JP7437865B2 - 高度にグリコシル化されたヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを含む、精製された医薬組成物 - Google Patents

高度にグリコシル化されたヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを含む、精製された医薬組成物 Download PDF

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Description

本発明は、哺乳動物細胞培養系中でＣＴＰ付加による組み換えヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）を製造する方法を提供する。
成長ホルモン（ソマトトロピン）は、小人症をもたらす小児における成長ホルモン分泌不全を主に治療するために、５０年超に亘って臨床利用されてきた。１９８５年に、組み換えＤＮＡ由来のヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）が、それまで唯一の利用可能な材料源であった死体の脳下垂体からのｈＧＨに取って代わった。ｈＧＨ補充治療は、数万人の患者にとって標準治療となり、安全性及び有効性が証明されてきた。ｈＧＨ血中濃度を有効治療濃度域内に維持する必要性は、１日１回または２日に１回の皮下または筋肉内注射を要する。市販のｈＧＨのほとんどは、細菌系中で生成される。
成長ホルモン（ＧＨ）は、１９１個のアミノ酸からなる脳下垂体タンパク質であり、それは、肝臓でのインスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）の生成及び体循環への放出を刺激する。現在利用可能なＧＨ製剤のほとんどは、１日１回の投与を要し、したがって、特に青年においてそのコンプライアンスが問題となり得る。成人ＧＨ分泌不全（ＧＨＤ）では、１日１回の投与及び付随する副作用（例えば、注射部位の不快感、一時的な浮腫及び関節痛）が、既存の製剤の実用性を制限している。ＧＨの長時間作用形態は、より少ない注射を要すること、及び１日１回の注射に伴って生じる血漿濃度のピーク値及びトラフ値に関連する有害事象を最小化することにより不快感を低減する潜在性を有する。
本明細書に開示される方法は、ＧＨＤの治療で現在要求される数多くの注射の必要性を不要にする、長時間作用性ｈＧＨ（ＭＯＤ－４０２３；図１）の生成を含む。この技術は、天然ペプチドであるヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のベータ鎖のＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）の使用に基づき、これは妊娠状態の維持のために要される長寿命をｈＣＧに提供する（初期Ｔ１／２約１０時間、最終Ｔ１／２約３７時間）。ＣＴＰは２８個のアミノ酸及び４～６個のＯ－結合糖鎖を有し、これらは全てセリン残基に結合している。排卵を引き起こす生殖ホルモンである黄体形成ホルモン（ＬＨ）のベータ鎖は、ｈＣＧとほとんど同一であるが、ＣＴＰを含まない。結果として、ＬＨは血中で著しく短い半減期を有する（初期Ｔ１／２約１時間、最終Ｔ１／２約１０時間）。
ＭＯＤ－４０２３は、ＣＴＰの３つのコピーに融合されたｈＧＨ分子であり、１つはＮ末端で、２つはＣ末端で融合する（配列番号７に記載されるＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰ）（図１）。ＭＯＤ－４０２３は、２７５個のアミノ酸及び１２～１８個のＯ－結合炭水化物を有する一本鎖タンパク質である。動物モデルで実証されるように（下垂体切除されたラットの重量増加）、ＭＯＤ－４０２３は、１週間に１回から２週間に１回の注射で、ｈＧＨの１日１回の注射と同様の臨床効果をもたらす潜在性を有する。
一態様において、高度にグリコシル化されたヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを含む、精製された医薬組成物であって、前記高度にグリコシル化されたＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨポリぺプチドと、前記ｈＧＨポリぺプチドのアミノ末端に接着したアミノ末端絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記ｈＧＨポリぺプチドのカルボキシ末端に接着して直列に配置された２つのカルボキシ末端絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含み、前記高度にグリコシル化されたＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの分子の少なくとも６０％が、１分子当たり１３～１８個のＯ－結合型グリカンを含む。
一態様において、ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）所定の数の細胞に、該ＣＴＰ修飾ヒト成長ホルモンをコードするコード部分を含む発現ベクターを安定してトランスフェクトするステップであって、該トランスフェクトされた細胞は、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを発現及び分泌する、ステップと、（ｂ）該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを過剰発現する細胞クローンを取得するステップと、（ｃ）該クローンを溶液中で所定の規模まで増殖させるステップと、（ｄ）該クローンを含有する該溶液を収集するステップと、（ｅ）該クローンを含有する該溶液を濾過して、浄化された収集溶液を取得するステップと、（ｆ）該浄化された収集溶液を精製して、所望の濃度のＣＴＰ修飾ｈＧＨを有する精製されたタンパク質溶液を取得するステップと、によりヒト絨毛性ゴナドトロピンペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを製造し、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨのアミノ酸配列が配列番号７に記載される、方法が本明細書に開示される。関連する態様において、該製造されたＣＴＰ修飾ｈＧＨは、高度に糖鎖付加されている。関連する態様において、該製造されたＣＴＰ修飾ｈＧＨは、高度にシアル酸付加されている。別の関連する態様において、該製造されたＣＴＰ修飾ｈＧＨの糖鎖付加パターンは、ＣＴＰごとに少なくとも４個のＯ－結合部位の糖鎖付加を含む。
一態様において、本明細書に開示される方法によって製造されたヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドが開示される。関連する態様において、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの糖鎖付加は、ＣＴＰごとに４個を超えるＯ－結合型グリカンを含む。関連する態様において、糖鎖付加は、ＣＴＰユニットごとに少なくとも４～６個のＯ－グリカンを含む。
他の特徴及び利点は、以下の詳細な説明、実施例、及び図面から明らかになるであろう。しかしながら、詳細な説明及び具体例は、製造方法及びその結果的な生成物の実施形態を示す一方、本明細書に開示される本方法及び生成物の原理と範囲内で様々な変更及び修正がこの詳細な説明から当業者には明白になり得るため、これらは例証の目的のみで提供されることを理解されたい。
組み換え長時間作用性ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチド（ＣＴＰ修飾ｈＧＨ）及びそれを製造する方法と見なされる主題は、本明細書の結論部分に具体的に指摘され明確に主張される。しかしながら、ＣＴＰ修飾ｈＧＨ及びそれを製造する方法は、その対象、特徴、及び利点と共に、構成及び操作方法の両方については、添付の図面と併せて読むことで以下の詳細な説明参照して最もよく理解され得る。
ＭＯＤ－４０２３（ＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰ）を例証する模式図を提示する。 ＭＯＤ－４０２３ ｐＣＩ－ｄｈｆｒプラスミドのマップを示す。 ＣＴＰ修飾ポリペプチド、例えばＭＯＤ－４０２３の上流工程フロー生成チャートを示す。 ＣＴＰ修飾ポリペプチド、例えばＭＯＤ－４０２３のフロー生成チャートを示す。 ＭＯＤ－４０２３医薬品（ＤＰ）製造プロセスのフローチャート概観を提示する。 第１のイオン交換クロマトグラフィー（ＩＥＸ）カラムによるＭＯＤ－４０２３高糖鎖付加型の精製を示す、クマシー染色されたＳＤＳ－ＰＡＧＥを提示する。レーン（１）収集物総タンパク質、図３のステップ８；レーン（２）限外濾過／透析濾過、図４のステップ１（ＵＦＤＦ１）濃縮及び透析濾過された総タンパク質；レーン（３）ＩＥＸフロースルー、図４のステップ３；レーン（４）ＩＥＸ洗浄材料、図４のステップ３；及びレーン（５）ＩＥＸ溶出、図４のステップ３。 異なるバッチからのＭＯＤ－４０２３のロバストなＯ－グリカン含有量を示すデータを提示する。１モルのＭＯＤ－４０２３ごとのＯ－グリカンモル含有量が、異なるバッチのＭＯＤ－４０２３原薬（ＤＳ）及び医薬品（ＤＰ）について判定された。 質量分析法（ＭＳ）の応答に基づく個々のＯ－糖鎖付加ペプチド間のバッチごとの比較を提示する。欄の記注は、「Ｏ」はＯ－結合型グリカンの省略である、アミノ酸配列である。第１のペプチドのＭＳ応答がデータ正規化のために使用され、１００％に設定された。 ＭＯＤ－４０２３の逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）プロファイルを提示する。ピーク４は、ＭＯＤ－４０２３のメインピークと対応する。４つの小程度の関連する形態もまた存在する（ピーク１、２、３、及び５）。 ＭＯＤ－４０２３のサイズ排除高速液体クロマトグラフィー（ＳＥＣ－ＨＰＬＣ）プロファイルを提示する。ピーク３は、ＭＯＤ－４０２３単量体と対応する。ピーク１及び２は、ＭＯＤ－４０２３二量体及び重合体とそれぞれ対応する。 ２２０ｎｍでのＲＰ－ＨＰＬＣによって分析された、ＭＯＤ－４０２３参照標準物質ＳＲ－９２９ＳＩ．１（上のプロファイル）とＭＯＤ－４０２３ Ｉ１５－ＰＰ（ＵＦＤＦ１試料）（下のプロファイル）との比較を提示する。ピーク１は、ＭＯＤ－４０２３糖鎖付加型と対応し、ピーク２は、非糖鎖付加型と対応する。 ２２０ｎｍでＲＰ－ＨＰＬＣによって分析された、ＭＯＤ－４０２３参照標準物質ＳＲ－９２９ＳＩ．１（上のプロファイル）とＭＯＤ－４０２３ Ｃ１０－ＰＰ（Ｅｌｕｔｉｏｎ ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）との比較を提示する。生成プロセスのこの時点では、ＭＯＤ－４０２３試料中で糖鎖付加ピークのみが認められた。 安定してトランスフェクトされた細胞中でのＭＯＤ－４０２３によるｈＧＨ受容体の活性化を示す。ＭＯＤ－４０２３による典型的な用量反応活性化曲線。それらの細胞表面上でｈＧＨ受容体を安定して発現するＢａｆ細胞上のｈＧＨ受容体のＭＯＤ－４０２３活性化。 エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭｕＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、レオウイルス３型（Ｒｅｏ－３）、及び仮性狂犬病ウイルス（ＰｒＶ）を用いたウイルス安全性評価研究に得られた、個々のプロセスステップ及び総体的なプロセスのクリアランス係数を提示する。理論上の用量当たりのウイルス負荷は、１５ｍｇ／用量の最大用量で計算された。 Ｏ－結合型グリカン構造、及び順相（ＮＰ）カラムを使用してＨＰＬＣで分離された、除去されたグリカンの２ＡＢ標識によって測定された２つのＭＯＤ－４０２３生成物中でのそれらの豊富さを示す。 超高速液体クロマトグラフィー（ＵＰＬＣ）で分離され、商業用標準物質に対して特定された、除去されたシアル酸の１，２－ジアミノ－４，５－メチレンジオキシベンゼン．２ＨＣｌ（ＤＭＢ）標識によって測定された２つのＭＯＤ－４０２３生成物試料中でのシアル酸型の豊富さを示す。 オンライン液体クロマトグラフ／エレクトロスプレー質量分析法（ＬＣ／ＥＳ－ＭＳ）による３つのＭＯＤ－４０２３バッチのトリプシン消化産物の分析から取得された３つの全イオン電流クロマトグラムのオーバーレイを示す。 オンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳによる、脱シアル化、還元、及びカルボキシメチル化されたＭＯＤ－４０２３タンパク質バッチ（図１６に示され、実施例２で説明されるように）のトリプシン消化の分析から得られたシグナルの評価を示し、少なくとも１つのＨｅｘＮＡｃ－Ｈｅｘ残基で修飾されたシグナルに焦点を当てる。 ＭＯＤ－４０２３の配列番号７のアミノ酸配列１～３０を示し、Ｏ－糖鎖付加は、１０位、１３位、１５位、及び２１位（赤で示される）のセリン（Ｓ）残基上で行われる。これらのセリン（Ｓ）は全て、配列中でプロリン（Ｐ）残基に続く。１～４（１～４）位のＳ残基のうちの少なくとも２つは、Ｏ－糖鎖付加部位（紫で示される）によって占有されている。 ＭＯＤ－４０２３の配列番号７のアミノ酸配列２１１～２７５を示し、Ｏ－糖鎖付加は、赤で示されるセリン（Ｓ）残基上で行われる。これらのセリン（Ｓ）は全て、配列中でプロリン（Ｐ）残基に続く。加えて、セリンが連続する領域では、Ｓ残基のうちの少なくとも２つが、Ｏ－糖鎖付加部位（紫で示される）によって占有されている。 脱シアル化後のオンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳによるＭＯＤ４０２３ ロット６４８－０１－１０－０１４Ａ試料の分析から取得されたｔＲ１９．８ｍｉｎでのＵＶ吸収成分の溶出の間に得られたデコンボリュートされた質量スペクトルを示す。 逆相（ＲＰ）－ＨＰＬＣを使用して査定した、ＭＯＤ－４０２３（ＤＳ）純度を示す。 サイズ排除クロマトグラフ（ＳＥＣ）－ＨＰＬＣを使用して査定した、ＭＯＤ－４０２３（ＤＳ）純度を示す。 効能結果を示す。 宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）、ＤＮＡ、メトトレキサート（ＭＴＸ）、プロピレングリコール（ＰＧ）、トリトン、インスリン、ＤＭＳＯ、及びバイオバーデンについて、不純物分析の結果を示す。
例証の簡便性及び明確性のために、図中に示される要素は必ずしも縮尺に合わせて描かれていないことは理解されるであろう。例えば、要素のいくつかの寸法は、明確性のために他の要素と比べて強調されている場合がある。更に、適切と考えられる場合には、対応するまたは類似する要素を指すために参照番号が図面間で繰り返されている場合がある。
以下の詳細な説明において、組み換え長時間作用性ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチド（ＣＴＰ修飾ｈＧＨ；ＭＯＤ－４０２３；配列番号７）及びそれを製造する方法の完全な理解を提供するために、数々の具体的な詳細が説明される。他の場合では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチド及びそれを製造する方法を不明瞭にしないために、公知の方法、手順、及び構成要素は、詳細に記載されていない。
一実施形態では、本明細書に開示される長時間作用性ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む。別の実施形態では、ＣＴＰは、タンパク質またはそれに由来するペプチドの分解に対する保護剤として作用する。別の実施形態では、ＣＴＰは、タンパク質またはそれに由来するペプチドの循環半減期を延長する。いくつかの実施形態では、ＣＴＰは、タンパク質またはそれに由来するペプチドの効能を増強する。
当業者は、「ＣＴＰペプチド」、「カルボキシ末端ペプチド」、及び「ＣＴＰ配列」という用語が、互換的に使用することができることを理解するであろう。一実施形態では、カルボキシ末端ペプチドは、全長ＣＴＰである。別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチドは、欠損したＣＴＰである。
当業者は、「シグナル配列」及び「シグナルペプチド」という用語が、互換的に使用することができることを理解するであろう。加えて、当業者は、「配列」という用語が、ポリヌクレオチドとの関連である場合、ポリヌクレオチド配列のコード部分を包含し得ることを理解するであろう。
当業者は、「ポリペプチド」、「ペプチド」、「目的のペプチド」、「目的のポリペプチド」、及び「目的のポリペプチド配列」という用語が、互換的に使用することができることを理解するであろう。一実施形態では、目的のペプチドは、全長タンパク質である。別の実施形態では、目的のペプチドは、成長ホルモンである。別の実施形態では、目的のペプチドは、ヒト成長ホルモンである。別の実施形態では、目的のペプチドは、ヒト成長ホルモンのタンパク質断片である。
別の実施形態では、成長ホルモンと、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）アミノ末端に接着した単一のヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、ＧＨのカルボキシ末端に接着した２つのヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、からなるポリペプチドが本明細書に開示され、該ポリペプチドは、シグナルペプチドを欠損し、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＧＨと、ＧＨのアミノ末端に結合した単一のＣＴＰと、ＧＨのカルボキシ末端に接着した２つのＣＴＰと、アミノ末端ＣＴＰのアミノ末端に接着したシグナルペプチドと、からなるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドが本明細書に開示され、該ポリペプチドは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を含む。当業者は、成熟分泌ポリペプチドは、シグナルペプチドを欠損していることを理解するだろう。
一実施形態では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチド（ＣＴＰ修飾ｈＧＨ）を製造する方法であって、（ａ）所定の数の細胞に、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨをコードするコード部分を含む発現ベクターを安定してトランスフェクトするステップであって、該トランスフェクトされた細胞は、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを発現及び分泌する、トランスフェクトするステップと、（ｂ）該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを過剰発現する細胞クローンを取得するステップと、（ｃ）該クローンを溶液中で所定の規模まで増殖させるステップと、（ｄ）該クローンを含有する該溶液を収集するステップと、（ｅ）該クローンを含有する該溶液を濾過して、浄化された収集溶液を取得するステップと、（ｆ）該浄化された収集溶液を精製して、所望の濃度のＣＴＰ修飾ｈＧＨを有する精製されたタンパク質溶液を取得するステップと、によりヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを製造し、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に記載される、方法が本明細書に開示される。
別の実施形態では、製造する方法は、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を有するＣＴＰ修飾ｈＧＨを発現及び分泌するクローンを含む。別の実施形態では、本明細書に開示される、増加した糖鎖付加含有量を有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを製造する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法で製造された、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、増加した数の糖鎖付加されたＯ－結合型糖鎖付加部位を有する。当業者は、「増加した数の糖鎖付加されたＯ－結合型糖鎖付加部位」という言い回しが、「増加したＯ－グリカン占有」と表現することもできることを理解するであろう。
ヒト絨毛性ゴナドトロピンペプチド（ＣＴＰ）修飾ポリペプチド
一実施形態では、長時間作用性ＧＨポリペプチドならびにその生成または製造及び使用方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、長時間作用性ポリペプチドは、ヒト絨毛性ゴナドトロピン（ｈＣＧ）のカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）を含む。別の実施形態では、ＣＴＰは、タンパク質またはそれに由来するペプチドの分解に対する保護剤として作用する。別の実施形態では、ＣＴＰは、タンパク質またはそれに由来するペプチドの循環半減期を延長する。いくつかの実施形態では、ＣＴＰは、タンパク質またはそれに由来するペプチドの効能を増強する。
当業者は、「ＣＴＰペプチド」、「ＣＴＰ」、「ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド」、「カルボキシ末端ペプチド」、及び「ＣＴＰ配列」という用語が、本明細書において互換的に使用することができることを理解するであろう。一実施形態では、カルボキシ末端ペプチドは、全長ＣＴＰである。別の実施形態では、カルボキシ末端ペプチドは、欠損したＣＴＰである。
別の実施形態では、ＧＨと、ＧＨのアミノ末端に結合した単一のＣＴＰと、ＧＨのカルボキシ末端に接着した２つのＣＴＰと、Ｎ末端ＣＴＰのアミノ末端に接着したシグナルペプチドと、からなるポリペプチドが本明細書に開示され、該ポリペプチドは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有する。当業者は、成熟分泌ポリペプチドは、シグナルペプチドを欠損し得ることを理解するだろう。よって、なお別の実施形態では、ＧＨと、ＧＨのアミノ末端に接着した単一のＣＴＰと、ＧＨのカルボキシ末端に接着した２つのＣＴＰからなり、シグナルペプチドを含まないポリペプチドが本明細書に開示され、該ポリペプチドは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、ＧＨと、ＧＨのアミノ末端に接着した単一のＣＴＰと、ＧＨのカルボキシ末端に接着した２つのＣＴＰと、アミノ末端ＣＴＰのアミノ末端に接着したシグナルペプチドと、からなるポリペプチドの生成方法が本明細書に開示され、該ポリペプチドは、配列番号４に記載されるアミノ酸配列を有する。なお別の実施形態では、ＧＨと、ＧＨのアミノ末端に接着した単一のＣＴＰと、ＧＨのカルボキシ末端に接着した２つのＣＴＰからなり、シグナルペプチドを含まないポリペプチドの生成方法が本明細書に開示され、該ポリペプチドは、配列番号７に記載されるアミノ酸配列を有する。
別の実施形態では、配列番号７に記載されるＣＴＰを含むＧＨは、ＣＴＰを有しない同じＧＨと比べて増強したインビボでの生物活性を有する。
別の実施形態では、対象はヒト対象である。別の実施形態では、対象は愛玩動物である。別の実施形態では、対象は哺乳動物である。別の実施形態では、対象は家畜である。別の実施形態では、対象はイヌである。別の実施形態では、対象はネコである。別の実施形態では、対象はサルである。別の実施形態では、対象はウマである。別の実施形態では、対象はウシである。別の実施形態では、対象はマウスである。別の実施形態では、対象はラットである。一実施形態では、対象は雄である。別の実施形態では、対象は雌である。
一実施形態では、カルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）配列は、配列番号１に記載されるアミノ酸配列を含む：ＤＰＲＦＱＤＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＱ（配列番号１）。
いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ末端及びポリペプチドのカルボキシ末端の両方でのＣＴＰ配列は、タンパク質の分解に対する増強した保護を提供する。いくつかの実施形態では、ポリペプチドのアミノ末端及びポリペプチドのカルボキシ末端の両方でのＣＴＰ配列は、接着するタンパク質に延長した半減期を提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ポリペプチドの分解に対する増強した保護を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、接着するタンパク質の延長した半減期を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨの増強した活性を有する。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、延長されたクリアランス時間を有する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨの増強したＣｍａｘを有する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨの増強したＴｍａｘを有する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨの増強したＴ１／２を有する。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨの延長した半減期を提供する。
別の実施形態では、本明細書に開示されるカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）ペプチドは、配列番号１に記載される、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのアミノ酸１１２～１４５位のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、配列番号２：ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱに記載される、ヒト絨毛性ゴナドトロピンのアミノ酸１１８～１４５位のアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ配列はまた、ヒト絨毛性ゴナドトロピンの１１２～１１８位の間の任意の位置から開始し、１４５位で終結する。いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列ペプチドは、２８、２９、３０、３１、３２、３３、または３４個のアミノ酸の長さであり、ＣＴＰアミノ酸配列の１１２、１１３、１１４、１１５、１１６、１１７、または１１８位から開始する。
別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、米国特許第５，７１２，１２２号に記載されるように、天然ＣＴＰとは１～５個の保存アミノ酸置換が異なる、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異型である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、天然ＣＴＰとは１個の保存アミノ酸置換が異なる、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異型である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、天然ＣＴＰとは２個の保存アミノ酸置換が異なる、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異型である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、天然ＣＴＰとは３個の保存アミノ酸置換が異なる、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異型である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、天然ＣＴＰとは４個の保存アミノ酸置換が異なる、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異型である。別の実施形態では、ＣＴＰペプチドは、天然ＣＴＰとは５個の保存アミノ酸置換が異なる、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰの変異型である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドアミノ酸配列は、天然ＣＴＰアミノ酸配列またはそのペプチドと少なくとも９５％相同である。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、天然ＣＴＰ ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも７０％相同である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、天然ＣＴＰ ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも８０％相同である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、天然ＣＴＰ ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも９０％相同である。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰペプチドＤＮＡ配列は、天然ＣＴＰ ＤＮＡ配列またはそのペプチドと少なくとも９５％相同である。
一実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの少なくとも１つが欠損している。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の両方が欠損している。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの２つが欠損している。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの２つ以上が欠損している。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の全てが欠損している。一実施形態では、欠損したＣＴＰは、配列番号３：ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰの最初の１０個のアミノ酸を含む。一実施形態では、欠損したＣＴＰは、配列番号３の最初の１１個のアミノ酸を含む。一実施形態では、欠損したＣＴＰは、配列番号３のアミノ酸を含む。
一実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの少なくとも１つが糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の両方が糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの２つが糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの２つ以上が糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の全てが糖鎖付加されている。一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、少なくとも１つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、２つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、３つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、４つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、５つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、６つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、７つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ配列は、８つの糖鎖付加部位を含む。別の実施形態では、糖鎖付加部位は、Ｏ－糖鎖付加部位である。別の実施形態では、糖鎖付加は、セリン残基でのものである。別の実施形態では、糖鎖付加は、スレオニン残基でのものである。
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ポリペプチドを製造し、該ＣＴＰ修飾ポリペプチドは高度に糖鎖付加されている。別の実施形態では、本明細書に記載される方法は、ＣＴＰ修飾ポリペプチドヒト成長ホルモン（ＣＴＰ－ｈＧＨ）を製造し、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨは高度に糖鎖付加されている。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造し、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨは高度にシアル酸付加されている。シアル酸付加は、シアル酸付加が高度であるほど、半減期がより延長され得るため、重要である。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造し、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの少なくとも１つが糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の両方が糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの２つが糖鎖付加されている。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造し、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの３つが糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列のうちの３つ以上が糖鎖付加されている。別の実施形態では、絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰアミノ酸配列の全てが糖鎖付加されている。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも１つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも２つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも３つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも４つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも５つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも６つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも７つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰ配列は、少なくとも８つの糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、糖鎖付加部位は、Ｏ－糖鎖付加部位である。別の実施形態では、糖鎖付加は、セリン残基でのものである。別の実施形態では、糖鎖付加は、スレオニン残基でのものである。
一実施形態では、製造された配列番号７のＣＴＰ修飾ｈＧＨは、ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つのＣＴＰと、ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つのＣＴＰとからなり、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、１２及び１８個の間の糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、１２～２１個の間の糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、１２～２４個の間の糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、１３及び１８、１４及び１８、１５及び１８、１６及び１８、１７及び１８、１３～２１、１４～２１、１５～２１、１６～２１、１７～２１、１８～２１、１９～２１、２０～２１、１３～２４、１４～２４、１５～２４、１６～２４、１７～２４、１８～２４、１９～２４、２０～２４、２１～２４、２２～２４、または２３～２４個の間の糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、１２個の糖鎖付加部位、１３個の糖鎖付加部位、１４個の糖鎖付加部位、１５個の糖鎖付加部位、１６個の糖鎖付加部位、１７個の糖鎖付加部位、１８個の糖鎖付加部位、１９個の糖鎖付加部位、２０個の糖鎖付加部位、２１個の糖鎖付加部位、２１個の糖鎖付加部位、２２個の糖鎖付加部位、２３個の糖鎖付加部位、または２４個の糖鎖付加部位での糖鎖付加を含む。各可能性は、別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、Ｏ－結合型糖鎖付加は、各ＣＴＰユニット内に存在する利用可能なセリン（Ｓ）残基で生じる。別の実施形態では、各ＣＴＰは、４～６個のＯ－結合型グリカンを含有し、糖鎖付加は、各ＣＴＰユニット内に存在するセリン（Ｓ）残基へのものである。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１２～１８個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１２～２１個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１２～２４個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１２個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１３個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１４個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１５個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１６個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１７個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１８個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、１９個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、２０個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、２１個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、２２個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、２３個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、各ＣＴＰユニットのセリン（Ｓ）残基でのＯ－結合型糖鎖付加は、２４個のＯ－結合型糖鎖を含む。別の実施形態では、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨのｈＧＨ配列（配列番号８）上に、Ｏ－結合型糖鎖は一切存在しない。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ＣＴＰごとに少なくとも４つのＯ－グリカンを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ＣＴＰごとに少なくとも５つのＯ－グリカンを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ＣＴＰごとに少なくとも６つのＯ－グリカンを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ＣＴＰごとに少なくとも７つのＯ－グリカンを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ＣＴＰごとに少なくとも８つのＯ－グリカンを含む。当業者は、Ｏ－グリカン占有は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチド内にあるＣＴＰごと異なり得ることを理解するであろう。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰポリペプチドは、４個を超えるＯ－グリカン占有を含む少なくとも１つのＣＴＰを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰポリペプチドは、５個を超えるＯ－グリカン占有を含む少なくとも１つのＣＴＰを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰポリペプチドは、６個を超えるＯ－グリカン占有を含む少なくとも１つのＣＴＰを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰポリペプチドは、７個を超えるＯ－グリカン占有を含む少なくとも１つのＣＴＰを含む。
当業者は、「相同性」という用語が、そのアミノ酸置換、及びその生物活性ポリペプチド断片を含む、欠失、挿入、または置換変異を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、置換変異は、ｈＧＨの６５位にあるグルタミンがバリンで置換されるものである［Ｇｅｌｌｅｒｆｏｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｂｉｏｍｅｄ Ａｎａｌ １９８９，７：１７３－８３］。
一実施形態では、「ペプチド」または「ペプチド断片」は、ペプチド結合によって複数のアミノ酸が結合している化合物を含む。ここで、非アミノ酸が含有されるとき、非アミノ酸と隣接するアミノ酸との間の結合がペプチド結合ではない場合がある。しかしながら、この場合の化合物も合わせてペプチドまたはペプチド断片と称される。
当業者は、「保護ペプチド断片」という用語が、ペプチド断片の調製またはペプチド断片の縮合反応の際に望ましくない副反応をもたらし得る、ペプチド断片のアミノ酸または非アミノ酸の側鎖のヒドロキシ基、アミノ基、グアニジノ基、イミダゾリル基、インドリル基、メルカプト基、及びカルボキシル基からなる群から選択された１つ以上の反応性置換基が、保護基で保護されている、ペプチドの断片を包含し得ることを理解するであろう。以下、本明細書においてこれは「保護ペプチド断片」と省略される。
いくつかの実施形態では、ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）は、本明細書に開示される教えに従って利用される。いくつかの実施形態では、ｈＧＨタンパク質のアミノ及びカルボキシ末端の両方へのＣＴＰ配列（複数可）の接着は、増加した効能をもたらす。いくつかの実施形態では、ｈＧＨタンパク質のアミノ及びカルボキシ末端の両方へのＣＴＰ配列の接着は、延長されたインビボ活性をもたらす。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨ前駆体ポリペプチドは、配列番号４に記載される。
配列番号４：ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ。
当業者は、「ヒト成長ホルモン」（ｈＧＨ）という言い回しが、Ｇｅｎｂａｎｋアクセッション番号Ｐ０１２４１（配列番号５）に記載されるような、ｈＧＨ活性（すなわち、成長の刺激）を発現するシグナルペプチドを含む前駆体ポリペプチドを包含し得ることを理解するであろう。配列番号５： ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦ。別の実施形態では、本明細書に開示される成熟ｈＧＨは、配列番号８：ＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦに記載されるアミノ酸配列を有する。
当業者は、本明細書に開示される「ｈＧＨ」は、相同体を包含し得ることを理解するであろう。別の実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物のＧＨアミノ酸配列は、デフォルトパラメータを使用する国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のＢｌａｓｔＰソフトウェアを使用して判定された本明細書に記載されるｈＧＨ配列と少なくとも５０％相同である。別の実施形態では、相同性パーセントは６０％である。別の実施形態では、相同性パーセントは７０％である。別の実施形態では、相同性パーセントは８０％である。別の実施形態では、相同性パーセントは９０％である。別の実施形態では、相同性パーセントは９５％である。別の実施形態では、相同性パーセントは９５％超である。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの発現及び分泌に続き、シグナルペプチドは前駆体タンパク質から切断され、成熟タンパク質となる。例えば、配列番号４において、アミノ酸１～２６、ＭＡＴＧＳＲＴＳＬＬＬＡＦＧＬＬＣＬＰＷＬＱＥＧＳＡ（配列番号６）は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドのシグナルペプチドを表し、アミノ酸ＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＦＰＴＩＰＬＳＲＬＦＤＮＡＭＬＲＡＨＲＬＨＱＬＡＦＤＴＹＱＥＦＥＥＡＹＩＰＫＥＱＫＹＳＦＬＱＮＰＱＴＳＬＣＦＳＥＳＩＰＴＰＳＮＲＥＥＴＱＱＫＳＮＬＥＬＬＲＩＳＬＬＬＩＱＳＷＬＥＰＶＱＦＬＲＳＶＦＡＮＳＬＶＹＧＡＳＤＳＮＶＹＤＬＬＫＤＬＥＥＧＩＱＴＬＭＧＲＬＥＤＧＳＰＲＴＧＱＩＦＫＱＴＹＳＫＦＤＴＮＳＨＮＤＤＡＬＬＫＮＹＧＬＬＹＣＦＲＫＤＭＤＫＶＥＴＦＬＲＩＶＱＣＲＳＶＥＧＳＣＧＦＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱＳＳＳＳＫＡＰＰＰＳＬＰＳＰＳＲＬＰＧＰＳＤＴＰＩＬＰＱ（配列番号７）は、シグナルペプチドを欠損した操作された成熟ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチド（ＭＯＤ－４０２３）を表す。一実施形態では、シグナルペプチドを有しないＣＴＰ修飾ｈＧＨのアミノ酸配列は、配列番号７に記載される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨのシグナルペプチドは、配列番号６に記載される。別の実施形態では、配列番号７に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨ配列のアミノ酸２９～２１９は、ｈＧＨを表す。別の実施形態では、配列番号７に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨ配列のアミノ酸１～２８、２２０～２４７、及び２４８～２７５は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの各ＣＴＰユニット、ｈＧＨへの１つのＮ末端、及びｈＧＨへの２つのＣ末端を表す。
一実施形態では、ＭＯＤ－４０２３（配列番号７）は、２つのジスルフィド（Ｓ－Ｓ）架橋を含み、Ｓ－Ｓ架橋の両方はｈＧＨ分子内にある。別の実施形態では、１つのジスルフィド架橋は配列番号７のシステイン残基８１とシステイン残基１９３との間にあり、第２のジスルフィド架橋は配列番号７のシステイン残基２１０とシステイン残基２１７との間にある。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、筋成長を刺激するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを提供する。
一実施形態では、本明細書に開示される製造する方法は、本明細書に開示されるシグナルペプチドを欠損した成熟ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドのアミノ酸配列を生成する。別の実施形態では、本明細書に開示される製造する方法は、配列番号７に記載される成熟ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドのアミノ酸配列を生成する。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、筋成長を刺激する配列番号７に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドをコードする核酸配列の使用を含む。一実施形態では、本明細書に開示される方法は、Ｎ末端上の１つのＣＴＰアミノ酸ペプチド及びＣ末端上の２つのＣＴＰアミノ酸ペプチドを有するｈＧＨペプチドをコードする配列番号９に記載される核酸の使用を含む。配列番号９：ＡＴＧＧＣＣＡＣＣＧＧＣＡＧＣＡＧＧＡＣＣＡＧＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＧＣＣＴＴＣＧＧＣＣＴＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＣＡＴＧＧＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＧＣＣＡＧＣＴＣＴＴＣＴＴＣＴＡＡＧＧＣＴＣＣＡＣＣＣＣＣＡＴＣＴＣＴＧＣＣＣＡＧＣＣＣＣＡＧＣＡＧＡＣＴＧＣＣＧＧＧＣＣＣＣＡＧＣＧＡＣＡＣＡＣＣＣＡＴＴＣＴＧＣＣＣＣＡＧＴＴＣＣＣＣＡＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＧＡＧＣＡＧＧＣＴＧＴＴＣＧＡＣＡＡＣＧＣＣＡＴＧＣＴＧＡＧＧＧＣＴＣＡＣＡＧＧＣＴＧＣＡＣＣＡＧＣＴＧＧＣＣＴＴＴＧＡＣＡＣＣＴＡＣＣＡＧＧＡＧＴＴＣＧＡＧＧＡＡＧＣＣＴＡＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＡＧＣＡＧＡＡＧＴＡＣＡＧＣＴＴＣＣＴＧＣＡＧＡＡＣＣＣＣＣＡＧＡＣＣＴＣＣＣＴＧＴＧＣＴＴＣＡＧＣＧＡＧＡＧＣＡＴＣＣＣＣＡＣＣＣＣＣＡＧＣＡＡＣＡＧＡＧＡＧＧＡＧＡＣＣＣＡＧＣＡＧＡＡＧＡＧＣＡＡＣＣＴＧＧＡＧＣＴＧＣＴＧＡＧＧＡＴＣＴＣＣＣＴＧＣＴＧＣＴＧＡＴＣＣＡＧＡＧＣＴＧＧＣＴＧＧＡＧＣＣＣＧＴＧＣＡＧＴＴＣＣＴＧＡＧＡＡＧＣＧＴＧＴＴＣＧＣＣＡＡＣＡＧＣＣＴＧＧＴＧＴＡＣＧＧＣＧＣＣＡＧＣＧＡＣＡＧＣＡＡＣＧＴＧＴＡＣＧＡＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＧＣＡＴＣＣＡＧＡＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧＣＣＧＧＣＴＧＧＡＧＧＡＣＧＧＣＡＧＣＣＣＣＡＧＧＡＣＣＧＧＣＣＡＧＡＴＣＴＴＣＡＡＧＣＡＧＡＣＣＴＡＣＡＧＣＡＡＧＴＴＣＧＡＣＡＣＣＡＡＣＡＧＣＣＡＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＣＣＣＴＧＣＴＧＡＡＧＡＡＣＴＡＣＧＧＧＣＴＧＣＴＧＴＡＣＴＧＣＴＴＣＡＧＡＡＡＧＧＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＧＧＴＧＧＡＧＡＣＣＴＴＣＣＴＧＡＧＧＡＴＣＧＴＧＣＡＧＴＧＣＡＧＡＡＧＣＧＴＧＧＡＧＧＧＣＡＧＣＴＧＣＧＧＣＴＴＣＡＧＣＴＣＣＡＧＣＡＧＣＡＡＧＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＣＧＡＧＣＣＴＧＣＣＣＴＣＣＣＣＡＡＧＣＡＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＧＣＣＣＴＣＣＧＡＣＡＣＡＣＣＡＡＴＣＣＴＧＣＣＡＣＡＧＡＧＣＡＧＣＴＣＣＴＣＴＡＡＧＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＴＣＣＣＴＧＣＣＡＴＣＣＣＣＣＴＣＣＣＧＧＣＴＧＣＣＴＧＧＣＣＣＣＴＣＴＧＡＣＡＣＣＣＣＴＡＴＣＣＴＧＣＣＴＣＡＧ。
一実施形態では、本方法は、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨをコードするコード部分を含む核酸配列の使用を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、配列番号９に記載される核酸配列の使用を含む。当業者は、核酸配列が、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨをコードするコード部分を含む発現ベクターの一部であり得ることを理解するであろう。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、参照によって本明細書に組み込まれる米国特許第８，９４６，１５５号に提供されるような数々の適応症における治療用途のためのＣＴＰ修飾ｈＧＨペプチドをコードする核酸配列を提供する。更に、かかるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、米国特許出願公開第ＵＳ－２０１４－０１１３８６０－Ａ１号、米国特許第８，４５０，２６９号、及び米国特許第８，３０４，３８６号に十分に記載され、これらは全て、その全体が参照によって本明細書に組み込まれている。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、ポリペプチドが可溶形態であることを要する治療において利用される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、標準固相法を使用して生化学的に合成される。いくつかの実施形態では、これらの生化学的製造方法は、排他的固相合成、部分的固相合成、断片縮合、または古典的溶液合成を含む。いくつかの実施形態では、これらの方法は、ポリペプチドが比較的短い（約５～１５ｋＤａ）場合、及び／またはそれを組み換え技術によって生成できない（すなわち、核酸配列によってコードされていない）場合に使用され、したがって、異なる化学を要する。
いくつかの実施形態では、固相ポリペプチド合成手順は、当業者に公知であり、Ｊｏｈｎ Ｍｏｒｒｏｗ Ｓｔｅｗａｒｔ ａｎｄ Ｊａｎｉｓ Ｄｉｌｌａｈａ Ｙｏｕｎｇ，Ｓｏｌｉｄ Ｐｈａｓｅ Ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｅｓ（２ｎｄ Ｅｄ．，Ｐｉｅｒｃｅ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ，１９８４）に更に記載される。いくつかの実施形態では、合成ポリペプチドは、分取高速液体クロマトグラフィーによって精製され［Ｃｒｅｉｇｈｔｏｎ Ｔ．（１９８３）Ｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ ａｎｄ ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ． ＷＨ Ｆｒｅｅｍａｎ ａｎｄ Ｃｏ． Ｎ．Ｙ．］、その組成物は、当業者に既知である方法によってアミノ酸配列を介して確認することができる。
いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質技術を使用して、本明細書に開示されるポリペプチドを生成する。いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質技術を使用して、比較的長いポリペプチド（例えば、１８～２５個のアミノ酸よりも長い）を生成する。いくつかの実施形態では、組み換えタンパク質技術を使用して、本明細書に開示されるポリペプチドを大量に生成する。いくつかの実施形態では、組み換え技術は、Ｂｉｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１５３：５１６－５４４、Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９０）Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１８５：６０－８９、Ｂｒｉｓｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９８４）Ｎａｔｕｒｅ ３１０：５１１－５１４、Ｔａｋａｍａｔｓｕ ｅｔ ａｌ．（１９８７）ＥＭＢＯ Ｊ． ６：３０７－３１１、Ｃｏｒｕｚｚｉ ｅｔ ａｌ．（１９８４）ＥＭＢＯ Ｊ． ３：１６７１－１６８０、及びＢｒｏｇｌｉ ｅｔ ａｌ，（１９８４）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２４：８３８－８４３、Ｇｕｒｌｅｙ ｅｔ ａｌ．（１９８６）Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．６：５５９－５６５、及びＷｅｉｓｓｂａｃｈ ＆ Ｗｅｉｓｓｂａｃｈ，１９８８，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｐｌａｎｔ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ，Ｓｅｃｔｉｏｎ ＶＩＩＩ，ｐｐ４２１－４６３に記載される。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを使用して合成される。いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、シス調節配列（例えば、プロモーター配列）の転写制御を含む発現ベクターに連結される。いくつかの実施形態では、シス調節配列は、本明細書に開示されるポリペプチドの構成的発現を指示するのに好適である。いくつかの実施形態では、シス調節配列は、本明細書に開示されるポリペプチドの組織特異的発現を指示するのに好適である。いくつかの実施形態では、シス調節配列は、本明細書に開示されるポリペプチドの誘導発現を指示するのに好適である。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドを発現するポリヌクレオチドは、配列番号９に記載されるヌクレオチド配列を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチド配列と併せた使用に好適な組織特異的プロモーターは、特定の細胞集団において機能的である配列を含み、例としては、肝臓特異的であるアルブミン［Ｐｉｎｋｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ． １：２６８－２７７］、リンパ球特異的なプロモーター［Ｃａｌａｍｅ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ａｄｖ． Ｉｍｍｕｎｏｌ． ４３：２３５－２７５］；特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター［Ｗｉｎｏｔｏ ｅｔ ａｌ．，（１９８９）ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９－７３３］及び免疫グロブリン；［Ｂａｎｅｒｊｉ ｅｔ ａｌ．（１９８３）Ｃｅｌｌ ３３７２９－７４０］、神経特異的なプロモーター、例えば神経フィラメントプロモーター［Ｂｙｒｎｅ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． ＵＳＡ ８６：５４７３－５４７７］、膵臓特異的なプロモーター［Ｅｄｌｕｎｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２－９１６］、または乳腺特異的なプロモーター、例えば乳清プロモーター（米国特許第４，８７３，３１６号及び欧州出願公開第２６４，１６６号）が挙げられるが、これらに限定されない。本明細書に開示される方法での使用に好適な誘導プロモーターとしては、例えば、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｓｒｏｕｒ，Ｍ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，２００３． Ｔｈｒｏｍｂ． Ｈａｅｍｏｓｔ． ９０： ３９８－４０５）が挙げられる。
当業者は、「ポリヌクレオチド」という言い回しが、単離され、ＲＮＡ配列、相補的ポリヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ）、ゲノムポリヌクレオチド配列、及び／または複合ポリヌクレオチド配列（例えば、上記の組み合わせ）の形態で提供される一本鎖または二本鎖核酸配列を包含し得ることを理解するであろう。
当業者は、「相補的ポリヌクレオチド配列」という言い回しが、逆転写酵素または任意の他のＲＮＡ依存性ＤＮＡポリメラーゼを使用したメッセンジャーＲＮＡの逆転写から生じる配列を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、配列はその後、ＤＮＡポリメラーゼを使用してインビボまたはインビトロで増幅され得る。
当業者は、「ゲノムポリヌクレオチド配列」は、染色体に由来する（単離された）配列を包含し得、よって、それは染色体の隣接部分を表すことを理解するであろう。
当業者は、「複合ポリヌクレオチド配列」という言い回しが、少なくとも部分的に相補的であり、かつ少なくとも部分的にゲノムである配列を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、複合配列は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするために必要とされるいくつかのエクソン配列、ならびにその間に挟まれたいくつかのイントロン配列を含んでもよい。一実施形態では、イントロン配列は、他の遺伝子を含む任意の源のものであってもよく、典型的には、保存スプライシングシグナル配列を含むことになる。一実施形態では、イントロン配列は、シス活性発現調節エレメントを含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、本明細書に開示されるポリペプチドの分泌のためのシグナルペプチドをコードするシグナル配列を更に含む。いくつかの実施形態では、シグナル配列には、配列番号６に記載されるｈＧＨの内在性シグナル配列が含まれるが、これに限定されない。別の実施形態では、シグナル配列は、Ｎ末端からＣＴＰ配列への配列であり、転じてＮ末端から目的のポリペプチド配列への配列であり、例えば、配列は（ａ）シグナル配列－（ｂ）ＣＴＰ－（ｃ）目的の配列－（ｄ）任意で１つ以上の追加のＣＴＰ配列である。別の実施形態では、１つ以上のＣＴＰ配列は、目的のポリペプチド配列のシグナル配列と目的のポリペプチドそのものとの間に挿入され、それにより目的の野生型配列を遮断する。
別の実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチド及びその生成方法は、配列番号７に記載される、シグナルペプチドを欠損した成熟ＣＴＰ修飾ＧＨを提供する。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、ＰＣＲ技術、または当業者に既知である任意の他の方法もしくは手順を使用して調製される。いくつかの実施形態では、手順は、２つの異なるＤＮＡ配列の連結を伴う（例えば、「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ」，ｅｄｓ． Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，１９９２を参照されたい）。
生物活性及び用途
一実施形態では、対象へのＧＨの投薬回数を低減する方法であって、ｈＧＨと、該ＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、該ＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰと、からなるポリペプチドの治療有効量を該対象に投与することを含み、該ポリペプチドはシグナルペプチドを欠損しており、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、それにより対象へのＧＨの投薬回数を低減する方法が本明細書に開示される。
別の実施形態では、対象へのＧＨの曲線下面積（ＡＵＣ）を向上させる方法であって、ｈＧＨと、該ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、該ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰと、からなるポリペプチドの治療有効量を該対象に投与することを含み、該ポリペプチドはシグナルペプチドを欠損しており、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、それにより対象へのＧＨの曲線下面積（ＡＵＣ）を向上させる方法が本明細書に開示される。
一実施形態では、ＧＨ治療を必要とする対象を治療する方法であって、ｈＧＨと、該ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、該ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰと、からなるポリペプチドの治療有効量を該対象に投与することを含み、該ポリペプチドはシグナルペプチドを欠損しており、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、それにより治療においてＧＨを必要とする該対象を治療する方法が本明細書に開示される。
別の実施形態では、対象のインスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）レベルを増加させる方法であって、ｈＧＨと、該ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、該ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰと、からなるポリペプチドの治療有効量を該対象に投与することを含み、該ポリペプチドはシグナルペプチドを欠損しており、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、それにより対象のインスリン様成長因子（ＩＧＦ－１）レベルを増加させる方法が本明細書に開示される。
別の実施形態では、対象のインスリン様成長因子（ＩＧＦ－Ｉ）レベルを維持する方法であって、ｈＧＨと、該ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、該ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰと、からなるポリペプチドの治療有効量を該対象に投与することを含み、該ポリペプチドはシグナルペプチドを欠損しており、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、それにより対象のインスリン様成長因子（ＩＧＦ－Ｉ）レベルを維持する方法が本明細書に開示される。別の実施形態では、ＩＧＦ－Ｉは、本明細書に更に開示されるように、規定された範囲内に保持される。
別の実施形態では、対象のインスリン様成長因子（ＩＧＦ－Ｉ）レベルを増加及び維持する方法であって、ｈＧＨと、該ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、該ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンＣＴＰと、からなるポリペプチドの治療有効量を該対象に投与することを含み、該ポリペプチドはシグナルペプチドを欠損しており、該ポリペプチドのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、それにより対象のインスリン様成長因子（ＩＧＦ－Ｉ）レベルを規定された範囲内で増加及び維持する方法が本明細書に開示される。
別の実施形態では、規定された範囲は、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨの投与によって達成される治療用量範囲である。別の実施形態では、規定された範囲は、ＩＧＦ－Ｉの類洞作用のＣｍａｘ及びＣｔｒｏｕｇｈが、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨの連続投与後に維持されるものである。別の実施形態では、規定された範囲は、対象における優れた応答性及び最小限の用量変更の必要性を伴う、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨの連続投与のための治療用量範囲である。別の実施形態では、規定された範囲は、正常と考えられる個体中のＩＧＦ－Ｉレベルと同等である。別の実施形態では、規定された範囲は、正常な固体中のＩＧＦ－Ｉレベル／値の正常範囲である。なお別の実施形態では、規定された範囲は、ＩＧＦ－Ｉ ＳＤＳ値が±２ＳＤＳである場合の正常範囲内である。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、骨成長を刺激する本明細書に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを提供する。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、骨成長を刺激する本明細書に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドをコードする核酸配列を提供する。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨは、未修飾ＧＨと同じ様式で使用される。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨは、増加した循環半減期及び血漿滞留時間、減少したクリアランス、ならびにインビボでの増加した臨床活動を有する。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨの向上した特性に起因して、このコンジュゲートは、未修飾ＧＨよりも少ない頻度で投与される。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰ修飾ＧＨは、１週間に１回から２週間ごとに１回、投与される。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰ修飾ＧＨは、２週間ごとに１回から３週間ごとに１回、投与される。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰ修飾ＧＨは、１日１回から１週間に３回、投与される。別の実施形態では、投与頻度の減少は患者によるコンプライアンスの向上をもたらし、治療成果の向上、ならびに患者の生活の質の向上につながる。別の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）に結合した従来のＧＨのコンジュゲートと比較して、本明細書に開示されるコンジュゲートの分子量及びリンカー構造を有するＧＨ ＣＴＰコンジュゲートは、向上した効能、向上した安定性、上昇したＡＵＣレベル、向上した循環半減期を有することが発見された。別の実施形態では、ポリ（エチレングリコール）に結合した従来のＧＨのコンジュゲートと比較して、本明細書に開示されるコンジュゲートの分子量及びリンカー構造を有するＧＨは、向上した効能、向上した安定性、上昇したＡＵＣレベル、向上した循環半減期を有することが発見された。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの治療有効量は、インビボでの測定可能な予期される生物活性のために必要なコンジュゲートの量である。別の実施形態では、本明細書に開示される教えに従って利用されるＧＨは、増加した効能を示す。いくつかの実施形態では、ＧＨのアミノ及びカルボキシ末端の両方へのＣＴＰ配列の接着は、延長されたインビボ活性をもたらす。
別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの治療有効量は、治療される病気の厳密な種類、治療される患者の容態、ならびに組成物中の他の成分等の要因によって決定される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり０．０１～１０μｇである。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり０．１～１μｇである。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり１μｇ～体重ｋｇ当たり１ｍｇである。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり１ｍｇである。別の実施形態では、成人成長ホルモン分泌不全患者へのＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む治療有効量は、１週間に１回投与される、１ｍｇ～１５ｍｇである。別の実施形態では、成人成長ホルモン分泌不全患者へのＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む治療有効量は、１週間に１回投与される、１ｍｇ超である。別の実施形態では、小児性成長ホルモン分泌不全患者へのＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり１μｇ～１ｍｇ／体重ｋｇの間である。別の実施形態では、小児性成長ホルモン分泌不全患者へのＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり６００μｇまでである。別の実施形態では、小児性成長ホルモン分泌不全患者へのＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり７００μｇまでである。別の実施形態では、小児性成長ホルモン分泌不全患者へのＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む治療有効量は、１週間に１回投与される、体重ｋｇ当たり約６００μｇ～７００μｇの間である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む薬学的組成物は、ヒトの患者への様々な手段での投与において有効な強さで調製される。
一実施形態では、本明細書に開示される方法、ポリヌクレオチド、及びポリペプチドは、獣医学において用いられる。一実施形態では、ヒトのコンパニオンとして養われる（例えば、イヌ、ネコ、ウマ）、著しい商品価値を有する（例えば、乳牛、肉牛、競技動物）、著しい科学的価値を有する（例えば、絶滅危惧種の捕らわれているもしくは自由な種）、または他の様式で価値を有する飼育哺乳動物の治療が本明細書に開示される。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドまたはポリヌクレオチドは、動物（例えば、マウス、ラット、ウサギ、ハムスター、モルモット、ブタ、超小型ブタ、ニワトリ、ラクダ、ヤギ、ウマ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、非ヒト霊長類、及びヒト）に投与される。一実施形態では、引用される用途は、幅広く多様な宿主において使用できる。いくつかの実施形態では、かかる宿主には、ヒト、マウス（ｍｕｒｉｎｅ）、ウサギ、ヤギ、モルモット、ラクダ、ウマ、マウス（ｍｏｕｓｅ）、ラット、ハムスター、ブタ、超小型ブタ、ニワトリ、ヤギ、ウシ、ヒツジ、イヌ、ネコ、または非ヒト霊長類が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、家畜は、本明細書に開示される方法で治療される。一実施形態では、家畜には、ブタ、肉牛、乳牛、ウマ、ヤギ、ヒツジ、ニワトリ、シチメンチョウ、ガン、アヒル、及び近縁種が含まれる。一実施形態では、実験動物は、本明細書に開示される方法で治療される。一実施形態では、実験動物には、ラット、マウス、モルモット、ウサギ、ヤギ、サル、イヌ、ネコ、及びその他が含まれる。一実施形態では、動物園の動物は、本明細書に開示される方法で治療される。一実施形態では、動物園の動物には、動物園で飼育される全ての脊椎動物が含まれる。一実施形態では、水生動物は、本明細書に開示される方法で治療される。一実施形態では、水生動物には、サカナ、ウナギ、カメ、アザラシ、ペンギン、サメ、クジラ、及び近縁種が含まれる。一実施形態では、飼育動物は、本明細書に開示される方法で治療される。一実施形態では、飼育動物には、ネコ及びイヌ等の任意のペット、またはヒトに飼育される動物、例えば、ウマ、ウシ、ブタ、ヤギ、ウサギ、ニワトリ、シチメンチョウ、ガン、アヒル等が含まれる。
当業者は、「ブタ」という用語が、ブタ、子ブタ、食肉用ブタ、未経産ブタ、去勢ブタ、種ブタ、及び養殖ブタを含むことを理解するであろう。同様に、当業者は、「ウシ」という用語が、子ウシ、ウシ、乳牛、未経産ウシ、去勢ウシ、及び雄ウシを包含することを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、ＣＴＰ配列修飾は、より低い投与量の使用を可能にする点で有利である。
製造
一実施形態では、ヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを製造する方法であって、（ａ）所定の数の細胞に、該ＣＴＰ修飾（ｈＧＨ）をコードするコード部分を含む発現ベクターを安定してトランスフェクトするステップであって、該トランスフェクトされた細胞は、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを発現及び分泌する、トランスフェクトするステップと、（ｂ）該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを過剰発現する細胞クローンを取得するステップと、（ｃ）該クローンを溶液中で所定の規模まで増殖させるステップと、（ｄ）該クローンを含有する該溶液を収集するステップと、（ｅ）該クローンを含有する該溶液を濾過して、浄化された収集溶液を取得するステップと、（ｆ）該浄化された収集溶液を精製して、所望の濃度のＣＴＰ修飾ｈＧＨを有する精製されたタンパク質溶液を取得するステップと、を含み、製造されたＣＴＰ修飾ｈＧＨのアミノ酸配列は配列番号７に記載され、それによりヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを製造する方法が本明細書に開示される。代替的な実施形態では、ステップ（ｅ）で、細胞及び破片が遠心分離によって除去される。ＣＴＰ修飾ｈＧＨの製造において、トランスフェクションは初期段階で行われる。別の実施形態では、製造する方法は、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを発現及び分泌するクローンを含む。最終高発現クローンが選択されると、各生成は、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の解凍、増殖、収集、及び精製を含む（例：収集を通したクローン増殖を説明する図３のステップ１～８；精製を説明する図４のステップ８～１６を参照されたい）。代替的な実施形態では、最終高発現クローンが選択されると、各生成は、マスターセルバンク（ＭＣＢ）の解凍、増殖、収集、及び精製を含む（例：収集を通したクローン増殖を説明する図３のステップ１～８；精製を説明する図４のステップ８～１６を参照されたい）。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドは、組み換えポリペプチドの発現を可能にするために発現ベクター（すなわち、核酸構築物）に挿入される。一実施形態では、本明細書に開示される発現ベクターは、このベクターを、原核生物における複製及び組み込みのために好適にする追加の配列を含む。一実施形態では、本明細書に開示される発現ベクターは、このベクターを、真核生物における複製及び組み込みのために好適にする追加の配列を含む。一実施形態では、本明細書に開示される発現ベクターは、このベクターを、原核生物及び真核生物の両方において複製及び組み込みのために好適にするシャトルベクターを含む。いくつかの実施形態では、クローニングベクターは、転写及び翻訳開始配列（例えば、プロモーター、エンハンサー）、ならびに転写及び翻訳ターミネーター（例えば、ポリアデニル化シグナル）を含む。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾ポリペプチド、例えばＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造する方法は、発現ベクターの使用を含むステップを含み、該発現ベクターは、プロモーターと、ＣＴＰ修飾ポリペプチドのためのコード配列と、ポリアデニル化配列とを含む。別の実施形態では、コード配列は、配列番号９に記載される。別の実施形態では、ポリアデニル化配列は、シミアンウイルス（ＳＶ）４０ポリアデニル化配列である。
一実施形態では、多様な真核細胞が、本明細書に開示されるポリペプチドを発現するための宿主発現系として使用され得る。いくつかの実施形態では、これらには、微生物、例えば、ポリペプチドコード配列を含有する組み換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母；組み換えウイルス発現ベクター（例えば、カリフラワーモザイクウイルス、ＣａＭＶ；タバコモザイクウイルス、ＴＭＶ）に感染したか、またはポリペプチドコード配列を含有するＴｉプラスミド等の組み換えプラスミドベクターで形質転換された植物細胞系が含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドを発現するために、非細菌発現系（例えば、ＣＨＯ細胞またはＣＨＯ細胞に由来する細胞等の哺乳動物発現系）が使用される。一実施形態では、本明細書に開示されるポリヌクレオチドを哺乳動物細胞内で発現するために使用される発現ベクターは、ＣＭＶプロモーター及びネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＣＩ－ＤＨＦＲベクターである。別の実施形態では、細胞は、付着性細胞培養として増殖される。別の実施形態では、懸濁培養液中で増殖される。
一実施形態では、本明細書に開示される発現ベクターは、例えば、配列内リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）等の単一のｍＲＮＡからのいくつかのタンパク質の翻訳を可能にする追加のポリヌクレオチド配列、及びプロモーター－キメラポリペプチドのゲノム組み込みのための配列を更に含む。
いくつかの実施形態では、哺乳動物発現ベクターには、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎから入手可能なｐｃＤＮＡ３、ｐｃＤＮＡ３．１（＋／－）、ｐＧＬ３、ｐＺｅｏＳＶ２（＋／－）、ｐＳｅｃＴａｇ２、ｐＤｉｓｐｌａｙ、ｐＥＦ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＭＶ／ｍｙｃ／ｃｙｔｏ、ｐＣＲ３．１、ｐＳｉｎＲｅｐ５、ＤＨ２６Ｓ、ＤＨＢＢ、ｐＮＭＴ１、ｐＮＭＴ４１、ｐＮＭＴ８１、Ｐｒｏｍｅｇａから入手可能なｐＣＩ、Ｓｔｒａｔｅｇｅｎｅから入手可能なｐＭｂａｃ、ｐＰｂａｃ、ｐＢＫ－ＲＳＶ、及びｐＢＫ－ＣＭＶ、Ｃｌｏｎｔｅｃｈから入手可能なｐＴＲＥＳ、ならびにこれらの誘導体が含まれるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、レトロウイルス等の真核ウイルス由来の調節エレメントを含有する発現ベクターは、本明細書に開示されるベクター中に発見され得る。ＳＶ４０ベクターには、ｐＳＶＴ７及びｐＭＴ２が含まれる。いくつかの実施形態では、ウシパピローマウイルスに由来するベクターにはｐＢＶ－１ＭＴＨＡが含まれ、エプスタインバーウイルスに由来するベクターにはｐＨＥＢＯ及びｐ２Ｏ５が含まれる。他の代表的な例としては、ｐＭＳＧ、ｐＡＶ００９／Ａ＋、ｐＭＴＯ１０／Ａ＋、ｐＭＡＭｎｅｏ－５、バキュロウイルスｐＤＳＶＥ、及びＳＶ－４０初期プロモーター、ＳＶ－４０後期プロモーター、メタロチオネインプロモーター、マウス乳がんウイルスプロモーター、ラウス肉腫ウイルスプロモーター、ポリヘドリンプロモーター、または真核細胞での発現に有効であることが示される他のプロモーターの指示下でのタンパク質の発現を可能にする任意の他のベクターが挙げられる。
一実施形態では、様々な方法を使用して、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨをコードする発現ベクターを細胞内に導入することができる。遺伝子組み換えされた細胞またはトランスジェニック細胞をもたらす、ポリヌクレオチドまたは発現ベクターを有する真核宿主細胞の「トランスフェクション」は、当該技術分野で公知であり、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇｓ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８９，１９９２）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｍｄ． （１９８９）、Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｏｍａｔｉｃ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ，Ｍｉｃｈ． （１９９５）、Ｖｅｇａ ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｅ Ｔａｒｇｅｔｉｎｇ，ＣＲＣ Ｐｒｅｓｓ，Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ Ｍｉｃｈ． （１９９５）、Ｖｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｓｕｒｖｅｙ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｖｅｃｔｏｒｓ ａｎｄ Ｔｈｅｉｒ Ｕｓｅｓ，Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈｓ，Ｂｏｓｔｏｎ Ｍａｓｓ． （１９８８）、及びＧｉｌｂｏａ ｅｔ ａｔ． ［Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ４（６）：５０４－５１２，１９８６］に記載される任意の方法で実施することができ、これには、例えば、安定または一過性トランスフェクション、及びエレクトロポレーションが含まれる。更に、正負選択法について、米国特許第５，４６４，７６４号及び同第５，４８７，９９２号を参照されたい。トランスフェクション方法としては、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ポリカチオン（ＤＥＡＥ－デキストラン等）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、ウイルス感染（組み換えウイルス感染を含む）、及びマイクロインジェクションが挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、トランスフェクションは安定トランスフェクションである。最適のトランスフェクション頻度、及び本明細書に開示される目的のペプチドをコードする異種遺伝子の特定の宿主細胞株及びタイプにおける発現を提供するトランスフェクション方法が推奨される。好適な方法は、常法により決定され得る。安定トランスフェクトについて、構築物は、宿主細胞のゲノムもしくは人工染色体／ミニ染色体中に組み込まれるか、または宿主細胞中に安定して維持されるようにエピソーム的に位置付けられる。
本明細書に開示される方法は、別途指示がない限り、細胞生物学、分子生物学、細胞培養、免疫学、及び当該技術分野における同様のものの従来の技術を用いる。これらの技術は、最新の文献に十分に開示されている。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ Ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ． （１９８９）、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（１９８７，ｕｐｄａｔｅｄ）；Ｂｒｏｗｎ ｅｄ．，Ｅｓｓｅｎｔｉａｌ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｇｏｅｄｄｅｌ ｅｄ．，Ｇｅｎｅ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｂｏｔｈｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ ａｎｄ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ Ｅｕｋａｒｙｏｔｉｃ Ｇｅｎｅｓ，Ｂａｒｔｌｅｔｔ Ｐｕｂｌ． （１９９０）、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ＤＮＡ Ｍｅｔｈｏｄｏｌｏｇｙ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，Ｓｔｏｃｋｔｏｎ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、ＭｃＰｈｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，ＰＣＲ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９１）、Ｇａｉｔ ｅｄ．，Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（１９８４）、Ｍｉｌｌｅｒ＆Ｃａｌｏｓ ｅｄｓ．，Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（１９８７）、Ｂｕｔｌｅｒ ｅｄ．，Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（１９９１）、Ｐｏｌｌａｒｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ（１９９０）、Ｆｒｅｓｈｎｅｙ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌｓ，Ａｌａｎ Ｒ． Ｌｉｓｓ（１９８７）、Ｓｔｕｄｚｉｎｓｋｉ，ｅｄ．，Ｃｅｌｌ Ｇｒｏｗｔｈ ａｎｄ Ａｐｏｐｔｏｓｉｓ，Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ ａｔ Ｏｘｆｏｒｄ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｐｒｅｓｓ（１９９５）、Ｍｅｌａｍｅｄ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ｆｌｏｗ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ ａｎｄ Ｓｏｒｔｉｎｇ，Ｗｉｌｅｙ－Ｌｉｓｓ（１９９０）、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ，Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ． （ｕｐｄａｔｅｄ）、Ｗｉｒｔｈ＆Ｈａｕｓｅｒ，Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ Ａｎｉｍａｌｓ Ｃｅｌｌｓ，ｉｎ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ． ２，Ｐｕｈｌｅｒ ｅｄ．，ＶＣＨ，Ｗｅｉｎｈｅｉｍ ６６３－７４４、ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｏｆ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）、及びＨａｒｌｏｗ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（１９８７）を参照されたい。
本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨをコードする目的の異種遺伝子は、様々な方法によって、例えばウイルス形質転換によって本明細書に開示される細胞内に導入されてもよい。目的の異種遺伝子は、直鎖状ＤＮＡとして、または発現ベクターの一部として細胞内に導入されてもよい。１つ以上の異種遺伝子の挿入及びそれらの発現のための複数のクローニング部位を提供する多くの真核発現ベクターが既知である。商業用供給業者としては、数ある中で、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ、Ｐｒｏｍｅｇａ，Ｍａｄｉｓｏｎ，Ｗｉｓ．，ＵＳＡ、またはＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡが挙げられる。ＤＮＡ、または目的の１つ以上の遺伝子をコードする発現ベクターでの細胞のトランスフェクションは、例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９またはＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９４に記載されるような従来の方法によって行われる。トランスフェクションの好適な方法としては、例えば、リポソーム媒介性トランスフェクション、リン酸カルシウム共沈、エレクトロポレーション、ポリカチオン（例えば、ＤＥＡＥデキストラン）媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、及びウイルス感染が挙げられる。好ましくは、安定トランスフェクションは、ＤＮＡ分子が、宿主細胞のゲノムもしくは人口染色体／ミニ染色体中に組み込まれるか、または宿主細胞中に安定した様式でエピソーム的に含有されている中で行われる。最適のトランスフェクション頻度、及び当の宿主細胞株における目的の１つ以上の異種遺伝子の発現を提供するトランスフェクション方法が好ましい。一実施形態では、目的の遺伝子は、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ＧＨをコードする。
いくつかの実施形態では、ウイルスの感染性の性質に起因してより高いトランスフェクション効率が得られるため、ウイルス感染による核酸の導入はリポフェクション及びエレクトロポレーション等の他の方法に対するいくつかの利点を提供する。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドはまた、上述の任意の好適な投与法（すなわち、インビボでの遺伝子療法）を用いて個体に投与された核酸構築物から発現され得ることも理解されるであろう。一実施形態では、核酸構築物は、適切な遺伝子送達ビヒクル／方法（トランスフェクション、形質導入、異種組み換え等）、及び必要に応じて発現系を介して好適な細胞内に導入され、次いで、修飾された細胞は、培養中で増殖され、個体に戻される（すなわち、エクスビボでの遺伝子療法）。
目的の異種遺伝子は、通常、目的の遺伝子の転写を可能にするプロモーター、及び目的の遺伝子の転写及び翻訳（発現）を可能にするか、またはその効率を増加させる他の調節エレメントに機能的に結合する。
当業者は、「プロモーター」という用語が、それに機能的に結合した遺伝子または配列の転写を可能にし、かつ制御するポリヌクレオチド配列を包含し得ることを理解するであろう。プロモーターは、ＲＮＡポリメラーゼを結合するための認識配列、及び転写のための開始部位（転写開始部位）を含有する。特定の細胞タイプまたは宿主細胞中で所望の配列を発現するために、好適な機能性プロモーターが選択されなければならない。当業者は、構成型、誘導性、及び抑制性プロモーターを含む、様々な源からの多様なプロモーターを知っているであろう。これらは、例えばＧｅｎＢａｎｋ等のデータバンクにデポジットされ、別個のエレメント、または市販の源もしくは個体源由来のポリヌクレオチド配列内でクローニングされたエレメントとして取得され得る。誘導性プロモーターについて、プロモーターの活性は、シグナルへの応答において低減されるか、または増加され得る。誘導性プロモーターの一例は、テトラサイクリン（ｔｅｔ）プロモーターである。これは、テトラサイクリン調節性トランスアクティベータータンパク質（ｔＴＡ）によって誘導され得るテトラサイクリンオペレーター配列（ｔｅｔＯ）を含有する。テトラサイクリンの存在下で、ｔＴＡのｔｅｔＯへの結合は阻害される。他の誘導性プロモーターの例は、ｊｕｎ、ｆｏｓ、メタロチオネイン、及びヒートショックプロモーターである（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．，Ｆｒｉｔｓｃｈ，Ｅ．Ｆ．＆Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９、Ｇｏｓｓｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ １９９４，５，５１６－５２０も参照されたい）。真核生物における高発現のために特に好適であるプロモーターのうち、例えば、ハムスターのユビキチン／Ｓ２７ａプロモーター（ＷＯ ９７／１５６６４）、ＳＶ４０初期プロモーター、アデノウイルス腫瘍後期プロモーター、マウスメタロチオネイン－１プロモーター、ウス肉腫ウイルスの末端反復配列領域、及びヒトサイトメガロウイルスがある。他の異種哺乳動物プロモーターの例は、アクチン、免疫グロブリン、またはヒートショックプロモーター（複数可）である。
例えば、プロモーターは、転写活性を増加させるためにエンハンサー配列に機能的に結合し得る。このために１つ以上のエンハンサー及び／またはエンハンサー配列のいくつかのコピー、例えばＣＭＶまたはＳＶ４０エンハンサーが使用され得る。例えば、プロモーターは、転写活性を増加させるためにエンハンサー配列に機能的に結合し得る。このために１つ以上のエンハンサー及び／またはエンハンサー配列のいくつかのコピー、例えばＣＭＶまたはＳＶ４０エンハンサーが使用され得る。
当業者は、「エンハンサー」という用語が、シス位置でプロモーターの活性上で作用し、それによりこのプロモーターに機能的に接続する遺伝子の転写を刺激するポリヌクレオチド配列を意味することを理解するであろう。プロモーターとは異なり、エンハンサーの効果は位置及び配置と無関係であり、したがって、これらは、転写ユニットの前もしくはその後ろ、イントロン内、また更にはコード領域内に位置付けられてもよい。エンハンサーは、転写ユニットの直近、及びプロモーターからかなりの距離を置いた位置の両方に位置付けられ得る。プロモーターと物理的及び機能的重複を有することも可能である。当業者は、独立したエレメント、またはポリヌクレオチド配列内でクローニングされたエレメント（例えば、ＡＴＣＣでデポジットされるか、または市販の源もしくは個体源由来）として入手可能な、様々な源からの多くのエンハンサー（かつＧｅｎＢａｎｋ等のデータバンクにデポジットされている、例えば、ＳＶ４０エンハンサー、ＣＭＶエンハンサー、ポリオーマエンハンサー、アデノウイルスエンハンサー）を知っているであろう。多くのプロモーター配列はまた、頻用のＣＭＶプロモーター等のエンハンサー配列も含有する。ヒトＣＭＶエンハンサーは、今のところ特定されている最も強いエンハンサーのうちの１つである。誘導性エンハンサーの一例は、グルココルチコイドまたは重金属によって刺激され得るメタロチオネインエンハンサーである。
基本的に、調節エレメントには、プロモーター、エンハンサー、ポリアデニル化シグナルの終結、及び他の発現制御エレメントが含まれる。誘導性及び構造型の両方の調節配列が、様々な細胞タイプについて既知である。「転写調節エレメント」は、一般に、発現される遺伝子配列の上流のプロモーターと、転写開始及び終結部位と、ポリアデニル化シグナルと、を含む。
当業者は、「転写開始部位」という用語が、一次転写物、すなわちｍＲＮＡ前駆体に組み込まれる第１の核酸に対応する、構築物中の核酸を包含し得ることを理解するであろう。転写開始位置は、プロモーター配列と重複し得る。
当業者は、「転写終結部位」という用語が、通常、目的の遺伝子または転写される遺伝子セクションの３'末端にあり、ＲＮＡポリメラーゼによる転写の終結をもたらすヌクレオチド配列を包含し得ることを理解するであろう。
当業者は、「ポリアデニル化シグナル」という用語が、真核生物ｍＲＮＡの３'末端の特定の部位での切断、及び切断された３'末端での約１００～２００個のアデニンヌクレオチドの配列（ｐｏｌｙＡ ｔａｉｌ）の翻訳後導入を引き起こすシグナル配列を包含し得ることを理解するであろう。ポリアデニル化シグナルは、切断部位の１０～３０個のヌクレオチド上流の配列ＡＡＴＡＡＡ、及び下流に位置する配列を含む。ｔｋ ｐｏｌｙＡ、ＳＶ４０後期及び初期ｐｏｌｙＡ、またはＢＧＨ ｐｏｌｙＡ（例えば、米国特許第５，１２２，４５８号に記載される）等の様々なポリアデニル化エレメントが既知である。
当業者は、「翻訳調節エレメント」という用語が、翻訳開始部位（ＡＵＧ）、停止コドン、及び発現される各ポリペプチドのためのｐｏｌｙＡシグナルを包含し得ることを理解するであろう。最適な発現において、転写または発現レベルでの発現に影響を及ぼし得る、潜在的に不適切ないかなる追加の翻訳開始コドンまたは他の配列も取り除くために、発現される核酸配列の５'－及び／または３'－未翻訳領域を除去、付加、または変更することが賢明であり得る。発現を促進させるために、リボソームコンセンサス結合部位が、開始コドンのすぐ上流に代替的に挿入されてもよい。分泌ポリペプチドを生成するために、目的の遺伝子は通常、合成ポリペプチドをＥＲ膜へ、及びそれを通して輸送するシグナル前駆体ペプチドをコードするシグナル配列を含有する。シグナル配列は、常にそうではないが、しばしば、分泌タンパク質のアミノ末端に位置し、タンパク質がＥＲ膜を通って濾過された後にシグナルペプチダーゼによって切断される。遺伝子配列、必ずしもそうではないが、通常、独自のシグナル配列を含有する。天然シグナル配列が存在しない場合、異種シグナル配列が既知の様式で導入されてもよい。数々の同様のシグナル配列が当業者に既知であり、ＧｅｎＢａｎｋ及びＥＭＢＬ等の配列データバンクにデポジットされている。
当業者は、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅｓ）」、「ポリペプチド（ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ）」、またはその同義語が、アミノ酸配列またはタンパク質のために使用され、任意の長さのアミノ酸のポリマーを包含し得ることを理解するであろう。この用語はまた、翻訳後に糖鎖付加、リン酸化、アセチル化、またはタンパク質プロセシング等の反応で修飾されたタンパク質も含む。ポリペプチドの構造は、その生物活性を保持しながら、例えば、アミノ酸の置換、欠失、または挿入、及び他のタンパク質との融合で修飾されてもよい。
目的の１つ以上の遺伝子産物を細胞内で生成するために、細胞は、目的の遺伝子の発現を可能にする条件下で、無血清培地中及び懸濁培養液中で増殖されてもよい。例えば、目的の遺伝子が構造型プロモーターの制御下にある場合、特別な誘導物質を添加する必要はない。目的の遺伝子の発現が誘導性プロモーターの制御下にある場合、例えば、対応する誘導物質を、十分であるが、非毒性の濃度で細胞培養培地に添加しなければならない。細胞を複数の継代培養により所望のように増殖し、好適な細胞培養容器に移すことができる。遺伝子産物（複数可）は、細胞状の、膜結合性の、または分泌産物のいずれかとして生成され得る。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造するステップは、所定の数の細胞に、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨをコードするコード部分を含む発現ベクターを安定してトランスフェクトすることを含む。別の実施形態では、コード部分のヌクレオチド配列は、配列番号９に記載される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造するステップは、細胞に該ＣＴＰ修飾ｈＧＨをコードするコード部分を含む発現ベクターをトランスフェクトすることを含む。一実施形態では、細胞はＣＨＯ細胞である。一実施形態では、細胞はＤＧ４４細胞である。別の実施形態では、細胞は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの発現及び分泌に好適な当該技術分野で既知の任意の細胞である。別の実施形態では、発現ベクターは、ｐＣＩ－ｄｈｆｒ－ＭＯＤ－２３発現ベクターである（図２）。別の実施形態では、トランスフェクトされた細胞は、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨを発現する。別の実施形態では、製造及び発現されるＣＴＰ修飾ｈＧＨは、該ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドと、該ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドと、からなり、発現された未成熟ＣＴＰ修飾ｈＧＨのアミノ酸配列は、配列番号４に記載される。別の実施形態では、製造、発現、及び分泌される成熟ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、該ｈＧＨのカルボキシ末端に接着した２つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドと、該ｈＧＨのアミノ末端に接着した１つの絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチドと、からなり、発現及び分泌された成熟ＣＴＰ修飾ｈＧＨのアミノ酸配列は、 配列番号７に記載される。他の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの発現は、高発現レベルである。別の実施形態では、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、高度に糖鎖付加されている。別の実施形態では、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、高度にシアル酸付加されている。上記に詳細に記載されるように、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、異なる糖鎖付加含有量及びパターンを有し得る。本明細書に開示される方法で製造されたＣＴＰ修飾ｈＧＨは、上記に開示される糖鎖付加パターン及び含有量のいずれを含んでもよい。一般に、本明細書に提示される製造方法は、高い糖鎖付加含有量及び糖鎖付加された糖鎖付加部位の高いパーセンテージを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨを提供する。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造するステップは、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを過剰発現する細胞クローンを取得することを含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの発現は、最適である。一実施形態では、発現のレベルは少なくとも２００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも３００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも４００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも５００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも６００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも７００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも８００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも９００ｍｇ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも１ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも１．２ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも１．４ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも１．６ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも１．８ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも２ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも２．２ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも２．４ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも２．６ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも２．８ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、発現のレベルは少なくとも３ｇｍ／Ｌである。別の実施形態では、ステップ（ｂ）のクローンは培地中で繁殖され、マスターセルバンク（ＭＣＢ）及びワーキングセルバンク（ＷＣＢ）を形成する。一実施形態では、ステップ（ｃ）のクローンは、ＭＣＢから取得される。別の実施形態では、ステップ（ｃ）のクローンは、ＷＣＢから取得される。
本明細書に開示される成熟ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチド産物は、分泌遺伝子産物として細胞培養培地から取得される。当業者は、分泌遺伝子産物が、全長翻訳産物に含まれ、核酸配列にコードされるシグナルペプチドを欠損するであろうことを理解するであろう。しかしながら、タンパク質またはポリペプチドが分泌シグナルを伴わずに発現された場合、遺伝子産物はまた細胞溶解物から単離され得る。他の組み換えタンパク質及び宿主細胞タンパク質を実質的に含有しない純粋な異種産物を取得するために、従来の精製手順が行われた。まず、細胞及び細胞破片が、培養培地または溶解物から頻繁に除去される。所望の遺伝子産物は次いで、例えば、免疫親和性及びイオン交換カラムでの分取、エタノール沈澱、セファデックス、ヒドロキシアパタイト、シリカ、もしくは陽イオン交換樹脂上での逆相ＨＰＬＣもしくはクロマトグラフィー、例えばＤＥＡＥによって、混在可溶性タンパク質、ポリペプチド、及び核酸から離される（本明細書の実施例を参照されたい）。組み換え宿主細胞によって発現される異種タンパク質の精製をもたらす当該技術分野で既知の方法は、当業者に既知であり、文献、例えば、Ｈａｒｒｉｓら（Ｈａｒｒｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，Ｐｉｃｋｗｏｏｄ ａｎｄ Ｈａｍｅｓ，ｅｄｓ．，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，１９９５）及びＳｃｏｐｅｓ（Ｓｃｏｐｅｓ，Ｒ．，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ Ｖｅｒｌａｇ，１９８８）によるものに記載されている。これらの方法は、本明細書に開示される方法において、全体としてまたは部分的に用いられてもよい。本明細書に提供される方法論に基づき、当業者は、当該技術分野の必要性及び知識に基づき、特定のクロマトグラフィー方法論の使用を理解し、適合及び変更することができるであろう。例えば、当業者は、陽イオン交換による分離の目的が維持される限り、ＤＥＡＥカラムの代わりに代替的な陽イオン交換カラムを選択してもよい。分取、免疫親和性、タンパク質沈澱、核酸沈澱、エタノール沈澱、逆相ＨＰＬＣ、またはセファデックス、ヒドロキシアパタイト、シリカ、陰イオン交換もしくは陽イオン交換樹脂上でのクロマトグラフィーのための、当該技術分野で既知の同様の代替法が当業者には理解されるであろう。
別の実施形態では、無血清条件下で１つ以上の生成物を哺乳動物細胞中に調製する方法であって、（ｉ）哺乳動物細胞は、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドをコードする遺伝子を含有することと、（ｉｉ）哺乳動物細胞は、哺乳動物細胞の複製を可能にする無血清条件下で増殖されることと、（ｉｉｉ）各場合において、これらの哺乳動物細胞（複数可）のうちの少なくとも１つが、無血清条件下で細胞培養容器中にデポジットされることと、（ｉｖ）好適にデポジットされた哺乳動物細胞は、無血清条件下で複製されることと、（ｖ）複製された細胞は、遺伝子が発現されＣＴＰ修飾ｈＧＨが分泌される無血清条件下で培養されることと、（ｖｉ）遺伝子産物は次いで、培地の上澄みから単離されて精製されることと、を特徴とする方法が本明細書に開示される（本明細書の実施例を参照されたい）。別の実施形態では、製造する方法は、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを発現及び分泌するクローンを含む。このプロセスの別の実施形態では、哺乳動物細胞は、目的の遺伝子が導入されているトランスフェクトされた哺乳動物細胞である。したがって、本明細書に開示される組み換え遺伝子産物を調製する方法は、上記のプロセスのステップ（ｉ）の前に、哺乳動物細胞に、目的の遺伝子を少なくともコードする核酸がトランスフェクトされていることを特徴とし得る。対応する哺乳動物細胞の安定トランスフェクションが好ましい。
無血清、無タンパク質、または既知組成培地の例としては、例えば、商業的に入手可能な培地であるハムＦ１２（Ｓｉｇｍａ，Ｄｅｉｓｅｎｈｏｆｅｎ，ＤＥ）、ＲＰＭＩ １６４０（Ｓｉｇｍａ）、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）、最小必須培地（ＭＥＭ；Ｓｉｇｍａ）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ；Ｓｉｇｍａ）、ＣＤＣＨＯ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｃａｒｌｓｂａｄ，Ｃａｌｉｆ．，ＵＳＡ）、ＣＨＯＳ－ＳＦＭＩＩ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）、無血清ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）、ＣＤ－ＰｏｗｅｒＣＨＯ２培地（Ｌｏｎｚａ）、及び無タンパク質ＣＨＯ培地（Ｓｉｇｍａ）が挙げられる。これらの培地のそれぞれは、所望される場合には、ホルモン及び／もしくは他の成長因子（例えば、インスリン、トランスフェリン、上皮成長因子、インスリン様成長因子）、塩（例えば、塩化ナトリウム、カルシウム、マグネシウム、リン酸塩）、緩衝剤（例えば、ＨＥＰＥＳ）、ヌクレオシド（例えば、アデノシン、チミジン）、グルタミン、グルコースもしくは同等の栄養剤、抗生物質及び／もしくは微量元素、または商業的に入手可能なＰｏｗｅｒ Ｆｅｅｄ Ａ（Ｌｏｎｚａ）もしくはＣｅｌｌ Ｂｏｏｓｔ ６（ＨｙＣＬｏｎｅ）等のフィードといった、様々な化合物で補われ得る。複製可能な細胞が１つ以上の選択可能なマーカーを発現する組み換え細胞である場合、抗生物質等の１つ以上の好適な選択薬剤も培地に添加されてもよい。
挿入されたコード配列（ポリペプチドをコードする）の転写及び翻訳に必要な要素を含有する以外に、本明細書に開示される発現構築物は、発現されるポリペプチドの安定性、生成、精製、収率、または活性を最適化するように操作された配列も含んでもよい。
いくつかの実施形態では、形質転換された細胞は、組み換えポリペプチドの高程度の発現を可能にする有効条件下で培養される。いくつかの実施形態では、有効培養条件には、有効な培地、バイオリアクター、温度、ｐＨ、及びタンパク質生成を許容する酸素条件が含まれるが、これらに限定されない。一実施形態では、有効な培地は、細胞が本明細書に開示される組み換えポリペプチドを生成するために培養される任意の培地を包含し得る。いくつかの実施形態では、培地は典型的に、吸収可能な炭素、窒素、及びリン酸塩源、ならびに適切な塩、鉱物、金属、及び他の栄養物、例えばビタミンを有する水溶液を含む。いくつかの実施形態では、本明細書に開示される細胞は、従来の発酵バイオリアクター、振とうフラスコ、試験管、マイクロタイターディッシュ、及びシャーレで培養されてもよい。いくつかの実施形態では、培養は、組み換え細胞のために適切な温度、ｐＨ、及び酸素含有量で行われる。いくつかの実施形態では、培養条件は、当業者の専門的技術に基づく。
一実施形態では、培養条件は、約２０～８０％の溶存酸素（ＤＯ）含有量を含む。別の実施形態では、ＤＯ含有量は、約２０～３０％である。別の実施形態では、ＤＯ含有量は、約３０～４０％である。別の実施形態では、ＤＯ含有量は、約４０～５０％である。別の実施形態では、ＤＯ含有量は、約５０～６０％である。別の実施形態では、ＤＯ含有量は、約６０～７０％である。別の実施形態では、ＤＯ含有量は、約７０～８０％である。
一実施形態では、培養条件は、１つの温度で開始し、製造中に別の温度に移行するｐＨを含む。別の実施形態では、ｐＨは約７．３で開始し、バイオリアクターでのインキュベーション中に約６．７に移行する。別の実施形態では、ｐＨは約７．３、約７．２、または約７．１で開始し、バイオリアクターでのインキュベーション中に約６．７、約６．８、約６．９、または約７．０に移行する。各可能性は、本明細書に開示される実施形態を表す。
いくつかの実施形態では、生成に使用されるベクター及び宿主系によって、本明細書に記載される結果的なポリペプチドは、組み換え細胞内に留まるか、または培地中に分泌される。
一実施形態では、培養での所定の時間を経て、組み換えポリペプチドの回収がもたらされる。
当業者は、「組み換えポリペプチドを回収すること」という言い回しが、ポリペプチドを含有する培地全体を収集することを包含し得、分離または精製の追加のステップを伴い得ることを理解するであろう。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、親和性クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、濾過、電気泳動法、疎水性相互作用クロマトグラフィー、ゲル濾過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、コンカナバリンＡクロマトグラフィー、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、等電点電気泳動及び示差的可溶化等（これらに限定されない）の多様な標準タンパク質精製技術を使用して精製される。
一実施形態では、各カラムは、制御または非制御温度下で泳動される。
一実施形態では、回収を促進するために、発現されたコード配列は、本明細書に開示されるポリペプチドをコードするように操作され、切断可能な部分に融合されてもよい。一実施形態では、融合タンパク質は、親和性クロマトグラフィーによって、例えば切断可能な部分に特異的なカラムでの固定化によってポリペプチドを容易に単離できるように設計されている。一実施形態では、切断部位は、ポリペプチドと切断可能な部位との間で操作され、切断可能な部位及びポリペプチドは、この部位で融合タンパク質を特に切断する適切な酵素または薬剤による治療によってクロマトグラフカラムから解放され得る［例えば、Ｂｏｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｉｍｍｕｎｏｌ． Ｌｅｔｔ． １９：６５－７０（１９８８）、及びＧａｒｄｅｌｌａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６５：１５８５４－１５８５９（１９９０）を参照されたい］。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、「実質的に純粋な」形態で取り出される。
当業者は、「実質的に純粋な」という言い回しが、本明細書に記載される用途におけるタンパク質の効果的使用を可能にする純度を包含し得ることを理解するであろう。かかる形態としては、本明細書にも開示される高度に糖鎖付加され、高度にシアル酸付加された形態も挙げられる。
一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、インビトロ発現系を使用して合成される。一実施形態では、インビトロ合成法は、当該技術分野で公知であり、系の構成要素は市販されている。
一実施形態では、組み換えＤＮＡ技術を使用してＣＴＰで修飾されたＧＨの生成が行われる。
いくつかの実施形態では、組み換えポリペプチドは、合成され、精製される；これらの治療効果は、インビボまたはインビトロのいずれかでアッセイすることができる。一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾された組み換えＧＨの結合活性は、様々なアッセイを使用して確認することができる。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造する方法は、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを最適に発現及び分泌するクローンを該ＷＣＢから取得し、該クローンを増殖させるステップを含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造する方法は、該ＣＴＰ修飾ｈＧＨを最適に発現するクローンを該ＭＣＢから取得し、該クローンを増殖させるステップを含む。別の実施形態では、製造する方法は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを最適に発現及び分泌するクローンを含む。別の実施形態では、細胞クローンは、一連の継代培養ステップを通して、生成バイオリアクターレベルまで溶液中で増殖される。別の実施形態では、該継代培養されたクローンを含有する溶液は、バイオリアクター内に播種される。別の実施形態では、バイオリアクターは使い捨てバイオリアクターである。別の実施形態では、バイオリアクターは、ステンレス鋼バイオリアクター、ＧＥのＷａｖｅシステム等のロッキングモーションバイオリアクター、潅流バイオリアクター、または当該技術分野で既知の任意の他のバイオリアクターシステムを含む。一実施形態では、バイオリアクターからの細胞の除去は、使い捨て濾過システムの使用によって達成される。大規模製造が実施される場合、濾過システムの使用の前に連続遠心分離を使用することができる。
一実施形態では、細胞クローンは、所望の規模が達成されるまで次第により大きいバイオリアクター内で該細胞を順次培養することにより、更に増殖されるか、または増殖される。別の実施形態では、バイオリアクターは流加モードで運転される。別の実施形態では、バイオリアクターはバッチモードで運転される。別の実施形態では、バイオリアクターは反復バッチモードで運転される。別の実施形態では、バイオリアクターは潅流モードで運転される。上記の各可能性は、別の実施形態である。
生細胞密度のピークは、用いられたバイオリアクターのタイプによって異なる。一実施形態では、本明細書に開示される製造する方法で使用されるバイオリアクターの生細胞密度のピークは、約０．２×１０６～１．４×１０６個の細胞／ｍｌである。別の実施形態では、本明細書に開示される製造する方法で使用されるバイオリアクターの生細胞密度のピークは、約０．０５×１０６～１００×１０６である。別の実施形態では、バイオリアクターの生細胞密度のピークは、約０．０５×１０６～０．５×１０６である。別の実施形態では、バイオリアクターの生細胞密度のピークは、約０．５×１０６～５×１０６である。別の実施形態では、バイオリアクターの生細胞密度のピークは、約５．０×１０６～５０×１０６である。別の実施形態では、バイオリアクターの生細胞密度のピークは、約５０×１０６～１００×１０６である。各可能性は、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。
バイオアクター利用における供給スキームは、例えば特定の日から１日１回反復供給されるかまたは数日の間に固定されるかで異なり得、加えて、添加される供給物の％は、数％～５０％以上までで異なり得る。各可能性は、本明細書に開示される実施形態である。
当該技術分野で既知の異なる濃度でＤＭＳＯがバイオリアクターに添加されてもよい。一実施形態では、バイオリアクターに０．１～３％のＤＭＳＯがその使用中に添加される。別の実施形態では、０．１～０．５％のＤＭＳＯが添加される。別の実施形態では、０．５～１．０％のＤＭＳＯが添加される。別の実施形態では、１．０～１．５％のＤＭＳＯが添加される。別の実施形態では、１．５～２．０％のＤＭＳＯが添加される。別の実施形態では、２．０～２．５％のＤＭＳＯが添加される。別の実施形態では、２．５～３．０％のＤＭＳＯが添加される。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造する方法は、浄化された収集溶液を精製して、精製されたタンパク質溶液を取得するステップを含む。別の実施形態では、本明細書に提示される方法を使用して製造された精製されたタンパク質溶液は、少なくとも４０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。別の実施形態では、精製されたタンパク質溶液は、少なくとも５０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。別の実施形態では、精製されたタンパク質溶液は、少なくとも６０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。別の実施形態では、精製されたタンパク質溶液は、少なくとも７０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。別の実施形態では、精製されたタンパク質溶液は、少なくとも８０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。別の実施形態では、精製されたタンパク質溶液は、少なくとも９０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。
一実施形態では、浄化された収集物は、２４時間まで、２～２５℃で保持される。別の実施形態では、浄化された収集物は、１カ月まで、５℃で保管される。
一実施形態では、ステップ（ｅ）で取得された浄化された収集物は、バイオバーデン、細菌内毒素、特定のタンパク質含有量、残存ＤＮＡ、ウイルス、ウイルス様粒子、及び／もしくはマイコプラズマ、またはこれらの任意の組み合わせについて試験される。
一実施形態では、ステップ（ｆ）での浄化された収集物の精製は、（ｇ）該浄化された収集溶液を濃縮、透析濾過、及び精製するステップであって、前記濃縮、透析濾過、及び精製が、前記浄化された収集溶液を、陰イオン交換カラム及び疎水性相互作用カラムを通して順次通す中空糸カセットまたは接線流カセットによって達成される、ステップと、（ｈ）ステップに続いて該浄化された収集物を取得するステップと、（ｉ）該ウイルスに有毒な溶液中でインキュベートすることにより該浄化された収集物中に存在する不活性化するステップと、（ｊ）該浄化された収集溶液を（ｈ）から取得し、該浄化された収集溶液を濃縮、透析濾過、及び精製するステップであって、該濃縮、透析濾過、及び精製が、該浄化された収集溶液をヒドロキシアパタイト混合モードカラム及び陽イオン交換カラムに順次通すことがそれに続く、ステップと、（ｊ）ステップ（ｉ）に続いて該浄化された収集溶液を取得し、ナノ濾過により該浄化された収集溶液をウイルスから物理的に除去するステップと、（ｋ）ステップ（ｊ）に続いて該浄化された収集溶液を取得し、最大限に精製された、ＣＴＰ修飾ポリペプチドの高度に糖鎖付加された形態を含有する浄化された収集物に達するまで、該浄化された収集溶液を濃縮、透析濾過、及び精製して、を達成するステップと、を含むステップを順次実施することで達成される。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、最終濾過前の遠心分離ステップを含む。当業者は、遠心分離及び／または濾過の両方が、溶液を浄化する方法であることを理解するであろう。
一実施形態では、浄化された収集物を濃縮及び濾過するための限外濾過及び透析濾過が、中空糸カートリッジまたは同等のＴＴＦベースＵＦＤＦステップを使用して実施され得る。カートリッジの公称分子量カットオフサイズは、１０，０００ｋＤａである。別の実施形態では、膜カートリッジは、３ｋＤａ～３０ｋＤａのカットオフを有するＰＥＳ／ＰＳ／ＲＣ膜を具備してもよい。
別の実施形態では、ステップ（ｇ）の陰イオン交換カラムは、ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムである。別の実施形態では、ＤＥＡＥカラムは、高度に糖鎖付加された形態の本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨを精製する。一実施形態では、糖鎖付加が高度であればあるほど、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの薬力学はより良い。別の実施形態では、陰イオン交換カラムは、当該技術分野で既知の他の陰イオン交換カラム、例えばＣａｐｔｏ ＤＥＡＥ陰イオン交換カラムまたはＥｓｈｍｕｎｏ Ｑ等の他の樹脂を含み得る。
一実施形態では、ステップ（ｇ）の疎水性カラムは、フェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）である。フェニルＨＩＣに使用されるサイクルの数は、約１～１０の間の範囲である。一実施形態では、１～３回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～５回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～６回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～７回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～８回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～９回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～１０回のサイクルが実施される。別の実施形態では、当該技術分野で既知の緩衝剤が、洗浄及び溶出のために使用される。一実施形態では、溶出緩衝剤は、プロピレングリコールを含有する硫酸アンモニウムを含む。一実施形態では、溶出緩衝剤は、エチレングリコールを含有する硫酸アンモニウムを含む。
一実施形態では、ヒドロキシアパタイト混合モードカラムは、セラミックヒドロキシアパタイト混合モードカラム（ＣＨＴ）を含む。ＣＨＴに使用されるサイクルの数は、約１～１０の間の範囲である。一実施形態では、１～３回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～５回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～６回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～７回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～８回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～９回のサイクルが実施される。別の実施形態では、１～１０回のサイクルが実施される。ＣＨＴカラムからの溶出は、約３～１０カラム容量（ＣＶ）の間で実施され得る。一実施形態では、溶出は約３ＣＶで実施される。別の実施形態では、溶出は約４ＣＶで実施される。別の実施形態では、溶出は約５ＣＶで実施される。別の実施形態では、溶出は約６ＣＶで実施される。別の実施形態では、溶出は約７ＣＶで実施される。別の実施形態では、溶出は約８ＣＶで実施される。別の実施形態では、溶出は約９ＣＶで実施される。別の実施形態では、溶出は約１０ＣＶで実施される。
一実施形態では、混在に起因して浄化された収集物中に存在し得るウイルスは、浄化された収集物中で不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、０．１～２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、０．２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、０．５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、１～４％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、０．２～０．５％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、０．５～１．０％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、２％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、３％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、４％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、ウイルスは、５～１０％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液を使用して不活性化される。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約０．５～２４時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約０．５～１時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約１～２時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約２～３時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約３～４時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約４～６時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約６～８時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約８～１０時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約１０～１２時間に及ぶ。別の実施形態では、Ｔｒｉｔｏｎ－Ｘ１００溶液中でのウイルス不活性化は、約１２～２４時間に及ぶ。
当該技術分野で入手可能であり、これらのウイルスに有毒である、コール酸ナトリウム及びＴｗｅｅｎ８０を含むがこれらに限定されない他の濃縮剤または他の溶液が本明細書に開示される方法で使用され得ることは当業者に理解されるであろう。別の実施形態では、リン酸トリ－ｎ－ブチル（ＴＮＢＰ）及びポリソルベート８０（Ｔｗｅｅｎ ８０）の混合物が、ステップ（ｈ）でウイルスを不活性化するために使用される。別の実施形態では、ウイルスの不活性化の方法は、ｐＨを低下させることを含む。当業者は、ウイルスの不活性化が、当該技術分野で既知のように溶液の条件を変更することを包含し得ることを理解するであろう。
一実施形態では、ウイルスは、ナノ濾過を使用することにより物理的に除去される。当該技術分野で既知のウイルス除去のための任意の濾過器を本明細書に開示される方法に適用し得ることを当業者は理解するであろう。別の実施形態では、ナノ濾過は、ＰｌａｎｏｖａまたはＰｌａｎｏｖａ型濾過カートリッジ（１～６０ｍｍ２）を使用して行われる。当該技術分野で既知の方法を使用した浄化された収集物からのウイルスのクリアランスの確認がかかる方法に続く。
一実施形態では、本明細書のステップ（ｉ）の陽イオン交換カラムは、ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗカラムである。別の実施形態では、陽イオン交換カラムは、ＣＭ ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｃａｐｔｏ Ｓを含む。別の実施形態では、陽イオン交換カラムは、本明細書の目的のための当該技術分野で既知の任意のものを含む。
一実施形態では、本明細書に開示される方法は、高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨの少なくとも２０％の回収率を達成する。別の実施形態では、本方法は、高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨの少なくとも２５％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、少なくとも９０％、少なくとも９５％、少なくとも９６％、少なくとも９７％、少なくとも９８％、少なくとも９９％、少なくとも９９．９％の回収率を達成する。
一実施形態では、本明細書に開示される高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨの精製に続いて、本明細書に開示される方法は、該ＣＴＰ修飾ポリペプチドを特徴づけることを更に含む。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの純度が判定される。別の実施形態では、糖鎖付加含有量が判定される。別の実施形態では、糖鎖付加部位占有が判定される。一実施形態では、純度、糖鎖付加含有量、及び糖鎖付加部位占有は、製造されたＣＴＰ修飾ｈＧＨ中で判定される。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法に利用される細胞クローンは、凍結セルバンクに保管される。別の実施形態では、細胞クローンは、凍結乾燥セルバンクに保管される。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物のセルバンクは、マスターセルバンクである。別の実施形態では、セルバンクは、ワーキングセルバンクである。別の実施形態では、セルバンクは、適正製造規範（ＧＭＰ）のセルバンクである。別の実施形態では、セルバンクは、臨床等級材料の生成のために意図される。別の実施形態では、セルバンクは、ヒトの使用のための規制慣行に準拠している。別の実施形態では、セルバンクは、当該技術分野で既知の任意の他のタイプのセルバンクである。
「適正製造規範」は、別の実施形態で、米国連邦規則集の（２１ ＣＦＲ ２１０－２１１）によって定義されている。別の実施形態では、「適正製造規範」は、臨床等級材料の生成またはヒトによる消費のための他の基準、例えば米国以外の国の基準によって定義される。
別の実施形態では、細胞を繁殖させるために使用される培地は、メトトレキサート（ＭＸＴ）を含有する。別の実施形態では、培地は、メトトレキサート不含培地である。別の実施形態では、培地中に存在するＭＸＴの濃度は、約０．１～２ｕＭである。別の実施形態では、培地中に存在するＭＸＴの濃度は、約０．１～０．５ｕＭである。別の実施形態では、培地中に存在するＭＸＴの濃度は、約０．５～１．０ｕＭである。別の実施形態では、培地中に存在するＭＸＴの濃度は、約１．０～１．５ｕＭである。別の実施形態では、培地中に存在するＭＸＴの濃度は、約１．５～２．０ｕＭである。「培地」という用語が、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む細胞の増殖または培養に好適な液体またはゲルまたは粉を包含し得ることを理解されるであろう。かかる培地は、代替的に、「増殖培地」または「培養培地」と呼ばれ、栄養培地、強化培地、最小培地、確認培地、輸送培地、または選択培地を含み得るが、これらに限定されない。更なる態様において、選択培地は、製造プロセス中、特定の群の細胞を選択するのに好適であり得る。
一実施形態では、精製されたタンパク質溶液は、少なくとも７０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含有する。別の実施形態では、精製されたタンパク質溶液は、少なくとも８０％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含有する。別の実施形態では、精製された溶液は、少なくとも９０～９５％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含有する。別の実施形態では、精製された溶液は、９５．１～９９．９％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含有する。別の実施形態では、精製された溶液は、１００％のＣＴＰ修飾ｈＧＨを含有する。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨは、高度に糖鎖付加されている。「高度に糖鎖付加されている」という用語が、収集物中に存在する収集されたＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドに関連する場合、精製された溶液の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約６０～８０％の糖鎖付加レベルを包含し得ることは、当業者には理解されるであろう（例えば、図１１で逆相ＨＰＬＣによって測定されたものを参照されたい）。別の実施形態では、高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む収集物は、精製された溶液中のＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの少なくとも５０％の糖鎖付加レベルを有する。別の実施形態では、高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む収集物は、精製された溶液中のＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの少なくとも６０％の糖鎖付加レベルを有する。別の実施形態では、高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む収集物は、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの少なくとも７０％の糖鎖付加レベルを有する。別の実施形態では、高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨは、精製された溶液中のＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの少なくとも８０％の糖鎖付加レベルを有する。別の実施形態では、収集物は、精製された溶液中の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約８１～９０％の糖鎖付加レベルを含む。別の実施形態では、高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨは、精製された溶液中のＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの少なくとも９０％の糖鎖付加レベルを有する。別の実施形態では、収集物は、精製された溶液中の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約９１～９５％の糖鎖付加レベルを含む。別の実施形態では、収集物は、精製された溶液中の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約９５．１～９９％の糖鎖付加レベルを含む。別の実施形態では、収集物は、精製された溶液中の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの１００％の糖鎖付加レベルを含む。
別の実施形態では、精製されたＣＴＰ修飾ｈＧＨ溶液（原薬（ＤＳ））は、分子の少なくとも９０％が高度に糖鎖付加している溶液を含む。別の実施形態では、精製されたＣＴＰ修飾ｈＧＨ溶液（原薬（ＤＳ））は、分子の少なくとも９５％が高度に糖鎖付加している溶液を含む。別の実施形態では、精製されたＣＴＰ修飾ｈＧＨ溶液（原薬（ＤＳ））は、分子の１００％が高度に糖鎖付加している溶液を含む。当業者は、精製されたＣＴＰ修飾ｈＧＨ原薬（ＤＳ）が、各分子が１２～１８個のＯ－グリカン占有を含むＣＴＰ修飾ｈＧＨを包含し得ることを理解するであろう。
当業者は、「原薬」（ＤＳ）という用語が、有効活性成分（ＡＰＩ）を包含し得るか、またはそれと同等であり得ることを理解するであろう。一実施形態では、配列番号７に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチド原薬（ＤＳ）は、バルク精製された薬物を含む。当業者はまた、「医薬品」（ＤＰ）という用語が、無菌状態下で最終の容器、例えばバイアルへと調合されて、最終的に製剤された薬物を包含し得ることも理解するであろう。一実施形態では、配列番号７に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチド原薬（ＤＰ）は、最終的に製剤されたＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。
高度に糖鎖付加されたＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、成長ホルモン分泌不全患者の低減された投与頻度、例えば１週間に１回の注射を援助するという、長時間作用性ｈＧＨ（例えば、ＭＯＤ－４０２３）の使用方法において有益な特性を有し得る。高糖鎖付加レベルは、組み換えｈＧＨと比較して著しく増加したＣＴＰ修飾ｈＧＨ、例えばＣＴＰ修飾ｈＧＨの流体力学的体積に寄与する。これは、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの延長された循環時間をもたらし得る。
一実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも４～６個である。別の実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカンの数は、４～６個の間である。別の実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも４～８個である。別の実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカンの数は、４～８個の間である。一実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも６～８個である。一実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカンの数は、６～８個の間である。別の実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカンの数は、４、５、６、７、または８個である。各可能性は、ＣＴＰ Ｏ－結合糖鎖付加の別の実施形態を表す。
一実施形態では、接着した１つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも４～６個である。別の実施形態では、接着した１つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも６～８個である。別の実施形態では、接着した１つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも４～８個である。別の実施形態では、接着した２つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも８～１２個である。別の実施形態では、接着した２つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１２～１６個である。別の実施形態では、接着した２つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも８～１６個である。別の実施形態では、接着した３つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１２～１８個である。別の実施形態では、接着した３つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１８～２４個である。別の実施形態では、接着した３つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１２～２４個である。別の実施形態では、接着した４つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１６～２４個である。別の実施形態では、接着した４つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも２４～３２個である。別の実施形態では、接着した４つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１６～３２個である。別の実施形態では、接着した５つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも２０～３０個である。別の実施形態では、接着した５つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも３０～４０個である。別の実施形態では、接着した５つのＣＴＰを有するＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも２０～４０個である。
別の実施形態では、各ＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰ（「ＭＯＤ－４０２３」としても知られる）のＯ－グリカンの数は、少なくとも１２～１８個である。別の実施形態では、ＭＯＤ－４０２３ごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１８～２４個である。別の実施形態では、ＭＯＤ－４０２３ごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１２～２４個である。別の実施形態では、ＭＯＤ－４０２３ごとのＯ－グリカンの数は、少なくとも１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、または２４個である。各可能性は、ＣＴＰ Ｏ－結合糖鎖付加の別の実施形態を表す。
一実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカン占有は、少なくとも７０％である。別の実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカン占有は、少なくとも８０％である。別の実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカン占有は、少なくとも９０％である。別の実施形態では、ＣＴＰごとのＯ－グリカン占有は、１００％である。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、高度にシアル酸付加されている。「高度にシアル酸付加されている」という用語が、ＣＴＰ修飾ｈＧＨに関連する場合、精製された溶液のＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約６０～８０％のシアル酸付加レベルを包含し得ることは、当業者には理解されるであろう。別の実施形態では、精製された溶液の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約６０～７０％のシアル酸付加レベルを包含し得る。別の実施形態では、精製された溶液の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約７０～８０％のシアル酸付加レベルを包含し得る。別の実施形態では、精製された溶液の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約８０～９０％のシアル酸付加レベル。別の実施形態では、精製された溶液の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約９０～９５％のシアル酸付加レベル。別の実施形態では、精製された溶液の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの約９５．１～９９％のシアル酸付加レベル。別の実施形態では、精製された溶液の総ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの１００％のシアル酸付加レベル。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨ中のＯ－グリカン結合は、モノシアル酸付加されたコア１を含む。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ヒトＧＨをコードするコード部分を含む発現ベクターはまた、プロモーターと、ＣＴＰ修飾ポリペプチドのコード配列と、ポリアデニル化配列とを含む。一実施形態では、ポリアデニル化配列は、シミアンウイルス（ＳＶ）４０のポリアデニル化配列である。
一実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも６００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも６００～７００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも７０１～８００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも８０１～９００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも９０１～１０００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１００１～１１００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１１０１～１２００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１２０１～１３００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１３０１～１４００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１４０１～１５００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１５０１～１６００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１６０１～１７００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１７０１～１８００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１８０１～１９００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも１９０１～２０００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２００１～２１００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２１０１～２２００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２２０１～２３００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２３０１～２４００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２４０１～２５００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２５０１～２６００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２６０１～２７００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２７０１～２８００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２８０１～２９００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、少なくとも２９０１～３０００ｍｇ／Ｌのレベルで発現される。
「発現」という用語が、宿主細胞中の異種核酸配列の転写及び／または翻訳を包含し得ることは、当業者には理解されるであろう。宿主細胞中の所望の生成物／目的のタンパク質の発現のレベルは、細胞内に存在する対応するｍＲＮＡもしくはｃＤＮＡの量、または本発明の実施例にあるように選択された配列によってコードされた所望のポリペプチド／目的のタンパク質の量のいずれかに基づいて判定され得る。例えば、選択された配列から転写されたｍＲＮＡは、ノーザンブロットハイブリダイゼーション、リボヌクレアーゼＲＮＡプロテクション、細胞内ＲＮＡへのその場でのハイブリダイゼーションによって、またはＰＣＲ（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ｕｐｄａｔｅｄを参照されたい）によって定量化することができる。選択された配列によってコードされたタンパク質は、様々な方法、例えば、ＥＬＩＳＡによって、ウェスタンブロット法によって、放射沈降によって、タンパク質の生物活性についてアッセイすることによって、タンパク質の免疫染色に続くＦＡＣＳ分析（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９、Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９８７ ｕｐｄａｔｅｄを参照されたい）によって、または異種時間分解蛍光法（ＨＴＲＦ）アッセイによって定量化することができる。一実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの定量化は、逆相高速液体クロマトグラフィー（ＲＰ－ＨＰＬＣ）の使用を含む。別の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｃ－１８カラムを含む。別の実施形態では、ＲＰ－ＨＰＬＣは、Ｃ－８カラムを含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して収集物中のＣＴＰ修飾ｈＧＨを定量化する（実施例のステップ３～８を参照されたい）。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＲＰ－ＨＰＬＣを使用して、精製の第１のステップにおけるＣＴＰ修飾ｈＧＨを定量化する（実施例のステップ９～１２を参照されたい）。
別の実施形態では、本明細書に開示されるセルバンクまたは凍結ストックは、解凍に際して９０％超の生存率を示す。別の実施形態では、保管は、不定量の時間に及ぶ。各可能性は、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、保管は２週間に及ぶ。別の実施形態では、保管は３週間に及ぶ。別の実施形態では、保管は１カ月に及ぶ。別の実施形態では、保管は２カ月に及ぶ。別の実施形態では、保管は３カ月に及ぶ。別の実施形態では、保管は５カ月に及ぶ。別の実施形態では、保管は６カ月に及ぶ。別の実施形態では、保管は９カ月に及ぶ。別の実施形態では、保管は１年に及ぶ。
別の実施形態では、本明細書に開示されるセルバンクまたは凍結ストックは、本明細書に開示される規定の培地中で細胞の培養液を増殖させることと、グリセロールを含む溶液中に培養液を凍結させることと、摂氏－２０度未満で細胞クローンを保管することとを含む方法によって凍結保存されている。別の実施形態では、温度は、摂氏約－７０度である。別の実施形態では、温度は、摂氏約－７０～－８０度である。別の実施形態では、本明細書に開示される任意の規定の培地をこの方法で使用してもよい。各規定の培地は、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。
本明細書に開示される方法及び組成物の別の実施形態では、培養液は、セルバンクから植え付けられる。別の実施形態では、培養液は、凍結ストックから植え付けられる。別の実施形態では、培養液は、種培養から植え付けられる。別の実施形態では、培養液は、細胞群体から植え付けられる。別の実施形態では、培養液は、中期対数増殖期に植え付けられる。別の実施形態では、培養液は、およそ中期対数増殖期に植え付けられる。別の実施形態では、培養液は、別の増殖期に植え付けられる。
本明細書に開示される方法及び組成物の別の実施形態では、凍結に使用される溶液は、２～２０％の量でＤＭＳＯを含む。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は２０％である。別の実施形態では、量は１％である。別の実施形態では、量は１．５％である。別の実施形態では、量は３％である。別の実施形態では、量は４％である。別の実施形態では、量は５％である。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は２％である。別の実施形態では、量は７％である。別の実施形態では、量は７．５％である。別の実施形態では、量は９％である。別の実施形態では、量は１０％である。別の実施形態では、量は１２％である。別の実施形態では、量は１４％である。別の実施形態では、量は１６％である。別の実施形態では、量は１８％である。別の実施形態では、量は２２％である。別の実施形態では、量は２５％である。別の実施形態では、量は３０％である。別の実施形態では、量は３５％である。別の実施形態では、量は４０％である。
別の実施形態では、添加剤はスクロースである。別の実施形態では、添加剤は、当該技術分野で既知の任意の他の束一的な添加剤または不凍特性を有する添加剤である。各可能性は、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。
一実施形態では、本方法で使用され、本法明細書に開示される組成物のための凍結溶液は、培養上清及びＤＭＳＯを含む。一実施形態では、本方法で使用され、本法明細書に開示される組成物のための凍結溶液は、約４６．２５５％の培養上清と７．５％の ＤＭＳＯとを含む。
一実施形態では、細胞培養液は、当該技術分野で常用される技術によって増殖される。別の実施形態では、細胞培養液の増殖の間、一定のｐＨが維持される。別の実施形態では、ｐＨは約７．０に維持される。別の実施形態では、ｐＨは約６である。別の実施形態では、ｐＨは約６．５である。別の実施形態では、ｐＨは約７．５である。別の実施形態では、ｐＨは約８である。別の実施形態では、ｐＨは６．５～７．５である。別の実施形態では、ｐＨは６～８である。別の実施形態では、ｐＨは６～７である。別の実施形態では、ｐＨは７～８である。各可能性は、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。
別の実施形態では、細胞培養液の増殖の間、一定の温度が維持される。別の実施形態では、温度は、約３７℃で維持される。別の実施形態では、温度は３７℃である。別の実施形態では、温度は２５℃である。別の実施形態では、温度は２７℃である。別の実施形態では、温度は２８℃である。別の実施形態では、温度は３０℃である。別の実施形態では、温度は３２℃である。別の実施形態では、温度は３４℃である。別の実施形態では、温度は３５℃である。別の実施形態では、温度は３６℃である。別の実施形態では、温度は３８℃である。別の実施形態では、温度は３９℃である。
別の実施形態では、細胞培養液の増殖の間、一定の溶存酸素濃度が維持される。別の実施形態では、溶存酸素濃度は、飽和状態の２０％で維持される。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の１５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の１６％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の１８％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の２２％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の２５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の３０％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の３５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の４０％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の４５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の５０％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の５５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の６０％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の６５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の７０％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の７５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の８０％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の８５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の９０％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の９５％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の１００％である。別の実施形態では、濃度は、飽和状態の１００％に近い。
本明細書に開示される方法及び組成物の別の実施形態では、培養液は、容器当たり２リットル（Ｌ）の最大容量を有する培地中で増殖される。別の実施形態では、培地は、容器当たり２００ｍｌの最大容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり３００ｍｌの最大容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍｌの最大容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり７５０ｍｌの最大容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり１Ｌの最大容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり１．５Ｌの最大容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり２．５Ｌの最大容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり３Ｌの容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり５Ｌの容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり少なくとも５Ｌの容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり少なくとも１０Ｌの容量を有する。
別の実施形態では、培地は、容器当たり２Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり５００ｍｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり７５０ｍｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり１Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり１．５Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり２．５Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり３Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり４Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり５Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり６Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり８Ｌの最小容量を有する。別の実施形態では、培地は、容器当たり１０Ｌの最小容量を有する。
別の実施形態では、凍結するステップは、培養液が１×１０６個の生細胞（ＶＣ）／ｍｌの密度を有したときに実施される。別の実施形態では、バイオマスは１．５×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは１．５×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは２×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、３×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、４×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、５×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、７×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、９×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、１０×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、１２×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、１５×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、２０×１０７ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、２５×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、３０×１０７ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、３３×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、４０×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、５０×１０６ＶＣ／ｍｌである。別の実施形態では、バイオマスは、５０×１０６ＶＣ／ｍｌ超である。
本明細書に開示される方法及び組成物の別の実施形態では、細胞培養液は、液体窒素中で瞬間凍結され、それに続いて最終凍結温度で保管される。別の実施形態では、培養液は、より漸進的な様式で、例えば、最終凍結温度で培養液のバイアル内に置くことによって凍結される。別の実施形態では、培養液は、細胞培養液を凍結するための当該技術分野で既知の任意の他の方法で凍結される。
「細胞培養」及び「組織培養」という用語が、互換的に使用され、インビトロ、液体培地中の懸濁培養液中、または液体培地を供給されたガラス、プラスチックもしくは寒天培養基の表面上の細胞の維持を意味することは、当業者には理解されるであろう。一般に、「細胞培養」は、一定の好適なｐＨを維持するために緩衝されている培地を必要とする。細胞培養に使用される培地は、一般に、必要な栄養の適切な供給量を含むように調製され、好適な限度内で温度及びガス相を制御しながら、維持される特定の細胞に浸透圧的に適合され得る。細胞培養技術は、当該技術分野で公知である。例えば、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ． １９９３ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、及びＡｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．Ｐ．１９９０ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照されたい。
「継代」という用語が、細胞集団の継代培養の作用を包含し得ることは、当業者には理解されるであろう。「継代培養」は、一実施形態では新鮮な滅菌培地である、前の培養からの試料での滅菌培地の植え付けによって確立された細胞培養を包含し得る。
また、「細胞株（ｃｅｌｌ ｓｔｒａｉｎ）」という用語が、継代培養技術を使用して初代培養に由来する細胞の集団を包含し得ることも、当業者には理解されるであろう。よって、初代培養は、２つ以上の新しい培養に継代培養され得、継代培養は、細胞株を維持するために数カ月に亘って定期的な感覚で繰り返される。本明細書に開示される方法下での継代培養は、確立された細胞培養技術を使用して行うことができる。
一実施形態では、継代培養された細胞株、及び不死化細胞系は、それらの特定の機能性マーカー、例えばケラチン、ホルモン及び成長因子受容体等の発現によって特徴づけられ得る。
いくつかの実施形態では、培養は、添加された成長因子を含有する無血清の規定された培地中で行われてもよい。他の態様において、培地は、添加された成長因子を含有するか、または含有せずに、血清を含有する。かかる変更は、細胞増殖を最適化するために、当業者によって経験的に判定され得る。
「細胞株（ｃｅｌｌ ｌｉｎｅ）」という用語が、インビトロでの無限増殖の可能性を有することで特徴づけられる単一の外植片に由来する細胞の集団を包含し得ることは、当業者には理解されるであろう。本明細書に開示されるように、細胞株は、その生存能力及び培養液中で継続して増殖する能力に基づき、初代培養から単離され得る。全ての腫瘍細胞集団がインビトロで無限に増殖する能力を有するわけではないが、元来、腫瘍組織に由来する細胞株は、インビボで形質転換されている場合がある。更に、細胞株は一般に、何回もの分化を通して、それらの差別化された特質を保持する。
好適な細胞培養基材は、一般に、殺菌することができ、有毒因子を浸出せず、顕微鏡画像を曲解しない容器である。よって、ガラス及びプラスチックから形成されたプレートが、本明細書に開示される方法での使用に好適な基材である。プラスチック容器は更に、当該技術分野で既知の技術を使用して細胞接着を促進するように処置される（Ｒａｍｓｅｙ ｅｔ ａｌ．１９８４ Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ２０：８０２）。好適な組織培養培地は、一般に、無機塩類、アミノ酸、ビタミン、及び様々な補助剤を加えた、エネルギー源を提供する等張性、緩衝性、基礎栄養培地からなる。補助剤としては、血清（例えば、ウシ胎仔血清等）、汚染を予防するため、または選択的条件、接着、及び成長因子を提供するための様々な抗生物質等が挙げられる。Ｒｏｓｅｗｅｌｌ Ｐａｒｋ Ｍｅｍｏｒｉａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ（ＲＰＭＩ） １６４０の基礎培地（ＭＥＭ）またはダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）等（これらに限定されない）の多くの培地調合物が当該技術分野で既知である。好適な組織培養条件もまた、当該技術分野で既知である。例えば、Ｍｏｒｇａｎ ｅｔ ａｌ．１９９３ Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ，ＢＩＯＳ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ Ｌｔｄ．，Ｏｘｆｏｒｄ，ＵＫ、及びＡｄａｍｓ，Ｒ．Ｌ．Ｐ．１９９０ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｆｏｒ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｓ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒを参照されたい。本明細書で開示される別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造する方法は、無血清のプロセスである。本明細書で開示される別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨを製造する方法は、動物由来のものを含まないプロセスである。
本明細書に開示される方法及び組成物の別の実施形態では、培養液の保管温度は、摂氏－２０～－８０度（℃）の間である。別の実施形態では、温度は、－２０℃よりも著しく低い。別の実施形態では、温度は、－７０℃よりも高くない。別の実施形態では、温度は、－７０℃である。別の実施形態では、温度は、約－７０℃である。別の実施形態では、温度は、－２０℃である。別の実施形態では、温度は、約－２０℃である。別の実施形態では、温度は、－３０℃である。別の実施形態では、温度は、－４０℃である。別の実施形態では、温度は、－５０℃である。別の実施形態では、温度は、－６０℃である。別の実施形態では、温度は、－８０℃である。別の実施形態では、温度は、－３０～－７０℃である。別の実施形態では、温度は、－４０～－７０℃である。別の実施形態では、温度は、－５０～－７０℃である。別の実施形態では、温度は、－６０～－７０℃である。別の実施形態では、温度は、－３０～－８０℃である。別の実施形態では、温度は、－４０～－８０℃である。別の実施形態では、温度は、－５０～－８０℃である。別の実施形態では、温度は、－６０～－８０℃である。別の実施形態では、温度は、－７０～－８０℃である。別の実施形態では、温度は、－７０℃よりも低い。別の実施形態では、温度は、－８０℃よりも低い。
別の実施形態では、凍結保存について、細胞は、それらが凍結保護剤を含む培地中で－７０℃未満の温度に達するまで緩徐に凍結され、次いで、それらを－１３０℃未満の温度で維持するためにバイアルは液体窒素凍結器に移される。
本明細書に開示される方法及び組成物の別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で２４時間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で２日間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で３日間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で４日間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で１週間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で２週間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で３週間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で１カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で２カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で３カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で５カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で６カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で９カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最大で１年間に及ぶ。
別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で１週間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で２週間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で３週間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で１カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で２カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で３カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で５カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で６カ月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で９か月間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で１年間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で１．５年間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で２年間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で３年間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で５年間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で７年間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、最短で１０年間に及ぶ。別の実施形態では、凍結保存または凍結保管は、１０年間以上に及ぶ。
本明細書に開示される方法及び組成物の別の実施形態では、細胞は、長期間の凍結保存または凍結保管に次ぐ解凍後に増殖を示す。別の実施形態では、細胞は、セルバンクまたは種培養由来の細胞を新鮮な培地に植え付けた後、約１５～２２時間以内に増殖を示す。別の実施形態では、細胞は、セルバンクまたは種培養由来の細胞を新鮮な培地に植え付けた後、約１２～２０時間以内に増殖を示す。一実施形態では、生存率、遺伝的安定性、及び表現型の安定性を確保するために、細胞株は、（定期的な継代培養を介して）指数増殖期に維持されなければならない。
当業者は、凍結保存または凍結保管の「長期間」という用語が、１カ月を包含し得ることを理解するであろう。別の実施形態では、期間は２カ月である。別の実施形態では、期間は３カ月である。別の実施形態では、期間は５カ月である。別の実施形態では、期間は６カ月である。別の実施形態では、期間は９カ月である。別の実施形態では、期間は１年である。別の実施形態では、期間は１．５年である。別の実施形態では、期間は２年である。別の実施形態では、期間は２～７年である。別の実施形態では、期間は少なくとも７年である。別の実施形態では、期間は少なくとも１０年である。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法及び組成物の細胞は、凍結保存に続く解凍後に、９０％を超える生存率を保持する。別の実施形態では、凍結保存期間に続く解凍に際した生存率は１００％に近い。別の実施形態では、解凍に際した生存率は９０％に近い。別の実施形態では、解凍に際した生存率は、少なくとも９０％である。別の実施形態では、解凍に際した生存率は、８０％を超える。
別の実施形態では、本明細書に開示されるワクチン投与のセルバンク、凍結ストック、またはバッチは、規定の細胞培養培地中で増殖される。かかる培地は当該技術分野で既知であり、これには、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．３０－２００２）、イスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．３０－２００５）、Ｈｙｂｒｉ－Ｃａｒｅ培地（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．４６－Ｘ）、マッコイ５Ａ及びＲＰＭＩ－１６４０（ＡＴＣＣ（登録商標）Ｎｏ．３０－２００７）、ハム栄養混合物（ＡＴＣＣ（登録商標）ＣＣＬ－６１（商標））、ＰｏｗｅｒＣＨＯ（商標）既知組成無血清ＣＨＯ培地（Ｌｏｎｚａ Ｃａｔ．Ｎｏ．１２－７７１Ｑ）、または当該技術分野で既知の任意の他の培地が含まれるが、これらに限定されない。別の実施形態では、これらの培地は、当業者によって経験的に判定されるように、抗生物質または動物血清中に補われてもよい。
一実施形態では、大規模な量での哺乳動物細胞の培養を可能にするバイオリアクター及び方法が本明細書に開示される。更に、かつ別の実施形態では、該バイオリアクター及び方法は、大規模な量で増殖されても最適な条件下で哺乳動物細胞の培養を可能にし、したがって、バイオリアクターの大きさとは無関係なプロセス性能及び生成品質を可能にする。規模及びバイオリアクターシステムを変えるだけでバイオリアクター内でのインキュベーションの期間が変化する場合があり、例えば、期間は８～９日の間、または１５～１６日の間であり得る。別の実施形態では、バイオリアクター内でのインキュベーションの期間は、約７日間、約８日間、約９日間、約１０日間、約１１日間、約１２日間、約１３日間、約１４日間、約１５日間、約１６日間、約１７日間、約１８日間、約１９日間、約２０日間、またはそれ以上である。別の実施形態では、潅流バイオリアクターが使用される場合、インキュベーションの期間は７～１２０日間にまで及び得る。上記に列挙される各可能性は、本明細書に開示される実施形態である。
別の実施形態では、バイオリアクター内で十分に混合された細胞懸濁液を維持し、かつ栄養供給物を混ぜ合わせながら、ｐＨ、溶存酸素分圧（ＤＯＴ）、及び温度等のプロセスパラメータに関して異種環境中での哺乳動物細胞の培養を可能にする大規模バイオリアクターが本明細書に開示される。別の実施形態では、バイオリアクターは使い捨てバイオリアクターである。
本明細書に開示される製造する方法は、バイオリアクター、バイオリアクターシステム、及び特に哺乳動物細胞の真核細胞の培養方法の提供により、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを製造する方法の根底にある技術的問題を解決する。
一実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも２５０リットル（Ｌ）の容量を有する。別の実施形態では、バイオリアクターは、少なくとも５００Ｌの容量を有する。別の実施形態では、容量は、少なくとも１０００Ｌ、少なくとも２０００Ｌ、少なくとも５，０００Ｌ、少なくとも１０，０００Ｌ、少なくとも１２，０００Ｌ、または少なくとも１５，０００Ｌである。
別の実施形態では、細胞は、次第により大きい容量のバイオリアクター内で継代培養される（本明細書の実施例を参照されたい）。
組成物
いくつかの実施形態では、本明細書に開示され、本明細書に開示される方法を使用して製造されるＣＴＰ修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを使用して、成長及び重量に関連する症状、例えば、成長欠乏障害、ＡＩＤＳ消耗、老化、ＨＩＶ感染対象の免疫機能不全、分解作用の病気、術後回復、うっ血型心筋症、肝臓移植、肝切除後の肝再生、慢性腎不全、腎性骨異栄養症、骨粗しょう症、軟骨無形成症／軟骨低形成症、骨格異形成症、クローン病等の慢性炎症性または栄養障害、短腸症候群、若年性関節リウマチ、嚢胞性繊維症、男性不妊症、Ｘ連鎖低リン血症性くる病、ダウン症候群、脊椎破裂、ヌーナン症候群、肥満症、筋力障害、及び線維筋痛症を有する対象を治療することができる。一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、個体それ自体に提供され得る。一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドは、それが薬学的に許容される担体と混合されている薬学的組成物の一部として個体に提供され得る。
当業者は、「薬学的組成物」という用語が、生理的に好適な担体及び賦形剤等の他の化学成分と合わせた、本明細書に記載される１つ以上の活性成分の製剤を包含し得ることを理解するであろう。薬学的組成物の目的は、有機体への化合物の投与を促進することである。
本明細書に開示される修飾ペプチドは、哺乳動物（例えば、ウシ、ウマ、ブタ、ヒツジ、ヒト）に経口または非経口で投与され得る、それ自体が既知である担体、希釈剤等と混合したカプセル及び注射剤等の好適な薬学的製剤に製剤化することができる。
当業者は、「活性成分」という用語が、生物学的効果を説明できる目的のポリペプチド配列を包含し得ることを理解するであろう。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される組成物はいずれも、任意の形態で目的のタンパク質に結合した少なくとも２つのＣＴＰ配列を含むことになる。一実施形態では、組み合わせ製剤が本明細書に開示される。当業者は、「組み合わせ製剤」という用語が、上記に定義される組み合わせパートナーが、独立して、または組み合わせパートナーの際立った量での異なる固定された組み合わせの使用によって、すなわち、同時に（ｓｉｍｕｌｔａｎｅｏｕｓｌｙ）、同時に（ｃｏｎｃｕｒｒｅｎｔｌｙ）、別々に、または順次投薬され得るという意味で、「パーツキット」を包含し得ることを理解するであろう。いくつかの実施形態では、パーツキットのパーツは次いで、例えば、同時に、またはパーツキットの任意のパーツについて異なる時点で、かつ等しいもしくは異なる時間間隔を置いて経時的にずらして投与され得る。いくつかの実施形態では、組み合わせパートナーの総量の比率が、組み合わせ製剤に投与され得る。一実施形態では、組み合わせ製剤は、例えば、治療される患者部分母集団の必要性、または特定の疾患、疾患の重症度、年齢、性別、または体重に起因する必要性が異なり得る単一の患者の必要性に対応するために、変化し得、これは当業者によって容易に作製され得る。
当業者は、互換的に使用され得る「生理的に許容される担体」及び「薬学的に許容される担体」という言い回しが、有機体に著しい刺激をもたらさず、投与された化合物の生物活性及び特性を抑止しない担体または希釈剤を包含し得ることを理解するであろう。アジュバントは、これらの言い回しに含まれる。一実施形態では、薬学的に許容される担体中に含まれる成分の１つは、例えば、有機及び水溶性の両方の培地での広い範囲の可溶性を有する生体適合性ポリマーであるポリエチレングリコール（ＰＥＧ）であり得る（Ｍｕｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９７９））。
当業者は、「賦形剤」という用語が、活性成分の投与を更に促進するために薬学的組成物に添加された不活性物質を包含し得ることを理解するであろう。一実施形態では、賦形剤には、炭酸カルシウム、リン酸カルシウム、デンプンの様々な糖及びタイプ、セルロース誘導体、ゼラチン、植物油、及びポリエチレングリコールが含まれる。
薬物の製剤及び投与の技術は、「Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ'ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ」Ｍａｃｋ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ Ｃｏ．，Ｅａｓｔｏｎ，ＰＡ，ｌａｔｅｓｔ ｅｄｉｔｉｏｎに見出され、これは参照により本明細書に組み込まれる。
一実施形態では、投与の好適な経路としては、例えば、経口、直腸、経粘膜、経鼻、腸、または、筋肉内、皮下、及び髄内注射、ならびに髄腔内、脳室内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、もしくは眼内注射を含む直接非経口送達が挙げられる。
一実施形態では、製剤は、全身的な様式ではなく局所、例えば、患者の身体の特定の領域への直接的な製剤の注射を介して投与される。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．１～５ｍｌの溶液中に１～９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．１～５ｍｌの溶液中に１～５０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．１～５ｍｌの溶液中に１～２５マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．１～５ｍｌの溶液中に５０～９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．１～５ｍｌの溶液中に１０～５０マイクログラムの用量で投与される。
別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１週間に１回の筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射によって、０．１～５ｍｌの溶液中に１～９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１週間に２回の筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射によって、０．１～５ｍｌの溶液中に１～９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１週間に３回の筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射によって、０．１～５ｍｌの溶液中に１～９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、２週間ごとに１回の筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射によって、０．１～５ｍｌの溶液中に１～９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１７日ごとに１回の筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射によって、０．１～５ｍｌの溶液中に１～９０マイクログラムの用量で投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１９日ごとに１回の筋肉内（ＩＭ）注射、皮下（ＳＣ）注射、または静脈内（ＩＶ）注射によって、０．１～５ｍｌの溶液中に１～９０マイクログラムの用量で投与される。
投与量範囲の様々な実施形態が企図される。一実施形態では、本明細書に開示されるポリペプチドの投与量は、０．０５～８０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．０５～５０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．１～２０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．１～１０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．１～５ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．５～５ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．５～５０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５～８０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、３５～６５ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、３５～６５ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、２０～６０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、４０～６０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、４５～６０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、４０～６０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、６０～１２０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１２０～２４０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、４０～６０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、２４０～４００ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、４５～６０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１５～２５ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５～１０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５５～６５ｍｇ／日の範囲内である。
一実施形態では、投与量は、２０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、３０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、４０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、５０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、６０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、７０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、８０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、９０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１００ｍｇ／日である。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの投与量は、０．００５～１００ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、０．００５～５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．０１～５０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．１～２０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．１～１０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．０１～５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．００１～０．０１ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．００１～０．１ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．１～５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．５～５０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．２～１５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、０．８～６５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１～５０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５～１０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、８～１５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１０～２０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、２０～４０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、６０～１２０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１２～４０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、４０～６０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５０～１００ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１～６０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１５～２５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５～１０ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５５～６５ｍｇ／週の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１～５ｍｇ／週の範囲内である。
別の実施形態では、対象に与えられるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの投与量は、同じ対象の集団（例えば、小児、高齢者、男性、女性、ＧＨ分泌不全、特定の国籍等）からの基準対象に与えられる標準投与量の５０％である。別の実施形態では、投与量は、特定の対象の集団からの対象に与えられる投与量の３０％である。別の実施形態では、投与量は、特定の対象の集団からの対象に与えられる投与量の４５％である。別の実施形態では、投与量は、特定の対象の集団からの対象に与えられる投与量の１００％である。
別の実施形態では、投与量は、１～５ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、２ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、４ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、１．２ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、１．８ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、およそ、本明細書に記載される投与量である。
別の実施形態では、投与量は、１～５ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投与量は、２ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投与量は、４ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投与量は、１．２ｍｇ／投与である。別の実施形態では、投与量は、１．８ｍｇ／投与である。一実施形態では、組成物は、１週間に１回、投与される。別の実施形態では、組成物は、２週間に１回、で投与される。別の実施形態では、組成物は、１カ月に１回、投与される。別の実施形態では、組成物は、１日１回、投与される。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、鼻腔内投与剤形に製剤化される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、注射可能な投与剤形に製剤化される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．０００１ｍｇ～０．６ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．００１ｍｇ～０．００５ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．００５ｍｇ～０．０１ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．０１ｍｇ～０．３ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、０．２ｍｇ～０．６ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１～１００マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１０～８０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、２０～６０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１０～５０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、４０～８０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１０～３０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、３０～６０マイクログラムの範囲の用量で対象に投与される。
別の実施形態では、ＣＴＰで修飾されたＧＨは、０．２ｍｇ～２ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、２ｍｇ～６ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、４ｍｇ～１０ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、５ｍｇ及び１５ｍｇの範囲の用量で対象に投与される。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、筋肉内に注射される（筋肉内注射）。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、皮膚の下に注射される（皮下注射）。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、筋肉内に注射される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、皮膚の下に注射される。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＧＨ治療の使用におけるコンプライアンスを向上させることを含み、それを必要とする対象に本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを提供し、それによりＧＨ治療の使用におけるコンプライアンスを向上させる。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチド等の５０，０００ダルトン未満の分子量のタンパク質薬剤は一般に、インビボにおいて短寿命種であり、数時間の短い循環半減期を有する。別の実施形態では、投与の皮下経路は一般に、循環へのより緩徐な放出を提供する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ポリペプチドは、ＧＨ等の５０，０００ダルトン未満の分子量のタンパク質薬剤の半減期を延長する。
別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの免疫原性は、単離されたＧＨと等しい。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨの免疫原性は、単離されたＧＨと同等である。別の実施形態では、本明細書に記載されるようにＣＴＰペプチドでＧＨを修飾することは、ＧＨの免疫原性を低減させる。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、単離されたＧＨと同程度に活性である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、単離されたＧＨよりも活性である。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨは、生物活性の低減を最小化しながら、分解に対するＧＨの保護能力を最大化する。
別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＧＨ治療を必要とする慢性病を患う対象のコンプライアンスを向上させることを含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、上記のようにＧＨをＣＴＰで修飾することによりＧＨの投薬頻度の低減を可能にする。別の実施形態では、コンプライアンスという用語は、固守を含む。別の実施形態では、本明細書に開示される方法は、ＧＨの投与の頻度を低減することによりＧＨ治療を必要とする患者のコンプライアンスを向上させることを含む。別の実施形態では、ＧＨの投与の頻度の低減は、ＣＴＰ修飾ＧＨをより安定にするＣＴＰ修飾によって達成される。別の実施形態では、ＧＨの投与の頻度の低減は、ＧＨの増加するＴ１／２の結果として達成される。別の実施形態では、ＧＨの投与の頻度の低減は、ＧＨのグリアランス時間の増加の結果として達成される。別の実施形態では、ＧＨの投与の頻度の低減は、ＧＨのＡＵＣ面積の増加の結果として達成される。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１日１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、２日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、３日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、４日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、５日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、６日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１週間に１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、７～１４日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１０～２０日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、５～１５日ごとに１回、対象に投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、１５～３０日ごとに１回、対象に投与される。
別の実施形態では、投与量は、５０～５００ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、５０～１５０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１００～２００ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、１５０～２５０ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、２００～３００ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、２５０～４００ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、３００～５００ｍｇ／日の範囲内である。別の実施形態では、投与量は、３５０～５００ｍｇ／日の範囲内である。
一実施形態では、投与量は、２０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、３０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、４０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、５０ｍｇ／日である。一実施形態では、投与量は、０．０１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、０．１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、０．５３０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、０．０５ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、５０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、２０～７０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、５ｍｇ／日である。
別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／２日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／３日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／４日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／５日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／６日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／９日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／１１日である。別の実施形態では、投与量は、１～９０ｍｇ／１４日である。
別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨ投与量は、１０～５０ｍｇ／日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／２日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／３日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／４日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０マイクログラム／５日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／６日である。別の実施形態では、投与量は、１０－５０ｍｇ／週である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／９日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／１１日である。別の実施形態では、投与量は、１０～５０ｍｇ／１４日である。
一実施形態では、経口投与は、錠剤、カプセル、甘味入り錠剤、咀嚼錠、懸濁液、乳剤等を含む単位剤形を含む。かかる単位剤形は、安全かつ有効量の所望の化合物（複数可）を含み、そのそれぞれは、一実施形態では、約０．７もしくは３．５ｍｇ～約２８０ｍｇ／７０ｋｇ、または他の実施形態では、約０．５もしくは１０ｍｇ～約２１０ｍｇ／７０ｋｇである。経口投与用の単位剤形の調製に好適な薬学的に許容される担体は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、錠剤は、典型的には、従来の薬学的に適合するアジュバント、例えば、炭酸カルシウム、炭酸ナトリウム、マンニトール、ラクトース、及びセルロース等の不活性希釈剤；デンプン、ゼラチン、及びスクロース等の結合剤；デンプン、アルギン酸、及びクロスカルメロース等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸、及びタルク等の潤沢剤を含む。一実施形態では、二酸化ケイ素等の滑剤を使用して、粉末混合物の流動特性を向上させることができる。一実施形態では、外観のためにＦＤ＆Ｃ染料等の着色剤を添加してもよい。アスパルテーム、サッカリン、メントール、ペパーミント、及び果実風味等の甘味料及び香味剤は、咀嚼剤に有用なアジュバントである。カプセルは典型的に、１つ以上の上記の固形希釈剤を含む。いくつかの実施形態では、担体成分の選択は、本明細書に開示される目的において重要ではない味、コスト、及び保存性等の補助的考慮事項に依存し、当業者によって容易に行われ得る。
一実施形態では、経口投与剤形は、所定の放出プロファイルを含む。一実施形態では、本明細書に開示される経口投与剤形は、持続放出性の錠剤、カプセル、甘味入り錠剤、または咀嚼剤を含む。一実施形態では、本明細書に開示される経口投与剤形は、徐放出性の錠剤、カプセル、甘味入り錠剤、または咀嚼剤を含む。一実施形態では、本明細書に開示される経口投与剤形は、即時放出性の錠剤、カプセル、甘味入り錠剤、または咀嚼剤を含む。一実施形態では、経口投与剤形は、当業者に既知であるように、薬学的活性成分の所望の放出プロファイルに従って製剤化される。
いくつかの実施形態では、経口組成物は、液体溶液、乳剤、懸濁液等を含む。いくつかの実施形態では、かかる組成物の調製に好適な薬学的に許容される担体は、当該技術分野で公知である。いくつかの実施形態では、液体経口組成物は、約０．０１２％～約０．９３３％、または他の実施形態では、約０．０３３％～０．７％の所望の化合物（複数可）を含む。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される方法での使用のための組成物は、溶液または乳剤を含み、これはいくつかの実施形態では、安全かつ有効量の本明細書に開示される化合物と、任意で、局所的鼻腔内投与を意図した他の化合物とを含む水溶液または乳剤である。いくつかの実施形態では、組成物は、約０．０１％～約１０．０％ｗ／ｖ、より好ましくは約０．１％～約２．０の主題の化合物を含み、これは化合物の鼻腔内経路による全身送達に使用される。
別の実施形態では、薬学的組成物は、液体製剤の静脈内、動脈内、または筋肉内注射によって投与される。いくつかの実施形態では、液体製剤は、溶液、分散、乳剤、油等を含む。一実施形態では、薬学的組成物は静脈内に投与され、よって、静脈内投与に好適な形態に製剤化される。別の実施形態では、薬学的組成物は動脈内に投与され、よって、動脈内投与に好適な形態に製剤化される。別の実施形態では、薬学的組成物は筋肉内に投与され、よって、筋肉内投与に好適な形態に製剤化される。
別の実施形態では、薬学的組成物は体表面に局所的に投与され、よって、局所的投与に好適な形態に製剤化される。好適な局所的製剤は、ゲル、軟膏、クリーム、ローション、点滴薬等を含む。局所的投与について、本明細書に開示される化合物は、薬学的担体を伴うかまたは伴わずに、生理的に許容される希釈剤中で溶液、懸濁液、または乳剤として調製及び適合された追加の適切な治療剤（複数可）と組み合わされる。
一実施形態では、本明細書に開示される薬学的組成物は、当該技術分野で公知のプロセスによって、例えば従来の混合、溶解、粒状化、糖剤作製、湿式粉砕、乳剤化、カプセル化、封入、または凍結乾燥プロセスによって製造される。
一実施形態では、本明細書の開示に従う使用のための薬学的組成物は、薬学的に使用され得る活性成分の製剤への加工を促進する賦形剤及び補助剤を含む１つ以上の生理的に許容される担体を使用する従来の様式で製剤化される。一実施形態では、製剤は、選択された投与経路に左右される。
一実施形態では、本明細書に開示される注射剤は、水溶液中で製剤化される。一実施形態では、本明細書に開示される注射剤は、生理的に適合する緩衝液、例えばハンクス液、リンゲル液、または生理食塩緩衝液中で製剤化される。いくつかの実施形態では、経粘膜投与のために、透過される障壁に適切な浸透液が製剤化に使用される。かかる浸透液は、当該技術分野で既知である。
一実施形態では、本明細書に記載される製剤は、例えばボーラス注射または持続投与による非経口投与のために製剤化される。いくつかの実施形態では、注射のための製剤化は、単位剤形で、例えばアンプルで、または反復投与容器で、任意で添加された保存剤を伴って提示される。いくつかの実施形態では、組成物は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液、または乳剤であり、懸濁剤、安定剤、及び／または分散剤等の調合剤を含有する。
組成物はまた、いくつかの実施形態では、塩化ベンザルコニウム及びチメロサール等の保存剤；エデト酸ナトリウム及び他のもの等のキレート剤；リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等の緩衝剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール等の等張剤；アスコルビン酸、アセチルシステイン、二亜硫酸ナトリウム等の抗酸化剤；セルロース及びその誘導体を含むポリマー等の粘度調節剤；及びポリビニルアルコール、ならびに必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調節するための酸及び塩基を含む。組成物はまた、いくつかの実施形態では、局所麻酔または他の活性物質を含む。組成物は、スプレー、噴霧、点滴等として使用することができる。
いくつかの実施形態では、非経口投与用の薬学的組成物は、水溶形態の活性化製剤の水溶液を含む。加えて、いくつかの実施形態では、活性成分の懸濁液は、適切な油性または水性の注射懸濁液として調製される。好適な親油性溶媒またはビヒクルとしては、いくつかの実施形態では、ゴマ油等の脂肪油、またはオレイン酸エチル、トリグリセリド、またはリポソーム等の合成脂肪酸エステルが挙げられる。水溶性注射懸濁液は、いくつかの実施形態では、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ソルビトール、またはデキストラン等の懸濁液の粘度を増加させる物質を含有する。別の実施形態では、懸濁液はまた、高濃度の溶液の調製を可能にするための好適な安定剤または活性成分の可溶性を増加させる薬剤も含有する。
別の実施形態では、活性化合物は、小胞、具体的にはリポソーム中に送達されてもよい（Ｌａｎｇｅｒ，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０）、Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，ｉｎ Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ． ３５３－３６５（１９８９）、Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ，同書，ｐｐ． ３１７－３２７を参照されたい；概して同書を参照されたい）。
別の実施形態では、制御放出系に送達された薬学的組成物は、静脈内点滴、埋め込み型浸透圧ポンプ、経皮パッチ、リポソーム、または他の様式の投与のために製剤化される。一実施形態では、ポンプが使用される（Ｌａｎｇｅｒ，上記、Ｓｅｆｔｏｎ，ＣＲＣ Ｃｒｉｔ． Ｒｅｆ． Ｂｉｏｍｅｄ． Ｅｎｇ． １４：２０１（１９８７）、Ｂｕｃｈｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｕｒｇｅｒｙ ８８：５０７（１９８０）、Ｓａｕｄｅｋ ｅｔ ａｌ．，Ｎ．Ｅｎｇｌ． Ｊ．Ｍｅｄ． ３２１：５７４（１９８９））を参照されたい。別の実施形態では、高分子材料を使用してもよい。なお別の実施形態では、制御放出系は、治療標的に近接した位置に、すなわち脳に置かれてもよく、それにより全身投与のうちの少量のみを要する（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，ｉｎ Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，上記，ｖｏｌ． ２，ｐｐ． １１５－１３８（１９８４））を参照されたい。他の制御放出系は、Ｌａｎｇｅｒによる概説の中で記述されている（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：１５２７－１５３３（１９９０））。
いくつかの実施形態では、活性成分は、好適なビヒクル、例えば、無菌パイロジェンフリー水性溶液との組成のため、使用前は、粉末状である。組成物は、いくつかの実施形態では、噴霧または吸入投与のために製剤化される。別の実施形態では、組成物は、噴霧手段が設置された容器に収容される。
一実施形態では、本明細書に開示される調剤は、直腸用の組成物、例えばカカオ脂または他のグリセリド等の従来の坐薬基剤を使用した、例えば坐薬または停留浣腸剤に製剤化される。
いくつかの実施形態では、本明細書に開示される文脈での使用に好適な薬学的組成物は、活性成分が意図される目的を達成するために有効な量で含有されている組成物を含む。いくつかの実施形態では、治療有効量は、疾患の症状を予防、緩和、もしくは改善するか、または治療される対象の生存期間を延長するために有効な活性成分の量を意味する。
一実施形態では、治療有効量の判定は、十分に当業者の手腕の範囲内である。
組成物はまた、塩化ベンザルコニウム及びチメロサール等の保存剤；エデト酸ナトリウム及び他のもの等のキレート剤；リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩等の緩衝剤；塩化ナトリウム、塩化カリウム、グリセリン、マンニトール等の等張剤；アスコルビン酸、アセチルシステイン、二亜硫酸ナトリウム 等の抗酸化剤；セルロース及びその誘導体を含むポリマー等の粘度調節剤；及びポリビニルアルコール、ならびに必要に応じてこれらの水性組成物のｐＨを調節するための酸及び塩基を含む。組成物はまた、局所麻酔または他の活性物質を含む。組成物は、スプレー、噴霧、点滴等として使用することができる。
薬学的に許容される担体またはその成分として働き得る物質のいくつかの例としては、糖、例えばラクトース、グルコース、スクロース；デンプン、例えばコーンスターチ及びジャガイモデンプン；セルロース及びその誘導体、例えばカルボキシメチルセルロースナトリウム、エチルセルロース、及びメチルセルロース；粉末状トラガント；モルト；ゼラチン；タルク；固形潤滑剤、例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム；硫酸カルシウム；植物油、例えばピーナツ油、綿実油、ゴマ油、オリーブ油、トウモロコシ油、及びテオブロマの油；ポリオール、例えばプロピレングリコール、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、及びポリエチレングリコール；アルギン酸；乳化剤、例えばＴｗｅｅｎ（商標）ブランドの乳化剤；湿潤剤、例えばラウリル硫酸ナトリウム；着色剤；香味剤；打錠剤、安定剤；抗酸化剤；保存剤；パイロジェンフリー水、等張食塩水；ならびにリン酸緩衝液が上がれられる。化合物と併せて使用される薬学的に許容される担体の選択は、基本的に、化合物が投与される方法によって決定される。対象の化合物が注射される場合、一実施形態では、薬学的に許容される担体は、血液に適合された懸濁化剤を含む無菌の生理食塩水であり、そのｐＨは約７．４に調節される。
加えて、組成物は、結合剤（例えばアカシア、コーンスターチ、ゼラチン、カルボマー、エチルセルロース、グアーガム、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、ポビドン）、崩壊剤（例えばコーンスターチ、ジャガイモデンプン、アルギン酸、二酸化ケイ素、クロスカルメロースナトリウム、クロスポビドン、グアーガム、デンプングリコール酸ナトリウム、）、様々なｐＨ及びイオン強度の緩衝剤（例えばＴｒｉｓ－ＨＣＩ、酢酸塩、リン酸塩）、添加剤、例えば表面への吸収を防止するためのアルブミンまたはゼラチン、洗剤（例えばＴｗｅｅｎ２０、Ｔｗｅｅｎ８０、ＰｌｕｒｏｎｉｃＦ６８、胆汁酸塩）、プロテアーゼ阻害剤、界面活性剤（例えばラウリル硫酸ナトリウム）、透過促進剤、可溶化剤（例えばグリセロール、プリエチレングリセロール）抗酸化剤（例えばアスコルビン酸、メタ重亜硫酸ナトリウム、ブチルヒドロキシアニソール）、安定剤（例えばヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース）、増粘剤（例えばカルボマー、コロイド状二酸化ケイ素、エチルセルロース、グアーガム）、甘味剤（例えばアスパルテーム、クエン酸）、保存剤（例えばチメロサール、ベンジルアルコール、パラベン）、滑沢剤（例えばステアリン酸、ステアリン酸マグネシウム、ポリエチレングリコール、ラウリル硫酸ナトリウム）、流動補助剤（例えばコロイド状二酸化ケイ素）、可塑剤（例えばフタル酸ジエチル、クエン酸トリエチル）、乳化剤（例えばカルボマー、ヒドロキシプロピルセルロース、ラウリル硫酸ナトリウム）、ポリマー被覆（例えばポロキサマーまたはポロキサミン）、被覆剤または膜形成剤（例えばエチルセルロース、アクリレート、ポリメタクリレート）、及び／またはアジュバントを更に含む。
シロップ剤、エリキシル剤、乳化剤、及び懸濁液のための担体の典型的な成分としては、エタノール、グリセロール、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、液体スクロース、ソルビトール、及び水が挙げられる。懸濁液について、典型的な懸濁剤としては、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、セルロース（例えばＡｖｉｃｅｌ（商標）、ＲＣ－５９１）、トラガント、及びアルギン酸ナトリウムが挙げられ、典型的な湿潤剤としては、レシチン及びポリエチレンオキシドソルビタン（例えばポリソルベート８０）が挙げられる。典型的な保存剤には、メチルパラベン及び安息香酸ナトリウムが含まれる。別の実施形態では、経口用の液状組成物はまた、上記に開示される甘味剤、香味剤、及び着色剤等の１つ以上の成分を含有する。
組成物はまた、ポリ乳酸、ポルグリコール酸、ヒドロゲル等の高分子化合物の粒状製剤中もしくはその上、またはリポソーム、マイクロエマルション、ミセル、単層もしくは多層小胞、血球影、またはスフェロプラスト中への活性材料の組み込みを含む。かかる組成物は、生理状態、可溶性、安定性、インビボ放出の速度、及びインビボクリアランスの速度に影響を及ぼすことになる。
別の実施形態では、組成物は、ポリマー（例えばポロキサマーまたはポロキサミン）で被覆された粒状組成物、及び組織特異的受容体、リガンド、または抗原に対する抗体に結合されるかまたは組織特異的受容体のリガンドに結合された化合物を含む。
いくつかの実施形態では、化合物は、ポリエチレングリコール、ポリエチレングリコールのコポリマー、及びポリプロピレングリコール、カルボキシメチルセルロース、デキストラン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、またはポリプロリン等の水溶ポリマーの共有結合で修飾される。別の実施形態では、修飾された化合物は、静脈内注射の後に、対応する未修飾の化合物が示すよりも実質的により長い半減期を血液中で示す。一実施形態では、修飾はまた、水溶液中での化合物の可溶性を増加させ、凝集を取り除き、化合物の物理的及び化学的安定性を向上させ、化合物の免疫原性及び反応性を大幅に低減させる。別の実施形態では、所望のインビボ生物活性が、かかる高分子化合物の投与によって達成され、未修飾の化合物よりもより少ない頻度、またはより少ない用量で外転する。
いくつかの実施形態では、有効量または用量の調製は、初めにインビトロアッセイによって予測することができる。一実施形態では、用量は動物モデルにおいて配合することができ、かかる情報を使用してより正確にヒトにおける有用な用量を判定することができる。
一実施形態では、本明細書に記載される活性成分の毒性及び治療有効性は、インビトロ、細胞培養、または実験動物での標準医薬手順によって判定することができる。一実施形態では、これらのインビトロ及び細胞培養アッセイならびに動物研究から取得されたデータを使用して、ヒトにおける使用のための用量の範囲を配合することができる。一実施形態では、投与量は、用いられる投与剤形及び利用される投与経路によって変化する。一実施形態では、正確な配合、投与経路、及び投与量は、患者の体調を考慮して個々の医師によって選択され得る。［例えば、Ｆｉｎｇｌ，ｅｔ ａｌ．，（１９７５）「Ｔｈｅ Ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｉｃａｌ Ｂａｓｉｓ ｏｆ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ」，Ｃｈ． １ ｐ．１を参照されたい］。
一実施形態では、治療される病態の重症度及び応答性によって、投与は、単一または複数の投与であり得、これは数日間から数週間に及ぶか、または回復がもたらされるかこの病態の減少が達成されるまでの期間に及ぶ治療を伴う。
一実施形態では、投与される組成物の量は、当然ながら、治療される対象、苦痛の重症度、投与の様式、処方する意思の判断等に左右される。
一実施形態では、適合する薬学的担体内に製剤化される本明細書に開示される製剤を含む組成物はまた、調製され、適切な容器内に入れられ、適応症状の治療のために標識される。
別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、全身投与を介して投与される。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰ修飾ｈＧＨは、静脈内、筋肉内、または皮下注射によって投与される。別の実施形態では、ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、非イオン性界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｅ ａｃｔｉｖｅ ａｇｅｎｔｓ）（すなわち、界面活性剤（ｓｕｒｆａｃｔａｎｔｓ））、様々な糖、有機ポリオール、及び／またはヒト血清アルブミン等の複合有機賦形剤及び安定剤と組み合わせた凍結乾燥（ｌｙｏｐｈｉｌｉｚｅｄ）（すなわち、凍結乾燥（ｆｒｅｅｚｅ－ｄｒｉｅｄ））製剤である。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の、無菌水中の記載されるＣＴＰで修飾された凍結乾燥ＧＨを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の、無菌ＰＢＳ中の本明細書に記載される凍結乾燥されたＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、注射用の、無菌０．９％ＮａＣＬ中の本明細書に記載される凍結乾燥されたＣＴＰ修飾ｈＧＨを含む。
別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰで修飾されたＧＨと、ヒト血清アルブミン、ポリオール、糖、及び陰イオン性界面活性剤等の複合担体とを含む。例えば、ＷＯ８９／１０７５６（Ｈａｒａ ｅｔ ａｌ．－ポリオール及びｐ－ヒドロキシ安息香酸塩を含有する）を参照されたい。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に開示されるＣＴＰ修飾ｈＧＨと、ラクトビオン酸と、酢酸／グリシン緩衝剤とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰで修飾された凍結乾燥ＧＨと、グリシンまたはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、緩衝剤（例えば、酢酸）と、等張剤（例えばＮａＣｌ）とを含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰで修飾された凍結乾燥ＧＨと、リン酸緩衝剤、グリシンと、ＨＳＡとを含む。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、約４～７．２の間のｐＨを有する緩衝溶液に置かれると安定する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、アミノ酸、また時には塩（アミノ酸が負荷された側鎖を含有しない場合）を安定剤として安定する。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、約０．３重量％～５重量％の間でアミノ酸である安定剤を含む液体組成物である。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、投与精度及び製品安全性を提供する。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、注射可能な用途での使用のための生物学的に活性な安定した液体製剤を提供する。一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、非粘性の液体製剤を含む。別の実施形態では、薬学的組成物は、本明細書に記載されるＣＴＰで修飾された、凍結乾燥されていないＧＨを含む。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、液体状態での長期間の保管を許容し、投与前の保管及び輸送を容易にする液体製剤を提供する。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、固体脂質をマトリックス材として含む。別の実施形態では、本明細書に記載されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む注射可能な薬学的組成物は、固体脂質をマトリックス材として含む。別の実施形態では、噴霧凝固による脂質微粒子の生成は、Ｓｐｅｉｓｅｒ（Ｓｐｅｉｓｅｒ ａｎｄ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ． Ｒｅｓ． ８（１９９１）４７－５４）に記載され、経口投与用の脂質ナノペレットがそれに続く（Ｓｐｅｉｓｅｒ ＥＰ０１６７８２５（１９９０））。別の実施形態では、使用する脂質に対して、体は耐性を有する（例えば、非経口栄養の乳剤中に存在する脂肪酸からなるグリセリド）。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、リポソームの形態である（Ｊ．Ｅ．Ｄｉｅｄｅｒｉｃｈｓ ａｎｄ ａｌ．，Ｐｈａｒｍ．／ｎｄ． ５６（１９９４）２６７－２７５）。
別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、高分子微粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む注射可能な薬学的組成物は、高分子微粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、リポソームを含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、脂肪乳剤を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、微小球を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、両親媒性脂質を含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを含む薬学的組成物は、薬物と脂質マトリックスと界面活性剤とを含む脂質ナノ粒子を含む。別の実施形態では、脂質マトリックスは、少なくとも５０％ｗ／ｗのモノグリセリド含有量を有する。
一実施形態では、本明細書に開示される組成物は、活性成分を含有する１つ以上の単位剤形を含有するＦＤＡ認可キット等のパックまたはディスペンサ装置内に提示される。一実施形態では、パックは、例えば、金属またはブリスターパック等のプラスチック箔を含む。一実施形態では、パックまたはディスペンサ装置には、投与の指示書が添付されている。一実施形態では、パックまたはディスペンサは、医薬の製造、使用、または販売を規制する政府機関によって規定された形態の容器に関連する通知に収容され、この通知は、組成物またはヒトまたは動物投与の形態の機関による認可を表す。かかる通知は、一実施形態では、処方薬または認可された製品への装入物のための米国食品医薬品局によって認可されたラベルである。
一実施形態では、本明細書に開示されるＣＴＰで修飾されたＧＨを、各薬剤単独での治療と比較して向上した治療効果を達成するために、追加の活性化剤と共に個体に提供することができることは理解されるであろう。別の実施形態では、手段（例えば投与及び相補的薬剤の選択）は、組み合わせ治療に関連する副作用を最小化するために講じられる。
別の実施形態では、本明細書に開示される組成物、細胞、プラスミド等と、アプリケーターと、及び本明細書に開示される方法の使用を記載する教材とを含むキットが本明細書に開示される。モデルキットが以下に記載されるが、他の有用なキットの内容物は、本開示に照らして当業者には明らかになるであろう。これらのキットのそれぞれは、本明細書に開示される別個の実施形態を表す。
追加の目的、利点、及び本明細書に開示される新規の特徴は、限定的であることを意図しない以下の実施例の検証によって当業者に明らかになるであろう。加えて、本明細書に開示され、上記に描写され、以下の請求項欄に請求されるような様々な実施形態及び態様のそれぞれは、以下の実施例に実験的支持を見出す。
実施例１ ｈＧＨ構築物の生成
ＭＯＤ－４０２３（ＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰ）の発現
細胞トランスフェクション（ヌクレオフェクション）：安定発現が、ＭＯＤ－４０２３遺伝子の標的細胞染色体への組み込みによって達成された：初めに遺伝子は細胞内に導入され、次に細胞核、そして最後に染色体ＤＮＡに組み込まれた。遺伝子移入の後、細胞を、ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）等の選択マーカーを含有する培地中で培養した。簡単に説明すると：
ｐＳＶ２－ｄｈｆｒ由来のマウスジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）遺伝子を、ｐＣＩネオプラスミドのネオマイシン部位にサブクローニングした。修飾発現ベクターｐＣＩ－ｄｈｆｒを作成するために（図２）。したがって、ＭＯＤ－４０２３発現ベクターは、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）ＩＥ（最初期）エンハンサー／プロモーター及び細胞選択のためのｄｈｆｒ遺伝子を含有する。ＭＯＤ－４０２３遺伝子は、ｈＧＨ遺伝子の５'末端に先行するＣ末端ペプチド（ＣＴＰ）のためのコード配列の１つのコピーと、ｈＧＨ遺伝子の３'末端の直後に続くＣＴＰコード配列の２つのコピーとを含む。ＭＯＤ－４０２３遺伝子を、ｐＣＩ－ｄｈｆｒのオープンリーディングフレーム内にサブクローニングした（図２）。したがって、ＭＯＤ－４０２３発現かセットは、ＣＭＶプロモーターと、ＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰ遺伝子配列と、ＳＶ４０ポリアデニル化配列からなる。
クローン選択－９６ウェルプレートでのプレーティングによる単一の細胞の限界希釈選択を単一細胞培養に適用し、１００％のクローン純度を得るために数回繰り返してもよい。増殖曲線、クローン特性評価、特定の生産性及びタンパク質プロファイルに基づく最も生産性の高いクローンを、バイオリアクターでの植え付けの前に、１Ｌの振とうフラスコ内で繁殖させた。簡単に説明すると：
ＭＯＤ－４０２３タンパク質生成細胞株を、組み換えＤＮＡ技術によって製造した。マスター及びワーキングセルバンク（ＭＣＢ；ＷＣＢ）の誘導を通して、動物要素不含の培地を使用した。無タンパク質培地及び懸濁液増殖に適合されたｄｈｆｒ陰性のＣＤ ＤＧ４４細胞（ＣＨＯ細胞）のトランスフェクションを、ＦｕＧＥＮＥ－６（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ）を使用して行った。細胞培養中の希釈ステップを制限することにより、安定クローンを単離した。最も生産性の高いクローンを、次第に増加する濃度のメトトレキサート（ＭＴＸ）で増幅した。クローン集団倍加レベル（ＰＤＬ）、ＭＯＤ－４０２３生産性（１日ごとの細胞ごとのピコグラム、ＰＣＤ）、及び選択された培地中で得られた最高細胞密度に基づき、最も生産性の高いクローンを単離して、Ｒ＆Ｄバンクの調製に使用し、適格なマスターセルバンク（ＭＣＢ）及びワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の製造がそれに続く。
上流工程
ＭＯＤ－４０２３の上流工程は、２つのタイプの培地配合、増殖培地（培地１）及び生産培地（培地２）からなる。培地１は、メトトレキサート（ＭＴＸ）を含み、培地２は、ＭＴＸを除いて培地１と同一であった。培地１は、２００リットルのバイオリアクター内に播種する前の、細胞培養繁殖（図３のステップ１～４）のために使用され、培地２は、Ｎ－２ステップ（最終生成物の前の２つの繁殖。Ｎは最終生成物を指す）、２００リットルのバイオリアクター（図３のステップ５～６）及び生産バイオリアクター１０００リットル（図３のステップ７）に使用された。
製造プロセス：ＭＯＤ－４０２３
無血清培用培地中で１０００リットル（Ｌ）規模でクローン＃２８を製造した。ＣＨＯ細胞株の培養をいくつかのステップで、ワーキングセルバンク（ＷＣＢ）の単一のバイアルから最終生成物の培養容量まで増殖した。生産細胞培養上清を、バイオバーデン、細菌内毒素、生産性、及び外来ウイルスについて試験した。このプロセスを、５０リットル及び２００リットル播種バイオリアクター、ならびに増殖用の１０００Ｌバイオリアクターを使用して実施した。全ての生成物接触表面は使い捨てである一方、使い捨てでない生成物接触機器は生成物専用である。これらの機器の部品を、バッチ間で洗浄及び消毒した。増殖のために、１０００Ｌバイオリアクターでの植え付けの前に培養を５０Ｌ及び２００Ｌ播種バイオリアクターで増殖させた。最終増殖及び流加バイオリアクター生産を、使い捨てバイオリアクター１０００Ｌ内で実施した。細胞の除去は、使い捨て濾過システム（ミリポア深層フィルター）を使用して達成された。
ＷＣＢのうちの１つまたは２つのバイアルを３７℃で解凍した。細胞を遠心分離し、細胞ペレットを１０ｍＬの新鮮培地低容量振とうフラスコで標的濃度に再懸濁して、３７±０．５℃、５±１％のＣＯ２と共にインキュベートした。２代の継代培養の後に、より高い生存率を有する細胞培養を更に増殖させ、他方の細胞培養は廃棄した。次第に増加する容量の振とうフラスコ内での４つの継代培養ステップを、播種濃度及びワーキングボリューム等の既定のステップパラメータを用いて実行した。容量は、典型的な１０００Ｌバイオリアクターの泳動のための２つの播種バイオリアクターステップに続いた。
５０リットル及び２００リットルの播種バイオリアクターを、播種バイオリアクターとして使用した。植え付けの前に、２００Ｌバイオリアクターをおよそ５０ＬのＰｏｗｅｒＣＨＯ ２ＣＤ培地２（ｗ／ｏ ＭＴＸ）で充填した。プロセス制御を以下のパラメータに設定した：ｐＨ７、温度３７℃、ＤＯ５０％。これらのパラメータは、培地の事前準備及びシードトレイン培養プロセスに適用される。
プロセスパラメータが既定の範囲内に制御されると、種菌の搬送が開始される。５０Ｌ及び２００Ｌ播種バイオリアクターでの細胞増殖の間、プロセスへの供給物の追加は一切適用されなかった。播種バイオリアクターでの予期される培養時間は、細胞が１０００Ｌ生産バイオリアクターに移される前の３～４日間であった。インプロセス制御（ＩＰＣ）のための試料を、毎日採取した。
生産用１０００Ｌバイオリアクターでの細胞繁殖（図３のステップ７）
培養を、バイオリアクター内で１１日間（細胞の生存率に依存する）、３７℃、２０％の溶存酸素（ＤＯ）、及びｐＨ７．２でインキュベートする。３日目に、ｐＨを収集まで６．９にシフトする。４日目に、供給物（脂質を含まないＰｏｗｅｒ Ｆｅｅｄ Ａ）を添加する。供給物容量は、最終バイオリアクター容量の３３％と等しい。６日目に、バイオリアクターにＤＭＳＯを添加する。所望の濃度を維持するためにグルコース供給液を培養に添加し、所望の培養濃度（ＨＣＯ３）を維持するために１Ｍの重炭酸ナトリウムのボーラスを添加した。収集は、既定の基準を使用して実施した。最初の４日間、細胞数、生存率、及び代謝分析について細胞培養を毎日サンプル抽出した。５日目以降は、細胞数、生存率、及び代謝分析について、９日目以降はまた逆相ＨＰＬＣによる特定の生産性について、細胞を１日２回、サンプル抽出した。ＭＯＤ－４０２３の生産性は少なくとも５００ｇｒ／Ｌであり、高糖鎖付加型は、収集物中の総ｈＧＨ－ＣＴＰタンパク質の少なくとも７０％からなる。
本明細書に提示される実施例は、流加モードを使用した製造を示すが、当業者は、概して同様の精製スキームを使用して潅流モードを開発することができるであろう。代替的には、当業者は、インキュベーションの期間が７～１２０日間に及び得る潅流モードを開発することができるであろう。
細胞収集及び保管（図３のステップ８）
使い捨て濾過プロセストレインを使用して収集を実施した。収集物を浄化するため、深層濾過及び０．２μｍ濾過を実施した。浄化に続いて、０．４５／０．２μｍ濾過を行った。深層フィルターを水で洗い流し、残留水分を空気でシステムから吹き出した。濾過プロセスは、≦１５Ｌ／分のポンプスピード及び最大の既定圧力で処理された。後にフィルターをＴｒｉｓ－ＨＣｌ緩衝液で洗浄し、生成物回収を増加させるために加圧空気で吹き出した。
浄化された収集物を、バイオバーデン、細菌内毒素、特定のタンパク質含有量について、ＲＰ－ＨＰＬＣ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、ＨＰＣ Ｅｌｉｓａアッセイ、残存ＤＮＡ、インビトロウイルスアッセイ、ウイルス様粒子、Ｓ＋Ｌ－、及びマイコプラズマによって試験した。
精製プロセス
精製スキームは図４に記載される。
限外濾過及び透析濾過１－ＵＦＤＦ１（ステップ８）
浄化された収集物を、中空糸カートリッジまたは同等のＴＦＦベースＵＦＤＦステップを使用して濃縮及び透析濾過した。カートリッジの公称分子量カットオフサイズは、１０，０００ｋＤａであった。濃縮及び透析濾過された収集物を、特定のタンパク質含有量についてＲＰ－ＨＰＬＣ及びＨＣＰ Ｅｌｉｓａによって試験した。
１％のＴｒｉｔｏｎ－Ｘ１００でのインキュベーションによるウイルス不活性化（ステップ９）
材料をミリポア１．５５ｍ２フィルターに続いて無菌Ｓａｒｔｏｐｏｒｅ ２ ＸＬＧ １０"フィルターを通して、無菌混合バッグへ濾過した（深層濾過ステップ）。次に、Ｔｒｉｓ／１０％Ｔｒｉｔｏｎ溶液を、最終濾過容量に添加し、Ｔｒｉｔｏｎ濃度を１％（ｗ／ｗ）にした。インキュベーションの後、ＤＥＡＥカラムへの負荷の前に、生成物溶液を０．２μｍフィルターユニットで濾過した。
ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ Ｆａｓｔ Ｆｌｏｗクロマトグラフィー（ステップ１０）
ＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を詰めたＤＥＡＥカラムをこのステップに使用した。カラムは、既定のベッド高に詰められた。アッセイにおいてＴｒｉｔｏｎによってもたらされる干渉のため、負荷中の特定のタンパク質をＴｒｉｔｏｎの添加の前に判定した。ＤＥＡＥカラムを、ウイルス不活性化プールで平衡及び負荷し、次いで洗浄した。第２の洗浄を行い、材料をｐＨ８．２の２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ／１５０ｍＭ ＮａＣｌで溶出し、次いで、翌日の処理のために周囲温度（１８～２６℃）で、またはより長い期間のために２～８℃で保管した。全てのクロマトグラフィーステップは、下向流モードで実行した。代替的には、ステップは上昇流モードで行われてもよい。溶出液を、特定のタンパク質についてＲＰ－ＨＰＬＣ（標的：単一ピークとしての主要ピーク溶出液）、ＨＣＰ Ｅｌｉｓａ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ウェスタンブロット、及び残存ＤＮＡによって試験した。
フェニル疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）カラムクロマトグラフィー（ステップ１１）
ＨＩＣフェニル樹脂をこのステップに使用した。カラムは、既定のベッド高に詰められた。ＨＩＣクロマトグラフィーを、生成物の量によって１～５回のサイクルで実施した。代替的には、１０回のサイクルまで泳動してもよい。ＤＥＡＥ溶出液を硫酸アンモニウムで調節することでＨＩＣ負荷を調製した。カラムを、調節され、０．２μｍで濾過されたＤＥＡＥ溶液で平行及び負荷し、次いで、ｐＨ７．３のプロピレングリコールを含有する１０ｍＭリン酸ナトリウム／６００ｍＭ硫酸アンモニウムで洗浄した。材料を、低減された濃度の硫酸アンモニウム及び増加した濃度のｐＨ７．３のプロピレングリコールで溶出し、次いで、更なる処理まで２～８℃で保管した。
ＨＩＣ溶出液限外濾過及び透析濾過（ステップ１２）
ＨＩＣ溶出液を、濃縮し、ｐＨ６．８の１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液へと透析濾過して、容量を低減させ、ＣＨＴカラムステップのための材料を調製した。カートリッジを、ｐＨ６．８の１０ｍＭリン酸ナトリウムで平衡させた。ＨＩＣ溶出液を濃縮し、次いでリン酸ナトリウム緩衝液に対して透析濾過して、６．８±０．１のｐＨ及び透析濾過緩衝液の伝導率の１０％以内の伝導率を達成した。ｐＨ及び伝導率が範囲内にあると判定したら、システムから排水し、０．４５／０．２μｍで無菌バッグへと濾過される。濃縮され透析濾過されたＨＩＣ溶出液の最終容量を、周囲室温（１８～２６℃）で一晩、保管した。濃縮水を、バイオバーデン、細菌内毒素、及び特定のタンパク質についてＡ２８０によって試験した。
セラミックヒドロキシアパタイト（ＣＨＴ）混合モードクロマトグラフィー（ステップ１３）
ヒドロキシアパタイト樹脂を詰めたＣＨＴカラムをこのステップに使用した。カラムは、既定のベッド高に詰められた。カラムを、ｐＨ６．８のリン酸ナトリウムで平衡させ、濃縮及び透析濾過されたＨＩＣ溶出液で負荷し、４カラム容量（ＣＶ）のｐＨ６．８のリン酸ナトリウムで洗浄した。フロースルー及び洗浄材料を収集し、更なる処理まで周囲温度（１８～２６℃）で一晩、保持した。
ＳＰ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅクロマトグラフィー（ステップ１４）
ＳＰ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ樹脂を詰めたカラムをこのステップに使用した。カラムは、既定のベッド高に詰められた。クエン酸でＣＨＴフロースルー画分をｐＨ５．０～６．０に調節することでＳＰ負荷を調製した。ｐＨ調節に続いて、溶液をカラムに負荷し、洗浄ステップがそれに続いた。フロースルーを、更なる処理のために収集した。０．１Ｍの水酸化ナトリウムでｐＨをｐＨ６．０～６．５に調節し、材料を０．４５／０．２μｍフィルターに通して濾過した。材料を、周囲温度（１８～２６℃）で一晩、または２～８℃で２４時間まで保管した。全てのクロマトグラフィーステップは、下向流モードで行った。
ナノ濾過によるウイルス不活性化（ステップ１５）
Ａｓａｈｉ Ｐｌａｎｏｖａ ２０Ｎウイルスフィルターを使用してウイルス濾過を実施した。０．４５／０．２μｍまたは０．１μｍ膜を有するＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２フィルターを、ナノ濾過の前置フィルターとして使用した。ウイルスフィルターを、予め平衡させ、ＷＦＩで作製された最終製剤を注入する。調節されたＳＰ－フロースルーを、フィルタートレイン内を通して連続加圧して通過させ、無菌バイオプロセスバッグに収集した。生成物回収を最大化するためにフィルタートレインを製剤緩衝液で洗い流した。製造業者の推奨手順に従い、使用前後にフィルターの完全性試験を行った。また製造業者の推奨手順に従い、使用後試験には金粒子試験が含まれる。
原薬のＵＦＤＦ３及び濾過及び保管（ステップ１６）
ウイルス濾液を、バルク濾過及び充填の用意のために標的最終ＤＳ濃度（これは５～１００ｍｇ／ｍｌで変化し得る）に濃縮した。３～３０ＫＤａのカットオフを有する使い捨て用または再利用可能なカセットをこのステップに使用した。生成物を第１ステップで５～２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、ｐＨ６．４の１０ｍＭクエン酸塩、１４７ｍＭ ＮａＣｌ（≧７ＤＦ容量）に透析濾過した。代替的には、生成物を第１ステップで５～２５ｍｇ／ｍｌに濃縮し、デバイスによる反復投与を支持するための保存剤、具体的には０．３％ｍ－クレゾールを含む１０ｍＭクエン酸ヒスチジン緩衝液に透析濾過し、また、凝集物及び肉眼では見えない粒子を低減させるためにＰ－１８８を０．２％で添加した。最終生成物濃度を、Ｍｉｌｌｉｐａｋ １００フィルターで調節及び濾過した。濾過された生成物溶液を分取し、－７０±５℃の温度で凍結させた。
ＭＯＤ－４０２３医薬品製造
医薬品（ＤＰ）の製剤化プロセスは、ＭＯＤ－４０２３ ＤＳの解凍から始まる。医薬品は、製剤緩衝液、無菌濾過、及び標準２Ｒバイアル、またはカートリッジもしくは予め充填されたシリンジ等の他の直接包装への充填を使用して原薬（ＤＳ）の必要な濃度への希釈によって達成された。特定のプロセスの記載は、図５に描かれる。
ＭＯＤ－４０２３の特性評価
高糖鎖付加型の収集物中のＭＯＤ－４０２３含有量を、特定のＲＰ－ＨＰＬＣ法によって判定した。収集物中の総タンパク質を、ブラッドフォード分析によって判定した。クローン＃２８によって生成された収集物中の特定のＭＯＤ－４０２３タンパク質のパーセンテージは、収集物中の総タンパク質と比べて７０％超であった。この特有の高レベルの特定のプロテインはまた、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ染色によって分析された収集物中の追加の宿主細胞タンパク質バンド及びＵＳＤＦ試料の強度と比べた、高及び低糖鎖付加ＭＯＤ－４０２３バンドの強い強度によっても認められる（図６）。加えて、ＭＯＤ－４０２３製造上流工程は、低糖鎖付加型と比べた高糖鎖付加ＭＯＤ－４０２３タンパク質の高パーセンテージを可能にするために開発された。高糖鎖付加型は、ＧＨ半減期のより長い延長をもたらすため、標的ＭＯＤ－４０２３形態である。
Ｏ－グリカン含有量
ＭＯＤ－４０２３グリカンを放出することにより糖プロファイルを実施し、続いて２－アミノベンズアミド（２ＡＢ）でグリカンを標識し、ＮＰ－ＨＰＬＣによって洗浄及び分析した。簡単に説明すると：
１モルのＭＯＤ－４０２３タンパク質当たりのＯ－グリカンモル数を計算するために、Ｏ－グリカン含有量アッセイを実行した。Ｏ－グリカンの末端ガラクトースユニットを、β－ガラクトシダーゼでタンパク質から酵素的に切断した。これらの遊離ガラクトースユニットを、ＣａｒｂｏＰａｃ ＰＡ２０カラムで分離し、アンペロメトリック電気化学法で検出した。ガラクトース参照標準物質での外部基準を使用してガラクトース（Ｇａｌ）を定量化した。ガラクトースの含有量は、Ｏ－グリカン構造、Ｇａｌ－ＧａｌＮＡｃと直接的に関連し得る。シアル酸（ＳＡ）含有量は原薬（ＤＳ）中で測定され、最終医薬品（ＤＰ）のＳＡ含有量と異なるべきではない。ＤＳ及びＤＰの両方を使用して、ＣＴＰ修飾ｈＧＨのＳＡ及びＯ－グリカン占有のレベルを示すことができる。図７に描かれる５つの異なるＭＯＤ－４０２３原薬及び医薬品バッチの分析は、ロバストなバッチごとの稠度を示す。この予期しないロバストな糖鎖付加含有量は著しく、ＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰ中のＣＴＰごとのＯ－グリカンの数が、当該技術分野で既知のものを上回って向上したことを示す。本明細書で製造されるＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰは、ｈＣＧが４個のＯ－グリカンのみを有する当該技術分野で既知のレベルと比較して、ＣＴＰごとに４～６個のＯ－グリカンを有した。
ＭＯＤ－４０２３試料の無傷分子量分析
Ｏ－結合糖鎖付加部位の数の情報を取得する目的で、４つの異なるＭＯＤ－４０２３ ＤＳバッチの分子量分析を実施した（実施例３で詳細な結果を参照されたい）。無傷ＭＯＤ－４０２３試料、ならびにノイラミニダーゼを使用して脱シアル化ＭＯＤ－４０２３試料、及びグリコシダーゼを使用して脱糖鎖付加試料を、オンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳによって分析した。脱シアル化試料の無傷質量測定から取得されたデータは、タンパク質が１５個の糖鎖付加部位で修飾されている、ＧａｌＮａｃ－Ｇａｌの１２～１８個の糖鎖付加部位で修飾されたタンパク質が最も強いことを示した。血清占有の高い％を示すこの結果は、当該技術分野で既知のレベルと比較して予期できないものであった（本明細書で製造されるＣＴＰ修飾ｈＧＨにおける６個までと比較して、４個のみの血清が糖鎖付加された）。
ＭＯＤ－４０２３タンパク質試料のＯ－結合糖鎖付加部位占有
ＭＯＤ－４０２３分子ごとのＯ－結合糖鎖付加部位の数の情報を取得する目的で、４つの異なるＭＯＤ－４０２３ ＤＳバッチのＯ－糖鎖付加部位占有をＭ－ｓｃａｎで実施した。ＭＯＤ－４０２３試料を、ノイラミニダーゼを使用して脱シアル化し、還元／カルボキシメチル化ＭＯＤ－４０２３試料のトリプシン消化がそれに続いた。最後に、治療された試料についてオンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳを実行して、指定のソフトウェアを使用してＭＳデータの解釈を行った。トリプシン消化混合物の分析から取得したデータの評価は、タンパク質配列の１００％がマップされることを許容するシグナルを導いた。Ｏ－糖鎖付加は、Ｎ末端及びＣ末端ＣＴＰ領域の両方で行われる。占有部位を、プロリンに続くセリン残基、ならびにセリンが連続する領域での４つのセリンのうちの２つとして特定した。合わせて１８個までのセリン残基が、Ｏ－グリカンの接着部位として働き得る。図８に提示されるように、バッチ間の著しい差異は一切検出されなかった。
ＭＯＤ－４０２３タンパク質試料ＭＯＤ－４０２３（配列番号７）のＯ－結合糖鎖付加部位占有は、Ｎ末端で１つのＣＴＰと、Ｃ末端で並ぶ２つのＣＴＰとを含有する。Ｏ－結合糖鎖付加分析は、各ＣＴＰが４～６個のＯ－結合グリカンを含有し、その全てがセリン（Ｓ）残基と結合することを示した。総じて、ＭＯＤ－４０２３ごとに１２～１８個のＯ－結合糖鎖があり、最も豊富な形態はＭＯＤ－４０２３ごとに１５個のＯ－グリカンを含有した。（以下の実施例２及び３の結果及び結論を参照されたい）ＧＨ配列上に糖鎖は一切存在しなかった。
配列番号７のアミノ酸配列をガイドとして使用して、部位占有分析の結果は、Ｏ－糖鎖付加が各ＣＴＰ上で、ＣＴＰユニットの１０、１３、１５、２１位のセリン残基で行われたことを示し、これは、第２のＣＴＰ配列上の２２９、２３２、２３４、２４０位、ならびに第３のＣＴＰ配列の２５７、２６０、２６２、及び２６８位に対応する。Ｎ末端ＣＴＰのセリン残基Ｓｅｒ１～Ｓｅｒ４（第２のＣＴＰ配列の２２０～２２３位、及び第３のＣＴＰ配列の２４８～２５１位に対応する）上で生じるＯ－糖鎖付加占有の２つの追加の部位が特定された。しかしながら、４つのセリン残基のうちのどの２つが修飾されているのかを質量分析法を介して判定することはできなかった。Ｏ－グリカン占有及び構造の詳細は、以下の実施例２に提供される。
Ｏ－グリカン構造
Ｏ－グリカンのメジャーピークは、モノシアル酸付加されたコア１に対応する（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）。また、少量の中性コア１（Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）、モノシアル酸付加コア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６（Ｇａｌβ１－３）ＧａｌＮＡｃ）及びジシアル酸付加コア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ）が認められた。試料中の主要なシアル酸はＮｅｕ５Ａｃ（ＮＡＮＡ）であった。Ｏ－結合グリカンの構造及びシアル酸型は、それぞれ図１５Ａ及び１５Ｂに提示される。
ＭＯＤ－４０２３純度
ＲＰ－ＨＰＬＣは、分子をそれらの極性によって分離する。より高い極性の溶媒からより低い極性の溶媒への移動相勾配を使用して、強い極性を有する分子をより低い極性の分子よりも先に溶出した。ＲＰ－ＨＰＬＣは、ＭＯＤ－４０２３原薬を、２１．０～２５．０分に認められたメジャーピークと、マイナーピークとに分離し、生成物関連変異を表す（図９）。関連形態を、２２０ｎｍでのＵＶ検出を使用して天然タンパク質から分離する。関連形態の相対的ピーク領域（領域％）及びメインピークは、対応するピーク領域を積分することで計算することができる。ＭＯＤ－４０２３原薬及び医薬品のメインピークは、９７％超のピーク領域からなり、これは、高度に精製された生成物及び効果的な精製プロセスを表す（図２１を参照されたい）。
サイズ排除ＨＰＬＣは、サイズによって分子を分離するクロマトグラフ技術である。選択された分取範囲内で、より大きい分子はより小さい分子よりも先に溶出する。分離機構は非吸収性であり、分子は定組成条件下で溶出される。ＳＥＣは、モノマーが標的分子の高分子量形態（例えばダイマー及びポリマー）から分離することを可能にする。ＳＥＣ法は、原薬及び医薬品中のＭＯＤ－４０２３ダイマー及びポリマーの含有量を分析するために開発された（図１０）。ＭＯＤ－４０２３モノマーは、９８％超のピーク領域からなり、これは、高度に精製された生成物及び効果的な精製プロセスを表す（図２２を参照されたい）。
ＲＰ－ＨＰＬＣ含有量方法
逆相クロマトグラフィーによるＭＯＤ－４０２３中間体試料のＭＯＤ－４０２３含有量判定、及び中間体試料中の非糖鎖付加ＭＯＤ－４０２３の％の判定に、この方法を使用する。逆相ＨＰＬＣは、分子をそれらの極性によって分離する。ＭＯＤ－４０２３等の比較的非極性の分子は、負荷される間にカラム材料に連結し、極性の分子は、カラムとの相互作用を果たさずに溶出する。
連結した分子は、極性からより低い極性の溶媒への勾配の補助によって溶出される。最も強い極性の分子が最初に溶出し、より低い極性の分子がそれに続いた。２１４ｎｍでの吸収を介して検出を行った。
精製の初期段階で（ＵＦＤＦ１試料）、２つのピークが認められた。ピーク１は、ＭＯＤ－４０２３の高糖鎖付加型であり、ピーク２は、低糖鎖付加型である（図１１）。２つのピークの相対的なピーク領域（領域％）は、対応するピーク領域を積分することで計算することができる。相対的なピーク領域Ｉは、７５％である。精製の第１ステップにおいて、カラムＤＥＡＥ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅは、これらのピーク間で分離し、溶出画分は、ＭＯＤ－４０２３糖鎖付加型のみを含有する（１００％）（図１２）。
ＭＯＤ－４０２３効能
ＭＯＤ－４０２３によるヒト成長ホルモンの活性化を、ｈＧＨ受容体を安定して発現するＢａｆ細胞を使用して特性評価した。細胞は、ＧＨ不含培地中で飢餓を経験し、洗浄ステップがそれに続き、アッセイ緩衝液中で再懸濁されて、９６ウェルプレート（１００μｌ／ウェル）に移された。３７℃で３０分間の細胞インキュベーション期間の間、次第に高まる濃度でＭＯＤ－４０２３を添加し、３７℃で一晩、５％のＣＯ２と共にインキュベートした。３０μｌのＣｅｌｌＴｉｔｅｒ ９６ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｏｎｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＭＴＳ）を細胞ウェルに添加することで、アッセイを終了した。ＭＴＳ添加の３時間後に、培養ウェルの光学的密度（ＯＤ）を４９２ｎｍで測定した。４９２ｎｍ吸収は、培養中の生存細胞の数に対して正比例する。ＭＯＤ－４０２３は、典型的な用量依存曲線においてＢａｆ－ｈＧＨ細胞への特異的結合を示した（図１３及び図２３）。
加えて、全てのバッチ中のＭＯＤ－４０２３活性が２以上のｍｇ当たり米国薬局方（ＵＳＰ）ソマトロピンユニットであった、下垂体切除されたラットでバイオアイデンティティ試験を実施した。
ウイルスクリアランス
製造プロセスが最終医薬品の内在性及び外来ウイルスによる汚染に対処及び軽減する能力は、予備調査の主題であった。ＧＬＰ対応の研究は、臨床試験用医薬品のための適用可能な指導に従い、これらのステップが添加されたウイルス集団を不活性化またはクリアする能力を定量化するために製造プロセスのスケールダウンしたセグメントに添加された３つのモデルウイルスを使用して行われてきた。ｌｏｇ１０調節された滴定量として表されるウイルスの量で、ｌｏｇ１０クリアランス係数は、単に出力値を入力値から減算することで判定される。ｌｏｇ１０数値として、クリアランス係数は、全ての評価ステップのための総体的クリアランス係数を引き出すために付加的である。個々のステップのクリアランス係数は、図１４で計算される。エーベルソンマウス白血病ウイルス（Ａ－ＭｕＬＶ）、マウス微小ウイルス（ＭＶＭ）、レオウイルス３型（Ｒｅｏ－３）、及び仮性狂犬病ウイルス（ＰｒＶ）を用いてウイルス安全性評価研究を実施した。理論上の用量当たりのウイルス負荷は、１５ｍｇ／用量の最大用量で計算された。Ａ－ＭｕＬＶは、ＣＨＯレトロウイルスの存在の可能性を表すモデルウイルスであると考えられ、汚染Ａ－ＭｕｌＶウイルスを不活性化及び除去するために講じた手段は少なくとも真数１０、２２．７４のクリアランス係数を達成し、これは、総体的なＭＯＤ－４０２３プロセスが優れたウイルス除去能力を有することを示す。
不純物
精製されたＭＯＤ－４０２３タンパク質中に存在する不純物の範囲の分析の結果は、図２４に提示される。１００ｎｇ／ｍｇ（ｐｐｍ）以下の宿主細胞タンパク質（ＨＣＰ）が発見された。ＤＮＡの存在は、１０ｐｇ／ｍｇ（ｐｐｂ）以下であった。残存メトトレキサート（ＭＴＸ）レベルは、５０ｎｇ／ｍＬ未満であった。残存プロピレングリコール（ＰＧ）は、６０μｇ／ｍｌ以下であった。２．５μｇ／ｍＬ以下のＴｒｉｔｏｎが発見された。また、１１５ｐｇ／ｍＬのインスリンが最終の精製されたＭＯＤ－４０２３タンパク質中に存在した。最後に、２５０μｇ／ｍＬ未満のＤＭＳＯが精製されたＭＯＤ－４０２３タンパク質生成物中に存在した。バイオバーデン分析の結果もまた図２４に提示され、精製された医薬品中に１０ｃｆｕ／１０ｍＬ以下で存在することを示す。
実施例２ ＭＯＤ－４０２３タンパク質の糖鎖付加部位占有
目的
この研究の目的は、ＭＯＤ－４０２３タンパク質（およそ１２個のＯ－結合糖鎖付加部位を有する糖タンパク質）の糖鎖付加部位占有の情報を提供することであった。
方法
ノイラミニダーゼを使用したＭＯＤ－４０２３の脱シアル化
およそ２１ｍｇ／ｍｌの濃度を有するＭｏｄ－４０２３試料を使用した。およそ２００ｕｇの試料を水中に緩衝液交換して、凍結乾燥させた。乾燥試料を、ノイラミニダーゼ中で懸濁し、３７℃でインキュベートした。
還元／カルボキシメチル化ＭＯＤ－４０２３タンパク質のトリプシン消化
脱シアル化に続いて、およそ２００μｇのＭＯＤ－４０２３をトリス／塩酸グアニジン緩衝液中に緩衝液交換して、ジチオスレイトールで還元し、ヨード酢酸を使用してカルボキシメチル化した。試料を次いで、重炭酸アンモニウム中に緩衝液交換し、３７℃でトリプシン消化した。
オンライン液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレー質量分析ＬＣ／ＥＳ－ＭＳ
オンライン液体クロマトグラフィー／エレクトロスプレー質量分析（ＬＣ／ＥＳ－ＭＳ）を、Ｊｕｐｉｔｅｒ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘカラム（Ｃ１８、５μ、２５０×２．１ｍｍ；室温；２１４ｎｍの波長；０．２ ｍｌ／分の流量）を使用して取得した、消化された試料の一定分量上で行った。溶媒Ａは、１ＬのＨ２Ｏ中に０．０５ｍＬのギ酸であった。溶媒Ｂは、１００ｍｌのＨ２Ｏ中、０．０５ｍＬのギ酸に加え、９００ｍＬのアセトニトリルであった。無傷及び還元された生成物について、以下の表１に提示される勾配を使用した。
Figure 0007437865000001
窒素乾燥ガスの使用によりイオン化が増強され、源泉温度が上昇した。源泉断片化を促進するために、わずかに増加したコーン電圧を引火した。質量範囲スキャンは、ｍ／ｚ２００～ｍ／ｚ２０００であった。
データ解釈
質量分析データの解釈は、Ｏ－糖鎖付加が予期される配列はＣＴＰユニット内に存在するものであるＣＴＰ修飾ｈＧＨ（配列番号７）のタンパク質配列と併せた、Ｇｅｎｅｒａｌ Ｐｒｏｔｅｉｎ／Ｍａｓｓ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｆｏｒ Ｗｉｎｄｏｗｓ（ＧＰＭＡＷ）ソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ ｄａｔａ）の使用に援助された。
結果
配列番号７の配列全体を分析したが、データの評価は、配列番号７のアミノ酸３７及び２２４の間のＭＯＤ－４０２３タンパク質の配列の完全なマッピングを導いた。
脱シアル化、還元、及びカルボキシメチル化されたＭＯＤ－４０２３のトリプシン消化混合物のＬＣ－ＥＳ－ＭＳ
脱シアル化、還元、及びカルボキシメチル化されたＭＯＤ－４０２３のトリプシン消化上でオンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳを実施した。バッチごとの比較については、図１６が３つの全イオン電流（ＴＩＣ）クロマトグラムのオーバーレイを示す。３つのバッチから取得されたデータは、検出されたペプチド及び強度の両方について高度に類似した。
図１７は、脱シアル化、還元、及びカルボキシメチル化されたＭＯＤ－４０２３タンパク質バッチのトリプシン消化のオンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳ分析から取得されたシグナルの評価を提示し、少なくとも１つのＨｅｘＮＡｃ－Ｈｅｘ残基で修飾されたシグナルに焦点を当てる。図１７に提示される結果は、図１８に示されるようなＮ末端領域でのＯ－結合糖鎖付加部位占有を示す。図１８は、ＭＯＤ－４０２３の配列番号７のアミノ酸配列１～３０を提示し、Ｏ－糖鎖付加は、１０位、１３位、１５位、及び２１位（赤で示される）のセリン（Ｓ）残基上で行われる。これらのセリン（Ｓ）は全て、配列中でプロリン（Ｐ）残基に続く。１～４（１～４）位のＳ残基のうちの少なくとも２つは、Ｏ－糖鎖付加部位（紫で示される）によって占有されている。
完全なＣＴＰユニットの更なるシグナルが、６個までのＯ－糖鎖付加部位を有する配列番号７のアミノ酸１～３６の予期される質量と一貫して認められた。このような、欠損した切断部位を含有する大きいトリプシンペプチドの発生は、Ｏ－糖鎖付加の存在と一致し、これはアルギニンまたはリシン残基に近接するグリカン残基が、立体及び静電気的障害の結果としてトリプシン切断を妨害するためである。
図１７に提示されるデータはまた、以前のデータ（図示しない）、すなわちＭＯＤ－４０２３のＣ末端ＣＴＰ－ＣＴＰ領域についてのデータとの比較性を示す。結果として、Ｏ－糖鎖付加は、図１８及び図１９のプロリン残基（赤で示される）に続くセリン残基上で行われると言える。加えて、セリン残基が連続する領域では、４つのセリンのうちの少なくとも２つがＯ－糖鎖付加によって占有されている。
取得された結果から、Ｎ末端ＣＴＰユニットに関して以下の結論が導かれた。Ｏ－糖鎖付加は、１０、１３、１５、及び２１位のセリン残基上（配列番号７のアミノ酸１０、１３、１５、及び２１）で行われた。これらのセリンは全て、配列中でプロリン残基に続いた。タンパク質Ｎ末端の１～４位の４つのセリン残基（配列番号７のアミノ酸１～４）のうち、少なくとも２つがＯ－糖鎖付加部位によって占有されている。Ｃ末端ＣＴＰ－ＣＴＰユニットにおいて：配列番号７のアミノ酸２２９、２３２、２３４、２４０、２５７、２６０、２６２、及び２６８。加えて、セリンが連続する領域では、４つのセリンのうち少なくとも２つがＯ－糖鎖付加部位によって占有されていた（Ｎ末端ＣＴＰユニットの配列番号７のアミノ酸１～４、ならびにＣ末端ＣＴＰ－ＣＴＰユニットの配列番号７のアミノ酸２２０～２２３及び２４８～２５１）。
大きい数のＯ－糖鎖付加部位を有するペプチドは、乏しいイオン化の結果として質量分析による検出を免れた可能性があることが理解される。この理由で、同一の試料を、より多い量、かつ高質量トリプシンペプチド上で好まれる変更されたイオン化条件で注射した。
結論
この研究の過程で、以下の記述を支持する証拠が収集された。トリプシン消化混合物の分析から取得したデータの評価は、タンパク質配列の１００％がマップされることを許容するシグナルを導いた。Ｏ－糖鎖付加はそれぞれ、Ｎ末端及びＣ末端のＣＴＰ及びＣＴＰ－ＣＴＰ領域の両方で行われる。占有部位を、プロリン残基に続くセリン残基、ならびにセリンが連続する領域での４つのセリンのうちの２つとして特定した。この方法で、合わせて１８個までのセリン残基が、Ｏ－グリカンの接着部位として働き得る。よって、驚くべきことに、かつ思いがけず、本明細書に開示される製造する方法を使用することで、Ｏ－グリカン占有は、各ＭＯＤ－４０２３（ＣＴＰ－ｈＧＨ－ＣＴＰ－ＣＴＰポリペプチド）のＣＴＰユニットごとに６個までのＯ－グリカンであった。脱シアル化後のＭＯＤ－４０２３タンパク質の分子量分析は、タンパク質が、ＨｅｘＮＡｃ－Ｈｅｘ構造の１２～１８個の糖鎖付加部位で修飾されたことを示した（実施例３を参照されたい）。
実施例３ ＭＯＤ－４０２３試料の無傷分子量分析
目的
この研究の目的は、ＭＯＤ－４０２３タンパク質（およそ１２個のＯ－結合糖鎖付加部位を有する糖タンパク質）の３つのバッチの正確な無傷分子量情報を提供することであった。
方法
取得した状態及び治療後の試料の分子量分析
分析した試料は、２１ｍｇ／ｍｌ及び４１ｍｇ／ｍｌの濃度であった。以下の条件を使用してオンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳを行った：
ＨＰＬＣ：ＧＥ ＡＫＴＡｍｉｃｒｏ液体クロマトグラフィーシステム
これは、Ｐ－９０５ポンプ、ＵＶ－９００ ３波長吸光、伝動性検出器、及びＡ－９０５オートサンプラー、フラクションコレクターＦｒａｃ－９５０を含む
ＭＳ：Ｍｉｃｒｏｍａｓｓ／Ｗａｔｅｒｓ Ｑ－ＴＯＦミクロ四重極飛行時間型質量
分光器
波長：２８０ｎｍ
カラム：Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｊｕｐｉｔｅｒ ３ｐ Ｃ１８ ３００Ａ １５０×２．０ｍｍ
（ＳＧＳ Ｍ－Ｓｃａｎ ＧｍｂＨカラム＃７４）
カラム温度４０℃
流量：０．２ｍＬ／分
溶媒Ａ：１ＬのＨ２０中、１．０ｍＬのＦＡ
溶媒Ｂ：１００ｍＬのＨ２０中、１．０ｍＬのＦＡに加え、８００ｍＬのアセトニトリル及び１００ｍＬのテトラヒドロフラン
脱シアル化生成物の分析に以下に記載される勾配を使用した。データ評価中の保持時間は、勾配の初め（ｔＲｏ＝１０分）に調節されていることに留意されたい。
Figure 0007437865000002
窒素乾燥ガスの使用によりイオン化が増強され、源泉温度が上昇した。スキャンした質量範囲は、ｍ／ｚ２００～ｍ／ｚ２０００であった。ＭＳ／ＭＳモードにあるＧｌｕ－フィブリノペプチドフラグメントイオンを使用して、機器を調整した。
ノイラミニダーゼを使用した脱シアル化
およそ１００ｐｇの試料を水中に緩衝液交換して、凍結乾燥させた。乾燥試料を、ノイラミニダーゼ中で懸濁し、３７℃でインキュベートした。そのおよそ１０ｐｇを、上記のように分析した。
データ解釈
質量分析データの解釈は、ＭＯＤ－４０２３タンパク質配列（配列番号７）と併せた、ＧＰＭＡＷソフトウェア（Ｌｉｇｈｔｈｏｕｓｅ ｄａｔａ）の使用に援助された。
結果
取得した状態の試料の無傷分子量分析
図２０に、脱シアル化後のオンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳによるＭＯＤ４０２３ ロット６４８－０１－１０－０１４Ａ試料の分析から取得されたｔＲ１９．８分でのＵＶ吸収成分の溶出の間に得られたデコンボリュートされた質量スペクトルを示される。
表３は、脱シアル化後のＭＯＤ４０２３ ロット６４８－０１－１０－０１４ＡのオンラインＬＣ／ＥＳ－ＭＳ分析中に得た質量分析検出から取得された結果の概要を提示する。
Figure 0007437865000003
結論
Ｏ－結合糖鎖付加部位の数の情報を取得する目的で、脱シアル化後の試料でＭＯＤ４０２３の３つのバッチの分子量分析を実施した。３つのバッチの全てにおいて一貫して、脱シアル化試料の無傷質量測定から取得されたデータは、ＨｅｘＮＡｃ－Ｈｅｘ構造の１２～１８個の糖鎖付加部位を有するＭＯＤ４０２３タンパク質の平均化学的質量と一致するシグナルを導いた（機器の実験誤差の範囲内）。３つのバッチ全てについて、１５個の糖鎖付加部位で修飾されているタンパク質が最も強かった。
対応する質量分析シグナルそれぞれは、およそ＋１６．５Ｄａでのサテライトシグナルの存在によって特徴づけられた。この質量シフトは、酸素残基またはＮＨ３残基の付加の結果であった可能性がある。後者は、ＮＨ３（＋１７Ｄａ）のネット付加を引き起こすＨ＋プロトン化ではなく、ＮＨ４ ＋プロトン化に由来し得る。酸化はあるいは、（メインピークの＋１酸素の質量と一致する、１８．５分でのＵＶシグナルの存在によって認められたように）溶出時間のシフトもたらし得るため、データは、後者の説明（サテライトがＮＨ４ ＋プロトン化の結果であること）が好ましいことを示した。しかしながら、無傷質量測定単独では、これを最終的に解明することはできなかった。
この研究から導かれた所見は、最大で１８個のＯ－糖鎖付加残基が発見され、１５個の糖鎖付加部位で修飾されたタンパク質が最も強いというＭＯＤ４０２３タンパク質の前の分析（データは示されない）と一致した。
本明細書に開示される特定の特徴が本明細書に例証及び記載されてきたが、多くの修正、代用、変更、及び同等物が、当業者には今では思い浮かぶであろう。したがって、添付の特許請求の範囲は、本明細書に開示される真の趣旨の範囲に入る全てのかかる修正及び変更に及ぶことを意図することを理解されたい。

Claims (24)

  1. 高度にグリコシル化されたヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）修飾ヒト成長ホルモン（ｈＧＨ）ポリペプチドを含む、精製された医薬組成物であって、
    前記高度にグリコシル化されたＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、ｈＧＨポリぺプチドと、前記ｈＧＨポリぺプチドのアミノ末端に接着したアミノ末端絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）と、前記ｈＧＨポリぺプチドのカルボキシ末端に接着して直列に配置された２つのカルボキシ末端絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド（ＣＴＰ）とを含み、
    前記高度にグリコシル化されたＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドは、配列番号７のアミノ酸配列を含み、
    前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの分子の少なくとも６０％が、１分子当たり１３～１８個のＯ－結合型グリカンを含む、精製された医薬組成物。
  2. 前記１３～１８個のＯ－結合型グリカンが、前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの前記ＣＴＰ上で発生する、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  3. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの分子が、１分子当たり１５または１６個のＯ－結合型グリカンを含む、請求項２に記載の精製された医薬組成物。
  4. 前記ＣＴＰの各々が、４、５または６個のＯ－結合型グリカンを含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  5. 前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドが、配列番号７の１０、１３、１５、２１、２２９、２３２、２３４、２４０、２５７、２６０、２６２、および２６８位のアミノ酸残基にＯ－結合型グリカンを含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  6. 前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドが、配列番号７のアミノ酸残基１～４から選択される２～４個の残基のＯ－結合型グリカン、配列番号７のアミノ酸残基２２０～２２３から選択される２～４個の残基のＯ－結合型グリカン、配列番号７のアミノ酸残基２４８～２５１から選択される２～４個の残基のＯ－結合型グリカン、またはそれらの任意の組み合わせをさらに含む、請求項５に記載の精製された医薬組成物。
  7. 前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドが、２つのジスルフィド架橋を含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  8. 前記ジスルフィド架橋の１つ目は、配列番号７のシステイン残基８１とシステイン残基１９３との間にあり、前記ジスルフィド架橋の２つ目は、配列番号７のシステイン残基２１０とシステイン残基２１７との間にある、請求項７に記載の精製された医薬組成物。
  9. 前記Ｏ－結合型グリカンが、シアル酸付加されたコア構造を含む、請求項４に記載の精製された医薬組成物。
  10. 前記Ｏ－結合型グリカンの各々が、モノシアル酸付加されたコア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）、中性コア１（Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）、モノシアル酸付加コア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６（Ｇａｌβ１－３）ＧａｌＮＡｃ）、およびジシアル酸付加コア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３（Ｎｅｕ５Ａｃα２－６）ＧａｌＮＡｃ）からなる群から選択されるＯ－グリカンコア構造を含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  11. 前記精製された医薬組成物が、前記高度にグリコシル化されたＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドを含む浄化された収集溶液である、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  12. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの前記分子の少なくとも７０％が、１分子当たり１３～１８個のＯ－結合型グリカンを含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  13. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの前記分子の少なくとも８０％が、１分子当たり１３～１８個のＯ－結合型グリカンを含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  14. 薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  15. ０．３％ｍ－クレゾールをさらに含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  16. ０．２％ポロキサマー１８８をさらに含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  17. 前記精製された医薬組成物は、皮下（ＳＣ）注射用の無菌水性組成物である、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  18. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの前記分子の少なくとも９０％が、１分子当たり１３～１８個のＯ－結合型グリカンを含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  19. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの最も豊富なＯ－グリカンコア構造は、モノシアル酸付加されたコア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）である、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  20. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの最も豊富な形態は、１５個のＯ－結合型グリカンを含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  21. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの前記分子の少なくとも６０％は、シアル酸付加されている、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  22. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの前記分子の最も豊富な前記シアル酸はＮｅｕ５Ａｃである、請求項２１に記載の精製された医薬組成物。
  23. 前記精製された医薬組成物中に存在する前記ＣＴＰ修飾ｈＧＨポリペプチドの前記分子は、モノシアル酸付加されたコア１（Ｎｅｕ５Ａｃα２－３Ｇａｌβ１－３ＧａｌＮＡｃ）であるＯ－グリカンコア構造を含む、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
  24. ａ．１００ｎｇ／ｍｇ以下の残存宿主細胞タンパク質、
    ｂ．１０ｐｇ／ｍｇ以下の残存ＤＮＡ、
    ｃ．５０ｎｇ／ｍＬ以下の残存メトトレキサート、
    ｄ．６０μｇ／ｍＬ以下の残存ポリエチレングリコール、
    ｅ．２．５μｇ／ｍＬ以下の残存Ｔｒｉｔｏｎ、
    ｆ．１１５ｐｇ／ｍＬ以下の残存インスリン、
    ｇ．２５０μｇ／ｍＬ以下の残存ＤＭＳＯ、または
    ｈ．バイオバーデン分析において、１０ｃｆｕ／１０ｍＬ以下、
    のうちの１つ以上を備える、請求項１に記載の精製された医薬組成物。
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