CN109535245A - 长效凝血因子和生产它们的方法 - Google Patents
长效凝血因子和生产它们的方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN109535245A CN109535245A CN201811365443.5A CN201811365443A CN109535245A CN 109535245 A CN109535245 A CN 109535245A CN 201811365443 A CN201811365443 A CN 201811365443A CN 109535245 A CN109535245 A CN 109535245A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ctp
- another embodiment
- coagulation factor
- polypeptide
- fix
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 title claims abstract description 601
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 title claims abstract description 597
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 title claims abstract description 597
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 10
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 claims abstract description 661
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 claims abstract description 661
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 claims abstract description 644
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 459
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 419
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 417
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 179
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims abstract description 97
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims abstract description 51
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims abstract description 51
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims abstract description 51
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 44
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 154
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 154
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 110
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 96
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 claims description 84
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 claims description 47
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 47
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 47
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims description 47
- 208000009292 Hemophilia A Diseases 0.000 claims description 45
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 45
- 208000031220 Hemophilia Diseases 0.000 claims description 42
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 33
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 30
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 claims description 29
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 29
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 claims description 28
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 28
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 21
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 19
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 18
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 17
- 108010023321 Factor VII Proteins 0.000 claims description 15
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 15
- 102100023804 Coagulation factor VII Human genes 0.000 claims description 13
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 12
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 10
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 7
- 230000008859 change Effects 0.000 claims description 7
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 claims description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 6
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 claims description 5
- 201000000839 Vitamin K Deficiency Bleeding Diseases 0.000 claims description 3
- 206010047634 Vitamin K deficiency Diseases 0.000 claims description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 3
- 208000016794 vitamin K deficiency hemorrhagic disease Diseases 0.000 claims description 3
- DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N (2s)-4-hydroxy-2-(propylamino)butanoic acid Chemical compound CCCN[C@H](C(O)=O)CCO DWNBOPVKNPVNQG-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 2
- 125000003147 glycosyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007711 solidification Methods 0.000 claims 1
- 230000008023 solidification Effects 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 44
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 42
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 40
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 39
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 34
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 34
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 32
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 29
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 29
- 208000034158 bleeding Diseases 0.000 description 27
- 231100000319 bleeding Toxicity 0.000 description 27
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 27
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 26
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 26
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 23
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 22
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 20
- 229940012414 factor viia Drugs 0.000 description 20
- 108010054265 Factor VIIa Proteins 0.000 description 19
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 19
- 239000000047 product Substances 0.000 description 19
- 108010014172 Factor V Proteins 0.000 description 17
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 16
- 108090001126 Furin Proteins 0.000 description 15
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 15
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 15
- 102000004961 Furin Human genes 0.000 description 14
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 14
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 14
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 13
- 108010014173 Factor X Proteins 0.000 description 12
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 208000009429 hemophilia B Diseases 0.000 description 12
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 12
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 11
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 11
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 11
- 229940012413 factor vii Drugs 0.000 description 11
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 11
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 10
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 10
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 10
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 10
- -1 aromatic amino acids Chemical class 0.000 description 9
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 9
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 9
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 9
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 9
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 9
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 9
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 9
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 9
- MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N Menadione Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(C)=CC(=O)C2=C1 MJVAVZPDRWSRRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 208000015294 blood coagulation disease Diseases 0.000 description 8
- 229940019700 blood coagulation factors Drugs 0.000 description 8
- 229960000182 blood factors Drugs 0.000 description 8
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 8
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 8
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 8
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 8
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 8
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000001994 activation Methods 0.000 description 7
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 7
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 7
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 7
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 108010094028 Prothrombin Proteins 0.000 description 6
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 6
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 6
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 6
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 6
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 6
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 6
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 6
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 229940046010 vitamin k Drugs 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 5
- 206010053567 Coagulopathies Diseases 0.000 description 5
- 108010074864 Factor XI Proteins 0.000 description 5
- 102000009123 Fibrin Human genes 0.000 description 5
- 108010073385 Fibrin Proteins 0.000 description 5
- BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N Fibrin monomer Chemical compound CNC(=O)CNC(=O)CN BWGVNKXGVNDBDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 description 5
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 5
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 5
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 5
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 5
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 5
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 5
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 5
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 5
- 239000007910 chewable tablet Substances 0.000 description 5
- 229940068682 chewable tablet Drugs 0.000 description 5
- 229960004407 chorionic gonadotrophin Drugs 0.000 description 5
- 230000009852 coagulant defect Effects 0.000 description 5
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 229950003499 fibrin Drugs 0.000 description 5
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 210000004209 hair Anatomy 0.000 description 5
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 5
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 5
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 5
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol Chemical compound NCC(O)=O.OCC(N)(CO)CO AXAVXPMQTGXXJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102100030563 Coagulation factor XI Human genes 0.000 description 4
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 4
- 206010010356 Congenital anomaly Diseases 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010074860 Factor Xa Proteins 0.000 description 4
- 101000911390 Homo sapiens Coagulation factor VIII Proteins 0.000 description 4
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 230000021523 carboxylation Effects 0.000 description 4
- 238000006473 carboxylation reaction Methods 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical group [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 4
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000013632 homeostatic process Effects 0.000 description 4
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 4
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 4
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 4
- 235000010603 pastilles Nutrition 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 4
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 4
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 235000012711 vitamin K3 Nutrition 0.000 description 4
- 239000011652 vitamin K3 Substances 0.000 description 4
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-anilino-5-sulfonaphthalen-1-yl)diazenyl]-5-hydroxynaphthalene-2,7-disulfonic acid Chemical compound C=12C(O)=CC(S(O)(=O)=O)=CC2=CC(S(O)(=O)=O)=CC=1N=NC(C1=CC=CC(=C11)S(O)(=O)=O)=CC=C1NC1=CC=CC=C1 QFVHZQCOUORWEI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 3
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 description 3
- 102100026735 Coagulation factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 3
- 101100481876 Danio rerio pbk gene Proteins 0.000 description 3
- 238000008157 ELISA kit Methods 0.000 description 3
- 108010062466 Enzyme Precursors Proteins 0.000 description 3
- 102000010911 Enzyme Precursors Human genes 0.000 description 3
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 3
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000003542 Factor VIII deficiency Diseases 0.000 description 3
- 108010071241 Factor XIIa Proteins 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 3
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 3
- 101100481878 Mus musculus Pbk gene Proteins 0.000 description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 3
- 102000002508 Peptide Elongation Factors Human genes 0.000 description 3
- 108010068204 Peptide Elongation Factors Proteins 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 3
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 3
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 230000017531 blood circulation Effects 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 3
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 3
- 229940063834 carboxymethylcellulose sodium Drugs 0.000 description 3
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 3
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 3
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000005034 decoration Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 3
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 3
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 3
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 3
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N gamma-carboxy-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(C(O)=O)C(O)=O UHBYWPGGCSDKFX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 3
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 3
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 230000008676 import Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 3
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 3
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 3
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 3
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 3
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 3
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 3
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 3
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 3
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 3
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 108010047303 von Willebrand Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100036537 von Willebrand factor Human genes 0.000 description 3
- 229960001134 von willebrand factor Drugs 0.000 description 3
- OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 2-aminoadipic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CCCC(O)=O OYIFNHCXNCRBQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100027211 Albumin Human genes 0.000 description 2
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Natural products OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010008111 Cerebral haemorrhage Diseases 0.000 description 2
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 2
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 2
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 2
- 108010071289 Factor XIII Proteins 0.000 description 2
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108090000113 Plasma Kallikrein Proteins 0.000 description 2
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100027378 Prothrombin Human genes 0.000 description 2
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 2
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 2
- 241000218636 Thuja Species 0.000 description 2
- 229930003448 Vitamin K Natural products 0.000 description 2
- 208000027276 Von Willebrand disease Diseases 0.000 description 2
- 208000013633 acquired hemophilia Diseases 0.000 description 2
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 2
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 2
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 2
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 2
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 2
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000001045 blue dye Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920003123 carboxymethyl cellulose sodium Polymers 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001136 chorion Anatomy 0.000 description 2
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N diethyl phthalate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N dioxosilane;oxomagnesium;hydrate Chemical compound O.[Mg]=O.[Mg]=O.[Mg]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O.O=[Si]=O FPAFDBFIGPHWGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 description 2
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 2
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 229940012444 factor xiii Drugs 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 230000010005 growth-factor like effect Effects 0.000 description 2
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 2
- TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N l-ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(O)=C(O)C1=O TYQCGQRIZGCHNB-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 230000005923 long-lasting effect Effects 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 238000002715 modification method Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 238000003032 molecular docking Methods 0.000 description 2
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 2
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 2
- 239000000816 peptidomimetic Substances 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N phylloquinone Natural products CC(C)CCCCC(C)CCC(C)CCCC(=CCC1=C(C)C(=O)c2ccccc2C1=O)C SHUZOJHMOBOZST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 2
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 229940039716 prothrombin Drugs 0.000 description 2
- 210000000664 rectum Anatomy 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 2
- 239000004576 sand Substances 0.000 description 2
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 2
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 2
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 2
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 2
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 2
- RUVINXPYWBROJD-ONEGZZNKSA-N trans-anethole Chemical compound COC1=CC=C(\C=C\C)C=C1 RUVINXPYWBROJD-ONEGZZNKSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000019168 vitamin K Nutrition 0.000 description 2
- 239000011712 vitamin K Substances 0.000 description 2
- 150000003721 vitamin K derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 2
- 208000012137 von Willebrand disease (hereditary or acquired) Diseases 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 1
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- OVBICQMTCPFEBS-SATRDZAXSA-N (2s)-1-[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-acetamido-3-naphthalen-2-ylpropanoyl]amino]-3-(4-chlorophenyl)propanoyl]amino]-3-pyridin-3-ylpropanoyl]amino]-3-hydroxypropanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-6-[bi Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.C([C@@H](C(=O)N[C@H](CCCCN=C(NCC)NCC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN=C(NCC)NCC)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@H](C)C(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](CC=1C=NC=CC=1)NC(=O)[C@@H](CC=1C=CC(Cl)=CC=1)NC(=O)[C@@H](CC=1C=C2C=CC=CC2=CC=1)NC(C)=O)C1=CC=C(O)C=C1 OVBICQMTCPFEBS-SATRDZAXSA-N 0.000 description 1
- IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N (2s)-2-(naphthalen-1-ylamino)propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(N[C@@H](C)C(O)=O)=CC=CC2=C1 IYKLZBIWFXPUCS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydroxypropan-2-yl formate Chemical compound OCC(CO)OC=O LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2,1-benzoxaborole Chemical compound C1=CC=C2B(O)OCC2=C1 XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 3-bromoimidazo[1,2-a]pyridine-6-carbonitrile Chemical compound C1=CC(C#N)=CN2C(Br)=CN=C21 UOQHWNPVNXSDDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 4-hydroxybenzoate Chemical compound OC1=CC=C(C([O-])=O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000032484 Accidental exposure to product Diseases 0.000 description 1
- 101100230376 Acetivibrio thermocellus (strain ATCC 27405 / DSM 1237 / JCM 9322 / NBRC 103400 / NCIMB 10682 / NRRL B-4536 / VPI 7372) celI gene Proteins 0.000 description 1
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000036487 Arthropathies Diseases 0.000 description 1
- 208000037157 Azotemia Diseases 0.000 description 1
- 208000004860 Blast Crisis Diseases 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408682 Caenorhabditis elegans pmt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 1
- 241000282994 Cervidae Species 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 101710094648 Coat protein Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100024746 Dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical group OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 108010080805 Factor XIa Proteins 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 102100035233 Furin Human genes 0.000 description 1
- 102100040890 Glucagon receptor Human genes 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102100021181 Golgi phosphoprotein 3 Human genes 0.000 description 1
- 206010018833 Haematocoele Diseases 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- 208000005873 Hematocele Diseases 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101001040075 Homo sapiens Glucagon receptor Proteins 0.000 description 1
- 101000659413 Homo sapiens Tricarboxylate transport protein, mitochondrial Proteins 0.000 description 1
- LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N Hydroxylysine Natural products NCC(O)CC(N)CC(O)=O LCWXJXMHJVIJFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N Hydroxyproline Chemical compound O[C@H]1CN[C@H](C(O)=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-DMTCNVIQSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 1
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 1
- 208000012659 Joint disease Diseases 0.000 description 1
- 108060005987 Kallikrein Proteins 0.000 description 1
- 102000001399 Kallikrein Human genes 0.000 description 1
- 108010025252 Kassinin Proteins 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N L-Ornithine Chemical compound NCCC[C@H](N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N L-alpha-phenylglycine zwitterion Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 1
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000856 Lyases Proteins 0.000 description 1
- 102000004317 Lyases Human genes 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- 206010061298 Mucosal haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004988 N-glycosylation Effects 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101710141454 Nucleoprotein Proteins 0.000 description 1
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N O-phosphoryl-L-serine Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N Orn-delta-NH2 Natural products NCCCC(N)C(O)=O AHLPHDHHMVZTML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N Ornithine Natural products OC(=O)C(C)CCCN UTJLXEIPEHZYQJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000004371 Panax ginseng Species 0.000 description 1
- 235000005035 Panax pseudoginseng ssp. pseudoginseng Nutrition 0.000 description 1
- 235000003140 Panax quinquefolius Nutrition 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 108010038988 Peptide Hormones Proteins 0.000 description 1
- 102000015731 Peptide Hormones Human genes 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 229920003110 Primojel Polymers 0.000 description 1
- 102100033237 Pro-epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101710083689 Probable capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 108010003581 Ribulose-bisphosphate carboxylase Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 206010051297 Soft tissue haemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 239000004902 Softening Agent Substances 0.000 description 1
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 1
- 102100026966 Thrombomodulin Human genes 0.000 description 1
- 108010079274 Thrombomodulin Proteins 0.000 description 1
- 208000007536 Thrombosis Diseases 0.000 description 1
- 229920001615 Tragacanth Polymers 0.000 description 1
- 108060008539 Transglutaminase Proteins 0.000 description 1
- DOOTYTYQINUNNV-UHFFFAOYSA-N Triethyl citrate Chemical compound CCOC(=O)CC(O)(C(=O)OCC)CC(=O)OCC DOOTYTYQINUNNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 235000010489 acacia gum Nutrition 0.000 description 1
- 239000001785 acacia senegal l. willd gum Substances 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002777 acetyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000011149 active material Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000006154 adenylylation Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 150000001336 alkenes Chemical class 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000006295 amino methylene group Chemical group [H]N(*)C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000003708 ampul Substances 0.000 description 1
- 229940011037 anethole Drugs 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000305 astragalus gummifer gum Substances 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 239000012752 auxiliary agent Substances 0.000 description 1
- 229940031422 benefix Drugs 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 1
- 238000002306 biochemical method Methods 0.000 description 1
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 1
- 208000015322 bone marrow disease Diseases 0.000 description 1
- 238000010322 bone marrow transplantation Methods 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 150000007516 brønsted-lowry acids Chemical class 0.000 description 1
- 150000007528 brønsted-lowry bases Chemical class 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 229940105329 carboxymethylcellulose Drugs 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 230000034303 cell budding Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004087 circulation Effects 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 210000000795 conjunctiva Anatomy 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 238000005260 corrosion Methods 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 229960000913 crospovidone Drugs 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N delta-DL-hydroxylysine Natural products NCC(O)CCC(N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 229950006137 dexfosfoserine Drugs 0.000 description 1
- 108020001096 dihydrofolate reductase Proteins 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 208000009190 disseminated intravascular coagulation Diseases 0.000 description 1
- PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N dl-hydroxyproline Natural products OC1C[NH2+]C(C([O-])=O)C1 PMMYEEVYMWASQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008298 dragée Substances 0.000 description 1
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 1
- 238000009510 drug design Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000004064 dysfunction Effects 0.000 description 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940095399 enema Drugs 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 208000001780 epistaxis Diseases 0.000 description 1
- YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N erythro-5-hydroxy-L-lysine Chemical compound NC[C@H](O)CC[C@H](N)C(O)=O YSMODUONRAFBET-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004667 ethyl cellulose Drugs 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 235000010944 ethyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001761 ethyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108700032141 ganirelix Proteins 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 235000008434 ginseng Nutrition 0.000 description 1
- 230000000762 glandular Effects 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000004920 hematocele of tunica vaginalis testis Diseases 0.000 description 1
- 230000023597 hemostasis Effects 0.000 description 1
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000833 heterodimer Substances 0.000 description 1
- 125000000487 histidyl group Chemical group [H]N([H])C(C(=O)O*)C([H])([H])C1=C([H])N([H])C([H])=N1 0.000 description 1
- 230000002962 histologic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 102000057593 human F8 Human genes 0.000 description 1
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N hydroxy-L-lysine Natural products NCCCCC(NO)C(O)=O QJHBJHUKURJDLG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002591 hydroxyproline Drugs 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 239000007972 injectable composition Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 1
- 208000020658 intracerebral hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N iron(III) oxide Inorganic materials O=[Fe]O[Fe]=O JEIPFZHSYJVQDO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 108010084553 jacalin Proteins 0.000 description 1
- 229940099563 lactobionic acid Drugs 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 210000002751 lymph Anatomy 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 1
- 238000007726 management method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- 125000001434 methanylylidene group Chemical group [H]C#[*] 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 1
- 230000000116 mitigating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 230000002969 morbid Effects 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002077 nanosphere Substances 0.000 description 1
- 239000006225 natural substrate Substances 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000008012 organic excipient Substances 0.000 description 1
- 229960003104 ornithine Drugs 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- RUVINXPYWBROJD-UHFFFAOYSA-N para-methoxyphenyl Natural products COC1=CC=C(C=CC)C=C1 RUVINXPYWBROJD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000016236 parenteral nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 239000000813 peptide hormone Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N phenyl(114C)methanol Chemical compound O[14CH2]C1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-ZQBYOMGUSA-N 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008055 phosphate buffer solution Substances 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 229960004838 phosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N phosphoserine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)COP(O)(O)=O BZQFBWGGLXLEPQ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 1
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 1
- WSHYKIAQCMIPTB-UHFFFAOYSA-M potassium;2-oxo-3-(3-oxo-1-phenylbutyl)chromen-4-olate Chemical compound [K+].[O-]C=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 WSHYKIAQCMIPTB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940116317 potato starch Drugs 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 229940126532 prescription medicine Drugs 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002947 procoagulating effect Effects 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N pyrrolidin-2-one Chemical compound O=C1CCCN1 HNJBEVLQSNELDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 108010013773 recombinant FVIIa Proteins 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229940047431 recombinate Drugs 0.000 description 1
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000003998 snake venom Substances 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 1
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 239000007939 sustained release tablet Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 150000003556 thioamides Chemical class 0.000 description 1
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 1
- 239000012929 tonicity agent Substances 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N trans-L-hydroxy-proline Natural products ON1CCCC1C(O)=O FGMPLJWBKKVCDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 102000003601 transglutaminase Human genes 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 1
- 230000000472 traumatic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000001069 triethyl citrate Substances 0.000 description 1
- VMYFZRTXGLUXMZ-UHFFFAOYSA-N triethyl citrate Natural products CCOC(=O)C(O)(C(=O)OCC)C(=O)OCC VMYFZRTXGLUXMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013769 triethyl citrate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001810 trypsinlike Effects 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 208000009852 uremia Diseases 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 1
- PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N warfarin Chemical compound OC=1C2=CC=CC=C2OC(=O)C=1C(CC(=O)C)C1=CC=CC=C1 PJVWKTKQMONHTI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005080 warfarin Drugs 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000000080 wetting agent Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P41/00—Drugs used in surgical methods, e.g. surgery adjuvants for preventing adhesion or for vitreum substitution
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
- A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/745—Blood coagulation or fibrinolysis factors
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/24—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g. HCG; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/43—Enzymes; Proenzymes; Derivatives thereof
- A61K38/46—Hydrolases (3)
- A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- A61K38/482—Serine endopeptidases (3.4.21)
- A61K38/4846—Factor VII (3.4.21.21); Factor IX (3.4.21.22); Factor Xa (3.4.21.6); Factor XI (3.4.21.27); Factor XII (3.4.21.38)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Hematology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Surgery (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Glass Compositions (AREA)
Abstract
本发明公开了多肽和编码它们的多核苷酸，所述多肽包含绒毛膜促性腺激素的至少一个羧基端肽(CTP)，所述羧基端肽连接至凝血因子的羧基端，但是没有连接至凝血因子的氨基端。还公开了包含本发明的多肽和多核苷酸的药物组合物以及使用和生产它们的方法。
Description
本申请是2014年10月13日提交的题为“长效凝血因子和生产它们的方法”的中国专利申请201380019660.8的分案申请。
技术领域
公开了包含与凝血因子的羧基端连接的绒毛膜促性腺激素的至少一个羧基端肽(CTP)的多肽和编码它们的多核苷酸。也公开包含本发明的多肽和多核苷酸的药物组合物以及使用和生产它们的方法。
背景技术
凝血因子补偿疗法的发展已经改变了许多具有血友病的个体的生活。血友病是一组损害身体的控制血液凝固或凝结的能力的遗传性基因障碍。具有血友病的患者不会产生足够量的有效血液凝固必需的因子VIII或因子IX蛋白。在严重的血友病患者中，即使微小损伤可以导致持续数天或数周的失血，并且可能不会发生完全愈合，从而导致对关节和其它器官的虚弱性永久损伤的可能性和过早死亡。
一类血友病(血友病B)是一种X-连接的由因子IX(FIX)基因中的突变所造成的出血障碍，从而导致FIX的促凝活性的缺乏。血友病B患者具有自发的软组织出血和反复的关节积血，经常导致摧毁性的关节病 (arthopathy)。这些患者的目前治疗方法包括静脉内施用重组FIX。但是， FIX的成本问题和从循环中相对快速清除的问题使得开发长效FIX成为一项挑战性的任务。
FVIII和FIX的商业可用性已经导致危及生命的出血发作的改善控制。许多患者接受预防性疗法，这会降低出血和它的有关并发症的风险。但是，高比例的患者(10-30％)会发展针对外源性施用的FVIII和FIX的抑制性抗体。FVIIa(它是一种旁路产物)的施用可以诱导体内稳态并提供对具有抑制性Ab的患者的有效治疗。
重组FVIIa是商购可得的，并且在1996年被批准用于治疗具有抑制剂的血友病患者中的出血发作。但是，rFVIIa以2.5小时的终末半衰期被快速地清除。所以，患者通常需要多次频繁输注(以2-3小时间隔施用2-3剂)以在轻度至中度出血后达到足够的体内稳态。结果，在开发长效形式的FVIIa中存在许多兴趣，所述长效形式的FVIIa会延长单次剂量以后止血活性的持续时间并允许频率低得多的给药。长效FVIIa也会增加长期预防性疗法的可行性。
正在开发用于延长FVIIa的半衰期的不同技术。但是，挑战是，实现该蛋白的延长的半衰期，同时保留它的生物活性并确保修饰不会诱导显著的免疫原性。
发明内容
在一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含CTP修饰的因子IX (FIX)多肽的药物组合物，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多肽由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽 (CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码CTP 修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种提高因子IX(FIX)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的AUC。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此降低所述FIX多肽的施用频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此降低所述FIX多肽的清除率。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP修饰的因子IX (FIX)多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此生产CTP修饰的FIX多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多肽包含FIX多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此治疗所述受试者中的血友病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种预防受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血因子包含连接至所述FVII多肽的羧基端的 3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防所述受试者中的血友病。
在另一个实施方案中，本发明涉及一种治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血因子包含连接至所述凝血因子的羧基端的 3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防所述受试者中的血友病。
从下述详细描述实施例和附图将明白本发明的其它特征和优点。但是，应当理解，所述详细描述和具体实施例尽管指出了本发明的优选实施方案，但是仅仅通过例证给出，因为本领域技术人员从该详细描述会明白在本发明的精神和范围内的各种变化和修改。
附图说明
图1A.显示的条形图显示了在有5μg/ml维生素K3存在下用FIX-CTP 和FIX-CTP-CTP变体有限稀释的、转染的和选择的细胞的收获物。使用人FIX ELISA试剂盒(AffinityBiologicals；目录号FIX-AG RUO)定量FIX 的水平，计算的蛋白质浓度(μg/ml)是两个独立运行的平均值。图1B显示了FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显微照片B描绘了在蛋白质印迹中抗-FIX抗体的识别；显微照片C描绘了在蛋白质印迹中抗-γ羧化抗体的识别。B-C中的泳道1加载了含有重组FIX的样品。B-C中的泳道 2加载了含有FIX-CTP收获物的样品。B-C中的泳道3加载了含有 FIX-(CTP)2收获物的样品。
图2.显示的图显示了与rhFIX(American Diagnostics)相比的FIX-CTP 和FIX-(CTP)2收获物对比产色活性(通过EC50.浓度测量)。
图3.显示的图显示了rhFIX、FIX-CTP-CTP的收获物、和FIX-CTP 收获物的PK谱。
图4.显示的条形图显示了使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号FIX-AG RUO)确定的FIX-CTP收获物和 FIX-CTP-CTP收获物和FIX-CTP-CTP纯化的蛋白FIX抗原水平。计算的蛋白浓度(μg/ml)是两个独立运行的平均值。
图5.显示了FIX Ab识别的SDS-PAGE凝胶显微照片。显微照片A描绘了考马斯蓝染色；显微照片B描绘了蛋白质印迹中抗-FIX抗体的识别；显微照片C描绘了蛋白质印迹中抗-γ羧化抗体的识别。A-C中的泳道1加载了含有FIX-(CTP)2的样品。A-C中的泳道2加载了含有未结合的 FIX-(CTP)2的样品。A-C中的泳道3加载了含有FIX-(CTP)2的浓缩洗脱液的样品。
图6.显示的图显示了与人正常合并血浆和rhFIX(American Diagnostics)相比的FIX-(CTP)2产色活性(样品浓度/O.D.)。
图7.显示的图显示了纯化的FIX-CTP-CTP、rhFIX、FIX-CTP-CTP 收获物和FIX-CTP收获物的PK谱。
图8.显示了与3、4或5个CTP融合的FIX的抗-CTP和抗-γ羧化抗体蛋白质印迹。使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3、 FIX-CTP4和FIX-CTP5收获物加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。使用抗-CTP 多克隆Ab(Adar Biotech Production)或抗-GlaAb(American Diagnostica) 通过蛋白免疫印迹进行SDS-PAGE分析。
图9.显示了FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的考马斯蓝检测。在利用Jacalin柱的纯化过程(糖基化蛋白的免疫亲和纯化)以后，使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3、FIX-CTP4和 FIX-CTP5加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。用考马斯蓝染料进行SDS-PAGE 染色用于样品检测。
图10.显示了FIX产色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒 BIOPHEN(Hyphen BioMed 221802)进行完全纯化的(HA柱)FIX-CTP3、 FIX-CTP4和FIX-CTP5相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将所有样品系列稀释，并通过将剂量响应曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。
图11.显示了FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的对比药代动力学 (PK)分布。使用人FIX Elisa试剂盒(Affinity Biologicals)定量血浆样品中的 FIX浓度。计算药代动力学分布，为每个时间点3只动物的平均值。使用 PK Solutions 2.0软件计算终末半衰期。
图12.显示了FIX-CTP3SDS-PAGE分析-考马斯SDS-PAGE。使用 Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3γ-羧化的富集的蛋白 rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。通过用考马斯蓝试剂(800ng蛋白)对凝胶染色，进行SDS-PAGE考马斯分析(图12A)。使用100ng蛋白用抗-人FIX多克隆Ab(图12B)、抗-人γ羧化单克隆抗体 (American Diagnostics目录号499,3570)(图12C)、抗-FIX前肽多克隆Ab (图12D)和抗-CTP多克隆Ab(图12E)进行蛋白免疫印迹。
图13:显示了FIX-CTP3产色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒BIOPHEN(Hyphen BioMed 221802)进行FIX-CTP3收获物和 FIX-CTP3γ-羧化的富集的蛋白相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将FIX-CTP3收获物和蛋白系列稀释，并通过将剂量响应曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。
图14:显示了对比凝固时间。进行了将FIX-CTP3的凝血活性与 BeneFIX进行对比的体外aPTT(活化的部分凝血酶时间测定)。将蛋白系列稀释，并掺入除去FIX的人血浆中，并评价凝固时间。
图15.显示了FIX-CTP3对比PK谱。使用人FIX ELISA试剂盒(AffinityBiologicals；目录号FIX-AG RUO)定量FIX浓度。计算每种蛋白的药代动力学分布，为每个时间点3只动物的平均值。
图16.显示了活性谱参数。与PK取样平行地，通过aPTT测定来评价施用了或FIX-CTP3的FIX-缺陷型动物的柠檬酸盐化的血浆样品的凝血活性，将其转换为活性百分比。将在每个收集点的活性百分比计算为当前凝固时间/正常血库小鼠血浆的凝固时间*100。
图17.显示了第一次攻击出血参数。给FIX-缺陷型小鼠施用100IU/Kg或rFIX-CTP3的单次静脉内注射。在给药后48小时稍微剪断尾静脉，并评价尾静脉出血时间(TVBT)和出血强度(血红蛋白OD)。在达到体内稳态以后15分钟进行第二次出血攻击，并测量相同的参数。
图18.显示了第二次攻击出血参数。在图19的说明中描述的第一次出血自发地或手工地停止以后，在第一次出血以后15分钟进行第二次出血攻击，并重新测量时间和出血强度。
图19.显示了的简图解释了rFVII-CTP构建体(A)、rFVII-CTP-CTP 构建体(B)、rFIX-CTP构建体(C)和rFIX-CTP-CTP构建体(D)。
图20A.显示的条形图显示了在有5μg/ml维生素K3存在下用 FVII-CTP变体有限稀释的、克隆转染的和选择的细胞的收获物。使用FVII ELISA(AssayPro)定量FVII水平。
图20B.显示的条形图显示了在有5μg维生素K3存在下用FVII-CTP 变体有限稀释的、转染的和选择的细胞的收获物.活性.使用FVII产色活性测定(AssayPro)定量FVII活性。
图20C.显示的条形图显示了在有5μg维生素K3存在下用FVII-CTP 变体有限稀释的、转染的和选择的细胞的收获物。通过将活性值除以收获物FVII浓度，为每种形式计算FVII的比活性。
图20D.显示的图显示了FVII、FVII-CTP-CTP和FVII-CTP收获物的 PK谱。
图21.显示了使用抗-FVII、抗-CTP和抗-γ羧化抗体检测的与3、4和 5个CTP融合的FVII的蛋白质印迹。使用Precision plus双色蛋白标志物 (Bio-Rad)将FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5收获物加载上12％Tris -甘氨酸凝胶(expedeon)。使用抗-FVII Ab、抗-CTP多克隆Ab(Adar Biotech Production)或抗-Gla Ab(American Diagnostica)通过蛋白免疫印迹进行 SDS-PAGE分析。
图22.显示了FVII活性-产色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)，进行HA纯化的(高度γ羧化的级分)FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5相对于正常人合并血浆的体外效能的对比评估。将所有样品系列稀释，并通过将剂量响应曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。
图23.显示了第一对比药代动力学(PK)分布-FVII 3、4和5个CTP。以250μg/kg体重的剂量将FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5(分别是组A、B和C)在单次静脉内注射中施用给Sprague Dawley大鼠(6只大鼠/ 治疗)。可替代地在给药后0.083、0.5、2、5、8、24、48、72和96小时从 3只大鼠在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆 (0.38％)，并在分析之前在-20℃储存。FVII-CTP5表现出与其它2种形式相比优越的特性。
图24.显示了第二对比PK谱-FVII 3、4和5个CTP。以29.45μg/kg 体重的剂量将FVII选择和HA纯化过程以后的FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5(分别是组A、B和C)在单次静脉内注射中施用给Sprague Dawley大鼠(每种物质3只大鼠)。在给药后0.083、0.5、2、8、24、48和 72小时在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆 (0.38％)，并在分析之前在-20℃储存。
图25.显示了FVII-CTP3纯化过程的示意图。生产了批次31用于 PK/PD研究。生产了批次38用于存活研究。
图26.显示了最终的FVII和FVIIa的SDS-PAGE和蛋白质印迹。将 10μg(批次31)或5μg(批次38)加载进考马斯染色的SDS-PAGE的每个泳道中。将1μg蛋白加载进蛋白质印迹的每个泳道中。1.FVII-CTP3多肽； 2.重链，包括3x CTP；3.轻链。所有3种抗体都检测FVII。α-CTP检测 FVIIa重链，α-FVII和α-Gla检测轻链。
图27.表明，由于在Ceramic Hydroxyapatite(HA)柱上的纯化，增强了FVII-CTP3产色活性。使用商购可得的产色活性试验试剂盒BIOPHEN (Hyphen BioMed 221304)，进行FVII-CTP3收获物、过程中级分和纯化的 FVII-CTP3相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将FVII-CTP3收获物和蛋白系列稀释，并通过将剂量响应曲线与正常人血浆的参考制剂进行对比来评估效能。
图28.显示了FVIII-缺陷型小鼠中FVIIa-CTP3相对于的 PK谱。在FVII选择、HA纯化过程和活化以后，生产FVIIa-CTP3。将 FVIIa-CTP3或在单次静脉内注射中施用给FVIII-/-血友病小鼠。在给药后0.083、0.5、2、8、24、48和72小时，在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.38％)，并在分析之前在-20℃储存，并使用STACLOT商业试剂盒基于FVIIa凝血活性来建立PK谱。
图29.表明，在FVII选择、HA纯化过程和活化以后生产FVIIa-CTP3。将FVIIa-CTP3或在单次静脉内注射中施用给FVIII-/-血友病小鼠。在给药后0.083、0.5、2、8、24、48和72小时在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.38％)，并在分析之前在-20℃储存。在PK实验过程中评价凝血酶产生参数，并评价包括达到峰值的最大量、达到时间点的凝血酶的量和凝血酶产生速率在内的参数。
图30.显示了尾静脉横断(TVT)以后的血友病小鼠存活曲线。在给药后 (A)15min、(B)24小时或(C)48小时进行TVT。在TVT以后观察小鼠存活24小时，并对于前12小时中的每个小时和24小时以后进行记录。图 30D总结了TVT后24小时记录的小鼠存活。对照组数据(媒介物)是使用5 只小鼠/实验的3个实验的总和。
图31.显示了FVII-3-CTP和FVII-5CTP免疫印迹：A)针对GLA 的印迹。B)针对FVIIa的印迹。C)针对CTP的印迹。
图32.显示了得自选择和HA柱纯化(FVIIS相对于FVII HA)的对比 PK谱(FVII 3个和5个CTP)。
图33.显示了第二个研究(静脉内相对于皮下)的对比PK谱(FVII 3个和5个CTP)。
图34.显示了尾静脉横断(TVT)以后的血友病小鼠存活曲线。在皮下施用后12小时进行TVT。在TVT以后观察小鼠存活24小时，并对于前12 小时中的每个小时和24小时以后进行记录。
图35.显示了静脉内或皮下施用以后MOD-5014相对于的PK谱。A)显示了静脉内施用；B)显示了皮下施用。
图36.显示了单次皮下施用以后MOD-5014(克隆61#75、#81)相对于的PK谱。
具体实施方式
在一个实施方案中，本发明提供了长效凝血因子以及生产和使用它们的方法。在另一个实施方案中，长效凝血因子包含羧基端肽(CTP，也被称作CTP单元)。在另一个实施方案中，包含凝血因子的长效多肽还包含人绒毛膜促性腺激素(hCG)的羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，CTP 充当对抗凝血因子降解的保护剂。在另一个实施方案中，CTP会延长凝血因子的Cmax。在另一个实施方案中，CTP会延长凝血因子的Tmax。在另一个实施方案中，CTP会延长凝血因子的循环半衰期。在某些实施方案中， CTP会增强凝血因子的效能。
在另一个实施方案中，本文提供了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此延长所述凝血因子的生物半衰期。在另一个实施方案中，本文提供了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将1-5个CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此延长所述凝血因子的生物半衰期。在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长凝血因子的循环半衰期的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种增加凝血因子的半衰期的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长凝血因子的半衰期的方法。
凝血因子VII(FVII)是作为无活性前酶由肝细胞分泌进血流中的444 个氨基酸的糖蛋白(50KDa)。在组织损害和暴露于循环血液以后，FVII会与组织因子(TF)形成复合物，所述组织因子是FVII的真实受体蛋白且由位于血管壁的深层中的不同细胞表达。该FVII-TF复合物的形成会导致 FVII的活化。活化的FVII(FVIIa)会通过活化因子IX和因子X启动外因性凝血途径。
FVII属于一群与凝血系统有关的维生素K依赖性的糖蛋白。除了FVII 以外，该群由因子IX、因子X、蛋白C和凝血酶原组成。这些蛋白具有类似的结构域组构，并且被合成为具有N-端前肽和随后的成熟氨基酸序列的前体。所述前肽含有γ羧化酶的停泊位点，所述γ羧化酶将谷氨酸(Glu) 转化成γ羧基谷氨酸(Gla)。该结构域后面是2个表皮生长因子样(EGF)结构域、连接区域(CR)和C-端丝氨酸蛋白酶结构域。在分泌之前，FVII前肽被切割从而形成406个氨基酸的单链酶原FVII糖蛋白。在分泌之后，所述蛋白可以通过在CR中的切割活化成二硫键连接的双链异源二聚体 FVIIa。FVII的血浆浓度是10nM，且大约1％在健康个体中以活性形式循环。
因子IX(FIX)是一种415个氨基酸(55KDa)的糖蛋白；它属于一群维生素K依赖性的与凝血系统有关的糖蛋白。FIX具有与因子FVII、因子X、蛋白C和凝血酶原(它们合成为具有N-端前肽和随后的成熟氨基酸序列的前体)类似的结构域组构。
FIX被分泌为经历复杂的转录后修饰的单链分子，其中的许多修饰对于它的生化和药代动力学性质而言是关键性的。在所有的转录后修饰中，在FIX的氨基端附近的12个谷氨酸残基(其被维生素K依赖性的γ羧化酶γ羧化)是最关键的残基。羧化是FIX与磷脂表面的相互作用和最佳 FIX活性所必需的。所述氨基端前肽充当γ羧化酶的识别位点，并因此在γ羧化之后由被称作成对的碱性氨基酸裂解酶(PACE/弗林蛋白酶)的高尔基体丝氨酸蛋白酶裂解除去。在高尔基体处可能发生四个额外的转录后修饰：酪氨酸155的硫酸化、丝氨酸158的磷酸化、Ser 63和61上的O-糖基化、以及最后在Asn 157和16上的N-糖基化，但是被证实不是FIX的适当活性所必需的。
FIX作为单链无活性酶原在血浆中循环(5μg/ml的平均浓度)。在一种或两种生理激活物FVIIa-TF复合物或FIXa在两个肽键Arg 145和Arg 180处发生蛋白水解性裂解以后，活化肽被除去，从而将FIX转化成由单个二硫键保持在一起的轻链和重链组成的完全活性的酶。所述N-端轻链含有非催化性的γ羧基谷氨酸(Gla)和两个表皮生长因子样结构域，而C-端重链含有该分子的胰蛋白酶样催化结构域。单独的FIXa的特征在于较差的催化活性。但是，当与FVIII形成复合物时，它对于它的天然底物FX的蛋白水解活性增加了4-5个数量级。
在另一个实施方案中，本文提供了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法或提高曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个 CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此延长所述凝血因子的生物半衰期或提高AUC。在另一个实施方案中，本文提供了一种延长凝血因子的生物半衰期的方法或提高曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将1-5个CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此延长所述凝血因子的生物半衰期或提高AUC。在另一个实施方案中，本文提供了一种延长FIX 的生物半衰期的方法或提高曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将1-5个CTP连接至FIX的羧基端，由此延长生物半衰期或提高 FIX的AUC。在另一个实施方案中，本文提供了一种延长FVII或FVIIa 的生物半衰期的方法或提高曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将1-5个CTP连接至FVII或FVIIa的羧基端，由此延长生物半衰期或提高FVII或FVIIa的AUC。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期。在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种延长因子VIIa (FVIIa)多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将至多5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此延长所述FVIIa多肽的生物半衰期。在一个实施方案中，将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将4个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种提高因子IX(FIX)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的AUC。在另一个实施方案中，本发明提供了一种提高因子VIIa(FVIIa) 多肽的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将至多5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此提高所述FVIIa多肽的AUC。在一个实施方案中，将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将4个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。在另一个实施方案中，将5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端。
在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是蛋白。在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是肽。在另一个实施方案中，本发明的凝血因子是多肽。在另一个实施方案中，所述凝血因子是酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是丝氨酸蛋白酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是转谷氨酰胺酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是无活性酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是本领域技术人员已知的任意凝血因子。
在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子VIII(FVIII)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子V(FV)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XIII(FXIII)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子X (FX)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是纤维蛋白。
在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子VIIa(FVIIa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子VII(FVII)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子IX(FIX)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子 X(FX)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XIa(FXIa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XII(FXII)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子Xa(FXa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子Va(FVa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是凝血酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是凝血酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XI(FXI)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是Von Willebrand 因子(vWF)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子VIIIa(FVIIIa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是B删除的结构域FVIII (FVIIIBDD)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是B结构域删除的FVIII (FVIIIBDD)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是β结构域删除的FVIII (FVIIIBDD)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子IXa(FIXa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是前激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子XIIa(FXIIa)。在另一个实施方案中，所述凝血因子是纤维蛋白原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是血栓调节蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是因子II(FII)。
在另一个实施方案中，所述凝血因子是糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是维生素K依赖性的糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是维生素K非依赖性的糖蛋白。
在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组糖蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组糖蛋白FV。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVI。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FIX。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FX。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXI。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组 FXII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FvW。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FII。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FIXa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组纤维蛋白。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组凝血酶原。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组凝血酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FVIIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组前激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组激肽释放酶。在另一个实施方案中，所述凝血因子是重组FXIIa。在另一个实施方案中，所述凝血因子是任意已知的重组凝血因子。在另一个实施方案中，所述包含信号肽的凝血因子是任意已知的重组凝血因子。
在另一个实施方案中，凝血因子包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连接至N-端的CTP。在另一个实施方案中，凝血因子包含至少一个连接至C-端的CTP且不包含连接至N-端的CTP。在另一个实施方案中，包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是经工程改造的凝血因子。在另一个实施方案中，包含至少一个连接至C-端的CTP且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是经工程改造的凝血因子。在另一个实施方案中，包含1-10个连接至C-端的CTP重复且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是缀合的凝血因子。在另一个实施方案中，包含至少一个连接至C-端的CTP且不包含连接至N-端的CTP的凝血因子是缀合的凝血因子。
在一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种CTP修饰的因子VIIa (FVIIa)多肽，其由FVIIa多肽和连接至所述FVIIa的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，所述凝血因子是包含与FIX、FVII、因子X、蛋白C或凝血酶原的结构域组构类似或相同的结构域组构的凝血因子。在另一个实施方案中，所述凝血因子被合成为具有N-端前肽的前体。在另一个实施方案中，本文中使用的凝血因子是呈无活性的前酶形式。在另一个实施方案中，所述凝血因子是在肝细胞中产生。在另一个实施方案中，所述凝血因子包含γ羧化酶的停泊位点，所述γ羧化酶将谷氨酸(Glu)转化成γ羧基谷氨酸(Gla)。在另一个实施方案中，本文中使用的凝血因子是商购可得的凝血因子。
在一个实施方案中，编码因子VII的核酸序列包含下述核酸序列： ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcag tcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggagga gctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagat cttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtc catgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagg gccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagt actgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacgg ggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagca aaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgtt ggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgttt cgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacg gggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaacc acgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccg aacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctggaccgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgca gcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggc agcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctg acgggcatcgtcagctggggccagggctgcgcaaccgtgggccactttggggtgtacaccagggtctccc agtacatcgagtggctgcaaaagctcatgcgctcagagccacgcccaggagtcctcctgcgagccccattt ccctgaggatgcggccgc(SEQ IDNO:11)。
在另一个实施方案中，因子VII的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEE LRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSP CQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCE QYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRN ASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVS AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVP GTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSG WGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYM FCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATV GHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP(SEQ ID NO:9)。
在另一个实施方案中，因子VII的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEE LRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSP CQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCE QYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRN ASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVS AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVP GTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSG WGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYM FCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATV GHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFP*GCGR(SEQ IDNO:10)。
在另一个实施方案中，编码因子VII-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcag tcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggaggagctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagat cttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtc catgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagg gccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagt actgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacgg ggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagca aaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgtt ggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgttt cgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacg gggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaacc acgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccg aacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgca gcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggc agcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacc tgaccggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtc ccagtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccc cttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagcg acacccccatcctgccccagtgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO:12)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEE LRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSP CQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCE QYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRN ASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVS AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVP GTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSG WGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATV GHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLP SPSRLPGPSDTPILPQ*(SEQ ID NO:13)。
在另一个实施方案中，编码因子VII-CTP-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcag tcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggagga gctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagat cttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtc catgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagg gccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagt actgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacgg ggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagca aaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgtt ggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgttt cgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacg gggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaacc acgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccg aacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgca gcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggc agcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctg accggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtccc agtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagcccccttccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctccgac acaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccctgccatccccctcccggctgcca ggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgcggccgc(SEQ ID NO: 14)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEE LRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSP CQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRN ASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVS AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVP GTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSG WGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYM FCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATV GHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLP SPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ IDNO:15)。
在另一个实施方案中，编码因子VII-CTP-CTP-CTP(连接至羧基端) 的核酸序列包含下述核酸序列： ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcag tcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggagga gctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagat cttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtc catgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagg gccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagt actgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacgg ggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagca aaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgtt ggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgttt cgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacg gggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaacc acgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccg aacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgca gcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggc agcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctg accggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtccc agtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagccccctt ccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgac acccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctg gccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatccccca gcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgcggccgcttaattaa (SEQ ID NO:24)。
在另一个实施方案中，因子VII-CTP-CTP-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEE LRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSP CQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCE QYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEKRN ASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWVVS AAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVP GTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSG WGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYM FCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCATV GHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSLP SPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO:25)。
在另一个实施方案中，编码因子VII-(CTP)4(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcag tcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggagga gctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagat cttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtc catgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagg gccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagt actgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacgg ggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagca aaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgtt ggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgttt cgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacg gggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaacc acgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccg aacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgca gcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggc agcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctg accggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtccc agtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagccccctt ccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggcccagtgac acccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccaccccctagcctgccttctccttctcggctgcctg gccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaaggctccccctccatctctgccatccccca gcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtgatgaggatccgc(SEQ ID NO: 26)。
在另一个实施方案中，因子VII-(CTP)4(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAF LEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCA SSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGG CEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEK RNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWV VSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYV PGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVS GWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEY MFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCAT VGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**G(SEQ ID NO:27)。
在另一个实施方案中，编码因子VII-(CTP)5(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： ctcgaggacatggtctcccaggccctcaggctcctctgccttctgcttgggcttcagggctgcctggctgcag tcttcgtaacccaggaggaagcccacggcgtcctgcaccggcgccggcgcgccaacgcgttcctggagga gctgcggccgggctccctggagagggagtgcaaggaggagcagtgctccttcgaggaggcccgggagat cttcaaggacgcggagaggacgaagctgttctggatttcttacagtgatggggaccagtgtgcctcaagtc catgccagaatgggggctcctgcaaggaccagctccagtcctatatctgcttctgcctccctgccttcgagg gccggaactgtgagacgcacaaggatgaccagctgatctgtgtgaacgagaacggcggctgtgagcagt actgcagtgaccacacgggcaccaagcgctcctgtcggtgccacgaggggtactctctgctggcagacgg ggtgtcctgcacacccacagttgaatatccatgtggaaaaatacctattctagaaaaaagaaatgccagca aaccccaaggccgaattgtggggggcaaggtgtgccccaaaggggagtgtccatggcaggtcctgttgtt ggtgaatggagctcagttgtgtggggggaccctgatcaacaccatctgggtggtctccgcggcccactgttt cgacaaaatcaagaactggaggaacctgatcgcggtgctgggcgagcacgacctcagcgagcacgacg gggatgagcagagccggcgggtggcgcaggtcatcatccccagcacgtacgtcccgggcaccaccaacc acgacatcgcgctgctccgcctgcaccagcccgtggtcctcactgaccatgtggtgcccctctgcctgcccg aacggacgttctctgagaggacgctggccttcgtgcgcttctcattggtcagcggctggggccagctgctgg accgtggcgccacggccctggagctcatggtcctcaacgtgccccggctgatgacccaggactgcctgca gcagtcacggaaggtgggagactccccaaatatcacggagtacatgttctgtgccggctactcggatggc agcaaggactcctgcaagggggacagtggaggcccacatgccacccactaccggggcacgtggtacctg accggcatcgtgagctggggccagggctgcgccaccgtgggccacttcggcgtgtacaccagggtgtccc agtacatcgagtggctgcagaaactgatgagaagcgagcccagacccggcgtgctgctgagagccccctt ccccagcagcagctccaaggcccctccccctagcctgcccagccctagcagactgcctgggccctctgaca cccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggctccaccaccttccctgcctagcccttcaagactgccagg ccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaaggctcccccacctagcctgccttctccatc aaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagcagctctagcaaggcacctccccccagtct gccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatcctcccacagtcctctagctctaaagctcc acctcccagcctgcccagccctagtagactccccggaccttctgatacccccatcttgccccagtgatgagg atccgc(SEQ ID NO:28)。
在另一个实施方案中，因子VII-(CTP)5(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： LEDMVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAF LEELRPGSLERECKEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCA SSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLPAFEGRNCETHKDDQLICVNENGG CEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTPTVEYPCGKIPILEK RNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINTIWV VSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYV PGTTNHDIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVS GWGQLLDRGATALELMVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEY MFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATHYRGTWYLTGIVSWGQGCAT VGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPFPSSSSKAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKA PPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**GS(SEQ ID NO:29)。
在另一个实施方案中，编码因子IX的核酸序列包含下述核酸序列： gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccattgccttttagga tatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaag aggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagt gtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgtt gatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaa tgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcaga tgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgca gaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaag ctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataa catcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtc aattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatg gattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgag gagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagcta ttaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacac ctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctgggg aagagtcttccacaaagggagatcagctttagttctccagtaccttagagttccacttgttgaccgagccac atgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagat tcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattatt agctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaact ggattaaggaaaaaacaaagctcacttgaacgcggccgc(SEQ ID NO:16)。
在另一个实施方案中，因子IX的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY VDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIK NGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSV SQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGG EDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKI TVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELD EPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVL QYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGP HVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL T*(SEQ ID NO:17)。
在另一个实施方案中，编码因子IX-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaa gaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaag tgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgtt gatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaa tgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcaga tgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgca gaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaag ctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataa catcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtc aattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatg gattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgag gagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagcta ttaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacac ctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctgggg aagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccac atgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagat tcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattatt agctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaact ggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaa gcaggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagtgatgaaggtctggatccgcggccgc (SEQ ID NO:18)。
在另一个实施方案中，因子IX-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY VDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIK NGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSV SQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGG EDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKI TVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELD EPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVL QYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGP HVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO:19)。
在另一个实施方案中，编码因子IX-CTP-CTP(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： gcgatcgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgccttttagg atatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcggccaaa gaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaag tgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagcagtatgtt gatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaattcctatgaa tgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaagaatggcaga tgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatcgacttgca gaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaacttctaag ctcacccgtgctgagactgtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccattttggataa catcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaaccaggtc aattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatgaaaaatg gattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataatattgag gagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaatgcagcta ttaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctacgttacac ctatttgcattgctacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtggctgggga agagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccgagccacat gtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggtagagattc atgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactggaattatta gctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatgtcaactg gattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctccccaagc aggctgcctgggccctccgacacaccaatcctgccacagagcagctcctctaaggcccctcctccatccct gccatccccctcccggctgcctggcccctctgacacccctatcctgcctcagtgatgaaggtctggatccgc ggccgc(SEQ ID NO:20)。
在另一个实施方案中，因子IX-CTP-CTP(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY VDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIK NGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSV SQTSKLTRAETVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGG EDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKI TVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELD EPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVL QYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGP HVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO:21)。
在另一个实施方案中，编码因子IX-(CTP)3(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列：tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctg ccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatc ggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatgga agaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaag cagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaat tcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaaga atggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatc gacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaa cttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccatt ttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaa ccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatga aaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataa tattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaat gcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctac gttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtg gctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccg agccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggt agagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactgg aattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatg tcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctc cccaagcaggctgcctgggcccagtgacacccctatcctgcctcagtccagctccagcaaggccccacccc ctagcctgccttctccttctcggctgcctggccccagcgatactccaattctgccccagtcctccagcagtaa ggctccccctccatctctgccatcccccagcagactgccaggcccttctgatacacccatcctcccacagtg atgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO:30)。
在另一个实施方案中，因子IX-(CTP)3(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKILNRPKR YNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEFWKQY VDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDVTCNIK NGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPCGRVSV SQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFTRVVGG EDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCVETGVKI TVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDIALLELD EPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKGRSALVL QYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQGDSGGP HVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIKEKTKL TSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**(SEQ ID NO:31)。
在另一个实施方案中，编码因子IX-(CTP)4(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： tctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctg ccttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatc ggccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaag cagtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaat tcctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaaga atggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatc gacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaa cttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccatt ttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaa ccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatga aaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataa tattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaat gcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctac gttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtg gctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccg agccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggt agagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactgg aattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatg tcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctc cccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggccccaccacc ttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaa ggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagc agctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactcccatt ctgccacagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO:32)。
在另一个实施方案中，因子IX-(CTP)4(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： SRVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKIL NRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEF WKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDV TCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPC GRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFT RVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCV ETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDI ALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKG RSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQG DSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIK EKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPQ**GSAA(SEQ ID NO:33)。
在另一个实施方案中，编码因子IX-(CTP)5(连接至羧基端)的核酸序列包含下述核酸序列： ctagagtcgaccccgccatgcagcgcgtgaacatgatcatggcagaatcaccaggcctcatcaccatctgc cttttaggatatctactcagtgctgaatgtacagtttttcttgatcatgaaaacgccaacaaaattctgaatcg gccaaagaggtataattcaggtaaattggaagagtttgttcaagggaaccttgagagagaatgtatggaagaaaagtgtagttttgaagaagcacgagaagtttttgaaaacactgaaagaacaactgaattttggaagc agtatgttgatggagatcagtgtgagtccaatccatgtttaaatggcggcagttgcaaggatgacattaatt cctatgaatgttggtgtccctttggatttgaaggaaagaactgtgaattagatgtaacatgtaacattaaga atggcagatgcgagcagttttgtaaaaatagtgctgataacaaggtggtttgctcctgtactgagggatatc gacttgcagaaaaccagaagtcctgtgaaccagcagtgccatttccatgtggaagagtttctgtttcacaaa cttctaagctcacccgtgctgaggcagtttttcctgatgtggactatgtaaattctactgaagctgaaaccatt ttggataacatcactcaaagcacccaatcatttaatgacttcactcgagttgttggtggagaagatgccaaa ccaggtcaattcccttggcaggttgttttgaatggtaaagttgatgcattctgtggaggctctatcgttaatga aaaatggattgtaactgctgcccactgtgttgaaactggtgttaaaattacagttgtcgcaggtgaacataa tattgaggagacagaacatacagagcaaaagcgaaatgtgattcgaattattcctcaccacaactacaat gcagctattaataagtacaaccatgacattgcccttctggaactggacgaacccttagtgctaaacagctac gttacacctatttgcattgctgacaaggaatacacgaacatcttcctcaaatttggatctggctatgtaagtg gctggggaagagtcttccacaaagggagatcagctttagttcttcagtaccttagagttccacttgttgaccg agccacatgtcttcgatctacaaagttcaccatctataacaacatgttctgtgctggcttccatgaaggaggt agagattcatgtcaaggagatagtgggggaccccatgttactgaagtggaagggaccagtttcttaactgg aattattagctggggtgaagagtgtgcaatgaaaggcaaatatggaatatataccaaggtatcccggtatg tcaactggattaaggaaaaaacaaagctcactagctccagcagcaaggcccctcccccgagcctgccctc cccaagcaggctgcctgggccctctgacacccctatcctgcctcagtccagctcctctaaggctccaccacc ttccctgcctagcccttcaagactgccaggccctagcgatacaccaattctgccccagtcctccagcagcaa ggctcccccacctagcctgccttctccatcaaggctgcctggcccatccgataccccaattttgcctcagagc agctctagcaaggcacctccccccagtctgccctctccaagcagactccctggcccttcagacactccaatc ctcccacagtcctctagctctaaagctccacctcccagcctgcccagccctagtagactccccggaccttctg atacccccatcttgccccagtgatgaggatccgcggccgc(SEQ ID NO:34)。
在另一个实施方案中，因子IX-(CTP)5(连接至羧基端)的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： RVDPAMQRVNMIMAESPGLITICLLGYLLSAECTVFLDHENANKIL NRPKRYNSGKLEEFVQGNLERECMEEKCSFEEAREVFENTERTTEF WKQYVDGDQCESNPCLNGGSCKDDINSYECWCPFGFEGKNCELDV TCNIKNGRCEQFCKNSADNKVVCSCTEGYRLAENQKSCEPAVPFPC GRVSVSQTSKLTRAEAVFPDVDYVNSTEAETILDNITQSTQSFNDFT RVVGGEDAKPGQFPWQVVLNGKVDAFCGGSIVNEKWIVTAAHCV ETGVKITVVAGEHNIEETEHTEQKRNVIRIIPHHNYNAAINKYNHDI ALLELDEPLVLNSYVTPICIADKEYTNIFLKFGSGYVSGWGRVFHKG RSALVLQYLRVPLVDRATCLRSTKFTIYNNMFCAGFHEGGRDSCQG DSGGPHVTEVEGTSFLTGIISWGEECAMKGKYGIYTKVSRYVNWIK EKTKLTSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSR LPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSL PSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**GSAA (SEQ ID NO:35)。
在另一个实施方案中，将弗林蛋白酶加入到表达本发明的凝血因子 -CTP的细胞中。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶增加细胞中本发明的凝血因子-CTP的生产效率。在另一个实施方案中，将弗林蛋白酶与包含本发明的凝血因子-CTP的编码序列的载体共转染。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶由单独载体编码。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶和凝血因子-CTP由一个载体编码。在另一个实施方案中，将弗林蛋白酶的编码序列插入pCI-DHFR中。在另一个实施方案中，弗林蛋白酶的编码序列被工程改造进pCI-dhfr/smaI+NotI、弗林蛋白酶/AsisI F.I.+NotI中。
在另一个实施方案中，编码弗林蛋白酶的核酸序列包含下述核酸序列： tctagagtcgaccccgccatggagctgaggccctggttgctatgggtggtagcagcaacaggaaccttggt cctgctagcagctgatgctcagggccagaaggtcttcaccaacacgtgggctgtgcgcatccctggaggcc cagcggtggccaacagtgtggcacggaagcatgggttcctcaacctgggccagatcttcggggactattac cacttctggcatcgaggagtgacgaagcggtccctgtcgcctcaccgcccgcggcacagccggctgcaga gggagcctcaagtacagtggctggaacagcaggtggcaaagcgacggactaaacgggacgtgtaccag gagcccacagaccccaagtttcctcagcagtggtacctgtctggtgtcactcagcgggacctgaatgtgaa ggcggcctgggcgcagggctacacagggcacggcattgtggtctccattctggacgatggcatcgagaag aaccacccggacttggcaggcaattatgatcctggggccagttttgatgtcaatgaccaggaccctgaccc ccagcctcggtacacacagatgaatgacaacaggcacggcacacggtgtgcgggggaagtggctgcggt ggccaacaacggtgtctgtggtgtaggtgtggcctacaacgcccgcattggaggggtgcgcatgctggatg gcgaggtgacagatgcagtggaggcacgctcgctgggcctgaaccccaaccacatccacatctacagtgc cagctggggccccgaggatgacggcaagacagtggatgggccagcccgcctcgccgaggaggccttctt ccgtggggttagccagggccgaggggggctgggctccatctttgtctgggcctcggggaacgggggccgg gaacatgacagctgcaactgcgacggctacaccaacagtatctacacgctgtccatcagcagcgccacgcagtttggcaacgtgccgtggtacagcgaggcctgctcgtccacactggccacgacctacagcagtggcaa ccagaatgagaagcagatcgtgacgactgacttgcggcagaagtgcacggagtctcacacgggcacctc agcctctgcccccttagcagccggcatcattgctctcaccctggaggccaataagaacctcacatggcggg acatgcaacacctggtggtacagacctcgaagccagcccacctcaatgccaacgactgggccaccaatgg tgtgggccggaaagtgagccactcatatggctacgggcttttggacgcaggcgccatggtggccctggccc agaattggaccacagtggccccccagcggaagtgcatcatcgacatcctcaccgagcccaaagacatcg ggaaacggctcgaggtgcggaagaccgtgaccgcgtgcctgggcgagcccaaccacatcactcggctgg agcacgctcaggcgcggctcaccctgtcctataatcgccgtggcgacctggccatccacctggtcagcccc atgggcacccgctccaccctgctggcagccaggccacatgactactccgcagatgggtttaatgactgggc cttcatgacaactcattcctgggatgaggatccctctggcgagtgggtcctagagattgaaaacaccagcg aagccaacaactatgggacgctgaccaagttcaccctcgtactctatggcaccgcccctgaggggctgccc gtacctccagaaagcagtggctgcaagaccctcacgtccagtcaggcctgtgtggtgtgcgaggaaggctt ctccctgcaccagaagagctgtgtccagcactgccctccaggcttcgccccccaagtcctcgatacgcacta tagcaccgagaatgacgtggagaccatccgggccagcgtctgcgccccctgccacgcctcatgtgccaca tgccaggggccggccctgacagactgcctcagctgccccagccacgcctccttggaccctgtggagcaga cttgctcccggcaaagccagagcagccgagagtccccgccacagcagcagccacctcggctgcccccggaggtggaggcggggcaacggctgcgggcagggctgctgccctcacacctgcctgaggtggtggccggcc tcagctgcgccttcatcgtgctggtcttcgtcactgtcttcctggtcctgcagctgcgctctggctttagttttcg gggggtgaaggtgtacaccatggaccgtggcctcatctcctacaaggggctgccccctgaagcctggcag gaggagtgcccgtctgactcagaagaggacgagggccggggcgagaggaccgcctttatcaaagaccagagcgccctctgaacgcggccgc(SEQ ID NO:22)。
在另一个实施方案中，弗林蛋白酶的氨基酸序列包含下述氨基酸序列： MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAV ANSVARKHGFLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQR EPQVQWLEQQVAKRRTKRDVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLN VKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHPDLAGNYDPGASFDVNDQ DPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGVGVAYNARIG GVRMLDGEVTDAVEARSLGLNPNHIHIYSASWGPEDDGKTVDGPA RLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIY TLSISSATQFGNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKC TESHTGTSASAPLAAGIIALTLEANKNLTWRDMQHLVVQTSKPAHL NANDWATNGVGRKVSHSYGYGLLDAGAMVALAQNWTTVAPQRK CIIDILTEPKDIGKRLEVRKTVTACLGEPNHITRLEHAQARLTLSYN RRGDLAIHLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDE DPSGEWVLEIENTSEANNYGTLTKFTLVLYGTAPEGLPVPPESSGCK TLTSSQACVVCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVE TIRASVCAPCHASCATCQGPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQS SRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLLPSHLPEVVAGLSCAFIVLV FVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPEAWQEECPSD SEEDEGRGERTAFIKDQSAL*(SEQ ID NO:23)。
在一个实施方案中，术语凝血因子进一步包括已知的凝血因子的同系物。在一个实施方案中，所述同系物具有凝血活性。在某些实施方案中，根据本发明的同源性也包括缺失、插入或置换变体，包括它们的氨基酸置换和它们的生物活性的多肽片段。在一个实施方案中，所述变体包含保守置换或没有显著改变凝血因子的三维结构的缺失、插入或置换。在另一个实施方案中，所述缺失、插入或置换没有改变凝血因子的目标功能，在一个实施方案中，所述目标功能是结合特定结合配偶体。
在另一个实施方案中，本发明包括凝血因子的同系物。在另一个实施方案中，本发明包括具有凝血活性的凝血因子的同系物。在另一个实施方案中，本发明包括具有功能性结合的凝血因子的同系物。在另一个实施方案中，本发明包括具有凝血活性的如本文中所述的凝血因子的同系物。在另一个实施方案中，本发明包括具有功能性结合的如本文中所述的凝血因子的同系物。在另一个实施方案中，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定，同系物例如多肽与凝血因子具有至少 50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。
在另一个实施方案中，本发明包括弗林蛋白酶的同系物。在另一个实施方案中，本发明包括维持目标功能的弗林蛋白酶的同系物，在一个实施方案中，所述目标功能是切割前体蛋白。在另一个实施方案中，使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BlastP软件使用默认参数确定，同系物例如多肽与弗林蛋白酶具有至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少 70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少87％、至少89％、至少91％、至少93％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同源性。
在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-10个促性腺激素羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-3个促性腺激素羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-5 个促性腺激素羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含在它的羧基端上具有至少一个CTP的凝血因子。
在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-5个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-5个CTP组成。
应当理解，包含如本文中所述的要素或步骤的本发明的组合物和方法在另一个实施方案中可以由那些要素或步骤组成，或在另一个实施方案中基本上由那些要素或步骤组成。在某些实施方案中，术语“包含”表示包括指定的活性剂，诸如CTP修饰的凝血因子，以及包括其它活性剂和药学上可接受的载体、赋形剂、软化剂、稳定剂等，正如制药工业中已知的。在某些实施方案中，术语“基本上由……组成”表示这样的组合物：其唯一活性成分是指定的活性成分，但是，可以包括用于使制剂稳定、防腐等、却不直接涉入指定的活性成分的治疗效果的其它化合物。在某些实施方案中，术语“基本上由……组成”可以表示促进活性成分的释放的组分。在某些实施方案中，术语“由……组成”表示含有活性成分和药学上可接受的载体或赋形剂的组合物。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2个促性腺激素羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-3个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-4个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-5个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-6个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-7个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-8个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-9个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-10个CTP。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-4个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-6个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-7个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-8个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-9个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-10个CTP。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4个促性腺激素羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-5个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-6个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-7个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-8个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-9个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-10个CTP。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽(CTP)。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-6个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-7个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-8个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-9个CTP。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-10个CTP。
在一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-3个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-4个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-5个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-6个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-7个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-10个CTP 组成。
在一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-4个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-6个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-7个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-10个CTP组成。
在一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-5个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-6个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-7个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-10个CTP组成。
在一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-6个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-7个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-10个CTP组成。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-3个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-4 个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-5个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-6个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-7个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的2-10个CTP组成。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-4个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-5 个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-6个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-7个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3-10个CTP组成。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-5个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-6 个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-7个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的4-10个CTP组成。
在一个实施方案中，本发明提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-6个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-7 个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-8个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-9个CTP组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，其基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的5-10个CTP 组成。
在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，所述多肽包含在它的氨基端不具有CTP的凝血因子，基本上由所述凝血因子组成或者由所述凝血因子组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，所述多肽包含在它的氨基端缺少CTP的凝血因子，基本上由所述凝血因子组成或者由所述凝血因子组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，所述多肽包含在它的羧基端上具有至少一个CTP且在它的氨基端上不具有CTP的凝血因子，基本上由所述凝血因子组成或者由所述凝血因子组成。在另一个实施方案中，本文提供了一种多肽，所述多肽包含在它的羧基端上具有如本文中所述的数目的CTP且在它的氨基端上不具有CTP的凝血因子，基本上由所述凝血因子组成或者由所述凝血因子组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上文中所述的多肽。
在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和连接至所述 FVIIa多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在一个实施方案中，本发明提供了如上文中所述的重组凝血因子。在一个实施方案中，本发明提供了如上文中所述的经工程改造的凝血因子。在一个实施方案中，如上文中所述的经工程改造的凝血因子被称作CTP 修饰的凝血因子。
在一个实施方案中，被连接至凝血因子的羧基端的CTP以串联方式连接至羧基端。
在一个实施方案中，如本文中所述的经工程改造的凝血因子与未-CTP 修饰的凝血因子相比具有相当的或改善的生物活性。在另一个实施方案中，如本文中所述的经工程改造的凝血因子与未-CTP修饰的凝血因子相比具有相当的或改善的药理学测量结果。在另一个实施方案中，如本文中所述的经工程改造的凝血因子与未-CTP修饰的凝血因子相比具有相当的或改善的药代动力学。在另一个实施方案中，如本文中所述的经工程改造的凝血因子与未-CTP修饰的凝血因子相比具有相当的或改善的药效动力学。
在一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗凝血或凝固障碍的方法。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：施用本发明的CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防和治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：施用本发明的CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：施用本发明的CTP修饰的因子VII。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：施用本发明的CTP修饰的因子IX。在一个实施方案中，血友病是血友病B。在一个实施方案中，血友病B被称作因子IX缺乏或Christmas病。在一个实施方案中，所述血友病是严重血友病，其在一个实施方案中描述了其中凝血因子水平为0-1％的血友病。在另一个实施方案中，所述血友病是中等血友病，其在一个实施方案中描述了其中凝血因子水平为1-5％的血友病。在另一个实施方案中，所述血友病是轻度血友病，其在一个实施方案中描述了其中凝血因子水平为5-50％的血友病。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者中的凝血或凝固障碍的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子 IX(FIX)多肽，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多肽包含FIX多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的凝血或凝固障碍。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者中的凝血或凝固障碍的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子VII(FVII)多肽，所述CTP修饰的因子VII(FVII)多肽包含FVII多肽和连接至所述FVII多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的凝血或凝固障碍。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多肽包含FIX多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽，所述CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽包含FVIIa 多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用一种或多种如本文中所述的CTP 修饰的凝血因子。因而，在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子 IX(FIX)多肽和CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽，所述CTP修饰的因子 IX(FIX)多肽包含FIX多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，所述CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽包含 FVIIa多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此治疗所述受试者中的血友病。在一个实施方案中，所述CTP修饰的FIX和所述CTP修饰的FVIIa在相同组合物中同时施用。在另一个实施方案中，所述CTP修饰的FIX和所述CTP修饰的FVIIa在分开的组合物中同时施用。在另一个实施方案中，所述CTP修饰的FIX 和所述CTP修饰的FVIIa在分开的组合物中在分开的时间施用。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)或 CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX或FVII多肽和连接至所述FIX或所述FVII多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用 CTP修饰的因子IX(FIX)或CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX或FVII 多肽和连接至所述FIX或所述FVII多肽的羧基端的4个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)或CTP修饰的因子 VII多肽，其包含FIX或FVII多肽和连接至所述FIX或所述FVII多肽的羧基端的5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子 IX(FIX)或CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX或FVII多肽和连接至所述FIX或所述FVII多肽的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)和CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX和FVII多肽和连接至所述FIX和所述FVII多肽的羧基端的3 个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX) 和CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX和FVII多肽和连接至所述FIX 和所述FVII多肽的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者皮下地或静脉内地施用CTP修饰的因子IX(FIX)或CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX或FVII多肽和连接至所述FIX或所述FVII多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者皮下地或静脉内地施用CTP修饰的因子IX(FIX)或CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX或FVII多肽和连接至所述FIX或所述FVII 多肽的羧基端的4个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者皮下地或静脉内地施用CTP修饰的因子IX(FIX)或CTP修饰的因子VII多肽，其包含 FIX或FVII多肽和连接至所述FIX或所述FVII多肽的羧基端的5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者皮下地或静脉内地施用CTP修饰的因子 IX(FIX)或CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX或FVII多肽和连接至所述FIX或所述FVII多肽的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者皮下地或静脉内地施用CTP修饰的因子IX(FIX)和CTP修饰的因子VII多肽，其包含FIX和FVII多肽和连接至所述FIX和所述FVII 多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防或治疗受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者皮下地或静脉内地施用CTP修饰的因子IX(FIX)和CTP修饰的因子VII多肽，其包含 FIX和FVII多肽和连接至所述FIX和所述FVII多肽的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此预防或治疗所述受试者中的血友病。
在某些实施方案中，本文提供了一种预防或治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者施用CTP修饰的凝血因子，所述CTP修饰的凝血因子包含连接至所述凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)多肽，其中所述CTP修饰的凝血因子的序列选自：SEQ ID NO:25、27或29，由此预防所述受试者中的血友病。
在某些实施方案中，本文提供了一种预防或治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括下述步骤：给所述受试者皮下地施用CTP修饰的因子VII，其包含连接至所述FVII多肽的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，其中所述CTP修饰的FVII的序列选自：SEQ ID NO:25、 27或29，由此预防所述受试者中的血友病。
在其它实施方案中，所述经工程改造的凝血因子是用于治疗血友病B 患者。在一个实施方案中，在它的羧基端包含3个串联CTP的凝血因子 IX是用于治疗血友病B患者。在一个实施方案中，在它的羧基端包含4 个串联CTP的凝血因子IX是用于治疗血友病B患者。在一个实施方案中，在它的羧基端包含5个串联CTP的凝血因子IX是用于治疗血友病B患者。在另一个实施方案中，在它的羧基端包含2个串联CTP的凝血因子IX是用于治疗血友病B患者。在另一个实施方案中，在它的羧基端包含1个 CTP重复的凝血因子IX是用于治疗血友病B患者。在其它实施方案中，所述经工程改造的凝血因子可以减小患者所需的输注的数目，减小患者所需的剂量，或它们的组合。
在一个实施方案中，相对于FIX-CTP-CTP收获物、FIX-CTP收获物或rhFIX，在它的羧基端包含3个串联CTP的凝血因子IX表现出改善的 PK谱，同时维持它的凝血活性。在一个实施方案中，rFIX-CTP3在大鼠中和在FIX-缺陷型小鼠中的消除半衰期是rFIX的2.5-4倍。在一个实施方案中，rFIX-CTP3的施用会在给药后使在FIX-缺陷型小鼠中的促凝血作用显著延长至少76小时。在一个实施方案中，rFIX-CTP3的施用会在 FIX-缺陷型小鼠中产生比rFIX更高的活性峰。在另一个实施方案中，相对于FIX-CTP收获物或rhFIX，在它的羧基端包含2个串联CTP的凝血因子IX表现出改善的PK谱，同时维持它的凝血活性。在另一个实施方案中，与rhFIX相比，在它的羧基端包含2个串联CTP的凝血因子IX表现出增加了3倍的半衰期和高了4.5倍的AUC。在另一个实施方案中，与重组FVII相比，皮下施用会导致CTP修饰的FVII的更高生物利用度。在另一个实施方案中，与的皮下施用相比，在FVIIa-CTP3和5 皮下施用以后具有更长的半衰期和更高的生物利用度(AUC SC/AUC IV)。在另一个实施方案中，与重组FVII相比，皮下注射的 MOD-5014和MOD-5019显示出提高的小鼠存活(参见下面的实施例8)。
在另一个实施方案中，术语“CTP肽”、“羧基端肽”和“CTP序列”在本文中可互换地使用。在另一个实施方案中，所述羧基端肽是全长CTP。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
在另一个实施方案中，将信号肽连接至CTP的氨基端，如在US 7,553,940中所述，其通过引用整体并入本文。
在其它实施方案中，术语经工程改造的凝血因子表示成熟凝血因子的氨基酸序列。在其它实施方案中，术语经工程改造的凝血因子表示包括它的信号序列或信号肽的凝血因子的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，“信号序列”和“信号肽”在本文中可互换地使用。在另一个实施方案中，当提及多核苷酸分子时，“序列”可以表示编码部分。每种可能性代表本发明的一个单独实施方案。
在另一个实施方案中，与不具有至少一个CTP的相同凝血因子相比，如本文中所述的包含至少一个CTP的经工程改造的凝血因子具有增强的体内生物活性。在一个实施方案中，所述增强的生物活性源自经工程改造的凝血因子的更长半衰期，同时维持至少一些生物活性。在另一个实施方案中，所述增强的生物活性源自由CTP修饰引起的增强的生物活性。在另一个实施方案中，所述增强的生物活性源自CTP修饰的凝血因子的更长的半衰期和增强的功能性。
在某些实施方案中，在凝血因子的羧基末端端部处的至少一个CTP 序列会提供增强的对抗凝血因子降解的保护。在某些实施方案中，在凝血因子的羧基末端端部处的至少一个CTP序列会提供增强的对抗清除的保护。在某些实施方案中，在凝血因子的羧基末端端部处的至少一个CTP 序列会提供延长的清除时间。在某些实施方案中，在凝血因子的羧基末端端部处的至少一个CTP序列会增强它的Cmax。在某些实施方案中，在凝血因子的羧基末端端部处的至少一个CTP序列会增强它的Tmax。在某些实施方案中，在凝血因子的羧基末端端部处的至少一个CTP序列会延长它的T1/2。
在另一个实施方案中，以与未修饰的缀合的凝血因子相同的方式使用本发明的缀合的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明的缀合的凝血因子具有增加的循环半衰期和血浆停留时间、降低的清除率和增加的体内临床活性。在另一个实施方案中，由于如本文中所述的缀合的凝血因子的改善的性能，与未修饰形式的相同凝血因子相比以更低的频率施用此缀合物。
在另一个实施方案中，降低的施用频率会导致改善的治疗策略，这在一个实施方案中会导致改善的患者顺应性，从而导致改善的治疗结果以及提高的患者生活质量。在另一个实施方案中，与常规凝血因子缀合物相比，已经发现，具有本发明缀合物的分子量和接头结构的缀合物具有改善的效能、改善的稳定性、提高的AUC水平和增强的循环半衰期。
在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种包含CTP修饰的因子 IX(FIX)多肽的药物组合物，所述CTP修饰的因子IX(FIX)多肽由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明另外提供了一种包含CTP修饰的因子 VIIa(FVIIa)多肽的药物组合物，所述CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽由FVIIa多肽和连接至所述FVIIa的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽 (CTP)组成。
在另一个实施方案中，本文提供了一种组合物，其包含如本文中所述的缀合的凝血因子。在另一个实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含如本文中所述的缀合的凝血因子。在另一个实施方案中，本文提供了一种药物组合物，其包含治疗有效量的如本文中所述的缀合的凝血因子。在一个实施方案中，根据诸如要治疗的具体病症、要治疗的患者的状况、以及组合物中的其它成分等因素，确定缀合的凝血因子的治疗有效量。
在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗罹患血友病的受试者。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于血友病的预防性治疗中以及减小出血和有关并发症的风险。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗罹患血友病的受试者，同时减小发展针对外源性地施用的凝血因子的抑制性抗体的风险。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗罹患血友病的受试者，从而诱导体内稳态。
在一个实施方案中，本发明的CTP修饰的凝血因子具有治疗用途。在另一个实施方案中，本发明的CTP修饰的凝血因子具有预防用途。
在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗经历了过度出血或擦伤或具有延长的凝血酶原时间(PT)或部分促凝血酶原时间(PTT)的受试者。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗具有导致出血的获得性病症(诸如维生素K缺乏或肝病)的受试者。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗具有凝血因子缺乏的受试者，所述凝血因子缺乏是获得性的(由于其它疾病)或遗传性的、轻度或严重的、长期或暂时的。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗罹患血友病A的受试者。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗罹患血友病B 的受试者。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗具有获得性缺陷的受试者，所述获得性缺陷是由于慢性疾病诸如肝病或癌症；由于急性病症诸如弥漫性血管内凝血(DIC)，其在快速速率耗尽凝血因子；或者由于维生素K缺乏或使用维生素K拮抗剂如华法林(因子II、 VII、IX和X的产生需要维生素K)进行治疗。在另一个实施方案中，如本文中所述的缀合的凝血因子可用于治疗罹患导致凝血失衡的疾病的受试者，例如但不限于肝病、尿毒症、癌症、骨髓障碍、暴露于蛇毒液、维生素K缺乏、抗凝血治疗、抗凝血剂华法林的意外摄取、多次输血(贮存的血单位丧失它们的凝血因子中的一些)或它们的组合。在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者的深静脉血栓形成的方法，所述方法包括：施用本发明的CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防具有血友病的受试者的失控出血的方法，所述方法包括：施用本发明的CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种预防具有血友病的受试者的出血发作的方法，所述方法包括：施用本发明的CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种控制具有血友病B(先天性因子IX缺乏)的受试者的出血发作的方法。
在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法是用于：治疗具有FVIII 或FIX的抑制剂的血友病A或B患者以及具有获得性血友病的患者的出血发作；预防具有FVIII或FIX的抑制剂的血友病A或B患者以及具有获得性血友病的患者的外科手术或侵入性手术中的出血；治疗具有先天性 FVII缺乏的患者的出血发作和预防具有先天性FVII缺乏的患者的外科手术或侵入性手术中的出血。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法是用于治疗或预防肌肉出血。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法是用于治疗或预防关节出血。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供鼻出血和牙龈出血、粘膜出血、向中枢神经系统中出血的治疗或预防性处理。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供胃肠或脑出血的治疗或预防性处理。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供低频率轻度出血的治疗或预防性处理。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供低频率中度出血的治疗或预防性处理。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供高频率轻度出血的治疗或预防性处理。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供高频率中度出血的治疗或预防性处理。
在一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供无症状血友病的治疗或预防性处理。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供轻度至中度血友病的治疗或预防性处理。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供重度血友病的治疗或预防性处理。
在一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供出血的治疗或预防性处理，所述出血在一个实施方案中是不可控制的出血，且在另一个实施方案中是脑内出血。在另一个实施方案中，本发明的组合物和方法会提供以下病症的治疗或预防性处理：新生儿凝血病；严重肝病；高危外科手术；创伤性失血；骨髓移植；血小板减少症和血小板功能障碍；口服抗凝血剂的急迫反转；因子V、VII、X和XI的先天性缺乏；或血管性血友病，在一个实施方案中，具有Von Willebrand因子的抑制剂的血管性血友病。
在一个实施方案中，本发明的CTP修饰的凝血因子是用于治疗受试者中的血友病或如本文中所述的有关疾病。在一个实施方案中，所述受试者是人。在另一个实施方案中，所述受试者是驯化的动物。在另一个实施方案中，所述受试者是哺乳动物。在另一个实施方案中，所述受试者是家畜。在另一个实施方案中，所述受试者是猴。在另一个实施方案中，所述受试者是马。在另一个实施方案中，所述受试者是母牛。在另一个实施方案中，所述受试者是小鼠。在另一个实施方案中，所述受试者是大鼠。在另一个实施方案中，所述受试者是犬科动物。在另一个实施方案中，所述受试者是猫科动物。在另一个实施方案中，所述受试者是牛、羊、猪、马、鼠或鹿。在一个实施方案中，所述受试者是雄性。在另一个实施方案中，所述受试者是雌性。在一个实施方案中，所述受试者是儿童，在另一个实施方案中，青少年，在另一个实施方案中，成年人，或在另一个实施方案中，老年受试者。在另一个实施方案中，所述受试者是儿科受试者，在另一个实施方案中，老年病受试者。
在另一个实施方案中，如本文中所述的[(CTP)n>1-凝血因子]包含全长凝血因子或其活性片段，其在它的羧基端通过肽键与至少一个CTP单元连接，在它的氨基端没有CTP。在另一个实施方案中，如本文中所述的 [(CTP)n>1-凝血因子]包含凝血因子或其活性片段，其通过肽键与至少一个 CTP单元连接，在它的氨基端没有CTP，所述CTP单元通过肽键与另一个CTP单元连接。在另一个实施方案中，一种核酸分子编码经工程改造的凝血因子，所述经工程改造的凝血因子包含连接至它的C-端的至少一个 CTP且在它的氨基端没有CTP。
在另一个实施方案中，所述CTP通过接头连接至凝血因子。在另一个实施方案中，将CTP序列与凝血因子连接的接头是共价键。在另一个实施方案中，将CTP序列与凝血因子连接的接头是肽键。在另一个实施方案中，将CTP序列与凝血因子连接的接头是被取代的肽键。在另一个实施方案中，所述CTP序列包含DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ IDNO:1)。在另一个实施方案中，所述CTP序列包含 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ IDNO:2)。在另一个实施方案中，所述CTP序列包含选自在SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2中阐述的序列的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，本发明的羧基端肽(CTP)包含人绒毛膜促性腺激素的氨基酸112至145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:1所示。在另一个实施方案中，本发明的CTP序列包含人绒毛膜促性腺激素的氨基酸 118至145位的氨基酸序列，如SEQ ID NO:2所示。在另一个实施方案中，所述CTP序列也从在人绒毛膜促性腺激素的第112-118位之间任何位置开始并在第145位结束。在某些实施方案中，所述CTP序列肽具有28、29、 30、31、32、33或34个氨基酸的长度，并从CTP氨基酸序列的第112、 113、114、115、116、117或118位开始。
在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差1-5个保守氨基酸置换，如通过引用并入本文的美国专利号5,712,122所述。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差1个保守氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP 相差2个保守氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差3个保守氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然 CTP相差4个保守氨基酸置换。在另一个实施方案中，所述CTP肽是绒毛膜促性腺激素CTP的变体，其与天然CTP相差5个保守氨基酸置换。
在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少70％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP 肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少80％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少90％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少95％同源性。在另一个实施方案中，本发明的CTP肽氨基酸序列与天然CTP氨基酸序列或其肽具有至少98％同源性。
在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTP DNA序列或其肽具有至少70％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然人CTP DNA序列或其肽具有至少80％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少90％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少95％同源性。在另一个实施方案中，编码本发明的CTP肽的多核苷酸与天然CTP DNA序列或其肽具有至少98％同源性。
在一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个被截短。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列二者被截短。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个被截短。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP 氨基酸序列中的3个被截短。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的4个被截短。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的5个被截短。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个被截短。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列全部被截短。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:3的前10个氨基酸。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:3包含下述氨基酸(AA)序列： SSSSKAPPPSLP。
在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4的前10个氨基酸。在另一个实施方案中，SEQ ID NO:4包含下述氨基酸(AA)序列： SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ。
在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4的前11个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4的前12 个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:3的前8个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4的前13个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4的前14个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:3的前6个氨基酸。在一个实施方案中，所述截短的CTP包含SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:3的前5个氨基酸。
在一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的至少一个被糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列二者被糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP 氨基酸序列中的2个被糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的3个被糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的4个被糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的5个被糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的2个或更多个被糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列全部被糖基化。
在一个实施方案中，本发明的CTP序列包含至少一个糖基化位点。在一个实施方案中，本发明的CTP序列包含2个糖基化位点。在一个实施方案中，本发明的CTP序列包含3个糖基化位点。在一个实施方案中，本发明的CTP序列包含4个糖基化位点。在一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的一个或更多个被完全糖基化。在另一个实施方案中，所述绒毛膜促性腺激素CTP氨基酸序列中的一个或更多个被部分地糖基化。在一个实施方案中，部分地糖基化指示，所述CTP糖基化位点中的一个被糖基化。在另一个实施方案中，所述CTP糖基化位点中的2个被糖基化。在另一个实施方案中，所述CTP糖基化位点中的3个被糖基化。
在某些实施方案中，所述CTP序列修饰在允许使用较低剂量方面是有利的。在某些实施方案中，所述CTP序列修饰在允许较少给药方面是有利的。在某些实施方案中，所述CTP序列修饰在允许安全长效作用方面是有利的。
在某些实施方案中，本文中使用的“多肽”、“经工程改造的凝血因子”或“蛋白”包括天然多肽(降解产物、合成的多肽或重组多肽)和肽拟似物(通常为合成的多肽)、以及为多肽类似物的类肽和半类肽，其在某些实施方案中具有使得含凝血因子的多肽在体内更稳定或者更加能够透入细胞中的修饰。
在某些实施方案中，修饰包括、但不限于C-端修饰，多肽键修饰，包括、但不限于CH2-NH、CH2-S、CH2-S＝O、O＝C-NH、CH2-O、 CH2-CH2、S＝C-NH、CH＝CH或CF＝CH、主链修饰和残基修饰。用于制备肽拟似物化合物的方法是本领域众所周知的，例如在QuantitativeDrug Design,C.A.Ramsden Gd.,第17.2章,F.Choplin Pergamon Press(1992) 中有具体描述，所述文献通过引用并入如同在本文中完整地阐述。在后文提供了在这方面的其它细节。
在某些实施方案中，多肽内的多肽键(-CO-NH-)被取代。在某些实施方案中，所述多肽键被N-甲基化键(-N(CH3)-CO-)取代。在某些实施方案中，所述多肽键被酯键(-C(R)H-C-O-O-C(R)-N-)取代。在某些实施方案中，所述多肽键被酮亚甲基键(ketomethylen bond)(-CO-CH2-)取代。在某些实施方案中，所述多肽键被α-氮杂键(-NH-N(R)-CO-)取代，其中R是任何烷基，例如甲基、carba键(-CH2-NH-)。在某些实施方案中，所述多肽键被羟基亚乙基键(-CH(OH)-CH2-)取代。在某些实施方案中，所述多肽键被硫代酰胺键(-CS-NH-)取代。在某些实施方案中，所述多肽键被烯族双键 (-CH＝CH-)取代。在某些实施方案中，所述多肽键被反酰胺键(-NH-CO-) 取代。在某些实施方案中，所述多肽键被多肽衍生物(-N(R)-CH2-CO-)取代，其中R是天然存在于碳原子上的“正常”侧链。在某些实施方案中，这些修饰沿着多肽链发生在任何键，且在一个实施方案中同时发生在几个键(2-3 个键)。
在某些实施方案中，所述多肽的天然芳族氨基酸诸如Trp、Tyr和Phe 被合成的非天然氨基酸置换，所述合成的非天然氨基酸是诸如苯基甘氨酸、 TIC、萘基丙氨酸(Nol)、Phe的环-甲基化衍生物、Phe的卤化衍生物或o- 甲基-Tyr。在某些实施方案中，本发明的多肽包括一个或多个修饰的氨基酸或者一个或多个非氨基酸单体(例如脂肪酸、复合碳水化合物等)。
在一个实施方案中，“氨基酸”或“氨基酸序列”应被理解为包括：20种天然存在的氨基酸；经常在体内翻译后修饰的那些氨基酸，包括例如羟脯氨酸、磷酸丝氨酸和磷酸苏氨酸；和其它罕见氨基酸，包括、但不限于2- 氨基己二酸、羟赖氨酸、异锁链素、正-缬氨酸、正-亮氨酸和鸟氨酸。在一个实施方案中，“氨基酸”包括D-和L-氨基酸。
在某些实施方案中，将本发明的多肽用在要求包含凝血因子的多肽处于可溶形式的治疗中。在某些实施方案中，本发明的多肽包括一个或更多个非天然的或天然的极性氨基酸(包括、但不限于丝氨酸和苏氨酸)，其由于含羟基的侧链而能增加多肽可溶性。
在某些实施方案中，以线性形式使用本发明的经工程改造的凝血因子，但是本领域技术人员将理解，在环化不会严重干扰经工程改造的凝血因子特性的情况下，也可以使用环状形式的经工程改造的凝血因子。
在某些实施方案中，本发明的经工程改造的凝血因子是通过生物化学方式合成的，例如通过使用标准的固相技术合成。在某些实施方案中，这些生物化学方法包括排它固相合成法、部分固相合成法、片段缩合法或经典的溶液合成法。
在某些实施方案中，将重组蛋白技术用于制备本发明的经工程改造的凝血因子。在某些实施方案中，将重组蛋白技术用于制备相对较长的多肽 (例如长于18-25个氨基酸)。在某些实施方案中，将重组蛋白技术用于制备大量的本发明的经工程改造的凝血因子。在某些实施方案中，重组技术由以下文献描述：Bitter等人,(1987)Methods inEnzymol.153:516-544, Studier等人(1990)Methods in Enzymol.185:60-89,Brisson等人(1984) Nature 310:511-514,Takamatsu等人(1987)EMBO J.6:307-311,Coruzzi等人(1984)EMBO J.3:1671-1680和Brogli等人,(1984)Science 224:838-843, Gurley等人(1986)Mol.Cell.Biol.6:559-565以及Weissbach和Weissbach, 1988,Methods for PlantMolecular Biology,Academic Press,NY,第VIII 部分,第421-463页，它们通过引用整体并入本文。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸分子，其包含编码如上文中所述的包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的促性腺激素羧基端肽的多肽的基因的编码部分。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸分子，其由编码如上文中所述的包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的促性腺激素羧基端肽的多肽的基因的编码部分组成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸分子，其基本上由编码如上文中所述的包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的促性腺激素羧基端肽的多肽的基因的编码部分组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上文中所述的包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽的多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上文中所述的由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽组成的多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其编码如上文中所述的基本上由凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽组成的多肽。在一个实施方案中，所述多核苷酸是多核苷酸序列。在一个实施方案中，所述多核苷酸是多核苷酸分子。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含如本文中所述的多核苷酸分子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX (FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽 (CTP)组成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa (FVIIa)多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽 (CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种细胞，其包含如本文中所述的表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含如本文中所述的表达载体。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP 修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含如本文中所述的细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是真核细胞。在另一个实施方案中，所述细胞是原核细胞。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP修饰的凝血因子的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP) 连接至所述凝血因子的羧基端，由此生产CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP修饰的凝血因子的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个编码绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)的多核苷酸序列连接至编码所述凝血因子的多核苷酸序列的羧基端，由此生产 CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP 修饰的因子IX(FIX)多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此生产CTP 修饰的FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此生产 CTP修饰的FVIIa多肽。
在另一个实施方案中，使用编码本发明多肽的多核苷酸分子合成本发明的经工程改造的凝血因子。在某些实施方案中，将编码本发明的经工程改造的凝血因子的多核苷酸分子连接进表达载体中，所述表达载体包含顺式调节序列(例如，启动子序列)的转录控制。在某些实施方案中，所述顺式调节序列适合于指导本发明的经工程改造的凝血因子的组成型表达。在某些实施方案中，所述顺式调节序列适合于指导本发明的经工程改造的凝血因子的组织特异性表达。在某些实施方案中，所述顺式调节序列适合于指导本发明的经工程改造的凝血因子的可诱导表达。
在某些实施方案中，适合与本发明一起使用的组织特异性启动子包括在一个或多个特定细胞群体中起作用的序列，实例包括、但不限于：启动子诸如肝特异性的白蛋白的启动子[Pinkert等人,(1987)Genes Dev. 1:268-277]，淋巴样特异性的启动子[Calame等人,(1988)Adv.Immunol. 43:235-275]；尤其是T-细胞受体[Winoto等人,(1989)EMBO J.8:729-733] 和免疫球蛋白的启动子；[Banerji等人(1983)Cell 33729-740]，神经元特异性的启动子诸如神经丝启动子[Byrne等人(1989)Proc.Natl.Acad.Sci. USA 86:5473-5477]，胰腺特异性的启动子[Edlunch等人(1985)Science 230:912-916]或乳腺特异性的启动子诸如乳清启动子(美国专利号4,873,316 和欧洲申请公开号264,166)。适合与本发明一起使用的诱导型启动子包括、例如四环素诱导型启动子(Srour,M.A.,等人,2003.Thromb.Haemost.90: 398-405)。
在一个实施方案中，短语“多核苷酸分子”表示单链或双链核酸序列，其是分离的并且以RNA序列、互补多核苷酸序列(cDNA)、基因组多核苷酸序列和/或组合的多核苷酸序列(例如上述形式的组合)的形式提供。
在一个实施方案中，“互补多核苷酸序列”表示这样的序列：其源自使用逆转录酶或任意其它RNA依赖性的DNA聚合酶对信使RNA的逆转录。在一个实施方案中，随后可以在体内或在体外使用DNA聚合酶扩增所述序列。
在一个实施方案中，“基因组多核苷酸序列”表示这样的序列：其衍生自染色体且因此它代表染色体的一个连续部分。
在一个实施方案中，“组合的多核苷酸序列”表示这样的序列：其为至少部分互补的和至少部分基因组的。在一个实施方案中，组合的序列可以包括编码本发明的多肽所需的一些外显子序列，以及插入二者之间的一些内含子序列。在一个实施方案中，所述内含子序列可以具有任何来源，包括其它基因，且通常包括保守剪接的信号序列。在一个实施方案中，内含子序列包括顺式起作用的表达调节元件。
在一个实施方案中，在表达和分泌之后，从前体经工程改造的凝血因子切除信号肽，从而产生成熟的经工程改造的凝血因子。
在某些实施方案中，使用PCR技术或本领域技术人员已知的任何其它方法或规程来制备本发明的多核苷酸。在某些实施方案中，所述规程包括连接两个不同的DNA序列(参见，例如，“Current Protocols in Molecular Biology”,Ausubel等人编,John Wiley&Sons,1992)。
在一个实施方案中，将编码经工程改造的凝血因子的本发明的多核苷酸插入表达载体(即，核酸构建体)中，以实现重组多肽的表达。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括额外序列，所述额外序列使得该载体适合于在原核生物中复制和整合。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括额外序列，所述额外序列使得该载体适合于在真核生物中复制和整合。在一个实施方案中，本发明的表达载体包括穿梭载体，所述穿梭载体使得该载体适合于在原核生物和真核生物二者中复制和整合。在某些实施方案中，克隆载体包含转录和翻译起始序列(例如，启动子、增强子)以及转录和翻译终止子(例如，聚腺苷酰化信号)。
在一个实施方案中，多种原核或真核细胞可以用作宿主表达系统来表达本发明的凝血因子。在某些实施方案中，这些包括、但不限于：微生物，诸如用含有多肽编码序列的重组噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA表达载体转化的细菌；用含有多肽编码序列的重组酵母表达载体转化的酵母；用重组病毒表达载体(例如，花椰菜花叶病毒、CaMV；烟草花叶病毒、TMV) 感染的或用含有多肽编码序列的重组质粒表达载体(诸如Ti质粒)转化的植物细胞系统。
在某些实施方案中，使用非细菌表达系统(例如哺乳动物表达系统诸如 CHO细胞)来表达本发明的凝血因子。在一个实施方案中，用于在哺乳动物细胞中表达本发明的多核苷酸的表达载体是包含CMV启动子和新霉素抗性基因的pCI-DHFR载体。根据一个实施方案，pCI-dhfr载体的构建描述在实施例1中。
在某些实施方案中，在本发明的细菌系统中，根据表达的多肽的预期用途，可以有利地选择许多表达载体。在一个实施方案中，需要大量的多肽。在一个实施方案中，需要指导蛋白产物的高水平表达的载体，可能是作为与疏水信号序列的融合体，所述疏水信号序列指导表达产物进入细菌周质或培养基中，在这些地方的蛋白产物易于被纯化。在一个实施方案中，用特异性切割位点工程改造的某些融合蛋白以辅助多肽的回收。在一个实施方案中，适合于这种操作的载体包括、但不限于pET系列的大肠杆菌表达载体[Studier等人,Methods in Enzymol.185:60-89(1990)]。
在一个实施方案中，使用酵母表达系统。在一个实施方案中，许多含有组成型或诱导型启动子的载体可以用于酵母中，如通过引用整体并入本文中的美国专利申请号5,932,447所公开的。在另一个实施方案中，使用促进外源DNA序列整合进酵母染色体中的载体。
在一个实施方案中，本发明的表达载体可以进一步包括额外多核苷酸序列，其允许例如从单一mRNA翻译几种蛋白，诸如内核糖体进入位点 (IRES)和用于启动子嵌合多肽的基因组整合的序列。
在某些实施方案中，哺乳动物表达载体包括、但不限于：pcDNA3、 pcDNA3.1(±)、pGL3、pZeoSV2(±)、pSecTag2、pDisplay、 pEF/myc/cyto、pCMV/myc/cyto、pCR3.1、pSinRep5、DH26S、 DHBB、pNMT1、pNMT41、pNMT81(它们可得自Invitrogen)、pCI (可得自Promega)、pMbac、pPbac、pBK-RSV和pBK-CMV(它们可得自Strategene)、pTRES(可得自Clontech)和它们的衍生物。
在某些实施方案中，在本发明中使用含有来自真核病毒(诸如逆转录病毒)的调节元件的表达载体。SV40载体包括pSVT7和pMT2。在某些实施方案中，衍生自牛乳头状瘤病毒的载体包括pBV-1MTHA，衍生自 Epstein Bar病毒的载体包括pHEBO和p2O5。其它示例性的载体包括 pMSG、pAV009/A+、pMTO10/A+、pMAMneo-5、杆状病毒pDSVE、和允许蛋白在启动子指导下表达的任何其它载体，所述启动子是SV-40早期启动子、SV-40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或经证实在真核细胞中有效表达的其它启动子。
在某些实施方案中，重组病毒载体可用于在体内表达本发明的凝血因子，因为它们会提供诸如横向感染和靶向特异性等优点。在一个实施方案中，横向感染是例如逆转录病毒的生命周期中固有的，是单个受感染细胞产生许多后代病毒颗粒及其出芽和感染相邻细胞的过程。在一个实施方案中，结果是，大面积被迅速感染，其中大部分最初未被原始病毒颗粒感染。在一个实施方案中，产生不能横向传播的病毒载体。在一个实施方案中，如果希望的目的是将指定基因仅导入局限数目的靶细胞中，该特性可以是有用的。
在一个实施方案中，可以使用不同方法将本发明的表达载体导入细胞中。这样的方法通常描述在：Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,ColdSprings Harbor Laboratory,New York(1989, 1992),Ausubel等人,Current Protocolsin Molecular Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1989),Chang等人,Somatic Gene Therapy, CRC Press,Ann Arbor,Mich.(1995),Vega等人,GeneTargeting,CRC Press,Ann Arbor Mich.(1995),Vectors:A Survey of MolecularCloning Vectors and Their Uses,Butterworths,Boston Mass.(1988)和Gilboa等人[Biotechniques 4(6):504-512,1986]，且包括、例如，稳定的或瞬时的转染、脂转染、电穿孔和用重组病毒载体感染。另外，关于正-负选择方法，参见美国专利号5,464,764和5,487,992，通过引用并入本文。
在某些实施方案中，通过病毒感染导入核酸会提供胜过其它方法(诸如脂转染和电穿孔)的几个优点，因为由于病毒的感染性质可以获得更高的转染效率。
在一个实施方案中，应当理解，也可以从核酸构建体表达本发明的经工程改造的凝血因子，使用在上文中描述的任何合适的施用模式将所述核酸构建体施用给个体(即，体内基因治疗)。在一个实施方案中，通过适当的基因递送媒介物/方法(转染、转导、同源重组等)和必要的表达系统将所述核酸构建体导入合适的细胞中，然后将修饰的细胞培养扩增并返回所述个体(即，离体基因治疗)。
在一个实施方案中，使用植物表达载体。在一个实施方案中，多肽编码序列的表达由许多启动子驱动。在某些实施方案中，使用病毒启动子诸如CaMV的35S RNA和19S RNA启动子[Brisson等人,Nature 310:511-514(1984)]，或TMV的外壳蛋白启动子[Takamatsu等人,EMBO J.6:307-311(1987)]。在另一个实施方案中，使用植物启动子，例如，RUBISCO的小亚基[Coruzzi等人,EMBO J.3:1671-1680(1984)；和Brogli 等人,Science 224:838-843(1984)]或热激启动子，例如，大豆hsp17.5-E或hsp17.3-B[Gurley等人,Mol.Cell.Biol.6:559-565(1986)]。在一个实施方案中，使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电穿孔和技术人员众所周知的其它技术，将构建体导入植物细胞中。参见，例如，Weissbach&Weissbach[Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press,NY,Section VIII,第421-463页(1988)]。本发明还可以使用本领域众所周知的其它表达系统诸如昆虫和哺乳动物宿主细胞系统。
应当理解，除了含有插入的编码序列(其编码多肽)的转录和翻译所必需的元件之外，本发明的表达构建体还可以包括经工程改造以优化表达的多肽的稳定性、产生、纯化、产量或活性的序列。
在某些实施方案中，将转化的细胞在有效条件下培养，所述条件允许经工程改造的重组凝血因子以较高量表达。在某些实施方案中，有效培养条件包括、但不限于允许蛋白产生的有效的培养基、生物反应器、温度、 pH和氧条件。在一个实施方案中，有效培养基表示在其中培养细胞以产生本发明的重组多肽的任何培养基。在某些实施方案中，培养基通常包括水溶液，其具有可同化的碳、氮和磷酸盐来源，和合适的盐、矿物质、金属和其它营养物诸如维生素。在某些实施方案中，可以将本发明的细胞在常规发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定平板和培养皿中培养。在某些实施方案中，在适合重组细胞的温度、pH和氧含量条件下进行培养。在某些实施方案中，培养条件的确定属于本领域普通技术人员的专业技术。
在某些实施方案中，根据用于生产的载体和宿主系统，所得的本发明的经工程改造的凝血因子保留在重组细胞内、分泌进发酵培养基中、分泌进两个细胞膜之间的空间(诸如大肠杆菌的周质间隙)；或保留在细胞或病毒膜的外表面上。
在一个实施方案中，在预定的培养时间之后，进行经工程改造的重组凝血因子的回收。
在一个实施方案中，本文中使用的短语“回收经工程改造的重组凝血因子”表示收集含有多肽的全部发酵培养基，且不一定暗示额外的分离或纯化步骤。
在一个实施方案中，使用多种标准的蛋白纯化技术来纯化本发明的经工程改造的凝血因子，所述技术是例如，但不限于，亲和色谱法、离子交换色谱法、过滤、电泳、疏水相互作用色谱法、凝胶过滤色谱法、反相色谱法、伴刀豆球蛋白A色谱法、色谱聚焦和差别增溶。
在一个实施方案中，为了促进回收，可以将表达的编码序列工程改造成编码本发明的经工程改造的凝血因子和融合的可切割的部分。在一个实施方案中，可以设计融合蛋白，使得所述多肽可以通过亲和色谱法容易地分离；例如，通过固定化在对可切割的部分特异性的柱上。在一个实施方案中，将切割位点工程改造在经工程改造的凝血因子和可切割的部分之间，并且通过用在此位点特异性地切割融合蛋白的合适酶或试剂处理，可以从色谱柱释放多肽[例如，参见Booth等人,Immunol.Lett.19:65-70(1988)；和Gardella等人,J.Biol.Chem.265:15854-15859(1990)]。
在一个实施方案中，以“基本上纯的”形式回收本发明的经工程改造的凝血因子。
在一个实施方案中，短语“基本上纯的”表示允许蛋白在本文描述的应用中有效使用的纯度。
在一个实施方案中，使用体外表达系统，也可以合成本发明的经工程改造的凝血因子。在一个实施方案中，体外合成方法是本领域众所周知的，所述系统的组分是商购可得的。
在某些实施方案中，合成和纯化经工程改造的重组凝血因子；可以在体内或在体外测定它们的治疗效果。在一个实施方案中，使用本领域技术人员已知的各种测定法，可以确定本发明的经工程改造的重组凝血因子的结合活性。
在另一个实施方案中，可以将本发明的经工程改造的凝血因子提供给个体本身。在一个实施方案中，可以将本发明的经工程改造的凝血因子作为药物组合物的一部分提供给个体，所述凝血因子在所述药物混合物中与药学上可接受的载体混合。
在另一个实施方案中，“药物组合物”表示一种或多种本文描述的活性成分与其它化学组分(诸如生理学上合适的载体和赋形剂)的制品。药物组合物的目的是便于将化合物施用给生物体。
在另一个实施方案中，“活性成分”表示引起生物学效应的目标多肽序列。
在另一个实施方案中，本发明的任何组合物将包含至少一个CTP序列，所述CTP序列仅结合任何形式的感兴趣的经工程改造的凝血因子的羧基端。在一个实施方案中，本发明提供了组合的制品。在一个实施方案中，“组合的制品”特别定义了“部件套件”，其含义是，如上定义的组合伴侣可以独立地施用或者通过使用与不同量的组合伴侣的不同固定组合，即同时施用、并行施用、单独施用或相继施用。在某些实施方案中，部件套件的部件然后可以例如同时施用或在时间上错开(即在不同时间点)施用，且部件套件的任何部件具有相等或不同的时间间隔。在某些实施方案中，所述组合伴侣的总量的比率可以在所述组合制品中施用。在一个实施方案中，所述组合的制品可以变化，例如以便应付要治疗的患者亚群的需要或由于特殊疾病、疾病的严重程度、年龄、性别或体重等而具有不同需要的单个患者的需要，所述变化可以由本领域技术人员容易地做出。
在另一个实施方案中，短语“生理上可接受的载体”和“药学上可接受的载体”可互换地用于表示，对生物体不引起显著刺激且不废除所施用的化合物的生物活性和性能的载体或稀释剂。佐剂被包含在这些短语下。在一个实施方案中，在药学上可接受的载体中包含的成分之一可以是例如聚乙二醇(PEG)，即在有机和水性介质中均具有宽溶解度范围的生物相容的聚合物(Mutter等人(1979))。
在另一个实施方案中，“赋形剂”表示加入药物组合物中以进一步促进活性成分施用的惰性物质。在一个实施方案中，赋形剂包括碳酸钙、磷酸钙、各种糖和各种类型的淀粉、纤维素衍生物、明胶、植物油和聚乙二醇。
药物的配制和施用技术参见“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, MackPublishing Co.,Easton,PA,最新版，其通过引用并入本文。
本发明预见到剂量范围的不同实施方案。在一个实施方案中，本发明的经工程改造的凝血因子的剂量是在0.005-100mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.005-5mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.01-50mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-20mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-10mg/ 天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.01-5mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.001-0.01mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.001-0.1mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.1-5mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.5-50mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.2-15 mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在0.8-65mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在1-50mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-10mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在8-15mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在 10-20mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在20-40mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在60-120mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在12-40mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在40-60mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在50-100mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在1-60 mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在15-25mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在5-10mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在55-65mg/天的范围内。
在另一个实施方案中，所述剂量是在50-500mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在50-150mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在100-200mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在150-250mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在 200-300mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在250-400mg/ 天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在300-500mg/天的范围内。在另一个实施方案中，所述剂量是在350-500mg/天的范围内。
在一个实施方案中，所述剂量是20mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是30mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是40mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是50mg/天。在一个实施方案中，所述剂量是0.01mg/ 天。在另一个实施方案中，所述剂量是0.1mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是1mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是0.530mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是0.05mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是50mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是10mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是20-70mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是 5mg/天。
在一个实施方案中，所述CTP修饰的凝血因子的剂量是1-5mg/天。在一个实施方案中，所述CTP修饰的凝血因子的剂量是1-3mg/天。在另一个实施方案中，所述CTP修饰的凝血因子的剂量是2mg/天。
在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/2天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/3天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/4天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/5天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/6天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/周。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/9天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/11天。在另一个实施方案中，所述剂量是1-90mg/14天。
在另一个实施方案中，所述凝血因子剂量是10-50mg/天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/2天。在另一个实施方案中，所述剂量是 10-50mg/3天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/4天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50微克/5天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/6天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/周。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/9天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/11天。在另一个实施方案中，所述剂量是10-50mg/14 天。
在另一个实施方案中，将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽配制成鼻内剂型。在另一个实施方案中，将包含凝血因子和至少一个CTP 单元的多肽配制成可注射剂型。在另一个实施方案中，以在0.0001mg至 0.6mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.001mg至0.005mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.005mg至0.01mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.01mg至 0.3mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在0.2mg至0.6mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，所述凝血因子在它的氨基端上不具有CTP。
在另一个实施方案中，以在1-100微克范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在 10-80微克范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在20-60微克范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在10-50微克范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在40-80微克范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在10-30微克范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在30-60微克范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。
在另一个实施方案中，以在0.2mg至2mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在2mg至6mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在4mg至10mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，以在5mg至15mg范围内的剂量将包含凝血因子和至少一个 CTP单元的多肽施用给受试者。
在一个实施方案中，CTP修饰的FIX的剂量占在相同时间段内在患者的重组FIX(例如，Wyeth或CSL Behring)的推荐剂量中施用的FIX的量的50％。在一个实施方案中，CTP修饰的FVIIa 的剂量占在相同时间段内在患者的重组FVIIa(例如，)的推荐剂量中施用的FVIIa的量的50％。在一个实施方案中，CTP修饰的FVII 的剂量占在相同时间段内在患者的重组FVII的推荐剂量中施用的FVII的量的50％。例如，如果在手术前或手术后以每2小时90微克/kg的剂量将施用给患者(即，对于85kg的患者，每2小时7.65mg，或在 12小时时段内分成6次给药的45.9mg)，可以在为患者的重组FVIIa的12- 小时给药的50％的剂量(即，在经12-小时时段内施用一次的23mg的剂量) 施用本发明的CTP修饰的凝血因子。
在另一个实施方案中，CTP修饰的凝血因子的剂量使得它含有使用未 -CTP修饰的凝血因子施用的凝血因子的量的45％。在另一个实施方案中， CTP修饰的凝血因子的剂量使得它含有使用未-CTP修饰的凝血因子施用的凝血因子的量的10％。在另一个实施方案中，CTP修饰的凝血因子的剂量使得它含有使用未-CTP修饰的凝血因子施用的凝血因子的量的25％。在另一个实施方案中，CTP修饰的凝血因子的剂量使得它含有使用未-CTP 修饰的凝血因子施用的凝血因子的量的35％。在另一个实施方案中，CTP 修饰的凝血因子的剂量使得它含有使用未-CTP修饰的凝血因子施用的凝血因子的量的75％。在另一个实施方案中，CTP修饰的凝血因子的剂量使得它含有使用未-CTP修饰的凝血因子施用的凝血因子的量的100％。但是，即使所述剂量含有与未-CTP修饰的凝血因子相同量的凝血因子(例如FIX)，它对于受试者仍然是有利的，因为它将以更低的频率施用，这是由于它与重组凝血因子相比增加的半衰期。
在另一个实施方案中，缀合的凝血因子的治疗有效量是在每天1次至每周1次施用的50-500IU/千克体重的FIX之间或10μg/Kg-500μg/Kg的 FVIIa之间。在另一个实施方案中，缀合的凝血因子的治疗有效量是每天 1次施用的150-250IU/千克体重。在另一个实施方案中，以对于通过多种方式施用给人患者而言有效的强度，配制包含缀合的凝血因子的药物组合物。
在一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环因子IX活性达到 20-30IU/dL的量施用FIX。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环因子IX活性达到25-50IU/dL的量施用FIX。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环因子IX活性达到50-100IU/dL的量施用FIX。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环因子IX活性达到100-200IU/dL的量施用FIX。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环因子IX活性达到10-50IU/dL的量施用FIX。在另一个实施方案中，以有效地使受试者中的循环因子IX活性达到20-100IU/dL的量施用FIX。
在一个实施方案中，每周1次地将CTP修饰的凝血因子施用给受试者。在另一个实施方案中，每周2次地将CTP修饰的凝血因子施用给受试者。在另一个实施方案中，每两星期1次地(每两周1次地)将CTP修饰的凝血因子施用给受试者。在另一个实施方案中，每月2次地将CTP修饰的凝血因子施用给受试者。在另一个实施方案中，每月1次地将CTP修饰的凝血因子施用给受试者。在另一个实施方案中，每天1次地将CTP修饰的凝血因子施用给受试者。在另一个实施方案中，每两天1次地将CTP修饰的凝血因子施用给受试者。
在另一个实施方案中，每三天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP 单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每四天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每五天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每六天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每7-14天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每 10-20天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每5-15天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP 单元的多肽施用给受试者。在另一个实施方案中，每15-30天1次地将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽施用给受试者。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括增加在凝血因子疗法使用中的顺应性，所述方法包括：给有此需要的受试者提供包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的至少一个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)的多肽，由此增加在凝血因子疗法使用中的顺应性。
在另一个实施方案中，本发明的方法包括：增加需要凝血因子疗法的罹患慢性疾病的患者的顺应性。在另一个实施方案中，本发明的方法能够通过用如上文中所述的CTP修饰凝血因子来降低凝血因子的施用频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此降低所述FIX多肽的施用频率。在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVIIa)多肽的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此降低所述FVIIa多肽的施用频率。
在另一个实施方案中，术语顺应性包括坚持性(adherence)。在另一个实施方案中，本发明的方法包括：通过降低凝血因子的施用频率来增加需要凝血因子疗法的患者的顺应性。在另一个实施方案中，通过CTP修饰来实现凝血因子的施用频率的降低，所述CTP修饰使得CTP修饰的凝血因子更稳定。在另一个实施方案中，由于增加凝血因子的T1/2而实现凝血因子的施用频率的降低。在另一个实施方案中，由于增加凝血因子的清除时间或降低凝血因子的清除率而实现凝血因子的施用频率的降低。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此降低所述FIX多肽的清除率。在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVIIa)多肽的清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此降低所述FVIIa多肽的清除率。
在另一个实施方案中，由于增加凝血因子的AUC测量而实现凝血因子的施用频率的降低。
在另一个实施方案中，本文提供了一种降低凝血因子的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将1-10个CTP连接至所述凝血因子的羧基端，由此降低凝血因子的施用频率。在另一个实施方案中，本文提供了一种降低凝血因子的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将1-5个CTP 连接至所述凝血因子的羧基端，由此降低凝血因子的施用频率。在另一个实施方案中，本文提供了一种降低凝血因子的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个CTP连接至凝血因子的羧基端，由此降低凝血因子的施用频率。在另一个实施方案中，本文提供了一种降低凝血因子的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将3-5个CTP连接至凝血因子的羧基端，由此降低凝血因子的施用频率。
在另一个实施方案中，本文提供了一种增加在凝血因子疗法使用中的顺应性的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此增加在凝血因子疗法使用中的顺应性。在另一个实施方案中，本文提供了一种增加在凝血因子疗法使用中的顺应性的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的1-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此增加在凝血因子疗法使用中的顺应性。在另一个实施方案中，本文提供了一种增加在凝血因子疗法使用中的顺应性的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此增加在凝血因子疗法使用中的顺应性。在另一个实施方案中，本文提供了一种增加在凝血因子疗法使用中的顺应性的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此增加在凝血因子疗法使用中的顺应性。
在另一个实施方案中，本文提供了一种预防或治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括：给所述受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此治疗所述受试者中的血液凝固或凝结障碍。在另一个实施方案中，本文提供了一种预防或治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的1-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此预防或治疗所述受试者中的血液凝固或凝结障碍。在另一个实施方案中，本文提供了一种预防或治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此预防或治疗所述受试者中的血液凝固或凝结障碍。在另一个实施方案中，本文提供了一种预防或治疗受试者中的血液凝固或凝结障碍的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此预防或治疗所述受试者中的血液凝固或凝结障碍。
在另一个实施方案中，本文提供了一种预防受试者的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此预防所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本文提供了一种预防受试者的血友病的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的1-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此预防所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本文提供了一种预防受试者的血友病的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此预防所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本文提供了一种预防受试者的血友病的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此预防所述受试者中的血友病。
在另一个实施方案中，本发明证实，本文提供的组合物在皮下施用以后会令人惊讶地更有效地被吸收进血流中(参见本文中的实施例7-9)。能够皮下地施用FVIIa是一个优点，因为它可以用于预防性施用。皮下注射对于患者而言也更易于自己注射，并且当患者非常年轻且他们的静脉较小和难以发现时是优点。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至所述凝血因子的羧基端的1-10个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的1-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3 个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给有此需要的受试者提供多肽，所述多肽包含凝血因子和连接至凝血因子的羧基端的3-5个绒毛膜促性腺激素羧基端肽，由此治疗所述受试者中的血友病。
在一个实施方案中，口服施用包括单位剂型，包括片剂、胶囊剂、锭剂、咀嚼片剂、混悬液、乳剂等。这样的单位剂型包含安全且有效量的期望的本发明的凝血因子，在一个实施方案中，其中的每一种是约0.7或3.5 mg至约280mg/70kg，或在另一个实施方案中，约0.5或10mg至约210 mg/70kg。适合于制备用于口服施用的单位剂型的药学上可接受的载体是本领域众所周知的。在某些实施方案中，片剂通常包含常规药学上相容的佐剂如惰性稀释剂，诸如碳酸钙、碳酸钠、甘露醇、乳糖和纤维素；粘合剂诸如淀粉、明胶和蔗糖；崩解剂诸如淀粉、海藻酸和交联羧甲纤维素 (croscarmelose)；润滑剂诸如硬脂酸镁、硬脂酸和滑石粉。在一个实施方案中，助流剂诸如二氧化硅可以用于改善粉末混合物的流动特性。在一个实施方案中，为了外观，可以加入着色剂诸如FD&C染料。甜味剂和矫味剂，诸如阿司帕坦、糖精、薄荷醇、薄荷和果味矫味剂，是咀嚼片剂的有用佐剂。胶囊剂通常包含以上公开的一种或多种固体稀释剂。在某些实施方案中，载体组分的选择取决于后续考虑事项，如味道、成本和贮存稳定性，其对于本发明的目的而言不是关键性的，且可以由本领域技术人员容易地选择。
在一个实施方案中，口服剂型包含预定义的释放特性。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含延长释放片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含缓释片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，本发明的口服剂型包含立即释放片剂、胶囊剂、锭剂或咀嚼片剂。在一个实施方案中，如本领域技术人员已知的，根据药物活性成分的期望释放特性配制所述口服剂型。
在某些实施方案中，口服组合物包含液体溶液、乳剂、混悬液等。在某些实施方案中，适合于制备这样的组合物的药学上可接受的载体是本领域众所周知的。在某些实施方案中，液体口服组合物包含约0.001％至约 0.933％的一种或多种期望的化合物，或在另一个实施方案中，约0.01％至约10％。
在某些实施方案中，用于本发明的方法中的组合物包含溶液或乳剂，在某些实施方案中，其为包含安全且有效量的本发明化合物和任选的意图用于局部鼻内施用的其它化合物的水溶液或乳剂。在某些实施方案中，所述组合物包含约0.001％至约10.0％(w/v)的主题化合物，更优选约00.1％至约2.0％，其用于通过鼻内途径全身性递送所述化合物。
在另一个实施方案中，将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽注射进肌肉中(肌肉内注射)。在另一个实施方案中，将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽注射在皮肤下面(皮下注射)。在另一个实施方案中，将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽注射进肌肉中。在另一个实施方案中，将包含凝血因子和至少一个CTP单元的多肽注射进皮肤中。在另一个实施方案中，通过全身施用来施用如本文中所述的凝血因子。在另一个实施方案中，通过静脉内注射来施用如本文中所述的凝血因子。在另一个实施方案中，施用可以是胃肠外的、肺的、口服的、局部的、真皮内的、肌肉内的、腹膜内的、静脉内的、皮下的、鼻内的、经鼻的、眼内的、眼的、硬膜外的、含服的、直肠的、透粘膜的、肠或胃肠外的递送，包括骨髓内注射以及鞘内或直接心室内施用。
在另一个实施方案中，以局部方式而不是全身性方式施用制剂，例如，通过将制剂直接注射进患者身体的特定区域中。
在一个实施方案中，所述施用途径可以是肠内的。在另一个实施方案中，所述途径可以是结膜的、透皮的、真皮内的、动脉内的、阴道的、直肠的、肿瘤内的、经癌灶(parcanceral)、透粘膜的、肌肉内的、血管内的、心室内的、颅内的、鼻内的、舌下的或它们的组合。
在另一个实施方案中，通过静脉内、动脉内或肌肉内注射液体制剂来施用所述药物组合物。在某些实施方案中，液体制剂包括溶液、混悬液、分散体、乳剂、油等。在一个实施方案中，静脉内地施用所述药物组合物，并因此将其配制成适合于静脉内施用的形式。在另一个实施方案中，动脉内地施用所述药物组合物，并因此将其配制成适合于动脉内施用的形式。在另一个实施方案中，肌内地施用所述药物组合物，并因此将其配制成适合于肌肉内施用的形式。
此外，在另一个实施方案中，将所述药物组合物局部施用于身体表面，并因此将其配制成适合于局部施用的形式。合适的局部制剂包括凝胶、软膏剂、乳膏剂、洗剂、滴剂等。对于局部施用，将本发明的化合物与一种或多种额外的适当治疗剂组合，制备，和作为在有或无药用载体的生理上可接受的稀释剂中的溶液、混悬液或乳剂来施用。
在一个实施方案中，通过本领域众所周知的的方法来制备本发明的药物组合物，例如，借助于常规混合、溶解、粒化、做糖衣丸、磨细、乳化、包封、截留或冻干过程制备。
在一个实施方案中，使用促进将所述活性成分加工成可在药学上使用的制品的一种或多种生理上可接受的载体(包括赋形剂和助剂)，以常规方式配制根据本发明使用的药物组合物。在一个实施方案中，制剂取决于选择的施用途径。
在一个实施方案中，在水溶液中配制本发明的注射剂。在一个实施方案中，在生理上相容的缓冲液(诸如汉克氏溶液、林格氏溶液或生理盐水缓冲液)中配制本发明的注射剂。在某些实施方案中，对于透粘膜施用，在所述制剂中使用适合要透过的屏障的穿透剂。所述穿透剂在本领域内是公知的。
在一个实施方案中，将本文所述的制品配制为用于胃肠外施用，例如，通过快速推注或连续输注。在某些实施方案中，注射用制剂呈单位剂型，例如在安瓿中或在多剂量容器中，任选具有加入的防腐剂。在某些实施方案中，组合物是在油性或水性媒介物中的混悬液、溶液或乳剂，且含有配制剂诸如助悬剂、稳定剂和/或分散剂。
在某些实施方案中，所述组合物还包含：防腐剂，诸如苯扎氯铵和硫柳汞等；螯合剂，诸如依地酸钠等；缓冲剂诸如磷酸盐、柠檬酸盐和乙酸盐；张度剂诸如氯化钠、氯化钾、甘油、甘露醇等；抗氧化剂诸如抗坏血酸、乙酰基胱氨酸、焦亚硫酸钠等；芳香剂；粘度调节剂，诸如聚合物，包括纤维素及其衍生物；和聚乙烯醇以及根据需要调节这些水性组合物的pH的酸和碱。在某些实施方案中，所述组合物还包含局部麻醉剂或其它活性物。所述组合物可以用作喷雾剂、合剂(mist)、滴剂等。
在某些实施方案中，用于胃肠外施用的药物组合物包括水溶性形式的活性制品的水溶液。另外，在某些实施方案中，将活性成分的混悬液制备成适当的基于油或水的注射混悬液。在某些实施方案中，合适的亲脂溶剂或媒介物包括：脂肪油诸如芝麻油，或合成的脂肪酸酯诸如油酸乙酯、甘油三酯或脂质体。在某些实施方案中，水性注射混悬液含有增加所述混悬液的粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、山梨醇或葡聚糖。在另一个实施方案中，所述混悬液还含有合适的稳定剂或增加活性成分的可溶性以允许制备高浓缩溶液的试剂。
在另一个实施方案中，可以在囊泡、特别是在脂质体中递送所述活性化合物(参见Langer,Science 249:1527-1533(1990)；Treat等人,in Liposomes in the Therapy ofInfectious Disease and Cancer,Lopez- Berestein和Fidler(编),Liss,New York,第353-365页(1989)； Lopez-Berestein,文献同上,第317-327页；J.E.Diederichs等人,Pharm./nd.56(1994)267-275)。
在另一个实施方案中，将在控释系统中递送的药物组合物配制成用于静脉内输注、可植入的渗透泵、透皮贴剂、脂质体或其它施用模式。在一个实施方案中，使用泵(参见Langer,出处同上；Sefton,CRC Crit.Ref. Biomed.Eng.14:201(1987)；Buchwald等人,Surgery 88:507(1980)； Saudek等人,N.Engl.J.Med.321:574(1989)。在另一个实施方案中，可以使用聚合材料。在另一个实施方案中，可以将控释系统置于治疗靶标(即，脑)的附近，因此仅需要全身剂量的一部分(参见，例如，Goodson,in Medical Applications ofControlled Release,出处同上,第2卷,第115-138 页(1984)。在Langer的综述(Science249:1527-1533(1990))中讨论了其它控释系统。
在某些实施方案中，所述活性成分是呈粉末形式，其用于在使用之前用合适的媒介物(例如，无菌的、无热原的基于水的溶液)构建。在某些实施方案中，将组合物配制用于雾化和吸入施用。在另一个实施方案中，将组合物包含在具有附带的雾化装置的容器中。
在一个实施方案中，使用例如常规栓剂基质诸如可可脂或其它甘油酯，将本发明的制品配制成直肠组合物诸如栓剂或保留灌肠剂。
在某些实施方案中，适用于用在本发明的上下文中的药物组合物包括这样的组合物：其中含有有效地实现预期目的的量的活性成分。在某些实施方案中，治疗有效量是指有效地预防、减轻或改善疾病征状或延长接受治疗的受试者的生存时间的活性成分的量。
在一个实施方案中，治疗有效量的确定完全是在本领域技术人员的能力范围内。
可以充当药学上可接受的载体或其组分的物质的一些例子是：糖类，诸如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉类，诸如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，诸如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和甲基纤维素；黄蓍胶粉末；麦芽；明胶；滑石粉；固体润滑剂，诸如硬脂酸和硬脂酸镁；硫酸钙；植物油，诸如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油、玉米油和可可油；多元醇诸如丙二醇、甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；海藻酸；乳化剂，诸如吐温TM商标乳化剂；润湿剂，诸如月桂基硫酸钠；着色剂；矫味剂；压片剂、稳定剂；抗氧化剂；防腐剂；无热原水；等张盐水；和磷酸盐缓冲溶液。要与所述化合物联合使用的药学上可接受的载体的选择基本上取决于要施用所述化合物的方式。在一个实施方案中，如果要注射主题化合物，那么所述药学上可接受的载体是含有血液相容的助悬剂的无菌生理盐水，其pH已经被调节至约7.4。
另外，所述组合物还包含：粘合剂(例如阿拉伯胶、玉米淀粉、明胶、卡波姆、乙基纤维素、瓜尔胶、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、聚维酮)，崩解剂(例如玉米淀粉、马铃薯淀粉、海藻酸、二氧化硅、交联羧甲纤维素钠、交聚维酮、瓜尔胶、淀粉羟乙酸钠)，不同pH和离子浓度的缓冲液(例如，Tris-HCl、乙酸盐、磷酸盐)，用于防止吸收至表面的添加剂诸如白蛋白或明胶，去污剂(例如，吐温20、吐温80、Pluronic F68、胆汁酸盐)，蛋白酶抑制剂、表面活性剂(例如月桂基硫酸钠)，渗透增强剂、增溶剂(例如，甘油、聚乙烯甘油)，抗氧化剂(例如，抗坏血酸、偏亚硫酸氢钠、丁羟茴香醚)，稳定剂(例如羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素)，增粘剂(例如卡波姆、胶体二氧化硅、乙基纤维素、瓜尔胶)，甜味剂(例如阿司帕坦、柠檬酸)，防腐剂(例如，硫柳汞、苯甲醇、对羟基苯甲酸酯)，润滑剂(例如硬脂酸、硬脂酸镁、聚乙二醇、月桂基硫酸钠)，助流剂(例如胶体二氧化硅)，塑化剂(例如邻苯二甲酸二乙酯、柠檬酸三乙酯)，乳化剂(例如卡波姆、羟丙基纤维素、月桂基硫酸钠)，聚合物包衣剂(例如，泊洛沙姆或泊洛沙胺)，包衣剂和成膜剂(例如乙基纤维素、丙烯酸酯、聚甲基丙烯酸酯)和/或佐剂。
糖浆剂、酏剂、乳剂和混悬液的载体的典型组分包括乙醇、甘油、丙二醇、聚乙二醇、液体蔗糖、山梨醇和水。对于混悬液而言，典型的助悬剂包括甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、纤维素(例如AvicelTM、RC-591)、黄蓍胶和海藻酸钠；典型的润湿剂包括卵磷脂和聚氧化乙烯脱水山梨糖醇 (例如聚山梨酯80)。典型的防腐剂包括对羟基苯甲酸甲酯和苯甲酸钠。在另一个实施方案中，口服液体组合物还含有上面公开的一种或多种组分诸如甜味剂、矫味剂和着色剂。
所述组合物还包括将活性物质掺入在高分子化合物(诸如聚乳酸、聚乙醇酸(polglycolic acid)、水凝胶等)的微粒制品的内部或表面上，或掺入在脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、血影(erythrocyte ghosts)或原生质球上。这样的组合物将影响物理状态、可溶性、稳定性、体内释放速率和体内清除速率。
本发明还包括用聚合物(例如泊洛沙姆或泊洛沙胺)包被的微粒组合物，以及偶联至针对组织特异性受体、配体或抗原的抗体的化合物或偶联至组织特异性受体的配体的化合物。
在某些实施方案中，通过共价连接水溶性聚合物来修饰化合物，所述水溶性聚合物是诸如聚乙二醇、聚乙二醇与聚丙二醇的共聚物、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮或聚脯氨酸。在另一个实施方案中，与相应的未修饰的化合物相比，所述修饰的化合物在静脉内注射之后表现出在血液中实质上更长的半衰期。在一个实施方案中，修饰也会增加所述化合物在水溶液中的可溶性，消除聚集，增强所述化合物的物理和化学稳定性，并极大地降低所述化合物的免疫原性和反应性。在另一个实施方案中，通过与未修饰的化合物相比以更低频率或更低剂量施用这样的聚合物-化合物加合物，实现期望的体内生物活性。
在某些实施方案中，最初可以从体外测定估算有效量或剂量的制品。在一个实施方案中，可以在动物模型中配制剂量，且这样的信息可以用来更准确地确定在人类中有用的剂量。
在一个实施方案中，通过标准制药规程在体外、在细胞培养物或实验动物中可以确定本文描述的活性成分的毒性和治疗效果。在一个实施方案中，可以将得自这些体外和细胞培养测定和动物研究的数据用于配置人用的剂量范围。在一个实施方案中，剂量随采用的剂型和利用的施用途径而变化。在一个实施方案中，精确的制剂、施用途径和剂量可以由个别医师考虑到患者的状况来选择[参见例如，Fingl,等人,(1975)“ThePharmacological Basis of Therapeutics”,第1章第1页]。
在一个实施方案中，取决于要治疗的病症的严重程度和应答性，给药可以是单次或多次给药，疗程持续几天至几周，或直到实现治愈或达到疾病状态的减轻。
在一个实施方案中，组合物的施用量当然取决于治疗的受试者、疾病严重程度、施用方式、处方医师的判断等。
在一个实施方案中，还制备组合物，包括在相容的药用载体中配制的本发明制品，其置于适当的容器中，并标示指定的病症的治疗。
在另一个实施方案中，如本文中所述的凝血因子是与以下物质组合的低压冻干的(即，冷冻干燥的)制品：复合的有机赋形剂和稳定剂诸如非离子表面活性剂(即，表面活性剂)、各种糖、有机多元醇和/或人血清白蛋白。在另一个实施方案中，药物组合物包含在无菌注射用水中低压冻干的如本文中所述的凝血因子。在另一个实施方案中，药物组合物包含在注射用无菌PBS中低压冻干的如本文中所述的凝血因子。在另一个实施方案中，药物组合物包含在注射用无菌0.9％NaCl中低压冻干的如本文中所述的凝血因子。
在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文中所述的凝血因子和复合载体诸如人血清白蛋白、多元醇、糖和阴离子表面活性稳定剂。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文中所述的凝血因子和乳糖酸和乙酸盐/甘氨酸缓冲液。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含如本文中所述的凝血因子和增加干扰素成分在水中的可溶性的氨基酸(诸如精氨酸或谷氨酸)。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含低压冻干的如本文中所述的凝血因子和甘氨酸或人血清白蛋白(HSA)、缓冲剂(例如乙酸盐)和等渗剂(例如NaCl)。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含低压冻干的如本文中所述的凝血因子和磷酸盐缓冲剂、甘氨酸和HSA。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物当置于具有约4至7.2之间的pH的缓冲溶液中时是稳定的。在另一个实施方案中，包含凝血因子的药物组合物是在具有约4至8.5之间的pH的缓冲溶液中。在另一个实施方案中，包含凝血因子的药物组合物是在具有约 6至7之间的pH的缓冲溶液中。在另一个实施方案中，包含凝血因子的药物组合物是在具有约6.5的pH的缓冲溶液中。在另一个实施方案中，用作为稳定剂的氨基酸且在某些情况下用盐(如果所述氨基酸不含有带电荷的侧链)来稳定包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物是这样的液体组合物：其包含约0.3重量％至5重量％之间的稳定剂，所述稳定剂是氨基酸。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物提供了给药准确度和产品安全性。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物提供了用于可注射施用中的生物学上有活性的、稳定的液体制剂。在另一个实施方案中，所述药物组合物包含未低压冻干的如本文中所述的凝血因子。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物提供了这样的液体制剂：其允许以液体状态长期贮存，从而促进在施用之前的贮存和运输。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含固体脂质作为基体材料。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的可注射药物组合物包含固体脂质作为基体材料。在另一个实施方案中，如Speiser(Speiser等人,Pharm.Res.8(1991)47-54)所述通过喷雾冷凝来生产脂质微粒，随后将脂质纳米球用于口服施用(Speiser EP 0167825(1990))。在另一个实施方案中,使用的脂质被身体较好地耐受(例如由存在于胃肠外营养物的乳剂中的脂肪酸组成的甘油酯)。
在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含高分子微粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含纳米颗粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含脂质体。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含脂质乳剂。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含微球。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含含有两亲脂质的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，包含如本文中所述的凝血因子的药物组合物包含含有药物、脂质基质和表面活性剂的脂质纳米颗粒。在另一个实施方案中，所述脂质基质具有为至少50％(w/w)的甘油单酯含量。
在一个实施方案中，本发明的组合物存在于包装或分配器装置中，诸如FDA批准的试剂盒，其包含一个或更多个含有活性成分的单位剂型。在一个实施方案中，所述包装例如包含金属或塑料箔，诸如泡罩包。在一个实施方案中，所述包装或分配器装置伴有施用说明书。在一个实施方案中，所述包装或分配器伴有与容器有关的公告，所述公告采用管理药物的制备、使用或销售的政府机构指定的形式，所述公告反映了所述机构对所述组合物的形式或人或兽施用的批准。在一个实施方案中，所述公告是由美国食品和药品管理局批准的关于处方药的标签或经批准的产品插页。
在一个实施方案中，应当理解，本发明的凝血因子可以与额外活性剂一起提供给个体，以实现与用每种药剂自身治疗相比改善的治疗效果。在另一个实施方案中，采取措施(例如互补药剂的施用和选择)来避免与联合治疗有关的不利副作用。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的因子VIIa (FVIIa)多肽，其由FVIIa多肽和连接至所述FVIIa的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含CTP修饰的因子VIIa (FVIIa)多肽的药物组合物，所述CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽由 FVIIa多肽和连接至所述FVIIa的羧基端的5个促性腺激素羧基端肽(CTP) 组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和连接至所述FVIIa 多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种表达载体，其包含编码CTP 修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的细胞，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种包含表达载体的组合物，所述表达载体包含编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子VIIa(FVIIa)多肽和连接至所述FVIIa多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种延长因子VIIa(FVIIa)多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此延长所述FVIIa多肽的生物半衰期。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种提高因子VIIa(FVIIa)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此提高所述 FVIIa多肽的AUC。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVIIa)多肽的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此降低所述FVIIa多肽的施用频率。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子VIIa(FVIIa)多肽的清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此降低所述FVIIa多肽的清除率。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP修饰的因子VIIa (FVIIa)多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FVIIa多肽的羧基端，由此生产CTP修饰的FVIIa 多肽。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽，所述CTP修饰的因子VIIa(FVIIa)多肽包含FVIIa多肽和连接至所述 FVIIa多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此治疗所述受试者中的血友病。
在一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，其由FIX多肽和连接至所述CTP修饰的FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种 CTP修饰的FIX多肽，其中所述CTP修饰的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO:31中阐述的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO: 2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的FIX多肽，其中至少一个 CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种CTP修饰的FIX多肽，其中所述接头是肽键。
在一个实施方案中，本发明提供了一种药物组合物，其包含CTP修饰的FIX多肽。
在一个实施方案中，本发明提供了一种编码CTP修饰的多肽的多核苷酸，所述CTP修饰的多肽由因子IX(FIX)多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个促性腺激素羧基端肽(CTP)组成。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其中所述多核苷酸的序列阐述在SEQ ID NO: 30中。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个 CTP是由选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个CTP 被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其中至少一个CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种多核苷酸，其中所述接头是肽键。一种表达载体，其包含所述多核苷酸。
在一个实施方案中，本发明提供了一种细胞，其包含所述表达载体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种组合物，其包含所述表达载体。
在一个实施方案中，本发明提供了一种延长因子IX(FIX)多肽的生物半衰期的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此延长所述FIX多肽的生物半衰期。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP 是由选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述接头是肽键。
在一个实施方案中，本发明提供了一种提高因子IX(FIX)多肽的曲线下面积(AUC)的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此提高所述FIX多肽的 AUC。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP 是由选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述接头是肽键。
在一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的施用频率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此降低所述FIX多肽的施用频率。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述接头是肽键。
在一个实施方案中，本发明提供了一种降低因子IX(FIX)多肽的清除率的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此降低所述FIX多肽的清除率。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述接头是肽键。
在一个实施方案中，本发明提供了一种生产CTP修饰的因子IX(FIX) 多肽的方法，所述方法包括下述步骤：将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽 (CTP)连接至所述FIX多肽的羧基端，由此生产CTP修饰的FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述CTP修饰的FIX 多肽的序列是在SEQ ID NO:31中阐述的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述接头是肽键。
在一个实施方案中，本发明提供了一种治疗受试者中的血友病的方法，所述方法包括：给所述受试者施用CTP修饰的因子IX(FIX)多肽，所述 CTP修饰的因子IX(FIX)多肽包含FIX多肽和连接至所述FIX多肽的羧基端的3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)，由此治疗所述受试者中的血友病。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述CTP 修饰的FIX多肽的序列是在SEQ ID NO:31中阐述的序列。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP是由选自SEQ ID NO: 1和SEQ ID NO:2的氨基酸序列编码。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被糖基化。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP被截短。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中至少一个CTP经由接头连接至所述FIX多肽。在另一个实施方案中，本发明提供了一种方法，其中所述接头是肽键。
如本领域普遍已知的，本发明的经修饰的肽和蛋白可以偶联至标记、药物、靶向试剂、载体、固体支持物等，取决于期望的用途。经标记的形式的经修饰的生物试剂可以用于跟踪它们的代谢命运；用于此目的的合适标记具体地包括放射性同位素标记诸如碘131、锝99、铟111等。所述标记也可以用于介导经修饰的蛋白或肽在测定系统中的检测；在该情况下，还可以使用放射性同位素，以及酶标记、荧光标记、产色标记等。如果肽或蛋白本身是靶向试剂诸如抗体或受体配体，这样的标记的应用是特别有用的。
可以采用类似的连接技术以及其它技术将本发明的经修饰的肽和蛋白偶联至固体支持物。当偶联时，这些经修饰的肽和蛋白然后可以用作亲和试剂，用于分离与其表现出特异性反应的期望组分。
最后，本发明的经修饰的肽和蛋白可以用于制备抗体，所述抗体可与这些新化合物特异性地免疫反应。这些抗体可用于多种诊断和治疗用途，取决于未修饰的肽或蛋白的生物活性的性质。应当理解，本发明提供了这样的抗体：其可与如本文中所述的CTP修饰的FIX、FVII或FVIIa发生免疫反应。在一个实施方案中，这样的抗体可以用于区分或鉴别从内源性凝血因子施用的CTP修饰的凝血因子。在另一个实施方案中，所述抗体可以用于局部化施用的CTP修饰的凝血因子。
本领域普通技术人员在检查下述实施例以后，会明白本发明的其它目标、优点和新颖的特征，所述实施例无意成为限制性的。另外，上文描述的和在下面的权利要求书部分中要求保护的本发明的不同实施方案和方面中的每一个，都可以得到下述实施例的实验支持。
实施例
通常，本文中使用的命名法和在本发明中使用的实验室规程包括分子技术、生物化学技术、微生物技术和重组DNA技术。在文献中充分解释了这样的技术。参见，例如，“Molecular Cloning:A laboratory Manual”Sambrook等人,(1989)；“Current Protocolsin Molecular Biology”第I-III卷Ausubel,R.M.,编(1994)；Ausubel等人,“CurrentProtocols in Molecular Biology”,John Wiley and Sons,Baltimore,Maryland(1989)；Perbal,“A Practical Guide to Molecular Cloning”,John Wiley&Sons, New York(1988)；Watson等人,“Recombinant DNA”,Scientific American Books,New York；Birren等人(编)“Genome Analysis:A Laboratory Manual Series”,第1-4卷,Cold SpringHarbor Laboratory Press,New York(1998)；在美国专利号4,666,828、4,683,202、4,801,531、5,192,659 和5,272,057中阐述的方法；“Cell Biology:A Laboratory Handbook”,第I-III卷Cellis,J.E.,编(1994)；“Culture of Animal Cells-A Manual of BasicTechnique”，Freshney,Wiley-Liss,N.Y.(1994),第三版；“Current Protocols inImmunology”第I-III卷Coligan J.E.,编(1994)；Stites等人 (编),“Basic and ClinicalImmunology”(第8版),Appleton&Lange, Norwalk,CT(1994)；Mishell和Shiigi(编),“Selected Methods in Cellular Immunology”,W.H.Freeman and Co.,New York(1980)；可利用的免疫测定被广泛地描述在专利和科学文献中，参见，例如，美国专利号3,791,932、3,839,153、3,850,752、3,850,578、3,853,987、3,867,517、3,879,262、3,901,654、 3,935,074、3,984,533、3,996,345、4,034,074、4,098,876、4,879,219、5,011,771 和5,281,521；“Oligonucleotide Synthesis”Gait,M.J.,编(1984)；“Nucleic Acid Hybridization”Hames,B.D.,和Higgins S.J.,编(1985)；“Transcription and Translation”Hames,B.D.,和Higgins S.J.,编(1984)；“Animal Cell Culture”Freshney,R.I.,编(1986)；“Immobilized Cells and Enzymes”IRL Press,(1986)；“A Practical Guide toMolecular Cloning”Perbal,B.,(1984)和“Methods in Enzymology”第1-317卷,Academic Press；“PCR Protocols:A Guide To Methods And Applications”, AcademicPress,San Diego,CA(1990)；Marshak等人,“Strategies for Protein Purification andCharacterization-A Laboratory Course Manual”CSHL Press(1996)；它们都通过引用并入。在本文件中提供了其它一般参考文献。
实施例1
凝血因子IX的制备和利用
重组FIX分子的克隆和表达：
在我们的真核表达载体pCI-neo(Promega,目录号E1841)中构建了因子IX克隆。从“OriGene”(RC219065)订购智人凝血因子IX的ORF克隆。从Sigma-Genosys订购引物。
301-1-pCI-neo-p200-11(因子IX-ctp x2)的构建：
引物101:5'GTTTAGTGAACCGTCAGAAT 3'(SEQ ID NO:36)
引物103R:5'TTGAGGAAGATGTTCGTGTA 3'(含有因子IX的SspI位点)(SEQ ID NO:37)
用引物101和引物103R和质粒DNA、因子IX的cDNA克隆 (OriGene”RC219065)(作为模板)，进行PCR反应；作为PCR扩增的结果，形成了约1085bp产物(pcr 10)，并从凝胶纯化(含有因子IX序列的氨基端的片段)。
引物98:5'ATTACAGTTGTCGCAGGTGA 3'(SEQ ID NO:38)
引物99R:5'GCTGGAGCTAGTGAGCTTTGTTTTTTCCTT 3'(SEQ ID NO:39)
引物100:5'GCTCACTAGCTCCAGCAGCAAGGCC 3'(SEQ ID NO:40)
引物27R:5'TTTTCACTGCATTCTAGTTGTGG 3'(SEQ ID NO:41)
进行3个PCR反应。用引物98和引物99R和质粒DNA、因子IX的 cDNA克隆(OriGene”,RC219065)(作为模板)，进行第一个反应；作为 PCR扩增的结果，形成了约540bp产物。
用引物100和引物27R和402-2-p72-3的质粒DNA(hGH-CTP-CTP) (作为模板)，进行第二个反应；作为PCR扩增的结果，形成了约258bp 产物。
用引物98和27R以及前述2个反应的产物的混合物(作为模板)，进行最后的反应(pcr 3)；作为PCR扩增的结果，形成了约790bp产物，并将其连接进TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)中。分离SspI-EcoRI 片段(TA 3-3)。
用引物101和引物27R以及pcr 10的产物与得自pcr 3的SspI-EcoRI 片段的混合物(作为模板)，进行另一个PCR反应(pcr 12)；作为PCR扩增的结果，形成了约1700bp产物(因子IX-ctp-ctp)，并将其连接进TA克隆载体(Invitrogen，目录K2000-01)(lig 180)。
在因子IX序列中发现了一个错误，所以用正确的DNA序列替换片段，以便形成因子IX-ctp-ctp的插入片段。
用SspI和XbaI消化TA-pcr 3-3，并分离大片段(载体)。用SspI和 XbaI消化TA180-4，分离小片段(插入片段)并连接至分离的用SspI和XbaI 消化的TA-pcr-3-3的大片段。用Sal I和NotI消化新质粒TA-183-2，并分离因子IX-CTP-CTP插入片段(约1575bp)。将该片段插入真核表达载体pCI-neo(用Sal I和Not I消化)中，以产生301-2-p200-11克隆。
pCI-dhfr-因子9-ctpx2(p223-4)构建：用SmaI和NotI消化载体 pCI-dhfr(p6-1)。用ASisI F.I.和NotI消化因子IX-CTP-CTP(p200-11)。连接2个片段。
pCI-dhfr因子9-ctp x3(p225-7)构建：用XbaI和ApaI消化载体 pCI-dhfr OXM-CTP×3(p216-4)。用XbaI和ApaI消化因子IX-CTP-CTP (223-4)。连接2个片段。
pCI-dhfr因子9-ctp x3T148A(p243-2)构建：质粒p225-7含有在位置 148处的苏氨酸，因为FIX的更常见形式含有在该位置处的丙氨酸，使用定向诱变方法将Thr替换为Ala。
引物75:ctcccagttcaattacagct(SEQ ID NO:42)
引物122r:ggaaaaactgcctcagcacgggtgagc(SEQ ID NO:43)
引物123:gtgctgaggcagtttttcctgatgtggactat(SEQ ID NO:44)
引物124r:caacacagtgggcagcag(SEQ ID NO:45)
进行3个PCR反应。用引物75和引物122r和质粒DNA p225-7(作为模板)进行第一个反应；作为PCR扩增的结果，形成了约692bp产物，并从凝胶纯化。用引物123和引物124r和质粒DNA p225-7(作为模板) 进行第二个PCR反应；作为PCR扩增的结果，形成了约237bp产物，并从凝胶纯化。用引物75和124r以及前述2个反应的产物的混合物(作为模板)进行第三个重叠PCR反应；作为PCR扩增的结果，形成了约910bp 产物。用XbaI和NsiI消化该重叠PCR产物，并重新连接进p225-7质粒(用 XbaI和NsiI消化过)，以产生因子IX-ctpx3T148A(被命名为p243-2)。
FIX-4CTP(p259-4)构建：用限制酶Apa1和Xba1从oxym-4CTP (p254-3)分离3.5CTP片段。用限制酶Apa1和Xba1从FIX-3CTP(p243-2) 分离FIX+0.5CTP片段。连接2个片段。
FIX-5CTP(p260-18)构建：用限制酶Apa1和Xba1从oxym-5CTP (255-1)分离4.5CTP片段。使用酶Apa1和Xba1从FIX-3CTP(p243-2)分离FIX+0.5CTP片段。连接2个片段。
将Dg44细胞铺板于100mm组织培养皿中，并培养至50-60％汇合。使用在无蛋白培养基(Invitrogene CD Dg44)中的FuGene试剂(Roche)，将共计2μg(微克)的FIX cDNA用于转染一个100mm平板。在转染后48小时除去培养基，并用不含核苷且存在800μg/ml G418(新霉素)的无蛋白培养基(Invitrogene CD Dg44)替换。14天后，将转染的细胞群体转移进T25组织培养瓶，并继续选择额外10-14天，直至细胞开始生长为稳定的克隆。选择高表达的克隆。将大约2x107个细胞用于接种在1700cm2滚瓶 (Corning，Corning NY)中的300ml生长培养基，其补充了5ng/ml维生素 K3(亚硫酸氢钠甲萘醌；Sigma)。在细胞存活力迅速下降至约70％之后，收集生产培养基(收获物)。首先澄清所述生产培养基，然后浓缩大约20倍，并使用流式过滤盒(10KDa MWCO；Millipore Corp.)用PBS透析。
FIX抗原水平的确定：使用AssayMax Human FIX ELISA试剂盒 (AssayPro-EF1009-1)确定FIX-CTP收获物抗原水平。计算的蛋白浓度是在两个独立运行中的三个不同稀释度的平均值(图1A，表1)。
表1:计算的蛋白浓度
FIX SDS-PAGE-免疫印迹：使用Precision Plus双色蛋白标志物 (Bio-Rad)，将FIX-CTP收获物或纯化的rhFIX(American Diagnostics)、 100ng蛋白加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。使用抗-人FIX多克隆抗体和抗- 人γ羧化单克隆抗体(AmericanDiagnostics)，通过蛋白免疫印迹进行 SDS-PAGE分析。如以前所报道的，rhFIX迁移在55KDa，而与两个CTP 融合的FIX迁移在75KDa。FIX-CTP蛋白的两种变体均被证实是γ羧化的，即对于FIX活性和功能而言必需的翻译后修饰(图1B)。
FIX产色活性的确定：使用商购可得的产色活性试验试剂盒 BIOPHEN(HyphenBioMed 221802)，进行FIX-CTP收获物相对于rhFIX 蛋白(American Diagnostics)的体外效能的对比评估。在有凝血酶、磷脂、钙存在下，过量的FXIa会激活取样的FIX成为FIXa。FIXa与凝血酶、激活的FVIII:C(过量提供)、磷脂和钙形成酶复合物，并将存在于测定系统中的因子X激活为FXa。该活性与作为限制因子的FIX的量直接相关。然后通过它在FXa产色底物(pNA)上的比活性，测量产生的FXa。产生的 pNA的量与FIXa活性直接成比例。将rhFIX和FIX-CTP收获物系列稀释，并通过将FIX收获物的剂量响应曲线与由rhFIX或人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。FIX的平均EC50是21ng/ml，而FIX-(CTP)2收获物的计算的EC50为382ng/ml，FIX-CTP收获物的计算的EC50为1644 ng/ml。观察到FIX-(CTP)2收获物的酶活性的大约15倍降低(图2)。
FIX凝血活性(aPTT)：激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)是凝血级联的内源且共同途径的完整性的量度。所述aPTT是在加入内源性途径激活物磷脂和钙之后血浆发生凝结所需的时间(以秒计)。所述aPTT试剂被称作部分促凝血酶原激酶，因为组织因子没有与磷脂一起被包括，它是与凝血酶原时间(PT)试剂一起。所述激活物会启动该系统，然后内源性途径的剩余步骤在有磷脂存在下发生。参考aPTT范围随实验室不同而变化，但是经常在27-34秒范围内。
该测定的原理是，通过加入rhFIX来定量FIX-CTP收获物的恢复FIX 除去的人血浆的凝血活性的能力。将300μl的FIX缺陷的人血浆与100μl rhFIX或FIX-CTP收获物混合并系列稀释。在37℃温育60秒之后，将促凝血酶原激酶、CaCl2和磷脂加入混合物中，确定以秒为单位的凝固时间(由 American Medical Laboratories进行)。通过将FIX收获物的剂量响应曲线与由rhFIX或人血浆组成的参考制剂进行对比，评估效能。1单位的FIX 活性对应于等于1ml正常人血浆的活性的FIX浓度。给出的aPTT结果指示，FIX-(CTP)2表现出与rhFIX相比其比凝血活性的5.7倍降低(表2)。此外，aPTT结果与产色活性体外测定一起提示，FIX-(CTP)2收获物具有与FIX-CTP收获物相比提高的酶活性(表2)。在优化表达系统(即用弗林蛋白酶共转染和优化维生素K3培养基浓度)之后，可以获得提高的FIX-CTP 蛋白活性，所述表达系统在用弗林蛋白酶超转染以后被强化(数据未显示)。
表2:FIX凝血活性
药代动力学研究：以75μg/kg体重的剂量，将rhFIX (American Diagnostic)和FIX-CTP收获物在单次静脉内注射中施用给 Sprague-Dawley大鼠(每种物质6只大鼠)(表3)。
表3:操作的PK研究计划
可替代地，在给药后0.083、0.5、1.5、4、8、24、48和72小时，从3 只大鼠眶后抽取血液样品。在取样后立即制备血浆，并在分析之前在-20℃储存。通过FIX ELISA-特异性的测定(AssayPro)，定量FIX浓度。计算每种蛋白的药代动力学分布，其代表每个时间点3只动物的平均值(图3)。使用PK Solutions 2.0软件计算终末半衰期。表4总结了在不同取样时间点观察的FIX浓度。
表4:观察的FIX浓度
在表5中总结了PK谱和终末半衰期的概要。FIX-CTP收获物表现出与rhFIX相比改善的T1/2β值(分别为2和5倍增加)。由于在FIX给药收集中，在24小时的动物血清浓度低于定量限(BLQ)，因此不计算额外的PK 参数。
表5:PK参数的概要
在该研究中，描述了用于在保留治疗效能的同时延长FIX半衰期的新方案。将CTP肽添加给活性蛋白具有干扰蛋白活性的有害可能性。因此，通过在FIX的C-端添加CTP序列而产生活性重组FIX-CTP是意外的。
免疫亲和纯化的FIX-CTP-CTP的表征
FIX-CTP-CTP纯化
为了评价具有增加的活性的高等级含量的蛋白(其PK谱模仿临床场合且可以外推至临床场合)，FIX-CTP-CTP是在它的羧基端用2个串联 CTP单元修饰的FIX。使用基质结合的单克隆抗体(American Diagnostics 目录号3570MX)纯化FIX-CTP-CTP，所述单克隆抗体针对存在于FIX的 N-端区域中的γ羧基谷氨酰基(Gla)残基。使所述单克隆抗体结合Sepharose CL-4B。将浓度为88μg/ml的FIX-CTP-CTP收获物在20mM Tris、150Mm NaCl和10mM EDTA(在PH＝7.4)中透析。加样速度为0.5ml/min，使用20Mm Tris-HCl、350mM NaCl和50mM CaCl进行洗脱，将未结合的级分再循环5次。最后，将洗脱级分用PBS透析、合并(pulled)并浓缩。
FIX抗原水平的确定：使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号FIX-AG RUO)确定FIX-CTP收获物、FIX-(CTP)2收获物和 FIX-(CTP)2纯化的蛋白水平。计算的蛋白浓度(μg/ml)是两个独立运行的平均值(图4，表6)。
表6:计算的蛋白浓度
另外，通过Bradford测定来定量FIX-CTP-CTP。计算的浓度为 202μg/ml，其与通过人FIX ELISA得到的浓度类似。
SDS-PAGE印迹：使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将 FIX-CTP-CTP收获物、未结合的级分和纯化的蛋白加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。通过用考马斯蓝试剂(800ng蛋白)将凝胶染色，进行SDS-PAGE 考马斯分析，用100ng蛋白、抗-人FIX多克隆抗体(Ab)和抗-人γ羧化单克隆Ab(American Diagnostics目录号499和目录号3570)进行蛋白免疫印迹。免疫亲和纯化规程在减少杂质的同时显著地富集FIX-CTP-CTP部分 (图5)。
N-端测序：将FIX-CTP-CTP纯化的蛋白通过12％Tris-甘氨酸 SDS-PAGE进行分离，随后电印迹在PVDF膜上。切下目标泳带，将其置于纯化的Biobrene处理过的玻璃纤维滤器上。通过Edmann降解使用装备有140C HPLC微梯度系统的脉冲液体蛋白测序仪，进行N-端序列分析。 N-端测序揭示，FIX-CTP-CTP是不完全的和完全的前肽裂解的蛋白的混合物。经证实不充分的前肽裂解会降低FIX凝血活性。通过与弗林蛋白酶一起共转染，可以改进前肽裂解方法。
FIX产色活性的确定：使用商购可得的产色活性试验试剂盒 BIOPHEN(HyphenBioMed 221802)，进行FIX-CTP-CTP纯化的蛋白相对于rhFIX(American Diagnostics)和人正常血浆集合的体外效能的对比评估。在有凝血酶、磷脂和钙存在下，过量的FXIa激活FIX成为FIXa。 FIXa与凝血酶(过量提供)、磷脂和钙形成酶复合物，并将存在于测定系统中的因子X激活为FXa。该活性与作为限制因素的FIX的量直接相关。通过它对FXa产色底物(pNA)的比活性，测量产生的FXa。产生的pNA 的量与FIXa活性直接成比例。将rhFIX、人血浆和FIX-CTP-CTP系列稀释，通过对比剂量响应曲线来评估效能(图6)。rhFIX的平均EC50是68.74ng/ml，而FIX-CTP-CTP的计算的EC50为505ng/ml。观察到 FIX-CTP-CTP的酶活性相对于重组FIX的大约7倍下降和相对于正常人合并的血浆的16.5倍下降。通过N-端前肽的不充分裂解(通过N-端分析来鉴定)，可以解释该降低的活性。
FIX凝血活性(aPTT)：激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)是凝血级联的内源且共同途径的完整性的量度。所述aPTT是在加入内源性途径激活物磷脂和钙之后血浆发生凝结所需的时间(以秒计)。
该测定通过加入rhFIX来定量FIX-CTP-CTP蛋白的恢复FIX除去的人血浆的凝血活性的能力。将300μl的FIX缺陷的人血浆与100μl rhFIX、 FIX-CTP-CTP(FIX-CTP-CTP(CTP以串联形式位于C-端))或正常血库人血浆混合并进一步稀释。在37℃温育60秒之后，将组织因子(TF)、CaCl2和磷脂加入混合物中。确定以秒为单位的凝固时间。通过将FIX-CTP-CTP的剂量响应曲线与rhFIX或人血浆的参考制剂进行对比，评估效能。将1 单位的FIX定义为等于1ml人正常血浆的活性的FIX的量。
aPTT结果指示，FIX-CTP-CTP凝血活性与正常血库人血浆相比仅低 1.4倍，且与rhFIX类似。所述aPTT结果与产色活性体外测定一起提示， FIX-CTP-CTP纯化不会损害其活性。
FIX-CTP-CTP的药代动力学活性：以100μg/kg体重的剂量，将纯化的FIX-CTP-CTP、rhFIX(American Diagnostic)以及含有FIX-CTP-CTP 和FIX-CTP的收获物在单次静脉内注射中施用给Sprague-Dawley大鼠(每种物质8只大鼠)(表7)。
表7:PK研究概要
可替代地在给药后0.083、0.5、2、4、7 10、24、48和72小时从4只大鼠眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.32％)，并在分析之前在-20℃储存。使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals)，定量FIX浓度。计算每种蛋白的药代动力学分布，为每个时间点的4只动物的平均值(图7)。使用PK Solutions 2.0软件计算终末半衰期。表8总结了在不同取样时间点观察的FIX浓度。
表8:观察的FIX浓度
PK参数的总结呈现在表9中。
表9:PK参数的总结
FIX-CTP-CTP收获物表现出与FIX-CTP收获物相比改善的PK谱。此外，纯化的FIX-CTP-CTP表现出与rhFIX相比T1/2β值的3倍增加和 AUC的4.5倍增加。
与串联的CTP分子融合的分泌型FIX相对于单个CTP的融合的减少量似乎是由于额外CTP的添加，并且通过ELISA检测没有降低，因为 Bradford纯化的FIX-CTP-CTP的计算浓度与ELISA计算的浓度类似。
FIX-CTP-CTP凝血活性与合并的人血浆类似；但是，与rhFIX或合并的人血浆相比，其体外产色活性显著更低。将产色活性测定报告为与凝固测定相比非常灵敏的测定。FIX-CTP-CTP的活性降低的原因可以变化。 CTP的添加可以降低FIX对FXIa的亲和力或减少转录后修饰(例如12-10 个GLA残基和前肽裂解)。N-端分析揭示，FIX-CTP-CTP前肽的蛋白水解性裂解在分泌之前未充分完成。由于该转录后修饰对于蛋白的正常酶活性而言是关键性的，因此与Furine-PACE质粒共转染是有利的，且可以改善FIX-CTP-CTP活性。
最后，在大鼠中的FIX-CTP-CTP对比PK研究证实，两个串联的CTP 与FIX的C-端的融合会产生具有延长的半衰期的FIX。
FIX除去的小鼠模型：为了评估体内活性，获得FIX敲除的小鼠，并建立繁育群。将10μg市售的重组hFIX或rFIX-(CTP)2 (FIX-CTP-CTP)注射进被麻醉的FIX敲除的小鼠(22-28g)的尾静脉中。注射的蛋白的量等于正常血浆中需要的FIX的浓度(5μg/ml)。在特定时间点，从截断的尾巴采集血液样品到肝素化的毛细管中。通过ELISA来评估血浆样品的FIX水平，通过aPTT凝固测定来测量效力。
增加FIX前肽裂解效力：将CTP肽cDNA融合至人FIX cDNA的3’末端。将表达对应的rFIX和弗林蛋白酶的构建体共转染进Dg44细胞中；人rFIX cDNA也用弗林蛋白酶质粒共转染作为对照。高水平的FIX的分泌会导致前因子(pro-factor)和成熟因子FIX的混合物的分泌，这归因于细胞中有限量的弗林蛋白酶。表达弗林蛋白酶的载体与表达前因子的载体的共转染会增加回收率并导致充分加工的FIX分泌进培养基中。
在FIX-(CTP)2和弗林蛋白酶共转染之后，产生稳定的克隆，并收集收获物用于前肽裂解评价。使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将100ng蛋白加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。使用抗-人FIX多克隆Ab (American Diagnostics)和抗-前肽多克隆抗体，通过蛋白免疫印迹进行 SDS-PAGE分析。如以前所报道的，rhFIX迁移在55KDa，而与两个CTP 融合的FIX迁移在75kDa。经证实FIX-蛋白的两种变体会经历适当的充分前肽裂解。
为了确定适当的前肽裂解是否会提高FIX-(CTP)2酶活性，进行与弗林蛋白酶共转染的FIX-(CTP)2收获物的产色和凝血活性的对比评估。观察到 FIX-(CTP)2比活性的显著改善，其与rhFIX类似。
综上所述，本文所述的结果提示，FIX-CTP-CTP可以有效地用于治疗血友病B患者。与CTP构建体融合的FIX受益于改善的体内药理学性能，所述性能克服了在某些体外测量中的缺点。该提议的治疗优于以前的治疗，因为降低了输注速率和需要的剂量。
重要的是注意到，当使用白蛋白融合的分子策略来改善FIX半衰期时，重组FIX变得无活性。本新颖的方案可以设计和纯化呈现改善的持久活性的新颖重组FIX-融合蛋白。由于仅仅尺寸修饰不会改善注射的FIX的药代动力学，与FIX融合的CTP会促进药代动力学参数的发现是意外的。高度糖基化的肽-唾液酸残基的存在会稳定所述蛋白，并保护它免于与血管受体的相互作用，而不废除FIX功能的关键性决定簇。
FIX-CTP在血友病B患者中具有与rFIX类似的治疗效果，且需要更低频率的施用。FIX-CTP的单次注射足以在血友病B患者中控制出血发作和减少在外科手术期间需要的注射的次数。
利用CTP技术来开发长效FIX。具体地，通过将至少一个人CTP与 FIX融合，延长重组rFIX分子的半衰期。将重组FIX-CTP在哺乳动物细胞中表达，并在体外和在体内表征。经证实，rFIX-CTP的体外活性与rFIX 相当。在大鼠中的药代动力学和效力研究证实了rFIX-CTP的改善的性能。该研究的结果证实，开发具有与野生型酶类似的止血性能的延长了半衰期的rFIX分子是可行的。
实施例2
纯化的FIX-CTP3相对于FIX-CTP4和FIX-CTP5的对比评估
2.1研究目的
在部分纯化过程以后FIX-CTP4和FIX-CTP5相对于FIX-CTP3的药代动力学参数对比评估。
2.2 FIX-CTP4和FIX-CTP5收获物的生产
使用Excell基因表达系统，在有10ng/L的维生素K3(Sigma, Mennadion)存在下，在Dg44细胞中表达在C-端与4或5个串联CTP序列融合的FIX cDNA(OriGene RC219065)。收集收获物(300ml),过滤并冷冻。
2.3 FIX-CTP3收获物的生产
使用pCI-DHFR载体克隆196、BR-9，在有25ng/L的维生素K3 (Sigma)存在下，在CHO细胞中在内部表达FIX-CTP3。收集收获物并过滤。
因为缺少材料，仅通过Jacalin柱纯化所有FIX-CTP样品(3、4和5 个CTP)。
2.4 FIX抗原水平的确定
使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号FIX-AG RUO)，确定FIX抗原水平。计算的蛋白浓度是4个独立运行的平均值。与另外2种形式相比，FIX-CTP3浓度稍微更高(表10)。
表10：FIX抗原水平
2.5 FIX-CTP考马斯染色和免疫印迹
使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5收获物加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。使用抗-CTP 多克隆Ab(Adar BiotechProduction)或抗-Gla Ab(American Diagnostica)，通过蛋白免疫印迹进行SDS-PAGE分析。
如以前所报道的，与3个CTP融合的FIX迁移在80kDa，而与4或 5个CTP融合的FIX分别迁移在85KDa或90KDa。如预期的，与在Prolor 生产的FIX-CTP3收获物相比，得自Excellgene的FIX-CTP4和FIX-CTP5收获物表现出非常低的γ羧化水平(图8)。
在利用Jacalin柱(糖基化蛋白的免疫亲和纯化)的纯化过程以后，使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)将FIX-CTP3、FIX-CTP4和 FIX-CTP5加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。用考马斯蓝染料进行SDS-PAGE 染色用于样品检测。所有变体表现出干净得多的泳带特性(图9)，从而提示提高的纯度。
2.6 FIX产色活性的确定
使用商购可得的产色活性试验试剂盒BIOPHEN(Hyphen BioMed 221802)，进行完全纯化的(HA柱)FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将所有样品系列稀释，并通过将剂量响应曲线与正常人血浆的参考制剂进行对比来评估效能。 FIX-CTP4和FIX-CTP5与血浆相比降低的产色活性(图10)可以是FIX蛋白的不适当转录后修饰(例如不适当的γ羧化和前肽裂解)的后果，或者可替换地，由于CTP盒的添加。FIX-CTP4和FIX-CTP5活性的波动(表11) 可能由FIX ELISA的不适当定量能力(归因于抗原位点的CTP掩蔽)造成。
表11:样品/血浆EC50比率
2.7药代动力学研究
以250μg/kg体重的剂量，将Jacalin纯化的FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5(分别是组A、B和C)在单次静脉内注射中施用给 Sprague-Dawley大鼠(每个治疗组6只大鼠)。可替代地，在给药后0.083、 0.5、2、5、8、24、48、72和96小时，从3只大鼠在眶后抽取血液样品(表12)。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.38％)，并在分析之前在-20℃储存。
表12:PK研究操作计划
使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals)，定量血浆样品中的 FIX浓度。计算药代动力学分布，其为每个时间点3只动物的平均值。使用PK Solutions 2.0软件计算终末半衰期。下面的表13总结了在不同取样时间点的计算的FIX浓度。
表13:计算的FIX浓度
PK谱和PK参数的概要呈现在下面的表14和图11中。在所有时间点的完整PK分析图谱提示，与FIX-CTP3相比，4或5个CTP盒向FIX 的添加不会增加它的半衰期。在FIX-CTP5施用以后的AUC相对于 FIX-CTP3增加了1.4-1.6倍，这不是统计上显著的。
表14:PK谱和PK参数的概要
由于给药后96小时样品被证实具有非常低的FIX浓度(其在测定的下定量限度)，重新计算终末半衰期，从而提供更精确的和在科学上适当的计算(表15)。根据该计算，得到了FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的半衰期之间甚至更小的差异。
表15:重新计算的终末半衰期
2.8结论：
在该研究中，评估了FIX-CTP3、FIX-CTP4和FIX-CTP5的药代动力学参数和潜在凝血活性。4和5个CTP与FIX的融合没有提供与FIX-CTP3相比优良的或改善的半衰期延长，并观察到降低的产色活性。下面的表16 总结了不同的FIX-CTP融合的变体(1-5个CTP)的半衰期的改善百分比。 CTP与FIX的融合改善了它的药代动力学行为，但是，不可预测的是，该改善是有限的。令人惊奇地，在3、4或5个串联CTP与FIX融合以后，计算出类似的半衰期值。
表16：半衰期的改善百分比的概要
这些数据提示，3个CTP与FIX的融合会产生蛋白半衰期的最大改善，从而证实，FIX-CTP3是在半衰期、结构和潜在凝血活性方面的最佳变体，将其用于进一步临床开发。
实施例3
FIX-/-血友病小鼠模型的FIX-CTP3治疗
如上所述，进行了试验FIX-CTP、FIX-CTP2和FIX-CTP3收获物相对于rhFIX的PK谱和凝血活性的研究。相对于FIX-CTP1和FIX-CTP2收获物或rhFIX，FIX-CTP3表现出改善的PK谱，同时维持它的凝血活性。为了进一步评价该结果，纯化了FIX-CTP3γ-羧基谷氨酸蛋白。在单次静脉内施用以后，与正常大鼠中的rhFIX相比，FIX-CTP3表现出半衰期的3 倍增加和AUC的4.5倍增加。FIX-CTP3表现出降低的体外产色和凝血活性，最可能是由于N-端前肽的不充分裂解和适当的转录后修饰(PTM)，诸如适当的γ羧化。
在当前的研究中，在FIX-缺陷型小鼠中试验了与3个串联CTP融合的人重组FIX的药代动力学和药效动力学性能。
研究目的：
在以类似比活性和剂量(PD的类似比活性和PK的类似FIX常数)单次静脉内施用FIX-(CTP)3以后，在FIX-缺陷型小鼠中确定rFIX-(CTP)3相对于市售rhFIX的药代动力学和药效动力学参数。
FIX-CTP3收获物的生产：
使用Excellgene表达系统，在有25ng/ml维生素K3(Sigma, Mennadion)存在下，在Dg44细胞中表达在C-端与3个串联CTP序列融合的FIX cDNA(OriGene RC219065-Thr 148)。培养了5个含有5升细胞混悬液的单独批次(总计25升)，并在生存力下降至60-70％以后收获。将收获物过滤并在-70℃冷冻。
收获物FIX抗原水平的确定：
使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号FIX-AG RUO)，确定收获物FIX抗原水平。计算每个批次的抗原水平。在不同的批次中维持FIX浓度(表17)。
表17:FIX抗原水平
FIX-CTP3纯化过程：
在短纯化研究以后，进行使用以下3个柱的纯化过程：DEAE Sepharose、HeparinSepharose和HA Bio Rad Ceramic Hydroxyapatite 1 型(40μm)，FIX-CTP3。纯化γ-羧化的富集的蛋白。简而言之：历时4天在4℃融化5升澄清的收获物。对于每个纯化批次，将澄清的收获物(2升) 浓缩4倍，并使用一次用弃的中空纤维筒(具有10KDa的标称分子量截止尺寸)在20mM Tris-HCl(pH 8.2)中透析。该过程(UFDF1)进行2次，并将1升UFDF1加载上DEAESepharose柱，并用20mM Tris-HCl、200 mM NaCl、10mM CaCl2(pH 8.2)洗脱因子IX。将产物用20mM Tris-HCl、 10mM CaCl2(pH 7.5)1:1稀释，并将pH调至7.5，然后加载上HeparinSepharose柱。用20mM Tris-HCl、300mM NaCl和10mM CaCl2(pH 7.5) 进行洗脱。将洗脱的产物浓缩，并使用Pellicon XL盒10KDa截止膜 (UFDF2)在10mM磷酸盐(pH 6.8)中透析。将产物加载上HA柱，并将活化的因子IX的级分用150mM磷酸盐(pH 6.8)洗脱。将纯化产物浓缩至2mg/ml的靶浓度，并在TBS(pH 7.45)中透析，分成等分试样，并在 -70℃储存。
每周1次地将纯化过程重复5次，以便纯化总体积(25升)。将纯化过程命名为HA#6-10。单独地评价每种纯化产物(App#1-5)。在纯化过程结束时，将不同的批次合并，并进一步浓缩至4mg/ml的靶浓度。
FIX-CTP3分析性能：
FIX抗原水平的确定
使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号FIX-AG RUO)，确定FIX-CTP3γ-羧化的富集的蛋白抗原水平。计算的蛋白浓度是两个独立运行的平均值(表18)。
表18:FIX-CTP3抗原水平
SDS-PAGE印迹：
使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将FIX-CTP3γ-羧化的富集的蛋白rhFIX和rFIXa(活化的FIX)加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。通过用考马斯蓝试剂(800ng蛋白)将凝胶染色，进行SDS-PAGE考马斯分析 (图12)。使用100ng含有抗-人FIX多克隆Ab(图12B)、抗-人γ羧化单克隆抗体(American Diagnostics目录号499，3570)(图12C)、抗-FIX前肽多克隆Ab(图12D)和抗-CTP多克隆Ab(图12E)的蛋白，进行蛋白免疫印迹。如以前所报道的，FIX-CTP3迁移在75KDa。
该纯化规程在减少杂质的同时显著地富集了FIX-CTP3部分。由于要求仅收集γ-羧化的FIX-CTP3级分，纯化过程收率是非常低的，在约2-3％的范围内(数据未显示)，如在抗-Gla免疫印迹中所证实的(图12B)。基于考马斯染色和FIX免疫印迹，FIX-CTP3部分仅为约60-70％，并且也检测到额外的较低分子量泳带，据推测含有较低糖基化形式。
FIX-CTP3凝血活性：
FIX-CTP3产色活性：
使用商购可得的产色活性试验试剂盒BIOPHEN(Hyphen BioMed 221802)，进行了FIX-CTP3收获物和FIX-CTP3γ-羧化的富集的蛋白相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将FIX-CTP3收获物和蛋白系列稀释，并通过将剂量响应曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。如以前所证实的，FIX-CTP3收获物的活性比人合并血浆低50 倍(表19，图13)。在FIX-CTP3纯化以后，产色活性显著提高，仅比人合并血浆低4.72倍(表19，图13)。收获物降低的产色活性可以是FIX蛋白变体的不适当转录后修饰(例如不适当的γ羧化和前肽裂解)的后果。在纯化和富集FIX-CTP3γ-羧化的级分以后，活性提高，从而证实了γ-羧化对 FIX活性的重要贡献。
表19:FIX-CTP3产色活性
单阶段凝血测定(aPTT)：
激活部分促凝血酶原激酶时间(aPTT)是凝血级联的内源且共同途径的完整性的量度。所述aPTT是在加入内源性途径激活物磷脂和钙之后血浆发生凝结所需的时间(以秒计)。该测定的原理是，通过加入rhFIX来定量FIX-CTP3的恢复FIX除去的人血浆的凝血活性的能力。将200μl FIX- 缺陷的人血浆与25μg/ml FIX-CTP3混合并在TBS中进一步稀释。在37℃温育60秒之后，将50μl PTT激活物(肌动蛋白FS)和50μl钙25mM加入混合物中，使用CA 1500凝固剂确定以秒为单位的凝固时间(由 Sheba hospital,NationalCoagulation Center使用经验证的aPTT测定进行)。通过将FIX-CTP3与正常人合并血浆的参考制剂的剂量响应曲线进行对比，评估效能。以从覆盖<1-110％的FIX水平的标准曲线内插的活性百分比，表达结果。FIX-CTP3表现出它的凝血活性相对于正常人合并血浆的15-20倍降低，因为在5μg/ml(其为体内的FIX的正常值)的活性被证实为6.5％(表20)。
表20:FIX-CTP3凝血活性
FIX-CTP3也表现出与相比增加的凝固时间(表21和图14)。
表21:对比凝固时间(aPTT)
在PK-PD研究开始之前，Paul Monahan博士在北卡罗来纳大学 (University ofNorth Carolina)在FIX-缺陷型小鼠中独立地进行了另一个凝血测定。aPTT结果提示，FIX-CTP3凝血活性比正常合并的人血浆低 40倍，如适当凝血活性需要的更长时间(以秒为单位测量)和更高浓度所证实的(表22)。
表22:对比凝血活性
通过ELISA计算的FIX-CTP3和的基于FIX抗原水平的比活性(u/ml)分别为4.46和198.9。
通过aPTT测定的优良灵敏度和体内关联性，可以解释在产色测定相对于aPTT测定中证实的计算的FIX-CTP3活性的不一致性。在产色活性测定中，存在过量的试剂和酶，它们可以活化低效的FIX形式。通过使用不同的试剂和自动化的机器，可以解释FIX-CTP比活性值的差异。将在北卡罗来纳大学(University of North Carolina)计算的活性值用于PK-PD 研究设计。
FIXa蛋白检测：
为了证实在纯化过程以后，FIX活化(FIXa)没有发生，使用FIXa BiophenChromogenic Assay(目录号参考221812)进行FIXa检测测定。该测定如前所述使用产色活性级联测量在特定样品中存在的FIXa的量。将 FIX-CTP3和rhFIX稀释，并评价FIXa水平。FIX-CTP3在纯化或贮存过程中没有被活化(表23)。
表23:FIXa检测
FIX-CTP3PK-PD研究：以625μg/kg体重(含有100IU FIX/kg体重) 的剂量，将FIX-CTP3和rhFIX在单次静脉内注射中施用给C57BI FIX-缺陷型小鼠。可替代地在给药后0.25、4、24、48、72和96小时从3只小鼠在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆 (0.32％)，并在分析之前在-20℃储存。评价hFIX抗原水平，并进行详细的PK分析。为了评价FIX-CTP3相对于的延长FIX-缺陷型动物的凝血活性的能力，使用自动化的FIX活性测定来计算从FIX-/-处理过的小鼠收集的柠檬酸盐化的血浆样品中的FIX活性(表24)。
表24:研究概要
*仅PK收集点
**在给药后T＝48的尾静脉出血；组群1和3
FIX-/-小鼠中的FIX-CTP3药代动力学分布
使用人FIX ELISA试剂盒(Affinity Biologicals；目录号FIX-AG RUO)，定量FIX浓度。计算每种蛋白的药代动力学分布，其为每个时间点的3只动物的平均值。下面的表25和图15总结了组群1和3在不同取样时间点的计算的FIX浓度。下面呈现了PK谱和PK参数的总结(表26 和27)。为了验证暴露，还进行了组群#2的PK分析(数据未显示)。
表25:FIX浓度
使用双隔室模块(WinLin软件)来确定AUC0-无穷大、T终末和清除率(CL)。下面在表26中描述了PK参数。
表26：PK性能
3个CTP“盒”向rhFIX的添加会使体内FIX半衰期延长至少2.5倍。在体内FIX-CTP3施用以后，AUC相对于rhFIX增加了2倍。注射了 FIX-CTP3的小鼠表现出与注射了的小鼠相比改善的PK谱。
FIX-缺陷型小鼠中的FIX-CTP3药效动力学分布：
与PK取样平行地，通过aPTT测定，评价了柠檬酸盐化的血浆样品在施用了或FIX-CTP3的FIX-缺陷型动物中的凝血活性，将其转换为活性百分比。将每个收集点的活性百分比计算为当前凝固时间/正常血库小鼠血浆的凝固时间*100。表27总结了在施用或FIX-CTP3以后的活性值。
在FIX-CTP3施用以后，在施用后1小时检测到显著的凝血活性，其达到给药后4小时的96％活性，而的最高活性值为40％(表27，图16)。FIX-CTP3凝血活性维持了更长的时间段，从而证实了延长的活性。治疗的小鼠的凝血活性在晚于36小时的时间点是不可检测的，而FIX-CTP3治疗的小鼠在给药后72小时继续保持可测量的活性(表27，图16)。凝血药代动力学分布百分比的分析提示，FIX-CTP3凝血活性维持显著更长的时段，且它的半衰期是的几乎2倍(表28)。
表27:FIX的活性百分比
表28:凝血活性
9.3 FIX-缺陷型小鼠出血攻击
给FIX-缺陷型小鼠施用100IU/kg或rFIX-CTP3的单次静脉内注射。在给药后48小时轻微剪断尾静脉，并评价尾静脉出血时间 (TVBT)和出血强度(血红蛋白OD)。在达到体内稳态以后15分钟，进行第二次出血攻击，并测量相同的参数。如通过血红蛋白OD值所证实的，在第一次出血攻击以后，施用了FIX-CTP3的动物的出血比出血的强度显著更低(图17)。
因为据以前报道，在血友病小鼠中的第一次出血攻击过程中，出血时间不一定与治疗效力相关，推荐在额外出血以后评价体内稳态。在自发地或手工地停止第一次出血以后，在第一次出血以后15分钟进行第二次出血攻击，并重新测量时间和出血强度。在第二次出血发作过程中，施用 FIX-CTP3的动物具有降低的出血时间和强度，从而证实了FIX-CTP3在以后的时间点是有效的(图18)。
最后，在第二次出血攻击以后进一步观察动物12小时，并记录所有复发的出血事件。施用FIX-CTP3的动物能够在接下来的12小时中维持血液体内稳态，没有复发的出血事件。相比而言，50％的治疗的小鼠具有从尾巴的自发出血发作(表29)。
表29:尾巴横断以后12小时的结果
开发了重组FIX-CTP3(即包含与3个串联CTP“盒”融合的单个FIX 分子的融合蛋白)以解决目前可得到的用于治疗血友病B患者的FIX产品的短半衰期。我们已经证实，rFIX-CTP3在大鼠中(如以前所报道的)和在 FIX-缺陷型小鼠中的消除半衰期一致地为rFIX的2.5-4倍。
不受理论的约束，融合蛋白会通过掩蔽来降低FIX的清除率并保护 FIX免于蛋白酶活性降解，并且降低FIX对肝受体的亲和力。CTP结构域的这些特征一起延长FIX的半衰期。
除了rFIX-CTP3的药代动力学分析以外，我们检查了FIX-CTP3在 FIX-缺陷型小鼠中的药效动力学性能。将rFIX-CTP3和rFIX以可比较的剂量(按单位计)施用，以补偿在FIX-缺陷型小鼠中的凝血缺乏水平。但是， rFIX-CTP3在FIX-缺陷型小鼠中的作用显著延长至给药后至少76小时，从而达到更高的活性峰。与相比，FIX-CTP3凝血活性在1-小时延迟以后开始。可能需要FIX活化，因为3个串联CTP的添加在理论上可能掩蔽活化位点和延迟级联开始。在FIX-CTP3施用以后，观察到100％峰活性，而活性仅为40％。优良的初始活性是一个非常重要的参数，并证实，3个CTP的添加具有提高回收率的可能性。
用于血友病B患者的预防性FIX补偿疗法的目标是，维持1-2％正常凝血活性的血浆水平。尾静脉出血测定是一个模仿人出血体内稳态模型的灵敏体内试验，其测量在低活性值维持出血体内稳态的能力。响应于给药后48小时的尾静脉出血攻击，施用了rFIX-CTP3的动物维持血液体内稳态，具有更短的和严重性更低的出血发作，从而证实了持久的凝血活性。
FIX是一种含有许多功能结构域的复合蛋白，所述功能结构域经历广泛的翻译后修饰。FIX活性的必需翻译后修饰之一是，维生素K依赖性的γ-谷氨酰基羧化酶对Gla结构域中的前12个谷氨酸的γ-羧化。该修饰会促进FIX与磷脂膜的结合，且因此对于它的功能而言是关键性的。没有被γ- 羧化的FIX是无功能的，且因此，γ-羧化是一个限速步骤。
使用瞬时转染的细胞进行该PK-PD研究。对从稳定的优化克隆生产和分泌的稳定FIX-CTP3蛋白进行翻译后修饰的广泛分析评价。
基于呈现的数据，FIX-CTP3凝血因子在接受FIX补偿疗法的常规预防剂量的患者中具有降低注射频率的潜力。预见到，在因子的每次给药以后，rFIX-CTP3可以赋予延长的出血保护，减少治疗出血发作所需的因子的总单位，和/或在外科手术过程中用更少的注射维持充分止血。
实施例4
凝血因子FVII的制备和利用
长效形式的活化的因子VII(FVIIa)凝血因子可用于治疗具有血友病A 和B的患者。FVIIa-CTP3重组蛋白具有如下改善血友病患者的治疗的临床潜力：通过降低输注频率，和甚至通过减少药物负载，从而实现可以显著提高患者生活质量、避免自发性出血发作以及对关节和其它器官的累积损伤的预防性治疗方案。
本文描述了基于FVII与人CTP的融合而具有延长的半衰期的重组 FVIIa-CTP分子的制备。在哺乳动物细胞中表达重组FVIIa-CTP，并在体外和在体内表征。经证实，rFVII-CTP活性与rFVII相当。在大鼠中的药代动力学和效力研究证实了改善的rFVII-CTP的性能。该研究的结果证实，开发具有与野生型酶非常类似的止血性能的延长了半衰期的rFVIIa分子是可行的。
重组FVII分子的克隆和表达：在我们的真核表达载体(pCI-dhfrr)中构建了几种因子VII克隆(图19)。从“Open Biosystems”订购含有智人凝血因子VII的序列的、人MGC验证的FL cDNA克隆(IRCM) (OB-MHS4426)。由Sigma-Genosys合成了具有下述序列的下述引物：引物67:5'CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCC3'(含有因子VII DNA 的5'末端和XhoI的限制位点)(SEQ ID NO:5)；引物68R:5' TCTAGAATAGGTATTTTTCCACATG3'(含有XbaI的限制位点)(SEQ ID NO:6)；引物69:5'TCTAGAAAAAAGAAATGCCAGC3'(含有XbaI 的限制位点)(SEQ IDNO:7)；和引物70R: 5'GCGGCCGCATCCTCAGGGAAATGGGGCTCGCA3'(含有因子VII DNA的3'末端和NotI的限制位点)(SEQ ID NO:8)。
在2组PCR反应中进行克隆。使用含有因子VII序列的cDNA质粒 (OB-MHS4426)作为模板，用引物67和引物68R进行第一个反应；作为PCR 扩增的结果，形成了约534bp产物，将其分离并连接进TA克隆载体 (Invitrogen，目录号:K2000-01)。分离含有因子VII序列的氨基端的XhoI -XbaI片段。使用引物69和引物70R，并再次使用具有因子VII序列的cDNA 质粒(OB-MHS4426)作为模板，进行第二个反应；作为PCR扩增的结果，形成了约813bp产物，将其连接进TA克隆载体(Invitrogen，目录号: K2000-01)。分离含有因子VII序列的羧基端的XbaI-NotI片段。将这两个片段插入我们的真核表达载体pCI-dhfr(三部分连接)中，以产生501-0-p136-1克隆。
将质粒501-p136-1(因子VII在pCI-dhfr载体中)用限制酶XhoI和 KpnI。分离约1186bp的片段。用限制酶KpnI和NotI消化后面连接CTP 序列、终止序列和由GeneArt(0721543)产生的NotI序列的部分因子VII 克隆(1180bp-1322bp)。分离约253bp的片段。将这两个片段插入我们的真核表达载体pCI-dhfr(三部分连接)中，以产生501-1-p137-2克隆。用限制酶XhoI和ApaI消化pCI-dhfr-701-2-p24-2，并分离大片段(载体)。
用限制酶XhoI和ApaI消化pCI-dhfr-501-2-p137-2(因子VII-ctp x1)，并分离约1200bp的插入片段。将所述载体和插入片段连接以产生 501-2-p139-2。将Dg44细胞铺板于100mm组织培养皿中，使其生长至 50-60％汇合。使用在无蛋白培养基(Invitrogen CDDg44)中的FuGene试剂 (Roche)，将总共2μg DNA用于转染一个100mm平板。转染后48小时，除去培养基，并用不含核苷的无蛋白培养基(Invitrogen CD Dg44)替换。14 天后，将转染的细胞群转移进T25组织培养瓶中，继续选择10-14天，直至细胞开始良好生长为稳定的克隆。选择高度表达的克隆，将大约2x107个细胞用于接种在1700cm2滚瓶(Corning，CorningNY)中的300ml生长培养基，所述滚瓶补充了5ng/ml维生素K3(亚硫酸氢钠甲萘醌；Sigma)。在细胞存活力迅速下降至约70％之后，收集生产培养基(收获物)。首先澄清该生产培养基，然后浓缩约20倍，并使用流式过滤盒(10KDaMWCO； Millipore Corp,Billerica,MA)在PBS中透析。
FVII抗原水平的确定
将编码CTP肽的cDNA融合至编码人FVII的cDNA的3’末端。将相应的rFVII构建体转染进Dg44细胞中。作为对照，使用人rFVII cDNA。将生产培养基(收获物)收集、浓缩并进一步评价分泌的重组FVII。通过 AssayMax人FVII ELISA试剂盒(AssayPro)确定rFVII、rFVII-CTP和 rFVII-CTP-CTP抗原水平(图20A)。与天然rFVII相比，rFVII-CTP和 rFVII-(CTP)2的分泌水平无显著差异。
SDS-PAGE印迹
通过加载50ng收获物、纯化的或活化的rFVII蛋白，进行SDS-PAGE 分析。使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将样品加载上 12％Tris-甘氨酸凝胶。使用抗-人FVII单克隆抗体(Ab)(R&D systems)或在兔中产生的抗-CTP多克隆抗体，通过蛋白免疫印迹进行SDS-PAGE分析。
将rFVII抗原水平与在用抗-FVII Ab免疫印迹的SDS-PAGE中检测出的蛋白水平相关联。rFVII-CTP作为单一条泳带迁移，而FVII对照的相应分子量为大约52KDa(数据未显示)。两种蛋白在免疫印迹上均与对 FVII特异性的抗体反应。rFVII-CTP也与对CTP特异性的抗体反应。 rFVII以其酶原形式分泌，没有激活的蛋白的迹象。
FVII产色活性：
使用商购可得的产色试验试剂盒(AssaySense人FVII产色活性测定试剂盒(AssayPro))，确定rFVII、rFVII-CTP和rFVII-(CTP)2收获物活性。对于rFVII-CTP的功能表征和它的被进一步激活(FVIIa)的能力，将浓缩的rFVII-CTP(收获物)置于商购可得的产色试验试剂盒(AssayPro)中，该试剂盒测量TF/FVIIa将因子X激活为因子Xa的能力，所述因子Xa在有 FXa特异性底物存在下释放定量信号。CTP肽在rFVII蛋白的C-端的添加不会削弱FVII丝氨酸蛋白酶活性(图20B，20C)。
FVII凝血活性：
凝血酶原时间(PT)测量凝血的外源性途径。所述PT是在加入外源性途径激活物磷脂和钙之后血浆发生凝固所需的时间(以秒为单位测量)。其用于确定血液的凝固趋势，特别是在华法林剂量、肝损伤和维生素K状况的测量中。凝血酶原时间的参考范围通常为约12-15秒。具体地，所述测定会定量FVII-CTP和FVII-(CTP)2收获物通过添加rhFVII而恢复FVII 除去的人血浆的凝血活性的能力。将300μl FVII-缺陷的人血浆与100μl指定浓度的FVII、FVII-CTP和FVII-(CTP)2收获物混合或与正常血库人血浆混合，并进一步稀释。在37℃温育60秒之后，将组织因子(TF)、CaCl2和磷脂加入混合物中。确定以秒为单位的凝固时间。通过将FVII-CTP和 FVII-(CTP)2收获物的剂量响应曲线与由rhFVII或人合并血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。1单位的活性FVII被定义为等于1ml人正常血浆的活性的FVII的量。在凝血计(Instrumentation Laboratory)上测量 rFVII和rFVII-CTP的PT凝血活性。
如前面证实的，CTP肽在rFVII蛋白的C-端的添加不会损害它的丝氨酸蛋白酶活性，并导致天然因子X和因子IX在人血浆中的起始和活化。在C末端处插入额外CTP以后，丝氨酸蛋白酶活性存在3倍下降(数据未显示)。
药代动力学研究：
以100μg/kg体重的剂量，将rFVII、rFVII-CTP和rFVII-(CTP)2收获物静脉内地施用给Sprague-Dawley大鼠(每种物质6只大鼠)。对于所有体内实验，基于FVII ELISA试剂盒确定各种蛋白的量。对于每种FVII 试验物，通过考虑rFVII相对于rFVII-CTP的分子量差异(其导致不同的摩尔浓度)，计算注射的量。
使用改变的取样方案在眶后抽取血液样品，以使得要定量的取样操作水平的干扰最小化：可替代地，从3只大鼠在30分钟和90分钟、2小时、 6小时和48小时取样，和从剩余的3只大鼠在15分钟、60分钟和1.5小时、4小时、24小时。在取样后立即制备血浆，并在分析之前在-20℃储存。通过FVII ELISA特异性的测定来定量FVII浓度。使用线性梯形法则，计算半衰期和曲线下面积(AUC)。这些清除参数的对比揭示，体内半衰期和 rFVII-(CTP)2AUC显著高于rFVII的相应值(表30)。
表30:PK研究参数
重组FVIIa-CTP的表征：
在活化过程中，FVII在R152处被裂解，从而产生通过单个二硫键连接在一起的重链和轻链结构域。通过离子交换柱纯化过程纯化和激活 rFVIIa-(CTP)2。为了充分评价rFVIIa-(CTP)2，将该蛋白在市售的FVIIa 的还原条件下加载上SDS-PAGE。将重链和轻链结构域分离，它们作为分子量55和25KDa的单独泳带迁移。两种蛋白与对FVII 特异性的抗体反应，但是rFVIIa-CTP的重链特异性地与抗-CTP-特异性抗体反应，从而指示该泳带代表与CTP融合的FVII重链。所述轻链特异性地与抗-γ羧化酶Ab反应。通过FVIIa-特异性的ELISA试剂盒确定FVIIa 蛋白浓度。
FVIIa N-端测序：
将激活的或酶原纯化的蛋白中的rFVII-CTP-CTP通过SDS-PAGE(在 12％Tris-甘氨酸上)分离，随后电印迹到PVDF膜上。切下目标泳带，置于纯化的Biobrene处理的玻璃纤维滤器上。使用装备有140C HPLC微梯度系统的脉冲式液体蛋白测序仪，通过Edmann降解进行N-端序列分析。通过N-端测序进一步验证重组蛋白和适当的前肽裂解的一致。
FVIIa凝血活性：
为了评价FVII-(CTP)2凝血活性，进行激活部分促凝血酶原激酶时间测定(aPTT)。用rFVIIa或rFVIIa-(CTP)2代替FVIII缺陷的血浆样品。将300μl FVII缺陷的人血浆与100μl指定浓度的FVIIa或 rFVIIa-(CTP)2混合或与正常合并的人血浆混合，并进一步稀释。在37℃温育60秒后，将组织因子(TF)、CaCl2和磷脂加入该混合物中。确定以秒为单位的凝固时间。通过将rFVIIa-(CTP)2的剂量响应曲线与由rhFVIIa 或人血库正常血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。1单位的FVIIa 被定义为等于1ml人正常血浆的活性的FVIIa的量。在凝血计 (Instrumentation Laboratory)上测量rFVII和rFVIIa-(CTP)2的aPTT凝血活性。rFVIIa和rFVIIa-(CTP)2的aPTT凝血活性是类似的。
在大鼠中的药代动力学研究：
为了表征给rFVIIa添加CTP对于其长效潜力的影响，在大鼠中进行了对比药代动力学研究。将在TBS中的(rFVIIa)和 rFVIIa-(CTP)2静脉内注射给6只SD大鼠。使用FVIIa ELISA试剂盒检测FVIIa随时间的水平。计算每种蛋白的半衰期和AUC。这些清除参数的对比揭示，rFVIIa-(CTP)2的半衰期、恢复和AUC的体内测量优于的相应值。
FVIIa-CTP体内效力模型(血友病的FVIII-缺陷型小鼠模型)：
为了评估体内活性模型，获得FVIII敲除的小鼠，并建立繁育群。将 10μg市售的重组hFVIIa或rFVIIa-(CTP)2注射进麻醉的 FVIII敲除小鼠(22-28g)的尾静脉。注射的蛋白的量等于正常血浆中需要的 FVIII的浓度(5μg/ml)。在特定时间点从截断的尾巴采取血液样品到肝素化的毛细管中。通过ELISA评价血浆样品的FVIIa水平，通过PTT凝固测定来测量效力。
在该研究中，制备FVII与CTP的融合构建体。该重组蛋白是提供延长的半衰期和治疗效能保留的治疗的基础。
这些结果提示，rFVIIa-(CTP)2在血友病患者中具有与rFVIIa类似的治疗效果。此外，该技术需要较更低频率的给药。似乎rFVIIa-(CTP)2的单次注射足以控制出血发作和减少在外科手术过程中需要的注射的数目。该重组蛋白可以用作长期预防性治疗。
实施例5
纯化的FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的对比评估
5.1研究目的
FVII-CTP4和FVII-CTP5相对于FVII-CTP3的药代动力学参数和凝血活性的对比评估
5.2 FVII-CTP4和FVII-CTP5收获物的生产
使用Excellgene表达系统，在有20μg/L的维生素K3(Sigma, Mennadion)存在下，在Dg44细胞中表达在C-端与4或5个串联CTP序列融合的FVII cDNA。将收获物收集(300ml)，过滤并冷冻。
5.3 FVII-CTP3收获物的生产
使用pCI-DHFR载体，在哺乳动物表达系统CHO细胞中在内部表达 FVII-CTP3。在有25ng/L的维生素K3(Sigma)存在下，在摇瓶中培养稳定的转染的库#71。收集收获物并过滤。
将所有FVII-CTP收获物(3、4和5个CTP)浓缩，并使用Pellicon XL MWCO 10kDa在TBS(50mM Tris,150mM NaCl,pH 7.4)中透析。
5.4 FVII抗原水平的确定
使用人FVII ELISA试剂盒(Zymotest HyPhen)，确定FVII抗原水平 (表31)。计算的蛋白浓度是两个独立运行的平均值。
表31:FVII抗原水平
5.5 FVII-CTP免疫印迹
使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将FVII-CTP3、 FVII-CTP4和FVII-CTP5收获物加载上12％Tris-甘氨酸凝胶(expedeon)。使用抗-CTP多克隆Ab(AdarBiotech Production)或抗-Gla Ab(American Diagnostica)，通过蛋白质免疫印迹进行SDS-PAGE分析。
与3、4和5个CTP融合的FVII分别迁移在80、90和100kDa。如预期的，得自Excellgene的FVII-CTP4和FVII-CTP5收获物含有比在 Prolor生产的FVII-CTP3收获物低的γ羧化含量，因为后一生产过程没有经过优化(图21)。
5.6 FVII体外效能的对比评估
使用商购可得的产色活性试验试剂盒BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)，进行HA纯化的(高度γ羧化的级分)FVII-CTP3、FVII-CTP4和 FVII-CTP5相对于正常人合并血浆的体外效能的对比评估。将所有样品系列稀释，并通过将剂量响应曲线与由正常人血浆组成的参考制剂进行对比来评估效能。FVII-CTP3和FVII-CTP5表现出比合并的正常血浆更低的产色活性(图22)。FVII-CTP4表现出比FVII-CTP3和FVII-CTP5更高的活性，如EC50比率所反映的(表32)。
表32:FVII体外凝血活性
5.7 FVII体外凝血活性：
使用缺乏因子VII的免疫吸附的血浆(Siemens)，在Sheba医学中心(即 IsraelNational Coagulation Center)进行的因子VII(FVII)活性测定是基于凝血酶原(PT)的测定。PT试剂是innovin，在CA 1500仪器中进行测定。FVII正常范围是在55-145％内。
表33:FVII体外产色活性
由于循环FVII在体内的正常水平是约0.5μg/ml，FVII-CTP3和 FVII-CTP5收获物表现出相对于正常人合并血浆降低了3倍的凝血活性；该结果与得到的产色活性相关(表33)。
FVII-CTP4收获物表现出相对于正常人合并血浆增加了3倍的潜在凝血活性，如在产色活性测定中观察到的(表33)。FVII-CTP4的活性百分比远高于FVII-CTP3和FVII-CTP5的活性百分比。ELISA方法的方法限度可能限制FVII-CTP4的抗原水平计算的准确度。
5.8药代动力学研究
为了确定FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5药代动力学(PK)参数，进行了2个药代动力学研究。在第一个研究中，以250μg/kg体重的剂量，将FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5(分别是组A、B和C)在单次静脉内注射中施用给Sprague Dawley大鼠(6只大鼠/治疗)。可替代地在给药后0.083、0.5、2、5、8、24、48、72和96小时，从3只大鼠在眶后抽取血液样品(表34)。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.38％)，并在分析之前在-20℃储存。
表34:药代动力学研究设计–浓缩的收获物
使用人FVII Elisa试剂盒(Zymutest FVII-Biophen)，定量血浆样品中的FVII浓度。计算药代动力学分布，其为每个时间点3只动物的平均值。使用PK Solutions 2.0软件，计算终末半衰期值。下面的表35总结了在不同取样时间点的计算的FVII浓度。下面还呈现了PK谱(图23-24)和PK 参数的总结(表36)。FVII-CTP5表现出比FVII-CTP3和FVII-CTP4优良的特性(表36)。
表35：第一药代动力学研究-FVII浓度
表36:药代动力学分析
与3个CTP相比，4或5个CTP的添加分别使FVII半衰期显著延长了2和3倍(表36)。该优越性在研究的初始部分(0.083-8小时)中更显著，从而提示潜在的提高的蛋白回收率和降低的额外血管清除率。相对于 FVII-CTP3，在FVII-CTP4和FVII-CTP5施用以后的AUC分别增加了3 和4倍。当将4和5个CTP添加至FVII时，也降低了清除率(表36)。
如在研究中观察到的，与3个CTP相比，4和5个CTP的添加在初始和终末半衰期两个方面显著延长了FVII半衰期。由于通过剂量和研究持续时间实现的不同分析方案，在第一个和第二个研究中的半衰期值是不同的，尽管如此，总趋势得到维持。相对于FVII-CTP3，在FVII-CTP4和 FVII-CTP5施用以后的AUC分别增加了2.5和7倍。
5.9结论：
在该研究中，评估了FVII-CTP3、FVII-CTP4和FVII-CTP5的PK参数和潜在凝血活性。4和5个CTP与FVII的融合会提供与FVII-CTP3相比优良的和改善的半衰期、暴露和降低的清除率，同时维持类似的产色和体外凝血活性。这些结果在不同蛋白浓度观察到，且对于收获物和纯化的蛋白而言是一致的。当评价CTP在C末端与FVII融合的总体效应时，1-5 个CTP的融合会以与CTP成比例的方式显著增加FVII的半衰期和AUC，这提示，随着分子的CTP部分增加，FVII寿命和稳定性显著提高，同时维持它的初始体外凝血活性，如在下文中在表37中所总结的。
表37:
如以前所报道的，在人类和动物中，FVII半衰期与活化形式的FVII (FVIIa)的半衰期相关。因此，预见到，在CTP融合以后，会得到活化形式的半衰期的类似改善。
实施例6
在FVIII-缺陷型血友病小鼠中的FVII-CTP3可行性研究
进行了在上文中描述的试验FVII-CTP、FVII-CTP2和FVII-CTP3收获物相对于市售FVII的PK谱和凝血活性的研究。相对于FVII-CTP和 FVII-CTP2收获物或rhFVII，FVII-CTP3表现出改善的PK谱，同时维持它的凝血活性。为了进一步表征FVII-CTP3体外和体内性能，制备了表达和分泌该蛋白的微型稳定库，并开发了纯化和活化方法。
在当前的研究中，在FVIII-缺陷型小鼠中试验了FVIIa-CTP3的药代动力学和药效动力学性能。评价了该蛋白的PK谱。建立了基于FVIIa比活性的PK谱，并与市售产品进行对比。另外，试验了在尾静脉横断(存活研究)以后FVIIa-CTP3在FVIII-缺陷型小鼠中诱导凝血的持久体内止血能力。
研究目的：
评价在以类似活性剂量单次静脉内施用以后，FVIIa-CTP3相对于市售的rhFVIIa在FVIII-缺陷型小鼠中的药代动力学和药效动力学参数
确定在以类似活性剂量单次静脉内施用FVIIa-CTP3和并随后进行尾静脉横断攻击(存活研究)以后，FVIIa-CTP3在FVIII-缺陷型小鼠中在体内维持体内平衡的能力
FVII-CTP3收获物的生产：
使用pCI-DHFR载体在Dg44细胞中在内部表达FVII-CTP3。在有25 ng/L的维生素K3(Sigma)存在下，在摇瓶中培养稳定的转染的库#71。培养细胞混悬液，并在生存力下降至60-80％以后收获。将收获物过滤，并在-70℃冷冻。
收获物FVII抗原水平的确定：
使用人FVII ELISA试剂盒(Zymotest HyPhen)，确定FVII抗原水平 (表38)。计算每个合并的收获物批次的抗原水平。
表38:FVII-CTP3抗原水平
FVII-CTP3纯化过程(图25)
过程概要
在短纯化研究以后，进行使用2个柱的下述纯化过程。VII-Select亲和柱(GE)和Ceramic Hydroxyapatite 1型(HA),40μm(Bio Rad)，纯化 FVII-CTP3γ-羧化的富集的蛋白。通过将纯化的FVII-CTP3在有CaCl2存在下在2-8℃温育过夜，诱导自活化。该纯化过程是处于它的最终开发阶段且正在优化中，因而纯化步骤的一部分在2个批次中是不同的。
使用10kDa中空纤维或Pellicon盒的超滤/渗滤(UFDF)
将澄清的收获物在4℃融化度过周末(2-3天)。
在批次31中，使用具有10KDa分子量截止值的中空纤维筒(GE Healthcare目录号UFP-10-C-4X2MA)，将澄清的收获物(12升)浓缩4倍(在2个连续批次中)。将浓缩的收获物在1-2体积的TBS(50mM Tris 150mM NaCl pH 7.4)中渗滤。
在批次38中，使用具有10KDa分子量截止值的Pellicon 2(Millipore) 盒，将澄清的收获物(8.5升)浓缩4倍。将浓缩的收获物直接加载上 VII-Select柱。
两次超滤均在冰上用冰冷的缓冲液进行。在加载之前将UFDF样品进行0.22μm过滤。
捕获在FVII-Select柱上
将UFDF或浓缩的收获物加载上VII-Select柱(XK16/20,CV 18ml)，用TBS(pH 7.4)预平衡。用50mM Tris-HCl、0.5M NaCl(pH 7.5)洗涤柱，并用50mM Tris-HCl、1M NaCl 50％(v/v)、丙二醇(pH 7.5)洗脱 FVII-CTP3。用相同的柱，在2个连续循环中进行该过程。
在Ceramic Hydroxyapatite柱上基于γ羧化的分离
将洗脱的产物用10mM磷酸钠(pH 6.8)1:10稀释，并加载上CeramicHydroxyapatite柱(XK16/20,CV 24ml)。用59mM磷酸钠(pH 6.8)洗涤柱，并用500mM磷酸钠(pH 6.8)洗脱γ-羧化的因子VII的富集级分。在相同柱上在2个连续循环中进行该过程。在每个批次，将2个循环的洗脱液合并，并浓缩至1.7-2mg/ml，并用20mM Tris-HCl、100mMNaCl (pH 8.2)渗滤以减小体积和制备用于活化步骤的材料。
FVII活化
将纯化的FVII-CTP3稀释至1mg/ml，并在20mM Tris-HCl、100mM NaCl和1mM CaCl2(pH 8.2)中在2-8℃温育24小时。通过缓冲液更换 (UFDF)为初步制剂缓冲液(20mM柠檬酸盐,240mM NaCl,13.3mM甘氨酸,pH 6.9)来终止活化。
FVII-CTP3和FVIIa-CTP3分析性能：
SDS-PAGE和蛋白质印迹
使用Precision Plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将纯化的FVII-CTP3和FVIIa-CTP3加载上12％Tris-甘氨酸凝胶。通过用考马斯亮蓝试剂(5或 10μg蛋白/泳道)将凝胶染色，进行SDS-PAGE考马斯分析。使用抗-人FVII 多克隆Ab(R&D systems；AF2338)、抗-人γ羧化单克隆抗体(American Diagnostics目录号499,3570)和抗-CTP多克隆Ab，进行蛋白质印迹分析 (1μg蛋白/泳道)。在还原条件下，FVII-CTP3迁移在75KDa，并且 FVIIa-CTP3作为2个主要泳带迁移：在50kDa的重链和在25kDa的轻链，在图26中分别表示为泳带2和3。
该纯化方法在减少杂质的同时显著地富集了FVII-CTP3部分。纯化过程产率是25-30％FVII(根据ELISA)。在纯化过程中丢失的大多数蛋白具有低FVII产色活性或没有活性。基于考马斯染色的SDS-PAGE，还原的 FVIIa-CTP3不仅含有预测的带。迁移至约75kDa的带代表非活化的FVII (图26,带1)。该带由2个具有微小分子量差异的带组成，它们可能反映了不同的γ-羧化含量。观察到具有低于20kDa的分子量的额外带。这在以前被报道为重链的降解产物。
FVII-CTP3产色活性：
使用商购可得的产色活性试验试剂盒BIOPHEN(Hyphen BioMed 221304)，进行FVII-CTP3收获物、过程中级分s和纯化的FVII-CTP3相对于人血库正常血浆的体外效能的对比评估。将FVII-CTP3收获物和蛋白系列稀释，并通过将剂量响应曲线与正常人血浆的参考制剂进行对比来评估效能。在FVII-CTP3纯化以后，产色活性显著改善，并且非活性级分主要通过HA柱得到分离(图27)。在蛋白质印迹中观察到FVII产色活性和FVII检测与单克隆抗-Gla抗体之间的强关联。由收获物的EC50值反映的 FVII产色活性的效能受羧化的和未羧化的FVII级分影响。在纯化和富集 FVII-CTP3γ-羧化的级分之后，活性提高，从而证实γ-羧化对FVII活性的重要贡献(图27)。该参数对于适当的FVII体内活性而言是关键性的，并且将在克隆开发程序中进一步实现。
通过A280的蛋白测定
使用ProtParam算法(http://web.expasy.org/protparam)，计算 FVIIa-CTP3和的理论消光系数。所述计算是基于氨基酸序列。 FVII-CTP3和的计算的消光系数分别为1.186和1.406。这些值代表在280nm为1g/L的吸光度。
2种蛋白之间的消光系数差异仅源自FVIIa-CTP3与相比的分子量增加，因为CTP缺少芳族残基和半胱氨酸残基，因而不会对吸光度做出贡献。
从VII-Select柱的洗脱开始，将通过A280的蛋白测定用于最终的FVII 和用于纯化的过程中样品。
FVIIa抗原水平的确定
使用人FVIIa ELISA试剂盒(IMUBIND,American Diagnostica)，确定 FVIIa抗原水平。计算每个批次的抗原水平。但是，该工具不用于确定注射剂量，因为它不代表活性产物的量。
FVIIa-VIIa-rTF的凝血测定
FVIIa源自单链FVII的链内裂解。天然组织因子(TF)是FVIIa的一种辅因子。在结合TF以后，FVII会介导因子X活化为Xa，同时它自身转化成FVIIa。可溶性组织因子是天然组织因子的细胞外部分。它不再可以通过自活化而活化FVII，但是与组织因子结合的FVIIa可以将FX活化为 FXa。
在该测定中使用的重组的可溶性组织因子(rsTF)利用FVIIa特异性来构建FVIIa凝血试验。在有FVIIa、钙和磷脂存在下，rsTF会导致血浆的凝固，而不会将FVII活化为FVIIa。
在该系统中观察到的凝固时间与试验样品中的FVIIa含量具有反相关，FVII在样品中的存在没有干扰。
由Omri Laboratories(Nes-Ziona,Israel)执行该测定。评价了(在重构之后)和FVIIa-CTP3(在每个研究之前)的FVIIa 活性。活性与在瓶上报告的预期活性没有关联，但是差异可能是由于活性评价的不同方案。表39总结了每个体积的FVIIa凝血活性，没有考虑蛋白浓度。
表39:分批产品的FVIIa凝血活性
FVIIa-CTP3的比活性
基于A280来计算FVIIa比活性(将其计算为，活性/ml除以蛋白浓度)，并呈现在表40中。当对比2种存在分子量差异的分子的比活性时，必须做出补偿，以便将活性标准化(即因为所述分子量差异，在1mg中的活性部位的数目是在FVIIa-CTP3中的1.185倍)。在下述方程式中呈现了换算因子的计算：
表40:相对于 的FVIIa-CTP3比活性
FVIIa-CTP3 PK-PD研究：
研究概要
以6.4E6U/kg体重(160,000U/动物)的剂量将FVIIa-CTP3和rhFVIIa (NS)在单次静脉内注射中施用给C57B FVIII-缺陷型小鼠。可替代地在给药后0.166、0.5、2、4、8、12、24、34、48、58和72小时，从4只小鼠在眶后抽取血液样品(表41)。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.32％)，并在分析之前在-20℃储存。评价FVIIa凝血活性水平，并进行详细的PK分析。由Omri Laboratories(Nes-Ziona,Israel)进行研究。
表41:研究概要
FVIII-缺陷型小鼠中的FVIIa-CTP3PK谱
使用VIIa-rTF试剂盒(Stago,Parsippany,NJ)，定量血液样品中的FVIIa活性。计算每种蛋白的药代动力学分布，其代表在每个时间点 4只动物的平均值。图28呈现了整个实验中FVIIa的PK谱。在表42中呈现了FVIIa回收率。在表43中呈现了PK参数的总结。
表41总结了施用或FVIIa-CTP3以后的凝血活性值。 FVIIa-CTP3和在给药后半小时达到最大活性。的最高活性值仅达到FVIIa-CTP3的最大活性值的43％。FVIIa-CTP3凝血活性维持较长时间段，从而证实了延长的活性。治疗的小鼠的凝血活性在晚于12小时的时间点是不可检测的，而FVII-CTP3治疗的小鼠在给药后48小时继续保留可测量的活性(表41和图28)。
通过给药后最高活性测得，与基于体外分析的预期活性相比，3个串联CTP拷贝向FVIIa的添加使回收率升高了100％(表42)，并使半衰期和平均停留时间(MRT)增加了5倍。暴露时间(AUC)增加了3倍(表43)。
表41:单次静脉内注射以后的FVIIa凝血活性
表42:FVIIa-CTP3回收率
*预期的Cmax源自施用剂量除以血液体积
表43：FVIIa-CTP3相对于 的PK参数
凝血酶产生测定(TGA)
凝血酶的产生是凝血级联的一个基础部分，这样，特定个体可以产生凝血酶的状况的估计可以与出血或血栓形成的风险关联。当分析凝血酶产生时，通常测量的变量包括：延迟时间，达到凝血酶产生峰值的时间，峰值，内源性凝血酶潜势[ETP](即，在曲线和尾巴下的面积)，凝血图 (thrombogram，“TG”)的时程。在延迟时间以后，观察到凝血酶的爆发。但是，凝血发生在延迟时间结束时，此时所有凝血酶中的超过95％尚未形成。使用补充了人血友病血浆的Thrombinoscope试剂，在Omri Laboratories进行凝血酶产生测定。TGA反映了源自和 FVIIa-CTP3注射的小鼠血浆中的凝血能力。图29呈现了施用FVIIa-CTP3或以后小鼠血浆的TGA参数值。在FVIIa-CTP3施用以后，所有3个参数(凝血酶产生速率、产生的凝血酶的最大量和KIIa)证实了 FVII-CTP3胜过治疗的优点。这进一步强化了FVII-CTP3相对于的潜在长效优越性的概念。
FVIIa-CTP3尾静脉横断(TVT)研究：
研究概要
得自FVIIa-CTP3的PK/PD试验的数据会提供对FVIIa-CTP3的功能性的洞察，并证实，FVIIa-CTP3与相比具有药代动力学优点。但是，该蛋白在创伤性事件以后诱发体内凝血的能力尚未得到证实。为了评价FVIIa-CTP3的停止出血的能力，将相同的FVIII-缺陷型小鼠模型用于出血攻击。
给FVIII-缺陷型小鼠施用FVIIa-CTP3或的单次静脉内注射。以提供等同FVIIa活性(1.6E05单位，200μl)的量给小鼠施用药物，所述量根据在FVIIa凝血活性测定中评价的每种药物的效能来计算(表44)。由于FVIIa-CTP3的降低的活性，施用的剂量为9mg/kg和40 mg/kg FVII-CTP3。给对照组注射200μl媒介物。
在施用后15min(注射1)、24小时(注射2)或48小时(注射3)，离尾尖 2.7cm横断尾静脉，并记录小鼠存活24小时。
表44:注射的样品的评价
通过A280确定蛋白浓度。
结果
将3次注射(5只动物x 3次注射)在注射媒介物的对照组中的数据总结并呈现在图30中。在尾静脉横断以后24小时观察到30％存活。
在FVIIa施用后15min执行尾静脉横断以后，和 FVIIa-CTP3治疗的小鼠表现出适当止血活性。在FVIIa-CTP3和治疗的动物中观察到100％存活率(图30)。
在施用后24小时执行尾静脉横断以后，最明显地观察到在PK/PD研究中证实的FVII-CTP3的降低的清除率。观察到的存活率的下降。类似于对照组，在10小时内观察到50％死亡。同时，90％的 FVIIa-CTP3治疗的小鼠存活(图30)。该结果强调了FVIIa-CTP3治疗的持久效力。
施用后48小时，在用FVIIa-CTP3或治疗的组中证实了存活率的下降(图30C)。观察到FVIIa-CTP小鼠中的轻微改善，但是差异没有达到统计显著性。
讨论：
CTP与重组蛋白的融合会延长蛋白的循环半衰期，同时维持可比较的活性。尽管超过70KDa阈值尺寸的蛋白的清除率降低背后的机制就肾清除率而言得到良好理解，在CTP融合以后实现了额外保护。认为CTP融合会扫除蛋白屏蔽并保护它免于蛋白水解性裂解，以增加它的残余分子量 (由于高负电荷)和降低它对肝清除受体的亲和力。
本研究的目的是，提供CTP与FVII的融合对蛋白半衰期和清除率的影响的具体洞察，并且也解决在该修饰以后它的比活性的范例。以类似剂量(基于单位)给FVIII-缺陷型小鼠施用FVIIa-CTP3或重组市售的FVIIa 的单次静脉内注射，并进行基于PK活性的分析。FVIIa-CTP3表现出优良的寿命，如它的半衰期和AUC分别增加5和3.5倍所反映的。通过活性试剂盒计算的FVIIa-CTP除以通过A280测量的蛋白浓度的比活性(U/mg)被证实比的比活性低4-5倍。
为了建立关于CTP如何影响FVIIa体内止血效应的理解，研究了 FVIIa-CTP3的减少出血的能力。在血友病小鼠模型的尾静脉横断出血模型中，rFVIIa施用可以提高攻击的动物的存活率，并避免它们出血至死亡。在本文描述的研究中，给动物施用FVIIa-CTP3或当在给药后0.25小时执行横断时，两种分子都能够维持体内稳态。当在给药后24 小时进行尾巴横断时，证实了FVIIa-CTP3治疗组的显著延长的活性持续时间。媒介物治疗组的存活率高于预期值，且高于在以前的研究中得到的值(50％相对于在以前的研究中的20％，数据未显示)。在更早的时间点(包括在给药后36小时)进一步评价了治疗的动物的存活百分比。
综上所述，证实了FVIIa-CTP3在血友病小鼠中具有增加的活性持续时间，其被解释为与相比更长的止血效应持续时间。收集的数据提示，CTP与FVII的融合是具有显著改善血友病患者中的预防性处理的潜力的技术。
实施例7：在给SD大鼠单次静脉内或皮下注射以后纯化的FVII-CTP3相对于FVII-CTP5的特性对比评估
研究目的
进行了2个研究：
第一研究目的是，在单次静脉内施用50μg/动物以后，确定在FVII选择-和HA-柱纯化以后rFVII-CTP3相对于rFVII-CTP5在雄性Sprague Dawley大鼠中的药代动力学参数。
在第二研究中，在单次静脉内或皮下施用100μg/动物以后，在雄性 SpragueDawley大鼠中检查了rFVII-CTP3-HA相对于rFVII-CTP5-HA 的药代动力学参数。
结果
FVII-CTP 3和FVII-CTP 5抗原水平的确定
使用人FVII ELISA试剂盒(Zymotest HyPhen)，确定FVII抗原水平 (参见表45)。
表45.总结了计算的蛋白浓度，其为3个独立运行的平均值。
检查的样品的蛋白质印迹分析
使用Precision plus双色蛋白标志物(Bio-Rad)，将FVII-CTP3,5样品加载上4-12％bisTrisgel(NuPage,invitrogene)。使用多克隆抗FVII Ab(R&D systems)、抗CTP多克隆Ab(Adar biotech production)或抗Gla Ab (American Diagnostica)，通过蛋白质免疫印迹进行SDS-PAGE分析。总之，与3和5个CTP融合的FVII分别迁移在80和100kDa(参见图31)。
FVII体外效能的对比评估
在Sheba医学中心(即国家凝血中心)进行的FVII活性测定是使用缺乏因子VII的免疫吸附的血浆(Siemens)的基于PT的测定。PT试剂是 innovin，在Sysmex CA 1500仪器中进行测定。FVII正常范围是在55-145％内。在表46中总结了样品活性。
表46:样品活性
体内的循环FVII的正常水平是约0.5μg/ml。FVII-CTP3和FVII-CTP5二者都表现出它们的凝血活性相对于正常人合并血浆的约5倍下降。
药代动力学研究
为了确定FVII-CTP3和FVII-CTP5(在FVII选择和FVII HA柱以后) 药代动力学(PK)分布和参数，进行了2个药代动力学研究。在第一个研究中，以50μg/大鼠的剂量将FVII选择/HA纯化以后的FVII-CTP3和 FVII-CTP5在单次静脉内注射中施用给Sprague Dawley大鼠(每种物质6 只大鼠)。
可替代地在给药后0.083、0.5、2、5、8、24、48、72、96和120小时，从3只大鼠在眶后抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆 (0.38％)，并在分析之前在-20℃储存。
在第二个研究中，仅试验了HA柱以后的样品。使用100μg/大鼠的剂量，将这些样品在单次静脉内或皮下注射中施用给Sprague Dawley大鼠 (每种物质6只大鼠)。在与上面第一个研究相同的时间点和条件收集血液样品。
表47.第一个研究设计(FVII选择相对于FVII HA).
表18.第二个研究设计(静脉内相对于皮下)
这2个研究之间的主要差异是剂量和施用途径。在第一个研究中，给大鼠静脉内注射50μg/大鼠，而在第二个研究中，给大鼠静脉内或皮下注射100μg/大鼠(总计500μg/kg；大鼠体重200g)。剂量的增加是由于施用类型的变化；皮下施用需要更高的量才能达到与静脉内施用类似的效果。
PK研究分析
使用人FVII Elisa试剂盒(zymutest FVII-Biophen)定量血浆样品中的 FVII浓度。计算药代动力学分布，其反映了在每个时间点3只动物的平均值。使用PK Solutions2.0软件计算终末半衰期值。下表总结了在不同取样时间点的计算的FVII浓度。PK谱和PK参数的总结呈现在下表中。
表49.第一药代动力学研究(FVII选择相对于FVII HA)-FVII浓度(ng/ml)。
表50.第二药代动力学研究(静脉内相对于皮下)-FVII浓度(ng/ml).
表51.PK分析-第一药代动力学研究(FVII S相对于HA).
与3个CTP相比，5个CTP的添加延长了FVII半衰期。在长时间点 (96和120小时)检测到5个CTP的两种形式(即FVIIS和FVII HA)，而 FVII-3CTP HA和FVIIS-3CTP分别直到72小时和96小时才检测到。基于该事实，FVII-5CTP的半衰期长于3CTP变体(参见图32)。所有检验材料(3和5个CTP)在相同时间点(8-72小时)的半衰期的对比表明，半衰期是类似的，尽管5个CTP是非常长的(图32)。
表52:PK分析–第二药代动力学研究-(静脉内相对于皮下).
再次如在第一个研究中观察到的，与添加3个CTP相比，5个CTP 的添加延长了FVII半衰期，既在初始和终末半衰期中，又以两种施用方式(静脉内和皮下，参见图33)。如预期的，在皮下施用以后，与静脉内施用它相比在更晚的时间点在血液中首先检测出FVII。
在上面总结了2个PK研究。第一个研究的主要目的是，检查在以下 2个不同柱以后FVII-3CTP和FVII-5CTP之间的差异：FVII选择和FVII HA。在我们的先前研究中，检查了收获物相对于纯化的蛋白，并发现，当给大鼠注射收获物时，3-5个CTP形式的FVII之间的差异更大。
在2个柱以后在FVII 3\5 CTP的结果之间没有显著差异，因此决定在第二个研究中注射FVII HA 3\5 CTP。
实施例8：皮下注射以后在FVIII缺陷型小鼠中的FVIIa-CTP3 (MOD-5014)存活研究
研究目的
在皮下施用以后，评价MOD-5014(FVIIA-CTP3)和 MOD-5019(FVIIA-CTP5)在尾静脉横断研究中的效力。
FVIIa-CTP3＝(MOD-5014)和FVIIa-CTP5＝(MOD 5019)分析性能：
通过A280的蛋白测定
使用ProtParam算法(http://web.expasy.org/protparam)，计算的理论消光系数。该计算是基于氨基酸序列。的计算的消光系数为1.406，MOD-5019的计算的消光系数为1.075(值代表在280nm时1g/L的吸光度)。通过在Mscan的氨基酸分析，确定 MOD-5014的消光系数。MOD-5014的消光系数为1.27。
FVIIa-STACLOT VIIa-rTF的凝血测定
FVIIa源自单链FVII的链内裂解。天然组织因子(TF)是FVIIa的一种辅因子，在结合TF以后，FVII会介导因子X活化为Xa，同时它自身转化成FVIIa。可溶性组织因子是天然组织因子的细胞外部分。它不再可以通过自活化而活化FVII，但是与组织因子结合的FVIIa可以将FX活化为 FXa。
在该测定中使用的重组可溶性组织因子(rsTF)利用FVIIa特异性来构建FVIIa凝血试验。在有FVIIa、钙和磷脂存在下，重组可溶性组织因子 (rsTF)会导致血浆的凝固，而不会将FVII活化为FVIIa。
在该系统中观察到的凝固时间与试验样品中的FVIIa含量具有反相关，FVII在样品中的存在没有干扰。
在每个研究之前，评价了重构的以及MOD-5014和 MOD-5019的FVIIa活性。
基于A280计算FVIIa比活性(将其计算为活性/ml除以蛋白浓度)，并呈现在表53中。当对比2种存在分子量差异的分子的比活性时，必须做出补偿，以便将活性标准化(即因为所述分子量差异，在1mg中的活性部位的数目是MOD-5014的1.185倍和MOD-5019的1.307倍)。因此，在下式中呈现了换算因子的计算：
表53-相对于的MOD-5014比活性
研究概要
最重要的测量是，所述蛋白在创伤性事件以后诱导体内凝血的能力。为了评价MOD-5014的停止出血的能力，将相同的FVIII缺陷型小鼠模型用于出血攻击。
给FVIII缺陷型小鼠施用MOD-5014、MOD-5019或的单次皮下注射。以与FVIIa活性等效的量，给组A和B分别施用和MOD-5014。在与MOD-5014等效量的FVIIa蛋白中，给组C施用MOD-5019，以便评价临界因子(蛋白的活性或量)。施用的剂量是4.2mg/kg以及8.6mg/kg MOD-5014和MOD-5019。在施用后12小时离尾巴尖2.7cm横断尾静脉，并记录小鼠存活24小时。
表54–组命名
结果
实验数据总结在表55和图34中。
表55.TVT研究结果
TVT后24小时，仅11％的注射的小鼠存活。30％的 MOD-5014和40％的MOD-5019已经存活至该时间点。皮下注射的 MOD-5014和MOD-5019显示出与相比改善的小鼠存活。尽管如此，结果不是最佳的，因为超过50％的动物在实验过程中死亡。
象其它凝血因子一样，正常地静脉内地注射因子VIIa，以便在血流中直接得到。但是，本发明证实，本文提供的组合物在皮下施用以后令人惊讶地更有效地吸收进血流中。能够皮下地施用FVIIa是一个优点，因为它可以用于预防性应用。皮下注射对于患者而言也更易于自己注射，并且当患者非常年轻且他们的静脉较小和难以发现时是优点。
因此，皮下施用可以用于预防性处理。
实施例9：在SD大鼠中皮下施用以后重组MOD-5014相对于的对比PK-PD研究
研究目的
在单次皮下施用以后，确定MOD-5014相对于市售的rFVIIa在SD 大鼠中的药代动力学和药效动力学参数
通过它们的药代动力学参数，对比含有源自2个不同克隆(克隆号28 相对于61)的MOD-5014产物的2个独立实验(05010和05034)。
实验方法
动物
在注射开始之前至少4天，从Harlan Laboratories Israel,Ltd得到24 只雄性SD大鼠。所述动物是健康的年轻成年动物，在研究开始时约200 克。在治疗开始时动物的体重变异应当不超过每个性别的平均重量的±20％。在到达时检查在该研究中使用的动物的健康状况。仅使处于良好健康的动物适应实验室条件并用于研究中。
FVIIa-STACLOT VIIa-Rtf的凝血测定
在该测定中使用的重组可溶性组织因子(rsTF)利用FVIIa特异性来构建FVIIa凝血试验。在有FVIIa、钙和磷脂存在下，rsTF会导致血浆的凝固，而不会将FVII活化为FVIIa。
在该系统中观察到的凝固时间与试验样品中的FVIIa含量具有反相关，FVII在样品中的存在没有干扰。
在每个研究之前，评价了重构后的和MOD-5014的FVIIa 活性。基于A280来计算FVIIa比活性。当对比2种存在分子量差异的分子的比活性时，必须做出补偿，以便将活性标准化(即因为所述分子量差异，在1mg中的活性部位的数目是在MOD-5014中的1.185倍)。
PK解算器软件
使用PK解算器软件计算药代动力学参数。将静脉内施用曲线分析为双隔室CA推注，并将皮下施用作为NCA血管外的-Log线性梯形分析。计算半衰期、AUC、清除率和体积分布规范，并在实验组之间的对比中研究了输出参数。
实验材料
实验编号05010：
A. RT:(在2012年7月31日制备的批号AU61553*)通过 A280测得的FVIIa浓度：0.86mg/ml。FVIIa Staclot活性测定:56,867 U/mg。注射剂量：946μg/kg。*等分试样库，都得自相同批号。
B.克隆28:MOD-5014RS12-001：基于A280，为0.77mg/ml**。FVIIa Staclot活性测定:34,162U/mg。注射剂量：850μg FVIIa/kg。
实验编号05034：
A. RT:(在2013年1月1日制备的批号AU61347)通过 A280测得的FVIIa浓度：0.82mg/ml，用无菌NS缓冲液稀释至0.4mg/ml。 FVIIa Staclot活性测定:55,688U/mg。注射剂量：360μg/kg和20,047.7 U/kg。
B.克隆61:MOD-5014批次75:基于A280，为1.9mg/ml**，用制剂缓冲液稀释至0.89mg/ml。注射剂量：20,047.7U/kg。FVIIa凝血活性:基于FVIIa Staclot活性测定，为25,002*U/mg。
C.克隆61:MOD-5014批次81A:基于A280，为2.36mg/ml(在研究当天早晨过滤，并在280nm重新测量)，用制剂缓冲液稀释至0.4mg/ml。注射剂量：360μg FVIIa/kg。FVIIa凝血活性:FVIIa Staclot活性测定，为 24943U/mg。
D.克隆61:MOD-5014批次81A:基于A280，为2.36mg/ml，用制剂缓冲液稀释至0.89mg/ml。注射剂量：20,047.7U/kg。FVIIa凝血活性:基于FVIIa Staclot活性测定，为24,943U/mg。
研究概要
实验编号05010
以0.9mg/kg体重的剂量，将MOD-5014和在单次静脉内或皮下注射中施用给SD大鼠。可替代地在给药后0.5、4、8、12、24、 34、48和58小时，从3只大鼠从眼眶窦抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.32％)，并在分析之前在-20℃储存。在“Science in Action”,Nes-Ziona进行研究。评价了FVIIa凝血活性水平，并在Prolor-Biotech进行详细的PK分析。
表55:研究设计05010
实验编号05034
以0.9mg/kg体重的剂量，将MOD-5014和在单次皮下注射中施用给SD大鼠。可替代地在给药后0.5、2、4、6、8、12、24、34、 48和72小时，从3只大鼠从眼眶窦抽取血液样品。在取样后立即制备柠檬酸盐化的血浆(0.32％)，并在分析之前在-20℃储存。在“Science in Action”,Nes-Ziona进行研究。
评价了FVIIa凝血活性水平，并在Prolor-Biotech进行详细的PK分析。
表56:研究设计05034
结果
使用STACLOT VIIa-rTF试剂盒(Stago)，定量血液样品中的FVIIa 活性。计算每种蛋白的药代动力学分布，其为每个时间点3只动物的平均值。
实验编号05010
背景减少以后:15mU/ml。
图35呈现了静脉内和皮下施用或MOD-5014以后FVIIa 的PK谱。在表57中呈现了每个时间点的FVIIa活性值的总结。静脉内和皮下施用具有不同的PK模式(参见图35；背景减少以后:15mU/ml)。由于在施用以后药物立即存在于血液中，静脉内注射以后的Cmax高于在皮下注射以后得到的值(在0.5小时测量，表57和表58)。但是，在皮下施用以后，药物分子转移至细胞内基质和组织，因而Cmax仅在注射后2小时才可测量。在皮下施用以后药物的总回收率低于静脉内注射以后的Cmax 值。
当静脉内或皮下注射时，注射后8小时，显示相同的PK 模式(背景减少以后：15mU/ml，图35)。此外，治疗的小鼠的凝血活性在晚于12小时的时间点是不可检测的，而MOD-5014治疗的小鼠在给药后58小时继续保持可测量的活性(表57；背景减少以后:15 mU/ml；图35)。
表57.静脉内或皮下施用以后MOD-5014相对于的FVIIa凝血活性
背景减少以后:15mU/ml。
表58:在静脉内或皮下施用以后MOD-5014相对于的PK参数
A.静脉内
B.皮下
实验编号05034
图36呈现了皮下施用或MOD-5017以后FVIIa的PK谱。与相比，在相同浓度或相同活性单位检验了2个不同批次(#75 和#81)的克隆编号61。在表59中呈现了每个时间点的FVIIa活性值的总结。
结果指示在与先前的实验对应的皮下施用以后类似的PK模式。此外，治疗的小鼠的凝血活性在晚于12小时的时间点是不可检测的，而MOD-5014治疗的小鼠在给药后24小时继续保留可测量的活性(表 59和图36；和背景减少以后:56mU/ml(8、12小时)或32mU/ml(0.5、2、 6、14小时))。
克隆编号61批号81(D)Cmax(1,301mU/ml)低于克隆编号61批号75 (B)和(A)(分别为3,521mU/ml和5,908mU/ml)的Cmax值，尽管它们都以相同的单位活性注射(表6)。但是，在注射后8小时测量，批号 75(B)和批号81(D)具有相同的活性单位(分别是559mU/ml和478mU/ml) (图36和表59；和背景减少以后:56mU/ml(8、12小时)或32mU/ml(0.5、 2、6、14小时))。
表59：单次皮下施用以后MOD-5014(克隆61#75、#81)相对于的FVIIa凝血活性.
背景减少以后:56mU/ml(8、12小时)或32mU/ml(0.5、2、6、14小时)。
表60：单次皮下施用以后MOD-5014(克隆61#75、#81)相对于的PK参数.
该报告总结了2个PK研究：05010和05034。我们的目的是，提供 CTP与FVII的融合在皮下施用中对蛋白半衰期和清除率的影响的具体洞察，并且解决在该修饰以后它的比活性的范例。在这些研究中，与重组市售的FVIIa相比，给SD大鼠施用源自2个克隆和2个不同批次的MOD-5014的单次皮下注射。以类似的FVIIa浓度(μg/Kg)或以相同活性水平(U/Kg)注射所述组分，并进行基于PK活性的分析。
第一个研究的主要目的是，验证在静脉内和皮下施用以后不同的PK 参数。基于该研究，我们可以得出结论，在静脉内或皮下施用以后测量的 PK模式之间存在差异。在MOD-5014皮下注射以后测得7.78小时的t1/2，在静脉内注射以后仅测得4.2小时。AUC值是相同的(表58)。
但是，第二个研究聚焦于MOD-5014克隆编号61的2个批次之间的差异，它们与相比在相同的FVIIa浓度或在相等活性单位注射。在该研究中，我们证实，克隆61批号75显示出比批号81更好的PK 参数。由于未知原因，以相同单位活性水平注射的批号81具有较低Cmax。此外，当以2种不同剂量(按FVIIa浓度或按单位活性)注射克隆61批号 81时测量出相同的Cmax，而不是2个活性值之间的2.5倍。在一起分析 2个研究以后，我们可以得出结论：在皮下注射以后，克隆28呈现出比克隆61#75(更好批次)延长的t1/2参数(分别是7.78小时和5.7小时，表60)。我们还可以得出结论：不同时间点样品产生不同的PK模式，这会导致PK 曲线的变化。曲线的模式可以教导我们关于血液中的药物性能的更多知识。因此，我们决定确定与Baxter检测到的那些类似的时间点(0、0.5、2、6、 8、12、24、34、48、72小时)。此外，在05010实验中的FVIIa浓度过高，并在以下皮下实验中修正(05034)。对于将来的PK研究，我们决定以每剂 360μg FVIIa/kg来注射该组分。
总之，我们可以得知关于我们的MOD-5014产物在皮下施用以后的更多知识，以便确定最高质量克隆和批次，并决定MOD-5014注射量(按 FVIIa浓度或活性单位)的最好方法。
尽管在本文中已经解释和描述了本发明的某些特征，本领域普通技术人员现在可以做出许多修改、替换、变化和等同方案。因此，应当理解，所附权利要求意图涵盖落入本发明的真实精神内的所有这样的修改和变化。
序列表
<110> 奥普科生物制品有限公司
<120> 长效凝血因子和生产它们的方法
<130> P-9520-PC5
<150> 13/372,540
<151> 2012-02-14
<160> 45
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 32
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 28
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 4
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 5
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for Factor VII
<400> 5
ctcgaggaca tggtctccca ggccc 25
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for Factor VII
<400> 6
tctagaatag gtatttttcc acat 24
<210> 7
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for Factor VII
<400> 7
tctagaaaaa agaaatgcca gc 22
<210> 8
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> PCR primer for Factor VII
<400> 8
gcggccgcat cctcagggaa atggggctcg ca 32
<210> 9
<211> 444
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 9
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro
435 440
<210> 10
<211> 448
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Gly Cys Gly Arg
435 440 445
<210> 11
<211> 1356
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 11
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacg 1200
ggcatcgtca gctggggcca gggctgcgca accgtgggcc actttggggt gtacaccagg 1260
gtctcccagt acatcgagtg gctgcaaaag ctcatgcgct cagagccacg cccaggagtc 1320
ctcctgcgag ccccatttcc ctgaggatgc ggccgc 1356
<210> 12
<211> 1442
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 12
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380
cctagcagac tgcctgggcc cagcgacacc cccatcctgc cccagtgagg atccgcggcc 1440
gc 1442
<210> 13
<211> 472
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 13
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro
450 455 460
Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
465 470
<210> 14
<211> 1535
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 14
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380
cctagcagac tgcctgggcc ctccgacaca ccaatcctgc cacagagcag ctcctctaag 1440
gcccctcctc catccctgcc atccccctcc cggctgccag gcccctctga cacccctatc 1500
ctgcctcagt gatgaaggtc tggatccgcg gccgc 1535
<210> 15
<211> 500
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 15
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro
450 455 460
Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro
465 470 475 480
Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
485 490 495
Ile Leu Pro Gln
500
<210> 16
<211> 1404
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 16
gcgatcgcca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat caccaggcct catcaccatt 60
gccttttagg atatctactc agtgctgaat gtacagtttt tcttgatcat gaaaacgcca 120
acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa attggaagag tttgttcaag 180
ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca cgagaagttt 240
ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga gatcagtgtg 300
agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc tatgaatgtt 360
ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt aacattaaga 420
atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt tgctcctgta 480
ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg ccatttccat 540
gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgagact gtttttcctg 600
atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc actcaaagca 660
cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa ccaggtcaat 720
tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc tctatcgtta 780
atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa attacagttg 840
tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga aatgtgattc 900
gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat gacattgccc 960
ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt tgcattgctg 1020
acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa 1080
gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttctccagta ccttagagtt ccacttgttg 1140
accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg 1200
gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc catgttactg 1260
aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga 1320
aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa 1380
caaagctcac ttgaacgcgg ccgc 1404
<210> 17
<211> 461
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr
450 455 460
<210> 18
<211> 1502
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 18
gcgatcgcca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat caccaggcct catcaccatc 60
tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacagttt ttcttgatca tgaaaacgcc 120
aacaaaattc tgaatcggcc aaagaggtat aattcaggta aattggaaga gtttgttcaa 180
gggaaccttg agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt 240
tttgaaaaca ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt 300
gagtccaatc catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt 360
tggtgtccct ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag 420
aatggcagat gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt 480
actgagggat atcgacttgc agaaaaccag aagtcctgtg aaccagcagt gccatttcca 540
tgtggaagag tttctgtttc acaaacttct aagctcaccc gtgctgagac tgtttttcct 600
gatgtggact atgtaaattc tactgaagct gaaaccattt tggataacat cactcaaagc 660
acccaatcat ttaatgactt cactcgagtt gttggtggag aagatgccaa accaggtcaa 720
ttcccttggc aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt 780
aatgaaaaat ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt 840
gtcgcaggtg aacataatat tgaggagaca gaacatacag agcaaaagcg aaatgtgatt 900
cgaattattc ctcaccacaa ctacaatgca gctattaata agtacaacca tgacattgcc 960
cttctggaac tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct 1020
gacaaggaat acacgaacat cttcctcaaa tttggatctg gctatgtaag tggctgggga 1080
agagtcttcc acaaagggag atcagcttta gttcttcagt accttagagt tccacttgtt 1140
gaccgagcca catgtcttcg atctacaaag ttcaccatct ataacaacat gttctgtgct 1200
ggcttccatg aaggaggtag agattcatgt caaggagata gtgggggacc ccatgttact 1260
gaagtggaag ggaccagttt cttaactgga attattagct ggggtgaaga gtgtgcaatg 1320
aaaggcaaat atggaatata taccaaggta tcccggtatg tcaactggat taaggaaaaa 1380
acaaagctca ctagctccag cagcaaggcc cctcccccga gcctgccctc cccaagcagg 1440
ctgcctgggc cctccgacac accaatcctg ccacagtgat gaaggtctgg atccgcggcc 1500
gc 1502
<210> 19
<211> 489
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 19
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Ser Ser Ser
450 455 460
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
485
<210> 20
<211> 1585
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 20
gcgatcgcca tgcagcgcgt gaacatgatc atggcagaat caccaggcct catcaccatc 60
tgccttttag gatatctact cagtgctgaa tgtacagttt ttcttgatca tgaaaacgcc 120
aacaaaattc tgaatcggcc aaagaggtat aattcaggta aattggaaga gtttgttcaa 180
gggaaccttg agagagaatg tatggaagaa aagtgtagtt ttgaagaagc acgagaagtt 240
tttgaaaaca ctgaaagaac aactgaattt tggaagcagt atgttgatgg agatcagtgt 300
gagtccaatc catgtttaaa tggcggcagt tgcaaggatg acattaattc ctatgaatgt 360
tggtgtccct ttggatttga aggaaagaac tgtgaattag atgtaacatg taacattaag 420
aatggcagat gcgagcagtt ttgtaaaaat agtgctgata acaaggtggt ttgctcctgt 480
actgagggat atcgacttgc agaaaaccag aagtcctgtg aaccagcagt gccatttcca 540
tgtggaagag tttctgtttc acaaacttct aagctcaccc gtgctgagac tgtttttcct 600
gatgtggact atgtaaattc tactgaagct gaaaccattt tggataacat cactcaaagc 660
acccaatcat ttaatgactt cactcgagtt gttggtggag aagatgccaa accaggtcaa 720
ttcccttggc aggttgtttt gaatggtaaa gttgatgcat tctgtggagg ctctatcgtt 780
aatgaaaaat ggattgtaac tgctgcccac tgtgttgaaa ctggtgttaa aattacagtt 840
gtcgcaggtg aacataatat tgaggagaca gaacatacag agcaaaagcg aaatgtgatt 900
cgaattattc ctcaccacaa ctacaatgca gctattaata agtacaacca tgacattgcc 960
cttctggaac tggacgaacc cttagtgcta aacagctacg ttacacctat ttgcattgct 1020
acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt ggctggggaa 1080
gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt ccacttgttg 1140
accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg ttctgtgctg 1200
gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc catgttactg 1260
aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag tgtgcaatga 1320
aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt aaggaaaaaa 1380
caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc ccaagcaggc 1440
tgcctgggcc ctccgacaca ccaatcctgc cacagagcag ctcctctaag gcccctcctc 1500
catccctgcc atccccctcc cggctgcctg gcccctctga cacccctatc ctgcctcagt 1560
gatgaaggtc tggatccgcg gccgc 1585
<210> 21
<211> 517
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 21
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Thr Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Ser Ser Ser
450 455 460
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
485 490 495
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
500 505 510
Pro Ile Leu Pro Gln
515
<210> 22
<211> 2413
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 22
tctagagtcg accccgccat ggagctgagg ccctggttgc tatgggtggt agcagcaaca 60
ggaaccttgg tcctgctagc agctgatgct cagggccaga aggtcttcac caacacgtgg 120
gctgtgcgca tccctggagg cccagcggtg gccaacagtg tggcacggaa gcatgggttc 180
ctcaacctgg gccagatctt cggggactat taccacttct ggcatcgagg agtgacgaag 240
cggtccctgt cgcctcaccg cccgcggcac agccggctgc agagggagcc tcaagtacag 300
tggctggaac agcaggtggc aaagcgacgg actaaacggg acgtgtacca ggagcccaca 360
gaccccaagt ttcctcagca gtggtacctg tctggtgtca ctcagcggga cctgaatgtg 420
aaggcggcct gggcgcaggg ctacacaggg cacggcattg tggtctccat tctggacgat 480
ggcatcgaga agaaccaccc ggacttggca ggcaattatg atcctggggc cagttttgat 540
gtcaatgacc aggaccctga cccccagcct cggtacacac agatgaatga caacaggcac 600
ggcacacggt gtgcggggga agtggctgcg gtggccaaca acggtgtctg tggtgtaggt 660
gtggcctaca acgcccgcat tggaggggtg cgcatgctgg atggcgaggt gacagatgca 720
gtggaggcac gctcgctggg cctgaacccc aaccacatcc acatctacag tgccagctgg 780
ggccccgagg atgacggcaa gacagtggat gggccagccc gcctcgccga ggaggccttc 840
ttccgtgggg ttagccaggg ccgagggggg ctgggctcca tctttgtctg ggcctcgggg 900
aacgggggcc gggaacatga cagctgcaac tgcgacggct acaccaacag tatctacacg 960
ctgtccatca gcagcgccac gcagtttggc aacgtgccgt ggtacagcga ggcctgctcg 1020
tccacactgg ccacgaccta cagcagtggc aaccagaatg agaagcagat cgtgacgact 1080
gacttgcggc agaagtgcac ggagtctcac acgggcacct cagcctctgc ccccttagca 1140
gccggcatca ttgctctcac cctggaggcc aataagaacc tcacatggcg ggacatgcaa 1200
cacctggtgg tacagacctc gaagccagcc cacctcaatg ccaacgactg ggccaccaat 1260
ggtgtgggcc ggaaagtgag ccactcatat ggctacgggc ttttggacgc aggcgccatg 1320
gtggccctgg cccagaattg gaccacagtg gccccccagc ggaagtgcat catcgacatc 1380
ctcaccgagc ccaaagacat cgggaaacgg ctcgaggtgc ggaagaccgt gaccgcgtgc 1440
ctgggcgagc ccaaccacat cactcggctg gagcacgctc aggcgcggct caccctgtcc 1500
tataatcgcc gtggcgacct ggccatccac ctggtcagcc ccatgggcac ccgctccacc 1560
ctgctggcag ccaggccaca tgactactcc gcagatgggt ttaatgactg ggccttcatg 1620
acaactcatt cctgggatga ggatccctct ggcgagtggg tcctagagat tgaaaacacc 1680
agcgaagcca acaactatgg gacgctgacc aagttcaccc tcgtactcta tggcaccgcc 1740
cctgaggggc tgcccgtacc tccagaaagc agtggctgca agaccctcac gtccagtcag 1800
gcctgtgtgg tgtgcgagga aggcttctcc ctgcaccaga agagctgtgt ccagcactgc 1860
cctccaggct tcgcccccca agtcctcgat acgcactata gcaccgagaa tgacgtggag 1920
accatccggg ccagcgtctg cgccccctgc cacgcctcat gtgccacatg ccaggggccg 1980
gccctgacag actgcctcag ctgccccagc cacgcctcct tggaccctgt ggagcagact 2040
tgctcccggc aaagccagag cagccgagag tccccgccac agcagcagcc acctcggctg 2100
cccccggagg tggaggcggg gcaacggctg cgggcagggc tgctgccctc acacctgcct 2160
gaggtggtgg ccggcctcag ctgcgccttc atcgtgctgg tcttcgtcac tgtcttcctg 2220
gtcctgcagc tgcgctctgg ctttagtttt cggggggtga aggtgtacac catggaccgt 2280
ggcctcatct cctacaaggg gctgccccct gaagcctggc aggaggagtg cccgtctgac 2340
tcagaagagg acgagggccg gggcgagagg accgccttta tcaaagacca gagcgccctc 2400
tgaacgcggc cgc 2413
<210> 23
<211> 794
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
Met Glu Leu Arg Pro Trp Leu Leu Trp Val Val Ala Ala Thr Gly Thr
1 5 10 15
Leu Val Leu Leu Ala Ala Asp Ala Gln Gly Gln Lys Val Phe Thr Asn
20 25 30
Thr Trp Ala Val Arg Ile Pro Gly Gly Pro Ala Val Ala Asn Ser Val
35 40 45
Ala Arg Lys His Gly Phe Leu Asn Leu Gly Gln Ile Phe Gly Asp Tyr
50 55 60
Tyr His Phe Trp His Arg Gly Val Thr Lys Arg Ser Leu Ser Pro His
65 70 75 80
Arg Pro Arg His Ser Arg Leu Gln Arg Glu Pro Gln Val Gln Trp Leu
85 90 95
Glu Gln Gln Val Ala Lys Arg Arg Thr Lys Arg Asp Val Tyr Gln Glu
100 105 110
Pro Thr Asp Pro Lys Phe Pro Gln Gln Trp Tyr Leu Ser Gly Val Thr
115 120 125
Gln Arg Asp Leu Asn Val Lys Ala Ala Trp Ala Gln Gly Tyr Thr Gly
130 135 140
His Gly Ile Val Val Ser Ile Leu Asp Asp Gly Ile Glu Lys Asn His
145 150 155 160
Pro Asp Leu Ala Gly Asn Tyr Asp Pro Gly Ala Ser Phe Asp Val Asn
165 170 175
Asp Gln Asp Pro Asp Pro Gln Pro Arg Tyr Thr Gln Met Asn Asp Asn
180 185 190
Arg His Gly Thr Arg Cys Ala Gly Glu Val Ala Ala Val Ala Asn Asn
195 200 205
Gly Val Cys Gly Val Gly Val Ala Tyr Asn Ala Arg Ile Gly Gly Val
210 215 220
Arg Met Leu Asp Gly Glu Val Thr Asp Ala Val Glu Ala Arg Ser Leu
225 230 235 240
Gly Leu Asn Pro Asn His Ile His Ile Tyr Ser Ala Ser Trp Gly Pro
245 250 255
Glu Asp Asp Gly Lys Thr Val Asp Gly Pro Ala Arg Leu Ala Glu Glu
260 265 270
Ala Phe Phe Arg Gly Val Ser Gln Gly Arg Gly Gly Leu Gly Ser Ile
275 280 285
Phe Val Trp Ala Ser Gly Asn Gly Gly Arg Glu His Asp Ser Cys Asn
290 295 300
Cys Asp Gly Tyr Thr Asn Ser Ile Tyr Thr Leu Ser Ile Ser Ser Ala
305 310 315 320
Thr Gln Phe Gly Asn Val Pro Trp Tyr Ser Glu Ala Cys Ser Ser Thr
325 330 335
Leu Ala Thr Thr Tyr Ser Ser Gly Asn Gln Asn Glu Lys Gln Ile Val
340 345 350
Thr Thr Asp Leu Arg Gln Lys Cys Thr Glu Ser His Thr Gly Thr Ser
355 360 365
Ala Ser Ala Pro Leu Ala Ala Gly Ile Ile Ala Leu Thr Leu Glu Ala
370 375 380
Asn Lys Asn Leu Thr Trp Arg Asp Met Gln His Leu Val Val Gln Thr
385 390 395 400
Ser Lys Pro Ala His Leu Asn Ala Asn Asp Trp Ala Thr Asn Gly Val
405 410 415
Gly Arg Lys Val Ser His Ser Tyr Gly Tyr Gly Leu Leu Asp Ala Gly
420 425 430
Ala Met Val Ala Leu Ala Gln Asn Trp Thr Thr Val Ala Pro Gln Arg
435 440 445
Lys Cys Ile Ile Asp Ile Leu Thr Glu Pro Lys Asp Ile Gly Lys Arg
450 455 460
Leu Glu Val Arg Lys Thr Val Thr Ala Cys Leu Gly Glu Pro Asn His
465 470 475 480
Ile Thr Arg Leu Glu His Ala Gln Ala Arg Leu Thr Leu Ser Tyr Asn
485 490 495
Arg Arg Gly Asp Leu Ala Ile His Leu Val Ser Pro Met Gly Thr Arg
500 505 510
Ser Thr Leu Leu Ala Ala Arg Pro His Asp Tyr Ser Ala Asp Gly Phe
515 520 525
Asn Asp Trp Ala Phe Met Thr Thr His Ser Trp Asp Glu Asp Pro Ser
530 535 540
Gly Glu Trp Val Leu Glu Ile Glu Asn Thr Ser Glu Ala Asn Asn Tyr
545 550 555 560
Gly Thr Leu Thr Lys Phe Thr Leu Val Leu Tyr Gly Thr Ala Pro Glu
565 570 575
Gly Leu Pro Val Pro Pro Glu Ser Ser Gly Cys Lys Thr Leu Thr Ser
580 585 590
Ser Gln Ala Cys Val Val Cys Glu Glu Gly Phe Ser Leu His Gln Lys
595 600 605
Ser Cys Val Gln His Cys Pro Pro Gly Phe Ala Pro Gln Val Leu Asp
610 615 620
Thr His Tyr Ser Thr Glu Asn Asp Val Glu Thr Ile Arg Ala Ser Val
625 630 635 640
Cys Ala Pro Cys His Ala Ser Cys Ala Thr Cys Gln Gly Pro Ala Leu
645 650 655
Thr Asp Cys Leu Ser Cys Pro Ser His Ala Ser Leu Asp Pro Val Glu
660 665 670
Gln Thr Cys Ser Arg Gln Ser Gln Ser Ser Arg Glu Ser Pro Pro Gln
675 680 685
Gln Gln Pro Pro Arg Leu Pro Pro Glu Val Glu Ala Gly Gln Arg Leu
690 695 700
Arg Ala Gly Leu Leu Pro Ser His Leu Pro Glu Val Val Ala Gly Leu
705 710 715 720
Ser Cys Ala Phe Ile Val Leu Val Phe Val Thr Val Phe Leu Val Leu
725 730 735
Gln Leu Arg Ser Gly Phe Ser Phe Arg Gly Val Lys Val Tyr Thr Met
740 745 750
Asp Arg Gly Leu Ile Ser Tyr Lys Gly Leu Pro Pro Glu Ala Trp Gln
755 760 765
Glu Glu Cys Pro Ser Asp Ser Glu Glu Asp Glu Gly Arg Gly Glu Arg
770 775 780
Thr Ala Phe Ile Lys Asp Gln Ser Ala Leu
785 790
<210> 24
<211> 1621
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 24
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380
cctagcagac tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag 1440
gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt 1500
ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1560
ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgcggc cgcttaatta 1620
a 1621
<210> 25
<211> 528
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 25
Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gln
1 5 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala His Gly Val
20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro
35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser Phe Glu Glu
50 55 60
Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile
65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln Asn Gly
85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe Cys Leu Pro
100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gln Leu Ile
115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser Asp His Thr
130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala
145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys Ile
165 170 175
Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly Arg Ile Val
180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln Val Leu Leu
195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile
210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg
225 230 235 240
Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly
245 250 255
Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro Ser Thr Tyr
260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu His Gln
275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg
290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser
305 310 315 320
Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met
325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu Gln Gln Ser
340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala
355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly
370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Val
385 390 395 400
Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr
405 410 415
Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met Arg Ser Glu
420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser Ser Ser Ser
435 440 445
Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro
450 455 460
Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro
465 470 475 480
Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
485 490 495
Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
500 505 510
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
515 520 525
<210> 26
<211> 1607
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 26
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380
cctagcagac tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag 1440
gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt 1500
ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1560
ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgc 1607
<210> 27
<211> 532
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 27
Leu Glu Asp Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gln Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala
20 25 30
His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu
35 40 45
Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser
50 55 60
Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu
65 70 75 80
Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys
85 90 95
Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe
100 105 110
Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp
115 120 125
Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser
130 135 140
Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys
165 170 175
Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly
180 185 190
Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln
195 200 205
Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile
210 215 220
Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys
225 230 235 240
Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu
245 250 255
His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro
260 265 270
Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg
275 280 285
Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu
290 295 300
Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser
305 310 315 320
Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu
325 330 335
Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu
340 345 350
Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met
355 360 365
Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp
370 375 380
Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr
385 390 395 400
Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly
405 410 415
Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met
420 425 430
Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
450 455 460
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys
465 470 475 480
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
485 490 495
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
500 505 510
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
515 520 525
Leu Pro Gln Gly
530
<210> 28
<211> 1775
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 28
ctcgaggaca tggtctccca ggccctcagg ctcctctgcc ttctgcttgg gcttcagggc 60
tgcctggctg cagtcttcgt aacccaggag gaagcccacg gcgtcctgca ccggcgccgg 120
cgcgccaacg cgttcctgga ggagctgcgg ccgggctccc tggagaggga gtgcaaggag 180
gagcagtgct ccttcgagga ggcccgggag atcttcaagg acgcggagag gacgaagctg 240
ttctggattt cttacagtga tggggaccag tgtgcctcaa gtccatgcca gaatgggggc 300
tcctgcaagg accagctcca gtcctatatc tgcttctgcc tccctgcctt cgagggccgg 360
aactgtgaga cgcacaagga tgaccagctg atctgtgtga acgagaacgg cggctgtgag 420
cagtactgca gtgaccacac gggcaccaag cgctcctgtc ggtgccacga ggggtactct 480
ctgctggcag acggggtgtc ctgcacaccc acagttgaat atccatgtgg aaaaatacct 540
attctagaaa aaagaaatgc cagcaaaccc caaggccgaa ttgtgggggg caaggtgtgc 600
cccaaagggg agtgtccatg gcaggtcctg ttgttggtga atggagctca gttgtgtggg 660
gggaccctga tcaacaccat ctgggtggtc tccgcggccc actgtttcga caaaatcaag 720
aactggagga acctgatcgc ggtgctgggc gagcacgacc tcagcgagca cgacggggat 780
gagcagagcc ggcgggtggc gcaggtcatc atccccagca cgtacgtccc gggcaccacc 840
aaccacgaca tcgcgctgct ccgcctgcac cagcccgtgg tcctcactga ccatgtggtg 900
cccctctgcc tgcccgaacg gacgttctct gagaggacgc tggccttcgt gcgcttctca 960
ttggtcagcg gctggggcca gctgctggac cgtggcgcca cggccctgga gctcatggtc 1020
ctcaacgtgc cccggctgat gacccaggac tgcctgcagc agtcacggaa ggtgggagac 1080
tccccaaata tcacggagta catgttctgt gccggctact cggatggcag caaggactcc 1140
tgcaaggggg acagtggagg cccacatgcc acccactacc ggggcacgtg gtacctgacc 1200
ggcatcgtga gctggggcca gggctgcgcc accgtgggcc acttcggcgt gtacaccagg 1260
gtgtcccagt acatcgagtg gctgcagaaa ctgatgagaa gcgagcccag acccggcgtg 1320
ctgctgagag cccccttccc cagcagcagc tccaaggccc ctccccctag cctgcccagc 1380
cctagcagac tgcctgggcc ctctgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctcctctaag 1440
gctccaccac cttccctgcc tagcccttca agactgccag gccctagcga tacaccaatt 1500
ctgccccagt cctccagcag caaggctccc ccacctagcc tgccttctcc atcaaggctg 1560
cctggcccat ccgatacccc aattttgcct cagagcagct ctagcaaggc acctcccccc 1620
agtctgccct ctccaagcag actccctggc ccttcagaca ctccaatcct cccacagtcc 1680
tctagctcta aagctccacc tcccagcctg cccagcccta gtagactccc cggaccttct 1740
gataccccca tcttgcccca gtgatgagga tccgc 1775
<210> 29
<211> 589
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor VII
<400> 29
Leu Glu Asp Met Val Ser Gln Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gln Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gln Glu Glu Ala
20 25 30
His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu
35 40 45
Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gln Cys Ser
50 55 60
Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu
65 70 75 80
Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gln Cys Ala Ser Ser Pro Cys
85 90 95
Gln Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gln Leu Gln Ser Tyr Ile Cys Phe
100 105 110
Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp
115 120 125
Gln Leu Ile Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gln Tyr Cys Ser
130 135 140
Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser
145 150 155 160
Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys
165 170 175
Gly Lys Ile Pro Ile Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gln Gly
180 185 190
Arg Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gln
195 200 205
Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gln Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile
210 215 220
Asn Thr Ile Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys
225 230 235 240
Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu
245 250 255
His Asp Gly Asp Glu Gln Ser Arg Arg Val Ala Gln Val Ile Ile Pro
260 265 270
Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Arg
275 280 285
Leu His Gln Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu
290 295 300
Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser
305 310 315 320
Leu Val Ser Gly Trp Gly Gln Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu
325 330 335
Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gln Asp Cys Leu
340 345 350
Gln Gln Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr Glu Tyr Met
355 360 365
Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp
370 375 380
Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr
385 390 395 400
Gly Ile Val Ser Trp Gly Gln Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly
405 410 415
Val Tyr Thr Arg Val Ser Gln Tyr Ile Glu Trp Leu Gln Lys Leu Met
420 425 430
Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro Ser
435 440 445
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
450 455 460
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys
465 470 475 480
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
485 490 495
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
500 505 510
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
515 520 525
Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser
530 535 540
Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser
545 550 555 560
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
565 570 575
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser
580 585
<210> 30
<211> 1673
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 30
tctagagtcg accccgccat gcagcgcgtg aacatgatca tggcagaatc accaggcctc 60
atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat gtacagtttt tcttgatcat 120
gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa attggaagag 180
tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca 240
cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga 300
gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc 360
tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt 420
aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt 480
tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg 540
ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgaggca 600
gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc 660
actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa 720
ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc 780
tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa 840
attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga 900
aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat 960
gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt 1020
tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt 1080
ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt 1140
ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg 1200
ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc 1260
catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag 1320
tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt 1380
aaggaaaaaa caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc 1440
ccaagcaggc tgcctgggcc cagtgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctccagcaag 1500
gccccacccc ctagcctgcc ttctccttct cggctgcctg gccccagcga tactccaatt 1560
ctgccccagt cctccagcag taaggctccc cctccatctc tgccatcccc cagcagactg 1620
ccaggccctt ctgatacacc catcctccca cagtgatgag gatccgcggc cgc 1673
<210> 31
<211> 545
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 31
Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser Pro Gly Leu Ile Thr
1 5 10 15
Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu Cys Thr Val Phe Leu
20 25 30
Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg Pro Lys Arg Tyr Asn
35 40 45
Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys
50 55 60
Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn
65 70 75 80
Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr Val Asp Gly Asp Gln
85 90 95
Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Asp Ile
100 105 110
Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe Glu Gly Lys Asn Cys
115 120 125
Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly Arg Cys Glu Gln Phe
130 135 140
Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys Ser Cys Thr Glu Gly
145 150 155 160
Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu Pro Ala Val Pro Phe
165 170 175
Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser Lys Leu Thr Arg Ala
180 185 190
Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn Ser Thr Glu Ala Glu
195 200 205
Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln Ser Phe Asn Asp Phe
210 215 220
Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro Gly Gln Phe Pro Trp
225 230 235 240
Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe Cys Gly Gly Ser Ile
245 250 255
Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His Cys Val Glu Thr Gly
260 265 270
Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn Ile Glu Glu Thr Glu
275 280 285
His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile Ile Pro His His Asn
290 295 300
Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp Ile Ala Leu Leu Glu
305 310 315 320
Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val Thr Pro Ile Cys Ile
325 330 335
Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys Phe Gly Ser Gly Tyr
340 345 350
Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly Arg Ser Ala Leu Val
355 360 365
Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg Ala Thr Cys Leu Arg
370 375 380
Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe Cys Ala Gly Phe His
385 390 395 400
Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Val
405 410 415
Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly Ile Ile Ser Trp Gly
420 425 430
Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile Tyr Thr Lys Val Ser
435 440 445
Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys Leu Thr Ser Ser Ser
450 455 460
Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly
465 470 475 480
Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro
485 490 495
Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr
500 505 510
Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
515 520 525
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
530 535 540
Gln
545
<210> 32
<211> 1757
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 32
tctagagtcg accccgccat gcagcgcgtg aacatgatca tggcagaatc accaggcctc 60
atcaccatct gccttttagg atatctactc agtgctgaat gtacagtttt tcttgatcat 120
gaaaacgcca acaaaattct gaatcggcca aagaggtata attcaggtaa attggaagag 180
tttgttcaag ggaaccttga gagagaatgt atggaagaaa agtgtagttt tgaagaagca 240
cgagaagttt ttgaaaacac tgaaagaaca actgaatttt ggaagcagta tgttgatgga 300
gatcagtgtg agtccaatcc atgtttaaat ggcggcagtt gcaaggatga cattaattcc 360
tatgaatgtt ggtgtccctt tggatttgaa ggaaagaact gtgaattaga tgtaacatgt 420
aacattaaga atggcagatg cgagcagttt tgtaaaaata gtgctgataa caaggtggtt 480
tgctcctgta ctgagggata tcgacttgca gaaaaccaga agtcctgtga accagcagtg 540
ccatttccat gtggaagagt ttctgtttca caaacttcta agctcacccg tgctgaggca 600
gtttttcctg atgtggacta tgtaaattct actgaagctg aaaccatttt ggataacatc 660
actcaaagca cccaatcatt taatgacttc actcgagttg ttggtggaga agatgccaaa 720
ccaggtcaat tcccttggca ggttgttttg aatggtaaag ttgatgcatt ctgtggaggc 780
tctatcgtta atgaaaaatg gattgtaact gctgcccact gtgttgaaac tggtgttaaa 840
attacagttg tcgcaggtga acataatatt gaggagacag aacatacaga gcaaaagcga 900
aatgtgattc gaattattcc tcaccacaac tacaatgcag ctattaataa gtacaaccat 960
gacattgccc ttctggaact ggacgaaccc ttagtgctaa acagctacgt tacacctatt 1020
tgcattgctg acaaggaata cacgaacatc ttcctcaaat ttggatctgg ctatgtaagt 1080
ggctggggaa gagtcttcca caaagggaga tcagctttag ttcttcagta ccttagagtt 1140
ccacttgttg accgagccac atgtcttcga tctacaaagt tcaccatcta taacaacatg 1200
ttctgtgctg gcttccatga aggaggtaga gattcatgtc aaggagatag tgggggaccc 1260
catgttactg aagtggaagg gaccagtttc ttaactggaa ttattagctg gggtgaagag 1320
tgtgcaatga aaggcaaata tggaatatat accaaggtat cccggtatgt caactggatt 1380
aaggaaaaaa caaagctcac tagctccagc agcaaggccc ctcccccgag cctgccctcc 1440
ccaagcaggc tgcctgggcc ctctgacacc cctatcctgc ctcagtccag ctcctctaag 1500
gccccaccac cttccctgcc tagcccttca agactgccag gccctagcga tacaccaatt 1560
ctgccccagt cctccagcag caaggctccc ccacctagcc tgccttctcc atcaaggctg 1620
cctggcccat ccgatacccc aattttgcct cagagcagct ctagcaaggc acctcccccc 1680
agtctgccct ctccaagcag actccctggc ccttcagaca ctcccattct gccacagtga 1740
tgaggatccg cggccgc 1757
<210> 33
<211> 583
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 33
Ser Arg Val Asp Pro Ala Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu
1 5 10 15
Ser Pro Gly Leu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala
20 25 30
Glu Cys Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn
35 40 45
Arg Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly
50 55 60
Asn Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala
65 70 75 80
Arg Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln
85 90 95
Tyr Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly
100 105 110
Ser Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly
115 120 125
Phe Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn
130 135 140
Gly Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val
145 150 155 160
Cys Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys
165 170 175
Glu Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr
180 185 190
Ser Lys Leu Thr Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val
195 200 205
Asn Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr
210 215 220
Gln Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys
225 230 235 240
Pro Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala
245 250 255
Phe Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala
260 265 270
His Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His
275 280 285
Asn Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg
290 295 300
Ile Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His
305 310 315 320
Asp Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr
325 330 335
Val Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu
340 345 350
Lys Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys
355 360 365
Gly Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp
370 375 380
Arg Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met
385 390 395 400
Phe Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp
405 410 415
Ser Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr
420 425 430
Gly Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly
435 440 445
Ile Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr
450 455 460
Lys Leu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser
465 470 475 480
Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser
485 490 495
Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu
500 505 510
Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys
515 520 525
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
530 535 540
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
545 550 555 560
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
565 570 575
Leu Pro Gln Gly Ser Ala Ala
580
<210> 34
<211> 1840
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 34
ctagagtcga ccccgccatg cagcgcgtga acatgatcat ggcagaatca ccaggcctca 60
tcaccatctg ccttttagga tatctactca gtgctgaatg tacagttttt cttgatcatg 120
aaaacgccaa caaaattctg aatcggccaa agaggtataa ttcaggtaaa ttggaagagt 180
ttgttcaagg gaaccttgag agagaatgta tggaagaaaa gtgtagtttt gaagaagcac 240
gagaagtttt tgaaaacact gaaagaacaa ctgaattttg gaagcagtat gttgatggag 300
atcagtgtga gtccaatcca tgtttaaatg gcggcagttg caaggatgac attaattcct 360
atgaatgttg gtgtcccttt ggatttgaag gaaagaactg tgaattagat gtaacatgta 420
acattaagaa tggcagatgc gagcagtttt gtaaaaatag tgctgataac aaggtggttt 480
gctcctgtac tgagggatat cgacttgcag aaaaccagaa gtcctgtgaa ccagcagtgc 540
catttccatg tggaagagtt tctgtttcac aaacttctaa gctcacccgt gctgaggcag 600
tttttcctga tgtggactat gtaaattcta ctgaagctga aaccattttg gataacatca 660
ctcaaagcac ccaatcattt aatgacttca ctcgagttgt tggtggagaa gatgccaaac 720
caggtcaatt cccttggcag gttgttttga atggtaaagt tgatgcattc tgtggaggct 780
ctatcgttaa tgaaaaatgg attgtaactg ctgcccactg tgttgaaact ggtgttaaaa 840
ttacagttgt cgcaggtgaa cataatattg aggagacaga acatacagag caaaagcgaa 900
atgtgattcg aattattcct caccacaact acaatgcagc tattaataag tacaaccatg 960
acattgccct tctggaactg gacgaaccct tagtgctaaa cagctacgtt acacctattt 1020
gcattgctga caaggaatac acgaacatct tcctcaaatt tggatctggc tatgtaagtg 1080
gctggggaag agtcttccac aaagggagat cagctttagt tcttcagtac cttagagttc 1140
cacttgttga ccgagccaca tgtcttcgat ctacaaagtt caccatctat aacaacatgt 1200
tctgtgctgg cttccatgaa ggaggtagag attcatgtca aggagatagt gggggacccc 1260
atgttactga agtggaaggg accagtttct taactggaat tattagctgg ggtgaagagt 1320
gtgcaatgaa aggcaaatat ggaatatata ccaaggtatc ccggtatgtc aactggatta 1380
aggaaaaaac aaagctcact agctccagca gcaaggcccc tcccccgagc ctgccctccc 1440
caagcaggct gcctgggccc tctgacaccc ctatcctgcc tcagtccagc tcctctaagg 1500
ctccaccacc ttccctgcct agcccttcaa gactgccagg ccctagcgat acaccaattc 1560
tgccccagtc ctccagcagc aaggctcccc cacctagcct gccttctcca tcaaggctgc 1620
ctggcccatc cgatacccca attttgcctc agagcagctc tagcaaggca cctcccccca 1680
gtctgccctc tccaagcaga ctccctggcc cttcagacac tccaatcctc ccacagtcct 1740
ctagctctaa agctccacct cccagcctgc ccagccctag tagactcccc ggaccttctg 1800
atacccccat cttgccccag tgatgaggat ccgcggccgc 1840
<210> 35
<211> 610
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CTP-modified Factor IX
<400> 35
Arg Val Asp Pro Ala Met Gln Arg Val Asn Met Ile Met Ala Glu Ser
1 5 10 15
Pro Gly Leu Ile Thr Ile Cys Leu Leu Gly Tyr Leu Leu Ser Ala Glu
20 25 30
Cys Thr Val Phe Leu Asp His Glu Asn Ala Asn Lys Ile Leu Asn Arg
35 40 45
Pro Lys Arg Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gln Gly Asn
50 55 60
Leu Glu Arg Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg
65 70 75 80
Glu Val Phe Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gln Tyr
85 90 95
Val Asp Gly Asp Gln Cys Glu Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly Gly Ser
100 105 110
Cys Lys Asp Asp Ile Asn Ser Tyr Glu Cys Trp Cys Pro Phe Gly Phe
115 120 125
Glu Gly Lys Asn Cys Glu Leu Asp Val Thr Cys Asn Ile Lys Asn Gly
130 135 140
Arg Cys Glu Gln Phe Cys Lys Asn Ser Ala Asp Asn Lys Val Val Cys
145 150 155 160
Ser Cys Thr Glu Gly Tyr Arg Leu Ala Glu Asn Gln Lys Ser Cys Glu
165 170 175
Pro Ala Val Pro Phe Pro Cys Gly Arg Val Ser Val Ser Gln Thr Ser
180 185 190
Lys Leu Thr Arg Ala Glu Ala Val Phe Pro Asp Val Asp Tyr Val Asn
195 200 205
Ser Thr Glu Ala Glu Thr Ile Leu Asp Asn Ile Thr Gln Ser Thr Gln
210 215 220
Ser Phe Asn Asp Phe Thr Arg Val Val Gly Gly Glu Asp Ala Lys Pro
225 230 235 240
Gly Gln Phe Pro Trp Gln Val Val Leu Asn Gly Lys Val Asp Ala Phe
245 250 255
Cys Gly Gly Ser Ile Val Asn Glu Lys Trp Ile Val Thr Ala Ala His
260 265 270
Cys Val Glu Thr Gly Val Lys Ile Thr Val Val Ala Gly Glu His Asn
275 280 285
Ile Glu Glu Thr Glu His Thr Glu Gln Lys Arg Asn Val Ile Arg Ile
290 295 300
Ile Pro His His Asn Tyr Asn Ala Ala Ile Asn Lys Tyr Asn His Asp
305 310 315 320
Ile Ala Leu Leu Glu Leu Asp Glu Pro Leu Val Leu Asn Ser Tyr Val
325 330 335
Thr Pro Ile Cys Ile Ala Asp Lys Glu Tyr Thr Asn Ile Phe Leu Lys
340 345 350
Phe Gly Ser Gly Tyr Val Ser Gly Trp Gly Arg Val Phe His Lys Gly
355 360 365
Arg Ser Ala Leu Val Leu Gln Tyr Leu Arg Val Pro Leu Val Asp Arg
370 375 380
Ala Thr Cys Leu Arg Ser Thr Lys Phe Thr Ile Tyr Asn Asn Met Phe
385 390 395 400
Cys Ala Gly Phe His Glu Gly Gly Arg Asp Ser Cys Gln Gly Asp Ser
405 410 415
Gly Gly Pro His Val Thr Glu Val Glu Gly Thr Ser Phe Leu Thr Gly
420 425 430
Ile Ile Ser Trp Gly Glu Glu Cys Ala Met Lys Gly Lys Tyr Gly Ile
435 440 445
Tyr Thr Lys Val Ser Arg Tyr Val Asn Trp Ile Lys Glu Lys Thr Lys
450 455 460
Leu Thr Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
465 470 475 480
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser
485 490 495
Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro
500 505 510
Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala
515 520 525
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
530 535 540
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
545 550 555 560
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
565 570 575
Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro
580 585 590
Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser
595 600 605
Ala Ala
610
<210> 36
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 101 for FIX-(CTP)2
<400> 36
gtttagtgaa ccgtcagaat 20
<210> 37
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 103-R for FIX-(CTP)2
<400> 37
ttgaggaaga tgttcgtgta 20
<210> 38
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 98 for FIX-(CTP)2
<400> 38
attacagttg tcgcaggtga 20
<210> 39
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 99-Rfor FIX-(CTP)2
<400> 39
gctggagcta gtgagctttg ttttttcctt 30
<210> 40
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 100 for FIX-(CTP)2
<400> 40
gctcactagc tccagcagca aggcc 25
<210> 41
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 27-R for FIX-(CTP)2
<400> 41
ttttcactgc attctagttg tgg 23
<210> 42
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 75
<400> 42
ctcccagttc aattacagct 20
<210> 43
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 122r
<400> 43
ggaaaaactg cctcagcacg ggtgagc 27
<210> 44
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 123
<400> 44
gtgctgaggc agtttttcct gatgtggact at 32
<210> 45
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer 124r
<400> 45
caacacagtg ggcagcag 18
Claims (17)
1.一种绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)修饰的凝血因子VII(FVII)多肽，其由活化的凝血FVII(FVIIa)和连接至所述凝血因子的羧基端的3个CTP组成，其中没有CTP连接至所述凝血因子的氨基端，所述CTP修饰的FVIIa多肽具有SEQ ID NO：25的氨基酸39-528所示的氨基酸序列，其中所述活化的CTP修饰的FVII是以二硫键连接的双链异源二聚体形式。
2.根据权利要求1所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中所述多肽在SEQ ID NO：25的精氨酸152处切割。
3.根据权利要求1-2任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中至少一个CTP被糖基化。
4.根据权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其制备用于预防或治疗血液凝固或凝结障碍用途的组合物。
5.根据权利要求4所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中所述血液凝固或凝结障碍是血友病。
6.根据权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其制备用于减少受试者过度出血或擦伤用途的组合物。
7.根据权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其制备用于在手术或在外科手术过程中维持受试者的稳态用途的组合物。
8.根据权利要求6-7任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中所述受试者是血友病受试者，或者是患有维生素K缺乏或肝病的受试者。
9.根据权利要求4-8任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中所述用途通过皮下施用。
10.根据权利要求4-8任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中所述用途通过静脉内施用。
11.根据权利要求4-10任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中所述组合物用于儿童。
12.一种药物组合物，其包含根据权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽和药学上可接受的载体。
13.用作药物的根据权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽。
14.一种延长凝血FVII多肽的生物半衰期、提高凝血FVII多肽的曲线下面积(AUC)、降低凝血FVII多肽的施用频率或降低凝血FVII多肽清除率的方法，所述方法包括将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至FVIIa多肽的羧基端的步骤，由此生产根据权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽，其中所述凝血因子具有延长的生物半衰期、提高的曲线下面积(AUC)、降低的施用频率或降低的清除率。
15.一种生产根据权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽的方法，所述方法包括将3个绒毛膜促性腺激素羧基端肽(CTP)连接至FVIIa多肽的羧基端的步骤，由此生产所述CTP修饰的凝血FVII多肽。
16.编码权利要求1-3任一项所述的CTP修饰的凝血FVII多肽的多核苷酸。
17.权利要求16的多核苷酸，其中所述多核苷酸的核酸序列示于SEQ ID NO：24。
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US13/372,540 | 2012-02-14 | ||
| US13/372,540 US8759292B2 (en) | 2006-02-03 | 2012-02-14 | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| CN201380019660.8A CN104427994A (zh) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | 长效凝血因子和生产它们的方法 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380019660.8A Division CN104427994A (zh) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | 长效凝血因子和生产它们的方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN109535245A true CN109535245A (zh) | 2019-03-29 |
Family
ID=48983616
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380019660.8A Pending CN104427994A (zh) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | 长效凝血因子和生产它们的方法 |
| CN201811365443.5A Pending CN109535245A (zh) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | 长效凝血因子和生产它们的方法 |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201380019660.8A Pending CN104427994A (zh) | 2012-02-14 | 2013-02-05 | 长效凝血因子和生产它们的方法 |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (3) | EP2822576B1 (zh) |
| JP (2) | JP6242819B2 (zh) |
| KR (3) | KR102630953B1 (zh) |
| CN (2) | CN104427994A (zh) |
| AU (3) | AU2013219935B2 (zh) |
| BR (1) | BR122021004014B1 (zh) |
| CA (1) | CA2870621C (zh) |
| CL (2) | CL2014002183A1 (zh) |
| CO (1) | CO7131365A2 (zh) |
| DK (2) | DK3326642T3 (zh) |
| EA (2) | EA028578B1 (zh) |
| ES (2) | ES2855133T3 (zh) |
| HK (1) | HK1205460A1 (zh) |
| HU (1) | HUE053068T2 (zh) |
| IL (2) | IL264959B (zh) |
| MX (3) | MX362446B (zh) |
| MY (1) | MY172539A (zh) |
| NO (1) | NO2920022T3 (zh) |
| PE (1) | PE20142290A1 (zh) |
| PL (1) | PL3326642T3 (zh) |
| SG (1) | SG11201404836QA (zh) |
| WO (1) | WO2013121416A1 (zh) |
Families Citing this family (13)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| JP6242819B2 (ja) | 2012-02-14 | 2017-12-06 | オプコ バイオロジクス リミテッド | 長時間作用型凝固因子およびその生成方法 |
| US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
| CN107438623B (zh) * | 2014-12-10 | 2023-07-14 | Opko生物科学有限公司 | 长效的ctp修饰的生长激素多肽的制备方法 |
| US10960058B2 (en) * | 2015-06-19 | 2021-03-30 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| TWI741992B (zh) | 2015-08-03 | 2021-10-11 | 美商百歐維拉提夫治療公司 | 因子ｉｘ融合蛋白以及其製備及使用方法 |
| HUE064463T2 (hu) * | 2016-07-11 | 2024-03-28 | Opko Biologics Ltd | Hosszantartó hatású VII. koagulációs faktor és az elõállítására vonatkozó eljárások |
| EP3502143A4 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-15 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | BINDING PEPTIDE FOR THE CONSTRUCTION OF A FUSION PROTEIN |
| CN106279437B (zh) | 2016-08-19 | 2017-10-31 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 高糖基化人凝血因子viii融合蛋白及其制备方法与用途 |
| CN106317226B (zh) | 2016-08-19 | 2017-09-05 | 安源医药科技（上海）有限公司 | 用于构建融合蛋白的连接肽 |
| JP7023925B2 (ja) | 2017-03-08 | 2022-02-22 | テイ・エス テック株式会社 | 乗物用シート |
| US11981718B2 (en) | 2020-05-27 | 2024-05-14 | Ampsource Biopharma Shanghai Inc. | Dual-function protein for lipid and blood glucose regulation |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101595122A (zh) * | 2006-02-03 | 2009-12-02 | 莫迪格纳公司 | 长效多肽及其生产和施用方法 |
| US20100317585A1 (en) * | 2006-02-03 | 2010-12-16 | Udi Eyal Fima | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
Family Cites Families (37)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL154600B (nl) | 1971-02-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen. |
| NL154598B (nl) | 1970-11-10 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van laagmoleculire verbindingen en van eiwitten die deze verbindingen specifiek kunnen binden, alsmede testverpakking. |
| NL154599B (nl) | 1970-12-28 | 1977-09-15 | Organon Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van specifiek bindende eiwitten en hun corresponderende bindbare stoffen, alsmede testverpakking. |
| US3901654A (en) | 1971-06-21 | 1975-08-26 | Biological Developments | Receptor assays of biologically active compounds employing biologically specific receptors |
| US3853987A (en) | 1971-09-01 | 1974-12-10 | W Dreyer | Immunological reagent and radioimmuno assay |
| US3867517A (en) | 1971-12-21 | 1975-02-18 | Abbott Lab | Direct radioimmunoassay for antigens and their antibodies |
| NL171930C (nl) | 1972-05-11 | 1983-06-01 | Akzo Nv | Werkwijze voor het aantonen en bepalen van haptenen, alsmede testverpakkingen. |
| US3850578A (en) | 1973-03-12 | 1974-11-26 | H Mcconnell | Process for assaying for biologically active molecules |
| US3935074A (en) | 1973-12-17 | 1976-01-27 | Syva Company | Antibody steric hindrance immunoassay with two antibodies |
| US3996345A (en) | 1974-08-12 | 1976-12-07 | Syva Company | Fluorescence quenching with immunological pairs in immunoassays |
| US4034074A (en) | 1974-09-19 | 1977-07-05 | The Board Of Trustees Of Leland Stanford Junior University | Universal reagent 2-site immunoradiometric assay using labelled anti (IgG) |
| US3984533A (en) | 1975-11-13 | 1976-10-05 | General Electric Company | Electrophoretic method of detecting antigen-antibody reaction |
| US4098876A (en) | 1976-10-26 | 1978-07-04 | Corning Glass Works | Reverse sandwich immunoassay |
| US4879219A (en) | 1980-09-19 | 1989-11-07 | General Hospital Corporation | Immunoassay utilizing monoclonal high affinity IgM antibodies |
| US5011771A (en) | 1984-04-12 | 1991-04-30 | The General Hospital Corporation | Multiepitopic immunometric assay |
| DE3421468A1 (de) | 1984-06-08 | 1985-12-19 | Dr. Rentschler Arzneimittel Gmbh & Co, 7958 Laupheim | Lipidnanopellets als traegersystem fuer arzneimittel zur peroralen anwendung |
| US4666828A (en) | 1984-08-15 | 1987-05-19 | The General Hospital Corporation | Test for Huntington's disease |
| US4683202A (en) | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
| US4801531A (en) | 1985-04-17 | 1989-01-31 | Biotechnology Research Partners, Ltd. | Apo AI/CIII genomic polymorphisms predictive of atherosclerosis |
| DE122007000007I2 (de) | 1986-04-09 | 2010-12-30 | Genzyme Corp | Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern |
| US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
| US5272057A (en) | 1988-10-14 | 1993-12-21 | Georgetown University | Method of detecting a predisposition to cancer by the use of restriction fragment length polymorphism of the gene for human poly (ADP-ribose) polymerase |
| DE69029799T2 (de) | 1989-02-21 | 1997-05-28 | Washington University, St. Louis, Mo. | Modifizierte formen von fortpflanzungshormonen |
| US5792460A (en) * | 1989-02-21 | 1998-08-11 | Washington University | Modified glycoprotein hormones having a CTP at the amino terminus |
| US6225449B1 (en) * | 1991-10-04 | 2001-05-01 | Washington University | Hormone analogs with multiple CTP extensions |
| US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
| US5192659A (en) | 1989-08-25 | 1993-03-09 | Genetype Ag | Intron sequence analysis method for detection of adjacent and remote locus alleles as haplotypes |
| US5281521A (en) | 1992-07-20 | 1994-01-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Modified avidin-biotin technique |
| US5541110A (en) | 1994-05-17 | 1996-07-30 | Bristol-Myers Squibb | Cloning and expression of a gene encoding bryodin 1 from Bryonia dioica |
| US7795210B2 (en) * | 2001-10-10 | 2010-09-14 | Novo Nordisk A/S | Protein remodeling methods and proteins/peptides produced by the methods |
| CN1245510C (zh) * | 2003-09-25 | 2006-03-15 | 复旦大学 | 长效重组组织因子途径抑制物及其制备方法 |
| US8759292B2 (en) * | 2006-02-03 | 2014-06-24 | Prolor Biotech, Llc | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
| US8048849B2 (en) * | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Modigene, Inc. | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
| TWI538916B (zh) * | 2008-04-11 | 2016-06-21 | 介控生化科技公司 | 經修飾的因子vii多肽和其用途 |
| WO2010015668A1 (en) * | 2008-08-06 | 2010-02-11 | Novo Nordisk A/S | Conjugated proteins with prolonged in vivo efficacy |
| JP6242819B2 (ja) * | 2012-02-14 | 2017-12-06 | オプコ バイオロジクス リミテッド | 長時間作用型凝固因子およびその生成方法 |
| EP3848386A1 (en) * | 2012-11-20 | 2021-07-14 | OPKO Biologics Ltd. | Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides |
-
2013
- 2013-02-05 JP JP2014557168A patent/JP6242819B2/ja active Active
- 2013-02-05 KR KR1020217031683A patent/KR102630953B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-05 CN CN201380019660.8A patent/CN104427994A/zh active Pending
- 2013-02-05 EA EA201491519A patent/EA028578B1/ru unknown
- 2013-02-05 EP EP13749077.7A patent/EP2822576B1/en active Active
- 2013-02-05 BR BR122021004014-1A patent/BR122021004014B1/pt active IP Right Grant
- 2013-02-05 EP EP20204439.2A patent/EP3791890A1/en active Pending
- 2013-02-05 PL PL18150731T patent/PL3326642T3/pl unknown
- 2013-02-05 PE PE2014001261A patent/PE20142290A1/es active IP Right Grant
- 2013-02-05 EA EA201790960A patent/EA201790960A3/ru unknown
- 2013-02-05 KR KR1020147025500A patent/KR102118729B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-05 WO PCT/IL2013/050107 patent/WO2013121416A1/en active Application Filing
- 2013-02-05 ES ES18150731T patent/ES2855133T3/es active Active
- 2013-02-05 HU HUE18150731A patent/HUE053068T2/hu unknown
- 2013-02-05 AU AU2013219935A patent/AU2013219935B2/en active Active
- 2013-02-05 SG SG11201404836QA patent/SG11201404836QA/en unknown
- 2013-02-05 CA CA2870621A patent/CA2870621C/en active Active
- 2013-02-05 MY MYPI2014002356A patent/MY172539A/en unknown
- 2013-02-05 ES ES13749077.7T patent/ES2665319T3/es active Active
- 2013-02-05 KR KR1020207015367A patent/KR102310704B1/ko active IP Right Grant
- 2013-02-05 MX MX2014009910A patent/MX362446B/es active IP Right Grant
- 2013-02-05 CN CN201811365443.5A patent/CN109535245A/zh active Pending
- 2013-02-05 DK DK18150731.0T patent/DK3326642T3/da active
- 2013-02-05 EP EP18150731.0A patent/EP3326642B1/en active Active
- 2013-02-05 DK DK13749077.7T patent/DK2822576T3/en active
- 2013-11-13 NO NO13855153A patent/NO2920022T3/no unknown
-
2014
- 2014-08-14 MX MX2022008807A patent/MX2022008807A/es unknown
- 2014-08-14 MX MX2019000708A patent/MX2019000708A/es unknown
- 2014-08-14 CO CO14178314A patent/CO7131365A2/es unknown
- 2014-08-14 CL CL2014002183A patent/CL2014002183A1/es unknown
-
2015
- 2015-06-25 HK HK15106044.6A patent/HK1205460A1/zh unknown
-
2016
- 2016-05-03 AU AU2016202829A patent/AU2016202829B2/en active Active
-
2017
- 2017-08-24 AU AU2017219044A patent/AU2017219044B2/en active Active
- 2017-09-04 CL CL2017002233A patent/CL2017002233A1/es unknown
- 2017-11-08 JP JP2017215861A patent/JP6510002B2/ja active Active
-
2019
- 2019-02-21 IL IL264959A patent/IL264959B/en unknown
-
2021
- 2021-04-07 IL IL282121A patent/IL282121B/en unknown
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101595122A (zh) * | 2006-02-03 | 2009-12-02 | 莫迪格纳公司 | 长效多肽及其生产和施用方法 |
| US20100317585A1 (en) * | 2006-02-03 | 2010-12-16 | Udi Eyal Fima | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| M.M.MATZUK ET AL.: ""The Biological Role of the Carboxyl-Terminal Extension of Human Chorionic Gonadotroin β-Subunit"", 《ENDOCRINOLOGY》 * |
| 冀倩倩等: ""重组人长效凝血因子Ⅶ药物研发进展"", 《药学进展》 * |
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN109535245A (zh) | 长效凝血因子和生产它们的方法 | |
| US10144921B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| CN102639144B (zh) | 长效凝固因子及产生其的方法 | |
| US8759292B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| US11066658B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| AU2020203459B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| CN109563145A (zh) | 长效凝血因子及其制备方法 | |
| US20220170005A1 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| AU2017201513B2 (en) | Long-acting coagulation factors and methods of producing same | |
| EA044349B1 (ru) | Факторы свертывания крови пролонгированного действия и способы их получения | |
| BR112014020198B1 (pt) | Fator de coagulação modificado por peptídeos carbóxiterminais da gonadotrofina coriônica (ctp) e seu uso, método para produzir e extender a meia-vida do referido fator de coagulação, polinucleotídeo e composição farmacêutica |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |