111, y similares. Los marcajes pueden usarse, además, 40 para mediar la detección de las proteínas o péptidos modificados en sistemas de ensayo; en este caso, también pueden usarse los radioisótopos así como marcajes con enzimas, marcajes fluorescentes, marcajes cromogénicos y similares. El uso de tales marcajes es particularmente útil si el péptido o la proteína es en sí mismo un agente de direccionamiento tal como un anticuerpo o un ligando de un receptor.
45 Pueden emplearse técnicas de unión similares, junto con otras, para acoplar los péptidos y proteínas modificados de la invención a soportes sólidos. Cuando se acoplan, estos péptidos y proteínas modificados pueden usarse después como reactivos de afinidad para la separación de componentes deseados con los que se muestra una reacción específica.
50 Se describe, además, que los péptidos y proteínas modificados de la invención pueden usarse para generar anticuerpos específicamente inmunorreactivos con estos nuevos compuestos. Estos anticuerpos son útiles en una variedad de aplicaciones diagnósticas y terapéuticas, en dependencia de la naturaleza de la actividad biológica del péptido o proteína no modificados. Debe entenderse que la invención proporciona anticuerpos que son inmunorreactivos con FIX, FVII o FVIIa modificados con CTP como se describe en la presente. En una modalidad, 55 tales anticuerpos pueden usarse para distinguir o identificar los factores de coagulación modificados con CTP administrados con relación a los factores de coagulación endógenos. En otra modalidad, los anticuerpos pueden usarse para localizar los factores de coagulación modificados con CTP administrados.
Otros objetos, ventajas y características novedosas de la presente invención resultarán evidentes para una persona 60 experta en la técnica luego del análisis de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas modalidades y aspectos de la presente invención tal como se expone en la presente descripción y como se reivindica en la sección de reivindicaciones más abajo encuentra apoyo experimental en los siguientes ejemplos.
65
Ejemplos
Generalmente, la nomenclatura usada en la presente y los procedimientos de laboratorio utilizados en la presente invención incluyen técnicas moleculares, bioquímicas, microbiológicas y de ADN recombinante. Dichas técnicas se explican ampliamente en la literatura. Véase, por ejemplo, quot;Molecular Cloning: A laboratory Manualquot; Sambrook y otros, (1989); quot;Current Protocols in Molecular Biologyquot; Volúmenes I-III Ausubel, R. M., ed. (1994); Ausubel y otros, 5 quot;Current Protocols in Molecular Biologyquot;, John Wiley and Sons, Baltimore, Maryland (1989); Perbal, quot;A Practical Guide to Molecular Cloningquot;, John Wiley & Sons, Nueva York (1988); Watson y otros, quot;Recombinant ADNquot;, Scientific American Books, Nueva York; Birren y otros (eds) quot;Genome Analysis: A Laboratory Manual Seriesquot;, Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (1998); metodologías como se exponen en las patentes de EE.UU. núms. 4,666,828; 4,683,202; 4,801,531; 5,192,659 y 5,272,057; quot;Cell Biology: A Laboratory Handbookquot;, Volúmenes 10 I-III Cellis, J. E., ed. (1994); quot;Culture of Animal Cells - A Manual of Basic Techniquequot; de Freshney, Wiley-Liss, N. Y. (1994), Tercera Edición; quot;Current Protocols in Immunologyquot; Volúmenes I-III Coligan J. E., ed. (1994); Stites y otros (eds), quot;Basic and Clinical Immunologyquot; (8va Edición), Appleton y Lange, Norwalk, CT (1994); Mishell y Shiigi (eds), quot;Selected Methods in Cellular Immunologyquot;, W. H. Freeman y Co., Nueva York (1980); los inmunoensayos disponibles se describen ampliamente en la literatura científica y de patentes, véase, por ejemplo, las patentes de 15 EE.UU. núms. 3,791,932; 3,839,153; 3,850,752; 3,850,578; 3,853,987; 3,867,517; 3,879,262; 3,901,654; 3,935,074; 3,984,533; 3,996,345; 4,034,074; 4,098,876; 4,879,219; 5,011,771 y5,281,521; quot;Oligonucleotide Synthesisquot; Gait, M. J., ed. (1984); quot;Nucleic Acid Hybridizationquot; Hames, B. D., y Higgins S. J., eds. (1985); quot;Transcription and Translationquot; Hames, B. D., e Higgins S. J., eds. (1984); quot;Animal Cell Culturequot; Freshney, R. I., ed. (1986); quot;Immobilized Cells and Enzymesquot; IRL 20 Press, (1986); quot;A Practical Guide to Molecular Cloningquot; Perbal, B., (1984) y quot;Methods in Enzymologyquot; Vol. 1-317, Academic Press; quot;PCR Protocols: A Guide To Methods And Applicationsquot;, Academic Press, San Diego, CA (1990); Marshak y otros, quot;Strategies for Protein Purification and Characterization - A Laboratory Course Manualquot; CSHL Press (1996). A lo largo de este documento se proporcionan otras referencias generales.
25
Ejemplo 1
Generación y utilización del Factor de coagulación IX
Clonaje y expresión de la molécula de FIX recombinante: 30
Los clones del factor IX se construyeron en nuestro vector de expresión en eucariota pCI-neo (Promega, núm. de catálogo E1841). El clon del ORF del factor de coagulación IX de Homo sapiens se solicitó a quot;OriGenequot; (RC219065). Los cebadores se solicitaron a Sigma-Genosys.
35
Construcción de 301-1-pCI-neo-p200-11 (Factor IX-ctp x2):
Cebador 101: 5' GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3' (sec. con núm. de ident.: 36)
Cebador 103R: 5' TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3' (contiene el sitio de SspI del factor IX) (sec. con núm. de ident.: 37) 40 Se realizó una reacción de PCR con el cebador 101 y el cebador 103Ry ADN plasmídico, el clon de ADNc del factor IX (OriGenequot; RC219065) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼ 1085 pb (pcr 10) y se purificó a partir del gel (el fragmento que contenía el amino terminal de la secuencia del factor IX).
Cebador 98: 5' ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3' (sec. con núm. de ident.: 38)
Cebador 99R : 5' GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3' (sec. con núm. de ident.: 39) 45
Cebador 100: 5' GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3' (sec. con núm. de ident.: 40)
Cebador 27R: 5' TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3' (sec. con núm. de ident.: 41)
Se realizaron tres reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 98 y el cebador 99R y ADN plasmídico, el clon de ADNc del factor IX (OriGenequot;, RC219065) como molde; como resultado de la amplificación por 50 PCR, se formó un producto de ∼ 540 pb.
La segunda reacción se realizó con el cebador 100 y el cebador 27R y ADN plasmídico de 402-2-p72-3 (hGH-CTP-CTP) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼ 258 pb.
55 La última reacción (pcr 3) se realizó con los cebadores 98 y 27R y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼ 790 pb y se ligó en el vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01). Se aisló el fragmento de SspI -EcoRI (TA 3-3).
Otra reacción de PCR se realizó (pcr 12) con el cebador 101 y el cebador 27R y una mezcla de los productos de la 60 pcr 10 y el fragmento de SspI-EcoRI de la pcr 3 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼ 1700 pb (Factor IX-ctp-ctp) y se ligó al vector de clonación TA (Invitrogen, catálogo K2000-01) (lig 180).
Se encontró un error en la secuencia del factor IX por lo que los fragmentos se volvieron a colocar para formar un 65 inserto del Factor IX-ctp-ctp con la secuencia de ADN correcta.
TA- pcr 3-3 se digirió con SspI y XbaI y se aisló el fragmento grande (vector). TA 180-4 se digirió con SspI y XbaI y se aisló el fragmento pequeño (inserto) y se ligó al fragmento grande aislado de TA-pcr-3-3digerido con SspI y Xbal. El nuevo plásmido TA-183-2 se digirió con Sal I y NotI, y se aisló el inserto Factor IX-CTP-CTP (∼1575 pb). Este fragmento se insertó en el vector de expresión pCI-neo de eucariotas (digerido con Sal I y Not I) para producir el clon 5 301-2-p200-11.
Construcción pCI-dhfr -Factor 9- ctpx2 (p223-4): El vector pCI-dhfr (p6-1) se digirió con SmaI y NotI. Factor IX-CTP-CTP (p200-11) se digirió con ASisI F.I. y Notl. Los dos fragmentos se ligaron.
10 Construcción pCI-dhfr Factor 9-ctp x3 (p225-7): El vector pCI-dhfr OXM-CTP×3 (p216-4) se digirió con XbaI y Apal. El factor IX-CTP-CTP (223-4) se digirió con XbaI y Apal. Los dos fragmentos se ligaron.
Construcción pCI-dhfr Factor 9-ctp x3 T148A (p243-2): El plásmido p225-7 contenía treonina en la posición 148, dado que la versión más común del FIX contiene alanina en esta posición, la Thr se reemplazó por Ala mediante el 15 uso del método de mutagénesis dirigida a un sitio.
Cebador 75: ctcccagttcaattacagct (sec. con núm. de ident.: 42)
Cebador 122r: ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc (sec. con núm. de ident.: 43)
Cebador 123: gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat (sec. con núm. de ident.: 44) 20
Cebador 124r: caacacagtgggcagcag (sec. con núm. de ident.: 45)
Se realizaron tres reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 75 y el cebador 122r y ADN plasmídico p225-7 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼ 692 pb y se purificó a partir del gel. Una segunda reacción de PCR se realizó con el cebador 123 y el cebador 124r y ADN 25 plasmídico p225-7 como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼237 pb y se purificó a partir del gel. La tercera reacción de PCR de superposición se realizó con los cebadores 75 y 124r, y una mezcla de los productos de las dos reacciones anteriores como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼ 910 pb. Este producto de PCR de superposición se digirió con XbaI y NsiI y se volvió a ligar al plásmido p225-7 (digerido con XbaI y Nsil) para producir el Factor IX-ctpx3 T148A designado p243-2. 30
Construcción FIX-4CTP (p259-4): El fragmento 3,5CTP se aisló a partir de oxym-4CTP (p254-3) mediante las enzimas de restricción Apa1 y Xbal. El fragmento FIX+0,5CTP se aisló a partir de FIX-3CTP (p243-2) con las enzimas de restricción Apa1 y Xbal. Los dos fragmentos se ligaron.
35 Construcción FIX-5CTP (p260-18): El fragmento 4,5CTP se aisló a partir de oxym-5CTP (255-1) mediante las enzimas de restricción Apa1 y Xbal. El fragmento FIX+0,5CTP se aisló a partir de FIX-3CTP (p243-2) mediante el uso de las enzimas Apa1 y Xbal. Los dos fragmentos se ligaron.
Las células Dg44 se sembraron en placas para cultivo de tejidos de 100 mm y se cultivaron hasta una confluencia 40 del 50-60 %. Un total de 2 µg (microgramo) de ADNc de FIX se usó para la transfección de una placa de 100 mm mediante el uso del reactivo FuGene (Roche) en medio libre de proteína (Invitrogene CD Dg44). El medio se eliminó 48 horas después de la transfección y se reemplazó con un medio libre de proteína (Invitrogene CD Dg44) sin nucleósidos y en presencia de 800 µg/ml de G418 (neomicina). Después de 14 días, la población celular transfectada se transfirió a matraces para el cultivo de tejidos T25, y la selección continuó durante otros 10-14 días 45 hasta que las células comenzaron a crecer como clones estables. Se seleccionaron clones con alta expresión. Se usaron aproximadamente 2x107 células para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella de rodillo de 1700 cm2 (Corning, Corning NY), suplementado con vitamina K3 a 5 ng/ml (menadiona bisulfato de sodio; Sigma). El medio de producción (cosecha) se recogió después de una disminución rápida en la viabilidad celular a aproximadamente 70 %. El medio de producción se clarificó primero y después se concentró aproximadamente 20 50 veces y se dializó con PBS mediante el uso de un casete de filtración de flujo (10 KDa MWCO; Millipore Corp.).
Determinación del nivel del antígeno FIX: los niveles de antígeno en la cosecha de FIX-CTP se determinaron mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano AssayMax (AssayPro-EF1009-1). La concentración de proteínas calculada es el promedio de tres diluciones diferentes en dos ejecuciones independientes (figura 1A, tabla 55 1).
Tabla 1: Concentración de proteínas calculada
FIX SDS-PAGE - inmunotransferencia: las cosechas de FIX-CTP o rhFIX purificado (American Diagnostics), 100 ng de proteína, se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del anticuerpo policlonal anti-FIX humano y anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics). Como se informó previamente, rhFIX migró a 55 KDa, mientras que FIX fusionado a dos CTP migró a 5 75 KDa. Ambas variantes de las proteínas FIX-CTP se mostraron estar gamma carboxiladas, una modificación postraduccional esencial para la actividad y la función de FIX (figura 1B).
Determinación de la actividad cromogénica de FIX: Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de las cosechas de FIX-CTP frente a la proteína rhFIX (American Diagnostics) se realizó mediante el uso del estuche de 10 prueba para la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos, calcio, cantidades en exceso de FXIa activa el FIX muestreado a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina, FVIII activado:C (suministrado en cantidades en exceso), fosfolípidos, y calcio y activa el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se mide después mediante su actividad específica 15 sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generado es directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX y las cosechas de FIX-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de las cosechas de FIX con una preparación de referencia que consistió en rhFIX o plasma humano. La EC50 promedio del FIX fue 21 ng/ml, mientras que la EC50 calculada para la cosecha de FIX-(CTP2) fue 382 ng/ml, y la EC50 calculada para la cosecha de FIX-CTP fue 1644 ng/ml. Se 20 observó una disminución de aproximadamente 15 veces en la actividad enzimática de la cosecha de FIX-(CTP2) (figura 2).
Actividad de coagulación de FIX (aPTT): El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínseca y común de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo, en segundos, para que el plasma se coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio. El reactivo 25 de aPTT se denomina una tromboplastina parcial porque el factor tisular no se incluye con el fosfolípido ya que está con el reactivo protime (PT). El activador inicia el sistema y después tiene lugar el resto de las etapas de la vía intrínseca en presencia de fosfolípido. El intervalo del aPTT de referencia varía entre los diferentes laboratorios, pero usualmente está en el intervalo de 27-34 segundos.
30 Lo importante del ensayo fue cuantificar la capacidad de las cosechas de FIX-CTP para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento de FIX mediante la adición de rhFIX. Se mezclaron 300 µl de plasma humano deficiente de FIX con 100 µl de rhFIX o las cosechas de FIX-CTP y diluidas en serie. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron tromboplastina, CaCl2 y fosfolípidos a la mezcla, y se determinó el tiempo de coagulación en segundos (realizado por American Medical Laboratories). La potencia se 35 evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de las cosechas de FIX con una preparación de referencia que consistió en rhFIX o plasma humano. Una unidad de actividad de FIX corresponde a la concentración del FIX que iguala la actividad de un ml de plasma humano normal. Los resultados de aPTT presentados indican que FIX-(CTP)2 muestra una reducción de 5,7 veces en su actividad específica de coagulación en comparación con rhFIX (tabla 2). Además, los resultados de aPTT junto con el ensayo de la actividad cromogénica in vitro sugieren 40 que la cosecha de FIX-(CTP)2 tiene una actividad enzimática mejorada frente a la cosecha de FIX-CTP (tabla 2). Una mejor actividad de las proteínas FIX-CTP puede obtenerse después de la optimización del sistema de expresión (es decir cotransfección con furina y optimización de la concentración de vitamina K3 en el medio), que se fortaleció después de la super-transfección con furina (datos no mostrados).
45
Tabla 2: Actividad de coagulación de FIX
Estudio farmacocinético: rhFIX (American Diagnostic) y las cosechas de FIX-CTP se administraron en una única 50 inyección intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (seis ratas por sustancia) a una dosis de 75 µg/kg de peso corporal (tabla 3).
Tabla 3: Plan de operación del estudio PK
5
- Grupos tratados
- Elemento de prueba Núm. de animales / grupo Vía de dosificación Género Nivel de dosis (µg/kg) Nivel de dosis (µg por animal) Vol. inyectado (µl) Con. (µg/ml) *Puntos de tiempo (horas después de la dosis)
- 1
- rFIX 6 IV M 75 15 500 30 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 1,5, 4, 8, 24, 48, 72.
- 2
- rFIX-CTP 6 IV M 75 15 500 30 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 1,5, 4, 8, 24, 48, 72.
- 3
- rFIX-CTP-CTP 6 IV M 75 15 1000 15 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 1,5, 4, 8, 24, 48, 72.
Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 1,5, 4, 8, 24, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. La concentración del FIX se cuantificó mediante ensayo ELISA específico para 10 FIX (AssayPro). Se calculó un perfil farmacocinético para cada proteína y representa la media de 3 animales en cada punto de tiempo (figura 3). Los tiempos de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK solutions 2.0. La tabla 4 resume las concentraciones observadas de FIX en los diferentes puntos de tiempo de muestreo.
15
Tabla 4: Concentraciones de FIX observadas
El perfil PK y el resumen de los tiempos de vida media terminal se resumen en la tabla 5. Las cosechas de FIX-CTP 20 muestran mejores valores de T½β en comparación con rhFIX (aumentos de 2 y 5 veces, respectivamente). Dado que en la recolección de la dosificación del FIX, las concentraciones séricas en el animal del FIX a las 24 horas estaban por debajo del límite de cuantificación (BLQ), no se calcularon otros parámetros PK.
Tabla 5: Resumen de los parámetros PK 25
En este estudio, se describió un novedoso enfoque para prolongar el tiempo de vida media del FIX mientras que se retiene la potencia terapéutica. La adición de un péptido CTP a una proteína activa tiene un potencial perjudicial al interferir con la actividad de la proteína. Por lo tanto, la generación de un FIX-CTP recombinante activo mediante la 5 adición de una secuencia CTP en el extremo C-terminal del FIX es inesperada.
Caracterización de un FIX-CTP-CTP purificado por inmunoafinidad
Purificación del FIX-CTP-CTP 10
Para evaluar una proteína en un contenido de alto grado con aumento de la actividad cuyo perfil PK imita y puede extrapolarse a un entorno clínico, FIX-CTP-CTP es un FIX modificado con 2 unidades de CTP en tándem en su carboxilo terminal. FIX-CTP-CTP se purificó mediante el uso de un anticuerpo monoclonal unido a la matriz contra residuos γ carboxiglutamilo (Gla) presentes en la región N-terminal del FIX (American Diagnostics Cat. # 3570MX). 15 El anticuerpo monoclonal se unió a sefarosa CL-4B. La cosecha de FIX-CTP-CTP a una concentración de 88 µg/ml se dializó contra Tris 20 mM, NaCl 150 Mm y EDTA 10 mM a pH =7,4. La velocidad de carga fue 0,5 ml/min, la elución se realizó mediante el uso de Tris-HCl 20 Mm, NaCl 350 mM y CaCl 50 mM, y la fracción no unida se recicló cinco veces. Finalmente, la fracción de elución se dializó con PBS, se mezcló bien y se concentró.
20 Determinación del nivel del antígeno FIX: los niveles de las cosechas de FIX-CTP, las cosechas de FIX-(CTP)2, y la proteína purificada FIX-(CTP)2 se determinaron mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. #FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada (µg/ml) es el promedio de dos ejecuciones independientes (figura 4, tabla 6).
25
Tabla 6: Concentración de proteínas calculada
Adicionalmente, FIX-CTP-CTP se cuantificó mediante el ensayo de Bradford. La concentración calculada fue 202 30 µg/ml, que es similar a la concentración obtenida por el ELISA para FIX humano.
Transferencias de SDS-PAGE: la cosecha de FIX-CTP-CTP, la fracción no unida y la proteína purificada, se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis del SDS-PAGE Coomassie se realizó mediante tinción del gel con el reactivo azul de 35 Coommasie (800 ng de proteína). Se realizó una inmunotransferencia Western con 100 ng de proteína, anticuerpo policlonal anti-FIX humano (Ac), y Ac monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics Cat #499 y #3570). El procedimiento de purificación por inmunoafinidad enriqueció significativamente la porción FIX-CTP-CTP mientras que se redujeron las impurezas (figura 5).
40 Secuenciación del N-terminal: La proteína purificada FIX-CTP-CTP se separó mediante SDS-PAGE en Tris-glicina al 12 % y posteriormente se electrotransfirió a una membrana de PVDF. La banda de interés se cortó y se colocó sobre un filtro de fibra de vidrio tratada Biobrene, purificado. El análisis de la secuencia N-terminal se llevó a cabo mediante degradación de Edmann con el uso de un secuenciador de proteína líquida por pulsos equipado con un sistema de microgradientes de HPLC 140 C. La secuenciación del N-terminal reveló que FIX-CTP-CTP es una 45 mezcla de proteínas escindidas completas e incompletas del propéptido. Se demostró que la escisión no adecuada del propéptido reduce la actividad de coagulación del FIX. Mediante cotransfección con furina, el proceso de escisión del propéptido puede mejorarse.
Determinación de la actividad cromogénica de FIX: Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de 50 la proteína purificada FIX-CTP-CTP frente a rhFIX (American Diagnostics) y una mezcla de plasma humano normal mediante el uso del estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos y calcio, cantidades en exceso de FXIa activan FIX a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina (suministrada en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio activan el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la 5 cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se midió por su actividad específica sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generada fue directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX, plasma humano y FIX-CTP-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta (figura 6). La ECla proteína purificada FIX-CTP-CTP frente a rhFIX (American Diagnostics) y una mezcla de plasma humano normal mediante el uso del estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos y calcio, cantidades en exceso de FXIa activan FIX a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina (suministrada en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio activan el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la 5 cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se midió por su actividad específica sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generada fue directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX, plasma humano y FIX-CTP-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta (figura 6). La ECla proteína purificada FIX-CTP-CTP frente a rhFIX (American Diagnostics) y una mezcla de plasma humano normal mediante el uso del estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos y calcio, cantidades en exceso de FXIa activan FIX a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina (suministrada en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio activan el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la 5 cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se midió por su actividad específica sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generada fue directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX, plasma humano y FIX-CTP-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta (figura 6). La ECla proteína purificada FIX-CTP-CTP frente a rhFIX (American Diagnostics) y una mezcla de plasma humano normal mediante el uso del estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos y calcio, cantidades en exceso de FXIa activan FIX a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina (suministrada en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio activan el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la 5 cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se midió por su actividad específica sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generada fue directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX, plasma humano y FIX-CTP-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta (figura 6). La ECla proteína purificada FIX-CTP-CTP frente a rhFIX (American Diagnostics) y una mezcla de plasma humano normal mediante el uso del estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). En la presencia de trombina, fosfolípidos y calcio, cantidades en exceso de FXIa activan FIX a FIXa. FIXa forma un complejo enzimático con trombina (suministrada en cantidades en exceso), fosfolípidos y calcio activan el Factor X, presente en el sistema de ensayo, a FXa. La actividad se correlaciona directamente con la 5 cantidad de FIX, que es el factor limitante. El FXa generado se midió por su actividad específica sobre un sustrato cromogénico de FXa (pNA). La cantidad de pNA generada fue directamente proporcional a la actividad de FIXa. rhFIX, plasma humano y FIX-CTP-CTP se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta (figura 6). La EC
Actividad de coagulación de FIX (aPTT): El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es una medida de la 15 integridad de las vías intrínseca y común de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo (medido en segundos) necesario para que el plasma coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio.
El ensayo cuantificó la capacidad de la proteína FIX-CTP-CTP para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento del FIX mediante la adición de rhFIX. 300 µl de plasma humano deficiente de FIX se 20 mezcló con 100 µl de rhFIX, FIX-CTP-CTP (FIX-CTP-CTP (los CTP están en tándem en el C-terminal)), o plasma humano normal mezclado que se diluyó adicionalmente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadió el factor tisular (TF), CaCl2, y fosfolípidos a la mezcla. Se determinó el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de FIX-CTP-CTP con una preparación de referencia de rhFIX o plasma humano. Una unidad de FIX se definió como la cantidad de FIX que 25 iguala la actividad de 1 ml de plasma humano normal.
Los resultados de aPTT indican que la actividad de coagulación de FIX-CTP-CTP es solo 1,4 menor que el plasma humano normal mezclado y similar al rhFIX. Los resultados de aPTT junto con el ensayo de actividad cromogénica in vitro sugieren que la purificación de FIX-CTP-CTP no afectó su actividad. 30
Actividad farmacocinética de FIX-CTP-CTP: FIX-CTP-CTP purificado, rhFIX (American Diagnostic) y las cosechas que contenían FIX-CTP-CTP y FIX-CTP se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (ocho ratas por sustancia) en una dosis de 100 µg/kg de peso corporal (tabla 7).
35
Tabla 7: Descripción del estudio de PK
- Grupos tratados
- Elemento de prueba Núm. de animales/grupo/punto de tiempo Nivel de dosis (µg/kg) Nivel de dosis (µg por animal) Vol. inyectado (µl) Con. (µg/ml) Puntos de tiempo (horas después de la dosis)
- A
- rFIX 8 100 20 500 40 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 7, 10, 24, 48, 72.
- B
- rFIX-CTP (cosecha) 8 100 20 500 40 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 7, 10, 24, 48, 72.
- C
- rFIX-CTP-CTP(cosecha) 6 100 20 500 40 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 7, 10, 24, 48, 72.
- D
- rFIX-CTP-CTP (purificado) 4 100 20 500 40 0,083, 0,5, 1, 2, 4, 7, 10, 24, 4, 8, 72.
Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 4 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 4, 7, 10, 24, 48, y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del 40 muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. La concentración del FIX se cuantificó mediante el uso de un estuche de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína como la media de 4 animales en cada punto de tiempo (figura 7). El tiempo de vida media terminal se calculó mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0. La tabla 8 resume las concentraciones observadas de FIX en diferentes puntos de tiempo de muestreo. 45
Tabla 8: Concentraciones de FIX observadas
En la tabla 9 se presenta un resumen de los parámetros PK.
5
Tabla 9: Resumen de los parámetros PK
10
La cosecha de FIX-CTP-CTP demostró un mejor perfil PK en comparación con la cosecha de FIX-CTP. Además, FIX-CTP-CTP purificado mostró un aumento de 3 veces en el valor de T½β y un aumento de 4,5 veces en el AUC en comparación con rhFIX.
15 La cantidad reducida del FIX secretado fusionado a las moléculas CTP en tándem frente a la fusión de un único CTP parece deberse a la adición de un CTP adicional y no a la detección reducida del ELISA, porque la concentración calculada de FIX-CTP-CTP purificado por Bradford fue similar a la concentración calculada por ELISA.
La actividad de coagulación de FIX-CTP-CTP fue similar al plasma humano mezclado; sin embargo, su actividad 20 cromogénica in vitro fue significativamente menor cuando se comparó con rhFIX o el plasma humano mezclado. El ensayo de actividad cromogénica se reportó como un ensayo muy sensible en comparación con el ensayo de coagulación. El motivo de la actividad reducida de FIX-CTP-CTP puede variar. La adición de CTP puede disminuir la afinidad de FIX por el FXIa o reducir las modificaciones postranscripcionales (por ejemplo 12-10 residuos GLA y la escisión del propéptido). El análisis del N-terminal reveló que la escisión proteolítica del propéptido de FIX-CTP-CTP 25 no se completó totalmente antes de la secreción. Dado que esta modificación postranscripcional es crucial para la actividad enzimática normal de la proteína, la cotransfección con el plásmido de furina-PACE es favorable y puede mejorar la actividad de FIX-CTP-CTP.
Finalmente, el estudio PK comparativo de FIX-CTP-CTP en ratas demostró que la fusión de dos CTP en tándem al C-terminal del FIX generó un FIX con un tiempo de vida media prolongado.
5 Modelo de ratón con agotamiento de FIX: Para evaluar la actividad in vivo, se obtienen ratones con inactivación del FIX, y se establece una colonia de reproducción. Se inyectaron 10 µg de hFIX recombinante comercial (BeneFIX®) o de rFIX-(CTP)2 (FIX-CTP-CTP) en la vena de la cola de un ratón con inactivación del FIX, anestesiado (22-28 g). La cantidad de proteína inyectada es igual a la concentración requerida de FIX en el plasma normal (5 µg/ml). Las muestras de sangre se toman de la cola comprimida a los tubos capilares heparinizados en puntos de tiempo 10 específicos. Las muestras de plasma se evalúan en cuanto a los niveles de FIX mediante ELISA y se mide la eficacia mediante el ensayo de coagulación de aPTT.
Aumento de la eficacia de la escisión del propéptido de FIX: El ADNc del péptido CTP se fusionó al extremo 3’ del ADNc del FIX humano. Las construcciones de expresión de rFIX y Furina correspondientes se co-transfectaron en 15 células Dg44; un ADNc de rFIX humano también se co-transfectó con el plásmido de furina como control. La secreción de un alto nivel de FIX conduce a la secreción de una mezcla del pro-factor y un factor FIX maduro, debido a la cantidad limitada de la proteasa de furina en la célula. La cotransfección de un vector de expresión de furina con un vector de expresión del pro-factor aumenta la recuperación y da como resultado la secreción de FIX completamente procesado al medio. 20
Después de la cotransfección de FIX-(CTP)2 y furina, los clones estables se generan y la cosecha se recolecta para la evaluación de la escisión del propéptido. Se cargan 100 ng de proteína en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realiza mediante inmunotransferencia Western con el uso de Ac policlonal anti-FIX humano (American Diagnostics) y anticuerpo 25 policlonal anti-propéptido. Como se informó previamente, el rhFIX migró a 55 KDa, mientras que el FIX fusionado a dos CTP migró a 75 kDa. Se muestra que ambas variantes de proteínas FIX experimentan una adecuada escisión completa del propéptido.
Para determinar si la escisión adecuada del propéptido mejora la actividad enzimática de FIX-(CTP)2, se realiza una 30 evaluación comparativa de la actividad cromogénica y de coagulación de la cosecha de FIX-(CTP)2 cotransfectada con furina. Se observa una mejora significativa de la actividad específica de FIX-(CTP)2, que es similar a rhFIX.
En conclusión, los resultados descritos en la presente sugieren que FIX-CTP-CTP puede usarse eficazmente para el tratamiento de pacientes con hemofilia B. El FIX fusionado a las construcciones de CTP tiene el beneficio de un 35 mejor rendimiento farmacológico in vivo que supera el inconveniente en determinadas medidas in vitro. Este tratamiento propuesto es ventajoso respecto a los tratamientos anteriores ya que se reduce la tasa de infusiones y la cantidad de dosis requeridas.
Es importante señalar que cuando se usó una estrategia de una molécula fusionada a la albúmina para mejorar el 40 tiempo de vida media del FIX, el FIX recombinante se inactivó. El novedoso enfoque actual conduce al diseño y la purificación de una novedosa proteína fusionada con FIX recombinante que presenta una mejor actividad a largo plazo. Dado que las modificaciones de tamaño solas no mejoraron la farmacocinética del FIX inyectado, el hallazgo de que el CTP fusionado al FIX facilita los parámetros farmacocinéticos fue inesperado. La presencia de residuos de ácido siálico en el péptido altamente glicosilado estabilizó la proteína y la protegió de las interacciones con los 45 receptores vasculares sin anular los determinantes principales de la función de FIX.
FIX-CTP tiene una eficacia terapéutica similar al rFIX en los pacientes con hemofilia B y se necesitó una dosificación menos frecuente. Una única inyección de FIX-CTP es suficiente para controlar los episodios de hemorragia y reducir la cantidad de inyecciones que se necesitan durante una intervención quirúrgica en pacientes con hemofilia B. 50
La tecnología de CTP se utilizó para el desarrollo de un FIX de acción prolongada. Específicamente, la prolongación del tiempo de vida media de la molécula de rFIX recombinante se realizó mediante la fusión de al menos un CTP humano al FIX. El FIX recombinante-CTP se expresó en células de mamífero y se caracterizó in vitro e in vivo. Se demostró que la actividad in vitro de rFIX-CTP fue comparable con rFIX. Los estudios de farmacocinética y eficacia 55 en ratas demostraron propiedades mejoradas del rFIX-CTP. Los resultados de este estudio demuestran que es posible desarrollar una molécula de rFIX con un tiempo de vida media prolongado que tenga propiedades hemostáticas similares a la enzima de tipo silvestre.
Ejemplo 2 60
Evaluación comparativa del FIX-CTP3 purificado vs. FIX-CTP4 y FIX-CTP5
2.1 Objetivo del estudio
Una evaluación comparativa de los parámetros farmacocinéticos de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 frente a FIX-CTP3 después de un proceso de purificación parcial.
2.2 Producción de cosechas de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 5
El ADNc de FIX (OriGene RC219065) fusionado en el extremo C-terminal a cuatro o cinco secuencias de CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de vitamina K3 a 10 ng/l (Sigma, Mennadion). Las cosechas se recolectaron (300 ml), filtraron y congelaron.
10
2.3 Producción de la cosecha de FIX-CTP3
FIX-CTP3 se expresó en el laboratorio en células CHO mediante el uso del vector pCI-DHFR, clon 196, BR-9 en presencia de vitamina K3 a 25 ng/l (Sigma). Las cosechas se recolectaron y filtraron.
15 Todas las muestras de FIX-CTP (3, 4 y 5 CTP) se purificaron solo mediante una columna de jacalina debido a la falta de material.
2.4 Determinación del nivel del antígeno FIX
20
El nivel del antígeno FIX se determinó mediante el uso del estuche de ELISA para el FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada es el promedio de cuatro ejecuciones independientes. La concentración de FIX-CTP3 fue ligeramente mayor en comparación con las dos versiones adicionales (tabla 10).
25
30
Tabla 10: Nivel del Ag FIX
35
2.5 Tinción de Coomassie e inmunotransferencia de FIX-CTP
Las cosechas de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del 40 marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica).
Como se informó previamente, el FIX fusionado a tres CTP migró a 80 kDa mientras que el FIX fusionado a cuatro o 45 cinco CTP migró a 85 KDa o 90 KDa, respectivamente. Como se esperaba, las cosechas de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 de Excellgene mostraron muy bajos niveles de gamma carboxilación en comparación con la cosecha de FIX-CTP3, que se produjo en Prolor (figura 8).
Después de un proceso de purificación con la utilización de una columna de jacalina (purificación por inmunoafinidad 50 de las proteínas glicosiladas), FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El SDS-PAGE se tiñó mediante el colorante azul de Coomassie para la detección de las muestras. Todas las variantes mostraron perfiles de bandas mucho más limpios (figura 9), lo que sugiere una mayor pureza.
55
2.6 Determinación de la actividad cromogénica de FIX
Se realizó una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 completamente purificados (columna HA) frente al plasma mezclado normal humano mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). Todas las muestras se 5 diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia de plasma normal humano. La reducción de la actividad cromogénica de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 (figura 10) en comparación con el plasma puede ser una consecuencia de modificaciones postranscripcionales inadecuadas de las proteínas FIX, por ejemplo gamma carboxilación y escisión del propéptido inapropiadas o, alternativamente, debido a la adición de los casetes de CTP. La fluctuación en la actividad de FIX-CTP4 y FIX-CTP5 10 (tabla 11) podría estar causada por las inapropiadas capacidades de cuantificación del ELISA para FIX debido al enmascaramiento del CTP del sitio antigénico.
Tabla 11: Relación de EC50 muestra/plasma
15
2.7 Estudio farmacocinético
FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5 purificados en jacalina (Grupo A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (seis ratas por grupo de tratamiento) a una dosis de 250 µg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a 20 las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación (tabla 12). El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis.
Tabla 12: Plan de operación del estudio PK
- Grupo de tratamiento
- Tratamiento Núm. de animales/grupo Vía de dosificación Nivel de dosis (µg por animal) Vol. inyectado (µl) Conc. (µg/ml) Puntos de tiempo (horas después de la dosis)
- A
- FIX-CTP*3 jacalina 40 6 IV 50 200 250 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96
- B
- FIX-CTP*4 jacalina 40 6 IV 50 200 250 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96
- C
- FIX-CTP*5 jacalina 40 6 IV 50 200 250 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96
La concentración del FIX en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de ELISA para FIX 25 humano (Affinity Biologicals). El perfil farmacocinético se calculó y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo. Los tiempos de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0 x. La tabla 13 más adelante resume las concentraciones de FIX calculadas en los diferentes puntos de tiempo de muestreo.
30 Tabla 13: Concentraciones de FIX calculadas
El perfil PK y un resumen de los parámetros PK se presentan en la tabla 14 más adelante y en la figura 11. Un perfil del análisis PK en todos los puntos de tiempo sugirió que la adición de 4 o 5 casetes de CTP al FIX no aumentó su 5 tiempo de vida media en comparación con FIX-CTP3. El AUC después de la administración de FIX-CTP5 aumentó en 1,4 a 1,6 veces frente a FIX-CTP3, el cual no fue estadísticamente significativo.
Tabla 14: Perfil PK y resumen de los parámetros PK
- 24- 96 horas
- 3 CTP 4 CTP 5 CTP
- Tiempo de vida media (horas)
- 20,43 22,02 23,96
- AUC (ng-horas/ml)
- 8218,38 10504,49 13329,41
- Vd (ml/kg)
- 700,76 586,02 494,89
- CL (ml/horas/kg)
- 23,77 18,45 14,32
10 Dado que se demostró que las muestras a las 96 horas después de la dosificación tenían concentraciones de FIX muy bajas, que estaban por debajo del límite de cuantificación del ensayo, el tiempo de vida media terminal se recalculó para proporcionar un cálculo más preciso y científicamente adecuado (tabla 15). De acuerdo con este cálculo, se obtuvieron incluso las diferencias más pequeñas entre el tiempo de vida media de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5. 15
Tabla 15: Tiempo de vida media terminal recalculado
- 8-72 horas
- 3 CTP 4 CTP 5 CTP
- Tiempo de vida media (horas)
- 15,38 16,63 16,04
2.8 Conclusiones: 20
En este estudio, se evaluaron los parámetros farmacocinéticos y la actividad de coagulación potencial de FIX-CTP3, FIX-CTP4 y FIX-CTP5. La fusión de 4 y 5 CTP al FIX no proporcionó una superior o mayor extensión del tiempo de vida media, en comparación con FIX-CTP3, y se observó una reducción de la actividad cromogénica. La tabla 16 más adelante resume la mejora en por ciento del tiempo de vida media para las diferentes variantes fusionadas FIX-25 CTP (1 a 5 CTP). La fusión de CTP al FIX mejoró su comportamiento farmacocinético, pero, de manera impredecible, esta mejora fue limitada. Sorprendentemente, después de la fusión de 3, 4 o 5 CTP en tándem al FIX, se calculó un valor similar del tiempo de vida media.
Tabla 16: Resumen del por ciento de mejora del tiempo de vida media 30
Estos datos sugieren que la fusión de 3 CTP al FIX produce una mejora máxima en el tiempo de vida media de la proteína, lo que confirma que FIX-CTP3 es la variante óptima en términos de tiempo de vida media, estructura y actividad potencial de coagulación para el desarrollo clínico futuro. 5
Ejemplo 3
Tratamiento con FIX-CTP3 del modelo de ratón hemofílico FIX-/-
10 Como se describió anteriormente, se realizó un estudio que probó el perfil PK de las cosechas de FIX-CTP, FIX-CTP2 y FIX-CTP3 y la actividad de coagulación frente a rhFIX. FIX-CTP3 mostró un mejor perfil PK a la vez que mantuvo su actividad de coagulación frente a las cosechas de FIX-CTP1 y FIX-CTP2 o rhFIX. Para evaluar adicionalmente este resultado, se purificó la proteína FIX-CTP3 γ-carboxiglutamato. FIX-CTP3 muestra un aumento de 3 veces en el tiempo de vida media y un AUC 4,5 veces mayor en comparación con rhFIX en las ratas normales 15 después de una única administración IV. FIX-CTP3 demostró una reducción de la actividad cromogénica y de coagulación in vitro, muy probablemente debido a la escisión insuficiente del propéptido N-terminal y a modificaciones postranscripcionales (PTM) inadecuadas, tal como la gamma carboxilación adecuada.
En el estudio actual, se analizaron las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas del FIX humano recombinante fusionado a tres CTP en tándem en ratones deficientes de FIX. 20
Propósito del estudio:
Determinar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de rFIX-(CTP)3 frente al rhFIX comercial (BeneFIX®) en ratones deficientes de FIX después de una única administración IV de FIX-(CTP)3 a una actividad 25 específica y dosis similares (actividad específica similar a la PD y similar constante de FIX para la PK).
Producción de la cosecha de FIX-CTP3:
El ADNc de FIX (OriGene RC219065-Thr 148) fusionado en el extremo C-terminal a tres secuencias de CTP en 30 tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de vitamina K3 a 25 ng/ml (Sigma, Mennadion). Se cultivaron cinco lotes separados que contenían 5 litros de suspensión celular (total de veinticinco litros) y se cosecharon después que la viabilidad disminuyó a 60-70 %. La cosecha se filtró y congeló a -70 °C.
35
Determinación del nivel del antígeno FIX de la cosecha:
El nivel del antígeno FIX de la cosecha se determinó mediante el uso de un estuche de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). El nivel del antígeno se calculó por cada lote. La concentración del FIX se mantuvo entre los diferentes lotes (tabla 17). 40
Tabla 17: Nivel del antígeno FIX
Proceso de purificación de FIX-CTP3: 45
Después de un corto estudio de purificación, se realizó un proceso de purificación mediante el uso de las siguientes 3 columnas: DEAE sefarosa, Heparina sefarosa e hidroxiapatita cerámica HA Bio Rad tipo 1 (40 µm), FIX-CTP3. Se purificó la proteína enriquecida γ-carboxilada. En resumen: Se descongelaron cinco litros de cosecha clarificada a 4 °C durante un periodo de 4 días. Para cada lote de purificación, la cosecha clarificada (2 litros) se concentró 4 veces 50 y se dializó contra Tris-HCl 20 mM pH 8,2 mediante el uso de un cartucho desechable de fibra hueca con un valor de corte del peso molecular nominal de 10 KDa. Este proceso (UFDF1) se realizó dos veces, y se cargó un litro de UFDF1 en columna de DEAE sefarosa, y el Factor IX se eluyó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 200 mM, CaCl2 10 mM pH 8,2. El producto se diluyó 1:1 con Tris-HCl 20 mM, CaCl2 10 mM pH 7,5, y el pH se ajustó a 7,5 antes de cargar en la columna de Heparina sefarosa. La elución se realizó con Tris-HCl 20 mM, NaCl 300 mM, y CaCl2 10 mM pH 7,5. 5 El producto eluido se concentró y dializó contra fosfato 10 mM pH 6,8 mediante el uso de una membrana con valor de corte de 10 KDa del casete Pellicon XL (UFDF2). El producto se cargó en una columna HA, y la fracción activada del Factor IX se eluyó con fosfato 150 mM pH 6,8. El producto de purificación se concentró hasta una concentración objetivo de 2 mg/ml y se dializó contra TBS pH 7,45, se dividió en alícuotas y se almacenó a -70 °C.
10 El proceso de purificación se repitió cinco veces, de manera semanal para purificar el volumen total (25 litros). Los procesos de purificación se denominaron HA# 6-10. Cada producto de purificación se evaluó separadamente (App # 1-5). Al final del proceso de purificación, los diferentes lotes se combinaron y se concentraron adicionalmente hasta una concentración objetivo de 4 mg/ml.
15
Propiedades analíticas de FIX-CTP3:
Determinación del nivel del antígeno FIX
El nivel del antígeno de la proteína FIX-CTP3 enriquecida γ-carboxilada se determinó mediante el uso de un estuche 20 de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). La concentración de proteínas calculada es el promedio de dos ejecuciones independientes (tabla 18).
Tabla 18: Nivel del antígeno FIX-CTP3
25
Transferencias de SDS-PAGE:
La proteína enriquecida γ-carboxilada FIX-CTP3, rhFIX y rFIXa (FIX activado) se cargaron en un gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis de Coomassie en SDS-PAGE se realizó mediante tinción del gel con el reactivo azul de Coomassie (800 ng de proteína) (figura 12). 30 Una inmunotransferencia Western se realizó mediante el uso de 100 ng de proteína con Ac policlonal anti-FIX humano (figura 12B), anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics Cat #499, 3570) (figura 12C), Ac policlonal anti-propéptido de FIX (figura 12D), y Ac policlonal anti-CTP (figura 12E). Como se informó previamente, el FIX-CTP3 migró a 75 KDa.
35 El procedimiento de purificación enriqueció significativamente la porción FIX-CTP3 a la vez que redujo impurezas. El rendimiento del proceso de purificación fue muy bajo en el intervalo de alrededor de 2-3 % (datos no mostrados) debido al requisito de recolectar solo las fracciones FIX-CTP3 γ-carboxiladas, como se demuestra en la inmunotransferencia anti-Gla (figura 12B). Basado en la tinción de Coomassie y la inmunotransferencia de FIX, la porción de FIX-CTP3 es solo de alrededor de 60-70 %, y también se detectaron bandas adicionales de menor peso 40 molecular, presumiblemente con menos formas de glicosilación.
Actividad de coagulación de FIX-CTP3:
Actividad cromogénica de FIX-CTP3:
Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FIX-CTP3 y de la proteína enriquecida γ-5 carboxilada FIX-CTP3, frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica, disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221802). La cosecha de FIX-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano. Como se demostró previamente, la cosecha de FIX-CTP3 fue 50 veces menos activa que el plasma humano mezclado (tabla 19, figura 10 13). Después de la purificación de FIX-CTP3, la actividad cromogénica mejoró significativamente y fue solo 4,72 veces menos activa que el plasma humano mezclado (tabla 19, figura 13). La actividad cromogénica reducida de la cosecha puede ser una consecuencia de inadecuadas modificaciones postranscripcionales de las variantes de la proteína FIX, por ejemplo inapropiadas gamma carboxilación y escisión del propéptido. Después de la purificación y enriquecimiento de la fracción γ-carboxilada FIX-CTP3, la actividad fue mejor, lo que demuestra la contribución 15 importante de la γ-carboxilación a la actividad del FIX.
Tabla 19: Actividad cromogénica de FIX-CTP3
Ensayo de coagulación de una etapa (aPTT): 20
El tiempo de tromboplastina parcial activada (aPTT) es una medida de la integridad de las vías intrínseca y común de la cascada de coagulación. El aPTT es el tiempo, en segundos, para que el plasma se coagule después de la adición de un activador de la vía intrínseca, fosfolípido y calcio. Lo importante del ensayo fue cuantificar la capacidad de FIX-CTP3 para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento de FIX mediante la 25 adición de rhFIX. Se mezclaron 200 µl de plasma humano deficiente de FIX con 25 µg/ml de FIX-CTP3 y se diluyeron adicionalmente en TBS. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadieron 50 µl del activador de PTT (Actina FS) y 50 µl de calcio 25 mM a la mezcla, y se determinó el tiempo de coagulación en segundos mediante el uso de un Coagulador Sysmex® CA 1500 (realizado por Sheba hospital, Centro Nacional de Coagulación, mediante el uso de un ensayo de aPTT validado). La potencia se evaluó mediante la comparación de 30 FIX-CTP3 con la curva de dosis-respuesta de una preparación de referencia de plasma mezclado normal humano. Los resultados se expresan en por ciento de actividad interpolada a partir de la curva estándar que incluye niveles de FIX de lt;1-110 %. FIX-CTP3 mostró una reducción de 15-20 veces en su actividad de coagulación frente al plasma mezclado normal humano ya que la actividad de 5 µg/ml, que es el valor normal de FIX en el cuerpo, se demostró que fue de 6,5 % (tabla 20). 35
40
Tabla 20: Actividad de coagulación de FIX-CTP3
- FIX-CTP3
- Concentración de FIX según el proveedor (mg/ml) Concentración en la muestra analizada (µg/ml) % de actividad de FIX (normalizado respecto al plasma mezclado normal humano)
- 3,83
- 25 34,7
- 5
- 6,5
FIX-CTP3 también mostró aumento del tiempo de coagulación en comparación con BeneFIX® (tabla 21 y figura 14). 45
Tabla 21: Tiempo de coagulación comparativo (aPTT)
Se realizó un ensayo de coagulación adicional de manera independiente en ratones deficientes de FIX por el Dr. Paul Monahan en la Universidad de Carolina del Norte antes de iniciar el estudio PK-PD. Los resultados de aPTT 5 sugirieron que la actividad de coagulación de FIX-CTP3 es 40 veces menor que el plasma humano mezclado normal como se demuestra por el periodo más prolongado (según se midió en segundos) y la mayor concentración necesaria para la actividad de coagulación adecuada (tabla 22).
Tabla 22: Actividad de coagulación comparativa 10
La actividad específica (u/ml), que se basó en el nivel del antígeno FIX según se calculó mediante ELISA para FIX-CTP3 y BeneFIX®, fue de 4,46 y 198,9 respectivamente.
La inconsistencia en la actividad calculada de FIX-CTP3 como se demuestra en los ensayos cromogénicos frente a 15 aPTT puede explicarse por la sensibilidad superior del ensayo de aPTT y la relevancia in vivo. En el ensayo de actividad cromogénica, está presente una cantidad en exceso de los reactivos y enzimas lo que puede activar versiones de FIX menos potentes. La diferencia en los valores de actividad específica de FIX-CTP puede explicarse por el uso de diferentes reactivos y equipos automatizados. El valor de actividad según se calculó en la Universidad de Carolina del Norte se usó para el diseño del estudio PK-PD. 20
Detección de la proteína FIXa:
Para confirmar que después del proceso de purificación, no se produjo activación de FIX (FIXa), se realizó un ensayo de detección de FIXa mediante el uso del ensayo cromogénico de FIXa Biophen (Cat. # Ref. 221812). El 25 ensayo mide la cantidad de FIXa presente en una muestra específica mediante el uso de la cascada de actividad cromogénica, como se describió previamente. FIX-CTP3 y rhFIX se diluyeron y se evaluaron los niveles de FIXa. FIX-CTP3 no se activó durante la purificación o el almacenamiento (tabla 23).
Tabla 23: Detección de FIXa 30
Estudio PK-PD de FIX-CTP3: FIX-CTP3 y rhFIX (BeneFIX®) se administraron en una única inyección intravenosa a los ratones C57BI deficientes de FIX en una dosis de 625 µg/kg de peso corporal que contenía 100 UI de FIX/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratones alternativamente a las 0,25, 5 4, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Se evaluó el nivel del antígeno hFIX, y se realizó un análisis PK detallado. Para evaluar la capacidad de FIX-CTP3 de prolongar la actividad de coagulación de los animales deficientes del FIX en comparación con BeneFIX®, se calculó la actividad del FIX en muestras plasmáticas citratadas, extraídas de ratones tratados FIX-/-, mediante el uso de un ensayo automatizado de la actividad del FIX 10 (tabla 24).
Tabla 24: Descripción del estudio
- Producto Administración Dosis Núm. de ratones Puntos de extracción (horas después de la dosificación) Cantidad requerida
- **Cohorte 1
- FIX-CTP3 Dosis única: IV 100 UI/Kg 2,5 UI/ratón (553 µg/ratón) 12 ratones, 0,25, 1, 4,8, 16, 24, 48 6636 µg
- Cohorte 2
- FIX-CTP3 Dosis única: IV **472 µg/Kg 12,57 µg/ratón 18 ratones *0,25,1*, 4*,8 *,16*, 24*, 48*, 72*,96* 200 µg 12,57 µg/ratón
- **Cohorte 3
- BeneFIX ® Dosis única: IV 100 UI/Kg 2,5 UI/ratón 18 ratones, 0,25, 1,4,8,16, 24, 48, *72,*96 226,3 µg 12,57 µg/ratón
- * Puntos de extracción para PK solo ** Sangrado por la vena de la cola en T=48 después de la dosificación; cohortes 1 y 3
Perfil farmacocinético de FIX-CTP3 en ratones FIX-/- 15
La concentración del FIX se cuantificó mediante el uso de estuches de ELISA para FIX humano (Affinity Biologicals; Cat. # FIX-AG RUO). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de tres animales en cada punto de tiempo. La tabla 25 más adelante y la figura 15 resumen las concentraciones de FIX calculadas en los diferentes puntos de tiempo de muestreo para las cohortes 1 y 3. Más adelante se presentan el perfil PK y un 20 resumen de los parámetros PK (tablas 26 y 27). También se realizó un análisis PK para la cohorte #2 para verificar la exposición (datos no mostrados).
25
Tabla 25: Concentraciones de FIX 30
Se usó un módulo de dos compartimentos (programa informático WinLin) para determinar AUC0-inf, Tterminal y aclaramiento (CL). Los parámetros PK se describen más adelante en la tabla 26.
5 Tabla 26: Propiedades PK
La adición de los tres quot;casetesquot; de CTP al rhFIX prolongó el tiempo de vida media in vivo de FIX en al menos 2,5 veces. El AUC después de la administración in vivo de FIX-CTP3 aumentó 2 veces frente a rhFIX. Los ratones 10 inyectados con FIX-CTP3 demostraron un mejor perfil PK en comparación con los ratones inyectados con BeneFIX®.
Perfil farmacodinámico de FIX-CTP3 en ratones deficientes de FIX:
15 En paralelo al muestreo de PK, los animales deficientes del FIX administrados con BeneFIX® o FIX-CTP3, las muestras plasmáticas citratadas, se evaluaron en cuanto a su actividad de coagulación mediante el ensayo de aPTT, que se tradujo a % de actividad. El % de actividad en cada punto de muestreo se calculó como el tiempo de coagulación actual/tiempo de coagulación del plasma mezclado de ratones normales * 100. La tabla 27 resume los valores de actividad después de la administración de BeneFIX® o FIX-CTP3. 20
Después de la administración de FIX-CTP3, se detectó una actividad de coagulación significativa una hora después de la administración que alcanzó el 96 % de actividad a las cuatro horas después de la dosificación, mientras que el mayor valor de actividad de BeneFIX® fue de 40 % (tabla 27, figura 16). La actividad de coagulación de FIX-CTP3 se mantuvo durante un periodo de tiempo más prolongado, lo que demuestra una actividad prolongada. La actividad 25 de coagulación para los ratones tratados con BeneFIX® no se detectó en los puntos de tiempo después de las 36 horas, mientras que los ratones tratados con FIX-CTP3 mantuvieron una actividad medible a las 72 horas después de la dosificación (tabla 27, figura 16). El análisis del perfil farmacocinético del % de coagulación sugiere que la actividad de coagulación de FIX-CTP3 se mantiene durante un periodo significativamente más prolongado y su tiempo de vida media es casi 2 veces mayor que para Benefix® (tabla 28). 30
35
40
Tabla 27: % de actividad de FIX
Tabla 28: Actividad de coagulación
5
9.3 Reto de sangrado en ratones deficientes de FIX
Los ratones deficientes de FIX se administraron con una única inyección intravenosa de 100 UI/kg de BeneFIX® o rFIX-CTP3. La vena de la cola se comprimió ligeramente 48 horas después de la dosificación, y se evaluaron el 10 tiempo de sangrado por la vena de la cola (TVBT) y la intensidad del sangrado (DO de hemoglobina). Un segundo reto de sangrado se realizó 15 minutos después de alcanzar la homeostasis, y se midieron los mismos parámetros. Después del primer reto de sangrado, el sangrado de los animales administrados con FIX-CTP3 fue significativamente menos intenso que el sangrado para BeneFIX® como se demuestra por los valores de DO de hemoglobina (figura 17). 15
Dado que se informó previamente que durante el primer reto de sangrado en ratones hemofílicos, el tiempo de sangrado no necesariamente se correlaciona con la eficacia del tratamiento, se recomienda evaluar la homeostasis después de un sangrado adicional. Una vez que el primer sangrado se detuvo espontánea o manualmente, se realizó un segundo reto de sangrado 15 minutos después del primero, y se volvieron a medir el tiempo y la 20 intensidad del sangrado. Durante el episodio del segundo sangrado los animales administrados con FIX-CTP3 tuvieron una reducción del tiempo de sangrado y de la intensidad, lo que demuestra que FIX-CTP3 fue potente en puntos de tiempo más tardíos (figura 18).
Finalmente, los animales también se observaron durante las 12 horas después del segundo reto de sangrado, y se 25 registraron todos los eventos de sangrado recurrentes. Los animales administrados con FIX-CTP3 fueron capaces de mantener la homeostasis sanguínea durante las próximas 12 horas sin que volvieran a ocurrir eventos de sangrado. Por el contrario, el 50 % de los ratones tratados con BeneFIX® tuvieron episodios espontáneos de sangrado por la cola (tabla 29).
30
Tabla 29: Resultado 12 horas después del corte de la cola
- Grupo de ratones
- Nuevo sangrado tardío Muerte o angustia que requiera eutanasia
- FIX-CTP3(100 UI/kg)
- 0/5 (0 %) 0/5
- BeneFIX® (100 UI/kg)
- 3/6 (50 %) 0/6
- FIX-/- (no tratados)
- 5/6 (100 %) 1/6
FIX-CTP3 recombinante, una proteína de fusión compuesta de una única molécula de FIX fusionada a tres quot;casetesquot; 35 de CTP en tándem se desarrolló para abordar el corto tiempo de vida media de los productos de FIX disponibles actualmente que se usan para tratar a los pacientes con hemofilia B. Nosotros hemos demostrado que el tiempo de vida media de eliminación de rFIX-CTP3 fue consistentemente 2,5 a 4 veces más prolongado que el de rFIX en ratas (como se informó previamente) y en ratones deficientes de FIX.
Sin estar atados por la teoría, la proteína de fusión reduce el aclaramiento del FIX y protege al FIX de la actividad de proteasas, la degradación por enmascaramiento y reduce la afinidad del FIX por los receptores hepáticos. En conjunto estas características del dominio CTP extienden el tiempo de vida media de FIX.
5 Además del análisis farmacocinético de rFIX-CTP3, examinamos las propiedades farmacodinámicas de FIX-CTP3 en ratones deficientes de FIX. rFIX-CTP3 y rFIX, se administraron en dosis comparables (en unidades) para compensar los niveles de deficiencia en la coagulación en los ratones deficientes de FIX. Sin embargo, el efecto de rFIX-CTP3 en los ratones deficientes de FIX se prolongó significativamente a al menos 76 horas después de la dosificación, para alcanzar un pico de actividad mayor. La actividad de coagulación de FIX-CTP3 comenzó después 10 de un retraso de 1 hora en comparación con BeneFIX®. La activación de FIX puede requerirse ya que la adición de tres CTP en tándem podría enmascarar teóricamente el sitio de activación y retrasar el inicio de la cascada. Después de la administración de FIX-CTP3, se observó una actividad máxima del 100 %, mientras que la actividad de BeneFIX® fue de solo 40 %. La actividad inicial superior es un parámetro muy importante y demuestra que la adición de 3 CTP tiene el potencial de mejorar la recuperación. 15
La terapia de reemplazo de FIX de manera profiláctica para los pacientes con hemofilia B ayuda a mantener los niveles plasmáticos de 1-2 % de la actividad de coagulación normal. El ensayo de sangrado por la vena de la cola es una prueba in vivo sensible que mide la capacidad para mantener la homeostasis del sangrado a valores bajos de actividad lo cual imita el modelo de homeostasis del sangrado en humanos. En respuesta al reto de sangrado por la 20 vena de la cola 48 horas después de la dosificación, los animales administrados con rFIX-CTP3 mantuvieron la homeostasis sanguínea con episodios de sangrado más cortos y menos graves, lo que demuestra una actividad de coagulación sostenida.
FIX es una proteína compleja que contiene una serie de dominios funcionales que experimentan grandes 25 modificaciones postraduccionales. Una de las modificaciones postraduccionales esenciales para la actividad del FIX es la gamma-carboxilación de los primeros 12 ácidos glutámicos en el dominio Gla por la γ-glutamil carboxilasa dependiente de la vitamina K. Esta modificación facilita la unión de FIX a las membranas fosfolipídicas y, por lo tanto, es crítica para su función. El FIX que no está gamma-carboxilado no es funcional, y por tanto la gamma-carboxilación es una etapa limitante de la velocidad. 30
Este estudio PK-PD se realizó mediante el uso de células transfectadas transitoriamente. Se realiza una amplia evaluación analítica de las modificaciones postraduccionales en la proteína FIX-CTP3 estable producida y secretada por un clon optimizado estable.
35 Basado en los datos presentados, el factor de coagulación FIX-CTP3 tiene el potencial de reducir la frecuencia de inyecciones en los pacientes que reciben dosis profilácticas de rutina de una terapia de reemplazo de FIX. Se anticipa que rFIX-CTP3 puede conferir una protección prolongada contra la hemorragia después de cada dosis del factor, disminución de las unidades totales del factor necesarias para tratar los episodios de hemorragia, y/o mantenimiento de la hemostasis adecuada durante los procedimientos quirúrgicos con menos inyecciones. 40
Ejemplo 4
Generación y utilización del Factor de coagulación FVII
45
Una versión de acción prolongada del factor de coagulación Factor VII activado (FVIIa) será útil para el tratamiento de pacientes con hemofilia A y B. La proteína recombinante FVIIa-CTP3 tiene el potencial clínico de mejorar el tratamiento de pacientes de hemofilia mediante la reducción de la frecuencia de infusiones e incluso mediante la reducción de la carga del fármaco, lo que permite un enfoque de tratamiento profiláctico que puede mejorar significativamente la calidad de vida del paciente, evitar episodios espontáneos de hemorragia y daño acumulado a 50 la articulación y otros órganos.
En la presente se describe la generación de una molécula FVIIa recombinante-CTP con un tiempo de vida media prolongado basado en la fusión del FVII con un CTP humano. El FVIIa recombinante-CTP se expresó en células de mamífero y se caracterizó in vitro e in vivo. Se demostró que la actividad de rFVII-CTP fue comparable con rFVII. Los 55 estudios farmacocinéticos y de eficacia en ratas demostraron mejores propiedades del rFVII-CTP. Los resultados de este estudio demostraron que es posible desarrollar una molécula de rFVIIa con tiempo de vida media prolongado con propiedades hemostáticas muy similares a la enzima de tipo silvestre.
Clonación y expresión de la molécula de FVII recombinante: Se construyeron numerosos clones del Factor VII en 60 nuestro vector de expresión en eucariotas (pCI-dhfrr) (figura 19). El clon de ADNc de FL verificado MGC humano (IRCM) que contiene la secuencia del factor de coagulación VII de homo sapiens se solicitó a quot;Open Biosystemsquot; (OB-MHS4426). Los siguientes cebadores se sintetizaron por Sigma-Genosys en la siguiente secuencia: Cebador 67: 5'CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3' (contiene el extremo 5’ del ADN del Factor VII y el sitio de restricción de XhoI) (sec. con núm. de ident.: 5); Cebador 68R: 5' TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3' (contiene el sitio de 65 restricción de Xbal) (sec. con núm. de ident.: 6); Cebador 69: 5' TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3' (contiene el sitio de restricción de Xbal) (sec. con núm. de ident.: 7); y Cebador 70de restricción de Xbal) (sec. con núm. de ident.: 7); y Cebador 70de restricción de Xbal) (sec. con núm. de ident.: 7); y Cebador 70
La clonación se realizó en dos conjuntos de reacciones de PCR. La primera reacción se realizó con el cebador 67 y 5 el cebador 68R mediante el uso de un ADNc plasmídico con la secuencia del factor VII (OB-MHS4426) como molde; como resultado de la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼534 pb, se aisló y se ligó al vector de clonación TA (Invitrogen, núm. de catálogo: K2000-01). Se aisló un fragmento de XhoI -Xbal que contenía el amino terminal de la secuencia del factor VII. La segunda reacción se realizó con el cebador 69 y el cebador 70R y de nuevo, un ADNc plasmídico con la secuencia del factor VII (OB-MHS4426) se usó como molde. Como resultado de 10 la amplificación por PCR, se formó un producto de ∼813 pb y se ligó al vector de clonación TA (Invitrogen, núm. de catálogo: K2000-01). Se aisló un fragmento de XbaI-NotI que contenía el carboxilo terminal de la secuencia del factor VII. Los dos fragmentos se insertaron en nuestro vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr (triple ligadura) para producir el clon 501-0-p136-1.
15 El plásmido 501-p136-1 (Factor VII en el vector pCI-dhfr) se digirió con las enzimas de restricción XhoI y KpnI. Se aisló un fragmento de ∼1186 pb. Un clon parcial del Factor VII (1180 pb-1322 pb) seguido por una secuencia CTP, una secuencia de terminación y una secuencia de NotI que se sintetizó por GeneArt (0721543) se digirió con las enzimas de restricción KpnI y NotI. Se aisló un fragmento de ∼253 pb. Los dos fragmentos se insertaron en nuestro vector de expresión en eucariotas pCI-dhfr (triple ligadura) para producir el clon 501-1-p137-2. pCI-dhfr-701-2-p24-2 20 se digirió con las enzimas de restricción XhoI y ApaI, y el fragmento grande (vector) se aisló.
pCI-dhfr-501-2-p137-2 (Factor VII-ctp x1) se digirió con las enzimas de restricción XhoI y ApaI, y se aisló un inserto de ∼1200 pb. El vector y el inserto se ligaron para producir 501-2-p139-2. Las células Dg44 se sembraron en placas para cultivo de tejidos de 100 mm y se cultivaron hasta una confluencia de 50-60 %. Se usó un total de 2 µg de ADN 25 para la transfección de una placa de 100 mm mediante el uso del reactivo FuGene (Roche) en medio libre de proteína (Invitrogen CD Dg44). El medio se eliminó a las 48 horas después de la transfección y se reemplazó con un medio libre de proteína (Invitrogen CD Dg44) sin nucleósidos. Después de 14 días, la población celular transfectada se transfirió a matraces T25 para el cultivo de tejidos, y la selección se continuó durante 10-14 días hasta que las células comenzaron a crecer bien como un clon estable. Los clones con alta expresión se seleccionaron y se usaron 30 aproximadamente 2x107 células para inocular 300 ml de medio de crecimiento en una botella tipo rodillo de 1700cm2 (Corning, Corning NY), suplementado con vitamina K3 a 5 ng/ml (menadiona bisulfato de sodio; Sigma). El medio de producción (cosecha) se recogió después de una disminución rápida en la viabilidad celular hasta alrededor de 70 %. El medio de producción se clarificó primero y después se concentró aproximadamente 20 veces y se dializó con PBS mediante el uso de un casete de filtración de flujo (10KDaMWCO; Millipore Corp, Billerica, MA). 35
Determinación del nivel del antígeno FVII
El ADNc que codifica al péptido CTP se fusionó al extremo 3’ del ADNc que codifica al FVII humano. La construcción de rFVII correspondiente se transfectó a las células Dg44. Como control, se utilizó un ADNc de rFVII humano. El 40 medio de producción (cosecha) se recogió, se concentró y el FVII recombinante secretado se evaluó adicionalmente. Se determinaron los niveles de los antígenos rFVII, rFVII-CTP y rFVII-CTP-CTP mediante un estuche de ELISA para FVII humano AssayMax (AssayPro) (figura 20A). No se encontraron diferencias significativas en el nivel de secreción de rFVII-CTP y rFVII-(CTP)2 en comparación con rFVII nativo.
45
Transferencias de SDS-PAGE
El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante la carga de 50 ng de cada proteína rFVII de cosecha, purificada o activada. Las muestras se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se llevó a cabo mediante la realización de una 50 inmunotransferencia Western con el uso de un anticuerpo monoclonal anti-FVII humano (Ac) (R&D systems) o un anticuerpo policlonal anti-CTP generado en conejo.
El nivel del antígeno rFVII se correlacionó con el nivel detectado de proteína en una inmunotransferencia de SDS-PAGE con Ac anti-FVII. El rFVII-CTP migró como una única banda, mientras que el peso molecular correspondiente 55 del control de FVII fue de aproximadamente 52 KDa (datos no mostrados). Ambas proteínas reaccionaron con los anticuerpos específicos para FVII en las inmunotransferencias. El rFVII-CTP también reaccionó con anticuerpos específicos para CTP. rFVII se secretó en su forma de zimógeno sin traza de la proteína activada.
Actividad cromogénica de FVII: 60
Las actividades de rFVII, de la cosecha de rFVII-CTP y de rFVII-(CTP)2 se determinaron mediante el uso de un estuche de prueba cromogénica disponible comercialmente (estuche de ensayo para la actividad cromogénica del FVII humano AssaySense (AssayPro). Para la caracterización funcional del rFVII-CTP y su capacidad para activarse adicionalmente (FVIIa), el rFVII-CTP concentrado (cosechas) se colocaron en un estuche de prueba cromogénica 65 disponible comercialmente que mide la capacidad de TF/FVIIa para activar el Factor X a Factor Xa que en presencia del sustrato específico de FXa libera una señal cuantificable (AssayPro). La adición del péptido CTP en el extremo C-terminal de la proteína rFVII no deterioró la actividad de serina proteasa del FVII (figura 20B, 20C).
Actividad de coagulación del FVII:
5 El tiempo de protrombina (PT) mide la vía de coagulación extrínseca. El PT es el tiempo (medido en segundos) necesario para que el plasma coagule después de la adición de un activador de la vía extrínseca, fosfolípido y calcio. Se usa para determinar la tendencia de coagulación de la sangre, específicamente en la medida de la dosificación de warfarina, daño hepático, y estado de la vitamina K. El intervalo de referencia para el tiempo de protrombina está usualmente alrededor de 12-15 segundos. Específicamente, el ensayo cuantificó la capacidad de la cosecha de 10 FVII-CTP y FVII-(CTP)2 para restaurar la actividad de coagulación del plasma humano con agotamiento de FVII mediante la adición de rhFVII. Se mezclaron 300 µl de plasma humano deficiente de FVII con 100 µl de FVII, cosechas de FVII-CTP y FVII-(CTP)2 a concentraciones específicas, o plasma humano normal mezclado y se diluyeron adicionalmente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añadió el factor tisular (TF), CaCl2, y fosfolípidos a la mezcla. Se determinó el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evaluó 15 mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de las cosechas de FVII-CTP y FVII-(CTP)2 con una preparación de referencia que consistió en rhFVII o plasma humano mezclado. Una unidad de FVII activo se definió como la cantidad de FVII que iguala la actividad de un ml de plasma humano normal. La actividad de coagulación por PT de rFVII y rFVII-CTP se midió en un coagulómetro (Instrumentation Laboratory).
20 Como se mostró previamente, la adición de un péptido CTP en el extremo C-terminal de la proteína rFVII no afectó su actividad de serina proteasa y condujo a la iniciación y activación de un Factor X nativo y Factor IX en plasma humano. Después de la inserción de un CTP adicional en el C terminal, hubo una reducción de tres veces en la actividad de serina proteasa (datos no mostrados).
25
Estudio farmacocinético:
Las cosechas de rFVII, rFVII-CTP, y rFVII-(CTP)2 se administraron por vía intravenosa a las ratas Sprague-Dawley (seis ratas por sustancia) con una dosis de 100 µg/kg de peso corporal. Para todos los experimentos in vivo, la cantidad de la proteína respectiva se determinó sobre la base de un estuche de ELISA para FVII. Para cada 30 sustancia de prueba FVII, la cantidad inyectada se calculó teniendo en cuenta las diferencias en el peso molecular de rFVII frente a rFVII-CTP, lo que conduce a una concentración molar diferente.
Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital mediante el uso de un esquema de muestreo alternante para minimizar la interferencia del procedimiento de muestreo en los niveles a cuantificar: de 3 ratas a los 35 30 y 90 min y a las 2, 6 y 48 horas, y de las tres ratas restantes a los 15 y 60 min y a las 1,5, 4, y 24 horas alternativamente. El plasma se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. La concentración de FVII se cuantificó mediante un ensayo específico ELISA para FVII. El tiempo de vida media y el área bajo la curva (AUC) se calcularon mediante el uso de una regla trapezoidal lineal. La comparación de estos parámetros de aclaramiento revelaron que el tiempo de vida media in vivo y el AUC de rFVII-(CTP)2 son 40 significativamente mayores que los de rFVII (tabla 30).
Tabla 30: Parámetros del estudio PK
45
Caracterización de FVIIa recombinante-CTP:
Durante la activación, el FVII se escinde en R152 lo que resulta en que los dominios de las cadenas pesada y ligera se mantienen juntos por un único puente disulfuro. rFVIIa-(CTP)2 se purifica y activa mediante un proceso de purificación en una columna de intercambio iónico. Para evaluar completamente el rFVIIa-(CTP)2, la proteína se 50 carga en SDS-PAGE en condiciones reductoras para el FVIIa comercial (NovoSeven®). Los dominios de la cadena pesada y la ligera se separan y migran como bandas separadas de pesos moleculares 55 y 25 KDa. Ambas proteínas reaccionan con anticuerpos específicos para FVII, pero la cadena pesada del rFVIIa-CTP reacciona específicamente con anticuerpos específicos anti-CTP, lo que indica que esta banda representa la cadena pesada de FVII fusionada al CTP. La cadena ligera reacciona específicamente con Ac anti-gamma carboxilasa. La concentración de la proteína FVIIa se determina mediante el estuche de ELISA específico para FVIIa.
Secuenciación del N-terminal de FVIIa:
5 rFVII-CTP-CTP en proteínas purificadas activadas o como zimógeno se separa mediante SDS-PAGE (en Tris-glicina al 12 %) y posteriormente se electrotransfiere a una membrana de PVDF. Las bandas de interés se cortan y se colocan en un filtro de fibra de vidrio purificado y tratado con Biobrene. El análisis de la secuencia del N-terminal se lleva a cabo mediante degradación de Edmann con el uso de un secuenciador de proteína líquida con pulsos, equipado con un sistema de microgradientes HPLC 140C. La identidad de la proteína recombinante y la adecuada 10 escisión del propéptido se verifican adicionalmente mediante secuenciación del N-terminal.
Actividad de coagulación del FVIIa:
Para evaluar la actividad de coagulación de FVII-(CTP)2, se realiza un ensayo del tiempo de tromboplastina parcial 15 activada (aPTT). La muestra de plasma deficiente de FVII se sustituye con rFVIIa (NovoSeven®) o rFVIIa-(CTP)2. Se mezclan 300 µl de plasma humano deficiente de FVII con 100 µl de FVIIa o rFVIIa-(CTP)2 a las concentraciones específicas, o plasma humano mezclado normal que se diluye adicionalmente. Después de una incubación de 60 segundos a 37 °C, se añaden el factor tisular (TF), CaCl2 y fosfolípidos a la mezcla. Se determina el tiempo de coagulación en segundos. La potencia se evalúa mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta de 20 rFVIIa-(CTP)2 con una preparación de referencia que consiste en rhFVIIa o plasma mezclado normal humano. Una unidad de FVIIa se define como la cantidad de FVIIa que iguala la actividad de 1 ml de plasma humano normal. La actividad de coagulación por aPTT del rFVII y rFVIIa-(CTP)2 se mide en un coagulómetro (Instrumentation Laboratory). La actividad de coagulación por aPTT de rFVIIa y rFVIIa-(CTP)2 es similar.
25
Estudios farmacocinéticos en ratas:
Para caracterizar la influencia de la adición de CTP al rFVIIa sobre su potencial de longevidad, se realiza un estudio farmacocinético comparativo en ratas. NovoSeven® (rFVIIa) y rFVIIa-(CTP)2 en TBS se inyectaron IV a 6 ratas SD. Los niveles de FVIIa en el tiempo se detectan mediante el uso de un estuche de ELISA para FVIIa. El tiempo de vida 30 media y el AUC se calculan para cada proteína. La comparación de estos parámetros de aclaramiento revela que las medidas del tiempo de vida media in vivo, la recuperación y el AUC del rFVIIa-(CTP)2 son superiores a las de NovoSeven®.
Modelo de eficacia de FVIIa-CTP in vivo (modelo de hemofilia en ratón deficiente de FVIII): 35
Para evaluar el modelo de actividad in vivo, se obtienen ratones con inactivación del FVIII, y se establece una colonia de reproducción. 10 µg de hFVIIa recombinante comercial (NovoSeven®) o rFVIIa-(CTP)2 se inyectaron en la vena de la cola de un ratón con inactivación del FVIII anestesiado (22-28 g). La cantidad de proteína inyectada es igual a la concentración requerida de FVIII en el plasma normal (5 µg/ml). Las muestras de sangre se toman de la 40 cola comprimida a los tubos capilares heparinizados en puntos de tiempo específicos. Las muestras de plasma se evalúan en cuanto a los niveles de FVIIa mediante ELISA, y la eficacia se mide mediante un ensayo de coagulación de PTT.
En este estudio, se genera una construcción de fusión del FVII con CTP. Esta proteína recombinante es la base para un tratamiento que proporciona un tiempo de vida media prolongado y retención de la potencia terapéutica. 45
Estos resultados sugieren que rFVIIa-(CTP)2 tiene una eficacia terapéutica similar al rFVIIa en pacientes de hemofilia. Además, esta tecnología requiere una dosificación menos frecuente. Parece que una única inyección de rFVIIa-(CTP)2 es suficiente para controlar los episodios de hemorragia y reducir la cantidad de inyecciones que se necesitan durante una intervención quirúrgica. Esta proteína recombinante puede usarse como un tratamiento 50 profiláctico a largo plazo.
Ejemplo 5
Evaluación comparativa de FVII-CTP3, FVII-CTP4, y FVII-CTP5 purificados 55
5.1 Objetivo del estudio
Evaluación comparativa de los parámetros farmacocinéticos y la actividad de coagulación de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 frente a FVII-CTP3. 60
5.2 Producción de las cosechas de FVII-CTP4 y FVII-CTP5
El ADNc del FVII fusionado en el extremo C-terminal a cuatro o cinco secuencias de CTP en tándem se expresó en células Dg44 mediante el uso del sistema de expresión Excellgene en presencia de vitamina K3 a 20 µg/L (Sigma, 65 Mennadion). La cosecha se recogió (300 ml), se filtró y congeló.
5.3 Producción de la cosecha de FVII-CTP3
FVII-CTP3 se expresó en el laboratorio en sistema de expresión en mamíferos, células CHO, mediante el uso del vector pCI-DHFR. La mezcla estable transfectada #71 se cultivó en matraces de agitación, en presencia de vitamina 5 K3 a 25 ng/L (Sigma). Las cosechas se recolectaron y filtraron.
Todas las cosechas de FVII-CTP (3, 4 y 5 CTP) se concentraron y dializaron contra TBS (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,4) mediante el uso de Pellicon XL MWCO 10 kDa.
10
5.4 Determinación del nivel del antígeno FVII
El nivel del antígeno FVII se determinó mediante el uso de un estuche de ELISA para FVII humano (Zymotest HyPhen) (tabla 31). La concentración de proteínas calculada es el promedio de dos ejecuciones independientes.
15
Tabla 31: Nivel del antígeno FVII
5.5 Inmunotransferencia de FVII-CTP
20
Las cosechas de FVII-CTP3, FVII-CTP4 y FVII-CTP5 se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % (expedeon) mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-CTP (Adar Biotech Production) o Ac anti-Gla (American Diagnostica).
25 El FVII fusionado a tres, cuatro y cinco CTP migró a 80, 90 y 100 KDa, respectivamente. Como se esperaba, las cosechas de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 de Excellgene contienen bajo contenido de gamma carboxilación en comparación con la cosecha de FVII-CTP3 que se produjo en Prolor ya que el proceso de producción no se optimizó (figura 21).
30
5.6 Evaluación comparativa de la potencia de FVII in vitro
Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de FVII-CTP3, FVII-CTP4 y FVII-CTP5 purificadas en HA (fracción altamente gamma carboxilada) frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). Todas las 35 muestras se diluyeron en serie, y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-respuesta con una preparación de referencia que consistió en plasma normal humano. FVII-CTP3 y FVII-CTP5 demostraron menor actividad cromogénica que el plasma normal mezclado (figura 22). FVII-CTP4 demostró mayor actividad como se refleja por las relaciones de EC50, en comparación con FVII-CTP3 y FVII-CTP5 (tabla 32).
40
Tabla 32: Actividad de coagulación de FVII in vitro
5.7 Actividad de coagulación del FVII in vitro: 45
El ensayo de actividad del Factor VII (FVII), que se realizó en Sheba Medical Center, Centro Nacional de Coagulación de Israel, es un ensayo basado en la protrombina (PT) mediante el uso de plasma inmuno-adsorbido deficiente en el Factor VII (Siemens). El reactivo del PT es innovin, y el ensayo se realiza en el instrumento CA 1500 Sysmex®. El intervalo normal del FVII está dentro de 55-145 %.
5 Tabla 33: Actividad cromogénica de FVII in vitro
Dado que el nivel normal de FVII circulante en el cuerpo es alrededor de 0,5 µg/ml, las cosechas de FVII-CTP3 y FVII-CTP5 muestran reducciones de 3 veces en su actividad de coagulación frente al plasma mezclado normal 10 humano; este resultado se correlaciona con la actividad cromogénica obtenida (tabla 33).
La cosecha de FVII-CTP4 muestra un aumento de 3 veces en su actividad de coagulación potencial frente al plasma mezclado normal humano como se observa en el ensayo de actividad cromogénica (tabla 33). El porcentaje de actividad de FVII-CTP4 es mucho mayor en comparación con el porcentaje de actividad de FVII-CTP3 y FVII-CTP5. 15 Las limitaciones metodológicas del método de ELISA pueden limitar la precisión de los cálculos del nivel de Ag de FVII-CTP4.
5.8 Estudio farmacocinético
20
Se realizaron dos estudios farmacocinéticos para determinar los parámetros farmacocinéticos (PK) de FVII-CTP3, FVII-CTP4 y FVII-CTP5. Durante el primer estudio, FVII-CTP3, FVII-CTP4 y FVII-CTP5 (Grupos A, B y C, respectivamente) se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por tratamiento) en una dosis de 250 µg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72 y 96 horas después de la dosificación 25 (tabla 34). El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis.
Tabla 34: Diseño del estudio farmacocinético – Cosecha concentrada
30
La concentración de FVII en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de Elisa para FVII humano (Zymutest FVII-Biophen). El perfil farmacocinético se calculó y es la media de 3 animales en cada punto de tiempo. Los valores del tiempo de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK Solutions 2.0. La tabla 35 más adelante resume las concentraciones calculadas de FVII en los diferentes puntos de 5 tiempo de muestreo. El perfil PK (Figuras 23-24) y un resumen de los parámetros PK (tabla 36) también se presentan más adelante. FVII-CTP5 demostró un perfil superior en comparación con FVII-CTP3y FVII-CTP4 (tabla 36).
Tabla 35: Primer estudio farmacocinético – Concentraciones de FVII 10
Tabla 36: Análisis farmacocinético
15
La adición de cuatro o cinco CTP prolongó significativamente el tiempo de vida media del FVII en comparación con 3 CTP en 2 y 3 veces, respectivamente (tabla 36). Esta superioridad fue más significativa en la parte inicial del estudio (0,083-8 horas), lo que sugiere una mejor recuperación potencial de la proteína y reducción del aclaramiento extravascular. El AUC después de la administración de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 aumentó en 3 y 4 veces, 20 respectivamente, frente a FVII-CTP3. El aclaramiento también se redujo cuando se añadieron 4 y 5 CTP al FVII (tabla 36).
Como se observó en el estudio, la adición de cuatro y cinco CTP prolongó significativamente el tiempo de vida media del FVII en comparación con 3 CTP, tanto del tiempo de vida media inicial como terminal. Los valores del tiempo de 25 vida media en el primer y segundo estudios son diferentes debido a un enfoque diferente del análisis que se realizó por la dosis y la duración del estudio, sin embargo se mantuvo la tendencia general. El AUC después de la administración de FVII-CTP4 y FVII-CTP5 aumentó en 2,5 y 7 veces, respectivamente, frente a FVII-CTP3.
5.9 Conclusiones: 30
En este estudio, se evaluaron los parámetros PK y la actividad de coagulación potencial de FVII-CTP3, FVII-CTP4, y FVII-CTP5. La fusión de 4 y 5 CTP al FVII proporcionó un superior y mejor tiempo de vida media, exposición y reducción del aclaramiento en comparación con FVII-CTP3 a la vez que se mantuvo una similar actividad cromogénica y de coagulación in vitro. Estos resultados se observaron a diferentes concentraciones de proteína y 35 fueron consistentes para la proteína de la cosecha y la purificada. Al evaluar el efecto general de la fusión de CTP en el extremo C terminal al FVII, la fusión de 1-5 CTP aumentó considerablemente el tiempo de vida media y el AUC de FVII de una manera proporcional a los CTP, lo que sugiere que a medida que aumenta la porción CTP de la molécula, la longevidad y la estabilidad del FVII mejoran significativamente a la vez que mantiene su actividad de coagulación inicial in vitro, como se resume en la tabla 37 a continuación.
5
Tabla 37:
Como se informó previamente, el tiempo de vida media del FVII se correlaciona con el tiempo de vida media de la forma activada del FVII (FVIIa) en humanos y animales. Por lo tanto, se prevé que se obtendrá una mejora similar en el tiempo de vida media para las versiones activadas después de la fusión de CTP. 10
Ejemplo 6
Estudios de factibilidad del FVII-CTP3 en ratones hemofílicos deficientes de FVIII
15
Se realizaron los estudios descritos anteriormente que prueban el perfil PK y la actividad de coagulación de las cosechas de FVII-CTP, FVII-CTP2 y FVII-CTP3 frente a un FVII comercial. FVII-CTP3 mostró un mejor perfil PK a la vez que mantuvo su actividad de coagulación frente a las cosechas de FVII-CTP y FVII-CTP2 o rhFVII. Para caracterizar adicionalmente las propiedades de FVII-CTP3 in vitro e in vivo, se generó una mini mezcla estable que expresaba y secretaba la proteína, y se desarrollaron procesos de purificación y activación. 20
En este estudio, las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas de FVIIa-CTP3 se analizaron en ratones deficientes de FVIII. Se evaluó el perfil PK de la proteína. Se estableció un perfil PK basado en la actividad específica de FVIIa y en comparación con el producto comercial NovoSeven®. Además, se analizaron las capacidades hemostáticas a largo plazo in vivo de FVIIa-CTP3 para inducir la coagulación en ratones deficientes de 25 FVIII después de un corte de la vena de la cola (estudio de supervivencia).
Objetivos del estudio:
Evaluar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de FVIIa-CTP3 frente al rhFVIIa comercial 30 (NovoSeven®) en ratones deficientes de FVIII después de una única administración IV a una dosis de actividad similar.
Determinar la capacidad in vivo del FVIIa-CTP3 para mantener la homeostasis en ratones deficientes de FVIII mediante una única administración IV de FVIIa-CTP3 y NovoSeven® a una dosis de la actividad similar seguido por 35 un reto de corte de la vena de la cola (estudio de supervivencia).
Producción de la cosecha de FVII-CTP3:
FVII-CTP3 se expresó en el laboratorio en células Dg44 mediante el uso de un vector pCI-DHFR. La mezcla estable 40 transfectada #71 se cultivó en matraces de agitación, en presencia de vitamina K3 a 25 ng/L (Sigma). La suspensión celular se cultivó y cosechó después que la viabilidad disminuyó a 60-80 %. La cosecha se filtró y congeló a -70 °C.
Determinación del nivel del antígeno FVII de cosecha:
El nivel del antígeno FVII se determinó mediante el uso de un estuche de ELISA para FVII humano (Zymotest 45 HyPhen) (tabla 38). El nivel del antígeno se calculó por cada lote de cosecha mezclado.
Tabla 38: Nivel del antígeno FVII-CTP3
50
Proceso de purificación de FVII-CTP3 (figura 25)
Descripción del proceso
Después de un corto estudio de purificación, se realizó el siguiente proceso de purificación mediante el uso de 2 5 columnas. La proteína enriquecida γ-carboxilada FVII-CTP3 se purificó en columna de afinidad VII-Select (GE) e hidroxiapatita cerámica tipo 1 (HA), 40 µm (Bio Rad). La autoactivación se indujo mediante incubación de FVII-CTP3 purificado en presencia de CaCl2 durante la noche a 2-8 °C. El proceso de purificación está en su etapa final de desarrollo y se está optimizando, por lo tanto parte de las etapas de purificación no son idénticas en los dos lotes.
10
Ultrafiltración/diafiltración (UFDF) mediante el uso del casete de fibra hueca de 10 KDa o Pellicon
La cosecha clarificada se descongeló a 4 °C durante el fin de semana (2-3 días).
En el lote 31, la cosecha clarificada (12 litros) se concentró 4 veces (en dos ejecuciones sucesivas) mediante el uso 15 de un cartucho de fibra hueca (GE Healthcare catálogo núm. UFP-10-C-4X2MA) con un valor de corte del peso molecular de 10 KDa. La cosecha concentrada se diafiltró contra 1-2 volúmenes de TBS (Tris 50 mM NaCl 150 mM pH 7,4).
En el lote 38, la cosecha clarificada (8,5 litros) se concentró 4 veces mediante el uso de un casete Pellicon 2 20 (Millipore) con un valor de corte del peso molecular de 10 KDa. La cosecha concentrada se cargó directamente en una columna VII-Select.
Ambas ultrafiltraciones se realizaron en hielo con tampones fríos. Las muestras UFDF se filtraron por 0,22 µm antes de la carga. 25
Captura en la columna FVII-Select
La cosecha por UFDF o concentrada se cargó en la columna VII-Select (XK16/20, CV 18 ml), equilibrada previamente con TBS pH 7,4. La columna se lavó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 0,5M, pH 7,5, y FVII-CTP3 se eluyó con 30 Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M 50 % (v/v), propilenglicol pH 7,5. El proceso se realizó en dos ciclos sucesivos con la utilización de la misma columna.
Separación basada en la gamma carboxilación en una columna de hidroxiapatita cerámica
35
El producto eluido se diluyó 1:10 con fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8 y se cargó en columnas de hidroxiapatita cerámica (XK16/20, CV 24 ml). La columna se lavó con fosfato de sodio 59 mM, pH 6,8 y la fracción rica γ-carboxilada del Factor VII se eluyó con fosfato de sodio 500 mM, pH 6,8. Este proceso se realizó en dos ciclos sucesivos en la misma columna. En cada lote, los eluatos de los dos ciclos se combinaron y concentraron a 1,7-2 mg/ml y se diafiltraron con Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM pH 8,2 para reducir el volumen y preparar el material para 40 la etapa de activación.
Activación de FVII
El FVII-CTP3 purificado se diluyó a 1 mg/ml y se incubó en Tris-HCl 20 mM, NaCl 100 mM y CaCl2 1 mM, pH 8,2 a 45 2-8 °C durante 24 horas. La activación se terminó mediante intercambio del tampón (UFDF) al tampón de formulación preliminar (citrato 20 mM, NaCl 240 mM, glicina 13,3 mM, pH 6,9).
Propiedades analíticas de FVII-CTP3 y FVIIa-CTP3:
50
SDS-PAGE y transferencias Western
El FVII-CTP3 purificado, y FVIIa-CTP3 se cargaron en gel de Tris-glicina al 12 % mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision Plus (Bio-Rad). El análisis del SDS-PAGE Coomassie se realizó mediante tinción del gel con el reactivo azul brillante de Coomassie (5 o 10 µg de proteína/carril). Se realizó un análisis por transferencia 55 Western (1 µg de proteína/ carril) mediante el uso del Ac policlonal anti-FVII humano (R&D systems; AF2338), anticuerpo monoclonal anti-gamma carboxilación humana (American Diagnostics catálogo #499, 3570), y Ac policlonal anti-CTP. En condiciones reducidas, el FVII-CTP3migró a 75 KDa, y FVIIa-CTP3 migró como dos bandas principales: una cadena pesada a 50 kDa, y una cadena ligera a 25 kDa, representado en la figura 26 como las bandas 2 y 3, respectivamente. 60
El procedimiento de purificación enriqueció significativamente la porción FVII-CTP3 a la vez que redujo las impurezas. El rendimiento del proceso de purificación fue de 25-30 % de FVII (de acuerdo con ELISA). La mayor parte de la proteína perdida durante la purificación tenía baja actividad cromogénica del FVII o no tenía actividad. Basado en SDS-PAGE teñido con Coomassie, el FVIIa-CTP3 reducido contiene más bandas que las predichas. Una 65 banda que migra a alrededor de ∼75 kDa representa el FVII no-activado (figura 26, Banda 1). Esta banda consiste en dos bandas con diferencias menores de PM, que podrían reflejar diferente contenido de γ-carboxilación. Se observaron bandas adicionales con PM menor que 20 kDa. Previamente se informó que estos son productos de degradación de la cadena pesada.
Actividad cromogénica de FVII-CTP3: 5
Una evaluación comparativa de la potencia in vitro de la cosecha de FVII-CTP3, las fracciones durante el proceso, y FVII-CTP3 purificado frente al plasma mezclado normal humano se realizó mediante el uso de un estuche de prueba de la actividad cromogénica disponible comercialmente, BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304). La cosecha de FVII-CTP3 y la proteína se diluyeron en serie y la potencia se evaluó mediante la comparación de una curva de dosis-10 respuesta con una preparación de referencia de plasma normal humano. Después de la purificación de FVII-CTP3, la actividad cromogénica mejoró significativamente, y las fracciones no activas se separaron principalmente mediante columna HA (figura 27). Se observó una fuerte correlación entre la actividad cromogénica de FVII y la detección de FVII con anticuerpos monoclonales anti-Gla en la transferencia Western. La potencia de la actividad cromogénica de FVII como se refleja por el valor de EC50 en la cosecha se afecta por ambas fracciones de FVII 15 carboxiladas y no carboxiladas. Después de la purificación y el enriquecimiento de la fracción γ-carboxilada de FVII-CTP3, la actividad mejoró, lo que demuestra la contribución importante de la γ-carboxilación para la actividad de FVII (figura 27). Este parámetro es crucial para una adecuada actividad de FVII in vivo y se abordará adicionalmente en un programa de desarrollo de clones.
20
Determinación de proteínas por A280
El coeficiente de extinción teórico de FVIIa-CTP3 y NovoSeven® se calculó mediante el uso del algoritmo ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). El cálculo se basa en la secuencia de aminoácidos. Los coeficientes de extinción calculados para FVII-CTP3 y NovoSeven® son 1,186 y 1,406, respectivamente. Estos valores representan la 25 absorbancia de 1 g/L a 280 nm.
La diferencia de los coeficientes de extinción entre las dos proteínas se deriva solamente del aumento en el peso molecular de FVIIa-CTP3 en comparación con NovoSeven®, dado que el CTP carece de residuos aromáticos y de cisteína, por lo tanto no contribuye a la absorbancia. 30
La determinación de proteínas por A280 se usa para FVII final, y para las muestras purificadas durante el proceso, que inició desde la elución de la columna VII-Select.
Determinación del nivel del antígeno FVIIa 35
El nivel del antígeno FVIIa se determinó mediante el uso del estuche de ELISA para FVIIa humano (IMUBIND, American Diagnostica). El nivel del antígeno se calculó por cada lote. Sin embargo, esta herramienta no fue útil para la determinación de la dosis para la inyección, ya que no representa la cantidad de producto activo.
40
Ensayo de coagulación de FVIIa- Staclot® VIIa-rTF
FVIIa se deriva de una escisión intracatenaria del FVII monocatenario. El factor tisular nativo (TF) es un cofactor de FVIIa. Después de la unión a TF, el FVII media la activación del Factor X a Xa, mientras que él mismo se transforma a FVIIa. El factor tisular soluble es la parte extracelular del factor tisular nativo. Éste ya no puede activar el FVII por 45 autoactivación, pero el FVIIa unido al factor tisular puede activar FX a FXa.
El factor tisular soluble recombinante (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad al FVIIa para construir una prueba de coagulación con FVIIa. El rsTF, en presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos conduce a la coagulación del plasma, sin activar FVII a FVIIa. 50
El tiempo de coagulación observado en este sistema tiene una relación inversa con el contenido de FVIIa en la muestra analizada, sin interferencia de la presencia de FVII en la muestra.
El ensayo se realizó por Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel). La actividad de FVIIa se evaluó para ambos NovoSeven® después de la reconstitución y FVIIa-CTP3 antes de cada estudio. La actividad de NovoSeven® no se 55 correlacionó con la actividad anticipada como se informó en el frasco, pero la discrepancia puede deberse a un enfoque diferente en la evaluación de la actividad. La tabla 39 resume la actividad de coagulación del FVIIa por volumen sin considerar la concentración de proteínas.
Tabla 39: Actividad de coagulación del FVIIa de los productos por lote 60
- Estudio PK Estudio de supervivencia
- FVIIa-3*CTP (FVIIa 31)
- NovoSeven ® FVIIa-3*CTP (FVIIa 38) NovoSeven ®
- Estudio PK Estudio de supervivencia
- FVIIa-3*CTP (FVIIa 31)
- NovoSeven ® FVIIa-3*CTP (FVIIa 38) NovoSeven ®
- Actividad (U/ml)
- 1,3E+06 2,5E+05 1,3E+06 7,4E+05
Actividad específica de FVIIa-CTP3
La actividad específica del FVIIa (que se calcula como la actividad/ml dividida por la concentración de proteínas) se calculó basada en A280 y se presenta en la tabla 40. Cuando se compara la actividad específica de las dos 5 moléculas, que difieren en PM, debe realizarse la compensación para normalizar la actividad (es decir debido a la diferencia de peso molecular, la cantidad de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en FVIIa-CTP3). El cálculo del factor de conversión se presenta en la siguiente ecuación:
10
Tabla 40: Actividad específica de FVIIa-CTP3 en comparación con NovoSeven®
- Muestra
- A280 promedio STDV (n=9) % CV Coeficiente de Extinción conc. de prot. (mg/ml) U/ml Actividad específica Disminución en veces de NovoSeven®
- U/mg proteína
- U/mg FVIIa
- NovoSeven®
- 1,274 0,031 2,398 1,406 0,906 8,36E+05 9,23E+05 9,23E+05 1,0
- FVIIa-CTP3
- 4,396 0,092 2,094 1,186 3,706 7,23E+05 1,95E+05 2,31E+05 4,0
Estudio PK-PD de FVIIa-CTP3:
15
Descripción del estudio
FVIIa-CTP3 y rhFVIIa (NovoSeven®, NS) se administraron en una única inyección intravenosa a los ratones C57B deficientes de FVIII a una dosis de 6,4E6 U/kg de peso corporal (160,000 U/animal). Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 4 ratones alternativamente a las 0,166, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, y 72 20 horas después de la dosificación (tabla 41). El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. Se evaluó la actividad de coagulación del nivel de FVIIa, y se realizó un análisis PK detallado. El estudio se realizó por Omri Laboratories (Nes-Ziona, Israel).
Tabla 41: Descripción del estudio 25
- Grupos tratados
- Elemento de prueba Núm. de animales/grupo/punto de tiempo Vía de dosificación Cantidad de unidades/animal Vol. inyectado (µl) Puntos de tiempo (horas después de la dosis)
- A
- rhFVIIa 4 IV 1,6e5 200 0 (Antes de la dosis) 0,166, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, 72
- B
- FVIIa - CTP3 4 IV 1,6e5 200 0 (Antes de la dosis) 0,166, 0,5, 2, 4, 8, 12, 24, 34, 48, 58, 72
Perfil PK de FVIIa-CTP3 en ratones deficientes de FVIII
Se cuantificó la actividad de FVIIa en muestras de sangre mediante el uso de un estuche para VIIa-rTF Staclot® (Stago, Parsippany, NJ). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y representa la media de 4 animales 30 en cada punto de tiempo. La figura 28 presenta el perfil PK de FVIIa a lo largo del experimento. La recuperación de FVIIa se presenta en la tabla 42. En la tabla 43 se presenta un resumen de los parámetros PK.
La tabla 41 resume los valores de la actividad de coagulación después de la administración de NovoSeven® o FVIIa-CTP3. FVIIa-CTP3 y NovoSeven® alcanzaron la actividad máxima media hora después de la dosificación. El valor 5 más alto de la actividad de NovoSeven® alcanzó solo el 43 % del valor máximo de actividad de FVIIa-CTP3. La actividad de coagulación de FVIIa-CTP3 se mantuvo durante un periodo de tiempo más prolongado, lo que demuestra una actividad prolongada. La actividad de coagulación para los ratones tratados con NovoSeven® no se detectó en los puntos de tiempo más tardíos que 12 horas, mientras que los ratones tratados con FVII-CTP3 mantuvieron una actividad medible a las 48 horas después de la dosificación (tabla 41 y Figura 28). 10
La adición de tres copias de CTP en tándem al FVIIa elevó la recuperación en 100 % (tabla 42), según se midió por la actividad más alta después de la dosificación y en comparación con la actividad anticipada basada en el análisis in vitro, y aumentó el tiempo de vida media y el tiempo medio de residencia (MRT) 5 veces. El tiempo de exposición (AUC) se incrementó 3 veces (tabla 43). 15
Tabla 41: Actividad de coagulación de FVIIa después de una única inyección IV
20
Tabla 42: Recuperación de FVIIa-CTP3
- Tratados. Grupos
- Elemento de prueba Cantidad de unidades/animal Dosis administrada práctica (U/ml) * Cmáx anticipada (U/ml sangre) Cmáx (U/ml) % Recobrado
- A
- rFVIIa 1,60E+05 1,20E+06 1,40E+05 4,25E+04 30
- B
- FVIIa - CTP3 1,60E+05 1,29E+06 1,50E+05 9,74E+04 64,6
- * Cmáx anticipada se deriva de la dosis administrada dividida por el volumen de sangre
Tabla 43: Parámetro PK de FVIIa-CTP3 vs. NovoSeven®
25
Ensayo de generación de trombina (TGA)
La generación de trombina es una parte fundamental de la cascada de coagulación y como tal un estimado de cuán bien un individuo particular puede generar trombina puede correlacionarse con un riesgo de hemorragia o trombosis. 30 Las variables medidas comúnmente cuando se analiza la generación de trombina incluyen: el tiempo de retraso, el tiempo hasta la generación máxima de trombina, el máximo, el potencial de trombina endógena [ETP] (es decir, el área bajo la curva y la cola), el curso de tiempo del trombograma (quot;TGquot;). Después de un tiempo de retraso, se observa un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTPobserva un aumento de trombina. Sin embargo, la coagulación se produce al final del tiempo de retraso, cuando más del 95 % de toda la trombina todavía no se ha formado. El ensayo de generación de trombina se realizó en Omri Laboratories, mediante el uso de reactivos Thrombinoscope suplementado con plasma hemofílico humano. El TGA refleja la capacidad de coagulación en el plasma de ratones, derivada de la inyección de NovoSeven® y FVIIa-CTP
10
Estudio de corte de la vena de la cola (TVT) y FVIIa-CTP3:
Descripción del estudio
Los datos obtenidos de la prueba PK/PD para FVIIa-CTP3 proporcionó información sobre la funcionalidad del FVIIa-CTP3, y demostró que FVIIa-CTP3 tiene una ventaja farmacocinética cuando se compara con NovoSeven®. Sin 15 embargo, la capacidad de la proteína para inducir un coágulo in vivo, después de un evento traumático todavía no se ha demostrado. Para evaluar la capacidad de FVIIa-CTP3 para detener la hemorragia, el mismo modelo de ratones deficientes de FVIII se empleó para un reto de sangrado.
Los ratones deficientes de FVIII se administraron con una única inyección intravenosa de FVIIa-CTP3 o 20 NovoSeven®. Los ratones se dosificaron con el fármaco en cantidades que proporcionan una actividad de FVIIa equivalente (1,6E05 unidades, 200 µl), calculada de acuerdo con la potencia de cada fármaco evaluado en el ensayo de actividad de coagulación para FVIIa (tabla 44). Las dosis administradas fueron 9 mg/kg de NovoSeven®, y 40 mg/kg de FVII-CTP3 debido a la actividad reducida de FVIIa-CTP3. Un grupo control se inyectó con 200 µl de vehículo. 25
La vena de la cola se cortó 2,7 cm desde la punta de la cola a los 15 min (inyección 1), 24 horas (inyección 2) o 48 horas (inyección 3) después de la administración, y la supervivencia de los ratones se registró durante 24 horas.
Tabla 44: Evaluación de las muestras inyectadas 30
- NovoSeven® FVIIa-CTP3
- Inyección núm.
- conc. de proteínas (mg/ml) Actividad (U/ml) Actividad específica (U/mg) conc. de proteínas (mg/ml) Actividad (U/ml) Actividad específica (U/mg) Actividad específica (normalizada)
- 1
- 0,91 8,0E+05 8,8E+05 3,63 6,6E+05 1,8E+05 2,2E+05
- 2
- 0,92 8,3E+05 9,0E+05 3,81 7,8E+05 2,0E+05 2,4E+05
- 3
- 0,89 8,8E+05 9,9E+05 3,68 7,3E+05 2,0E+05 2,3E+05
La concentración de proteínas se determinó por A280.
Resultados 35
Los datos de los grupos control inyectados con vehículo para las tres inyecciones (5 animales x 3 inyecciones), se resumieron y se presentan en la figura 30. Se observó 30 % de supervivencia a las 24 horas después del corte de la vena de la cola.
40 Los ratones tratados con NovoSeven® y FVIIa-CTP3 demostraron adecuada actividad hemostática después del corte de la vena de la cola realizado 15 min después de la administración de FVIIa. Se observó un 100 % de la tasa de supervivencia en los animales tratados con FVIIa-CTP3 y NovoSeven® (figura 30).
La reducción de la velocidad de aclaramiento de FVII-CTP3 que se demostró en el estudio PK/PD se aprecia más 45 claramente después de un corte de la vena de la cola realizado 24 horas después de la administración. Se observa una disminución en la tasa de supervivencia de NovoSeven®. Similar al grupo control, se observa 50 % de muerte dentro de las 10 horas. Mientras tanto, el 90 % de los ratones tratados con FVIIa-CTP3 sobrevivieron (figura 30). Este resultado enfatiza la eficacia a largo plazo del tratamiento con FVIIa-CTP3.
50 48 horas después de la administración, se demostró una disminución en la tasa de supervivencia en los grupos tratados con FVIIa-CTP3 o NovoSeven® (figura 30C). Se observó una ligera mejora en los ratones con FVIIa-CTP, pero la diferencia no alcanzó significación estadística.
Discusión: 55
La fusión de CTP a proteínas recombinantes aumenta el tiempo de vida media en circulación de las proteínas a la vez que mantiene una actividad comparable. A la vez que el mecanismo detrás de la reducción del aclaramiento de la proteína por encima de un valor umbral de 70 KDa se entiende bien con respecto al aclaramiento renal, se logra una protección adicional después de la fusión de CTP. Se considera que la fusión de CTP barre alrededor del 5 escudo proteico y lo protege de la escisión proteolítica, para aumentar su peso molecular radial debido a la carga altamente negativa y para reducir su afinidad con los receptores hepáticos de eliminación.
El presente estudio tuvo como objetivo proporcionar información específica sobre el impacto de la fusión de CTP al FVII sobre el tiempo de vida media y el aclaramiento de la proteína y además aborda el paradigma de su actividad 10 específica después de esta modificación. Los ratones deficientes de FVIII se administraron con una única inyección IV de FVIIa-CTP3 o FVIIa recombinante comercial (NovoSeven®) en dosis similar (basada en la unidad) y se realizó un análisis basado en la actividad PK. FVIIa-CTP3 demostró una longevidad superior como se refleja por el aumento de 5 y 3,5 veces en su tiempo de vida media y AUC, respectivamente. La actividad específica (U/mg) de FVIIa-CTP según se calculó por el estuche para la actividad Staclot® dividido por la concentración de proteínas medida por 15 A280 se demostró que fue 4-5 veces menor que la actividad específica de NovoSeven®.
Para contribuir a la comprensión de cómo el CTP afecta los efectos hemostáticos de FVIIa in vivo, se investigó la capacidad de FVIIa-CTP3 para reducir una hemorragia. En el modelo de hemorragia por corte de la vena de la cola en el modelo de ratones hemofílicos, la administración de rFVIIa puede mejorar la tasa de supervivencia de los 20 animales retados y evitar su sangrado hasta la muerte. En el estudio descrito en la presente, los animales se administraron con FVIIa-CTP3 o NovoSeven®. Ambas moléculas fueron capaces de mantener la homeostasis cuando el corte se realizó 0,25 horas después de la dosificación. Se demostró una duración significativamente prolongada de la actividad para el grupo tratado con FVIIa-CTP3 cuando el corte de la cola se realizó 24 horas después de la dosificación. La tasa de supervivencia del grupo tratado con vehículo fue mayor que la anticipada y 25 mayor que la obtenida en estudios anteriores (50 % frente a 20 % en estudios anteriores, datos no mostrados). El por ciento de supervivencia de los animales tratados también se evalúa en puntos de tiempo más tempranos, que incluyen a las 36 horas después de la dosificación.
En conclusión, se demostró que FVIIa-CTP3 tiene una duración aumentada de la actividad en los ratones 30 hemofílicos lo que se traduce en una duración más prolongada del efecto hemostático en comparación con NovoSeven®. Los datos reunidos sugieren que la fusión de CTP a FVII es una tecnología con el potencial de mejorar significativamente el tratamiento profiláctico en pacientes con hemofilia.
Ejemplo 7: Evaluación comparativa del perfil de FVII-CTP3 purificado frente a FVII-CTP5 después de una inyección 35 única IV o SC a ratas SD
Objetivo del estudio
Se llevaron a cabo dos estudios: 40
El objetivo del primer estudio fue determinar los parámetros farmacocinéticos de rFVII-CTP3 frente a rFVII-CTP5 después de la purificación en columna FVII select y HA en ratas macho Sprague Dawley, después de una única administración intravenosa de 50 µg/animal.
45 En el segundo estudio, los parámetros farmacocinéticos de rFVII-CTP3-HA frente a rFVII-CTP5-HA se examinaron en ratas macho Sprague Dawley después de una única administración intravenosa o subcutánea de 100 µg/animal.
Resultados
50
Determinación del nivel del antígeno FVII-CTP 3 y FVII-CTP 5
El nivel del antígeno FVII se determinó mediante el uso del estuche de ELISA para FVII humano (Zymotest HyPhen) (Véase la tabla 45). T 55
Tabla 45. Resumen de la concentración de proteínas calculada, que es el promedio de tres ejecuciones independientes.
- FVII 3 CTP FVII 5 CTP
- FVIIS 46 el.Conc. Dial FVII HA 46 el.Conc. Dial FVIIS el.Conc. Dial FVII HA 5 100 % BConc. Dial
- PROM (ng\ml)
- 3,78E+06 1,59E+06 1,88E+06 7,92E+05
- FVII 3 CTP FVII 5 CTP
- FVIIS 46 el.Conc. Dial FVII HA 46 el.Conc. Dial FVIIS el.Conc. Dial FVII HA 5 100 % BConc. Dial
- SD
- 1,30E+06 6,03E+05 7,15E+05 3,57E+05
- CV (%)
- 3,43E+01 3,80E+01 3,80E+01 4,51E+01
Análisis por transferencia Western de las muestras examinadas
Las muestras de FVII-CTP3,5 se cargaron en 4-12 % de bisTrisgel (NuPage, Invitrogene) mediante el uso del marcador de proteína de color dual Precision plus (Bio-Rad). El análisis por SDS-PAGE se realizó mediante 5 inmunotransferencia Western con el uso del Ac policlonal anti-FVII (R&D systems), Ac policlonal anti-CTP (Adar biotech production) o Ac anti Gla (American diagnostica). En resumen, el FVII fusionado a tres y cinco CTP migró a 80 y 100 KDa, respectivamente (véase la figura 31).
Evaluación comparativa de la potencia de FVII in vitro 10
El ensayo de actividad de FVII, que se realizó en Sheba Medical Center, el Centro Nacional de Coagulación, es un ensayo basado en PT con el uso de plasma inmunoadsorbido deficiente en factor VII (Siemens). El reactivo de PT es innovin y el ensayo se realiza en el instrumento Sysmex CA 1500. El intervalo normal del FVII está dentro de 55-145 %. Las actividades de las muestras se resumen en la tabla 46. 15
Tabla 46: Actividad de las muestras
- Muestra
- Concentración (mg/ml) de acuerdo con (NANODROP) Concentración en la muestra analizada (µg/ml) Resultados (%) Promedio-% de plasma
- FVII-5CTP FVIIS el. Conc. Dial
- 2,19 2 87 16 %
- 1
- 30
- 0,5
- 10
- FVII-5CTP HA 5 100 %B conc. Dial
- 1 2 97 21 %
- 1
- 36
- 0,5
- 13
- FVIIS 46 el. Conc. Dial
- 3,17 2 100 18 %
- 1
- 35
- 0,5
- 12
- FVII HA 46 el. Conc. Dial (1)
- 1,5 2 92 20 %
- 1
- 33
- 0,5
- 10
El nivel normal de FVII circulante en el cuerpo es alrededor de 0,5 µg/ml. Ambos, FVII-CTP3 y FVII-CTP5 muestran reducciones de aproximadamente 5 veces en su actividad de coagulación frente al plasma mezclado normal 20 humano.
Estudio farmacocinético
Se realizaron dos estudios farmacocinéticos para determinar el perfil y los parámetros farmacocinéticos (PK) de FVII-25 CTP3 y FVII-CTP5 (después de la columna select para FVII y HA para FVII). En el primer estudio, FVII-CTP3, y FVII-CTP5 después de la purificación de FVII por select/ HA se administraron en una única inyección intravenosa a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por sustancia) en una dosis de 50 µg/rata.
Las muestras de sangre se extrajeron de manera retroorbital de 3 ratas alternativamente a las 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 30 48, 72, 96 y 120 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,38 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 hasta su análisis.
En el segundo estudio, solo se analizaron las muestras después de la columna HA. Estas muestras se administraron en una única inyección intravenosa o subcutánea a las ratas Sprague Dawley (seis ratas por sustancia) mediante el 35 uso de una dosis de 100 µg/rata. Las muestras de sangre se recolectaron en los mismos puntos de tiempo y condiciones como en el primer estudio anterior.
Tabla 47. Diseño del primer estudio (FVII select frente a FVII HA).
- Grupos tratados
- Elemento de prueba Núm. de animales/ grupo/ Vía de dosificación Nivel de dosis (µg por animal) Vol. inyectado (µl) Conc. (µg/ml) Puntos de tiempo (horas después de la dosis)
- A
- FVII-CTP*3 lote 46 HA 6 IV 50 200 250 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120
- B
- FVII-CTP*3 lote 46 FVIIS 6 IV 50 200 250 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120
- C
- FVII-CTP*5lote 5 HA 6 IV 50 200 250 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120
- D
- FVII-CTP*5 lote 5 FVIIS 6 IV 50 200 250 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24, 48, 72, 96, 120
5
Tabla 18. Diseño del segundo estudio (IV frente a SC)
- Grupos tratados
- Elemento de prueba Núm. de animales/ grupo/ Vía de dosificación Nivel de dosis (µg por animal) Vol. inyectado (µl) Conc. (µg/ml) Puntos de tiempo (horas de dosis)
- A
- FVII-CTP*3 lote 46 HA 6 IV 100 200 500 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24,48,72, 96,120
- B
- FVII-CTP*3 lote 46 HA 6 SC 100 200 500 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24,48,72, 96,120
- C
- FVII-CTP*5lote 5 HA 6 IV 100 200 500 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24,48,72, 96,120
- D
- FVII-CTP*5 lote 5 HA 6 SC 100 200 500 0 (Antes de la dosis) 0,083, 0,5, 2, 5, 8, 24,48,72, 96,120
Las diferencias principales entre estos dos estudios son las dosificaciones y la vía de administración. En el primer estudio, las ratas se inyectaron IV con 50 µg\rata, mientras en el segundo estudio, las ratas se inyectaron IV o SC con 100 µg\rata (total 500) µg/kg; peso de las ratas 200 g). El aumento en la dosificación se debe al cambio en el 10 tipo de administración; la administración SC requiere mayores cantidades para lograr efectos similares a la administración IV.
Análisis del estudio de PK
15
La concentración de FVII en las muestras de plasma se cuantificó mediante el uso de estuches de Elisa para FVII humano (zymutest FVII-Biophen). Los perfiles farmacocinéticos se calcularon y reflejan la media para 3 animales en cada punto de tiempo. Los valores del tiempo de vida media terminal se calcularon mediante el uso del programa informático PK solutions 2.0. La tabla más adelante resume las concentraciones calculadas de FVII en los diferentes puntos de tiempo de muestreo. El perfil PK y un resumen de los parámetros PK se presentan en una tabla más adelante.
Tabla 49. Primer estudio farmacocinético (FVII select frente a FVII HA) -concentraciones de FVII (ng\ml).
- Tiempo (hora)
- FVII CTP*3 Lote 46 HA FVII CTP*3 Lote 46 FVII S FVII CTP*5 Lote 5 HA FVII CTP*5 Lote 5 FVII S
- 0,083
- 1816,3 1633,9 2064,3 1853,5
- 0,5
- 1523,7 1409,9 1351,4 1418,0
- 2
- 1284,9 1041,7 1389,7 834,4
- 5
- 607,9 531,6 722,7 737,2
- 8
- 524,2 430,0 712,2 614,6
- 24
- 115,5 132,9 272,5 201,8
- 48
- 21,1 31,6 62,3 90,4
- 72
- 9,5 15,8 29,1 31,8
- 96
- BLQ 5,8 7,0 16,9
- 120
- BLQ BLQ 8,5 13,4
5
Tabla 50. Segundo estudio farmacocinético (IV frente a SC) -concentraciones de FVII (ng\ml).
- Tiempo (hora)
- FVII CTP*3 Lote 46 HA-IV FVII CTP*5 Lote 5 HA-IV FVII CTP*3 Lote 46 HA-SC FVII CTP*5 Lote 5 HA-SC
- 0,083
- 6452,6 6153,3 5,0 BLQ
- 0,5
- 3930,7 3660,6 14,5 14,6
- 2
- 1992,3 2176,2 113,6 96,2
- 5
- 1598,9 2087,3 106,6 70,5
- 8
- 781,6 1075,6 188,9 129,7
- 24
- 268,5 627,2 155,0 239,2
- 48
- 51,9 143,3 43,0 88,6
- 72
- 8,8 39,0 7,0 36,7
- 96
- BLQ 10,8 BLQ 10,4
- 120
- BLQ 8,2 BLQ 8,7
Tabla 51. Análisis PK- primer estudio farmacocinético (FVII S frente a HA).
- FVII CTP*3 Lote 46 HA FVII CTP*3 Lote 46 FVII S FVII CTP*5 Lote 5 HA FVII CTP*5 Lote 5 FVII S
- Tiempo de vida media (0,083-8 horas) (horas)
- 4,3 4,0 5,51 5,59
- Tiempo de vida media (8-72\96\120 horas) (horas)
- 11,1 12,1 16,46 20,29
- Tiempo de vida media (8-72) (horas)
- 11,1 13,4 13,62 15,64
- AUC(O-t)(área obs)(8-72/96/120 horas)
- 14566,9 13686,4 21812,7 19307,9
- AUC (∞) área(8-72/96/120 horas)
- 14718,2 13788,1 22013,9 19701
- Vd(área)/kg (ml/kg)(8-2/96/120 horas)
- 271,1 316,1 269,7 371,5
- CL(área)/kg(ml/horas/kg) (8-72/96/120 horas)
- 17,0 18,1 11,356 12,69
La adición de cinco CTP prolongó el tiempo de vida media de FVII en comparación con 3 CTP. Ambas formas de 5 CTP (es decir FVIIS y FVII HA) se detectaron en los mayores puntos de tiempo (96 y 120 horas), mientras que FVII-3 CTP HA y FVIIS -3 CTP se detectaron hasta las 72 horas y 96 horas, respectivamente. Basados en este hecho, el 5 tiempo de vida media de FVII-5 CTP es más prolongado que las variantes de 3CTP (véase la figura 32). La comparación del tiempo de vida media de todos los materiales examinados (3 y 5 CTP) en los mismos puntos de tiempo (8-72 horas) mostró que los tiempos de vida media son similares, aunque los de 5 CTP son considerablemente más prolongados (figura 32).
10
Tabla 52: Análisis PK - segundo estudio farmacocinético (IV frente a SC).
- FVII CTP*3 Lote 46 HA-IV FVII CTP*5 Lote 5 HA-IV FVII CTP*3 Lote 46 HA-SC FVII CTP*5 Lote H 5 HA-SC Biodisponibilidad CTP*3 Biodisponibilidad CTP*5
- Tiempo de vida media (0,083-8 horas) (horas)
- 3,0 3,9 -1,8 -3,18
- Tiempo de vida media (8-72\96\120 horas) (horas)
- 9,9 14,6 13,14 22,94
- Tiempo de vida media (8-72) (horas)
- 9,9 13,0 13,14 29,47
- AUC(O-t)(área obs)(8-72/96/120 horas)
- 28866,8 43761,0 6600 9822,7 22,9 22,4
- AUC (∞) área(8-72/96/120 horas)
- 28993,0 43934,4 6733 10110,8 23,22 23,01
- Vd(área)/kg (ml/kg) (8-72/96/120 horas)
- 246,4 240,5 1407,6 1636,8
- CL(área)/kg( ml/horas/kg) (8-72/96/120 horas)
- 17,2 11,4 74,261 49,452
De nuevo, como se observó en el primer estudio, la adición de 5 CTP prolongó el tiempo de vida media de FVII en comparación con la adición de 3 CTP, en el tiempo de vida media inicial y terminal y en ambas formas de administración (IV y SC, véase la figura 33). Como se esperaba, después de la administración SC, FVII se detectó 15 primero en la sangre a un punto de tiempo más tardío en comparación a cuando se administró IV.
En lo anterior, se resumieron dos estudios PK. El propósito principal del primer estudio fue verificar la diferencia entre FVII-3CTP y FVII-5 CTP después de 2 columnas diferentes: FVII select y FVII HA. En nuestros estudios anteriores, se verificaron las proteínas de cosecha frente a las purificadas y se encontró que la diferencia entre las 20 versiones 3 y 5 CTP del FVII fue mayor cuando se inyectó la cosecha a las ratas.
No hubo diferencia significativa entre los resultados de FVII 3\5 CTP después de ambas columnas, por tanto se decidió inyectar FVII HA 3\5 CTP en el segundo estudio.
25
Ejemplo 8: Estudio de supervivencia con FVIIa-CTP3 (MOD-5014) en ratones decientes de FVIII después de una inyección subcutánea
Objetivo del estudio
Evaluar la eficacia de NovoSeven®, MOD-5014 (FVIIA-CTP3) y MOD-5019 (FVIIA-CTP5) en un estudio con corte de la vena de la cola, después de una administración subcutánea.
Propiedades analíticas de FVIIa-CTP3(MOD-5014) y FVIIa-CTP5(MOD 5019): 5
Determinación de proteínas por A280
El coeficiente de extinción teórico de NovoSeven® se calculó mediante el uso del algoritmo ProtParam (http://web.expasy.org/protparam). El cálculo se basa en la secuencia de aminoácidos. El coeficiente de extinción 10 calculado para NovoSeven® es 1,406, y para MOD-5019 es 1,075 (los valores representan la absorbancia de 1 g/l a 280 nm). El coeficiente de extinción de MOD-5014 se determinó mediante un análisis de aminoácidos en Mscan. El coeficiente de extinción para MOD-5014 es 1,27.
Ensayo de coagulación de FVIIa - STACLOT VIIa-rTF 15
FVIIa se deriva de una escisión intracatenaria del FVII monocatenario. El factor tisular nativo (TF) es un cofactor de FVIIa, tras la unión al TF, el FVII media la activación del Factor X a Xa, mientras que él mismo se transforma a FVIIa. El factor tisular soluble es la parte extracelular del factor tisular nativo. Éste ya no puede activar el FVII por autoactivación, pero el FVIIa unido al factor tisular puede activar FX a FXa. 20
El factor tisular recombinante soluble (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad al FVIIa para construir una prueba de coagulación del FVIIa. El factor tisular recombinante soluble (rsTF), en presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos, produce coagulación del plasma sin activar FVII a FVIIa.
25 El tiempo de coagulación observado en este sistema tiene una relación inversa con el contenido de FVIIa en la muestra analizada, sin interferencia de la presencia de FVII en la muestra.
La actividad de FVIIa se evaluó para NovoSeven® reconstituido, y para MOD-5014 y MOD-5019 antes de cada estudio. 30
La actividad específica de FVIIa (que se calcula como la actividad/ ml dividida por la concentración de proteínas) se calculó basado en A280 y se presenta en la tabla 53. Cuando se compara la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en el peso molecular, debe realizarse la compensación para normalizar la actividad (es decir debido a la diferencia de peso molecular, la cantidad de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces 35 mayor que en MOD-5014 y 1,307 veces mayor que en MOD-5019). Por tanto, el cálculo del factor de conversión se presenta en la siguiente fórmula:
40
Tabla 53- Actividad específica de MOD-5014 en comparación con NovoSeven®
- Muestra
- Conc. de proteínas Por A280 (mg/ml) Actividad específica (U/mg FVIIa) Disminución en veces de ®NovoSeven
- ®NovoSeven
- 0,93 52 487 1,0
- MOD-5014 lote 73
- 1,4 25 490 2,05
- MOD-5019 lote 9
- 3,0 11 698 4,48
Descripción del estudio
La medición más significativa es la capacidad de la proteína para inducir un coágulo in vivo, después de un evento 45 traumático. Para evaluar la capacidad de MOD-5014 para detener una hemorragia, se empleó el mismo modelo de ratones deficientes de FVIII para un reto de sangrado.
Los ratones deficientes de FVIII se administraron con una única inyección subcutánea de MOD-5014, MOD-5019 o NovoSeven®. Los grupos A y B se dosificaron con NovoSeven® y MOD-5014 respectivamente, en cantidades 50 equivalentes a la actividad de FVIIa. El grupo C se dosificó con MOD-5019 en una cantidad equivalente a la proteína FVIIa como MOD-5014, para evaluar el factor crítico (actividad o cantidad de proteína). Las dosis administradas fueron 4,2 mg/kg de NovoSeven®, y 8,6 mg/kg de MOD-5014 y MOD-5019. La vena de la cola se cortó 2,7cm desde la punta de la cola, 12 horas después de la administración, y la supervivencia de los ratones se registró durante 24 horas.
Tabla 54 – Designación de los grupos 5
- T
- Grupo
- Fecha de la inyección Elemento de prueba Dosis administrada Volumen inyectado (µl) Núm. de ratones por grupo Tiempo de sangrado, horas después de la dosificación
- mg de FVII /Kg
- mU/Kg
- A
- 13.1.13 ®NovoSeven 4,23 221 876 100 10 12
- B
- 15.1.13 MOD-5014, lote 73 8,59 218 750 160 10 12
- C
- 27.1.13 MOD-5019, lote 9 8,59 100 496 160 10 12
Resultados
Los datos del experimento se resumen en la tabla 55 y en la figura 34.
10
Tabla 55. Resultados del estudio de TVT
- Tiempo
- Núm. de ratones sobrevivientes % de supervivencia
- Después de TVT (h)
- NovoSeven® MOD-5014 MOD-5019 NovoSeven® MOD-5014 MOD-5019
- 0
- 9 10 10 100 100 100
- 1
- 9 10 10 100 100 100
- 2
- 9 10 10 100 100 100
- 3
- 8 10 8 89 100 80
- 4
- 6 9 8 67 90 80
- 5
- 5
- 9 7 56 90 70
- 6
- 4 8 5 44 80 50
- 7
- 3 8 5 33 80 50
- 8
- 2 7 5 22 70 50
- 9
- 1 6 5 11 60 50
- 10
- 1 5 5 11 50 50
- 11
- 1 3 5 11 30 50
- 12
- 1 3 5 11 30 50
- 24
- 1 3 4 11 30 40
24 horas después de TVT, solo 11 % de los ratones inyectados con NovoSeven® habían sobrevivido. El 30 % de MOD-5014 y el 40 % de MOD-5019 habían sobrevivido hasta este punto de tiempo. MOD-5014 y MOD-5019 inyectados por vía subcutánea muestran mejor supervivencia de los ratones en comparación con NovoSeven®. Sin 15 embargo, los resultados no son óptimos ya que más del 50 % de los animales murieron durante el experimento.
El factor VIIa, como otros factores de coagulación, se inyecta normalmente por vía intravenosa, para que esté disponible directamente en el torrente sanguíneo. Sin embargo, la presente invención muestra que las composiciones proporcionadas en la presente sorprendentemente se absorben más eficazmente en el torrente 20 sanguíneo después de la administración SC. La posibilidad de administrar el FVIIa por vía subcutánea constituye una ventaja ya que puede usarse para aplicaciones profilácticas. Además es mucho más fácil que los pacientes se inyecten ellos mismos las inyecciones subcutáneas, y son una ventaja cuando los pacientes son muy jóvenes y sus venas son pequeñas y difíciles de encontrar.
Por tanto, la aplicación subcutánea puede usarse para un tratamiento profiláctico,
5
Ejemplo 9: Estudio de PK-PD comparativo de MOD-5014 recombinante vs. NOVOSEVEN® después de una administración subcutánea en ratas SD
Objetivos del estudio
10 Determinar los parámetros farmacocinéticos y farmacodinámicos de MOD-5014 frente a rFVIIa comercial en ratas SD después de una única administración SC.
Comparar dos experimentos independientes (05010 y 05034) que contienen los productos MOD-5014 originados a partir de dos clones diferentes (clon núm. 28 frente al 61) según sus parámetros farmacocinéticos. 15
Métodos experimentales
Animales
20 24 ratas SD machos arribaron de Harlan Laboratories Israel, Ltd, al menos 4 días antes de iniciar las inyecciones. Los animales eran adultos jóvenes saludables, de -200 gr al inicio del estudio. La variación del peso corporal de los animales en el momento de iniciar el tratamiento no debía exceder ± 20 % de la media del peso de cada sexo. El estado de salud de los animales usados en este estudio se examinó a su llegada. Solo los animales con buen estado de salud se adaptan a las condiciones del laboratorio y se usan en el estudio. 25
Ensayo de coagulación de FVIIa - STACLOT VIIa-Rtf
El factor tisular recombinante soluble (rsTF) usado en este ensayo utiliza la especificidad al FVIIa para construir una prueba de coagulación de FVIIa. rsTF, en la presencia de FVIIa, calcio y fosfolípidos produce coagulación del 30 plasma, sin activar FVII a FVIIa.
El tiempo de coagulación observado en este sistema tiene una relación inversa con el contenido de FVIIa en la muestra analizada, sin interferencia de la presencia de FVII en la muestra.
35 Se evaluó la actividad de FVIIa para NovoSeven® después de la reconstitución y para MOD-5014 antes de cada estudio. La actividad específica de FVIIa se calculó basada en A280. Cuando se compara la actividad específica de las dos moléculas, que difieren en PM, debe realizarse la compensación para normalizar la actividad (es decir debido a la diferencia de peso molecular, la cantidad de sitios activos en 1 mg de NovoSeven® es 1,185 veces mayor que en MOD-5014). 40
Programa informático PK solver
Los parámetros farmacocinéticos se calcularon mediante el uso del programa informático PK solver. La curva de administración IV se analizó como bolo CA de dos compartimentos, y la administración SC como análisis trapezoidal 45 lineal Log - NCA Extravascular. Se calcularon las especificaciones del tiempo de vida media, el AUC, el aclaramiento y la distribución de volumen y los parámetros de salida se estudiaron en comparación entre los grupos de los experimentos.
Materiales experimentales 50
Experimento núm. 05010:
A. NovoSeven® RT: (Lote # AU61553 preparado el 31.7.12*) Concentración de FVIIa por A280: 0,86 mg/ml. Ensayo de actividad de FVIIa Staclot: 56 867 U/mg. Dosis inyectada: 946 µg/kg. *Mezcla de alícuotas de NovoSeven®, todas del mismo lote núm. 55
B. Clon 28: MOD-5014 RS12-001: 0,77 mg/ml** basado en A280. Ensayo de actividad de FVIIa Staclot: 34 162 U/mg. Dosis inyectada: 850 µg FVIIa/kg.
Experimento núm. 05034:
A. NovoSeven® RT: (Lote #AU61347 preparado el 1.1.13) Concentración de FVIIa por A280: 0,82 mg/ml, 60 diluida a 0,4 mg/ml con tampón NS estéril. Ensayo de actividad de FVIIa Staclot: 55 688 U/mg. Dosis inyectada: 360 µg/kg y 20 047,7 U/kg.
B. Clon 61: MOD-5014 Lote 75: 1,9 mg/ml** basado en A280, diluida a 0,89 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 20 047,7 U/kg. Actividad de coagulación del FVIIa: 25 002* U/mg basado en el ensayo de actividad de FVIIa Staclot. 65
C. Clon 61: MOD-5014 Lote 81A: 2,36 mg/ml basada en A280 (filtrado en la mañana del día del estudio y se volvió a medir a 280 nm), diluida a 0,4 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 360 µg FVIIa/kg. Actividad de coagulación del FVIIa: 24943U/mg basada en el ensayo de actividad de FVIIa Staclot.
D. Clon 61: MOD-5014 Lote 81A: 2,36 mg/ml basada en A280, diluida a 0,89 mg/ml con tampón de formulación. Dosis inyectada: 20 047,7 U/kg. Actividad de coagulación del FVIIa: 24 943 U/mg basada en el 5 ensayo de actividad de FVIIa Staclot.
Descripción de los estudios
Experimento núm. 05010 10
MOD-5014 y NovoSeven® se administraron en una única inyección intravenosa o subcutánea a las ratas SD en una dosis de 0,9 mg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron a partir del seno orbital del ojo de 3 ratas alternativamente a las 0,5, 4, 8, 12, 24, 34, 48 y 58 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó inmediatamente después del muestreo y se almacenó a – 20 °C hasta su análisis. El estudio se realizó en 15 quot;Science in Actionquot;, Nes-Ziona. Se evaluó el nivel de actividad de coagulación del FVIIa y se realizó un análisis PK detallado en Prolor-Biotech.
Tabla 55: Diseño del estudio 05010
20
Experimento núm. 05034
MOD-5014 y NovoSeven® se administraron en una única inyección subcutánea a las ratas SD en una dosis de 0,9 mg/kg de peso corporal. Las muestras de sangre se extrajeron del seno orbital del ojo de 3 ratas alternativamente a las 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48 y 72 horas después de la dosificación. El plasma citratado (0,32 %) se preparó 25 inmediatamente después del muestreo y se almacenó a -20 °C hasta su análisis. El estudio se realizó en quot;Science in Actionquot;, Nes-Ziona.
Se evaluó el nivel de actividad de coagulación del FVIIa y se realizó un análisis PK detallado en Prolor-Biotech.
30
Tabla 56: Diseño del estudio 05034
- Tratados. Grupos
- Elemento de prueba Núm. de animales/grupo/punto de tiempo *** Vía de dosificación Género Nivel de dosis por animal (µg/kg) Nivel de dosis por animal (U/kg) Vol. inyectado (µl) Puntos de tiempo (horas después de la dosis)
- A
- FVIIa (NovoSeven®) 3 SC M 360 20047. 7 207 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48,72
- B
- FVIIa 75 (clon 61) 3 SC M 801,8 4 20047. 7 207 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72
- C
- FVIIa 81A (clon 61) 3 SC M 360 8979,4 8 207 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72
- D
- FVIIa 81A (clon 61) 3 SC M 803,7 4 20047. 7 207 0, 0,5, 2, 4, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72
Resultados
La actividad del FVIIa en las muestras de sangre se cuantificó mediante el uso del estuche STACLOT VIIa-rTF (Stago). El perfil farmacocinético se calculó para cada proteína y es la media de 3 animales en cada punto de 5 tiempo.
Experimento núm. 05010
Después de la reducción de fondo: 15 mU/ml. 10
La figura 35 presenta el perfil PK de FVIIa después de la administración IV y SC de NovoSeven® o MOD-5014. En la tabla 57 se presenta un resumen de los valores de actividad del FVIIa para cada punto de tiempo. La administración IV y SC tienen un patrón PK diferente (véase la figura 35; después de la reducción de fondo: 15 mU/ml). La Cmáx después de la inyección IV es mayor que la obtenida después de la inyección SC, debido a la presencia del fármaco 15 en la sangre inmediatamente después de la administración (medida a las 0,5 hora, tabla 57 y tabla 58). Sin embargo, después de la administración SC las moléculas del fármaco se transfieren a la matriz intracelular y los tejidos, por lo tanto la Cmáx puede medirse solo después de 2 horas de la inyección. La recuperación total del fármaco después de la administración SC es menor que el valor de Cmáx después de la inyección IV.
20 8 horas después de la inyección, NovoSeven® manifestó un patrón PK igual cuando se inyectó IV o SC, (después de la reducción de fondo: 15 mU/ml, figura 35). Además, no se detectó actividad de coagulación para los ratones tratados con NovoSeven® en los puntos de tiempo después de las 12 horas, mientras que los ratones tratados con MOD-5014 retuvieron la actividad medible a las 58 horas después de la dosificación (tabla 57; después de la reducción de fondo: 15 mU/ml; figura 35). 25
Tabla 57. Actividad de coagulación del FVIIa de MOD-5014 frente a NovoSeven® después de la administración IV o SC
- Tiempo (h)
- NovoSeven® IV (A) MOD-5014 IV (B) NovoSeven® SC (C) MOD-5014 SC (D)
- mU/ml
- % CV mU/ml % C V mU/ml % C V mU/ml % C V
- 0,5
- 304651,7 18,7 232818,3 5,0 11491,7 2,4 3691,7 19,0
- 4
- 40068,3 7,8 62085,0 9,5 21385,0 22,6 12018. 3 15,8
- 8
- 5276,7 2,5 25931,7 6,1 5525,0 32,5 6445,0 2,2
- 12
- 255,0 13,8 5633,3 9,3 297,7 41,4 924,7 24,1
- 24
- 1,3 7,1 251,3 11,8 1,3 89,2 249,3 60,3
- Tiempo (h)
- NovoSeven® IV (A) MOD-5014 IV (B) NovoSeven® SC (C) MOD-5014 SC (D)
- mU/ml
- % CV mU/ml % C V mU/ml % C V mU/ml % C V
- 34
- 0,0 78,3 4,5 0,0 63,7 85,5
- 48
- 29,0 9,9 0,0 35,0 47,2
- 58
- 10,3 4,6 0,0 13,7 33,5
Después de la reducción de fondo: 15 mU/ml.
Tabla 58: Parámetros PK de MOD-5014 vs. NovoSeven® después de la administración IV o SC
- A. IV
- Parámetros PK
- NovoSeven® RT (A) MOD-5014 (RS 12-001) (B)
- Tiempo de vida media-α (0,5-4 horas)
- 0,24 1,04
- Tiempo de vida media-β (4-58 horas)
- 1,31 3,17
- AUC 0-inf mU/ml*h
- 702467,95 820778,67
- Vss [U/Kg/(mU/ml)]
- 0,13 0,13
- CL [(U/Kg)/(mU/ml)/h]
- 0,08 0,04
- MRT (horas)
- 1,74 3,62
- B. SC
- Parámetros PK
- NovoSeven® RT (B) MOD-5014 (RS 12-001) (C)
- Tiempo de vida media (horas)
- 1,40 7,78
- Cmáx (mU/ml)
- 21385,00 12018,33
- AUC 0-inf (mU/ml*h)
- 115099,72 84158,87
- MRT 0-inf (horas)
- 4,32 7,04
- Vz/F (U/Kg)/(mU/ml)
- 0,95 3,88
- Cl/F (U/Kg)/(mU/ml)/h
- 0,47 0,35
5
Experimento núm. 05034
La figura 36 presenta el perfil PK de FVII a después de la administración SC de NovoSeven® o MOD-5017. Dos lotes diferentes del clon núm. 61 (#75 y #81) se examinaron a la misma concentración o las mismas unidades de actividad, en comparación con NovoSeven®. En la tabla 59 se presenta un resumen de los valores de actividad del 10 FVIIa para cada punto de tiempo.
Los resultados indican un patrón PK similar después de la administración SC correspondiente a los experimentos anteriores. Además, no se detectó actividad de coagulación para los ratones tratados con NovoSeven® en los puntos de tiempo después de las 12 horas, mientras que los ratones tratados con MOD-5014 retuvieron una 15 actividad medible a las 24 horas después de la dosificación (tabla 59 y figura 36; y después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8, 12 horas) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 horas)).
El clon núm. 61 lote #81 (D) Cmáx (1,301 mU/ml) fue menor que los valores de Cmáx del clon núm. 61 lote #75 (B) y NovoSeven® (A) (3,521 mU/ml y 5,908 mU/ml respectivamente), aunque todos se inyectaron con la misma actividad 20 unitaria (tabla 6). Sin embargo, el lote #75 (B) y #81 (D) tienen las mismas unidades de actividad (559 mU/ml y 478 mU/ml respectivamente) medidas 8 horas después de la inyección (figura 36 y tabla 59; y después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8, 12 horas) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 horas)).
Tabla 59: Actividad de coagulación del FVIIa de MOD-5014 (Clon 61 #75, #81) frente a NovoSeven® después de 25 una única administración SC.
- Tiempo (h)
- NovoSeven® (A) MOD-5014 Clon 61 Lote 75 (B) - igual U/kg MOD-5014 Clon 61 Lote 81A (C) - igual conc.FVIIa µg/kg MOD-5014 Clon 61 Lote 81A (D) - igual U/kg
- mU/ml
- % CV mU/ml % CV mU/ml % CV mU/ml % C V
- 0,5
- 3271 ,3 46,5 350,3 26,6 101,3 24,1 208,7 51,2
- 2
- 5908 ,0 18,1 3521,3 70,9 1294,7 7,0 1301,3 31,6
- 6
- 1411 ,7 23,6 1349,7 45,6 425,3 27,6 663,0 13,4
- 8
- 1029 ,0 12,4 559,3 52,7 152,7 19,5 478,0 25,4
- 12
- 121. 3 9,9 563,0 17,4 148,7 36,3 712,7 16,2
- 24
- 1,0 25,0 117,0 41,9 21,3 36,4 99,0 36,7
Después de la reducción de fondo: 56 mU/ml (8,12 horas) o 32 mU/ml (0,5, 2, 6, 14 horas).
Tabla 60: Parámetros PK de MOD-5014 (Clon 61 #75, #81) frente a NovoSeven® después de una única administración SC. 5
- Pk
- Parámetros de NovoSeven® RT (A) MOD-5014 Clon 61 Lote 75 (B)- igual U/kg MOD-5014 Clon 61 Lote 81A (C)- igual conc.FVIIa µg/kg MOD-5014 Clon 61 Lote 81A (D)- igual U/kg
- Tiempo de vida media (horas)
- 1,67 5,70 4,62 6,41
- Cmáx (mU/ml)
- 5908,00 3521,33 1294,67 1301,33
- AUC 0-inf (mU/ml*h)
- 24688,18 20456,96 6260,23 13098,16
- MRT 0-inf (horas)
- 3,73 7,86 6,40 10,59
- Vz/F (U/Kg)/(mU/ml)
- 1,96 8,06 9,55 14,15
- Cl/F (U/Kg)/(mU/ml)/h
- 0,81 0,98 1,43 1,53
Este informe resume dos estudios PK; 05010 y 05034. Nuestro objetivo fue proporcionar información específica sobre el impacto de la fusión de CTP a FVII en el tiempo de vida media y el aclaramiento de la proteína en una administración subcutánea y abordar el paradigma de su actividad específica después de esta modificación. En estos estudios, las ratas SD se administraron con una única inyección SC de MOD-5014 originado de dos clones, y 10 dos lotes diferentes, en comparación con el FVIIa recombinante comercial (NovoSeven®). Los componentes se inyectaron a una concentración similar de FVIIa (µg/Kg) o al mismo nivel de actividad (U/Kg) y se realizó el análisis basado en la actividad PK.
El propósito principal del primer estudio fue verificar los diferentes parámetros PK después de una administración IV 15 y SC. Basados en este estudio podemos concluir que existe una diferencia entre el patrón PK medido después de una administración IV o SC. A un t1/2 de 7,78 horas medido después de la inyección SC de MOD-5014, y solo 4,2 horas después de la inyección IV. Los valores de AUC fueron los mismos (tabla 58).
El segundo estudio sin embargo, estuvo destinado a las diferencias entre dos lotes de MOD-5014 clon núm. 61, que 20 se inyectaron con la misma concentración de FVIIa o en igual unidad de actividad, en comparación con NovoSeven®. En este estudio demostramos que el clon 61 lote #75 manifestó mejores parámetros PK que el lote #81. El lote #81, que se inyectó al mismo nivel de actividad unitaria, tuvo menor Cmáx por un motivo desconocido. Además, se midió la misma Cmáx cuando se inyectó el clon 61 lote #81 en dos dosis diferentes (por la concentración de FVIIa o por la actividad unitaria), en lugar de 2,5 veces entre los dos valores de actividad. Después 25 del análisis de ambos estudios en conjunto, podemos concluir que el clon 28 manifestó un parámetro de t1/2 prolongado que el clon 61 #75 (el mejor lote) después de la inyección SC (7,78 horas y 5,7 horas respectivamente, tabla 60). Podemos concluir además que las muestras en puntos de tiempo diferentes crean un patrón PK diferente, que conduce a una variación en las curvas PK. Los patrones de las curvas pueden enseñarnos más sobre el comportamiento del fármaco en la sangre. Por lo tanto, decidimos determinar los puntos de tiempo similares a los 30 detectados por Baxter (0, 0,5, 2, 6, 8, 12, 24, 34, 48, 72 horas). Además, la concentración de FVIIa en el experimento 05010 fue demasiado alta, y se revisó en el siguiente experimento SC (05034). Para futuros estudios PK, decidimos inyectar el componente a 360 µg de FVIIa/kg para una dosis.
En conjunto, podemos aprender más sobre nuestro producto MOD-5014 después de una administración SC para 35 determinar el clon y lote de más calidad y decidir el mejor método para la cantidad de inyecciones de MOD-5014- por la concentración de FVIIa o por las unidades de actividad.
Aunque algunas características de la invención se han ilustrado y descrito en la presente, los expertos en la técnica podrán realizar muchas modificaciones, sustituciones, cambios, y equivalentes. 5
Listado de secuencias
lt;110gt; PROLOR BIOTECH INC. FIMA, UDI EYAL HART, GILI 10
lt;120gt; FACTORES DE COAGULACIÓN DE ACCIÓN PROLONGADA Y MÉTODOS PARA PRODUCIR LOS MISMOS
lt;130gt; P-9520-PC5
15
lt;150gt; 13/372,540 lt;151gt; 2012-02-14
lt;160gt; 45
20
lt;170gt; PatentIn versión 3.5
lt;210gt; 1 lt;211gt; 32 lt;212gt; PRT 25 lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 1
30
lt;210gt; 2 lt;211gt; 28 lt;212gt; PRT lt;213gt; Homo sapiens 35
lt;400gt; 2
40
lt;210gt; 3 lt;211gt; 12 lt;212gt; PRT lt;213gt; Homo sapiens
45
lt;400gt; 3
lt;210gt; 4 50 lt;211gt; 28 lt;212gt; PRT lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 4 55
lt;210gt; 5 lt;211gt; 25 5 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Cebador de PCR para el factor VII 10
lt;400gt; 5 ctcgaggaca tggtctccca ggccc 25
lt;210gt; 6 15 lt;211gt; 24 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; 20 lt;223gt; Cebador de PCR para el factor VII
lt;400gt; 6 tctagaatag gtatttttcc acat 24
25
lt;210gt; 7 lt;211gt; 22 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
30
lt;220gt; lt;223gt; Cebador de PCR para el factor VII
lt;400gt; 7 tctagaaaaa agaaatgcca gc 22 35
lt;210gt; 8 lt;211gt; 32 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 40
lt;220gt; lt;223gt; Cebador de PCR para el factor VII
lt;400gt; 8 45 gcggccgcat cctcagggaa atggggctcg ca 32
lt;210gt; 9 lt;211gt; 444 lt;212gt; PRT 50 lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 9
lt;210gt; 10 lt;211gt; 448 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 10
10
lt;210gt; 11 lt;211gt; 1356 lt;212gt; ADN lt;213gt; Homo sapiens 5
lt;400gt; 11
lt;210gt; 12 lt;211gt; 1442 5 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP 10
lt;400gt; 12
lt;210gt; 13 lt;211gt; 472 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
10
lt;400gt; 13
lt;210gt; 14 lt;211gt; 1535 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 5
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
lt;400gt; 14 10
lt;210gt; 15 lt;211gt; 500 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
10
lt;400gt; 15
lt;210gt; 16 lt;211gt; 1404 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 16
10
lt;210gt; 17 lt;211gt; 461 5 lt;212gt; PRT lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 17
10
lt;210gt; 18 lt;211gt; 1502 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP
10
lt;400gt; 18
lt;210gt; 19 lt;211gt; 489 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP
10
lt;400gt; 19
lt;210gt; 20 lt;211gt; 1585 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 5
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP
lt;400gt; 20 10
lt;210gt; 21 lt;211gt; 517 5 lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP 10
lt;400gt; 21
15
lt;210gt; 22 lt;211gt; 2413 lt;212gt; ADN lt;213gt; Homo sapiens 5
lt;400gt; 22
lt;210gt; 23 lt;211gt; 794 5 lt;212gt; PRT lt;213gt; Homo sapiens
lt;400gt; 23
10
lt;210gt; 24 lt;211gt; 1621 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
10
lt;400gt; 24
lt;210gt; 25 lt;211gt; 528 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
10
lt;400gt; 25
lt;210gt; 26 lt;211gt; 1607 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 5
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
lt;400gt; 26 10
lt;210gt; 27 lt;211gt; 532 lt;212gt; PRT 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
10
lt;400gt; 27
lt;210gt; 28 lt;211gt; 1775 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP
10
lt;400gt; 28
lt;210gt; 29 lt;211gt; 589 5 lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor VII modificado con CTP 10
lt;400gt; 29
15
lt;210gt; 30 lt;211gt; 1673 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 5
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP
lt;400gt; 30 10
lt;210gt; 31 lt;211gt; 545 5 lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP 10
lt;400gt; 31
lt;210gt; 32 lt;211gt; 1757 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP
10
lt;400gt; 32
lt;210gt; 33 lt;211gt; 583 5 lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP 10
lt;400gt; 33
15
lt;210gt; 34 lt;211gt; 1840 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP
10
lt;400gt; 34
lt;210gt; 35 5 lt;211gt; 610 lt;212gt; PRT lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Factor IX modificado con CTP
lt;400gt; 35
5
lt;210gt; 36 lt;211gt; 20 lt;212gt; ADN 5 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 101 para FIX-(CTP)2
10
lt;400gt; 36 gtttagtgaa ccgtcagaat 20
lt;210gt; 37 lt;211gt; 20 15 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 103-R para FIX-(CTP)2 20
lt;400gt; 37 ttgaggaaga tgttcgtgta 20
lt;210gt; 38 25 lt;211gt; 20 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 98 para FIX-(CTP)2
lt;400gt; 38 attacagttg tcgcaggtga 20 5
lt;210gt; 39 lt;211gt; 30 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 10
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 99-R para FIX-(CTP)2
lt;400gt; 39 15 gctggagcta gtgagctttg ttttttcctt 30
lt;210gt; 40 lt;211gt; 25 lt;212gt; ADN 20 lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 100 para FIX-(CTP)2
25
lt;400gt; 40 gctcactagc tccagcagca aggcc 25
lt;210gt; 41 lt;211gt; 23 30 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 27-R para FIX-(CTP)2 35
lt;400gt; 41 ttttcactgc attctagttg tgg 23
lt;210gt; 42 40 lt;211gt; 20 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
lt;220gt; 45 lt;223gt; Cebador 75
lt;400gt; 42 ctcccagttc aattacagct 20
50
lt;210gt; 43 lt;211gt; 27 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial
55
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 122r
lt;400gt; 43 ggaaaaactg cctcagcacg ggtgagc 27 60
lt;210gt; 44 lt;211gt; 32 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 65
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 123
lt;400gt; 44 gtgctgaggc agtttttcct gatgtggact at 32 5
lt;210gt; 45 lt;211gt; 18 lt;212gt; ADN lt;213gt; Secuencia artificial 10
lt;220gt; lt;223gt; Cebador 124r
lt;400gt; 45 15 caacacagtg ggcagcag 18
20
Claims (19)
- REIVINDICACIONES
- 1. Un factor de coagulación modificado con péptido del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) que consiste en un factor de coagulación y tres CTP unidos al carboxilo terminal de dicho factor de coagulación, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es: 5un polipéptido del factor IX (FIX) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o de los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31;un polipéptido del factor VII (FVII) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25; oun factor VIIa activado (FVIIa) modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los 10 aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25.
- 2. El factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con la reivindicación 1, en donde al menos un CTP está glicosilado.15
- 3. El factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FIX modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 31 o de los aminoácidos 47-545 de la sec. con núm. de ident.: 31.20
- 4. El factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en donde dicho factor de coagulación modificado con CTP es un polipéptido del FVII modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de la sec. con núm. de ident.: 25 o de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25, o en donde el factor de coagulación modificado con CTP es un FVIIa modificado con CTP que consiste en la secuencia de aminoácidos de los aminoácidos 39-528 de la sec. con núm. de ident.: 25. 25
- 5. Un polinucleótido que codifica el factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4.
- 6. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la secuencia de ácido nucleico de dicho 30 polinucleótido es como se expone en la sec. con núm. de ident.: 30.
- 7. El polinucleótido de acuerdo con la reivindicación 5, en donde la secuencia de ácido nucleico de dicho polinucleótido es como se expone en la sec. con núm. de ident.: 24.35
- 8. Una composición farmacéutica que comprende un factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, o un polinucleótido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 5 a la 7, y un portador farmacéuticamente aceptable.
- 9. Un factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, o 40 una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, para usar como un medicamento.
- 10. Un factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, o una composición farmacéutica de acuerdo con la reivindicación 8, para usar en la prevención o el tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre o de formación de coágulos en un sujeto. 45
- 11. El factor de coagulación modificado con CTP o la composición farmacéutica para usar de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el trastorno de coagulación de la sangre o de formación de coágulos es hemofilia.
- 12. El factor de coagulación modificado con CTP o la composición farmacéutica para usar en la prevención o el 50 tratamiento de un trastorno de coagulación de la sangre o de formación de coágulos en un sujeto de acuerdo con la reivindicación 10 u 11 mediante administración subcutánea.
- 13. El factor de coagulación modificado con CTP o la composición farmacéutica para usar de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 10 a la 12, en donde el sujeto es un niño. 55
- 14. Un método para prolongar el tiempo de vida media biológica de un factor de coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa, para producir así 60 un factor de coagulación modificado con CTP como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, en donde el factor de coagulación tiene un tiempo de vida media biológica prolongado.
- 15. Un método para mejorar el área bajo la curva (AUC) de un factor de coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de 65 un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa, para producir así un factor de coagulación modificado con CTP como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, en donde el factor de coagulación tiene un área bajo la curva (AUC) mejorada.5
- 16. Un método para reducir la frecuencia de dosificación de un factor de coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa, para producir así un factor de coagulación modificado con CTP como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, en donde el 10 factor de coagulación tiene una reducción de la frecuencia de dosificación.
- 17. Un método para reducir la velocidad de aclaramiento de un factor de coagulación, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina 15 coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o FVIIa, para producir así un factor de coagulación modificado con CTP como se definió en cualquiera de las reivindicaciones 1 a la 4, en donde el factor de coagulación tiene una velocidad de aclaramiento reducida.
- 18. Un método para producir el factor de coagulación modificado con CTP de acuerdo con cualquiera de las 20 reivindicaciones 1 a la 4, el método comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FIX, o que comprende la etapa de unir tres péptidos del carboxilo terminal de la gonadotropina coriónica (CTP) al carboxilo terminal de un polipéptido del FVII o del FVIIa, para producir así el factor de coagulación modificado con CTP.25
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201213372540 | 2012-02-14 | ||
US13/372,540 US8759292B2 (en) | 2006-02-03 | 2012-02-14 | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
PCT/IL2013/050107 WO2013121416A1 (en) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2665319T3 true ES2665319T3 (es) | 2018-04-25 |
Family
ID=48983616
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES13749077.7T Active ES2665319T3 (es) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para producir los mismos |
ES18150731T Active ES2855133T3 (es) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | Factores de coagulación de acción prolongada y usos de los mismos |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES18150731T Active ES2855133T3 (es) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | Factores de coagulación de acción prolongada y usos de los mismos |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
EP (3) | EP3791890A1 (es) |
JP (2) | JP6242819B2 (es) |
KR (3) | KR102310704B1 (es) |
CN (2) | CN104427994A (es) |
AU (3) | AU2013219935B2 (es) |
BR (1) | BR122021004014B1 (es) |
CA (1) | CA2870621C (es) |
CL (2) | CL2014002183A1 (es) |
CO (1) | CO7131365A2 (es) |
DK (2) | DK3326642T3 (es) |
EA (2) | EA028578B1 (es) |
ES (2) | ES2665319T3 (es) |
HK (1) | HK1205460A1 (es) |
HU (1) | HUE053068T2 (es) |
IL (2) | IL264959B (es) |
MX (3) | MX362446B (es) |
MY (1) | MY172539A (es) |
NO (1) | NO2920022T3 (es) |
PE (1) | PE20142290A1 (es) |
PL (1) | PL3326642T3 (es) |
SG (1) | SG11201404836QA (es) |
WO (1) | WO2013121416A1 (es) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
CA2870621C (en) | 2012-02-14 | 2022-08-09 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
EP4212546A1 (en) | 2014-12-10 | 2023-07-19 | OPKO Biologics Ltd. | Methods of producing long acting ctp-modified polypeptides |
JP7096668B2 (ja) * | 2015-06-19 | 2022-07-06 | オプコ バイオロジクス リミテッド | 長時間作用型凝固因子およびその製造方法 |
WO2017024060A1 (en) | 2015-08-03 | 2017-02-09 | Biogen Ma Inc. | Factor ix fusion proteins and methods of making and using same |
WO2018011799A1 (en) | 2016-07-11 | 2018-01-18 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factor vii and methods of producing same |
CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
CN107759697B (zh) | 2016-08-19 | 2023-03-24 | 安源医药科技(上海)有限公司 | 制备融合蛋白的方法 |
US11123438B2 (en) | 2016-08-19 | 2021-09-21 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Linker peptide for constructing fusion protein |
WO2018163586A1 (ja) | 2017-03-08 | 2018-09-13 | テイ・エス テック株式会社 | 乗物用シート |
US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
Family Cites Families (39)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
US4879219A (en) | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
US5011771A (en) | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
DE3421468A1 (de) | 1984-06-08 | 1985-12-19 | Dr. Rentschler Arzneimittel Gmbh & Co, 7958 Laupheim | Lipidnanopellets als traegersystem fuer arzneimittel zur peroralen anwendung |
US4666828A (en) | 1984-08-15 | 1987-05-19 | The General Hospital Corporation | Test for Huntington's disease |
US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US4801531A (en) | 1985-04-17 | 1989-01-31 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis |
EP0264166B1 (en) | 1986-04-09 | 1996-08-21 | Genzyme Corporation | Transgenic animals secreting desired proteins into milk |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
AU648020B2 (en) | 1989-02-21 | 1994-04-14 | Washington University | Modified forms of reproductive hormones |
US6225449B1 (en) | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
US5792460A (en) * | 1989-02-21 | 1998-08-11 | Washington University | Modified glycoprotein hormones having a CTP at the amino terminus |
US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
US5192659A (en) | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
US5281521A (en) | 1992-07-20 | 1994-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified avidin-biotin technique |
US5541110A (en) | 1994-05-17 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb | Cloning and expression of a gene encoding bryodin 1 from Bryonia dioica |
US7795210B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
CN1245510C (zh) * | 2003-09-25 | 2006-03-15 | 复旦大学 | 长效重组组织因子途径抑制物及其制备方法 |
US7553941B2 (en) * | 2006-02-03 | 2009-06-30 | Modigene Inc | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
US8048849B2 (en) * | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Modigene, Inc. | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
US8759292B2 (en) * | 2006-02-03 | 2014-06-24 | Prolor Biotech, Llc | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
US8476234B2 (en) * | 2006-02-03 | 2013-07-02 | Prolor Biotech Inc. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
TWI465247B (zh) * | 2008-04-11 | 2014-12-21 | Catalyst Biosciences Inc | 經修飾的因子vii多肽和其用途 |
WO2010015668A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-02-11 | Novo Nordisk A/S | Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy |
CA2870621C (en) * | 2012-02-14 | 2022-08-09 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
AU2013349239B2 (en) * | 2012-11-20 | 2018-04-12 | Opko Biologics Ltd. | Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides |
-
2013
- 2013-02-05 CA CA2870621A patent/CA2870621C/en active Active
- 2013-02-05 ES ES13749077.7T patent/ES2665319T3/es active Active
- 2013-02-05 SG SG11201404836QA patent/SG11201404836QA/en unknown
- 2013-02-05 CN CN201380019660.8A patent/CN104427994A/zh active Pending
- 2013-02-05 BR BR122021004014-1A patent/BR122021004014B1/pt active IP Right Grant
- 2013-02-05 MX MX2014009910A patent/MX362446B/es active IP Right Grant
- 2013-02-05 ES ES18150731T patent/ES2855133T3/es active Active
- 2013-02-05 KR KR1020207015367A patent/KR102310704B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-05 PE PE2014001261A patent/PE20142290A1/es active IP Right Grant
- 2013-02-05 HU HUE18150731A patent/HUE053068T2/hu unknown
- 2013-02-05 EA EA201491519A patent/EA028578B1/ru unknown
- 2013-02-05 EA EA201790960A patent/EA201790960A3/ru unknown
- 2013-02-05 KR KR1020217031683A patent/KR102630953B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-05 DK DK18150731.0T patent/DK3326642T3/da active
- 2013-02-05 EP EP20204439.2A patent/EP3791890A1/en active Pending
- 2013-02-05 DK DK13749077.7T patent/DK2822576T3/en active
- 2013-02-05 EP EP18150731.0A patent/EP3326642B1/en active Active
- 2013-02-05 JP JP2014557168A patent/JP6242819B2/ja active Active
- 2013-02-05 KR KR1020147025500A patent/KR102118729B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-05 EP EP13749077.7A patent/EP2822576B1/en active Active
- 2013-02-05 CN CN201811365443.5A patent/CN109535245A/zh active Pending
- 2013-02-05 PL PL18150731T patent/PL3326642T3/pl unknown
- 2013-02-05 MY MYPI2014002356A patent/MY172539A/en unknown
- 2013-02-05 AU AU2013219935A patent/AU2013219935B2/en active Active
- 2013-02-05 WO PCT/IL2013/050107 patent/WO2013121416A1/en active Application Filing
- 2013-11-13 NO NO13855153A patent/NO2920022T3/no unknown
-
2014
- 2014-08-14 CL CL2014002183A patent/CL2014002183A1/es unknown
- 2014-08-14 CO CO14178314A patent/CO7131365A2/es unknown
- 2014-08-14 MX MX2019000708A patent/MX2019000708A/es unknown
- 2014-08-14 MX MX2022008807A patent/MX2022008807A/es unknown
-
2015
- 2015-06-25 HK HK15106044.6A patent/HK1205460A1/xx unknown
-
2016
- 2016-05-03 AU AU2016202829A patent/AU2016202829B2/en active Active
-
2017
- 2017-08-24 AU AU2017219044A patent/AU2017219044B2/en active Active
- 2017-09-04 CL CL2017002233A patent/CL2017002233A1/es unknown
- 2017-11-08 JP JP2017215861A patent/JP6510002B2/ja active Active
-
2019
- 2019-02-21 IL IL264959A patent/IL264959B/en unknown
-
2021
- 2021-04-07 IL IL282121A patent/IL282121B/en unknown
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2665319T3 (es) | Factores de coagulación de acción prolongada y métodos para producir los mismos | |
US10144921B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
JP6430592B2 (ja) | 長期作用性凝固因子およびそれを製造する方法 | |
US8759292B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
US11066658B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
US10538755B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
US20220170005A1 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
BR112014020198B1 (pt) | Fator de coagulação modificado por peptídeos carbóxiterminais da gonadotrofina coriônica (ctp) e seu uso, método para produzir e extender a meia-vida do referido fator de coagulação, polinucleotídeo e composição farmacêutica |