ES2882890T3 - Método para aumentar el volumen hidrodinámico de polipéptidos mediante la unión a péptidos carboxi terminales de la gonadotrofina - Google Patents

Método para aumentar el volumen hidrodinámico de polipéptidos mediante la unión a péptidos carboxi terminales de la gonadotrofina Download PDF

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Abstract

Un método para aumentar el tamaño hidrodinámico de un polipéptido recombinante, en donde dicho polipéptido es el factor VIIa de la coagulación (FVIIa), el método comprende: (i) una etapa de fusión recombinante de tres unidades del péptido carboxi terminal (CTP) de la gonadotrofina coriónica al carboxi terminal de dicho factor VIIa de la coagulación (FVIIa), (ii) seguido de una etapa de expresión del polipéptido modificado con CTP recombinante en una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), en donde la expresión comprende glicosilar dichas unidades de CTP.

Description

DESCRIPCIÓN
Método para aumentar el volumen hidrodinámico de polipéptidos mediante la unión a péptidos carboxi terminales de la gonadotrofina
Campo de la invención
Esta invención está dirigida al uso de un péptido carboxi terminal (CTP) de la gonadotrofina coriónica para aumentar el volumen hidrodinámico de un polipéptido.
Antecedentes de la invención
Los productos biotecnológicos cubren una mayor proporción de todos los fármacos terapéuticos, que incluyen los anticuerpos monoclonales, vacunas, factores de crecimiento, hormonas, citocinas, factores de coagulación, proteínas de fusión, enzimas y otras proteínas. Además de los anticuerpos monoclonales y las vacunas, muchos en esta lista poseen una masa molecular más abajo de 50 kDa y una vida media terminal corta que está en el intervalo de minutos a horas.
La eficacia de las proteínas terapéuticas está fuertemente determinada por sus propiedades farmacocinéticas, que incluyen sus vidas medias plasmáticas, que influyen en la distribución y excreción. Aunque un tamaño pequeño facilita la penetración en los tejidos, estas moléculas a menudo se eliminan rápidamente de la circulación. Por tanto, para mantener una concentración terapéuticamente efectiva durante un período prolongado de tiempo, se realizan infusiones o administraciones frecuentes, o el fármaco se aplica locorregional o subcutáneamente utilizando una adsorción lenta en el torrente sanguíneo. Estas limitaciones de los fármacos proteicos de pequeño tamaño han llevado al desarrollo y la implementación de estrategias de extensión de la vida media para prolongar la circulación de estos anticuerpos recombinantes en la sangre y así mejorar la administración y las propiedades farmacocinéticas y farmacodinámicas.
La presente invención emplea una estrategia de este tipo para aumentar el tamaño o volumen hidrodinámico de las proteínas de interés, que incluye los péptidos, mediante un factor particular y, de esta manera, mejorar la administración, la farmacocinética, así como también las propiedades farmacodinámicas de las mismas. Este aumento en el volumen hidrodinámico se logra mediante el uso de una tecnología basada en péptidos para extender la vida media de proteínas y péptidos en el suero. Esta tecnología se basa en el uso de un péptido natural, el péptido C-terminal (CTP) de la cadena beta de la gonadotropina coriónica humana (hCG), que proporciona a la hCG la longevidad necesaria para mantener el embarazo. La cadena beta de la hormona luteinizante (LH), una hormona de la fertilidad que desencadena la ovulación, es casi idéntica a la hCG, pero no incluye el CTP. Como resultado, la LH tiene una vida media en sangre significativamente más corta. La unión de un número predeterminado de CTP a una proteína o péptido de interés aumenta el volumen hidrodinámico del mismo en un factor específico y da como resultado propiedades mejoradas que incluyen una vida media en el suero mejorada y la potencia de la proteína o péptido de interés.
Resumen de la invención
La invención está definida por las reivindicaciones adjuntas. La presente invención proporciona un método para aumentar el tamaño hidrodinámico de un polipéptido recombinante, en donde dicho polipéptido es el factor VIIa de la coagulación (FVIIa), el método comprende fusionar de forma recombinante tres unidades del péptido carboxi terminal (CTP) de la gonadotrofina coriónica al extremo carboxi de dicho factor VIIa de la coagulación (FVIIa), seguido de la expresión del polipéptido modificado con CTP recombinante en una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), en donde la expresión comprende glicosilar dichas unidades de CTP.
En una modalidad, la secuencia de aminoácidos de una de las unidades de CTP comprende la SEQ ID NO: 2.
En una modalidad, la glicosilación de las unidades de CTP comprende la O-glicosilación que consiste de una unión de GalNAc a serina (Ser) o treonina (Thr) en la cadena polipeptídica de las unidades de CTP mediante un enlace aglicosídico, un núcleo 1 de glicosilación, una O-fucosilación, una O-manosilación u O-glucosilación.
En una modalidad, la O-glicosilación va seguida de la adición de una a sesenta moléculas de galactosa o de la adición de una a 120 moléculas de ácido siálico.
En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del polipéptido que consiste de tres CTP fusionados al carboxi terminal de dicho FVIIa comprende la SEQ ID NO: 52.
Otras características y ventajas de la presente invención serán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos y figuras.
Breve descripción de los dibujos
Los siguientes dibujos forman parte de la presente descripción y se incluyen para demostrar además ciertos aspectos de la presente descripción, cuyas invenciones pueden entenderse mejor con referencia a uno o más de estos dibujos en combinación con la descripción detallada de las modalidades específicas presentadas en la presente descripción.
La Figura 1 muestra un análisis de SDS-PAGE de seis proteínas diferentes modificadas con CTP purificadas y sus proteínas nativas correspondientes. 1. CTP-hGH-CTP-CTP (MOD-4023), 2. Biotropina (rhGH), 3. Marcador de tamaño, 4. CTP-EPO-CTP-CTP, 5. CTP-CTP-EPO, 6. CTP-CTP-EPO-CTP-CTP, 7. EPREX® (rEPO), 8. Marcador de tamaño, 9. APO-A1, 10. Marcador de tamaño, 11. Apo-CTP, 12. Apo-CTP-CTP, 13. Marcador de tamaño.
La Figura 2 muestra un análisis de SDS-PAGE de cinco proteínas diferentes modificadas con CTP purificadas y sus proteínas nativas correspondientes. 1. FIX-CTP-CTP-CTP 2. marcador de tamaño 3. FIX-CTP-CTP-CTP-c Tp 4. FIX-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP 5. Mononine® (rFIX) 6. marcador de tamaño 7. FVIIa-CTP-CTP-CTP 8. FVIIa-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP 9. marcador de tamaño.
La Figura 3 muestra el incremento de peso molecular (kDa) de una copia de CTP de proteínas modificadas con CTP tanto no glicosiladas (A) como glicosiladas (B) según se midió mediante MALDI-TOF.
La Figura 4 muestra el incremento del tamaño hidrodinámico de las proteínas modificadas con CTP glicosiladas en comparación con sus proteínas nativas correspondientes, medido por SEC-HPLC. (A) exhibe el incremento total del tamaño hidrodinámico, mientras que (B) exhibe el incremento calculado por una copia de CTP glicosilada.
La Figura 5 muestra el incremento del tamaño hidrodinámico de las proteínas modificadas con CTP no glicosiladas en comparación con sus proteínas nativas correspondientes, medido por columna SEC-HPLC. (A) exhibe el incremento total del tamaño hidrodinámico, mientras que (B) exhibe el incremento calculado por una copia de CTP no glicosilada.
Descripción detallada de la invención
La presente invención proporciona un método para aumentar el tamaño hidrodinámico de un polipéptido recombinante, en donde dicho polipéptido es el factor VIIa de la coagulación (FVIIa), el método comprende fusionar de forma recombinante tres unidades del péptido carboxi terminal (CTP) de la gonadotrofina coriónica al extremo carboxi de dicho factor VIIa de la coagulación (FVIIa), seguido de la expresión del polipéptido modificado con CTP recombinante en una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), en donde la expresión comprende glicosilar dichas unidades de CTP.
En una modalidad, los términos "proteína" y "polipéptido" se usan indistintamente en la presente descripción.
En una modalidad, los términos "tamaño hidrodinámico" o "volumen hidrodinámico" se usan indistintamente en la presente descripción y cada uno se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) basado en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión o movimiento de una proteína a través de la solución puede procesarse para obtener un tamaño aparente de la proteína, donde el tamaño viene dado por el "radio de Stokes" o el "radio hidrodinámico" de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de manera que dos proteínas que tienen la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos en función de la conformación general de la proteína.
En otra modalidad, el tipo de glicosilación es O-glicosilación. En otra modalidad, el tipo de O-glicosilación es la unión de GalNAc a serina (Ser) o treonina (Thr) en la cadena proteica mediante un enlace a-glicosídico. En otra modalidad, el tipo de O-glicosilación es la unión de N-acetilglucosamina (GlcNac) a los residuos de Ser o Thr en la cadena proteica. En otra modalidad, el tipo de O-glicosilación es O-fucosilación, O-manosilación, O-glicosilación del núcleo 1, O-glicosilación del núcleo 2 u O-glucosilación. En otra modalidad, la O-glicosilación es O-glicosilación de tipo mucina. En otra modalidad, la O-glicosilación comprende los glicanos enlazados a O unidos al oxígeno del hidroxi de las cadenas laterales de serina, treonina, tirosina, hidroxilisina o hidroxiprolina. En otra modalidad, la O-glicosilación es seguida por la adición de galactosa y/o ácido siálico, donde en otras modalidades se adiciona al menos una molécula de galactosa, y/o al menos una molécula de ácido siálico se adiciona a la proteína de interés a seguido de la O-glicosilación. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 3 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 3 moléculas de ácido siálico. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 5 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 5 moléculas de ácido siálico. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 10 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 20 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 21 a 30 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 31 a 40 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 41 a 50 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 51 a 60 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 61 a 70 moléculas de galactosa. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 10 moléculas de ácido siálico. En otra modalidad, se adicionan 2 moléculas de ácido siálico por cada molécula de galactosa adicionada. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 5 moléculas de galactosa por cada CTP. En otra modalidad, se adicionan de 1 a -10 moléculas de ácido siálico por cada CTP. En otra modalidad, se adicionan de 1 a 60 moléculas de galactosa y se adicionan de 1 a 120 moléculas de ácido siálico en total por cada polipéptido modificado con CTP.
En otra modalidad, el tipo de glicosilación proporcionado en la presente descripción es N-glicosilación. En otra modalidad, los glicanos enlazados a N se unen a un nitrógeno de las cadenas laterales de asparagina o arginina. La secuencia consenso de aminoácidos enlazados a N es Asn-cualquier aminoácido-Ser o Thr, donde ningún aminoácido puede ser prolina.
En una modalidad, el CTP glicosilado aumenta el volumen hidrodinámico de una proteína a la que está unida o fusionada.
Se describe que las proteínas modificadas con CTP que contienen glicanos en la porción nativa de la proteína contribuyen a un incremento mayor del volumen hidrodinámico de una copia de CTP glicosilado, por ejemplo, el ejemplo 3/tabla 4 en la presente descripción demuestra que las proteínas modificadas con FIX y FVIIa-CTP que contienen glicanos en la porción nativa de la proteína contribuyen a un incremento mayor del volumen hidrodinámico de una copia de CTP glicosilado.
En una modalidad, el término "unido" y variantes gramaticales del mismo se refieren a la unión de una proteína, polipéptido o péptido a otra proteína, polipéptido o péptido. En otra modalidad, tal unión se refiere a la unión de una proteína, polipéptido o péptido de interés a al menos un péptido CTP proporcionado en la presente descripción. En otra modalidad, tal unión se refiere a la unión de una proteína, polipéptido o péptido de interés a uno a diez péptidos CTP proporcionados en la presente descripción. Tal unión puede lograrse a través de numerosos medios que incluyen, entre otros, unión covalente, unión de hidrógeno, unión iónica, unión metálica, unión covalente polar, unión no covalente (interacciones de van der Waals, interacciones hidrófobas, unión de hidrógeno, etc.), unión mediante el uso de enlazadores y similares.
El experto en la materia apreciará que los términos "sin glicosilación" y "desglicosilación" y variantes gramaticales de los mismos se usan indistintamente en la presente descripción.
El método de la invención puede dar como resultado el aumento de la actividad biológica in vivo, el aumento de la vida media en el suero, el aumento de la biodisponibilidad, el aumento de la potencia o la extensión del área bajo la curva (AUC) del polipéptido FVIIa.
En otra modalidad, el polipéptido modificado con CTP puede tener una menor actividad biológica in vitro, pero esta menor actividad se compensa con una vida media prolongada. En otra modalidad, el polipéptido modificado con CTP tiene una actividad biológica in vitro aumentada.
En otra modalidad, aumentar el volumen hidrodinámico del polipéptido proporcionado en la presente descripción reduce la frecuencia de administración del polipéptido. En otra modalidad, aumentar el volumen hidrodinámico del polipéptido también aumenta el peso molecular aparente del polipéptido.
En una modalidad, el peso molecular aparente se determina mediante el uso de los métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen, entre otros, cromatografía de exclusión por tamaño (SEC), métodos de dispersión dinámica de luz (DLS), velocidad de sedimentación, centrifugación en equilibrio de sedimentación y detección espectrofotométrica. En otra modalidad, el peso molecular teórico se determina mediante el uso de un software proteómico disponible en la técnica. Tales softwares incluyen, entre otros, el portal Expasy, ProteoIQ, Scaffold 3 y similares. En otra modalidad, el peso molecular real se determina mediante el uso de los métodos bien conocidos en la técnica, que incluyen, pero no se limitan a, MALDI-TOF.
Los métodos descritos en la presente descripción demuestran inesperadamente que las adiciones posteriores de péptidos CTP glicosilados a un polipéptido de interés contribuyen linealmente con aproximadamente el mismo peso molecular aparente que una unión anterior de un péptido CTP al polipéptido de interés (véase la tabla 3).
En una modalidad, el método aumenta el tamaño o volumen hidrodinámico del polipéptido en aproximadamente 84 -159 kDa en comparación con un polipéptido no modificado. En otra modalidad, el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 84-162 kDa se logra al unir 3 péptidos CTP glicosilados al polipéptido de interés.
El método de la invención puede resultar en el aumento de la actividad biológica, la vida media en el suero, la biodisponibilidad, la potencia, etc, del polipéptido de interés de FVIIa modificado con CTP aumentando el volumen hidrodinámico del polipéptido de interés en una cantidad específica, como en comparación con una forma no modificada del polipéptido.
En una modalidad, el método aumenta el volumen hidrodinámico del polipéptido de interés de FVIIa modificado con CTP y mejora la biodisponibilidad del polipéptido. En otra modalidad, el método reduce la frecuencia de dosificación requerida del polipéptido de interés.
En esta invención, el polipéptido al que se unen los péptidos CTP es el Factor IIa (FVIIa). Otros polipéptidos, tales como la eritropoyetina (EPO), la hormona del crecimiento humano (hGH), la apolipoproteína A1 (APO-A1), el Factor IX (FIX) o la oxintomodulina (OXM) se describen en la presente descripción como polipéptidos de referencia.
Se describe que el CTP no glicosilado aporta un volumen hidrodinámico diferente a cada polipéptido al que se enlaza el CTP no glicosilado. Esta diferencia depende del polipéptido al que se une el CTP no glicosilado (véase el ejemplo 3 en la presente descripción). También se describe que el CTP no glicosilado aporta inesperadamente el mismo tamaño hidrodinámico por cada CTP en cada polipéptido particular independientemente del número de péptidos CTP no glicosilados unidos al polipéptido (véase el ejemplo 3 en la presente descripción).
Se describe que el aumento de la vida media en el suero o la actividad biológica de FVIIa se logra al aumentar el tamaño o volumen hidrodinámico del polipéptido en aproximadamente 43-50 kDa en comparación con un FVIIA no modificado. El aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 86-100 kDa se logra al unir 2 péptidos CTP glicosilados al FVIIA. En otra modalidad, el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 129-150 kDa se logra al unir 3 péptidos CTP glicosilados al FVIIA. También se describe que el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 172-200 kDa se logra mediante la unión de 4 péptidos CTP glicosilados al FVIIA; el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 215-250 kDa se logra mediante la unión de 5 péptidos CTP glicosilados al FVIIA; el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 258-300 kDa se logra mediante la unión de 6 péptidos CTP glicosilados al FVIIA; el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 301-350 kDa se logra mediante la unión de 7 péptidos CTP glicosilados al FVIIA; el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 344-400 kDa se logra mediante la unión de 8 péptidos CTP glicosilados al FVIIA; el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 387-450 kDa se logra mediante la unión de 9 péptidos CTP glicosilados al FVIIA; y el aumento del tamaño o volumen hidrodinámico en aproximadamente 430-500 kDa se logra mediante la unión de 10 péptidos CTP glicosilados al FVIIA.
En una modalidad, el volumen hidrodinámico aumenta el tiempo de retención de la proteína de interés en una muestra biológica. En otra modalidad, el volumen hidrodinámico aumenta el área bajo la curva (AUC) de la proteína de interés en una muestra biológica. En otra modalidad, la muestra biológica es sangre, tejidos diana (por ejemplo, ligamento, CNS), líquido cefalorraquídeo (CSF), linfa o suero.
En otra modalidad, el aumento del volumen hidrodinámico aumenta la biodisponibilidad del polipéptido de interés proporcionado en la presente descripción. En otra modalidad, el aumento del volumen hidrodinámico del polipéptido también extiende la vida media del polipéptido en el suero.
En otra modalidad, el aumento del volumen hidrodinámico aumenta la bioactividad del polipéptido.
En otra modalidad, los términos "péptido CTP", "péptido carboxi terminal" y "secuencia de CTP" se usan indistintamente en la presente descripción. En otra modalidad, el péptido carboxi terminal es un CTP de longitud completa. En otra modalidad, el péptido carboxi terminal es un CTP truncado.
En otra modalidad, se une un péptido señal al extremo amino del CTP, como se describió en el documento de EE. UU. 7,553,940.
En otra modalidad, al menos un CTP se une al polipéptido mediante un enlazador. En otra modalidad, el enlazador es un enlace peptídico. En otra modalidad, la proteína fusionada forma un polipéptido modificado con CTP. En una modalidad, el aumento del volumen hidrodinámico del polipéptido comprende fusionar el polipéptido con tres péptidos CTP en el extremo carboxilo terminal de los polipéptidos. En otra modalidad, el CTP se fusiona de forma recombinante con los polipéptidos.
En una modalidad, los polipéptidos de interés modificados con CTP modificados por ingeniería genética son al menos equivalentes a los polipéptidos de interés no modificados con CTP, en términos de actividad biológica. En otras modalidades, los polipéptidos de interés modificados con CTP modificados por ingeniería genética son al menos equivalentes a los polipéptidos de interés no modificados con CTP, en términos de medidas farmacológicas tales como farmacocinética y farmacodinámica.
En una modalidad, la secuencia de CTP proporcionada en la presente descripción comprende: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPIL (SEQ ID NO: 1). En otra modalidad, la secuencia de CTP comprende: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 2). En otra modalidad, la secuencia del CTP comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada de las secuencias que se establece en la SEQ ID NO: 1 o la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad más, la secuencia de CTP se selecciona del grupo que consiste en la SEQ ID NO: 1 y la SEQ ID NO: 2.
En una modalidad, el péptido carboxi terminal (CTP) de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 112 a la posición 145 de la gonadotrofina coriónica humana. En otra modalidad, la secuencia de CTP de la presente invención comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 118 a la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se establece en la SEQ ID NO: 2. En otra modalidad, la secuencia de CTP también comienza desde cualquier posición entre las posiciones 112-118 y termina en la posición 145 de la gonadotrofina coriónica humana. En otra modalidad, el péptido con secuencia de CTP tiene 28, 29, 30, 31, 32, 33 o 34 aminoácidos de longitud y comienza en la posición 112, 113, 114, 115, 116, 117 o 118 de la secuencia de aminoácidos de CTP.
En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 10 aminoácidos de la SEQ ID NO: 3. En otra modalidad, la SEQ ID NO: 3 comprende la siguiente secuencia de aminoácidos (AA): SSSSKAPPPSLP.
En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 11 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 12 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 8 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 13 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 14 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 6 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3. En una modalidad, el CTP truncado comprende los primeros 5 aminoácidos de la SEQ ID NO: 2 o de la SEQ ID NO: 3.
En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de la gonadotrofina coriónica que difiere del CTP nativo por 1-5 sustituciones conservadoras de aminoácidos como se describió en la patente de Estados Unidos núm.
5,712,122. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de la gonadotrofina coriónica que difiere del CTP nativo por 1 sustitución conservadora de aminoácidos. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de la gonadotrofina coriónica que difiere del CTP nativo por 2 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de la gonadotrofina coriónica que difiere del CTP nativo por 3 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de la gonadotrofina coriónica que difiere del CTP nativo por 4 sustituciones conservadoras de aminoácidos. En otra modalidad, el péptido CTP es una variante de CTP de la gonadotrofina coriónica que difiere del CTP nativo por 5 sustituciones conservadoras de aminoácidos.
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 40 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 50 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 60 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 70 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 80 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 90 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 95 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del péptido CTP de la presente invención es al menos 98 % homóloga a la secuencia de aminoácidos del CTP nativo o un péptido del mismo.
En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP de la presente invención es al menos un 70 % homólogo a la secuencia de ADN del CTP humano nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP de la presente invención es al menos un 80 % homólogo a la secuencia de ADN del CTP humano nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP de la presente invención es al menos un 90 % homólogo a la secuencia de ADN del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP de la presente invención es al menos un 95 % homólogo a la secuencia de ADN del CTP nativo o un péptido del mismo. En otra modalidad, el polinucleótido que codifica el péptido CTP de la presente invención es al menos un 98 % homólogo a la secuencia de ADN del CTP nativo o un péptido del mismo.
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotrofina coriónica está truncada. En otra modalidad, dos de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotrofina coriónica están truncadas. En otra modalidad, todas las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotrofina coriónica están truncadas.
En una modalidad, los péptidos CTP proporcionados en la presente descripción se unen a los polipéptidos proporcionados en la presente descripción mediante un enlazador. En una modalidad, uno a diez péptidos CTP están unidos a los polipéptidos proporcionados en la presente descripción mediante un enlazador. En una modalidad, al menos un CTP se une a los polipéptidos proporcionados en la presente descripción mediante un enlazador. En otra modalidad, el enlazador es un enlace peptídico.
En esta invención, todas las secuencias de aminoácidos de CTP de gonadotrofina coriónica unidas al FVIIa están glicosiladas.
La secuencia de CTP glicosilado para uso en la presente invención comprende al menos un sitio de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP glicosilado comprende dos sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP glicosilado comprende tres sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP glicosilado comprende cuatro sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP glicosilado comprende cinco sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP glicosilado comprende seis sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP glicosilado comprende siete sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP glicosilado comprende ocho sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP comprende de uno a cuatro sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP comprende de cuatro a nueve sitios de glicosilación. En otra modalidad, la secuencia de CTP comprende de seis a doce sitios de glicosilación.
En una modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotrofina coriónica está completamente glicosilada. En otra modalidad, al menos una de las secuencias de aminoácidos del CTP de la gonadotrofina coriónica está parcialmente glicosilada. En una modalidad, parcialmente glicosilado indica que al menos uno de los sitios de glicosilación de CTP está glicosilado. En otra modalidad, los sitios de glicosilación son sitios de O-glicosilación. En otra modalidad, los sitios de glicosilación son sitios de N-glicosilación.
En una modalidad, la modificación de la secuencia de CTP es ventajosa al permitir el uso de dosis más bajas cuando se une al polipéptido de FVIIa. En otra modalidad, la modificación de las secuencias de CTP es ventajosa al permitir menos dosis del polipéptido FVIIa. En otra modalidad, la modificación de las secuencias de CTP es ventajosa porque permite un efecto seguro y de acción prolongada cuando se administra un polipéptido FVIIa modificado con CTP.
En una modalidad, se entiende que “aminoácido” o “secuencia de aminoácidos" incluyen los 20 aminoácidos naturales; aquellos aminoácidos frecuentemente modificados postraduccionalmente in vivo, que incluyen, por ejemplo, hidroxiprolina, fosfoserina y fosfotreonina; y otros aminoácidos inusuales que incluyen, pero que no se limitan a, ácido 2-aminoadípico, hidroxilisina, isodesmosina, norvalina, norleucina y ornitina.
En algunas modalidades, las técnicas de proteínas recombinantes se usan para generar los polipéptidos modificados por ingeniería genética en la presente invención. En otra modalidad, las técnicas recombinantes se describen por Bitter y otros, (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier y otros. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89, Brisson y otros. (1984) Nature 310:511-514, Takamatsu y otros. (1987) EMBO J. 6:307-311, Coruzzi y otros. (1984) EMBO J.
3:1671-1680 y Brogli y otros. (1984) Science 224:838-843, Gurley y otros. (1986) Mol. Cell. Biol. 6: 559-565 y Weissbach & Weissbach, 1988.
En una modalidad, el polipéptido de interés proporcionado en la presente descripción comprende además un péptido señal. En otra modalidad, después de la expresión y secreción, el péptido señal se escinde de los péptidos/polipéptidos modificados por ingeniería genética precursores dando como resultado los péptidos/polipéptidos modificados por ingeniería genética maduros. En otra modalidad, las secuencias señales incluyen, pero no se limitan a las secuencias señales endógenas.
En otra modalidad, "secuencia señal" y "péptido señal" se usan indistintamente en la presente descripción. En otra modalidad, “secuencia” cuando se usa en referencia a una molécula de polinucleótido puede referirse a una porción codificante.
En una modalidad, la secuencia de aminoácidos del factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC
KEEQCS FEE AREIFKD AERTKLFWIS YS DGDQC AS SPCQNGGSCKDQLQS YICFCLP
AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTP
TVEYPCGK1PILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINT
IWVVSAAHCFDKTKNWRNLTAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVTTPSTYVPGTTNH
DIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALEL
MVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH
YRGTW YLTGIVS WGQ GC AT VGHF G V YTR V SQYIEWLQ KLMRS EPR
PGVLLRAPF(SEQ ID NO: 45).
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del factor VII comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC
KEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLP
AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTP
TVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINT
IWVVSAAHCFDK1KNWRNL1AVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNH
DIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALEL
MVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH
YRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPF
P*C3CGR.(SEQ ID NO: 46).
En otra modalidad, la secuencia de ácido nucleico que codifica el factor VII comprende la secuencia de ácido nucleico:
CTCGAGGAC ATGGTCT CCC AGGCCCTC AGGCTCCTCTGCCTTCT GCTTGGGCTTC A
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCA
CCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGA
GAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAA
GGACGCGG AGAGGACG A AGCT GTTCTGG ATTTC TT AC AGT GATGGGG AC C AGTG
TGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTAT
ATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATG
ACC AGCTGAT C TGTGTG A ACG AGA ACGGCGGCT GT G AGC AGT ACT GC AGT GACC
ACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAG
ACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCT
AGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGT
GCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTT
GTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTC
GACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTC
AGCG AGC ACGACGGGG ATG AGC AG AGCCGGCGGGTGGCGC AGGTC ATC ATCCCC
AGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACC
AGCCCGT GGT CCTC ACT GACC ATGT GGT GCCCCTCT GCCT GCCCGA AC GG ACGTT
CTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAG
CTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGC
TGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATA
TCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAA
GGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGAC g g g c a tc g tc a g c t g g g g c c a g g g c t g c g c a a c c g t g g g c c a c t t t g g g g t g t a
CACCAGGGTCTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAAAAGCTCATGCGCTCAGAGCC
AÍ.X.íí.X.XVAGO AGTÍA.'TÍ.X'TGC’G AC.íCXX.X'ATTTCXX.'TO AG(.¡ ATGCX.X.ií.X.X.iC' (SEQ ID NO: 47).
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el factor VII-CTP (unido al extremo carboxi) puede comprender la siguiente secuencia de ácido nucleico:
CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCA
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCA
CCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGA
GAGGGAGTGCAAGGAGGAGGAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAA
GGACGCGGAGAGGACGAAGCTGTTCTGGATTTCTTACAGTGATGGGGACCAGTG
TGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTAT
ATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATG
ACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACC
ACACGGGCACCAAGCGCTCCTGTCGGTGCCACGAGGGGTACTCTCTGCTGGCAG
ACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCT
AGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGT
GCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTT
GTGTGGGGGGACCCTGATCAACACCATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCCACTGTTTC
GAC A AAATC A AGA ACT GGAGG A ACCTGATCGCGGTGCT GGGCGAGC ACGACCTC
AGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCC
AGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACC
AGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGGCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTT
CTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAG
CTGCTGGACCCTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGC
TGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATA
TCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGGAGCAAGGACTCCTGCAA
GGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGACCGG
CATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTACACCAGG
GTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCCCAGACCCGGC
GTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCTCCCCCTAGCCTGC
CCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCAGCGACACCCCCATCCTGCCCCAGTGAGGATC
CGCGGCCGC (SEQ ID NO: 48).
Una secuencia de aminoácidos del factor VII-CTP (unido al extremo carboxi) puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC
KEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLP
AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTP
TVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINT
IWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNH
DIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALEL
MVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH
YRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPF
PSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ:(SEQ ID NO: 49).
Una secuencia de ácido nucleico que codifica el factor VII-CTP-CTP (unido al extremo carboxi) puede comprender la siguiente secuencia de ácido nucleico:
CTCGAGGACATGGTCTCCCAGGCCCTCAGGCTCCTCTGCCTTCTGCTTGGGCTTCA
GGGCTGCCTGGCTGCAGTCTTCGTAACCCAGGAGGAAGCCCACGGCGTCCTGCA
CCGGCGCCGGCGCGCCAACGCGTTCCTGGAGGAGCTGCGGCCGGGCTCCCTGGA
GAGGGAGTGCAAGGAGGAGCAGTGCTCCTTCGAGGAGGCCCGGGAGATCTTCAA
GGACGC GG AGAGGACG A AGCT GTTCTGG ATTTCTT AC AGT G ATGGGGACC AG T G
TGCCTCAAGTCCATGCCAGAATGGGGGCTCCTGCAAGGACCAGCTCCAGTCCTAT
ATCTGCTTCTGCCTCCCTGCCTTCGAGGGCCGGAACTGTGAGACGCACAAGGATG
ACCAGCTGATCTGTGTGAACGAGAACGGCGGCTGTGAGCAGTACTGCAGTGACC
AC ACGGGC ACC A AGCGCTCCT GT CGGT GCC ACG AGGGGT ACTCT CTGCT GGC AG
ACGGGGTGTCCTGCACACCCACAGTTGAATATCCATGTGGAAAAATACCTATTCT
AGAAAAAAGAAATGCCAGCAAACCCCAAGGCCGAATTGTGGGGGGCAAGGTGT
GCCCCAAAGGGGAGTGTCCATGGCAGGTCCTGTTGTTGGTGAATGGAGCTCAGTT
GTGTGGGGGGACCCTG ATC A AC ACC ATCTGGGTGGTCTCCGCGGCCC ACTGTTTC
GACAAAATCAAGAACTGGAGGAACCTGATCGCGGTGCTGGGCGAGCACGACCTC
AGCGAGCACGACGGGGATGAGCAGAGCCGGCGGGTGGCGCAGGTCATCATCCCC
AGCACGTACGTCCCGGGCACCACCAACCACGACATCGCGCTGCTCCGCCTGCACC
AGCCCGTGGTCCTCACTGACCATGTGGTGCCCCTCTGCCTGCCCGAACGGACGTT
CTCTGAGAGGACGCTGGCCTTCGTGCGCTTCTCATTGGTCAGCGGCTGGGGCCAG
CTGCTGGACCGTGGCGCCACGGCCCTGGAGCTCATGGTCCTCAACGTGCCCCGGC
TGATGACCCAGGACTGCCTGCAGCAGTCACGGAAGGTGGGAGACTCCCCAAATA
TCACGGAGTACATGTTCTGTGCCGGCTACTCGGATGGCAGCAAGGACTCCTGCAA
GGGGGACAGTGGAGGCCCACATGCCACCCACTACCGGGGCACGTGGTACCTGAC
CGGCATCGTGAGCTGGGGCCAGGGCTGCGCCACCGTGGGCCACTTCGGCGTGTA
CACCAGGGTGTCCCAGTACATCGAGTGGCTGCAGAAACTGATGAGAAGCGAGCC
CAGACCCGGCGTGCTGCTGAGAGCCCCCTTCCCCAGCAGCAGCTCCAAGGCCCCT
CCCCCTAGCCTGCCCAGCCCTAGCAGACTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCC
TGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCG
GCT GCC AGGCCCC TCTGAC ACCCCT AT CCTGCCTC AGTGATGA AGGT CT GGAT CC
GCGGCCGC(SEQ ID NO: 50).
Una secuencia de aminoácidos del factor VII-CTP-CTP (unido al extremo carboxi) puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC
KEEQCSFEEARE1FKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLP
AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTP
TVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINT
IWVVSAAHCFDKIKNWRNL1AVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNH
DIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALEL
MVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH
YRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPF
PSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ**
(SEQ ID NO: 51).
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos del factor VII-CTP-CTP-CTP (tres unidos al extremo carboxi) comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC
KEEQCSFEEARE1FKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLP
AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTP
TVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINT
IWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNH
DIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALEL
MVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH
YRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPF
PSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSK
APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(SEQ ID NO: 52).
Una secuencia de aminoácidos del factor VII-CTP(X4) (cuatro unidos al extremo carboxi) puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC
KEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFW1SYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSYICFCLP
AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTP
TVEYPCGKIPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINT
IWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVITPSTYVPGTTNH
DIALLRLHQPV VLTDH VVPLCLPERTFSERTL AF VRFS LV S GW GQLLDR G AT ALEL
MVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH
YRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYIEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPF
PSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSK
APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDT PILPQ( SEQ ID NO: 53).
Una secuencia de aminoácidos del factor VII-CTP(x5) (cinco unidos al extremo carboxi) puede comprender la siguiente secuencia de aminoácidos:
MVSQALRLLCLLLGLQGCLAAVFVTQEEAHGVLHRRRRANAFLEELRPGSLEREC
KEEQCSFEEAREIFKDAERTKLFWISYSDGDQCASSPCQNGGSCKDQLQSY1CFCLP
AFEGRNCETHKDDQLICVNENGGCEQYCSDHTGTKRSCRCHEGYSLLADGVSCTP
TVEYPCGKTPILEKRNASKPQGRIVGGKVCPKGECPWQVLLLVNGAQLCGGTLINT
IWVVSAAHCFDKIKNWRNLIAVLGEHDLSEHDGDEQSRRVAQVIIPSTYVPGTTNH
DIALLRLHQPVVLTDHVVPLCLPERTFSERTLAFVRFSLVSGWGQLLDRGATALEL
MVLNVPRLMTQDCLQQSRKVGDSPNITEYMFCAGYSDGSKDSCKGDSGGPHATH
YRGTWYLTGIVSWGQGCATVGHFGVYTRVSQYTEWLQKLMRSEPRPGVLLRAPF
PSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSK
APPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSL
PSPSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 54).
En otra modalidad, se adiciona furina a una célula que expresa el factor de coagulación-CTP en el método de la invención. En otra modalidad, la furina aumenta la eficiencia de producción de un factor de coagulación-CTP de la invención en una célula. En otra modalidad, la furina se transfecta conjuntamente con el vector que comprende la secuencia codificante del factor de coagulación-CTP de la invención. En otra modalidad, la furina está codificada por un vector separado. En otra modalidad, la furina y un factor de coagulación-CTP están codificados por un vector. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se inserta en el pCI-DHFR. En otra modalidad, la secuencia codificante de furina se modifica por ingeniería genética en el pCI-dhfr/smaI+NotI, Furin/AsisI F.I.+NotI.
En otra modalidad, la secuencia del ácido nucleico que codifica furina comprende la siguiente secuencia de ácido nucleico:
tctagagtcgacccCCCCATGCAGCTGACGCCCTGGTTGCTATGGGTGGTAGCAGCAACA
GGAACCTTGGTCCTGCTAGCAGCTGATGCTCAGGGCCAGAAGGTCTTCACCAACA C GTGGGCTGTGC GC ATCC CTGG A GGCCC AGC GGTGGCC A AC AGTGTGGC ACGG A AGCATGGGTTCCTCAACCTGGGCCAGATCTTCGGGGACTATTACCACTTCTGGCA TCGAGGAGTGACGAAGCGGTCCCTGTCGCCTCACCGCCCGCGGCACAGCCGGCT GCAGAGGGAGCCTCAAGTACAGTGGCTGGAACAGCAGGTGGCAAAGCGACGGA CTAAACGGGACGTGTACCAGGAGCCCACAGACCCCAAGTTTCCTCAGCAGTGGT AC CT GT CTGGTGT C ACTC AGC GGGACCT GA ATGT G A AGGCGGCCT GGGCGC AGG GCTACACAGGGCACGGCATTGTGGTCTCCATTCTGGACGATGGCATCGAGAAGA ACCACCCGGACTTGGCAGGCAATTATGATCCTGGGGCCAGTTTTGATGTCAATGA CC AGG ACCCTG ACCCCC AGCC TC GGT AC AC AC AGAT GA AT G AC A AC AGGC ACGG CACACGGTGTGCGGGGGAAGTGGCTGCGGTGGCCAACAACGGTGTCTGTGGTGT AGGTGTGGCCTACAACGCCCGCATTGGAGGGGTGCGCATGCTGGATGGCGAGGT GACAGATGCAGTGGAGGCACGCTCGCTGGGCCTGAACCCCAACCACATCCACAT CT AC AGTGCC AGC TGGGGCCCCGAGG AT GACGGC A AGAC AGT GG ATGGGCC AGC CCGCCTCGCCGAGGAGGCCTTCTTCCGTGGGGTTAGCCAGGGCCGAGGGGGGCT GGGCTCCATCTTTGTCTGGGCCTCGGGGAACGGGGGCCGGGAACATGACAGCTG CAACTGCGACGGCTACACCAACAGTATCTACACGCTGTCCATCAGCAGCGCCAC GCAGTTTGGCAACGTGCCGTGGTACAGCGAGGCCTGCTCGTCCACACTGGCCACG ACCTACAGCAGTGGCAACCAGAATGAGAAGCAGATCGTGACGACTGACTTGCGG CAGAAGTGCACGGAGTCTCACACGGGCACCTCAGCCTCTGCCCCCTTAGCAGCCG GCATCATTGCTCTCACCCTGGAGGCCAATAAGAACCTCACATGGCGGGACATGC AACACCTGGTGGTACAGACCTCGAAGCCAGCCCACCTCAATGCCAACGACTGGG CCACCAATGGTGTGGGCCGGAAAGTGAGCCACTCATATGGCTACGGGCTTTTGG ACGCAGGCGCCATGGTGGCCCTGGCCCAGAATTGGACCACAGTGGCCCCCCAGC GGAAGTGCATCATCGACATCCTCACCGAGCCCAAAGACATCGGGAAACGGCTCG AGGTGCGGAAGACCGTGACCGCGTGCCTGGGCGAGCCCAACCACATCACTCGGC TGGAGCACGCTCAGGCGCGGCTCACCCTGTCCTATAATCGCCGTGGCGACCTGGC CATCCACCTGGTCAGCCCCATGGGCACCCGCTCCACCCTGCTGGCAGCCAGGCCA C ATG ACT ACTCCGC AGATGGGTTT A ATG AC TGGGCCTTC ATG AC A ACTC ATTCCT GGGATGAGGATCCCTCTGGCGAGTGGGTCCTAGAGATTGAAAACACCAGCGAAG CCAACAACTATGGGACGCTGACCAAGTTCACCCTCGTACTCTATGGCACCGCCCC TGAGGGGCTGCCCGTACCTCCAGAAAGCAGTGGCTGCAAGACCCTCACGTCCAG TCAGGCCTGTGTGGTGTGCGAGGAAGGCTTCTCCCTGCACCAGAAGAGCTGTGTC CAGCACTGCCCTCCAGGCTTCGCCCCCCAAGTCCTCGATACGCACTATAGCACCG AGAATGACGTGGAGACCATCCGGGCCAGCGTCTGCGCCCCCTGCCACGCCTCAT GTGCCACATGCCAGGGGCCGGCCCTGACAGACTGCCTCAGCTGCCCCAGCCACG CCTCCTTGGACCCTGTGGAGCAGACTTGCTCCCGGCAAAGCCAGAGCAGCCGAG AGT CCCCGCC AC AGC AGC AGCC ACC TCGGCTGCCCC CGGAGGT GG AGGC GGGGC
AACCGCTGCGGGCAGGGCTGCTGCCCTCACACCTGCCTCACGTGGTGGCCGGCC
TCAGCTGCGCCTTCATCGTGCTGGTCTTCGTCACTGTCTTCCTGGTCCTGCAGCTG
CGCTCTGGCTTTAGTTTTCGGGGGGTGAAGGTGTACACCATGGACCGTGGCCTCA
TCTCCTACAAGGGGCTGCCCCCTGAAGCCTGGCAGGAGGAGTGCCCGTCTGACTC
AGAAGAGGACGAGGGCCGGGGCGAGAGGACCGCCTTTATCAAAGACCAGAGCG
CCCTCTGAACGCGGCCGC (SEQ ID NO: 64).
En otra modalidad, la secuencia de aminoácidos de la furina comprende la siguiente secuencia de aminoácidos:
MELRPWLLWVVAATGTLVLLAADAQGQKVFTNTWAVRIPGGPAVANSVARKHG
FLNLGQIFGDYYHFWHRGVTKRSLSPHRPRHSRLQREPQVQWLEQQVAKRRTKR
DVYQEPTDPKFPQQWYLSGVTQRDLNVKAAWAQGYTGHGIVVSILDDGIEKNHP
DLAGNYDPGASFDVNDQDPDPQPRYTQMNDNRHGTRCAGEVAAVANNGVCGV
GVAYNARIGGVRMFDGEVTDAVEARSLGLNPNH1HIYSASWGPEDDGKTVDGPA
RLAEEAFFRGVSQGRGGLGSIFVWASGNGGREHDSCNCDGYTNSIYTLSISSATQF
GNVPWYSEACSSTLATTYSSGNQNEKQIVTTDLRQKCTESHTGTSASAPLAAGIIA
LTLE AN KN LT WRDMQHL V VQT S KPAHLN ANDW ATN G V GRK V S H S YG YG LLD A
G AM V AL AQN WTT V APQRKCIIDILTEPKDIGKRLE VRKT VT ACLGEPNHITRLEH A
QARLTLSYNRRGDLA1HLVSPMGTRSTLLAARPHDYSADGFNDWAFMTTHSWDE
DPS GE W VLEIENTS E ANN Y GTLT KFTL VL Y GT APEGLP VPPES S GC KTLTSS Q AC V
VCEEGFSLHQKSCVQHCPPGFAPQVLDTHYSTENDVETIRASVCAPCHASCATCQ
GPALTDCLSCPSHASLDPVEQTCSRQSQSSRESPPQQQPPRLPPEVEAGQRLRAGLL
PSHLPEVVAGLSCAFIVLVFVTVFLVLQLRSGFSFRGVKVYTMDRGLISYKGLPPE
AWQEECPSDSEEDEGRGERTAFIKDQSAL* (SEQ ID NO: 65).
Debe entenderse que los métodos de la presente invención que comprenden los elementos o etapas como se describió en la presente descripción pueden, en otra modalidad, consistir en esos elementos o etapas, o en otra modalidad, consistir esencialmente en esos elementos o etapas.
En una modalidad, una secuencia de CTP en el extremo C-terminal de un polipéptido proporciona una protección mejorada contra la degradación del polipéptido. En otra modalidad, una secuencia de CTP en el extremo C-terminal del polipéptido proporciona una protección mejorada contra el aclaramiento. En otra modalidad, una secuencia de CTP en el extremo C-terminal del polipéptido proporciona un tiempo de aclaramiento prolongado. En otra modalidad, una secuencia de CTP en el extremo C-terminal del polipéptido aumenta su Cmáx. En otra modalidad, una secuencia de CTP en el extremo C-terminal del polipéptido aumenta su Tmáx. En otra modalidad, una secuencia de CTP en el extremo C-terminal del polipéptido prolonga su T©. En otra modalidad, una secuencia de CTP en el extremo C-terminal del polipéptido prolonga su AUC.
En otra modalidad, el polipéptido de FVIIa modificado con CTP tiene una vida media circulante y un tiempo de residencia en el plasma aumentados, un aclaramiento reducido y una actividad clínica aumentada in vivo. En otra modalidad, debido a las propiedades mejoradas del polipéptido de FVIIa modificado con CTP, este conjugado se administra con menos frecuencia que el polipéptido.
En otra modalidad, la frecuencia de administración disminuida da como resultado una estrategia de tratamiento mejorada, que, en una modalidad, conduce a un cumplimiento mejorado del paciente que conduce a resultados de tratamiento mejorados, así como también a una calidad de vida mejorada del paciente. En otra modalidad, en comparación con los conjugados convencionales, los conjugados proporcionados en la presente descripción que tienen el volumen hidrodinámico proporcionado adicionalmente en la presente descripción tienen una potencia in vivo mejorada, una estabilidad mejorada, niveles elevados de AUC y una vida media circulante mejorada.
En una modalidad, el polipéptido de FVIIa modificado con CTP tiene usos terapéuticos. En otra modalidad, el polipéptido de FVIIa modificado con CTP tiene usos profilácticos.
En una modalidad, los términos "reducir, reducción, bajar, etc." se refieren a una reducción del 100 % desde un nivel medido o determinado previamente o desde un nivel normal. En otra modalidad, la reducción es del 89-99 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 79-88 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 69-78 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 59-68 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 49-58 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 39-48 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 29-38 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 19-28 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 9-18 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 5-8 % desde un nivel determinado previamente. En otra modalidad, la reducción es del 1-4 % desde un nivel determinado previamente.
Los promotores inducibles adecuados para su uso en la presente invención incluyen, por ejemplo, el promotor inducible por tetraciclina (Srour, M.A., y otros, 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
En una modalidad, la frase “una molécula de polinucleótido” se refiere a una secuencia de ácido nucleico monocatenario o bicatenario que se aísla y se proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómica y/o una secuencia de polinucleótidos compuesta (por ejemplo, una combinación de los anteriores).
En una modalidad, una “secuencia de polinucleótidos complementaria” se refiere a una secuencia, que resulta de la transcripción inversa de un ARN mensajero mediante el uso de una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. En una modalidad, la secuencia puede amplificarse subsecuentemente in vivo o in vitro mediante el uso de una ADN polimerasa.
En una modalidad, una “secuencia de polinucleótidos genómica” se refiere a una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y por lo tanto representa una porción contigua de un cromosoma.
En una modalidad, una “secuencia de polinucleótidos compuesta” se refiere a una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. En una modalidad, una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias de exones necesarias para codificar el polipéptido de la presente invención, así como también algunas secuencias intrónicas que se interponen entre ellas. En una modalidad, las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, que incluye otros genes, e incluirán típicamente secuencias señales de empalme conservadas. En una modalidad, las secuencias intrónicas incluyen elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.
En una modalidad, los polinucleótidos se preparan usando técnicas de PCR o cualquier otro método o procedimiento conocido por un experto en la técnica. En otra modalidad, el procedimiento implica la ligación de dos secuencias de ADN diferentes (véase, por ejemplo, “Current Protocols in Molecular Biology”, ed. Ausubel y otros, John Wiley & Sons, 1992).
En una modalidad, los polinucleótidos que codifican los polipéptidos de FVIIa modificados con CTP modificados por ingeniería genética de interés proporcionados en la presente descripción se insertan en los vectores de expresión (es decir, una construcción de ácido nucleico) para permitir la expresión del péptido/polipéptido recombinante. En una modalidad, el vector de expresión de la presente invención incluye las secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en eucariotas. En otra modalidad, el vector de expresión de la presente invención incluye un vector lanzadera que hace que este vector sea adecuado para la replicación e integración en procariotas y eucariotas. En otra modalidad, los vectores de clonaje comprenden secuencias de inicio de la transcripción y la traducción (por ejemplo, promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (por ejemplo, señales de poliadenilación).
En esta invención, se usa un sistema de expresión no bacteriano, células CHO, para expresar el polipéptido modificado con CTP. En otra modalidad, el vector de expresión usado para expresar los polinucleótidos de la presente invención en células de mamífero es el vector pCI-dhfrr. La construcción del vector pCI-dhfr se describe, de acuerdo con una modalidad, en los materiales y métodos de los ejemplos, más abajo.
En una modalidad, el vector de expresión puede incluir, además, las secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas a partir de un solo ARNm tal como un sitio interno de entrada al ribosoma (IRES) y las secuencias para la integración genómica del promotor-polipéptido quimérico.
En una modalidad, los vectores de expresión en mamíferos incluyen, pero no se limitan a, pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, d Hb B, pNMT1, pNMT41, pNMT81, comercializados por Invitrogen, pCI comercializado por Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV comercializados por Stratagene, pTRES comercializado por Clontech, y sus derivados.
En una modalidad, en la presente invención se usan los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucariotas tales como retrovirus. Los vectores de SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. En otra modalidad, los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO y p205. Otros vectores ilustrativos incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, pDSVE de baculovirus y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, promotor tardío de SV-40, promotor de metalotioneína, promotor del virus del tumor mamario murino, promotor del virus de sarcoma de Rous, promotor de polihedrina, u otros promotores que demuestran eficacia para la expresión en células eucariotas.
En una modalidad, pueden usarse varios métodos para introducir el vector de expresión en las células. Tales métodos se describen generalmente en Sambrook y otros, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel y otros, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang y otros, Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Michigan (1995), Vega y otros, Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa y otros [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, lipofección, electroporación e infección con vectores virales recombinantes. Además, véanse las patentes de EE. UU. núms. 5,464,764 y 5,487,992 para los métodos de selección positivo-negativo.
En una modalidad, la introducción de ácido nucleico por infección viral ofrece varias ventajas con respecto a otros métodos tales como la lipofección y electroporación, ya que puede obtenerse una mayor eficiencia de transfección debido a la naturaleza infecciosa de los virus.
Se apreciará que además de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica el polipéptido), la construcción de expresión puede incluir además secuencias modificadas por ingeniería genética para optimizar la estabilidad, la producción, la purificación, el rendimiento o la actividad del polipéptido expresado.
En una modalidad, las células transformadas se cultivan bajo condiciones efectivas, que permitan la expresión de grandes cantidades de péptidos recombinantes modificados por ingeniería genética. En otra modalidad, las condiciones de cultivo efectivas incluyen, pero no se limitan a, medios efectivos, condiciones del biorreactor, temperatura, pH y oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una modalidad, un medio efectivo se refiere a cualquier medio en el que una célula se cultiva para producir el polipéptido recombinante. En otra modalidad, un medio incluye típicamente una solución acuosa que tiene fuentes de carbono, nitrógeno y fosfato asimilables, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. Las células pueden cultivarse en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas Petri. En otra modalidad, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. En algunas modalidades, las condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto en la técnica.
En una modalidad, en dependencia del vector y del sistema huésped usado para la producción, el polipéptido modificado con CTP resultante se expresa dentro de una célula recombinante para que tenga lugar la glicosilación del CTP, se secreta en el medio de fermentación o se retiene en la superficie exterior de una célula de mamífero.
En una modalidad, después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recuperación del polipéptido recombinante.
En una modalidad, la frase “recuperación del polipéptido recombinante modificado por ingeniería genética” se refiere a recolectar todo el medio de fermentación que contiene el polipéptido y no necesita implicar etapas adicionales de separación o purificación. En otra modalidad, se llevaron a cabo etapas adicionales de separación o purificación bien conocidas en la técnica con el fin de recuperar el polipéptido modificado por ingeniería genética recombinante.
En una modalidad, los polipéptidos de FVIIa modificados con CTP por ingeniería genética se purifican mediante el uso de una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, tales como, pero que no se limitan a, cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
Para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada puede modificarse por ingeniería genética para codificar el polipéptido de FVIIa modificado con CTP y un resto escindible fusionado. Además, una proteína de fusión puede diseñarse de manera que el polipéptido pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; por ejemplo, mediante inmovilización en una columna específica para el resto escindible. Un sitio de escisión se modifica por ingeniería genética entre el polipéptido y la porción escindible y el polipéptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante el tratamiento con una enzima o agente adecuado que escinde específicamente la proteína de fusión en este sitio [por ejemplo, véase Booth y otros, Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella y otros, J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].
En una modalidad, el polipéptido de FVIIa modificado con CTP modificado por ingeniería genética se recupera en forma "sustancialmente pura".
En una modalidad, la frase “sustancialmente puro” se refiere a una pureza que permite el uso efectivo de la proteína en las aplicaciones descritas en la presente descripción.
En una modalidad, los polipéptidos de FVIIa modificados con CTP modificados por ingeniería genética recombinantes se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica puede ensayarse in vivo o in vitro. Las actividades de unión de los polipéptidos de FVIIa modificados con CTP modificados por ingeniería genética recombinante pueden determinarse mediante el uso de varios ensayos como los conoce un experto en la técnica.
Los polipéptidos de FVIIa modificados con CTP preparados de acuerdo con la presente invención pueden proporcionarse al individuo per se. En una modalidad, los polipéptidos de FVIIa modificados con CTP modificados por ingeniería genética pueden proporcionarse al individuo como parte de una composición farmacéutica en la que se mezclan con un portador farmacéuticamente aceptable.
Una “composición farmacéutica” se refiere a una preparación de los ingredientes activos descritos en la presente descripción con otros componentes químicos tales como portadores y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo. El "ingrediente activo" se refiere al polipéptido de FVIIa modificado con CTP, que es responsable del efecto biológico.
Las frases “portador fisiológicamente aceptable” y “portador farmacéuticamente aceptable” usadas de manera intercambiable en la presente descripción se refieren a un portador o un diluyente que no provoca irritación significativa en un organismo y no bloquea la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Estas frases incluyen un adyuvante. Por ejemplo, uno de los ingredientes incluidos en el portador farmacéuticamente aceptable puede ser por ejemplo polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio intervalo de solubilidad en medios orgánicos y acuosos (Mutter y otros (1979)).
En otra modalidad, el término “excipiente” se refiere a una sustancia inerte adicionada a una composición farmacéutica para facilitar adicionalmente la administración de un ingrediente activo. En una modalidad, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las técnicas para la formulación y administración de fármacos se encuentran en “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
Las composiciones farmacéuticas pueden fabricarse mediante procesos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, por medio de mezcla, disolución, granulación, elaboración de pastillas recubiertas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización convencionales. Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional mediante el uso de uno o más portadores fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente.
En una modalidad, el término "aproximadamente" significa en términos cuantitativos más o menos 5 %, o en otra modalidad más o menos 10 %, o en otra modalidad más o menos 15 %, o en otra modalidad más o menos 20 %.
Ejemplos
Materiales y Métodos:
Producción de diferentes proteínas modificadas con CTP
La región codificante de ADN de la hormona del crecimiento humano (hGH), eritropoyetina (EPO), APO-A1, Factor IX y Factor VII se ligaron a la secuencia de ADN del péptido CTP. El péptido CTP se fusionó al N-terminal y/o C-terminal en una sola copia o en tándem, como se detalla en la tabla 1. Los plásmidos modificados por ingeniería genética se transfectaron y se expresaron en la línea celular CHO que permiten la estructuración adecuada de los O-glicanos, que juegan un papel crítico en el aumento del volumen hidrodinámico de las proteínas (véase la tabla 4). Las diferentes proteínas se purificaron de acuerdo con los procesos personalizados que se desarrollaron de forma única para cada proteína, como se detalla más abajo:
CTP-EPO-CTP-CTP: La cosecha clarificada se cargó en una columna de Blue Sepharose. El producto eluido se diluyó y se cargó en una columna de Q Sepharose. La fracción eluida de la columna de Q Sepharose se procesó mediante ultrafiltración mediante el uso de un dispositivo centrífugo Amicon (valor de corte de 30 kDa) y se dializó. La fracción concentrada y dializada se cargó en una columna de fenil-Sepharose. La fracción eluida de fenil Sepharose se procesó mediante ultrafiltración con un dispositivo centrífugo Amicon (valor de corte de 30 kDa) y se dializó frente a PBS pH 7.
CTP-CTP-EPO y CTP-CTP-EPO-CTP-CTP: La cosecha clarificada se cargó en una columna de DEAE Sepharose y se eluyó. La fracción eluida se acondicionó con sulfato de amonio y se cargó en una columna de fenil Sepharose HS. La elución con fenil se concentró y se dializó. Las siguientes dos columnas están en modo de flujo continuo: Hidroxiapatita tipo I 40 m y SP Sepharose. El producto final se concentró, se dializó y se almacenó a -20 °C.
APO-CTP y APO-CTP-CTP: Estas dos versiones de las proteínas APO se purificaron con una columna de afinidad (Capture Select Apo, Bac). La cosecha clarificada se diluyó 1:1 con PBS y se eluyó de la columna. La elución se concentró y dializó frente a PBS y se almacenó a -80 °C.
CTP-hGH-CTP-CTP: La cosecha clarificada se filtró mediante el uso de UFDF1. Se logró la inactivación del virus. La primera cromatografía es una cromatografía de intercambio aniónico, DEAE Sepharose FF. La resina de la segunda cromatografía es fenil Sepharose. El conjunto de eluatos de la segunda cromatografía se diafiltró y se concentró en UFDF-2. La etapa de UFDF-2 es seguida por dos cromatografías más, hidroxiapatita cerámica Tipo I 40 mM y SP Sepharose FF, en un modo de flujo continuo. Se realizó una nanofiltración. La solución del producto se concentró a 41 6 1 mg/ml y se dializó.
FIX-CTP-CTP-CTP: Se adicionó Tris-HCl, pH 9 a la cosecha clarificada. La primera columna de cromatografía se llevó a cabo mediante el uso de una columna Q de intercambio aniónico. La siguiente columna fue Heparin Hyper D. La fracción eluida se ajustó a la concentración final de fosfato de sodio 10 mM con un pH final de 6,8. La última etapa de cromatografía se realizó en resina CHT. La fracción eluida se concentró y se dializó frente a TBS pH 7,5.
FIX-CTP-CTP-CTP-CTP: La cosecha clarificada se concentró y se dializó. La única etapa de cromatografía es una cromatografía de afinidad, con jacalina inmovilizada. El producto eluido se concentró y se dializó frente a TBS a pH 7,5.
FIX-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP: La cosecha clarificada se concentró y se dializó. La única etapa de cromatografía es una cromatografía de afinidad, con jacalina inmovilizada. El producto eluido se concentró y se dializó frente a TBS a pH 7,5.
APOA1-CTP-CTP: La cosecha clarificada fue concentrada y dializada. La primera cromatografía se llevó a cabo mediante el uso de una columna de cromatografía de intercambio aniónico, DEAE Sepharose FF. La segunda etapa de cromatografía se realizó en la resina con jacalina inmovilizada. El eluato se diafiltró y se concentró en UFDF-2 frente a TBS pH 7,4.
APOA1-CTP: La primera cromatografía se llevó a cabo mediante el uso de cromatografía de afinidad, columna Capture-Select APOAI. La segunda etapa de cromatografía se realizó en la resina con jacalina inmovilizada. El eluato se diafiltró y se concentró en UFDF-2 frente a TBS pH 7,4.
APOA1: La cosecha diluida se cargó en la cromatografía de afinidad, Capture-Select APO-AI. El eluato se diafiltró y se concentró en UFDF-2 frente a TBS pH 7,4.
FVIIa-CTP-CTP-CTP: La cosecha clarificada fue concentrada y dializada. Se logró la inactivación del virus. La primera cromatografía se llevó a cabo mediante el uso de una columna de afinidad, VII Select. La fracción eluida se diluyó antes de cargarla en la siguiente columna: hidroxiapatita cerámica (CHT). El eluato de la CHT se cargó en una columna de fenil Sepharose. El eluato se diafiltró y se activó en una columna de cromatografía de intercambio aniónico. A continuación, se lavó la columna y se eluyó el producto. Se realizó una nanofiltración.
FVIIa-CTP-CTP-CTP-CTP-CTP: La cosecha clarificada fue concentrada y dializada. La primera cromatografía se llevó a cabo mediante el uso de una columna de afinidad, VII Select. La fracción eluida se cargó en la siguiente columna: hidroxiapatita cerámica (CHT). Se lavó la columna y se eluyó el producto. El eluato de la CHT se cargó en una columna de fenil Sepharose. El eluido se diafiltró y se concentró. El factor VII se activó en una cromatografía de intercambio aniónico. Luego se lavó la columna y se eluyó el producto.
Tabla 1: Descripción esquemática de la proteína modificada con CTP
Figure imgf000020_0001
Desglicosilación de las proteínas modificadas con CTP
La desglicosilación de las proteínas modificadas con CTP se realizó mediante el uso de la Glyko sialidasa A (núm. de cat. PZ PZGK80040, Prozyme), O-glicanasa (núm. de cat. PZ PZGK80090, Prozyme) y N-glicanasa (núm. de cat. PZGKE-5006A, Prozyme). Las proteínas se digirieron durante 2 h (a 37 °C) con la sialidasa A, seguido de la digestión con la O-glicanasa y, si fuera necesario, con la N-glicanasa durante la noche.
Determinación del peso molecular por MALDI-TOF
Los pesos moleculares (Mw) de las proteínas modificadas con CTP se midieron mediante la tecnología MALDI-TOF mediante el uso del modelo REFLEX-IV (Bruker Daltonics, Bremen, Alemania). La espectrometría de masas por tiempo de vuelo de ionización/desorción láser asistida por matriz (MALDI-TOF MS) es una técnica en la que un coprecipitado de una matriz absorbente de luz UV y una biomolécula como proteínas o péptidos se irradia mediante un pulso láser. Las biomoléculas ionizadas se aceleran en un campo eléctrico y entran en el tubo de vuelo. Durante el vuelo en este tubo, diferentes moléculas se separan de acuerdo con su relación masa/carga y llegan al detector en diferentes momentos. De esta manera, cada molécula produce una señal distinta que puede convertirse en peso molecular. El método se usa para la caracterización de diferentes proteínas y péptidos con masas moleculares entre 400 y 350000 Da. Es un método muy sensible, que permite la detección de cantidades bajas (10-15 a 10-18 moles) de muestra con una precisión de 0,1 - 0,01 %. Las mediciones se realizaron en la Unidad de Servicios de Investigación Analítica (Universidad Ben-Gurion, Beer-Sheva, Israel).
Análisis de tamaño hidrodinámico por HPLC mediante el uso de columna SEC
El tamaño hidrodinámico de las proteínas se midió por HPLC (Dionex UltiMate 3000) mediante el uso de una columna TSKgel G2000SW SEC (núm. de cat. 08540, TosoHaas) para la hGH, Epo y Apo nativa y las proteínas modificadas con CTP relacionadas o una columna TSKgel G3000WXL SEC (núm. de cat. 08541, TosoHaas) para el Factor IX y Factor VII nativos y las proteínas modificadas con CTP relacionadas. Se usó el kit de calibración H Mw (núm. de cat.
151-1901, BioRad) para medir el tamaño de las proteínas. Los resultados se ajustaron a un ajuste logarítmico (y=a*ln X b) y se calcularon los tamaños hidrodinámicos de las diferentes proteínas.
Resultados
Ejemplo 1: Producción de diferentes proteínas modificadas con CTP.
Se transfectaron y expresaron once proteínas modificadas con CTP diferentes en una línea celular CHO. Las diversas cosechas se purificaron de acuerdo con los métodos descritos anteriormente. Las proteínas purificadas se muestran en las figuras 1 y 2.
Ejemplo 2: Análisis del peso molecular por el método MALDI-TOF
El peso molecular de las diferentes proteínas modificadas con CTP glicosiladas y no glicosiladas se determinó mediante el uso de la tecnología MALDI-TOF y se comparó con el peso molecular correspondiente de sus proteínas nativas (proteínas intactas que no están fusionadas con CTP, específicamente, Biotropina para hGH, EPREX® para Epo, ApoAI, Mononine® para Factor IX y Novoseven® para FVIIa) Tabla 2. El Mw medido para todas las proteínas nativas y no glicosiladas concuerda bien con el Mw teórico, que se basa en las secuencias de aminoácidos de las proteínas. Se calcularon los incrementos en los pesos moleculares por copia de CTP glicosilada y no glicosilada y se muestran en las figuras 3A y 3B, respectivamente. La contribución de una copia de CTP al peso molecular se calculó de la siguiente manera: En primer lugar, se calculó el incremento en el peso molecular restando el peso molecular medido o teórico -en el caso de la hGH nativa- de las proteínas nativas del peso molecular medido de sus correspondientes proteínas modificadas con CTP. Luego, el incremento calculado se dividió por el número de copias de CTP para cada proteína. Por ejemplo, MOD-4023 (hGH que se fusionó con una copia de CTP en el N-terminal y con 2 copias de CTP en tándem en el C-terminal) tiene un peso molecular de 38128, mientras que la hGH nativa tiene un peso molecular teórico de 22000. La diferencia entre esas dos proteínas es de 16,13 kDa, lo que significa que la contribución de cada CTP glicosilado es de 5,4 kDa (16,13 dividido por 3 copias de CTP). La contribución promedio de una copia de CTP no glicosilado en todas las proteínas medidas es 2,76 kDa 60.103 (Figura 3A, Tabla 2). Este resultado está alineado con el Mw teórico de un solo CTP, que es 2,78 kDa. El CTP glicosilado contribuye con un promedio de 4,76 kDa 60422 al Mw (Figura 3B, Tabla 2), sin diferencias significativas entre las diversas proteínas medidas.
Tabla 2: Resultados de MALDI-TOF de proteínas modificadas con CTP glicosiladas y no glicosiladas y sus correspondientes proteínas nativas. ND - no determinado.
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Ejemplo 3: Análisis del tamaño hidrodinámico por el método HPLC
El volumen hidrodinámico es el parámetro principal que influye en el tiempo de retención (RT) de las proteínas cuando pasan a través de la columna de exclusión por tamaño. Por lo tanto, los tamaños de las proteínas se calcularon mediante una columna SEC mediante el uso de un kit de calibración de filtración en gel de HMw (núm. de cat. 151­ 1901, BioRad). El tiempo de retención de los estándares se midió en las columnas SEC TSK 2000 y TSK 3000 y se calculó el % de error relativo (% RE) para cada columna para determinar la precisión de los métodos analíticos. Se calculó el % RE del Mw observado de las proteínas de calibración y se comparó con el Mw conocido y esperado de las proteínas de calibración. Los resultados del Mw calculados para la curva de calibración y el % RE se presentan en la tabla 3a para la columna TSK 2000 SEC y en la tabla 3b para la columna TSK 3000 SEC. Los resultados muestran que el % RE fue inferior o igual al 20 % (< 20 %), lo que indica una alta precisión para un amplio intervalo de peso molecular determinado de una proteína.
Tabla 3a: Resultados de la curva de calibración H Mw y % RE calculado mediante el uso de TSK 2000. El peso molecular esperado de las proteínas de la curva de calibración fue proporcionado por el kit comercial que se usó (kit de calibración de H Mw BioRad núm. de cat. 151-1901).
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Tabla 3b: Resultados de la curva de calibración H Mw y % RE calculado mediante el uso de la columna TSK 3000. El Mw esperado de las proteínas de la curva de calibración fue proporcionado por el kit comercial que se usó (kit de calibración de H Mw BioRad núm. de cat. 151-1901).
Figure imgf000022_0002
Para determinar la contribución del CTP glicosilado al volumen hidrodinámico de las proteínas modificadas con CTP, se analizaron varias proteínas modificadas con CTP mediante columna SEC y se calcularon sus tamaños hidrodinámicos. Las proteínas recombinantes correspondientes: Se analizaron la Biotropina (rhGH), EPREX® (rEPO), ApoAl, Mononine® (rFIX) y Novoseven® (rFVIIa) en paralelo a sus proteínas correspondientes modificadas con CTP para calcular la contribución del CTP glicosilado a la proteína (Tabla 4, Figura 4). La figura 4A presenta el incremento total del tamaño hidrodinámico de las proteínas modificadas con CTP a las proteínas nativas según se midió mediante la columna SEC.
Tabla 4: Resultados de SEC-HPLC e incremento calculado de una copia de CTP de las proteínas modificadas con CTP y sus correspondientes proteínas nativas.
Figure imgf000022_0003
El incremento en el peso molecular de una copia de CTP glicosilado se calculó restando el tamaño hidrodinámico medido de las proteínas nativas del tamaño hidrodinámico medido de sus correspondientes proteínas modificadas con CTP. Luego, el incremento calculado se dividió por el número de copias de CTP para cada proteína. Las contribuciones calculadas de una copia de los CTP glicosilados al peso molecular de varias proteínas se presentan en la figura 4B. Las diversas proteínas exhiben incrementos en el intervalo entre 29 kDa y 53 kDa por una copia de CTP glicosilado.
Curiosa e inesperadamente, la contribución de una copia de CTP glicosilado de FIX y FVIIa fue marcadamente mayor con una contribución de 43-53 kDa (por una copia de CTP) en comparación con otras proteínas medidas (Tabla 4). El incremento en el tamaño hidrodinámico por copia de CTP glicosilado es mucho mayor que la contribución calculada de 4,76 kDa por copia de CTP glicosilado al peso molecular, medido por MALDI-TOF. Las diferencias en el Mw calculado entre los métodos se deben al hecho de que mientras MALDI-TOF mide el Mw real de la proteína, la medición de SEC-HPLC se ve afectada por el volumen hidrodinámico de la proteína, lo que sugiere que el CTP glicosilado aumenta sustancialmente el volumen hidrodinámico de proteínas a las que está unido. La magnitud en el volumen hidrodinámico es aproximadamente 6-11 veces mayor en comparación con la contribución calculada por CTP medido por MALDI-TOF. Es de destacar que la contribución de CTP al tamaño hidrodinámico de la proteína que se está modificando fue menor para hGH y las variantes de EPO modificadas con CTP (alrededor de 30 kDa) pero ligeramente mayor para las variantes modificadas de FIX y FVII-CTP, y sorprendentemente no se vio afectada por el número de CTP que se adicionan a la proteína particular.
Además, la contribución de CTP no glicosilado al Mw de la proteína se determinó mediante SEC-HPLC (Tabla 5, Figuras 5A y 5B). La desglicosilación se realizó al incubar las proteínas con sialidasa A (eliminar el ácido siálico) durante 2 h 37 °C seguido de la adición de O-glicanasa (para eliminar los O-glicanos). En el caso de EPREX® (rEPO), Mononine® (rFIX), NovoSeven® (rFVII) y sus correspondientes proteínas modificadas con CTP, que contienen N-glicanos, se adicionó N-glicanasa para una digestión durante la noche para eliminar los N-glicanos. Se calculó la contribución de CTP no glicosilado al tamaño o volumen hidrodinámico de varias proteínas y se comparó con sus proteínas nativas correspondientes, es decir, la contribución de los polipéptidos modificados con CTP no glicosilados al volumen hidrodinámico se calculó al comparar el volumen hidrodinámico de los polipéptidos modificados con CTP no glicosilados al de la proteína nativa correspondiente no glicosilada. Por ejemplo, para la EPO, los N y O-glicanos se eliminaron de Eprex®, y se calculó el aumento en el volumen hidrodinámico de las variantes de Epo modificadas con CTP y se comparó con su peso molecular.
La figura 5A representa el incremento en el tamaño hidrodinámico de las proteínas intactas, mientras que la figura 5B representa la contribución de una copia de las proteínas modificadas con CTP no glicosiladas. Sorprendentemente, el CTP no glicosilado aumenta el tamaño hidrodinámico de las proteínas modificadas con CTP en comparación con las proteínas nativas correspondientes. La contribución calculada de una copia de CTP no glicosilado fue diferente entre las diversas proteínas, en el intervalo entre 8 kDa y 21 kDa por una copia de CTP no glicosilado (Tabla 5). Teniendo en cuenta que el peso molecular teórico de CTP, el cual consiste de 28 aminoácidos, es de 2,78 kDa y el peso molecular medido (por MALDI-TOF) también fue de aproximadamente 2,76 kDa, estos resultados sugieren que la contribución de CTP no glicosilado al peso es mayor de lo esperado. Además, y como se observó de manera similar para el CTP glicosilado, también se observó que el volumen hidrodinámico era mucho mayor que el esperado para el CTP no glicosilado. En general, la unión de CTP a una proteína da como resultado un aumento en el volumen hidrodinámico que es atribuible tanto a la cadena principal de CTP como a los glicanos de CTP.
También se observó que la cantidad de CTP adicionados a una proteína en particular no afectó la contribución al tamaño hidrodinámico de la misma. El incremento más significativo de CTP no glicosilado se observó para Apo, FIX y FVII que tienen copias de CTP en el C-terminal de la proteína. Este hallazgo de que la adición de CTP en el C-terminal conduce a una mayor contribución al volumen hidrodinámico fue inesperado. Curiosa e inesperadamente, la contribución de una copia de CTP no glicosilado de las proteínas modificadas con CTP, Apo, FIX y FVIIa fue muy similar y midió -20 kDa (Tabla 5), pero la contribución de CTP glicosilado de los factores de coagulación fue significativamente mayor en comparación con CTP glicosilado Apo (Tabla 4).
Tabla 5: Resultados de SEC-HPLC e incremento calculado de una copia de CTP de proteínas modificadas con CTP no glicosiladas y sus correspondientes proteínas nativas.
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Claims (5)

REIVINDICACIONES
1. Un método para aumentar el tamaño hidrodinámico de un polipéptido recombinante, en donde dicho polipéptido es el factor VIIa de la coagulación (FVIIa), el método comprende:
(i) una etapa de fusión recombinante de tres unidades del péptido carboxi terminal (CTP) de la gonadotrofina coriónica al carboxi terminal de dicho factor VIIa de la coagulación (FVIIa),
(ii) seguido de una etapa de expresión del polipéptido modificado con CTP recombinante en una célula huésped de ovario de hámster chino (CHO), en donde la expresión comprende glicosilar dichas unidades de CTP.
2. El método de la reivindicación 1, en donde la secuencia de aminoácidos de una de las unidades de CTP comprende la SEQ ID NO: 2.
3. El método de la reivindicación 1, en donde dicha glicosilación de las unidades de CTP comprende la O-glicosilación que consiste de una unión de GalNAc a serina (Ser) o treonina (Thr) en la cadena polipeptídica de las unidades de CTP por un enlace a-glicosídico, un núcleo 1 de glicosilación, O-fucosilación, O-manosilación u O-glucosilación.
4. El método de la reivindicación 3, en donde dicha O-glicosilación es seguida por la adición de una a sesenta moléculas de galactosa o por la adición de una a 120 moléculas de ácido siálico.
5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde la secuencia de aminoácidos del polipéptido que consiste de tres CTP fusionados al carboxi terminal de dicho FVIIa comprende la SEQ ID NO: 52.
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