ES2943359T3 - Métodos de producción de polipéptidos de hormona de crecimiento modificados con CTP de acción prolongada - Google Patents

Métodos de producción de polipéptidos de hormona de crecimiento modificados con CTP de acción prolongada Download PDF

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Abstract

En el presente documento se describe un método para fabricar una hormona de crecimiento humana recombinante (hGH) modificada por una extensión de CTP en un sistema de cultivo de células de mamífero. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Métodos de producción de polipéptidos de hormona de crecimiento modificados con CTP de acción prolongada
Campo de interés
La presente invención proporciona un método para fabricar una hormona de crecimiento humana recombinante (hGH) modificada por extensiones de CTP en un sistema de cultivo de células de mamífero.
Antecedentes de la invención
La hormona del crecimiento (somatotropina) ha estado en uso clínico durante más de 50 años, principalmente para tratar la deficiencia de la hormona del crecimiento en los niños, lo que provoca enanismo. En 1985, la hormona de crecimiento humana (hGH) de origen de ADN recombinante reemplazó a la hGH de pituitaria cadavérica, que era la única fuente del material disponible hasta entonces. La terapia de reemplazo de hGH ha sido el estándar de atención para decenas de miles de pacientes y ha demostrado ser segura y eficaz. La necesidad de mantener los niveles de hGH en sangre dentro de una ventana terapéutica eficaz requiere inyecciones subcutáneas o intramusculares diarias o cada dos días. La mayoría de la hGH comercial se produce en sistemas bacterianos.
La hormona del crecimiento (GH) es una proteína pituitaria de 191 aminoácidos que estimula la producción hepática y la liberación del factor de crecimiento similar a la insulina-1 (IGF-1) en la circulación sistémica. La mayoría de las preparaciones de GH actualmente disponibles requieren administración diaria; por lo tanto, el cumplimiento puede ser un problema, especialmente en adolescentes. En la deficiencia de GH en adultos (GHD), la administración diaria y los efectos secundarios concomitantes (p. ej., malestar en el lugar de la inyección, edema transitorio y artralgia) limitan la utilidad terapéutica de las formulaciones existentes. Una forma de GH de acción prolongada tiene el potencial de reducir la incomodidad al requerir menos inyecciones y posiblemente al minimizar los eventos adversos asociados con los picos y depresiones en la concentración plasmática que ocurren con la inyección diaria.
Los métodos descritos en el presente documento comprenden la producción de una hGH de acción prolongada (MOD-4023; Figura 1), lo que evita la necesidad de las numerosas inyecciones que ahora se requieren para el tratamiento de la GHD. Esta tecnología se basa en el uso de un péptido natural, el péptido C-terminal (CTP) de la cadena beta de la gonadotropina coriónica humana (hCG), que proporciona hCG con la longevidad necesaria para mantener el embarazo (T1/2 inicial ~10 h, T1/2 terminal ~37 horas). CTP tiene 28 aminoácidos y de cuatro a seis cadenas de azúcar unidas a O, que están todas unidas a un residuo de serina. La cadena beta de la hormona luteinizante (LH), una hormona de la fertilidad que desencadena la ovulación, es casi idéntica a la hCG pero no incluye la CTP. Como resultado, la LH tiene una vida media significativamente más corta en la sangre (T1/2 inicial ~1 h, T1/2 terminal ~10 horas).
MOD-4023 es una molécula de hGH fusionada con 3 copias de CTP; uno en el extremo N y dos en el extremo C (CTP-hGH-CTP-CTP como se establece en SEQ ID NO: 7) (Figura 1). MOD-4023 es una proteína de cadena única de 275 aminoácidos con 12-18 carbohidratos unidos a O. Como se demostró en modelos animales (ganancia de peso de ratas hipofisectomizadas), MOD-4023 puede tener el potencial de inyectarse una vez por semana o una vez cada dos semanas, con una eficacia clínica similar a las inyecciones diarias de hGH.
El documento WO 2014/080401 describe el uso de un péptido carboxi terminal de gonadotropina coriónica o fragmentos del mismo para modificar un polipéptido para aumentar el volumen hidrodinámico del polipéptido. El documento US 2009/312254 describe polipéptidos que comprenden un péptido carboxi-terminal de gonadotropina coriónica unido al extremo amino de una citocina y dos péptidos carboxi-terminal de gonadotropina coriónica unidos al extremo carboxi de una citocina. Dalton et al. (Protein Science, vol. 23, no.5, páginas 517-525, 2014, XP055258467, DOI: 10.1002/pro.2439) revelan la sobreexpresión de proteínas secretadas de líneas celulares de mamíferos.
Compendio de la invención
La presente invención proporciona un método para fabricar un polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica humana altamente glicosilada, consistiendo el polipéptido en dos CTP unidos al extremo carboxi de la hGH y un CTP unido al extremo amino terminal de la hGH, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se establece en SEQ ID NO: 7, y en el que la hGH modificada con CTP altamente glicosilada está glicosilada en entre 12 y 18 sitios de glicosilación unidos a O, comprendiendo el método la pasos de: (a) transfectar de manera estable un número predeterminado de células con un vector de expresión que comprende una porción codificante que codifica dicha hormona de crecimiento humana modificada con CTP, en el que dicha célula transfectada expresa y secreta dicha hGH modificada con CTP; (b) obtener clones celulares que sobreexpresen dicha hGH modificada con CTP; (c) expandir dichos clones en solución a una escala predeterminada cultivando en un contenido de oxígeno disuelto (OD) de 20-30 %; (d) recolectar dicha solución que contiene dichos clones; (e) filtrar dicha solución que contiene dichos clones para obtener una solución de cosecha clarificada; y (f) purificar dicha solución de cosecha clarificada para obtener una solución de proteína purificada de la hGH modificada con CTP, en la que al menos el 60 % de la hGH modificada con CTP purificada en la cosecha clarificada es la forma altamente glicosilada de la hGH modificada con CTP; fabricando así un polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido de gonadotropina coriónica humana (CTP) altamente glicosilado.
En una realización, el paso (c) comprende la expansión de clones obtenidos de un banco de células de trabajo (WCB) o un banco de células maestras (MCB) que expresa y secreta de forma óptima la hGH modificada con CTP.
En una realización, en el paso (c) los clones expresan y secretan la hGH modificada con CTP altamente glicosilada a un nivel de al menos 600 mg/L.
En una realización, en el paso (c) los clones se expanden en solución a través de una serie de pasos de subcultivo hasta el nivel del biorreactor de producción.
En una realización, el biorreactor comprende un biorreactor desechable o un biorreactor de acero inoxidable y el biorreactor funciona como un biorreactor en modo alimentación discontinua.
En una realización, la purificación (paso f) de la cosecha clarificada comprende realizar secuencialmente los siguientes pasos que comprenden:
(g) concentrar y diafiltrar dicha solución de cosecha clarificada;
(h) obtener la cosecha clarificada obtenida siguiendo el paso (g) e inactivar los virus presentes en la cosecha clarificada mediante incubación en una solución tóxica para dichos virus;
(i) obtener la solución de cosecha clarificada del paso (h) y purificar la solución de cosecha clarificada,
i. en el que la purificación se logra pasando secuencialmente la solución de cosecha clarificada a través de una columna de intercambio de aniones y una columna de interacción hidrofóbica seguida de un paso de concentración y diafiltración,
ii. en el que a la purificación le sigue el paso secuencial de la solución de cosecha clarificada a través de una columna de modo mixto de hidroxiapatita y una columna de intercambio catiónico;
(j) obtener la solución de cosecha clarificada siguiendo el paso (ii) y eliminar físicamente la solución de cosecha clarificada de los virus mediante nanofiltración;
(k) obtener la solución de cosecha clarificada siguiendo el paso (j) y concentrar y diafiltrar la solución de cosecha clarificada para llegar a una cosecha clarificada purificada al máximo que contiene la hGH modificada con CTP. En varias realizaciones, la columna de intercambio aniónico es una columna DEAE-Sepharose; la columna hidrofóbica es una columna HIC de fenilo; la solución tóxica para los virus es una solución Triton-X 100 al 1 %; la columna de intercambio catiónico es una columna SP-Sepharose; o el aclaramiento viral muestra un factor de reducción logarítmica viral (LRF) de aproximadamente 22.
En una realización, el método logra al menos una tasa de recuperación del 20 % de la hGH modificada con CTP altamente glicosilada.
En una realización, el método de fabricación es un proceso sin animales.
En una realización, la pureza de la proteína de hGH modificada con CTP altamente glicosilada es de al menos el 90 %.
En una realización, el patrón de glicosilación de la hGH modificada con CTP fabricada comprende la glicosilación de 4 a 6 sitios de glicosilación unidos a O por CTP.
En una realización, la hGH modificada con CTP fabricada está altamente sialilada.
Otras características y ventajas se harán evidentes a partir de la siguiente descripción detallada, ejemplos y figuras.
Breve descripción de los dibujos
Los métodos de fabricación del polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido carboxi terminal (CTP) de gonadotropina coriónica humana de acción prolongada recombinante (hGH modificada con CTP) se señalan particularmente y se reivindican claramente en la parte final de la memoria descriptiva. Sin embargo, los métodos de fabricación de la hGH modificada con CTP, tanto en lo que se refiere a la organización como al método de operación, junto con los objetos, características y ventajas de los mismos, pueden entenderse mejor con referencia a la siguiente descripción detallada cuando se lee con los dibujos adjuntos en los que:
Figura 1. Presenta un diagrama esquemático que ilustra el MOD-4023 (CTP-hGH-CTP-CTP).
Figura 2. Muestra el mapa del plásmido MOD-4023 pCI-dhfr.
Figura 3. Muestra el diagrama de producción de flujo del proceso aguas arriba de polipéptidos modificados con CTP, por ejemplo, MOD-4023.
Figura 4. Presenta un diagrama de flujo del proceso de purificación de polipéptidos modificados por CTP, por ejemplo MOD-4023.
Figura 5. Presenta un resumen del diagrama de flujo del proceso de fabricación del producto farmacéutico (DP) MOD-4023.
Figura 6. Presenta una SDS-PAGE teñida con Coomassie que muestra la purificación de formas altamente glicosiladas de MOD-4023 mediante la primera columna de cromatografía de intercambio iónico (IEX). Carril (1) Cosecha de proteína total, paso 8 de la Figura 3; Carril (2) ultrafiltración/diafiltración, paso 1 de la Figura 4 (UFDF1) proteína total concentrada y diafiltrada; Carril (3) flujo de IEX, paso 3 de la Figura 4; carril (4) material de lavado de IEX, paso 3 de la Figura 4; y Carril (5) Elución de IEX, paso 3 de la Figura 4.
Figura 7. Presenta datos que muestran un contenido robusto de O-glicano de MOD-4023 de diferentes lotes. El contenido molar de O-glicano por mol de MOD-4023 se determinó para diferentes lotes de principio activo (DS) y producto farmacéutico (DP) de MOD-4023.
Figura 8. Presenta una comparación de lote a lote entre péptidos O-glicosilados individuales basada en la respuesta de espectrometría de masas (MS). Las anotaciones de columna son secuencias de aminoácidos con "O" como abreviatura de glicano unido a O. La respuesta de MS del primer péptido se usó para la normalización de datos y se ajustó al 100 %.
Figura 9. Presenta el perfil de cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa (RP-HPLC) de MOD-4023. El pico 4 corresponde al pico principal del MOD-4023. También están presentes cuatro formas menores relacionadas (picos 1,2, 3 y 5).
Figura 10. Presenta el perfil de cromatografía líquida de alta eficacia de exclusión por tamaño (SEC-HPLC) de MOD-4023. El pico 3 corresponde a los monómeros MOD-4023. Los picos 1 y 2 corresponden a dímeros y polímeros de MOD-4023, respectivamente.
Figura 11. Presenta una comparación de un estándar de referencia MOD-4023 SR-929SI.1 (perfil superior) con MOD-4023 I15-PP (muestra UFDF1) (perfil inferior), analizado por RP-HPLC a 220 nm. El pico 1 corresponde a la forma glicosilada de MOD-4023 y el pico 2 corresponde a la forma no glicosilada.
Figura 12. Presenta una comparación de un estándar de referencia MOD-4023 SR-929SI.1 (perfil superior) con MOD-4023 C10-PP (Elución de DEAE Sepharose), según lo analizado por RP-HPLC a 220 nm. En este punto del proceso de producción, solo se observa el pico glicosilado en la muestra de MOD-4023Figura 13. Muestra la activación del receptor de hGH por MOD-4023 en células transfectadas de forma estable. Curva típica de activación dosis-respuesta por MOD-4023. Activación por MOD-4023 de los receptores de hGH en células Baf que expresan de manera estable el receptor de hGH en su superficie celular.
Figura 14. Presenta factores de eliminación de pasos de procesos individuales y procesos generales derivados de estudios de evaluación de la seguridad viral con el virus de la leucemia murina de Abelson (A-MuLV), el virus diminuto del ratón (MVM), el reovirus tipo 3 (Reo-3) y el virus de la pseudorrabia (PrV). Las cargas teóricas de virus por dosis se calcularon sobre una dosis máxima de 15 mg/dosis.
Figuras 15A y 15B. Muestran las estructuras de los glicanos unidos a O y su abundancia en dos productos MOD-4023 como se mide mediante el marcaje 2AB de los glicanos eliminados separados en HPLC usando una columna de fase normal (NP). (Figura 15A) También la abundancia del tipo de ácido siálico en dos muestras de productos MOD-423, como se mide por el marcaje con 1,2-diamino-4,5-metilendioxibenceno.2HCl (DMB) del ácido siálico eliminado separado en cromatografía líquida de ultra eficacia (UPLC) e identificado frente a estándares comerciales (Figura 15B)
Figura 16. Muestra una superposición de tres cromatogramas de corriente de iones totales obtenidos a partir de análisis de cromatografía de líquidos/espectroscopia de masas por electropulverización (LC/ES-MS) en línea de los productos de digestión tríptica de tres lotes de MOD-4023.
Figura 17. Muestra la evaluación de las señales obtenidas del análisis LC/ES-MS en línea de una digestión tríptica de lotes de proteína MOD-4023 desialilada, reducida y carboximetilada (como se muestra en la Figura 16 y se analiza en el Ejemplo 2) con un enfoque en la señal modificada por al menos un residuo HexNAc-Hex.
Figura 18. Muestra la secuencia de aminoácidos 1 -30 de MOD-4023 SEQ ID NO: 7, en la que la O-glicosilación tiene lugar en los residuos de serina (S) en las posiciones 10, 13, 15 y 21 (mostrados en rojo). Esas serinas (S) siguen todas a residuos de prolina (P) en la secuencia. Al menos dos de los residuos S en las posiciones uno a cuatro (1-4) están ocupados por sitios de O-glicosilación (mostrados en púrpura).
Figura 19. Muestra las secuencias de aminoácidos 211-275 de MOD-4023 SEQ ID NO: 7, en las que la O-glicosilación tiene lugar en los residuos de serina (S) que se muestran en rojo. Esas serinas (S) siguen todas a residuos de prolina (P) en la secuencia. Además, en la región de repeticiones de serina, al menos dos de los residuos S están ocupados por sitios de O-glicosilación (mostrados en púrpura).
Figura 20. Muestra el espectro de masas desconvolucionado adquirido durante la elución del componente absorbente de UV en tR 19,8 min obtenido del análisis LC/ES-MS en línea de la muestra MOD4023 Lote 648-01-10-014A después de la desialilación.
Figura 21. Muestra la pureza de MOD-4023 (DS), como se evalúa usando HPLC de fase inversa (RP).
Figura 22. Muestra la pureza de MOD-4023 (DS), como se evalúa usando un cromatógrafo de exclusión por tamaño (SEC)-HPLC.
Figura 23. Muestra resultados de potencia.
Figura 24. Muestra los resultados de análisis de impurezas para proteínas de células huésped (HCP); ADN, metotrexato (MTX); Propilenglicol (PG); Tritón; Insulina; DMSO; y carga biológica.
Se apreciará que por simplicidad y claridad de la ilustración, los elementos que se muestran en las figuras no se han dibujado necesariamente a escala. Por ejemplo, las dimensiones de algunos de los elementos pueden estar exageradas en relación con otros elementos para mayor claridad. Además, cuando se considere apropiado, los números de referencia pueden repetirse entre las figuras para indicar elementos correspondientes o análogos.
Descripción detallada
La presente invención proporciona un método para fabricar un polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica humana altamente glicosilada, consistiendo el polipéptido en dos CTP unidos al extremo carboxi de la hGH y un CTP unido al extremo amino de la hGH, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se establece en SEQ ID NO: 7, y en el que la hGH modificada con CTP altamente glicosilada está glicosilada en entre 12 y 18 sitios de glicosilación unidos a O, comprendiendo el método la pasos de: (a) transfectar de manera estable un número predeterminado de células con un vector de expresión que comprende una porción codificante que codifica la hormona del crecimiento humana modificada con CTP, en el que la célula transfectada expresa y secreta la hGH modificada con CTP; (b) obtener clones celulares que sobreexpresen la hGH modificada con CTP; (c) expandir los clones en solución a una escala predeterminada cultivando a un contenido de oxígeno disuelto (OD) de 20-30 %; (d) recolectar la solución que contiene los clones; (e) filtrar la solución que contiene los clones para obtener una solución de cosecha clarificada; y (f) purificar la solución de cosecha clarificada para obtener una solución de proteína purificada de la hGH modificada con CTP, en la que al menos el 60 % de la hGH modificada con CTP purificada en la cosecha clarificada es la forma altamente glicosilada de la hGH modificada con CTP; fabricando así un polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido de gonadotropina coriónica humana (CTP) altamente glicosilado.
En la siguiente descripción detallada, se exponen numerosos detalles específicos para proporcionar una comprensión profunda del polipéptido de la hormona del crecimiento humano (hGH) modificado con el péptido carboxi-terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica humana de acción prolongada recombinante (hGH modificada con CTP; MOD-4023; SEQ ID NO: 7) y métodos de fabricación del mismo. En otros casos, los métodos, procedimientos y componentes bien conocidos no se han descrito en detalle para no oscurecer el polipéptido de hGH modificado con CTP y los métodos de fabricación del mismo.
El polipéptido de hGH modificado con CTP de acción prolongada preparado mediante el método de la presente invención comprende el péptido carboxi terminal (CTP) de la gonadotropina coriónica humana (hCG). En una realización, CTP actúa como protector contra la degradación de proteínas o péptidos derivados de las mismas. En otra realización, CTP prolonga la vida media circulatoria de proteínas o péptidos derivados de las mismas. En algunas realizaciones, CTP mejora la potencia de proteínas o péptidos derivados de las mismas.
Un experto en la materia apreciaría que los términos "péptido CTP", "péptido carboxi terminal" y "secuencia CTP" se pueden usar indistintamente en el presente documento.
Un experto en la materia apreciaría que los términos "secuencia señal" y "péptido señal" se pueden usar indistintamente. Además, el experto en la materia apreciaría que el término "secuencia" cuando se refiere a un polinucleótido puede abarcar una parte codificante de la secuencia del polinucleótido.
Un experto en la materia apreciaría que los términos "polipéptido", "péptido", "péptido de interés", "polipéptido de interés" y "secuencia polipeptídica de interés" se pueden usar indistintamente. Un experto en la materia apreciaría que un polipéptido secretado maduro carezca de un péptido señal. Un experto en la materia apreciaría que la frase "número aumentado de sitios de glicosilación unidos a O glicosilados" también puede expresarse como una "ocupación aumentada de O-glicano".
Polipéptidos modificados con péptido de gonadotropina coriónica humana (CTP)
El polipéptido producido por el método de la invención consiste en dos péptidos carboxi terminales (CTP) de gonadotropina coriónica humana unidos al extremo carboxi de la hormona del crecimiento humana (hGH) y un CTP unido al extremo amino de la hGH, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se establece en SEQ ID NO: 7, y en el que el polipéptido está glicosilado en entre 12 y 18 sitios de glicosilación unidos a O. Como se describe en el presente documento, el polipéptido es un polipéptido de GH de acción prolongada.
En otra realización, una GH que comprende CTP establecido en SEQ ID NO: 7 tiene actividad biológica in vivo mejorada en comparación con la misma GH sin CTP.
Los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención se pueden administrar a un sujeto. En una realización, el sujeto es un sujeto humano. En otra realización, el sujeto es una mascota. En otra realización, el sujeto es un mamífero. En otra realización, el sujeto es un animal de granja. En otra realización, el sujeto es un perro. En otra realización, el sujeto es un gato. En otra realización, el sujeto es un mono. En otra realización, el sujeto es un caballo. En otra realización, el sujeto es una vaca. En otra realización, el sujeto es un ratón. En otra realización, el sujeto es una rata. En una realización, el sujeto es un macho. En otra realización, el sujeto es una hembra.
Tal como se describe en el presente documento, el polipéptido de hGH modificado con CTP puede tener una protección mejorada contra la degradación del polipéptido, o puede tener una vida media extendida para la proteína unida, o puede tener una actividad mejorada de la hGH.
Como se describe en el presente documento, el polipéptido de hGH modificado con CTP puede tener un tiempo de aclaramiento prolongado. Como se describe en el presente documento, el polipéptido de hGH modificado con CTP puede haber mejorado la Cmáxima de la hGH; puede haber mejorado el Tmáximo de la hGH; puede haber mejorado el T1/2 de la hGH; o puede haber extendido la vida media de la hGH.
El CTP en los polipéptidos de hGH preparados mediante el método de la invención comprende la secuencia de aminoácidos desde el aminoácido 118 hasta la posición 145 de la gonadotropina coriónica humana, como se establece en SEQ ID NO: 2: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
En una realización, la secuencia de ADN que codifica el péptido CTP es al menos un 90 % homóloga a la secuencia de ADN CTP nativa. En otra realización, la secuencia de ADN que codifica el péptido CTP es al menos un 95 % homóloga a la secuencia de ADN CTP nativa.
En el polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención, todas las secuencias de aminoácidos de CTP de gonadotropina coriónica están glicosiladas. En otra realización, la secuencia de CTP en el polipéptido de hGH modificado con CTP comprende 4 sitios de glicosilación. En otra realización, la secuencia de CTP comprende 5 sitios de glicosilación. En otra realización, la secuencia de CTP comprende 6 sitios de glicosilación. En otra realización, los sitios de glicosilación son sitios de O-glicosilación. En otra realización, la glicosilación se realiza en un residuo de serina. En otra realización, la glicosilación es en un residuo de treonina.
En otra realización, los métodos descritos en el presente documento fabrican una hGH modificada con CTP, en la que dicha hGH modificada con CTP está altamente sialilada. La sialilación es importante ya que cuanto mayor es la sialilación, más prolongada puede ser la vida media.
En una realización, la hGH modificada con CTP comprende la glicosilación entre 13 y 18, 14 y 18, 15 y 18, 16 y 18 o 17 y 18 sitios de glicosilación. En otra realización, la hGH modificada con CTP comprende la glicosilación en 12 sitios de glicosilación, en 13 sitios de glicosilación, en 14 sitios de glicosilación, en 15 sitios de glicosilación, en 16 sitios de glicosilación, en 17 sitios de glicosilación, en 18 sitios de glicosilación.
En una realización de la invención en la que la secuencia de aminoácidos de la hGH modificada con CTP se establece en la SEQ ID NO: 7, la glicosilación con unión a O se produce en los residuos de serina (S) disponibles presentes dentro de cada unidad de CTP. En otra realización, cada CTP contiene de 4 a 6 glicanos unidos a O, en el que la glicosilación es a los residuos de serina (S) presentes en cada unidad de CTP. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad de CTP comprende 12-18 cadenas de azúcar unidas a O. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad de CTP comprende 12 cadenas de azúcar unidas a O. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad de CTP comprende 13 cadenas de azúcar unidas a O. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad de CTP comprende 14 cadenas de azúcar unidas a O. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad CTP comprende 15 cadenas de azúcar unidas a O. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad de CTP comprende 16 cadenas de azúcar unidas a O. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad de CTP comprende 17 cadenas de azúcar unidas a O. En otra realización, la glicosilación con unión a O en los residuos de serina (S) de cada unidad de CTP comprende 18 cadenas de azúcar unidas a O.
En otra realización, un polipéptido de hGH modificado con CTP descrito en el presente documento comprende al menos una ocupación de 4 O-glicanos por CTP. En otra realización, un polipéptido de hGH modificado con CTP descrito en el presente documento comprende al menos una ocupación de 5 O-glicanos por CTP. En otra realización, un polipéptido de hGH modificado con CTP descrito en el presente documento comprende una ocupación de 6 O-glicanos por CTP. Un experto en la materia reconocería que la ocupación de O-glicanos puede diferir por CTP comprendido dentro de un polipéptido de hGH modificado con CTP.
Un experto en la materia apreciaría que el término "homología" puede abarcar supresiones, inserciones o variantes de sustitución, incluida una sustitución de aminoácidos de las mismas, y fragmentos polipeptídicos biológicamente activos de las mismas. En una realización, la variante de sustitución es aquella en la que la glutamina en la posición 65 de la hGH se sustituye por una valina [Gellerfors et al., J Pharm Biomed Anal 1989, 7:173-83].
En una realización, un "péptido" o un "fragmento peptídico" comprende un compuesto en el que una pluralidad de aminoácidos están unidos por un enlace peptídico. En el presente documento, cuando está contenido un no aminoácido, hay un caso en el que un enlace entre el no aminoácido y un aminoácido adyacente no es un enlace peptídico. Sin embargo, un compuesto en este caso también se denomina colectivamente péptido o fragmento peptídico.
Un polipéptido precursor de hGH modificado con CTP descrito en el presente documento se establece en SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 4:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIP
LSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPS
NREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLE
EGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYS KFDTNS HNDDALLKN Y GLLY CFRKDMDK
VETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPS
PSRLPGPSDTPILPQ.
Un experto en la materia apreciaría que la frase "hormona de crecimiento humana" (hGH) pueda abarcar un polipéptido precursor que incluye un péptido señal, tal como se establece en el número de acceso de Genbank P01241 (SEQ ID NO: 5), que muestra actividad de hGH (es decir, estimulación de crecimiento). SEQ ID NO: 5: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQ EFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLE PVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTY SKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF. La hGH madura descrita en el presente documento puede tener la secuencia de aminoácidos establecida en SEQ ID NO: 8:
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSES
IPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLL
KDLEEGrQTLMGRLEDGSPRTGQTFKQTYS KFDTNS HNDDALLKNYGLLYCFRKD
MDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF.
En una realización, después de la expresión y secreción de un polipéptido de hGH modificado con CTP, como se describe en el presente documento, el péptido señal se escinde de la proteína precursora dando como resultado una proteína madura. Por ejemplo, en SEQ ID NO: 4, los aminoácidos 1-26, MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA (SEQ ID NO: 6) representan el péptido señal del polipéptido de hGH modificado con CTP y los aminoácidos
SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQE
FEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEP
V QFLRS VFANSL V Y G ASDSNV YDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGS PRTGQIFKQT Y S
KFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPP
PSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPS PSRLPGPSDTPILPQ (SEQ ID NO: 7)
representan el polipéptido de hGH modificado con CTP modificado por ingeniería genética maduro que carece del péptido señal (MOD-4023). La secuencia de aminoácidos de hGH modificada con CTP obtenida mediante el método de la invención, sin el péptido señal, se establece en SEQ ID NO: 7. En una realización, el péptido señal de hGH modificada con CTP se establece en SEQ ID NO: 6. Los aminoácidos 29-219 de la secuencia de hGH modificada con CTP como se establece en SEQ ID NO: 7 representan la hGH. Los aminoácidos 1-28, 220-247 y 248-275 de la secuencia de hGH modificada con CTP como se establece en SEQ ID NO: 7 representan cada una de las unidades CTP, una N-terminal para la hGH y dos C-terminal a la hGH, de la hGH modificada con CTP.
En una realización, MOD-4023 (SEQ ID NO: 7) comprende dos puentes disulfuro (S-S), en los que ambos puentes S-S están dentro de la molécula de hGH. En otra realización, un puente disulfuro está entre el residuo de cisteína 81 y el residuo de cisteína 193 de SEQ ID NO: 7, y un segundo puente disulfuro está entre el residuo de cisteína 210 y el residuo de cisteína 217 de SEQ ID NO: 7.
En otra realización, el polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención estimula el crecimiento muscular.
El método de fabricación como se describe en el presente documento produce la secuencia de aminoácidos de un polipéptido de hGH modificado con CTP maduro que carece de un péptido señal. El método de fabricación descrito en el presente documento produce la secuencia de aminoácidos del polipéptido de hGH modificado con CTP maduro como se establece en SEQ ID NO: 7.
En otra realización, los métodos como se describen en el presente documento comprenden el uso de una secuencia de ácido nucleico que codifica un polipéptido de hGH modificado con CTP. En una realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden el uso del ácido nucleico establecido en SEQ ID NO: 9 que codifica un péptido de hGH con un péptido de aminoácido CTP en el extremo N y dos péptidos de aminoácido CTP en el extremo C.
SEC ID NO: 9:
ATGGCCACCGGCAGCAGGACCAGCCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCT
GCCATGGCTGCAGGAGGGCAGCGCCAGCTCTTCTTCTAAGGCTCCACCCCCAT
CTCTGCCCAGCCCCAGCAGACTGCCGGGCCCCAGCGACACACCCATTCTGCCC
CAGTTCCCCACCATCCCCCTGAGCAGGCTGTTCGACAACGCCATGCTGAGGGC
TCACAGGCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTCGAGGAAGCCT
ACATCCCCAAGG AGCAG AAG TACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCT
GTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACCCCCAGCAACAGAGAGGAGACCCAGCAG
AAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGGATCTCCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCT
GGAGCCCGTGCAGTTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGC
GCCAGCGACAGCAACGTGTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCC
AGACCCTGATGGGCCGGCTGGAGGACGGCAGCCCCAGGACCGGCCAGATCTT
CAAGCAGACCTACAG CAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACG CCCTG
CTG A A G A ACT ACGGGCT GCT GT ACT GCTTC AG A A AGG AC ATGG AC A AGGT GG
AGACCTTCCTGAGGATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGCGGCTT
CAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGC
CTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCT
CCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCTGGCCCCTCTGACACCCCTATC
CTGCCTCAG.
En una realización, los métodos de la invención comprenden el uso de una secuencia de ácido nucleico que comprende una porción codificante que codifica una hGH modificada con CTP descrita en el presente documento. En otra realización, el método comprende el uso de una secuencia de ácido nucleico como se establece en SEQ ID NO: 9. Un experto en la materia apreciaría que una secuencia de ácido nucleico puede ser parte de un vector de expresión que comprende una porción codificante que codifica una hGH modificada con CTP descrita en el presente documento.
En otra realización, los métodos descritos en el presente documento producen un péptido de hGH modificado con CTP para uso terapéutico en numerosas indicaciones, como se proporciona en la Patente de EE.UU. núm. 8.946.155. Además, dichos polipéptidos de hGH modificados con CTP están bien descritos en la publicación de solicitud de patente de EE.u U. con número de serie US-2014-0113860-A1, en Patente de EE.UU. núm. 8.450.269, y en Patente de EE.UU. núm. 8.304.386.
Los polipéptidos preparados mediante el método como se describe en el presente documento pueden utilizarse en tratamientos que requieren que los polipéptidos estén en forma soluble.
Se usan técnicas de proteínas recombinantes para generar los polipéptidos de hGH modificados con CTP descritos en el presente documento. Las técnicas de proteína recombinante se utilizan para la generación de polipéptidos relativamente largos (p. ej., de más de 18-25 aminoácidos). Las técnicas de proteína recombinante se usan para la generación de grandes cantidades del polipéptido descrito en el presente documento. Las técnicas recombinantes están descritas por Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544, Studier et al. (1990) Methods in Enzymol.
185:60-89, Brisson et al. (1984) Nature 310:511 -514, Takamatsu et al. (1987) EMBO J.6:307-311, Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680 y Brogli et al, (1984) Science 224:838-843, Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565 y Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Sección VIII, pp 421­ 463.
El polipéptido preparado por el método de la invención descrito en el presente documento se sintetiza utilizando un polinucleótido que codifica el polipéptido. En algunas realizaciones, el polinucleótido que codifica un polipéptido está ligado a un vector de expresión, que comprende un control transcripcional de una secuencia reguladora en cis (p. ej., secuencia promotora). En algunas realizaciones, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión constitutiva del polipéptido. En algunas realizaciones, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión específica del tejido del polipéptido. En algunas realizaciones, la secuencia reguladora en cis es adecuada para dirigir la expresión inducible del polipéptido.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos que expresan el polipéptido de hGH modificado con CTP comprenden la secuencia de nucleótidos que se establece en SEQ ID NO: 9.
En algunas realizaciones, los promotores específicos de tejido adecuados para su uso con secuencias de polinucleótidos comprenden secuencias que son funcionales en una población celular específica, los ejemplos incluyen promotores como la albúmina que es específica del hígado [Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], promotores linfoides específicos [Calame et al., (1988) Adv. inmunol. 43:235-275]; en particular promotores de receptores de células T [Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] e inmunoglobulinas; [Banerji et al. (1983) Cell 33729-740], promotores específicos de neuronas como el promotor de neurofilamentos [Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], promotores específicos del páncreas [Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916] o promotores específicos de las glándulas mamarias como el promotor del suero de leche (Patente de EE.UU. núm.
4.873.316 y Publicación de Solicitud Europea núm. 264.166). Los promotores inducibles adecuados para usar en los métodos descritos en el presente documento incluyen, por ejemplo, el promotor inducible por tetraciclina (Srour, M.A., et al., 2003. Thromb. Hemost. 90:398-405).
Un experto en la materia apreciaría que la frase "un polinucleótido" puede abarcar una secuencia de ácido nucleico de cadena simple o doble que se aísla y proporciona en forma de una secuencia de ARN, una secuencia de polinucleótidos complementaria (ADNc), una secuencia de polinucleótidos genómicos y/o una secuencia polinucleotídica compuesta (p. ej., una combinación de las anteriores).
Un experto en la materia apreciaría que la frase "secuencia polinucleotídica complementaria" puede abarcar una secuencia que resulta de la transcripción inversa del ARN mensajero usando una transcriptasa inversa o cualquier otra ADN polimerasa dependiente de ARN. En una realización, la secuencia se puede amplificar posteriormente in vivo o in vitro utilizando una ADN polimerasa.
Un experto en la materia apreciaría que la frase "secuencia de polinucleótidos genómicos" puede abarcar una secuencia derivada (aislada) de un cromosoma y, por lo tanto, representa una parte contigua de un cromosoma.
Un experto en la técnica apreciaría que la frase "secuencia de polinucleótidos compuesta" puede abarcar una secuencia, que es al menos parcialmente complementaria y al menos parcialmente genómica. En una realización, una secuencia compuesta puede incluir algunas secuencias exonales requeridas para codificar el polipéptido descrito en el presente documento, así como algunas secuencias intrónicas que se interponen entre ellas. En una realización, las secuencias intrónicas pueden ser de cualquier fuente, incluidos otros genes, y normalmente incluirán secuencias señal de corte y empalme conservadas. En una realización, las secuencias intrónicas incluyen elementos reguladores de la expresión que actúan en cis.
En una realización, los polinucleótidos descritos en el presente documento comprenden además una secuencia señal que codifica un péptido señal para la secreción de los polipéptidos descritos en el presente documento. En algunas realizaciones, las secuencias señal incluyen la secuencia señal endógena para hGH como se establece en SEQ ID NO: 6. En otra realización, la secuencia señal es N-terminal para la secuencia CTP que a su vez es N-terminal para la secuencia polipeptídica de interés.
En esta invención, los métodos proporcionan una GH modificada con CTP madura que carece de un péptido señal como se establece en SEQ ID NO: 7.
En algunas realizaciones, los polinucleótidos descritos en el presente documento se preparan utilizando técnicas de PCR o cualquier otro método o procedimiento conocido por los expertos en la materia. En algunas realizaciones, el procedimiento implica el legado de dos secuencias de ADN diferentes (ver, por ejemplo, "Current protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992).
Actividad biológica y usos
En una realización, los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención pueden usarse para reducir la frecuencia de dosificación de una GH en un sujeto.
En otra realización, los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención pueden usarse para mejorar el área bajo la curva (AUC) de una GH en un sujeto.
En una realización, los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención se pueden usar para tratar a un sujeto que necesita terapia con GH.
En otra realización, los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención pueden usarse para aumentar los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) en un sujeto.
En otra realización, los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención pueden usarse para mantener los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) en un sujeto. En otra realización, los niveles de IGF-I se pueden mantener en un rango definido, como se describe más adelante en el presente documento.
En otra realización, los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención se pueden usar para aumentar y mantener los niveles del factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-I) dentro de un rango definido en un sujeto. En una realización, el rango definido es un rango de dosis terapéutica logrado mediante la administración de la hGH modificada con CTP. En otra realización, el rango definido es uno en el que la Cmax y la Cmin del comportamiento sinusoidal de IGF-I se mantienen tras administraciones consecutivas de hGH modificada con CTP. En otra realización, el rango definido es un rango de dosis terapéuticas para administrar de forma consecutiva la hGH modificada con CTP con una capacidad de respuesta excelente en un sujeto y con una necesidad mínima de modificación de la dosis. En otra realización, el rango definido es comparable al rango de niveles de IGF-I en individuos que se consideran normales. En otra realización, el rango definido es el rango normal de niveles/valores de IGF-I en individuos normales. En otra realización más, el rango definido está dentro del rango normal cuando los valores de IGF-I SDS están dentro de ±2 SDS.
En otra realización, los métodos descritos en el presente documento proporcionan un polipéptido de hGH modificado con CTP que puede usarse para estimular el crecimiento óseo.
Una hGH modificada con CTP preparada por el método de la invención se puede usar de la misma manera que las GH no modificadas. La hGH modificada con CTP puede tener una vida media circulante y un tiempo de residencia en plasma aumentados, un aclaramiento disminuido y una actividad clínica aumentada in vivo. Debido a las propiedades mejoradas de la hGH modificada con CTP, se puede administrar con menos frecuencia que las GH no modificadas. La GH modificada con CTP se puede administrar de una vez a la semana a una vez cada dos semanas, o se puede administrar de una vez cada dos semanas a una vez cada tres semanas, o se puede administrar de una vez al día a tres veces a la semana. La disminución de la frecuencia de administración puede resultar en un mejor cumplimiento por parte del paciente, lo que conduce a mejores resultados del tratamiento, así como a una mejor calidad de vida del paciente. En comparación con los conjugados convencionales de GH unidos a polietilenglicol, se ha encontrado que los conjugados de GH CTP preparados por el método de la invención pueden tener una potencia mejorada, una estabilidad mejorada, niveles elevados de AUC y una vida media circulante mejorada. Una cantidad terapéuticamente eficaz de una hGH modificada con CTP preparada mediante el método de la invención puede ser la cantidad de conjugado necesaria para la actividad biológica esperada medible in vivo. Una GH preparada por el método de la invención utilizada según las enseñanzas descritas en el presente documento puede mostrar una potencia aumentada 0 una actividad prolongada in vivo.
Una cantidad terapéuticamente eficaz de una hGH modificada con CTP preparada mediante el método de la invención puede determinarse según factores como el tipo exacto de condición que se trata, la condición del paciente que se trata, así como los demás ingredientes de la composición. Una cantidad terapéuticamente eficaz de hGH modificada con CTP preparada mediante el método de la invención puede ser de 0,01 a 10 gg por kg de peso corporal administrada una vez por semana, o de 0,1 a 1 gg por kg de peso corporal, administrada una vez por semana, o 1 gg por kg de peso corporal a 1 mg por kg de peso corporal, administrado una vez a la semana, o 1 mg por kg de peso corporal, administrado una vez a la semana. Una cantidad terapéuticamente eficaz para un paciente adulto con deficiencia de hormona del crecimiento puede comprender hGH modificada con CTP a 1 mg - 15 mg, administrada una vez a la semana, o más de 1 mg, administrada una vez a la semana. Una cantidad terapéuticamente eficaz para un paciente infantil con deficiencia de la hormona del crecimiento puede comprender hGH modificada con CTP a entre 1 gg por kg de peso corporal y 1 mg/kg de peso corporal, administrada una vez a la semana, o hasta 600 gg por kg de peso corporal, administrada una vez a la semana, o hasta 700 gg por kg de peso corporal, administrados una vez por semana, o entre aproximadamente 600 gg por kg de peso corporal y 700 gg por kg de peso corporal, administrados una vez por semana. Una composición farmacéutica que comprende una hGH modificada con CTP preparada por el método de la invención se puede formular en una fuerza eficaz para la administración por varios medios a un paciente humano.
Los polipéptidos preparados por el método de la invención pueden emplearse en medicina veterinaria. Los polipéptidos se pueden usar en el tratamiento de mamíferos domésticos que se mantienen como compañeros humanos (p. ej., perros, gatos, caballos), que tienen un valor comercial significativo (p. ej., vacas lecheras, ganado vacuno, animales deportivos), que tienen un valor científico significativo (por ejemplo, especímenes cautivos o libres de especies en peligro de extinción), o que de otro modo tengan valor.
Los polipéptidos preparados por la invención se pueden administrar a un animal (p. ej., ratón, rata, conejo, hámster, cobaya, cerdo, microcerdo, pollo, camello, cabra, caballo, vaca, oveja, perro, gato, primate no humano y humanos. Las aplicaciones enumeradas pueden tener usos en una amplia variedad de huéspedes. Dichos huéspedes pueden incluir humanos, murinos, conejos, cabras, cobayas, camellos, caballos, ratones, ratas, hámsteres, cerdos, microcerdos, pollos, cabra, vaca, oveja, perro, gato o primate no humano.
Los polipéptidos preparados por la invención pueden usarse en el tratamiento de animales de granja. Los animales de granja pueden incluir cerdos, vacas, vacas lecheras, caballos, cabras, ovejas, pollos, pavos, gansos, patos y especies relacionadas. Los polipéptidos pueden usarse en el tratamiento de animales de laboratorio. Los animales de laboratorio pueden incluir ratas, ratones, cobayas, conejos, cabras, monos, perros, gatos y otros. Los polipéptidos pueden usarse en el tratamiento de animales de zoológico. Los animales de zoológico pueden incluir todos los animales vertebrados mantenidos en zoológicos. Los polipéptidos pueden usarse en el tratamiento de animales acuáticos. Los animales acuáticos pueden incluir peces, anguilas, tortugas, focas, pingüinos, tiburones, ballenas y especies relacionadas. Los polipéptidos preparados por la invención pueden usarse en el tratamiento de animales domésticos. Los animales domesticados pueden incluir cualquier mascota, como gatos y perros, o animales que son mantenidos por humanos, por ejemplo, caballos, vacas, cerdos, cabras, conejos, pollos, pavos, gansos, patos y similares.
Un experto en la materia apreciaría que el término "cerdos" incluye cerdos, lechones, puercos, lechonas, cerdos castrados, verracos y cerdas. De manera similar, el experto en la materia apreciaría que el término "ganado" incluye terneros, vacas, vacas lecheras, novillas, novillos y toros.
Fabricación
La presente invención proporciona un método para fabricar un polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido carboxi terminal (CTP) de gonadotropina coriónica humana altamente glicosilada, consistiendo el polipéptido en dos CTP unidos al extremo carboxi de la hGH y un CTP unido al extremo amino de la hGH, en el que la secuencia de aminoácidos del polipéptido se establece en SEQ ID NO: 7, y en el que la hGH modificada con CTP altamente glicosilada está glicosilada en entre 12 y 18 sitios de glicosilación unidos a O, comprendiendo el método la pasos de: (a) transfectar de manera estable un número predeterminado de células con un vector de expresión que comprende una porción codificante que codifica dicha (hGH) modificada con CTP, en el que dicha célula transfectada expresa y secreta dicha hGH modificada con CTP; (b) obtener clones celulares que sobreexpresen dicha hGH modificada con CTP; (c) expandir dichos clones en solución a una escala predeterminada cultivando a un contenido de oxígeno disuelto (OD) de 20-30 %; (d) recolectar dicha solución que contiene dichos clones; (e) filtrar dicha solución que contiene dichos clones para obtener una solución de cosecha clarificada; y (f) purificar dicha solución de cosecha clarificada para obtener una solución de proteína purificada, en la que al menos el 60 % de la hGH modificada con CTP purificada en la cosecha clarificada es la forma altamente glicosilada de la hGH modificada con CTP; fabricando así un polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido carboxi terminal (CTP) de gonadotropina coriónica humana altamente glicosilada. En otra realización, el método de fabricación en la presente invención comprende clones que expresan y secretan dicha hGH modificada con CTP. Una vez que se selecciona el clon final de alta expresión, cada producción incluye la descongelación de un banco de células de trabajo (WCB), la expansión, la cosecha y la purificación. (Véase el ejemplo: pasos 1-8 de la Figura 3 que describen la expansión del clon a través de la cosecha; pasos 8-16 de la Figura 4 que describen la purificación). En una realización alternativa, una vez que se selecciona el clon final de alta expresión, cada producción incluye la descongelación de un banco de células maestras (MCB), la expansión, la cosecha y la purificación. (Véase el ejemplo: pasos 1-8 de la Figura 3 que describe la expansión del clon a través de la cosecha; pasos 8-16 de la Figura 4 que describe la purificación).
En una realización, los polinucleótidos descritos en el presente documento se insertan en vectores de expresión (es decir, una construcción de ácido nucleico) para permitir la expresión del polipéptido recombinante. En una realización, el vector de expresión descrito en el presente documento incluye secuencias adicionales que hacen que este vector sea adecuado para la replicación e integración en eucariotas. En una realización, el vector de expresión descrito en el presente documento incluye un vector lanzadera que hace que este vector sea adecuado para la replicación e integración tanto en procariotas como en eucariotas. En algunas realizaciones, los vectores de clonación comprenden secuencias de iniciación de la transcripción y la traducción (p. ej., promotores, potenciadores) y terminadores de la transcripción y la traducción (p. ej., señales de poliadenilación).
En una realización, el método de fabricación de la hGH modificada con CTP comprende el uso de un vector de expresión, en el que dicho vector de expresión comprende un promotor, una secuencia codificante para un polipéptido modificado con CTP y una secuencia de poliadenilación. En otra realización, la secuencia codificante se establece en SEQ ID NO: 9. En otra realización, la secuencia de poliadenilación es una secuencia de poliadenilación de virus de simio (SV) 40.
Se puede usar una variedad de células eucariotas como sistemas de expresión del huésped para expresar los polipéptidos descritos en el presente documento. Por lo tanto, se utilizan sistemas de expresión no bacterianos (p. ej., sistemas de expresión de mamíferos tales como células CHO o células derivadas de células CHO) para expresar el polipéptido como se describe en el presente documento. En una realización, el vector de expresión usado para expresar polinucleótidos como se describe en el presente documento en células de mamífero es el vector pCI-DHFR que comprende un promotor de CMV y un gen de resistencia a la neomicina. En otra realización, las células se cultivan como un cultivo de células adherentes. En otra realización, las células se cultivan en cultivo en suspensión.
En una realización, el vector de expresión como se describe en el presente documento comprende además secuencias de polinucleótidos adicionales que permiten, por ejemplo, la traducción de varias proteínas a partir de un solo ARNm, como un sitio de entrada al ribosoma interno (IRES) y secuencias para la integración genómica del promotorpolipéptido quimérico.
En algunas realizaciones, los vectores de expresión de mamíferos incluyen pcDNA3, pcDNA3.1 (+/-), pGL3, pZeoSV2 (+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHb B, pNMT1, pNMT41, pNMT81, que están disponibles en Invitrogen, pCI, que está disponible en Promega, pMbac, pPbac, pBK-RSV y pBK-CMV, que están disponibles en Stratagene, pTRES, que está disponible en Clontech, y sus derivados.
En algunas realizaciones, los vectores de expresión que contienen elementos reguladores de virus eucarióticos tales como retrovirus se pueden encontrar en los vectores descritos en el presente documento. Los vectores SV40 incluyen pSVT7 y pMT2. En algunas realizaciones, los vectores derivados del virus del papiloma bovino incluyen pBV-1 MTHA, y los vectores derivados del virus de Epstein Bar incluyen pHEBO y p2O5. Otros vectores ejemplares incluyen pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, baculovirus pDSVE y cualquier otro vector que permita la expresión de proteínas bajo la dirección del promotor temprano de SV-40, el promotor tardío de SV-40, el promotor de metalotioneína, el promotor del virus del tumor mamario murino, el promotor del virus del sarcoma de Rous, el promotor de la polihedrina, u otros promotores que se hayan mostrado eficaces para la expresión en células eucariotas.
La "transfección" de células huésped eucarióticas con un polinucleótido o vector de expresión, que da como resultado células modificadas genéticamente o células transgénicas, puede realizarse mediante cualquier método bien conocido en la técnica y descrito, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, Nueva York (1989, 1992), en Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989), Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995), Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995), Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988) y Gilboa et al. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986] e incluyen, por ejemplo, transfección estable o transitoria, y electroporación. Además, véanse las Patentes de EE.UU. núms.
5.464.764 y 5.487.992 para métodos de selección positivo-negativo. Los métodos de transfección incluyen además la transfección mediada por liposomas, la coprecipitación con fosfato de calcio, la electroporación, la transfección mediada por policationes (como DEAE-dextrano), la fusión de protoplastos, las infecciones virales (incluidas las infecciones virales recombinantes) y la microinyección. Preferiblemente, la transfección es una transfección estable. Se favorece el método de transfección que proporciona una frecuencia de transfección óptima y la expresión de los genes heterólogos que codifican el péptido de interés descrito en el presente documento en la línea y el tipo de células huésped particulares. Los métodos adecuados pueden determinarse mediante procedimientos de rutina. Para transfectantes estables, las construcciones se integran en el genoma de la célula huésped o en un cromosoma/minicromosoma artificial o se ubican episómicamente para mantenerse estables dentro de la célula huésped.
Los métodos descritos en el presente documento emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas convencionales de biología celular, biología molecular, cultivo celular, inmunología y similares que se encuentran en la experiencia de un experto en la materia. Estas técnicas se describen completamente en la literatura actual. Véase, p. ej. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989); Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, actualizado); Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991); Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991); Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990); Wu et al., eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989); Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990); McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press (1991); Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984); Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987); Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991); Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990); Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987); Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press en Oxford University Press (1995); Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990); Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (actualizado); Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, en: Biotechnology vol. 2, Pühler ed., VCH, Weinheim 663-744; la serie Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.), y Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987).
Un gen heterólogo de interés que codifica la hGH modificada con CTP descrita en el presente documento puede introducirse en la célula descrita en el presente documento mediante diversos métodos, por ejemplo mediante transformación viral, transfección o microinyección. El gen heterólogo de interés puede introducirse en la célula como ADN lineal o como parte de un vector de expresión. Se conocen varios vectores de expresión eucarióticos que permiten múltiples sitios de clonación para la inserción de uno o más genes heterólogos y su expresión. Los proveedores comerciales incluyen empresas como Stratagene, La Jolla, Calif., EE. UU.; Invitrogen, Carlsbad, Calif., EE. UU.; Promega, Madison, Wis., EE. UU. o BD Biosciences Clontech, Palo Alto, Calif., EE. UU. La transfección de las células con un ADN o un vector de expresión que codifica(n) uno o más genes de interés se lleva a cabo mediante métodos convencionales como se describe, por ejemplo, en Sambrook et al., 1989 o Ausubel et al., 1994. Los métodos adecuados de transfección incluyen, por ejemplo, transfección mediada por liposomas, coprecipitación con fosfato cálcico, electroporación, transfección mediada por policationes (p. ej., DEAE dextrano), fusión de protoplastos, microinyección e infecciones virales. Preferiblemente, se lleva a cabo una transfección estable en la que las moléculas de ADN se integran en el genoma de la célula huésped o en un cromosoma/minicromosoma artificial, o se contienen episómicamente de manera estable en la célula huésped. Se prefiere el método de transfección que proporcione la expresión y la frecuencia de transfección óptimas de uno o más genes heterólogos de interés en la célula huésped en cuestión. En esta invención, el gen de interés codifica una GH modificada con CTP como se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, la introducción de ácido nucleico por infección viral ofrece varias ventajas sobre otros métodos como la lipofección y la electroporación, ya que se puede obtener una mayor eficacia de transfección debido a la naturaleza infecciosa de los virus.
El gen heterólogo de interés suele estar ligado funcionalmente a un promotor que permite la transcripción del gen de interés, y a otros elementos reguladores que permiten la transcripción y traducción (expresión) del gen de interés o aumentan su eficacia.
Un experto en la materia apreciaría que el término "promotor" puede abarcar una secuencia de polinucleótidos que permite y controla la transcripción de los genes o secuencias ligados funcionalmente a ella. Un promotor contiene secuencias de reconocimiento para unirse a la ARN polimerasa y el sitio de inicio de la transcripción (sitio de inicio de la transcripción). Para expresar una secuencia deseada en un determinado tipo de célula o una célula huésped, debe elegirse un promotor funcional adecuado. El experto en la materia estará familiarizado con una variedad de promotores de diversas fuentes, incluidos los promotores constitutivos, inducibles y reprimibles. Se depositan en bancos de datos como GenBank, por ejemplo, y se pueden obtener como elementos separados o elementos clonados dentro de secuencias de polinucleótidos de fuentes comerciales o individuales. En los promotores inducibles, la actividad del promotor puede reducirse o aumentarse en respuesta a una señal. Un ejemplo de un promotor inducible es el promotor de tetraciclina (tet). Este contiene secuencias operadoras de tetraciclina (tetO) que pueden ser inducidas por una proteína transactivadora regulada por tetraciclina (tTA). En presencia de tetraciclina, se inhibe la unión de tTA a tetO. Ejemplos de otros promotores inducibles son jun, fos, metalotioneína y promotor de choque térmico (véase también Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989; Gossen, M. et al., Curr Opi Biotech 1994, 5, 516-520). De los promotores que son particularmente adecuados para una alta expresión en eucariotas, están, por ejemplo, el promotor ubiquitina/S27a del hámster (documento WO 97/15664), promotor temprano SV 40, promotor tardío principal de adenovirus, promotor de metalotioneína-1 de ratón, la región de repetición terminal larga del virus del sarcoma de Rous y el promotor temprano del citomegalovirus humano. Ejemplos de otros promotores heterólogos de mamíferos son los promotores de actina, inmunoglobulina o choque térmico.
Por ejemplo, el promotor puede unirse funcionalmente a secuencias potenciadoras para aumentar la actividad transcripcional. Para esto, se pueden usar uno o más potenciadores y/o varias copias de una secuencia potenciadora, p. ej. un potenciador de CMV o SV40. Por ejemplo, el promotor puede unirse funcionalmente a secuencias potenciadoras para aumentar la actividad transcripcional. Para esto, se pueden usar uno o más potenciadores y/o varias copias de una secuencia potenciadora, p. ej. un potenciador de CMV o SV40.
Un experto en la materia reconocería que el término "potenciador" indica una secuencia de polinucleótidos que en la ubicación cis actúa sobre la actividad de un promotor y, por lo tanto, estimula la transcripción de un gen conectado funcionalmente a este promotor. A diferencia de los promotores, el efecto de los potenciadores es independiente de la posición y la orientación y, por lo tanto, pueden colocarse delante o detrás de una unidad de transcripción, dentro de un intrón o incluso dentro de la región codificante. El potenciador puede estar ubicado tanto en la vecindad inmediata de la unidad de transcripción como a una distancia considerable del promotor. También es posible tener una superposición física y funcional con el promotor. El experto en la materia conocerá una serie de potenciadores de diversas fuentes (y depositados en bancos de datos como GenBank, p. ej., potenciadores de SV40, potenciadores de CMV, potenciadores de polioma, potenciadores de adenovirus) que están disponibles como elementos independientes o elementos clonados dentro de secuencias de polinucleótidos (p. ej., depositado en la ATCC o de fuentes comerciales e individuales). Varias secuencias promotoras también contienen secuencias potenciadoras tales como el promotor CMV usado con frecuencia. El potenciador de CMV humano es uno de los potenciadores más fuertes identificados hasta ahora. Un ejemplo de potenciador inducible es el potenciador de metalotioneína, que puede ser estimulado por glucocorticoides o metales pesados.
Básicamente, los elementos reguladores incluyen promotores, potenciadores, señales de terminación y poliadenilación y otros elementos de control de la expresión. Tanto las secuencias inducibles como las constitutivamente reguladoras son conocidas para los diversos tipos de células. Los "elementos reguladores de la transcripción" generalmente comprenden un promotor aguas arriba de la secuencia del gen a expresar, sitios de inicio y terminación de la transcripción y una señal de poliadenilación.
Un experto en la materia apreciaría que el término "sitio de inicio de la transcripción" puede abarcar un ácido nucleico en la construcción que corresponde al primer ácido nucleico que se incorpora en el transcrito primario, es decir, el precursor de ARNm. El sitio de iniciación de la transcripción puede solaparse con las secuencias del promotor.
Un experto en la materia apreciaría que el término "sitio de terminación de la transcripción" puede abarcar una secuencia de nucleótidos que normalmente se encuentra en el extremo 3' del gen de interés o de la sección del gen que se va a transcribir, y que provoca la terminación de la transcripción por la ARN polimerasa.
Un experto en la materia apreciaría que el término "señal de poliadenilación" abarque una secuencia señal que provoque la escisión en un sitio específico en el extremo 3' del ARNm eucariótico y la incorporación postranscripcional de una secuencia de aproximadamente 100-200 nucleótidos de adenina (cola poliA) en el extremo 3' escindido. La señal de poliadenilación comprende la secuencia AATAAA aproximadamente 10-30 nucleótidos aguas arriba del sitio de escisión y una secuencia ubicada aguas abajo. Se conocen varios elementos de poliadenilación como tk poliA, SV40 tardío y poliA temprano o BGH poliA (descritos por ejemplo en la Patente de EE.UU. núm. 5.122.458).
Un experto en la materia apreciaría que el término "elementos reguladores de la traducción" puede abarcar un sitio de inicio de la traducción (AUG), un codón de parada y una señal poliA para cada polipéptido que se va a expresar. Para una expresión óptima, puede ser aconsejable eliminar, añadir o cambiar las regiones no traducidas en 5' y/o 3' de la secuencia de ácido nucleico que se va a expresar, para eliminar cualquier codón de iniciación de la traducción adicional potencialmente inadecuado u otras secuencias que podrían afectar a la expresión a nivel de transcripción o expresión. Para promover la expresión, los sitios de unión de consenso ribosómico se pueden insertar alternativamente inmediatamente aguas arriba del codón de inicio. Para producir un polipéptido secretado, el gen de interés normalmente contiene una secuencia señal que codifica un péptido precursor de señal que transporta el polipéptido sintetizado a y a través de la membrana del RE. La secuencia señal a menudo, aunque no siempre, se ubica en el extremo amino de la proteína secretada y se escinde por las peptidasas señal después de que la proteína haya sido filtrada a través de la membrana del RE. La secuencia del gen normalmente, pero no necesariamente, contendrá su propia secuencia señal. Si la secuencia señal nativa no está presente, se puede introducir una secuencia señal heteróloga de manera conocida. Numerosas secuencias señal de este tipo son conocidas por el experto en la materia y están depositadas en bancos de datos de secuencias tales como GenBank y EMBL.
Un experto en la materia apreciaría que el término "polipéptidos", "polipéptido" o equivalentes gramaticales de los mismos, se utilice para secuencias de aminoácidos o proteínas y abarque polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. Este término también incluye proteínas que han sido modificadas postraduccionalmente por reacciones tales como glicosilación, fosforilación, acetilación o procesamiento de proteínas.
Para producir uno o más productos génicos de interés en las células, las células pueden cultivarse en un medio de cultivo libre de suero y en cultivo en suspensión en condiciones que permitan la expresión del gen de interés. Si por ejemplo el gen de interés está bajo el control de un promotor constitutivo, no hay necesidad de añadir inductores especiales. Si la expresión del gen de interés está bajo el control de un promotor inducible, por ejemplo, se debe añadir un inductor correspondiente al medio de cultivo celular en una concentración suficiente pero no tóxica. Las células pueden expandirse según se desee mediante múltiples subpasajes y transferirse a recipientes de cultivo celular adecuados. El (los) producto(s) génico(s) se produce(n) como un producto celular, unido a la membrana o secretor.
El método de fabricación de una hGH modificada con CTP como se describe en el presente documento comprende un paso de transfección de forma estable de un número predeterminado de células con un vector de expresión que comprende una parte codificante que codifica la hGH modificada con CTP. En otra realización, la secuencia de nucleótidos de la porción codificante se establece en SEQ ID NO: 9. En una realización, las células son células CHO. En otra realización, las células son células DG44. En otra realización, las células son cualquier célula conocida en la técnica adecuadas para la expresión y secreción de hGH modificada con CTP. En otra realización, el vector de expresión es un vector de expresión pCI-dhfr-MOD-23 (Figura 2). Las células transfectadas expresan y secretan la hGH modificada con CTP, en la que la secuencia de aminoácidos de la hGH modificada con CTP madura expresada y secretada se establece en SEQ ID NO: 7. En otra realización, la expresión de la hGH modificada con CTP es en un alto nivel de expresión. La hGH modificada con CTP está altamente glicosilada. En otra realización, la hGH modificada con CTP puede estar altamente sialilada. En general, el método de fabricación presentado en el presente documento proporciona una hGH modificada con CTP que tiene un alto contenido de glicosilación y un alto porcentaje de sitios de glicosilación glicosilados.
El método de fabricación de una hGH modificada con CTP comprende un paso de obtención de clones celulares que sobreexpresan la hGH modificada con CTP. En otra realización, la expresión de hGH modificada con CTP es óptima. En una realización, el nivel de expresión es de al menos 200 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 300 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 400 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 500 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 600 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 700 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 800 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 900 mg/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 1 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 1,2 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 1,4 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 1,6 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 1,8 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 2 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 2,2 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 2,4 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 2,6 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 2,8 g/L. En otra realización, el nivel de expresión es de al menos 3 g/L. En otra realización, los clones en el paso (b) se propagan en un medio para formar un banco de células maestras (MCB) y un banco de células de trabajo (WCB). En una realización, los clones en el paso (c) se obtienen de un MCB. En otra realización, los clones en el paso (c) se obtienen de un WCB.
El producto polipeptídico de hGH modificado con CTP maduro se obtiene del medio de cultivo celular como un producto génico secretado. El experto en la materia reconocería que el producto génico secretado carecería del péptido señal comprendido en el producto de traducción de longitud completa y codificado en la secuencia de ácido nucleico. Sin embargo, si una proteína o polipéptido se expresa sin una señal de secreción, el producto génico también puede aislarse de los lisados celulares. Para obtener un producto homogéneo puro que esté sustancialmente libre de otras proteínas recombinantes y proteínas de células huésped, se llevan a cabo procedimientos de purificación convencionales. En primer lugar, las células y los desechos celulares se eliminan con frecuencia del medio de cultivo o del lisado. A continuación, el producto génico deseado puede liberarse de proteínas, polipéptidos y ácidos nucleicos solubles contaminantes, p. ej. por fraccionamiento en columnas de intercambio iónico y de inmunoafinidad, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa o cromatografía en Sephadex, hidroxiapatita, sílice o resinas de intercambio catiónico como DEAE (véanse los Ejemplos en el presente documento). Los métodos conocidos en la técnica y que dan como resultado la purificación de una proteína heteróloga expresada por células huésped recombinantes son conocidos por los expertos y se describen en la literatura, p. ej. por Harris et al. (Harris et al., Protein Purification: A Practical Approach, Pickwood and Hames, eds., IRL Press, Oxford, 1995) y Scopes (Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, 1988). Estos métodos pueden emplearse en su totalidad o en parte en los métodos descritos en el presente documento. En base a la metodología proporcionada en el presente documento, el experto en la materia apreciaría y sería capaz de adaptar y modificar el uso de metodologías de cromatografía particulares en función de la necesidad y el conocimiento en la técnica. Por ejemplo, el experto en la materia puede elegir una columna de intercambio catiónico alternativa en lugar de una columna DEAE, en la que se mantendría el objetivo de separación por intercambio catiónico. El experto en la materia reconocería alternativas similares conocidas en la técnica para fraccionamiento, inmunoafinidad, precipitación de proteínas, precipitación de ácidos nucleicos, precipitación con etanol, HPLC de fase inversa o cromatografía en Sephadex, hidroxiapatita, sílice, resinas de intercambio aniónico o de intercambio catiónico.
En otra realización, el método de preparación del polipéptido de hGH modificado con CTP puede llevarse a cabo en células de mamífero en condiciones libres de suero.
Los ejemplos de medios libres de suero, libres de proteínas o químicamente definidos incluyen, por ejemplo, los medios obtenibles comercialmente Ham's F12 (Sigma, Deisenhofen, DE), RPMI 1640 (Sigma), medio Eagle modificado de Dulbecco (DMEM; Sigma), medio esencial mínimo (MEM; Sigma), medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM; Sigma), CDCHO (Invitrogen, Carlsbad, Calif., EE. UU.), CHO-S-SFMII (Invitrogen), medio CHO libre de suero (Sigma), medio CD-PowerCHO2 (Lonza) y medio CHO libre de proteínas (Sigma). Si se desea, cada uno de estos medios puede complementarse con diversos compuestos, como hormonas y/u otros factores de crecimiento (p. ej., insulina, transferrina, factor de crecimiento epidérmico, factor de crecimiento similar a la insulina), sales (p. ej., cloruro de sodio, calcio, magnesio, fosfato), tampones (p. ej., HEPES), nucleósidos (p. ej., adenosina, timidina), glutamina, glucosa u otros nutrientes equivalentes, antibióticos y/o elementos traza o piensos disponibles comercialmente como Power Feed A (Lonza) o Cell Boost 6 (HyCLone). Si las células replicables son células recombinantes que expresan uno o más marcadores seleccionables, también se pueden añadir al medio uno o más agentes de selección adecuados tales como antibióticos.
Se apreciará que además de contener los elementos necesarios para la transcripción y traducción de la secuencia codificante insertada (que codifica el polipéptido), la construcción de expresión descrita en el presente documento también puede incluir secuencias diseñadas para optimizar la estabilidad, producción, purificación, rendimiento o actividad del polipéptido expresado.
En algunas realizaciones, las células transformadas se cultivan en condiciones eficaces, que permiten la expresión de grandes cantidades de polipéptido recombinante. En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo eficaces incluyen medios eficaces, biorreactor, temperatura, pH y condiciones de oxígeno que permitan la producción de proteínas. En una realización, un medio eficaz puede abarcar cualquier medio en el que se cultive una célula para producir el polipéptido recombinante descrito en el presente documento. En algunas realizaciones, un medio normalmente incluye una solución acuosa que tiene fuentes asimilables de carbono, nitrógeno y fosfato, y sales, minerales, metales y otros nutrientes apropiados, tales como vitaminas. En algunas realizaciones, las células descritas en el presente documento se pueden cultivar en biorreactores de fermentación convencionales, matraces de agitación, tubos de ensayo, placas de microtitulación y placas de Petri. En algunas realizaciones, el cultivo se lleva a cabo a una temperatura, pH y contenido de oxígeno apropiados para una célula recombinante. En algunas realizaciones, las condiciones de cultivo están dentro de la experiencia de un experto en la materia.
En esta invención, las condiciones de cultivo comprenden un contenido de oxígeno disuelto (OD) de 20-30 %.
En una realización, las condiciones de cultivo comprenden que el pH comienza en una temperatura y cambia a otra durante la fabricación. En otra realización, el pH comienza en aproximadamente 7,3 y cambia a aproximadamente 6,7 durante la incubación en el biorreactor. En otra realización, el pH comienza en aproximadamente 7,3, aproximadamente 7,2 o aproximadamente 7,1 y cambia a aproximadamente 6,7, aproximadamente 6,8, aproximadamente 6,9 o aproximadamente 7,0 durante la incubación en el biorreactor.
En una realización, después de un tiempo predeterminado en cultivo, se efectúa la recuperación del polipéptido recombinante.
En una realización, los polipéptidos se purifican usando una variedad de técnicas estándar de purificación de proteínas, como cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, filtración, electroforesis, cromatografía de interacción hidrofóbica, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de fase inversa, cromatografía con concanavalina A, cromatografía con hidroxiapatita, cromatoenfoque y solubilización diferencial.
En una realización, cada columna se ejecuta a temperatura controlada o no controlada.
En una realización, para facilitar la recuperación, la secuencia codificante expresada se puede diseñar para que codifique el polipéptido descrito en el presente documento y se fusione con un resto escindible. En una realización, se diseña una proteína de fusión para que el polipéptido pueda aislarse fácilmente mediante cromatografía de afinidad; p. ej., por inmovilización en una columna específica para el resto escindible. En una realización, se diseña un sitio de escisión entre el polipéptido y el resto escindible y el polipéptido puede liberarse de la columna cromatográfica mediante tratamiento con una enzima o agente apropiado que escinda específicamente la proteína de fusión en este sitio [p. ej., véase Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988); y Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)].
En una realización, el polipéptido se recupera en forma "sustancialmente pura".
Un experto en la materia apreciaría que la frase "sustancialmente pura" puede abarcar una pureza que permita el uso eficaz de la proteína como se describe en el presente documento. Tal forma también puede incluir formas altamente glicosiladas y altamente sialiladas como también se describe en el presente documento.
En algunas realizaciones, los polipéptidos recombinantes se sintetizan y purifican; su eficacia terapéutica se puede ensayar in vivo o in vitro. En una realización, las actividades de unión de la GH recombinante modificada por los CTP descritos en el presente documento pueden verificarse utilizando varios ensayos.
En una realización, un método para fabricar una hGH modificada con CTP como se describe en el presente documento comprende un paso para obtener clones que expresen y secreten de manera óptima dicha hGH modificada con CTP a partir de dicha WCB, y expandir dichos clones. En otra realización, un método para fabricar hGH modificada con CTP comprende un paso para obtener clones que expresen de manera óptima dicha hGH modificada con CTP a partir de dicho MCB, y expandir dichos clones. En otra realización, un método de fabricación comprende clones que expresan y secretan de manera óptima dicha hGH modificada con CTP. En otra realización, los clones celulares se expanden en solución a través de una serie de pasos de subcultivo hasta el nivel del biorreactor de producción. En otra realización, la solución que contiene dichos clones subcultivados se siembra en un biorreactor. En otra realización, el biorreactor es un biorreactor desechable. En otra realización, el biorreactor comprende un biorreactor de acero inoxidable, un biorreactor de movimiento basculante como el sistema Wave de GE, un biorreactor de perfusión o cualquier otro sistema de biorreactor conocido en la técnica. En una realización, la eliminación de células de un biorreactor se logra mediante el uso de un sistema de filtro desechable. Si se lleva a cabo una fabricación a gran escala, se podría utilizar una centrifugación continua antes de utilizar un sistema de filtrado.
En una realización, los clones celulares se expanden más o aumentan de escala cultivando en serie dichas células en tamaños crecientes del biorreactor hasta alcanzar la escala deseada. En otra realización, un biorreactor funciona en un modo de alimentación por lotes. En otra realización, un biorreactor funciona en un modo por lotes. En otra realización, un biorreactor funciona en un modo de lotes repetidos. En otra realización, un biorreactor funciona en un modo de perfusión.
Las densidades celulares máximas viables difieren según el tipo de biorreactor empleado. En una realización, la densidad celular máxima viable de un biorreactor utilizado en los métodos de fabricación descritos en el presente documento es de aproximadamente 0,2 x 106 - 1,4 x 106 células/ml. En otra realización, la densidad celular máxima viable de un biorreactor utilizado en los métodos de fabricación descritos en el presente documento es de aproximadamente 0,05 x 106 - 100 x 106. En otra realización, la densidad celular máxima viable de un biorreactor es de aproximadamente 0,05 x 106 - 0,5 x 106. En otra realización, la densidad celular máxima viable de un biorreactor es de aproximadamente 0,5 x 106 - 5 x 106. En otra realización, la densidad celular máxima viable de un biorreactor es de aproximadamente 5,0 x 106 - 50 x 106. En otra realización, la densidad celular máxima viable de un biorreactor es de aproximadamente 50 x 106 - 100 x 106.
Los esquemas de alimentación para el uso de biorreactores podrían ser diferentes, p. ej. alimentación diaria repetida desde un día determinado, o fija en varios días, además el % de alimento añadido podría ser diferente desde un pequeño % hasta incluso un 50 % o más.
Puede añadirse DMSO a un biorreactor a diferentes concentraciones como se conoce en la técnica. En una realización, se añade 0,1-3 % de DMSO a un biorreactor durante su uso. En otra realización, se añade 0,1-0,5 % de DMSO. En otra realización, se añade 0,5-1,0 % de DMSO. En otra realización, se añade 1,0-1,5 % de DMSO. En otra realización, se añade 1,5-2,0 % de DMSO. En otra realización, se añade 2,0-2,5 % de DMSO. En otra realización, se añade 2,5-3,0 % de DMSO.
En una realización, un método para fabricar una hGH modificada con CTP comprende el paso de purificar una solución de cosecha clarificada para obtener una solución de proteína purificada. En otra realización, una solución de proteína purificada comprende al menos un 60 % de hGH modificada con CTP. En otra realización, una solución de proteína purificada comprende al menos un 70 % de hGH modificada con CTP. En otra realización, una solución de proteína purificada comprende al menos un 80 % de hGH modificada con CTP. En otra realización, una solución de proteína purificada comprende al menos un 90 % de hGH modificada con CTP.
En una realización, una cosecha clarificada se mantiene hasta 24 horas a 2-25 °C. En otra realización, la cosecha clarificada se almacena a 5 °C hasta por un mes.
En una realización, la cosecha clarificada obtenida en el paso (e) se analiza para carga biológica, endotoxina bacteriana, contenido de proteína específica, ADN residual, virus, partículas similares a virus y/o micoplasma, o cualquier combinación de los mismos.
En una realización, la purificación de la cosecha clarificada en el paso (f) se logra realizando secuencialmente los pasos que comprenden: (g) concentrar, diafiltrar y purificar dicha solución de cosecha clarificada, donde dicha concentración, diafiltración y purificación se logra mediante un casete de fibra hueca o casete de flujo tangencial que pasa secuencialmente dicha solución de cosecha clarificada a través de una columna de intercambio aniónico y una columna de interacción hidrofóbica; (h) obtener dicha cosecha clarificada obtenida después del paso (g) e inactivar los virus presentes en dicha cosecha clarificada incubando en una solución tóxica para dichos virus; (i) obtener dicha solución de cosecha clarificada a partir de (g) purificando dicha solución de cosecha clarificada, i. en el que dicha purificación se logra pasando secuencialmente dicha solución de cosecha clarificada a través de una columna de intercambio de aniones y una columna de interacción hidrofóbica seguido de un paso de concentración y diafiltración, ii. en el que a dicha purificación le sigue el paso secuencial de dicha solución de cosecha clarificada a través de una columna de modo mixto de hidroxiapatita y una columna de intercambio catiónico; (j) obtener dicha solución de cosecha clarificada después del paso (ii) y eliminar físicamente dicha solución de cosecha clarificada de los virus mediante nanofiltración; (k) obtener dicha solución de cosecha clarificada después del paso (j) y concentrar y diafiltrar dicha solución de cosecha clarificada para llegar a una cosecha clarificada máximamente purificada que contiene dicha forma altamente glicosilada de polipéptidos modificados con CTP. En otra realización, los métodos descritos en el presente documento comprenden un paso de centrifugación antes de la filtración final. Un experto en la técnica apreciaría que tanto la centrifugación como la filtración son métodos para clarificar una solución.
En una realización, la ultrafiltración y la diafiltración para concentrar y filtrar una cosecha clarificada se pueden realizar usando un cartucho de fibra hueca o un paso equivalente de UFDf basado en TFF. El tamaño de corte del peso molecular nominal del cartucho es de 10.000 kDa. En otra realización, un cartucho de membrana podría cumplir con las membranas PES/PS/RC con un corte de 3 kDa a 30 kDa.
En otra realización, la columna de intercambio aniónico del paso (i) es una columna de flujo rápido DEAE-Sepharose. En otra realización, la columna DEAE purifica una forma altamente glicosilada de hGH modificada con CTP descrita en el presente documento. En una realización, cuanto mayor sea la glicosilación, mejor será la farmacodinámica de la hGH modificada con CTP. En otra realización, una columna de intercambio de aniones puede comprender otras columnas de intercambio de aniones conocidas en la técnica, por ejemplo, una columna de intercambio de aniones Capto DEAE u otras resinas como Eshmuno Q.
En una realización, la columna hidrófoba del paso (i) es una columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) de fenilo. El número de ciclos de uso para HIC de fenilo puede oscilar entre aproximadamente 1 y 10. En una realización, se realizan de 1 a 3 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 5 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 6 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 7 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 8 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 9 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 10 ciclos. En otra realización, se utilizan tampones conocidos en la técnica para el lavado y elución. En una realización, un tampón de elución comprende sulfato de amonio con propilenglicol. En una realización, un tampón de elución comprende sulfato de amonio con etilenglicol.
En una realización, una columna de modo mixto de hidroxiapatita comprende una columna de modo mixto de hidroxiapatita cerámica (CHT). El número de ciclos de uso de CHT puede oscilar entre aproximadamente 1 y 10. En una realización, se realizan de 1 a 3 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 5 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 6 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 7 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 8 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 9 ciclos. En otra realización, se realizan de 1 a 10 ciclos. La elución de una columna CHT se puede realizar con entre aproximadamente 3 y 10 volúmenes de columna (CV). En una realización, la elución se realiza con aproximadamente 3 CV. En otra realización, la elución se realiza con aproximadamente 4 CV. En otra realización, la elución se realiza con aproximadamente 5 CV. En otra realización, la elución se realiza con aproximadamente 6 CV. En otra realización, la elución se realiza con aproximadamente 7 CV. En otra realización, la elución se realiza con aproximadamente 8 CV. En otra realización, la elución se realiza con aproximadamente 9 CV. En otra realización, la elución se realiza con aproximadamente 10 CV.
En una realización, los virus que podrían estar presentes en la cosecha clarificada debido a la contaminación se inactivan en la cosecha clarificada. En otra realización, los virus se inactivan usando una solución T riton-X 100 al 1 %. En otra realización, los virus se inactivan utilizando una solución de Triton-X 100 del 0,1 al 2 %. En otra realización, los virus se inactivan utilizando una solución de Triton-X 100 al 0,2 %. En otra realización, los virus se inactivan utilizando una solución de Triton-X 100 al 0,5 %. En otra realización, los virus se inactivan utilizando una solución de Triton-X 100 al 1-4 %. En otra realización, los virus se inactivan utilizando una solución de Triton-X 100 al 0,2-0,5 %. En otra realización, los virus se inactivan utilizando una solución de Triton-X 100 al 0,5-1,0 %. En otra realización, los virus se inactivan usando una solución de Triton-X 100 al 2 %. En otra realización, los virus se inactivan usando una solución de Triton-X 100 al 3 %. En otra realización, los virus se inactivan usando una solución de Triton-X 100 al 4 %. En otra realización, los virus se inactivan utilizando una solución de Triton-X 100 al 5-10 %. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X 100 dura aproximadamente 0,5 a 24 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 0,5 a 1 hora. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 1 a 2 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 2 a 3 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 3 a 4 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 4 a 6 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 6 a 8 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 8 a 10 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 10 a 12 horas. En otra realización, la inactivación viral en una solución de Triton-X dura aproximadamente 12 a 24 horas.
El experto en la materia apreciará que en los métodos descritos en el presente documento se pueden usar otras concentraciones u otras soluciones disponibles en la técnica y que son tóxicas para estos virus, incluidos colato de sodio y Tween 80. En otra realización, se usa una mezcla de fosfato de tri-n-butilo (TNBP) y polisorbato 80 (Tween 80) para inactivar el virus en el paso (h). En otra realización, los métodos de inactivación de virus comprenden la reducción del pH. Un experto en la materia apreciaría que la inactivación de virus puede abarcar condiciones cambiantes de la solución como se sabe en la técnica.
En una realización, los virus se eliminan físicamente usando nanofiltración. El experto en la materia apreciará que cualquier filtro conocido en la técnica para eliminar virus puede aplicarse en los métodos descritos en el presente documento. En otra realización, la nanofiltración se realiza mediante un cartucho filtrante tipo Planova o Planova (1­ 60 mm2). Dichos métodos son seguidos por la confirmación del aclaramiento viral de la cosecha clarificada utilizando métodos conocidos en la técnica.
En una realización, una columna de intercambio catiónico del paso (i) en el presente documento es una columna de flujo rápido SP-Sepharose. En otra realización, la columna de intercambio catiónico comprende una CM Sepharose Capto S. En otra realización, la columna de intercambio catiónico comprende cualquiera conocida en la técnica para el propósito del presente documento.
En una realización, los métodos descritos en el presente documento alcanzan al menos el 60 %, al menos el 70 %, al menos el 80 %, al menos el 90 %, al menos el 95 %, al menos el 96 %, al menos el 97 %, al menos el 98 %, al menos el 99 %, al menos el 99,9 % de tasa de recuperación de hGH modificada con CTP altamente glicosilada.
En una realización, después de la purificación de una hGH modificada con CTP altamente glicosilada, los métodos comprenden además caracterizar dicho polipéptido modificado con CTP. En otra realización, se determina la pureza de la hGH modificada con CTP. En otra realización, se determina el contenido de glicosilación. En otra realización, se determina la ocupación del sitio de glicosilación. En una realización, la pureza, el contenido de glicosilación y la ocupación del sitio de glicosilación se determinan en la hGH modificada con CTP fabricada.
En otra realización, los clones celulares utilizados en los métodos se almacenan en un banco de células congeladas. En otra realización, los clones celulares se almacenan en un banco de células liofilizadas.
En otra realización, el banco de células es un banco de células maestro. En otra realización, el banco de células es un banco de células de trabajo. En otra realización, el banco de células es un banco de células de Buenas Prácticas de Fabricación (GMP). En otra realización, el banco de células está destinado a la producción de material de calidad clínica. En otra realización, el banco de células se ajusta a las prácticas reguladoras para uso humano. En otra realización, el banco de células es cualquier otro tipo de banco de células conocido en la técnica.
Las "buenas prácticas de fabricación" se definen, por ejemplo, en (21 CFR 210-211) del Código de Regulaciones Federales de los Estados Unidos. En otra realización, las "buenas prácticas de fabricación" están definidas por otros estándares para la producción de material de grado clínico o para consumo humano; p. ej. normas de un país que no sea Estados Unidos.
En otra realización, el medio utilizado para la propagación de células contiene metotrexato (MTX). En otra realización, el medio es un medio libre de metotrexato. En otra realización, la concentración de MTX presente en un medio está entre aproximadamente 0,1 y 2 pM. En otra realización, la concentración de MTX presente en el medio es de aproximadamente 0,1-0,5 pM. En otra realización, la concentración de MTX presente en el medio es de aproximadamente 0,5-1,0 pM. En otra realización, la concentración de MTX presente en el medio es de aproximadamente 1,0-1,5 pM. En otra realización, la concentración de MTX presente en el medio es de aproximadamente 1,5-2,0 pM. Se apreciará bien que el término "medio" puede abarcar un líquido, gel o polvo que es adecuado para el crecimiento o cultivo de las células que comprenden la hGH modificada con CTP descrita en el presente documento. Dicho medio puede denominarse alternativamente como "medio de crecimiento" o "medio de cultivo" y puede incluir medios nutrientes, medios enriquecidos, medios mínimos, medios diferenciales, medios de transporte o medios selectivos. En otro aspecto, el medio selectivo puede ser adecuado para seleccionar un grupo particular de células durante el proceso de fabricación.
En una realización, una solución de proteína purificada contiene al menos un 70 % de hGH modificada con CTP. En otra realización, la solución de proteína purificada contiene al menos un 80 % de hGH modificada con CTP. En otra realización, la solución purificada contiene al menos 90-95 % de hGH modificada con CTP. En otra realización, la solución purificada contiene 95,1-99,9 % de hGH modificada con CTP. En otra realización, la solución purificada contiene 100 % de hGH modificada con CTP.
La hGH modificada con CTP fabricada está altamente glicosilada. Será muy apreciado por el experto en la materia que el término "altamente glicosilado" cuando se refiere a los polipéptidos de hGH modificados con CTP cosechados presentes en la cosecha, puede abarcar un nivel de glicosilación de aproximadamente 60-80 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. (Véase, por ejemplo, como se mide por HPLC de fase inversa en la Figura 11). En otra realización, la cosecha que comprende hGH modificada con CTP altamente glicosilada tiene un nivel de glicosilación de al menos el 60 % de los polipéptidos de hGH modificados con CTP en la solución purificada. En otra realización, la cosecha que comprende hGH modificada con CTP altamente glicosilada tiene un nivel de glicosilación de al menos el 70 % de los polipéptidos de hGH modificados con CTP. En otra realización, la cosecha que comprende hGH modificada con CTP altamente glicosilada tiene un nivel de glicosilación de al menos 80 % de los polipéptidos de hGH modificados con CTP en la solución purificada. En otra realización, la cosecha comprende un nivel de glicosilación de aproximadamente 81-90 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, la cosecha que comprende hGH modificada con CTP altamente glicosilada tiene un nivel de glicosilación de al menos el 90 % de los polipéptidos de hGH modificados con CTP en la solución purificada. En otra realización, la cosecha comprende un nivel de glicosilación de aproximadamente 91-95 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, la cosecha comprende un nivel de glicosilación de aproximadamente 95,1-99 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, la cosecha comprende un nivel de glicosilación del 100 % del polipéptido de hGH modificado con CTP total de la solución purificada.
En otra realización, la solución de hGH modificada con CTP purificada (principio activo (DS)) comprende una solución en la que al menos el 90 % de las moléculas están altamente glicosiladas. En otra realización, la solución de hGH modificada con CTP purificada (principio activo (DS)) comprende una solución en la que al menos el 95 % de las moléculas están altamente glicosiladas. En otra realización, la solución de hGH modificada con CTP purificada (principio activo (DS)) comprende una solución en la que el 100 % de las moléculas están altamente glicosiladas. Un experto en la materia reconocería que el principio activo (DS) de hGH modificada con CTP purificada puede abarcar hGH modificada con CTP en la que cada molécula comprende una ocupación de 12-18 O-glicanos.
Un experto en la materia apreciaría que el término "principio activo" (DS) puede abarcar o ser equivalente al ingrediente farmacéutico activo (API). En una realización, un polipéptido de hGH modificado con CTP, como se establece en SEQ ID NO: 7, principio activo (DS) comprende el fármaco purificado a granel. El experto en la materia también apreciaría que el término "producto farmacéutico" (DP) pueda abarcar el fármaco formulado finalmente una vez dispensado en un recipiente final, por ejemplo, un vial, en condiciones asépticas. En una realización, un polipéptido de hGH modificada con CTP, como se establece en SEQ ID NO: 7, producto farmacéutico (DP) comprende la hGH modificada con CTP finalmente formulada.
Los polipéptidos de hGH modificados con CTP altamente glicosilados pueden tener propiedades beneficiosas para su uso como hGH de acción prolongada (por ejemplo, MOD-4023), lo que respalda una frecuencia de administración reducida, por ejemplo, una sola inyección semanal, de pacientes con deficiencia de hormona de crecimiento. Los altos niveles de glicosilación contribuyen al aumento significativo del volumen hidrodinámico de una hGH modificada con CTP, por ejemplo, una hGH modificada con CTP, en comparación con la hGH recombinante. Esto puede dar como resultado un tiempo de circulación prolongado de la hGH modificada con CTP.
El número de O-glicanos por cada CTP-hGH-CTP-CTP (también conocido como "MOD-4023") está entre 12 y 18. En otra realización, el número de O-glicanos por MOD-4023 es al menos 13, 14, 15, 16, 17 o 18.
En una realización, la hGH modificada con CTP está altamente sialilada. El experto en la materia apreciará que el término "altamente sialilado" cuando se refiere a una hGH modificada con CTP, puede abarcar un nivel de sialilación de aproximadamente 60-80 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, un nivel de sialilación de aproximadamente 60-70 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, un nivel de sialilación de aproximadamente 70-80 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, un nivel de sialilación de aproximadamente 80-90 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, un nivel de sialilación de aproximadamente 90-95 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, un nivel de sialilación de aproximadamente 95,1-99 % del total de polipéptidos de hGH modificados con CTP de la solución purificada. En otra realización, un nivel de sialilación del 100 % de los polipéptidos de hGH modificados con CTP totales de la solución purificada. En otra realización, una estructura de O-glicano en una hGH modificada con CTP comprende un núcleo 1 monosialilado.
En una realización, el vector de expresión que comprende una porción codificante que codifica una GH humana modificada con CTP también comprende un promotor, una secuencia codificante para el polipéptido modificado con CTP y una secuencia de poliadenilación. En una realización, la secuencia de poliadenilación es una secuencia de poliadenilación de virus de simio (SV) 40.
En una realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 600 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 600-700 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 701 -800 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 801-900 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 901 -1000 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1001 -1100 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1101-1200 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1201-1300 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1301-1400 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1401-1500 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1501-1600 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1601 -1700 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1701 -1800 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1801 -1900 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 1901-2000 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2001-2100 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2101 -2200 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2201-2300 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2301-2400 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2401 -2500 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2501 -2600 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2601 -2700 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2701-2800 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2801-2900 mg/L. En otra realización, la hGH modificada con CTP se expresa a un nivel de al menos 2901-3000 mg/L.
El experto en la materia apreciará que el término "expresión" puede abarcar la transcripción y/o traducción de una secuencia de ácido nucleico heterólogo dentro de una célula huésped. El nivel de expresión de un producto/proteína de interés deseado en una célula huésped se puede determinar sobre la base de la cantidad de ARNm o ADNc correspondiente que está presente en la célula, o la cantidad del polipéptido/proteína de interés deseado codificado por la secuencia seleccionada como en los presentes ejemplos. Por ejemplo, el ARNm transcrito a partir de una secuencia seleccionada puede cuantificarse mediante hibridación de transferencia Northern, protección de ARN con ribonucleasa, hibridación in situ con ARN celular o mediante PCR (véase Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987 actualizado). Las proteínas codificadas por una secuencia seleccionada se pueden cuantificar mediante varios métodos, p. ej. por ELISA, por inmunoelectrotransferencia, por radioinmunoensayos, por inmunoprecipitación, por ensayo de la actividad biológica de la proteína, por inmunotinción de la proteína seguido de análisis FACS (véase Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987 actualizado) o mediante ensayos homogéneos de fluorescencia resuelta en el tiempo (HTRF). En una realización, la cuantificación de la hGH modificada con CTP comprende el uso de una cromatografía líquida de alta eficacia de fase inversa (RP-HPLC). En otra realización, la RP-HPLC comprende una columna C-18. En otra realización, la RP-HPLC comprende una columna C-8. En otra realización, los métodos descritos en el presente documento utilizan una RP-HPLC para cuantificar una hGH modificada con CTP en la cosecha (véanse los pasos del ejemplo 3 a 8). En otra realización, los métodos descritos en el presente documento utilizan una RP-HPLC para cuantificar una hGH modificada con CTP en los primeros pasos de purificación (véanse los pasos de ejemplo 9-12).
En otra realización, un banco de células o material congelado descrito en el presente documento muestra una viabilidad tras la descongelación de más del 90 %. En otra realización, el almacenamiento es por tiempo indefinido. En otra realización, el almacenamiento es por 2 semanas. En otra realización, el almacenamiento es por 3 semanas. En otra realización, el almacenamiento es por 1 mes. En otra realización, el almacenamiento es por 2 meses. En otra realización, el almacenamiento es por 3 meses. En otra realización, el almacenamiento es por 5 meses. En otra realización, el almacenamiento es por 6 meses. En otra realización, el almacenamiento es por 9 meses. En otra realización, el almacenamiento es por 1 año.
En otra realización, se crioconserva un banco de células o material congelado mediante un método que comprende hacer crecer un cultivo de células en un medio definido, congelar el cultivo en una solución que comprende glicerol y almacenar los clones celulares por debajo de -20 grados Celsius. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente -70 grados Celsius. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente -70--80 grados Celsius. En otra realización, cualquier medio definido descrito en el presente documento puede usarse en este método.
En otra realización, el cultivo se inocula desde un banco de células. En otra realización, el cultivo se inocula a partir de un stock congelado. En otra realización, el cultivo se inocula a partir de un cultivo iniciador. En otra realización, el cultivo se inocula a partir de una colonia. En otra realización, el cultivo se inocula a mitad logarítmica de la fase de crecimiento. En otra realización, el cultivo se inocula aproximadamente en la mitad logarítmica de la fase de crecimiento. En otra realización, el cultivo se inocula en otra fase de crecimiento.
En otra realización, la solución utilizada para la congelación comprende DMSO en una cantidad del 2 al 20 %. En otra realización, la cantidad es del 2 %. En otra realización, la cantidad es del 20 %. En otra realización, la cantidad es del 1 %. En otra realización, la cantidad es del 1,5 %. En otra realización, la cantidad es del 3 %. En otra realización, la cantidad es del 4 %. En otra realización, la cantidad es del 5 %. En otra realización, la cantidad es del 7 %. En otra realización, la cantidad es del 7,5 %. En otra realización, la cantidad es del 9 %. En otra realización, la cantidad es del 10 %. En otra realización, la cantidad es del 12 %. En otra realización, la cantidad es del 14 %. En otra realización, la cantidad es del 16 %. En otra realización, la cantidad es del 18 %. En otra realización, la cantidad es del 22 %. En otra realización, la cantidad es del 25 %. En otra realización, la cantidad es del 30 %. En otra realización, la cantidad es del 35 %. En otra realización, la cantidad es del 40 %.
En otra realización, el aditivo es sacarosa. En otra realización, el aditivo es cualquier otro aditivo coligativo o aditivo con propiedades anticongelantes que se conoce en la técnica.
En una realización, una solución de congelación comprende medios acondicionados y DMSO. En una realización, una solución de congelación comprende aproximadamente un 46,255 % de medio acondicionado y un 7,5 % de DMSO.
En una realización, el cultivo celular se cultiva mediante técnicas habituales en la técnica. En otra realización, se mantiene un pH constante durante el crecimiento del cultivo celular. En otra realización, el pH se mantiene en aproximadamente 7,0. En otra realización, el pH es de aproximadamente 6. En otra realización, el pH es de aproximadamente 6,5. En otra realización, el pH es de aproximadamente 7,5. En otra realización, el pH es de aproximadamente 8. En otra realización, el pH es de 6,5-7,5. En otra realización, el pH es 6-8. En otra realización, el pH es 6-7. En otra realización, el pH es 7-8.
En otra realización, se mantiene una temperatura constante durante el crecimiento del cultivo. En otra realización, la temperatura se mantiene a aproximadamente 37 °C. En otra realización, la temperatura es de 37 °C. En otra realización, la temperatura es de 25 °C. En otra realización, la temperatura es de 27 °C. En otra realización, la temperatura es de 28 °C. En otra realización, la temperatura es de 30 °C. En otra realización, la temperatura es de 32 °C. En otra realización, la temperatura es de 34 °C. En otra realización, la temperatura es de 35 °C. En otra realización, la temperatura es de 36 °C. En otra realización, la temperatura es de 38 °C. En otra realización, la temperatura es de 39 °C.
En otra realización, se mantiene una concentración constante de oxígeno disuelto durante el crecimiento del cultivo. En otra realización, la concentración de oxígeno disuelto se mantiene al 20 % de saturación. En otra realización, la concentración es del 22 % de saturación. En otra realización, la concentración es del 25 % de saturación. En otra realización, la concentración es del 30 % de saturación.
En otra realización, el cultivo crece en medios que tienen un volumen máximo de 2 litros (L) por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen máximo de 200 ml por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen máximo de 300 ml por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen máximo de 500 ml por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen máximo de 750 ml por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen máximo de 1 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen máximo de 1,5 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen máximo de 2,5 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen de 3 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen de 5 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen de al menos 5 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen de al menos 10 L por recipiente.
En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 2 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 500 ml por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 750 ml por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 1 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 1,5 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 2,5 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 3 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 4 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 5 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 6 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 8 L por recipiente. En otra realización, el medio tiene un volumen mínimo de 10 L por recipiente.
En otra realización, el paso de congelación se realiza cuando el cultivo tiene una densidad de 1 x 106 células viables (CV)/ml. En otra realización, la biomasa es 1,5 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 1,5 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 2 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 3 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 4 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 5 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 7 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 9 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 10 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 12 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 15 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 20 x 107 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 25 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 30 x 107 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 33 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 40 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es 50 x 106 CV/ml. En otra realización, la biomasa es más de 50 x 106 CV/ml.
En otra realización, el cultivo celular se congela instantáneamente en nitrógeno líquido, seguido de almacenamiento a la temperatura de congelación final. En otra realización, el cultivo se congela de manera más gradual; p. ej. colocándolo en un vial del cultivo a la temperatura final de almacenamiento. En otra realización, el cultivo se congela mediante cualquier otro método conocido en la técnica para congelar cultivos celulares.
El experto en la materia entenderá que los términos "cultivo celular" y "cultivo tisular" pueden usarse indistintamente y denotan el mantenimiento de las células in vitro, en cultivo en suspensión en un medio líquido o en una superficie como vidrio, plástico o agar provista de medio líquido. En general, el "cultivo celular" necesita un medio que esté tamponado para mantener un pH adecuado constante. Los medios utilizados en el cultivo celular generalmente se formulan para incluir un suministro adecuado de los nutrientes necesarios y se pueden adaptar osmóticamente a las células particulares que se mantienen, controlando también la temperatura y la fase gaseosa dentro de límites adecuados. Las técnicas de cultivo celular son bien conocidas en la técnica. Véase, p. ej., Morgan et al. 1993 Animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers, Oxford, Reino Unido; y Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, segunda edición, Elsevier.
El experto en la técnica apreciará que el término "Pasaje" puede abarcar el acto de subcultivar una población celular. Un "subcultivo" puede abarcar un cultivo celular establecido mediante la inoculación de un medio estéril, que en una realización es un medio estéril nuevo, con una muestra de un cultivo anterior.
El experto en la materia también apreciará que el término "cepa celular" puede abarcar una población de células derivadas de un cultivo primario utilizando técnicas de subcultivo. Por lo tanto, un cultivo primario se puede subcultivar en dos o más cultivos nuevos y el subcultivo puede repetirse a intervalos periódicos durante varios meses para mantener la cepa celular. El subcultivo bajo los métodos descritos en el presente documento se puede llevar a cabo utilizando técnicas de cultivo celular establecidas.
En una realización, las cepas celulares pasadas y las líneas celulares inmortalizadas pueden caracterizarse por su expresión de marcadores funcionales específicos tales como queratinas, receptores hormonales y de factores de crecimiento y similares.
En algunas realizaciones, los cultivos pueden llevarse a cabo en medios definidos libres de suero con factores de crecimiento añadidos. En otros aspectos, los medios contienen suero con o sin factores de crecimiento añadidos. Dichas modificaciones pueden determinarse empíricamente por el experto en la materia para optimizar la proliferación celular.
Un experto en la materia apreciará que el término "línea celular" puede abarcar una población de células derivadas de un único explante que se caracterizan por tener el potencial de proliferación ilimitada in vitro. Como se describe en el presente documento, se puede aislar una línea celular de un cultivo primario en función de su capacidad para sobrevivir y seguir creciendo en el cultivo. Las líneas celulares que se han derivado originalmente de tejido tumoral pueden haberse transformado in vivo, aunque no todas las poblaciones celulares neoplásicas tienen la capacidad de crecer indefinidamente in vitro. Además, las líneas celulares generalmente retienen su carácter diferenciado a través de muchas rondas de división.
Los sustratos de cultivo celular adecuados son generalmente un recipiente que pueda esterilizarse, que no filtre factores tóxicos y que no distorsione las imágenes microscópicas. Por lo tanto, las placas formadas a partir de vidrio y plástico son sustratos adecuados para usar en los métodos descritos en el presente documento. Los recipientes de plástico pueden tratarse adicionalmente para estimular la unión celular utilizando técnicas conocidas en la técnica (Ramsey et al. 1984 In vitro 20:802). Los medios de cultivo tisular adecuados generalmente consisten en un medio nutritivo basal isotónico, tamponado, que proporciona una fuente de energía, acoplada con sales inorgánicas, aminoácidos, vitaminas y varios suplementos. Los suplementos pueden incluir suero (p. ej., suero fetal de ternera o similares) varios antibióticos para evitar la contaminación o para proporcionar condiciones selectivas, factores de unión y crecimiento o similares. En la técnica se conocen varias formulaciones de medios, como el medio esencial mínimo (MEM), el Rosewell Park Memorial Institute (RPM') 1640 o el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Las condiciones adecuadas de cultivo tisular también se conocen en la técnica. Véase, p. ej., Morgan et al. 1993 animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, Reino Unido, y Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, segunda edición, Elsevier. En otra realización, el método de fabricación de hGH modificada con CTP es un proceso libre de suero. En otra realización, el método de fabricación de hGH modificada con CTP es un proceso libre de derivados animales.
En otra realización, la temperatura de almacenamiento del cultivo está entre '20 y '80 grados Celsius (°C). En otra realización, la temperatura está significativamente por debajo de '20 °C. En otra realización, la temperatura no es más cálida de '70 °C. En otra realización, la temperatura es '70 °C. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente '70 °C. En otra realización, la temperatura es '20 °C. En otra realización, la temperatura es de aproximadamente '20 °C. En otra realización, la temperatura es '30 °C. En otra realización, la temperatura es '40 °C. En otra realización, la temperatura es '50 °C. En otra realización, la temperatura es '60 °C. En otra realización, la temperatura es '80 °C. En otra realización, la temperatura es '30' '70 °C. En otra realización, la temperatura es '40' ' 70 °C. En otra realización, la temperatura es '50' '70 °C. En otra realización, la temperatura es '60' '70 °C. En otra realización, la temperatura es '30' '80 °C. En otra realización, la temperatura es '40' '80 °C. En otra realización, la temperatura es '50' '80 °C. En otra realización, la temperatura es '60' '80 °C. En otra realización, la temperatura es ' 70' '80 °C. En otra realización, la temperatura es más fría de '70 °C. En otra realización, la temperatura es más fría de '80 °C.
En otra realización, para la crioconservación, las células se congelan lentamente hasta que alcanzan una temperatura por debajo de '70 °C en un medio que incluye un crioprotector y luego se transfieren los viales a un congelador de nitrógeno líquido para mantenerlas a temperaturas por debajo de '130 °C.
En otra realización, la crioconservación, o almacenamiento congelado, es por un máximo de 24 horas. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 2 días. En otra realización, la crioconservación, el almacenamiento congelado es por un máximo de 3 días. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 4 días. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 1 semana. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 2 semanas. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 3 semanas. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 1 mes. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 2 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 3 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 5 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 6 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 9 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un máximo de 1 año.
En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 1 semana. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 2 semanas. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 3 semanas. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 1 mes. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 2 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 3 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 5 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 6 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 9 meses. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 1 año. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 1,5 años. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 2 años. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 3 años. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 5 años. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 7 años. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por un mínimo de 10 años. En otra realización, la crioconservación o almacenamiento congelado es por más de 10 años.
En otra realización, las células muestran crecimiento después de la descongelación que sigue a un período prolongado de crioconservación o almacenamiento congelado. En otra realización, las células muestran crecimiento dentro de aproximadamente 15'22 horas después de inocular medios frescos con células del banco de células o cultivo iniciador. En otra realización, las células muestran crecimiento dentro de aproximadamente 12'20 horas después de inocular medios frescos con células del banco de células o cultivo iniciador. En una realización, para garantizar la viabilidad, la estabilidad genética y la estabilidad fenotípica, es necesario mantener las líneas celulares en la fase de crecimiento exponencial (mediante el subcultivo de forma regular).
Un experto en la materia apreciaría que el término "período prolongado" de crioconservación, o almacenamiento congelado, puede abarcar 1 mes. En otra realización, el período es de 2 meses. En otra realización, el período es de 3 meses. En otra realización, el período es de 5 meses. En otra realización, el período es de 6 meses. En otra realización, el período es de 9 meses. En otra realización, el período es de 1 año. En otra realización, el período es de 1,5 años. En otra realización, el período es de 2 años. En otra realización, el período es de 2 a 7 años. En otra realización, el período es de al menos 7 años. En otra realización, el período es de al menos 10 años.
En otra realización, las células de los métodos descritos en el presente documento retienen una viabilidad de más del 90 % después de la descongelación que sigue a la crioconservación. En otra realización, la viabilidad tras la descongelación es cercana al 100 % después del periodo de crioconservación. En otra realización, la viabilidad tras la descongelación es cercana al 90 %. En otra realización, la viabilidad tras la descongelación es de al menos el 90 %. En otra realización, la viabilidad tras la descongelación es superior al 80 %.
En otra realización, se cultiva un stock congelado de un banco de células en un medio de cultivo celular definido. Dichos medios son conocidos en la técnica y pueden incluir el medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (ATCC® No. 30-2002), el medio de Dulbecco modificado por Iscove (IMDM) (ATCC® No. 30-2005), el medio Hybri-Care (ATCC® No. 46-X), McCoy's 5A y RPMI-1640 (ATCC® No. 30-2007), Mezclas de nutrientes de Ham (At Cc® CCL-61™), Medio CHO libre de suero, químicamente definido PowerCHO™ (Núm. Cat. Lonza 12-771Q); o cualquier otro medio conocido en la técnica. En otra realización, estos medios pueden complementarse con antibióticos o sueros animales, como determinará empíricamente el experto en la materia.
También se describen en el presente documento biorreactores y métodos que permiten el cultivo de células de mamífero en volúmenes a gran escala. Además, y en otra realización, dichos biorreactores y métodos, permiten el cultivo de células de mamíferos en condiciones óptimas, incluso si se cultivan en volúmenes a gran escala y por tanto permiten un rendimiento del proceso y calidad del producto independiente del tamaño del biorreactor. La duración del tiempo de incubación dentro del biorreactor puede variar, simplemente cambiando la escala y el sistema del biorreactor, por ejemplo, la duración puede ser entre 8-9, o puede ser entre 15-16 días. En otra realización, la duración de la incubación en un biorreactor es de aproximadamente 7 días, aproximadamente 8 días, aproximadamente 9 días, aproximadamente 10 días, aproximadamente 11 días, aproximadamente 12 días, aproximadamente 13 días, aproximadamente 14 días, aproximadamente 15 días, aproximadamente 16 días, aproximadamente 17 días, aproximadamente 18 días, aproximadamente 19 días, aproximadamente 20 días o más. En otra realización, cuando se usa un biorreactor de perfusión, la duración de la incubación puede ser de hasta 7-120 días.
También se describen en el presente documento biorreactores a gran escala que permiten el cultivo de células de mamíferos en un entorno homogéneo con respecto a los parámetros del proceso, como el pH, la tensión de oxígeno disuelto (DOT) y la temperatura, manteniendo una suspensión de células bien mezclada y mezclando alimentos de nutrientes dentro del biorreactor. En otra realización, el biorreactor es un biorreactor desechable.
Los métodos de fabricación descritos en el presente documento resuelven los problemas técnicos subyacentes a la fabricación de polipéptidos de hGH modificados con CTP mediante la provisión de biorreactores, sistemas de biorreactores y métodos para el cultivo de células eucariotas, especialmente de células de mamífero.
En una realización, el biorreactor tiene un volumen de al menos 250 litros (L). En otra realización, el biorreactor tiene un volumen de al menos 500 L. En otra realización, el volumen es de al menos 1000 L, al menos 2000 L, al menos 5.000 L, al menos 10.000 L, al menos 12.000 L o al menos 15.000 L.
En otra realización, las células se subcultivan en volúmenes crecientes de biorreactores (véanse los Ejemplos en el presente documento).
Composiciones
Los polipéptidos de la hormona del crecimiento humano (hGH) modificados con CTP fabricados usando los métodos de la invención se pueden usar para tratar a un sujeto, con condiciones relacionadas con el crecimiento y el peso, tales como un trastorno de deficiencia del crecimiento, debilitación por SIDA, envejecimiento, función inmunológica alterada de Sujetos infectados por el VIH, una enfermedad catabólica, recuperación quirúrgica, una miocardiopatía congestiva, trasplante de hígado, regeneración del hígado después de una hepatectomía, insuficiencia renal crónica, osteodistrofia renal, osteoporosis, acondroplasia/hipocondroplasia, displasia esquelética, un trastorno inflamatorio o nutricional crónico como la enfermedad de Crohn, síndrome de intestino corto, artritis crónica juvenil, fibrosis quística, infertilidad masculina, raquitismo hipofosfatémico ligado al cromosoma X, síndrome de Down, espina bífida, síndrome de Noonan, obesidad, disminución de la fuerza muscular y fibromialgia. Los polipéptidos preparados por el método de la invención se pueden proporcionar al individuo per se. Los polipéptidos preparados por el método de la invención se pueden proporcionar al individuo como parte de una composición farmacéutica donde se mezclan con un vehículo farmacéuticamente aceptable.
Un experto en la materia apreciaría que el término "composición farmacéutica" puede abarcar una preparación de uno o más de los ingredientes activos descritos en el presente documento con otros componentes químicos tales como vehículos y excipientes fisiológicamente adecuados. El propósito de una composición farmacéutica es facilitar la administración de un compuesto a un organismo.
Los péptidos modificados preparados por el método de la invención se pueden formular en preparaciones farmacéuticas adecuadas, como cápsulas e inyecciones, mezcladas con vehículos, diluyentes, etc. conocidos per se, que se pueden administrar por vía oral o parenteral a mamíferos (p. ej., vacas, caballos, cerdos, ovejas, humanos).
Un experto en la materia apreciaría que el término "ingrediente activo" puede abarcar la secuencia polipeptídica de interés, que es responsable del efecto biológico.
Un experto en la materia apreciaría que el término "una preparación combinada" puede abarcar un "kit de partes" en el sentido de que los socios de la combinación, como se define anteriormente, se pueden dosificar de forma independiente o mediante el uso de diferentes combinaciones fijas con cantidades distinguidas de los socios de la combinación, es decir, simultáneamente, concurrentemente, por separado o secuencialmente. En algunas realizaciones, las partes del kit de partes pueden entonces, p. ej., administrarse simultáneamente o escalonadas cronológicamente, es decir, en puntos de tiempo diferentes y con intervalos de tiempo iguales o diferentes para cualquier parte del kit de partes. La proporción de las cantidades totales de los socios de combinación, en algunas realizaciones, se puede administrar en la preparación combinada. En una realización, la preparación combinada se puede variar, p. ej., para hacer frente a las necesidades de una subpoblación de pacientes a tratar o las necesidades de un solo paciente, cuyas diferentes necesidades pueden deberse a una enfermedad particular, la gravedad de una enfermedad, edad, sexo o peso corporal como puede hacerse fácilmente por un experto en la materia.
Un experto en la materia apreciaría que las frases "vehículo fisiológicamente aceptable" y "vehículo farmacéuticamente aceptable", que se pueden usar indistintamente, pueden abarcar un vehículo o un diluyente que no cause irritación significativa a un organismo y no anule la actividad biológica y las propiedades del compuesto administrado. Bajo estas frases se incluye un adyuvante. En una realización, uno de los ingredientes incluidos en el vehículo farmacéuticamente aceptable puede ser, por ejemplo, polietilenglicol (PEG), un polímero biocompatible con un amplio rango de solubilidad tanto en medios orgánicos como acuosos (Mutter et al. (1979).
Un experto en la materia apreciaría que el término "excipiente" puede abarcar una sustancia inerte añadida a una composición farmacéutica para facilitar aún más la administración de un ingrediente activo. En una realización, los excipientes incluyen carbonato de calcio, fosfato de calcio, varios azúcares y tipos de almidón, derivados de celulosa, gelatina, aceites vegetales y polietilenglicoles.
Las técnicas de formulación y administración de fármacos se encuentran en "Remington’s Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, última edición.
En una realización, las vías de administración adecuadas, por ejemplo, incluyen distribución oral, rectal, transmucosa, transnasal, intestinal o parenteral, incluidas inyecciones intramusculares, subcutáneas e intramedulares, así como inyecciones intratecales, intraventriculares directas, intravenosas, intraperitoneales, intranasales o intraoculares.
La preparación puede administrarse de manera local más que sistémica, por ejemplo, mediante inyección de la preparación directamente en una región específica del cuerpo de un paciente.
Los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados por el método de la invención pueden administrarse en una dosis de 1-90 microgramos en 0,1-5 ml de solución, en una dosis de 1-50 microgramos en 0,1-5 ml de solución, en una dosis de 1-25 microgramos en 0,1-5 ml de solución, en una dosis de 50-90 microgramos en 0,1-5 ml de solución o en una dosis de 10-50 microgramos en 0,1-5 ml de solución.
Los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención pueden administrarse en una dosis de 1-90 microgramos en 0,1-5 ml de solución mediante inyección intramuscular (IM), inyección subcutánea (SC) o inyección intravenosa (IV) una vez por semana, dos veces por semana, tres veces por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada 17 días o una vez cada 19 días.
La dosificación del polipéptido preparado por el método de la invención puede estar en el rango de 0,05-80 mg/día, en el rango de 0,05-50 mg/día, en el rango de 0,1-20 mg/día, en el rango de 0,1-10 mg/día, en el rango de 0,1-5 mg/día, en el rango de 0,5-5 mg/día, en el rango de 0,5-50 mg/día, en el rango de 5-80 mg/día, en el rango de 35-65 mg/día, en el rango de 35-65 mg/día, en el rango de 20-60 mg/día, en el rango de 40-60 mg/día, en el rango de 45-60 mg/día, en el rango de 40-60 mg/día, en el rango de 60-120 mg/día, en el rango de 120-240 mg/día, en el rango de 40-60 mg/día, en el rango de 240-400 mg/día, en el rango de 45-60 mg/día, en el rango de 15-25 mg/día, en el rango de 5­ 10 mg/día, o en el rango de 55-65 mg/día.
La dosis puede ser de 20 mg/día, 30 mg/día, 40 mg/día, 50 mg/día, 60 mg/día, 70 mg/día, 80 mg/día, 90 mg/día o 100 mg/día.
La dosificación de los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados por el método de la invención puede estar en el rango de 0,005-100 mg/semana, en el rango de 0,005-5 mg/semana, en el rango de 0,01-50 mg/semana, en el rango de 0,1-20 mg/semana, en el rango de 0,1-10 mg/semana, en el rango de 0,01-5 mg/semana, en el rango de 0,001 -0,01 mg/semana, en el rango de 0,001 -0,1 mg/semana, en el rango de 0,1-5 mg/semana, en el rango de 0,5­ 50 mg/semana, en el rango de 0,2-15 mg/semana, en el rango de 0,8-65 mg/semana, en el rango de 1 -50 mg/semana, en el rango de 5-10 mg/semana, en el rango de 8-15 mg/semana, en el rango de 10-20 mg/semana, en el rango de 20-40 mg/semana, en un rango de 60-120 mg/semana, en el rango de 12-40 mg/semana, en el rango de 40-60 mg/semana, en un rango de 50-100 mg/semana, en un rango de 1-60 mg/semana, en el rango de 15-25 mg/semana, en el rango de 5-10 mg/semana, en el rango de 55-65 mg/semana, o en el rango de 1-5 mg/semana.
La dosis de los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados por la presente invención administrados a un sujeto puede ser el 50 % de la dosis estándar administrada a un sujeto de referencia de la misma población de sujetos (p. ej., niños, ancianos, hombres, mujeres, deficientes en GH, nacionalidad específica, etc.). La dosis puede ser el 30 % de la dosis administrada a un sujeto de una población específica de sujetos. La dosis puede ser el 45 % de la dosis administrada a un sujeto de una población específica de sujetos. La dosis puede ser el 100 % de la dosis administrada a un sujeto de una población específica de sujetos.
La dosis puede ser de 1 -5 mg/semana, 2 mg/semana, 4 mg/semana, 1,2 mg/semana o 1,8 mg/semana.
La dosis puede ser de 1 -5 mg/administración, 2 mg/administración, 4 mg/administración, 1,2 mg/administración o 1,8 mg/administración. La composición se puede administrar una vez a la semana, una vez cada dos semanas, mensualmente o diariamente.
El polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención puede formularse en una forma de dosificación intranasal. El polipéptido de hGH modificado con CTP puede formularse en una forma de dosificación inyectable. El polipéptido de hGH modificado con CTP puede administrarse a un sujeto en una dosis que oscila de 0,0001 mg a 0,6 mg, que oscila de 0,001 mg a 0,005 mg, que oscila de 0,005 mg a 0,01 mg, que oscila de 0,01 mg a 0,3 mg, o que oscila de 0,2 mg a 0,6 mg.
El polipéptido de hGH modificado con CTP puede administrarse a un sujeto en una dosis que oscila de 1 a 100 microgramos, que oscila de 10 a 80 microgramos, que oscila de 20 a 60 microgramos, que oscila de 10 a 50 microgramos, que oscila de 40 a 80 microgramos, que oscila de 10 a 30 microgramos, o que oscila de 30 a 60 microgramos.
La GH modificada por CTP preparada por el método de la invención se puede administrar a un sujeto en una dosis que oscila de 0,2 mg a 2 mg, de 2 a 6 mg, de 4 a 10 mg, o que oscila de 5 a 15 mg.
El polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención se inyecta en el músculo (inyección intramuscular). El polipéptido de hGH modificado con CTP puede inyectarse debajo de la piel (inyección subcutánea). El polipéptido de hGH modificado puede inyectarse en el músculo. El polipéptido de hGH modificado con CTP puede inyectarse debajo de la piel.
El polipéptido preparado por el método de la invención puede aumentar el cumplimiento en el uso de la terapia con GH.
Los fármacos proteicos de peso molecular inferior a 50.000 Dalton, como los polipéptidos de hGH modificados con CTP preparados mediante el método de la invención, pueden ser, en general, especies de vida corta in vivo, que tienen vidas medias circulatorias cortas de varias horas. La vía de administración subcutánea en general puede proporcionar una liberación más lenta a la circulación. El polipéptido modificado con CTP prolonga la vida media de fármacos proteicos de peso molecular inferior a 50.000 Daltons, como la GH.
La inmunogenicidad de una hGH modificada con CTP preparada mediante el método de la invención puede ser igual a la de una GH aislada. La inmunogenicidad de una hGH modificada con CTP puede ser comparable a la de una GH aislada. La modificación de una GH como se describe en el presente documento con péptidos CTP puede reducir la inmunogenicidad de la GH. La hGH modificada con CTP puede ser tan activa como una proteína GH aislada. El polipéptido de hGH modificado con CTP puede ser más activo que una GH aislada. La hGH modificada con CTP puede maximizar la capacidad protectora de la GH contra la degradación mientras minimiza las reducciones en la bioactividad.
El polipéptido de hGH modificado por CTP puede aumentar el cumplimiento de los sujetos que padecen enfermedades crónicas que necesitan una terapia con GH, o puede permitir la reducción de la frecuencia de dosificación de una GH. El término cumplimiento puede comprender adherencia. El polipéptido de hGH modificado con CTP puede aumentar el cumplimiento de los pacientes que necesitan una terapia con GH al reducir la frecuencia de administración de la GH. La reducción en la frecuencia de administración de la GH puede lograrse debido a las modificaciones de CTP que hacen que la GH modificada con CTP sea más estable. La reducción en la frecuencia de administración de la Gh puede lograrse como resultado del aumento de T1/2 de la GH. La reducción en la frecuencia de administración de la GH puede lograrse como resultado del aumento del tiempo de aclaramiento de la GH. La reducción en la frecuencia de administración de la GH puede lograrse como resultado del aumento de la medida AUC de la GH.
El polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención se puede administrar a un sujeto una vez al día, una vez cada dos días, una vez cada tres días, una vez cada cuatro días, una vez cada cinco días, una vez cada seis días, una vez cada semana, una vez cada 7-14 días, una vez cada 10-20 días, una vez cada 5-15 días o una vez cada 15-30 días. La dosificación del polipéptido preparado por el método de la invención puede estar en un rango de 50-500 mg/día, en un rango de 50-150 mg/día, en un rango de 100-200 mg/día, en un rango de 150-250 mg/día, en un rango de 200-300 mg/día, en un rango de 250-400 mg/día, en un rango de 300-500 mg/día, o en un rango de 350-500 mg/día. La dosificación puede ser de 20 mg/día, 30 mg/día, 40 mg/día, 50 mg/día, 0,01 mg/día, 0,1 mg/día, 1 mg/día, 0,530 mg/día, 0,05 mg/día, 50 mg/día, los 10 mg/día, 20-70 mg/día o 5 mg/día. La dosificación puede ser de 1-90 mg/día, 1-90 mg/2 días, 1-90 mg/3 días, 1-90 mg/4 días, 1-90 mg/5 días, 1-90 mg/6 días, 1-90 mg/semana, 1 -90 mg/9 días, 1 -90 mg/11 días, o 1 -90 mg/14 días. La dosis de hGH modificada con CTP puede ser de 10 a 50 mg/día, de 10 a 50 mg/2 días, de 10 a 50 mg/3 días, de 10 a 50 mg/4 días, de 10 a 50 microgramos mg/5 días, de 10 a 50 mg/6 días, 10-50 mg/semana, 10-50 mg/9 días, 10-50 mg/11 días o 10-50 mg/14 días.
La administración oral puede comprender una forma de dosificación unitaria del polipéptido de hGH modificado con CTP que comprende comprimidos, cápsulas, pastillas, comprimidos masticables, suspensiones, emulsiones y similares. Dichas formas de dosificación unitaria pueden comprender una cantidad segura y eficaz del compuesto o compuestos deseados, cada uno de los cuales puede ser de aproximadamente 0,7 o 3,5 mg a aproximadamente 280 mg/70 kg, o de aproximadamente 0,5 o 10 mg a aproximadamente 210 mg/70 kg. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de formas de dosificación unitaria para administración peroral son bien conocidos en la técnica. Los comprimidos normalmente comprenden adyuvantes farmacéuticamente compatibles convencionales como diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, manitol, lactosa y celulosa; aglutinantes como almidón, gelatina y sacarosa; disgregantes tales como almidón, ácido algínico y croscarmelosa; lubricantes tales como estearato de magnesio, ácido esteárico y talco. Se pueden usar deslizantes como el dióxido de silicio para mejorar las características de flujo de la mezcla de polvo. Se pueden añadir agentes colorantes, como los tintes FD&C, para la apariencia. Los edulcorantes y los agentes saborizantes, como aspartamo, sacarina, mentol, menta y sabores de frutas, son adyuvantes útiles para los comprimidos masticables. Las cápsulas normalmente comprenden uno o más diluyentes sólidos descritos anteriormente. La selección de los componentes de transporte puede depender de consideraciones secundarias como sabor, costo y estabilidad en almacenamiento, que no son críticas para los propósitos descritos en el presente documento, y una persona experta en la técnica puede realizarlas fácilmente.
La forma de dosificación oral puede comprender un perfil de liberación predefinido. La forma de dosificación oral puede comprender comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar o comprimidos masticables de liberación prolongada. La forma de dosificación oral puede comprender comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar o tabletas masticables de liberación lenta. La forma de dosificación oral puede comprender comprimidos, cápsulas, pastillas para chupar o comprimidos masticables de liberación inmediata. La forma de dosificación oral se puede formular según el perfil de liberación deseado del ingrediente activo farmacéutico como se conoce por los expertos en la técnica.
Las composiciones perorales pueden comprender soluciones líquidas, emulsiones, suspensiones y similares. Los vehículos farmacéuticamente aceptables adecuados para la preparación de dichas composiciones son bien conocidos en la técnica. En algunas realizaciones, las composiciones orales líquidas pueden comprender de aproximadamente 0,012 % a aproximadamente 0,933 % del compuesto o compuestos deseados, o en otra realización, de aproximadamente 0,033 % a aproximadamente 0,7 %.
Las composiciones pueden comprender soluciones o emulsiones, que pueden ser soluciones o emulsiones acuosas que comprenden una cantidad segura y eficaz de los compuestos descritos en el presente documento (el polipéptido de hGH modificado con CTP) y, opcionalmente, otros compuestos, destinados a la administración intranasal tópica. Las composiciones pueden comprender de aproximadamente 0,01 % a aproximadamente 10,0 % en p/v de un compuesto en cuestión, más preferiblemente de aproximadamente 0,1 % a aproximadamente 2,0, que puede usarse para la administración sistémica de los compuestos por vía intranasal.
Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse mediante inyección intravenosa, intraarterial o intramuscular de una preparación líquida. En algunas realizaciones, las formulaciones líquidas incluyen soluciones, suspensiones, dispersiones, emulsiones, aceites y similares. Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía intravenosa y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intravenosa. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía intraarterial y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intraarterial. Las composiciones farmacéuticas pueden administrarse por vía intramuscular y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración intramuscular.
Las composiciones farmacéuticas se pueden administrar por vía tópica a las superficies del cuerpo y, por lo tanto, se formulan en una forma adecuada para la administración tópica. Las formulaciones tópicas adecuadas incluyen geles, ungüentos, cremas, lociones, gotas y similares. Para la administración tópica, los compuestos pueden combinarse con un agente o agentes terapéuticos apropiados adicionales y prepararse como soluciones, suspensiones o emulsiones en un diluyente fisiológicamente aceptable con o sin un vehículo farmacéutico.
Las composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento se fabrican mediante procesos bien conocidos en la técnica, p. ej., mediante procesos convencionales de mezcla, disolución, granulación, fabricación de grageas, levigación, emulsión, encapsulación, atrapamiento o liofilización.
Las composiciones farmacéuticas pueden formularse de manera convencional usando uno o más vehículos fisiológicamente aceptables que comprenden excipientes y auxiliares, que facilitan el procesamiento de los ingredientes activos en preparaciones que pueden usarse farmacéuticamente. En una realización, la formulación depende de la vía de administración elegida.
Los inyectables pueden formularse en soluciones acuosas. Los inyectables pueden formularse en tampones fisiológicamente compatibles, como la solución de Hank, la solución de Ringer o el tampón salino fisiológico. En algunas realizaciones, para la administración transmucosa, se usan en la formulación penetrantes apropiados para la barrera a atravesar. Dichos penetrantes son generalmente conocidos en la técnica.
Las preparaciones del polipéptido de hGH modificado con CTP pueden formularse para administración parenteral, p. ej., mediante inyección en bolo o infusión continua. Las formulaciones para inyección se pueden presentar en forma de dosificación unitaria, p. ej., en ampollas o en envases multidosis con, opcionalmente, un conservante añadido. Las composiciones pueden ser suspensiones, soluciones o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y contienen agentes de formulación tales como agentes de suspensión, estabilización y/o dispersión.
Las composiciones también pueden comprender conservantes, tales como cloruro de benzalconio y timerosal y similares; agentes quelantes, como edetato de sodio y otros; tampones como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; ajustadores de la viscosidad, tales como polímeros, incluida la celulosa y sus derivados; y alcohol polivinílico y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones también pueden comprender anestésicos locales u otros activos. Las composiciones se pueden usar como aerosoles, nieblas, gotas y similares.
Las composiciones farmacéuticas para administración parenteral pueden incluir soluciones acuosas de la preparación activa en forma soluble en agua. Además, las suspensiones de los ingredientes activos se pueden preparar como suspensiones de inyección a base de agua u oleosas apropiadas. Los disolventes o vehículos lipofílicos adecuados pueden incluir aceites grasos tales como aceite de sésamo o ésteres de ácidos grasos sintéticos tales como oleato de etilo, triglicéridos o liposomas. Las suspensiones acuosas para inyección pueden contener sustancias que aumentan la viscosidad de la suspensión, como carboximetilcelulosa sódica, sorbitol o dextrano. La suspensión también puede contener estabilizantes o agentes adecuados que aumenten la solubilidad de los ingredientes activos para permitir la preparación de soluciones altamente concentradas.
El compuesto activo se puede administrar en una vesícula, en particular un liposoma (véase Langer, Science 249:1527-1533 (1990); Treat et al., en Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, López-Berestein and Fidler (eds.), Liss, Nueva York, págs. 353-365 (1989); López-Berestein, ibid., págs. 317-327; véase en general ibid).
La composición farmacéutica administrada en un sistema de liberación controlada puede formularse para infusión intravenosa, bomba osmótica implantable, parche transdérmico, liposomas u otros modos de administración. Se puede usar una bomba (véase Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989). Se pueden utilizar materiales poliméricos. Un sistema de liberación controlada puede colocarse cerca del objetivo terapéutico, es decir, el cerebro, requiriendo así solo una fracción de la dosis sistémica (véase, p. ej., Goodson, en Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, págs. 115-138 (1984). Otros sistemas de liberación controlada se discuten en la revisión de Langer (Science 249: 1527-1533 (1990).
El ingrediente activo puede estar en forma de polvo para la reconstitución con un vehículo adecuado, p. ej., una solución a base de agua estéril y libre de pirógenos, antes de su uso. Las composiciones se pueden formular para atomización y administración por inhalación. Las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente con medios atomizadores adjuntos.
La preparación del polipéptido puede formularse en composiciones rectales tales como supositorios o enemas de retención, usando, p. ej., bases de supositorios convencionales tales como manteca de cacao u otros glicéridos.
Las composiciones farmacéuticas adecuadas incluyen composiciones en las que los ingredientes activos están contenidos en una cantidad eficaz para lograr el propósito pretendido. Una cantidad terapéuticamente eficaz puede significar una cantidad de ingredientes activos eficaz para prevenir, aliviar o mejorar los síntomas de la enfermedad o prolongar la supervivencia del sujeto que se está tratando.
La determinación de una cantidad terapéuticamente eficaz está dentro de la capacidad de los expertos en la técnica.
Las composiciones también comprenden conservantes, tales como cloruro de benzalconio y timerosal y similares; agentes quelantes, como edetato de sodio y otros; tampones como fosfato, citrato y acetato; agentes de tonicidad tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, glicerina, manitol y otros; antioxidantes tales como ácido ascórbico, acetilcistina, metabisulfito de sodio y otros; agentes aromáticos; ajustadores de la viscosidad, tales como polímeros, incluida la celulosa y sus derivados; y alcohol polivinílico y ácidos y bases para ajustar el pH de estas composiciones acuosas según sea necesario. Las composiciones también comprenden anestésicos locales u otros activos. Las composiciones se pueden usar como aerosoles, nieblas, gotas y similares.
Algunos ejemplos de sustancias que pueden servir como vehículos farmacéuticamente aceptables o componentes de los mismos son azúcares, tales como lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, tales como almidón de maíz y almidón de patata; celulosa y sus derivados, tales como carboximetilcelulosa sódica, etilcelulosa y metilcelulosa; tragacanto en polvo; malta; gelatina; talco; lubricantes sólidos, como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales, tales como aceite de cacahuete, aceite de semilla de algodón, aceite de sésamo, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; polioles tales como propilenglicol, glicerina, sorbitol, manitol y polietilenglicol; ácido algínico; emulsionantes, como los emulsionantes de marca Tween™; agentes humectantes, tales como laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes aromatizantes; agentes de formación de comprimidos, estabilizantes; antioxidantes; conservantes; agua libre de pirógenos; solución salina isotónica; y soluciones de tampón fosfato. La elección de un vehículo farmacéuticamente aceptable para usar junto con el compuesto está determinada básicamente por la forma en que se administrará el compuesto. Si se va a inyectar el compuesto en cuestión, en una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable es una solución salina fisiológica estéril, con un agente de suspensión compatible con la sangre, cuyo pH se ha ajustado a aproximadamente 7,4.
Además, las composiciones comprenden además aglutinantes (p. ej., goma arábiga, almidón de maíz, gelatina, carbómero, etilcelulosa, goma guar, hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa, povidona), agentes desintegrantes (p. ej., almidón de maíz, almidón de patata, ácido algínico, dióxido de silicio, croscarmelosa de sodio, crospovidona, goma guar, glicolato de almidón sódico), tampones (p. ej., Tris-HCl, acetato, fosfato) de diversos pH y fuerza iónica, aditivos como albúmina o gelatina para evitar la absorción en las superficies, detergentes (p. ej., Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, sales de ácidos biliares), inhibidores de la proteasa, tensioactivos (p. ej., lauril sulfato de sodio), potenciadores de la permeación, agentes solubilizantes (p. ej., glicerol, polietilenglicerol), antioxidantes (p. ej., ácido ascórbico, metabisulfito de sodio, hidroxianisol butilado), estabilizantes (p. ej., hidroxipropilcelulosa, hidroxipropilmetilcelulosa), agentes que aumentan la viscosidad (p. ej., carbómero, dióxido de silicio coloidal, etilcelulosa, goma guar), edulcorantes (p. ej., aspartamo, ácido cítrico), conservantes (p. ej., timerosal, alcohol bencílico, parabenos), lubricantes (p. ej., ácido esteárico, estearato de magnesio, polietilenglicol, laurilsulfato de sodio), coadyuvantes de fluidez (p. ej., dióxido de silicio coloidal), plastificantes (p. ej., ftalato de dietilo, citrato de trietilo), emulsionantes (p. ej., carbómero, hidroxipropilcelulosa, laurilsulfato de sodio), recubrimientos de polímero (p. ej., poloxámeros o poloxaminas), agentes de recubrimiento y formadores de película (p. ej., etilcelulosa, acrilatos, polimetacrilatos) y/o adyuvantes.
Los componentes típicos de vehículos para jarabes, elixires, emulsiones y suspensiones incluyen etanol, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol, sacarosa líquida, sorbitol y agua. Para una suspensión, los agentes de suspensión típicos incluyen metilcelulosa, carboximetilcelulosa de sodio, celulosa (p. ej., Avicel™, RC-591), tragacanto y alginato de sodio; los agentes humectantes típicos incluyen lecitina y sorbitán de óxido de polietileno (p. ej., polisorbato 80). Los conservantes típicos incluyen metilparabeno y benzoato de sodio. En otra realización, las composiciones líquidas perorales también contienen uno o más componentes tales como edulcorantes, agentes saborizantes y colorantes descritos anteriormente.
Las composiciones también incluyen la incorporación del material activo en o sobre preparaciones en partículas de compuestos poliméricos tales como ácido poliláctico, ácido poliglicólico, hidrogeles, etc., o sobre liposomas, microemulsiones, micelas, vesículas unilaminares o multilaminares, fantasmas de eritrocitos o esferoplastos. Tales composiciones influirán en el estado físico, la solubilidad, la estabilidad, la tasa de liberación in vivo y tasa de aclaramiento in vivo.
Las composiciones pueden comprender composiciones de partículas recubiertas con polímeros (p. ej., poloxámeros o poloxaminas) y el compuesto acoplado a anticuerpos dirigidos contra receptores, ligandos o antígenos específicos de tejido o acoplado a ligandos de receptores específicos de tejido.
'La preparación de una cantidad o dosis eficaz se puede estimar inicialmente a partir de ensayos in vitro. Se puede formular una dosis en modelos animales y dicha información se puede utilizar para determinar con mayor precisión las dosis útiles en humanos.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de los ingredientes activos descritos en el presente documento pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar in vitro, en cultivos celulares o animales de experimentación. Los datos obtenidos de estos ensayos in vitro y de cultivo celular y los estudios en animales se pueden usar para formular un rango de dosificación para uso en humanos. Las dosis varían dependiendo de la forma de dosificación empleada y la vía de administración utilizada. La formulación exacta, la vía de administración y la dosificación pueden elegirse por el médico en vista de la condición del paciente. [Véase, p. ej., Fingl, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", cap. 1 pág.1].
Dependiendo de la gravedad y la capacidad de respuesta de la condición a tratar, la dosificación puede ser de una sola administración o una pluralidad de administraciones, con un curso de tratamiento que dura desde varios días hasta varias semanas o hasta que se efectúa la curación o se logra la disminución del estado de la enfermedad.
La cantidad de una composición a administrar dependerá, por supuesto, del sujeto a tratar, la gravedad de la condición, la forma de administración, el criterio del médico que prescribe, etc.
Las composiciones que incluyen la preparación del polipéptido preparado mediante el método de la invención formulado en un vehículo farmacéutico compatible también pueden prepararse, colocarse en un recipiente apropiado y marcarse para el tratamiento de una condición indicada.
El polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención puede administrarse mediante administración sistémica. La hGH modificada con CTP preparada mediante el método de la invención puede administrarse por inyección intravenosa, intramuscular o subcutánea. El polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención puede ser una preparación liofilizada (es decir, seca por congelación) en combinación con excipientes orgánicos complejos y estabilizantes tales como agentes de superficie activa no iónicos (es decir, tensioactivos), varios azúcares, polioles orgánicos y/o albúmina de suero humano. La composición farmacéutica puede comprender una GH liofilizada modificada por CTP preparada por el método de la invención en agua estéril para inyección. Una composición farmacéutica puede comprender una hGH modificada con CTP liofilizada en PBS estéril para inyección. Una composición farmacéutica puede comprender una hGH modificada con CTP liofilizada en NaCl al 0,9 % estéril para inyección.
La composición farmacéutica puede comprender una GH modificada por CTP preparada por el método de la invención y vehículos complejos tales como albúmina de suero humano, polioles, azúcares y agentes tensioactivos estabilizantes aniónicos. Véase, por ejemplo, el documento WO 89/10756 (Hara et al.- que contiene poliol y p-hidroxibenzoato). La composición farmacéutica puede comprender la hGH modificada con CTP y ácido lactobiónico y un tampón de acetato/glicina. La composición farmacéutica puede comprender una GH liofilizada modificada por CTP y glicina o albúmina de suero humano (HSA), un tampón (p. ej., acetato) y un agente isotónico (p. ej., NaCl). La composición farmacéutica puede comprender una GH liofilizada modificada por CTP y tampón fosfato, glicina y HSA.
La composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP preparada por el método de la invención puede estabilizarse cuando se coloca en soluciones tamponadas que tienen un pH entre aproximadamente 4 y 7,2. La composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP puede estabilizarse con un aminoácido como agente estabilizante y en algunos casos una sal (si el aminoácido no contiene una cadena lateral cargada). La composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP preparada por el método de la invención puede ser una composición líquida que comprende un agente estabilizante entre aproximadamente 0,3 % y 5 % en peso que es un aminoácido.
La composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP preparada por el método de la invención puede proporcionar precisión de dosificación y seguridad del producto. La composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP preparada mediante el método de la invención puede proporcionar una formulación líquida estable, biológicamente activa, para el uso en aplicaciones inyectables. La composición puede comprender una formulación líquida no viscosa. Una composición farmacéutica puede comprender una GH no liofilizada modificada por CTP. Una composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP puede proporcionar una formulación líquida que permita el almacenamiento durante un largo período de tiempo en un estado líquido que facilite el almacenamiento y el traslado antes de la administración. La composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP puede comprender lípidos sólidos como material de matriz. Una composición farmacéutica inyectable que comprende una GH modificada por CTP puede comprender lípidos sólidos como material de matriz. Speiser describió la producción de micropartículas lipídicas mediante solidificación por aspersión (Speiser and al., Pharm. Res. 8 (1991) 47-54) seguido de nanogránulos de lípidos para administración peroral (Speiser documento EP 0167825 (1990)). Los lípidos que se pueden utilizar, son bien tolerados por el organismo (p. ej., glicéridos compuestos de ácidos grasos que pueden estar presentes en las emulsiones para nutrición parenteral).
Una composición farmacéutica que comprende una GH modificada por CTP preparada por el método de la invención puede estar en forma de liposomas (J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267-275). Una composición farmacéutica que comprende la GH modificada por CTP puede comprender micropartículas poliméricas, nanopartículas, liposomas, emulsión lipídica, microesferas, nanopartículas lipídicas, nanopartículas lipídicas que comprenden lípidos anfifílicos o nanopartículas lipídicas que comprenden un fármaco, una matriz lipídica y un tensioactivo. La matriz lipídica puede tener un contenido de monoglicéridos que es al menos 50 % en p/p.
Las composiciones pueden presentarse en un paquete o dispositivo dispensador, como un kit aprobado por la FDA, que contiene una o más formas de dosificación unitaria que contienen el ingrediente activo. En una realización, el paquete, por ejemplo, comprende una lámina de metal o plástico, como un paquete de burbujas. El paquete o dispositivo dispensador puede ir acompañado de instrucciones para la administración. El paquete o dispensador puede admitirse por una notificación asociada con el envase en una forma prescrita por una agencia gubernamental que regula la fabricación, uso o venta de productos farmacéuticos, dicha notificación refleja la aprobación por parte de la agencia de la forma de las composiciones o la administración veterinaria o a humanos. Dicha notificación, en una realización, es un marcaje aprobado por la Administración de Fármacos y Alimentos de los EE. UU. para medicamentos recetados o de un inserto de producto aprobado.
Se apreciará que la GH modificada por CTP preparada por el método de la invención se puede proporcionar al individuo con agentes activos adicionales para lograr un efecto terapéutico mejorado en comparación con el tratamiento con cada agente por sí mismo. Se pueden tomar medidas (p. ej., dosificación y selección del agente complementario) para minimizar los efectos secundarios adversos que están asociados con las terapias de combinación.
También se describe en el presente documento un kit que comprende composiciones del polipéptido de hGH modificado con CTP preparado mediante el método de la invención, y un aplicador y material instructivo. Aunque los kits modelo se describen a continuación, los contenidos de otros kits útiles serán evidentes para el experto en la materia a la luz de la presente descripción.
Los objetos adicionales, las ventajas y las características novedosas descritas en el presente documento resultarán evidentes para un experto en la materia tras el examen de los siguientes ejemplos, que no pretenden ser limitantes. Además, cada una de las diversas realizaciones y aspectos descritos en el presente documento como se delineó anteriormente y como se reivindica en la sección de reivindicaciones a continuación encuentra soporte experimental en los siguientes ejemplos.
Ejemplos
Ejemplo 1
Producción de construcciones de hGH
Expresión de MOD-4023 (CTP-hGH-CTP-CTP)
Transfección celular (nucleofección): La expresión estable se logró mediante la integración del gen MOD-4023 en el cromosoma de la célula objetivo: inicialmente, el gen se introdujo en la célula, posteriormente en el núcleo y finalmente se integró en el ADN cromosómico. Después de la transferencia génica, las células se cultivaron en un medio que contenía un marcador de selección como la dihidrofolato reductasa (DHFR). Brevemente:
El gen de la dihidrofolato reductasa (dhfr) murina del plásmido pSV2-dhfr se subclonó en el sitio de neomicina en el plásmido pCI-neo. Para crear un vector de expresión modificado, pCI-dhfr (Figura 2). En consecuencia, el vector de expresión MOD-4023 contiene un potenciador/promotor IE (inmediato-temprano) de citomegalovirus (CMV) y el gen dhfr para la selección celular. El gen MOD-4023 incluye una copia de la secuencia codificante del péptido C-terminal (CTP) que precede al extremo 5' del gen de hGH, y dos copias de la secuencia codificante del CTP que siguen inmediatamente al extremo 3' del gen de hGH. El gen MOD-4023 se subclonó en el marco de lectura abierto de pCI-dhfr (Figura 2). Por lo tanto, el casete de expresión de MOD-4023 está compuesto por el promotor CMV, la secuencia del gen CTP-hGH-CTP-CTP y la secuencia de poliadenilación de SV40.
Selección de clones -Limitar la dilución de una sola célula poniendo en placas en placas de 96 pocillos. La selección se aplicó al cultivo de una sola célula y puede repetirse varias veces para obtener una pureza clonal del 100 %. El clon de mayor producción, en base a la curva de crecimiento, la caracterización del clon, la productividad específica y el perfil de proteínas, se propagó en un matraz de agitación de 1 L antes de la inoculación en el biorreactor. Brevemente:
La línea celular productora de proteína MOD-4023 se fabricó mediante tecnología de ADN recombinante. Se utilizaron medios libres de componentes animales durante la derivación de los bancos de células maestras y de trabajo (MCB; WCB). La transfección de células CD DG44 negativas para dhfr (células CHO), que se adaptaron a medio libre de proteínas y crecimiento en suspensión, se llevó a cabo usando FuGENE-6 (Roche Applied Science). Los clones estables se aislaron limitando los pasos de dilución en el cultivo celular. Los clones de mayor producción se amplificaron con concentraciones crecientes de metotrexato (MTX). En base al nivel de duplicación de la población de clones (PDL), la productividad de MOD-4023 (picogramos por célula por día, PCD) y la densidad celular máxima alcanzada en el medio seleccionado, los clones de mayor producción se aislaron y usaron para preparar los bancos de I+D seguidos de la fabricación de un Banco de Células Maestras cualificado (MCB) y Banco de Células de T rabajo (WCB).
Proceso aguas arriba
El proceso aguas arriba de MOD-4023 consistió en 2 tipos de formulaciones de medio; medio de crecimiento (medio 1) y medio de producción (medio 2). El medio 1 incluía metotrexato (MTX) y el medio 2 era idéntico al medio 1 excluyendo el MTX. El medio 1 se utilizó para la propagación del cultivo celular (Paso 1-4 de la Figura 3) antes de la siembra en un biorreactor de 200 litros y se usó el medio 2 en los pasos N-2 (dos propagaciones antes del producto final. N se refiere al producto final), un biorreactor de 200 litros (Pasos 5-6 de la Figura 3) y un biorreactor de producción de 1000 Litros (Paso 7 de la Figura 3).
Proceso de Fabricación: MOD-4023
El clon núm. 28 se fabricó a una escala de 1000 litros (L) en medio de cultivo libre de suero. El cultivo de la línea de células CHO se expandió en varios pasos desde un solo vial del banco de células de trabajo (WCB) hasta el volumen de cultivo de producción final. El sobrenadante del cultivo celular de producción se analizó en cuanto a carga biológica, endotoxina bacteriana, productividad y virus adventicios. El proceso se realizó utilizando biorreactores de siembra de 50 Litros y 200 Litros y un biorreactor de 1000 L para escalado. Todas las superficies de contacto con el producto son desechables, mientras que los equipos de contacto con el producto no desechables están dedicados al producto. Estas partes del equipo se limpiaron y desinfectaron entre lotes. El cultivo se expande a biorreactores de siembra de 50 L y 200 L antes de la inoculación en un biorreactor de 1000 L para el escalado. El escalado final y la producción de biorreactores alimentados por lotes se realizaron en biorreactores desechables de 1000 L. La eliminación de las células se realizó utilizando un sistema de filtro desechable (filtro de profundidad Millipore).
Se descongelaron uno o dos viales de WCB a 37 °C. Las células se centrifugaron y el sedimento celular se resuspendió a una concentración objetivo con un matraz de agitación de bajo volumen de medio fresco de 10 ml y se incubó a 37±0,5 °C, 5±1 % de CO2. Después del segundo subcultivo, el cultivo celular con mayor viabilidad se expandió aún más; el otro cultivo celular se descartó. Se realizaron cuatro pasos de subcultivo en matraz de agitación con volúmenes crecientes con parámetros de paso predefinidos, como la concentración de siembra y el volumen de trabajo. Volúmenes seguidos de dos pasos de biorreactor de siembra para una marcha típica de biorreactor de 1000 L.
Los biorreactores de siembra de 50 litros y 200 litros se utilizaron como biorreactor de siembra. Antes de la inoculación, el biorreactor de 200 L se llenó con aprox. 50 L de medio 2 de PowerCHO 2CD (sin MTX). El control del proceso se ajustó a los siguientes parámetros: pH 7, Temperatura 37 °C, OD 50 %. Estos parámetros se aplican al preacondicionamiento del medio y al proceso de cultivo de escalado de semillas.
Cuando los parámetros del proceso se controlaron dentro de sus rangos predefinidos, se inició la transferencia del inóculo. Durante la expansión de la masa celular en el biorreactor de siembra de 50 L y 200 L no se aplicó ninguna adición de alimentación al proceso. El tiempo de cultivo esperado en el biorreactor de siembra fue de 3 a 4 días antes de que las células se transfirieran al biorreactor de producción de 1000 L. Diariamente se tomaron muestras para control en proceso (IPC).
Propagación celular en el biorreactor de 1000 L de producción (Paso 7 de la Figura 3)
El cultivo se incuba en el biorreactor durante 11 días (dependiendo de la viabilidad de las células) a 37 °C, 20 % de oxígeno disuelto (OD) y pH 7,2. En el día 3, el pH se cambia a 6,9 hasta la cosecha. El día 4, se añade alimentación (Power Feed A sin lípidos). El volumen de alimentación es igual al 33 % del volumen final del biorreactor. El día 6, se añade DMSO al biorreactor. Se añadió solución de alimentación de glucosa al cultivo para mantener la concentración deseada y se añadió un bolo de bicarbonato de sodio 1 M para mantener la concentración de cultivo deseada (HCO3). La cosecha se realizó utilizando criterios predefinidos. Durante los primeros cuatro días, se tomaron muestras diarias del cultivo celular para el recuento celular, la viabilidad y el análisis metabólico. A partir del día 5, se tomaron muestras del cultivo dos veces al día para el recuento celular, la viabilidad y el análisis metabólico y a partir del día 9 también para la productividad específica mediante HPLC de fase inversa. La productividad de MOD-4023 fue de al menos de 500 g/L con la forma altamente glicosilada que consiste en al menos el 70 % de la proteína hGH-CTP total en la cosecha.
El ejemplo presentado en el presente documento muestra la fabricación utilizando un modo de lote alimentado, aunque un experto en la materia podría desarrollar un modo de perfusión utilizando, en general, un esquema de purificación similar. Alternativamente, un experto en la materia podría desarrollar un método de perfusión en el que la duración de la incubación podría ser incluso de hasta 7-120 días.
Cosecha y almacenamiento de células (Paso 8 de la Figura 3)
La cosecha se realizó usando un tren de proceso de filtración desechable. Para clarificar la cosecha se realizó una filtración en profundidad y una filtración de 0,2 gm. La clarificación fue seguida por una filtración de 0,45/0,2 gm. Los filtros de profundidad se enjuagaron y el líquido residual se eliminó del sistema con aire. El proceso de filtración se llevó a cabo con una velocidad de bomba de < 15 L/min y una presión máxima definida. Posteriormente, los filtros se lavaron con tampón Tris-HCl y se eliminaron con aire a presión para aumentar la recuperación del producto.
La cosecha clarificada se analizó para determinar la carga biológica, la endotoxina bacteriana, el contenido de proteínas específicas mediante RP-HPLC, SDS-PAGE, inmunoelectrotransferencia, ensayo HPC Elisa, ADN residual, ensayo de virus in vitro, partículas similares a virus, S+L- y micoplasma.
Proceso de purificación
El esquema de purificación se describe en la Figura 4.
Ultrafiltración y Diafiltración 1 - UFDF1 (Paso 8)
La cosecha clarificada se concentró y se diafiltró utilizando un cartucho de fibra hueca o un paso UFDF basado en TFF equivalente. El tamaño de corte del peso molecular nominal del cartucho fue de 10.000 kDa. La cosecha concentrada y diafiltrada se analizó para determinar el contenido de proteína específico mediante RP-HPLC y HCP Elisa.
Inactivación viral por incubación con Triton-X100 al 1 % (Paso 9)
El material se filtró a través de un filtro Millipore de 1,55 m2 seguido de un filtro estéril Sartopore 2 XLG de 10" en una bolsa de mezcla estéril (paso de filtración en profundidad). A continuación, se añadió una solución de T ris/T riton al 10 % al volumen de filtrado final llevando a la concentración de Triton al 1 % (p/p). Después de la incubación, antes de cargar en la columna DEAE, la solución del producto se filtró con una unidad de filtro de 0,2 gm.
Cromatografía de flujo rápido DEAE-Sepharose (Paso 10)
Para este paso se utilizó una columna de DEAE rellena con resina DEAE Sepharose. La columna se empaquetó en una altura de lecho predefinida. La proteína específica en la carga se determinó antes de la adición de Triton debido a la interferencia causada por Triton en el ensayo. La columna de DEAE se equilibró y se cargó con el conjunto viral inactivado y luego se lavó. Se realizó un segundo lavado y el material se eluyó con Tris-HCl 20 mM/NaCl 150 mM pH 8,2 y luego se almacenó a temperatura ambiente (18-26 °C) para procesar al día siguiente o a 2-8 °C para un tiempo más largo. Todos los pasos de la cromatografía se realizaron en modo de flujo descendente. Alternativamente, los pasos podrían haberse ejecutado en un modo de flujo ascendente. El eluato se analizó para la proteína específica mediante RP-HPLC (Objetivo: el pico principal eluye como pico único), HCP Elisa, SDS-PAGE, inmunoelectrotransferencia y ADN residual.
Cromatografía de columna de cromatografía de interacción hidrófoba (HIC) de fenilo (Paso 11)
Para este paso se usó una resina de HIC de fenilo. La columna es una columna empaquetada en una altura de lecho predefinida. La cromatografía HIC se realizó en 1 - 5 ciclos dependiendo de la cantidad de producto. Alternativamente, se podrían haber ejecutado hasta 10 ciclos. La carga de HIC se preparó ajustando el eluato de DEAE con sulfato de amonio. La columna se equilibró y se cargó con el eluato de DEAE ajustado y filtrado por 0,2 pm y luego se lavó con fosfato sódico 10 mM/sulfato amónico 600 mM que contenía propilenglicol, pH 7,3. El material se eluyó con una concentración reducida de sulfato de amonio y una concentración aumentada de propilenglicol, pH 7,3 y luego se almacenó a 2-8 °C hasta su posterior procesamiento.
Ultrafiltración y diafiltración de eluatos de HIC 2 (Paso 12)
El eluato de HIC se concentró y se diafiltró en tampón de fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8, para reducir el volumen y preparar el material para el paso de la columna CHT. El cartucho se equilibró con fosfato de sodio 10 mM, pH 6,8. El eluato de HIC se concentró y luego se diafiltró frente a tampón de fosfato de sodio para lograr un pH de 6,8 ± 0,1 y una conductividad que estaba dentro del 10 % de la conductividad del tampón de diafiltración. Una vez que se determinó que el pH y la conductividad estaban dentro del rango, se drenó el sistema y se filtró en 0,45/0,2 pm en una bolsa estéril. El volumen final de eluato de HIC diafiltrado concentrado se almacenó a temperatura ambiente (18-26 °C) durante la noche. El retenido se analizó para carga biológica, endotoxina bacteriana y proteína específica por A280.
Cromatografía de modo mixto de hidroxiapatita cerámica (CHT) (Paso 13)
Para este paso se utilizó una columna CHT empaquetada con resina de hidroxiapatita. La columna era una columna empaquetada en una altura de lecho predefinida. La columna se equilibró con fosfato de sodio, pH 6,8 y se cargó con el eluato de HIC concentrado y diafiltrado y se lavó con 4 volúmenes de columna (CV) de fosfato de sodio, pH 6,8. El flujo continuo y el material de lavado se recogen y se mantienen durante la noche a temperatura ambiente (18-26 °C) hasta su posterior procesamiento.
Cromatografía SP-Sepharose (Paso 14)
Para este paso se utilizó una columna empaquetada con resina SP Sepharose. La columna era una columna empaquetada en una altura de lecho predefinida. La carga de SP se preparó ajustando la fracción de flujo de CHT a pH 5,0-6,0 con ácido cítrico. Después del ajuste del pH, la solución se cargó en la columna, seguido de un paso de lavado. El flujo continuo se recogió para su posterior procesamiento. El pH se ajustó a pH 6,0-6,5 con hidróxido de sodio 0,1 M y el material se filtró a través de un filtro de 0,45/0,2 pm. El material se almacenó a temperatura ambiente (18-26 °C) durante la noche o a 2-8 °C hasta 24 horas. Todos los pasos de la cromatografía se realizaron en modo de flujo descendente.
Inactivación viral por nanofiltración (Paso 15)
La filtración viral se realizó utilizando un filtro de virus Asahi Planova 20N. Como prefiltro del nanofiltro se utilizó un filtro Sartopore 2 con una membrana de 0,45/0,2 pm o 0,1 pm. El filtro de virus se pre-equilibró y cebó con la formulación final hecha con WFI. El flujo continuo SP ajustado se pasó a través del tren de filtros a una presión continua y se recogió en una bolsa de bioproceso estéril. El tren de filtros se enjuagó con tampón de formulación para maximizar la recuperación del producto. Se probó la integridad del filtro antes y después del uso según los procedimientos recomendados por el fabricante. La prueba de uso posterior incluye una prueba de partículas de oro, también según el procedimiento del fabricante.
UFDF3 y filtración y almacenamiento de la sustancia farmacéutica (Paso 16)
El filtrado viral se concentró a una concentración de DS final objetivo (que puede variar de 5 a 100 mg/ml) en preparación para la filtración y llenado a granel. Para este paso se usó un solo casete usado o reutilizable con un corte de 3-30 kDa. El producto se concentró en un primer paso a 5-25 mg/ml y se diafiltró a citrato 10 mM, NaCl 147 mM pH 6,4 (>7 volúmenes de DF). Alternativamente, el producto se concentró en un primer paso a 5-25 mg/ml y se diafiltró a tampón de histidina citrato 10 mM, incluidos los conservantes para respaldar la dosificación repetida mediante un dispositivo, específicamente m-cresol al 0,3 %, también se añadió P-188 a 0,2 % para reducir agregados y partículas sub-visibles. Se ajustó la concentración del producto final y se filtró con un filtro Millipak 100. Las soluciones del producto filtrado se dividieron en alícuotas y se congelaron a una temperatura de -70 ± 5 °C.
Fabricación del Producto Farmacéutico MOD-4023
El proceso de formulación del producto farmacéutico (DP) se inicia con la descongelación del MOD-4023 DS. El producto farmacéutico se logró mediante la dilución del principio activo (DS) a la concentración requerida utilizando el tampón de formulación, filtración aséptica y llenado en viales estándar 2R u otros envases primarios, como cartuchos o jeringas precargadas. La descripción del proceso específico se muestra en la Figura 5.
Caracterización de MOD-4023
El contenido de MOD-4023 en la cosecha y el porcentaje de formas altamente glicosiladas se determinaron mediante un método específico de RP-HPLC. La proteína total en la cosecha se determinó mediante el análisis de Bradford. El porcentaje de proteína específica de MOD-4023 en la cosecha producida por el Clon núm. 28 estuvo por encima del 70 % con respecto a la proteína total en la cosecha. Este alto nivel único de proteína específica también se puede observar por la fuerte intensidad de las bandas de MOD-4023 glicosiladas alta y baja en comparación con la intensidad de las bandas de proteínas de células huésped adicionales en las muestras de cosecha y UFDF analizadas por SDS-PAGE con tinción de Coomassie (Figura 6). Además, el proceso aguas arriba de fabricación de MOD-4023 se desarrolló para permitir un alto porcentaje de la proteína MOD-4023 altamente glicosilada en comparación con la forma poco glicosilada. La forma altamente glicosilada es la forma objetivo de MOD-4023, ya que da como resultado una extensión mayor de la vida media de GH.
Contenido de O-glicanos
El glicoperfilado se realizó mediante la liberación de glicanos MOD-4023 seguido del marcaje de glicanos con 2-aminobenzamida (2AB), se limpió y se analizó por NP-HPLC.
Se realizó un ensayo de contenido de O-glicanos para calcular el número de moles de O-glicanos por mol de proteína MOD-4023. Las unidades terminales de galactosa de los O-glicanos se escindieron enzimáticamente de la proteína mediante la p-galactosidasa. Estas unidades de galactosa libres se separaron en una columna CarboPac PA20 y se detectaron con amperometría pulsada. La galactosa (Gal) se cuantificó utilizando una calibración externa con un estándar de referencia de galactosa. El contenido de galactosa puede estar directamente relacionado con el contenido de estructura de O-glicano, Gal-GalNAc. El contenido de ácido siálico (SA) se mide en el principio activo (DS) y no debería ser diferente del contenido de SA del producto farmacéutico final (DP). Tanto el DS como el DP pueden usarse para mostrar los niveles de ocupación de SA y O-glicano de la hGH modificada con CTP. El análisis de 5 lotes diferentes de principios activos y productos farmacéuticos de MOD-4023 se representada en la Figura 7 demuestran una consistencia robusta de lote a lote. Este contenido de glicosilación robusto inesperado es significativo, lo que demuestra que el número de O-glicanos por CTP en CTP-hGH-CTP-CTP se mejoró con respecto a lo conocido en la técnica. El CTP-hGH-CTP-CTP fabricado en la presente documento tenía 4-6 O-glicanos por CTP, en comparación con los niveles conocidos en la técnica, en los que la hCG tiene solo 4 O-glicanos.
Análisis de peso molecular intacto de muestras de MOD-4023
Se realizó un análisis de peso molecular de 4 lotes diferentes de MOD-4023 DS con el objetivo de obtener información sobre el número de sitios de glicosilación unidos a O. (Véanse los resultados detallados en el Ejemplo 3). Las muestras intactas de MOD-4023, así como las muestras desialiladas de MOD-4023 que usan neuraminidasa y las muestras des-O-glicosiladas que usan O-glicosidasa, se analizaron mediante LC/ES-MS en línea. Los datos obtenidos de la medición de la masa intacta de las muestras desialiladas sugirieron que la proteína se modificaba con 12-18 sitios de glicosilación de GalNac-Gal, siendo la proteína modificada con 15 sitios de glicosilación la más intensa. Este resultado que muestra un alto % de ocupación de serina fue inesperado en comparación con los niveles conocidos en la técnica (solo 4 serinas glicosiladas en comparación con hasta 6 en la hGH modificada con CTP fabricada en el presente documento).
Ocupación del sitio de glicosilación unido a O de muestras de proteína MOD-4023
La ocupación del sitio de O-glicosilación de 4 lotes diferentes de MOD-4023 DS se realizó en M-scan con el objetivo de obtener información sobre el número de sitios de glicosilación unidos a O por molécula de MOD-4023. Las muestras de MOD-4023 se desialilaron usando neuraminidasa seguido de digestión tríptica de muestras de MOD-4023 reducido/carboximetilado. Finalmente, se llevó a cabo una LC/ES-MS en línea para las muestras tratadas y se realizó la interpretación de los datos de MS usando un software designado. La evaluación de los datos obtenidos a partir del análisis de las mezclas de digestión tríptica condujo a señales que permitieron mapear el 100 % de la secuencia de proteínas. La O-glicosilación tiene lugar tanto en la región CTP N-terminal como en la C-terminal. Los sitios de ocupación se identificaron como residuos de serina después de la prolina, así como dos de las cuatro serinas en las regiones de repeticiones de serina. Un total de hasta 18 residuos de serina pueden servir como sitios de unión para O-glicanos. No se detectaron diferencias significativas entre los lotes como se presenta en la Figura 8.
Ocupación del sitio de glicosilación unido a O de muestras de proteína MOD-4023 MOD-4023 (SEQ ID NO: 7) contiene un CTP en el extremo N y dos CTP en tándem en el extremo C. El análisis de glicosilación unida a O mostró que cada CTP contenía 4-6 glicanos unidos a O, todos unidos a residuos de serina (S). En general, hubo 12-18 cadenas de azúcar unidas a O por MOD-4023 conteniendo la forma más abundante 15 O-glicanos por MOD-4023. (Véanse los resultados y las conclusiones de los Ejemplos 2 y 3 posteriores). No estaban presentes cadenas de azúcar en la secuencia de GH.
Usando la secuencia de aminoácidos SEQ ID NO: 7 como guía, los resultados del análisis de ocupación del sitio mostraron que la O-glicosilación tuvo lugar en cada CTP en los residuos de serina en las posiciones 10, 13, 15, 21 de la unidad CTP, que corresponde a las posiciones 229, 232, 234, 240 en la segunda secuencia CTP y 257, 260, 262 y 268 para la tercera secuencia CTP. Se identificaron dos sitios adicionales de ocupación de O-glicosilación, que ocurren en los residuos de serina Ser1 a Ser 4 del CTP N-terminal (correspondientes a las posiciones 220-223 en la segunda secuencia CTP y 248-251 para la tercera secuencia CTP). Sin embargo, no se pudo determinar mediante espectrometría de masas qué dos de los cuatro residuos de serina se modificaron. Los detalles de la ocupación y estructura de los O-glicanos se proporcionan en el Ejemplo 2 posterior.
Estructuras de O-glicanos
El pico principal de O glicano correspondía al núcleo monosialilado 1 (Neu5Aca2-3Galp1-3GalNAc). Además, se observaron pequeñas cantidades de núcleo neutro 1 (Galp1-3GalNAc), núcleo monosialilado 1 (Neu5Aca2-6(Galp1-3)GalNAc) y núcleo disialilado 1 (Neu5Aca2-3Galp1-3(Neu5Aca2-6)GalNAc). El principal ácido siálico en la muestra fue Neu5Ac (NANA). Las estructuras de los glicanos unidos a O y del tipo ácido siálico se presentan en las Figuras 15A y 15B, respectivamente.
Pureza de MOD-4023
La RP-HPLC separa las moléculas según su polaridad. Se usó un gradiente de fase móvil de un disolvente más polar a uno menos polar para eluir moléculas con una fuerte polaridad antes que las moléculas menos polares. La RP-HPLC separa el principio activo MOD-4023 en un pico principal, observado a los 21,0 a 25,0 minutos, y picos menores, que representan variantes relacionadas con el producto (Figura 9). Las formas relacionadas se separan de la proteína nativa usando detección UV a 220 nm. Las áreas de pico relativas (% de área) de las formas relacionadas y el pico principal se pueden calcular integrando las áreas de pico correspondientes. El pico principal de principio activo y producto farmacéutico de MOD-4023 consiste en más del 97 % del área del pico, lo que indica un producto altamente purificado y un proceso de purificación eficaz (véase Figura 21).
La HPLC de exclusión por tamaño es una técnica cromatográfica que separa las moléculas según su tamaño. Dentro del rango de fraccionamiento elegido, las moléculas más grandes eluyen antes que las moléculas más pequeñas. El mecanismo de separación no es adsorbente y las moléculas se eluyen en condiciones isocráticas. SEC permite que los monómeros se separen de formas de mayor peso molecular (como dímeros y polímeros) de la molécula objetivo. El método SEC se desarrolló para analizar el contenido de dímeros y polímeros de MOD-4023 en el principio activo y el producto farmacéutico (Figura 10). El monómero MOD-4023 consiste en más del 98 % del área del pico, lo que indica un producto altamente purificado y un proceso de purificación eficaz (véase la Figura 22).
Método de contenido de RP-HPLC
Este método se está utilizando para la determinación del contenido de MOD-4023 en muestras intermedias de MOD-4023 y la determinación del % de MOD-4023 no glicosilado en muestras intermedias mediante cromatografía de fase inversa. La HPLC de fase inversa separa las moléculas debido a su polaridad. Las moléculas relativamente no polares, como MOD-4023, se ligan al material de la columna, mientras que las moléculas cargadas y polares se eluyen sin lograr una interacción con la columna.
Las moléculas ligadas se eluyeron con la ayuda de un gradiente de una solución polar a una menos polar. Las moléculas de la polaridad más fuerte eluyeron primero seguidas por las moléculas menos polares. La detección se realizó por absorción a 214 nm.
En los primeros pasos de purificación (muestra UFDF1) se observaron dos picos. El pico 1 es la forma altamente glicosilada de MOD-4023 y el pico 2 es la forma poco glicosilada (Figura 11). Las áreas de pico relativas (% de área) de los dos picos se pueden calcular integrando las áreas de pico correspondientes. El área relativa del pico I es del 75 %. En el primer paso de purificación, la columna DEAE Sepharose separa estos picos y la fracción de elución contiene solo MOD-4023 en forma glicosilada (100 %), (Figura 12).
Potencia de MOD-4023
La activación del receptor de crecimiento humano por MOD-4023 se caracterizó utilizando células Baf que expresan de manera estable el receptor de hGH. Las células experimentaron inanición en medio libre de GH seguido de un paso de lavado y se resuspendieron en tampón de ensayo y se transfirieron a placas de 96 pocillos (100 pl/pocillo). Durante el tiempo de incubación de las células a 37 °C durante 30 min, se añadió MOD-4023 a concentraciones crecientes y las células se incubaron durante la noche a 37 °C con 5 % de CO2. El ensayo finalizó añadiendo 30 pl de Reactivo de solución única acuosa de CellTiter 96 (MTS) a los pocillos de cultivo. Tres horas después de la adición de MTS, se midió la densidad óptica (DO) de los pocillos de cultivo a 492 nm. La absorbancia de 492 nm es directamente proporcional al número de células vivas en el cultivo. MOD-4023 demostró una unión específica a las células Baf-hGH en una curva típica de dependencia de la dosis (Figura 13 y Figura 23).
Además, se realizó una prueba de bioidentidad en ratas hipofisectomizadas en las que la actividad de MOD-4023 en todos los lotes no fue inferior a 2 unidades de somatropina de la Farmacopea de los Estados Unidos (USP) por mg (Figura 23).
Aclaramiento viral
La capacidad del proceso de fabricación para abordar y mitigar la contaminación del producto farmacéutico final con virus endógenos y adventicios ha sido objeto de una evaluación preliminar. Se ha llevado a cabo un estudio que cumple con GLP según la guía aplicable para productos en investigación utilizando tres virus modelo enriquecidos en segmentos reducidos del proceso de fabricación para cuantificar la capacidad de estos pasos para inactivar o eliminar la población de virus enriquecidos. Con las cantidades de virus expresadas como título ajustado log 10, el factor de aclaramiento log10 se determina simplemente restando el valor de salida del valor de entrada. Como números log 10, los factores de aclaramiento se suman para derivar un factor de aclaramiento general para todos los pasos evaluados. Los factores de aclaramiento de los pasos individuales se calculan en Figura 14. Se realizaron estudios de evaluación de la seguridad viral con el virus de la leucemia murina de Abelson (A-MuLV), el virus diminuto de ratones (MVM), el reovirus tipo 3 (Reo-3) y el virus de la pseudorrabia (PrV). Las cargas teóricas de virus por dosis se calcularon sobre una dosis máxima de 15 mg/dosis. Se considera que A-MuLV es un virus modelo que representa la posible presencia de retrovirus de CHO, las medidas tomadas para inactivar y eliminar el virus A-MuLV contaminante lograron un factor de eliminación de al menos antilog10, 22,74, lo que sugiere que el proceso general de MOD-4023 tiene un excepcional capacidad de eliminación viral.
Impurezas
Los resultados de los análisis de una variedad de impurezas presentes en la proteína MOD-4023 purificada se presentan en la Figura 24. Se encontró menos de o igual a 100 ng/mg (ppm) de proteínas de la célula huésped (HCP). La presencia de ADN fue menor o igual a 10 pg/mg (ppb). Mientras que los niveles residuales de metotrexato (MTX) fueron inferiores a 50 ng/ml. El propilenglicol (PG) residual fue menor que o igual a 60 gg/ml. Se encontró Tritón menor o igual a 2,5 gg/ml. Además, en la proteína MOD-4023 purificada final estaba presente menos de o igual a 115 pg/ml de insulina. Finalmente, estaba presente menos de 250 gg/mL de DMSO en el producto proteico MOD-4023 purificado. Los resultados de un análisis de carga biológica también se presentan en la Figura 24 y muestran menos de o igual a 10 cfu/10 ml presentes en el producto farmacéutico purificado.
Ejemplo 2
Ocupación del sitio de glicosilación de la proteína MOD-4023
Objetivo
El objetivo del estudio fue proporcionar información sobre la ocupación del sitio de glicosilación de la proteína MOD-4023 (una glicoproteína con alrededor de 12 sitios de glicosilación unidos a O).
Métodos
Desialilación de MOD-4023 usando neuraminidasa
Se usaron muestras de Mod-4023 que tenían una concentración de aproximadamente 21 mg/ml. Aproximadamente 200 ug de muestra se cambiaron de tampón a agua y se liofilizaron. La muestra seca la resuspendimos en Neuraminidasa y la incubamos a 37 °C.
Digestión tríptica de proteína MOD-4023 reducida/carboximetilada
Después de la desialilación, aproximadamente 200 gg de MOD-4023 se cambiaron de tampón a tampón Tris/clorhidrato de guanidina, se redujeron con ditiotreitol y se carboximetilaron usando ácido yodoacético. A continuación, las muestras se cambiaron de tampón a tampón de bicarbonato de amonio y se digirieron con tripsina a 37 °C.
Cromatografía líquida/espectrometría de masas por electropulverización LC/ES-MS en línea
La cromatografía líquida/espectrometría de masas por electropulverización (LC/ES-MS) en línea se llevó a cabo en una alícuota de las muestras digeridas tal como se recibieron utilizando una columna Jupiter Phenomenex (C18, 5 g, 250 x 2,1 mm; temperatura ambiente; longitud de onda de 214 nm; un caudal de 0,2 ml/minuto). El disolvente A era 0,05 ml de ácido fórmico en 1 L de H2O. El disolvente B era 0,05 ml de ácido fórmico en 100 ml de H2O más 900 ml de acetonitrilo. El gradiente que se presenta a continuación en la Tabla 1 se usó para el producto intacto y reducido.
Tabla 1: Gradiente de columna
Figure imgf000036_0001
Figure imgf000037_0001
La ionización se mejoró mediante el uso de un gas de secado de nitrógeno y una temperatura de fuente elevada. Se aplicó un voltaje de cono ligeramente aumentado para facilitar la fragmentación de la fuente. La exploración del rango de masas fue de m/z 200 a m/z 2000.
Interpretación de datos
La interpretación de los datos de espectrometría de masas se vio favorecida por el uso del software General Protein/Mass Analysis for Windows (GPMAW) (Lighthouse data) junto con la secuencia de proteína de hGH modificada con CTP (SEQ ID NO: 7), en la que las secuencias esperadas a O-glicosilar son los presentes en las unidades CTP.
Resultados
La evaluación de los datos condujo al mapeo completo de la secuencia de la proteína MOD-4023 entre los aminoácidos 37 y 224 de SEQ ID NO: 7, aunque se analizó la secuencia completa de SEQ ID NO: 7.
LC-ES-MS de una mezcla de digestión tríptica de MOD-4023 desialilada, reducida y carboximetilada
Se realizó una LC/ES-MS en línea en una digestión tríptica de MOD-4023 desialilada, reducida y carboximetilada. Para la comparación de lote a lote, la Figura 16 muestra una superposición de tres cromatogramas de corriente de iones totales (TIC). Los datos obtenidos para los tres lotes fueron altamente comparables tanto en péptidos detectados como en intensidad.
La Figura 17 presenta una evaluación de la señal obtenida a partir del análisis LC/ES-MS en línea de una digestión tríptica de lotes de proteína MOD-4023 desialilada, reducida y carboximetilada con un enfoque en la señal modificada por al menos un residuo HexNAc-Hex. Los resultados presentados en la Figura 17 sugieren la ocupación del sitio de glicosilación unida a O en la región N-terminal como se muestra en la Figura 18. La Figura 18 presenta la secuencia de aminoácidos 1-30 de MOD-4023 SEQ ID NO: 7, en la que la O-glicosilación tiene lugar en los residuos de serina (S) en las posiciones 10, 13, 15 y 21 (mostrados en rojo). Esas serinas (S) siguen todas a los residuos de prolina (P) en la secuencia. Al menos dos de los residuos S en las posiciones uno a cuatro (1 -4) están ocupados por sitios de O-glicosilación (mostrados en púrpura).
Se observaron señales adicionales de la unidad CTP completa coherentes con la masa esperada de aminoácidos 1­ 36 de SEQ ID NO: 7 con hasta seis sitios de O-glicosilación. La aparición de dichos péptidos trípticos más grandes que contienen sitios de escisión perdidos está de acuerdo con la presencia de O-glicosilación ya que los residuos de glicano en la proximidad de los residuos de arginina o lisina dificultan la escisión tríptica como resultado de la interferencia estérica y electrostática.
Los datos presentados en la Figura 17 también muestran la comparabilidad con los datos anteriores (no mostrados), es decir, para la región CTP-CTP C-terminal de MOD-4023. Como resultado, se puede decir que la O-glicosilación tiene lugar en los residuos de serina que siguen a los residuos de prolina (mostrado en rojo) en la Figura 18 y la Figura 19. Además, en las regiones de repeticiones de serina, al menos dos de las cuatro serinas estaban ocupadas por O-glicosilación.
A partir de los resultados obtenidos, se extrajeron las siguientes conclusiones con respecto a la unidad CTP N-terminal. La O-glicosilación tuvo lugar en los residuos de serina en las posiciones 10, 13, 15 y 21 (aminoácidos 10, 13, 15 y 21 de SEQ ID NO: 7). Todas esas serinas seguían a residuos de prolina en la secuencia. De los cuatro residuos de serina en las posiciones uno a cuatro del extremo N de la proteína (aminoácidos 1-4 de SEQ ID NO: 7), al menos dos están ocupados por sitios de O-glicosilación. En las unidades CTP-CTP C-terminales: Aminoácidos 229, 232, 234, 240, 257, 260, 262 y 268 de SEQ ID NO: 7). Además, en las regiones de serina repetida, al menos dos de las cuatro serinas estaban ocupadas por sitios de O-glicosilación (Aminoácidos 1-4 de SEQ ID NO: 7 la unidad CTP N-terminal y Aminoácidos 220-223 y 248- 251 de SEQ ID NO: 7 de las unidades CTP-CTP C-terminales).
Se entiende que los péptidos con un alto número de sitios de O-glicosilación podrían haber escapado a la detección espectrométrica de masas como resultado de una mala ionización. Por esta razón, la muestra idéntica se inyectó en mayor cantidad y se modificaron las condiciones de ionización que se favorecen en los péptidos trípticos de alta masa.
Conclusiones
Durante el curso de este estudio se reunió evidencia que respalda las siguientes afirmaciones. La evaluación de los datos obtenidos a partir de los análisis de las mezclas de digestión tríptica condujo a señales que permitieron mapear el 100 % de la secuencia de proteínas. La O-glicosilación tiene lugar en las regiones CTP- y CTP-CTP tanto N-terminal como C-terminal, respectivamente. Los sitios de ocupación fueron residuos de serina que seguían a residuos de prolina, así como dos de las cuatro serinas en las regiones de repeticiones de serina. De esta forma, un total de hasta 18 residuos de serina pueden servir como sitios de unión para O-glicanos. Por lo tanto, sorprendente e inesperadamente, utilizando los métodos de fabricación descritos en el presente documento, la ocupación de O-glicanos fue de hasta 6 O-glicanos por unidad CTP de cada MOD-4023 (polipéptido CTP-hGH-CTP-CTP). Los análisis de peso molecular de la proteína MOD-4023 después de la desialilación sugirieron que la proteína se modificó con 12­ 18 sitios de glicosilación de estructura HexNAc-Hex (véase el Ejemplo 3).
Ejemplo 3
Análisis de peso molecular intacto de MOD-4023
Objetivo
El objetivo del estudio fue proporcionar información precisa sobre el peso molecular intacto de tres lotes de proteína MOD-4023 (una glicoproteína con alrededor de 12 sitios de glicosilación unidos a O)
Métodos
Análisis de peso molecular de las muestras tal como se reciben y después del tratamiento.
Las muestras analizadas tenían una concentración de 21 mg/ml y 41 mg/ml. La LC/ES-MS en línea se llevó a cabo utilizando las siguientes condiciones:
HPLC: sistema de cromatografía líquida GE AKTAmicro que comprende bomba P-905, absorbancia de longitud de onda triple UV-900, detector de conductividad y automuestreador A-905, colector de fracción Frac-950
MS: espectrómetro de masas Micromass/Waters Q-TOF micro cuadrupolo-tiempo de vuelo
Longitud de onda: 280 nm
Columna: Phenomenex Jupiter 3p C18300A 150 x 2,0 mm (SGS M-Scan GmbH columna núm. 74) Temperatura de col. 40 °C
Caudal: 0,2 ml/minuto
Disolvente A: 1,0 ml de FA en 1 L de H2O
Disolvente B: 1,0 ml de FA en 100 ml de H2O más 800 ml de acetonitrilo y 100 ml de tetrahidrofurano
El gradiente descrito a continuación se utilizó para el análisis del producto desialilado. Cabe señalar que el tiempo de retención durante la evaluación de datos se ha ajustado al inicio del gradiente (tRo = a los 10 min):
Tabla 2: Gradiente de columna
Figure imgf000038_0001
La ionización se mejoró mediante el uso de un gas de secado de nitrógeno y una temperatura de fuente elevada. El rango de masas escaneado fue de m/z 350 a m/z 3500. Se usaron iones de fragmentos de Glu-Fibrinopéptido en modo MS/MS para calibrar el instrumento.
Desialilación usando neuraminidasa
Aproximadamente 100 pg de muestra se cambiaron de tampón a agua y se liofilizaron. La muestra seca se resuspendió en Neuraminidasa y se incubó a 37 °C. Se analizaron aproximadamente 10 pg de la misma como se describe anteriormente.
Interpretación de datos
La interpretación de los datos de espectrometría de masas se vio favorecida por el uso del software GPMAW (Lighthouse data) junto con las secuencias de la proteína MOD-4023 (SEQ ID NO: 7).
Resultados
Análisis de peso molecular intacto de las muestras tal como se reciben
En la Figura 20 se muestra el espectro de masas deconvolucionado adquirido durante la elución del componente absorbente de UV en tR 19,8 min obtenido a partir del análisis LC/ES-MS en línea de la muestra de MOD4023 Lote 648-01 -10-014A después de la desialilación.
La Tabla 3 presenta un resumen de los resultados obtenidos a partir de la detección espectrométrica de masas adquirida durante el análisis LC/ES-MS en línea de MOD4023 Lote 648-01-10-014A después de la desialilación.
Tabla 3:
Figure imgf000039_0001
Conclusiones
Se realizaron análisis de peso molecular de tres baños de proteína MOD4023 en las muestras después de la desialilación con el objetivo de obtener información sobre el número de sitios de glicosilación unidos a O. De manera consistente para los tres lotes, los datos obtenidos de la medición de la masa intacta de las muestras desialiladas generaron señales coherentes con la masa química promedio de la proteína MOD4023 con 12-18 sitios de glicosilación de la estructura HexNAc-Hex (dentro del error experimental del instrumento). Para los tres lotes, la proteína modificada con 15 sitios de glicosilación fue la más intensa.
Cada una de las señales de espectro de masas correspondientes se caracterizó por la presencia de señales satélite a aproximadamente 16,5 Da. Este cambio de masa podría haber sido el resultado de la adición de residuos de oxígeno o de residuos de NH3. Esto último podría originarse a partir de protonación de NH4+ en lugar de protonación de H+ que produce una adición neta de NH3 (+17 Da). Como una oxidación posiblemente daría lugar a un cambio en el tiempo de elución (como se observa por la presencia de señales UV a los 18,5 min, coherente con la masa del pico principal 1 oxígeno), los datos sugirieron la última explicación como favorable (siendo los satélites el resultado de protonación de NH4+). Sin embargo, a partir de la medición de la masa intacta por sí sola, esto finalmente no se pudo desentrañar.
Los hallazgos extraídos de este estudio fueron coherentes con análisis previos de la proteína MOD4023 (datos no mostrados) donde también se encontró un máximo de 18 residuos O-glicosilados, siendo la proteína modificada con 15 sitios de glicosilación la más intensa.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Un método para fabricar un polipéptido de hormona de crecimiento humano (hGH) modificado con péptido carboxilo terminal (CTP) de gonadotropina coriónica humana altamente glicosilada, consistiendo dicho polipéptido en dos CTP unidos al extremo carboxi de la hGH y un CTP unido al extremo amino de la hGH, en el que la secuencia de aminoácidos de dicho polipéptido se establece en SEQ ID NO: 7, y en el que la hGH modificada con CTP altamente glicosilada está glicosilada entre 12 y 18 sitios de glicosilación unidos a O, comprendiendo el método los pasos de: (a) transfectar de forma estable un número predeterminado de células con un vector de expresión que comprende una parte codificante que codifica dicha hGH modificada con CTP, en el que dicha célula transfectada expresa y secreta dicha hGH modificada con CTP;
(b) obtener clones celulares que sobreexpresen dicha hGH modificada con CTP;
(c) expandir dichos clones en solución a una escala predeterminada cultivando a un contenido de oxígeno disuelto (OD) de 20-30 %;
(d) recolectar dicha solución que contiene dichos clones;
(e) filtrar dicha solución que contiene dichos clones para obtener una solución de cosecha clarificada; y,
(f) purificar dicha solución de cosecha clarificada para obtener una solución de proteína purificada de la hGH modificada con CTP, en la que al menos el 60 % de la hGH modificada con CTP purificada en la cosecha clarificada es la forma altamente glicosilada de la hGH modificada con CTP;
fabricando así una hGH modificada con CTP altamente glicosilada.
2. El método según la reivindicación 1, en el que dicho paso (c) comprende expandir clones obtenidos de un banco de células de trabajo (WCB) o un banco de células maestras (MCB) que expresa y secreta de manera óptima dicha hGH modificada con CTP.
3. El método según la reivindicación 1 o 2, en el que en el paso (c) dichos clones expresan y secretan la hGH modificada con CTP altamente glicosilada a un nivel de al menos 600 mg/l.
4. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que en el paso (c) dichos clones se expanden en solución a través de una serie de pasos de subcultivo hasta el nivel del biorreactor de producción.
5. El método según la reivindicación 4, en el que dicho biorreactor comprende un biorreactor desechable o un biorreactor de acero inoxidable y dicho biorreactor funciona como un biorreactor en modo discontinuo alimentado.
6. El método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicha purificación (paso f) de dicha cosecha clarificada comprende realizar secuencialmente los siguientes pasos que comprenden:
(g) concentrar y diafiltrar dicha solución de cosecha clarificada;
(h) obtener dicha cosecha clarificada obtenida siguiendo el paso (g) e inactivar los virus presentes en dicha cosecha clarificada incubando en una solución tóxica para dichos virus;
(i) obtener dicha solución de cosecha clarificada del paso (h) y purificar dicha solución de cosecha clarificada, i. en el que dicha purificación se logra pasando secuencialmente dicha solución de cosecha clarificada a través de una columna de intercambio de aniones y una columna de interacción hidrofóbica seguido de un paso de concentración y diafiltración,
ii. en el que dicha purificación va seguida del paso secuencial de dicha solución de cosecha clarificada a través de una columna de modo mixto de hidroxiapatita y una columna de intercambio catiónico;
(j) obtener dicha solución de cosecha clarificada siguiendo el paso (ii) y eliminar físicamente dicha solución de cosecha clarificada de virus mediante nanofiltración;
(k) obtener dicha solución de cosecha clarificada siguiendo el paso (j) y concentrar y diafiltrar dicha solución de cosecha clarificada para llegar a una cosecha clarificada purificada al máximo que contiene dicha hGH modificada con CTP.
7. El método según la reivindicación 6, en el que:
a. dicha columna de intercambio aniónico es una columna DEAE-Sepharose;
b. dicha columna hidrófoba es una columna HIC de fenilo;
C. dicha solución tóxica para dichos virus es una solución T riton-X 100 al 1 %;
d. dicha columna de intercambio catiónico es una columna SP-Sepharose; o
e. dicho aclaramiento viral muestra un factor de reducción logarítmica viral (LRF) de aproximadamente 22.
8. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho método logra al menos un 20 % de tasa de recuperación de la hGH modificada con CTP altamente glicosilada.
9. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho método de fabricación es un proceso libre de animales.
10. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la pureza de la proteína hGH modificada con CTP altamente glicosilada es de al menos el 90 %.
11. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que el patrón de glicosilación de dicha hGH modificada con CTP fabricada comprende la glicosilación de 4 a 6 sitios de glicosilación unidos a O por CTP.
12. El método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que dicha hGH modificada con CTP fabricada está altamente sialilada.
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