KR102527180B1 - 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 - Google Patents
장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR102527180B1 KR102527180B1 KR1020227010215A KR20227010215A KR102527180B1 KR 102527180 B1 KR102527180 B1 KR 102527180B1 KR 1020227010215 A KR1020227010215 A KR 1020227010215A KR 20227010215 A KR20227010215 A KR 20227010215A KR 102527180 B1 KR102527180 B1 KR 102527180B1
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- ctp
- another embodiment
- modified hgh
- pharmaceutical composition
- modified
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 166
- 102000018997 Growth Hormone Human genes 0.000 title description 115
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 title description 115
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 claims abstract description 417
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 claims abstract description 414
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 claims abstract description 271
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 170
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 142
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 132
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 113
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 106
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 claims description 90
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 claims description 90
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 75
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 72
- 108010062540 Chorionic Gonadotropin Proteins 0.000 claims description 65
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 64
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 63
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 claims description 62
- 102000011022 Chorionic Gonadotropin Human genes 0.000 claims description 61
- 230000004989 O-glycosylation Effects 0.000 claims description 58
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 46
- 101800005309 Carboxy-terminal peptide Proteins 0.000 claims description 39
- 229940015047 chorionic gonadotropin Drugs 0.000 claims description 39
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 31
- DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N Propylene glycol Chemical compound CC(O)CO DNIAPMSPPWPWGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 28
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 28
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 claims description 18
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 claims description 18
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 16
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims description 12
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 11
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 claims description 8
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 claims description 8
- GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N triton Chemical compound [3H+] GPRLSGONYQIRFK-MNYXATJNSA-N 0.000 claims description 7
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 4
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 4
- OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N N-acetyl-D-galactosamine Chemical compound CC(=O)N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O OVRNDRQMDRJTHS-KEWYIRBNSA-N 0.000 claims description 4
- MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N N-acetyl-D-galactosamine Natural products CC(=O)NC(C=O)C(O)C(O)C(O)CO MBLBDJOUHNCFQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 4
- RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N m-cresol Chemical compound CC1=CC=CC(O)=C1 RLSSMJSEOOYNOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 108010081954 galacto-N-biose Proteins 0.000 claims description 2
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 claims description 2
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 claims description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims 3
- CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide/propylene oxide copolymer Chemical compound CCCOC(C)COCCO CTKXFMQHOOWWEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N N-acetylneuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)CC(O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-LUWBGTNYSA-N 0.000 claims 1
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 claims 1
- 229940044519 poloxamer 188 Drugs 0.000 claims 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 abstract description 28
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 abstract description 19
- 101800001415 Bri23 peptide Proteins 0.000 description 263
- 101800000655 C-terminal peptide Proteins 0.000 description 263
- 102400000107 C-terminal peptide Human genes 0.000 description 246
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 163
- 108091022709 MOD-4023 Proteins 0.000 description 121
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 111
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 99
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 73
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 57
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 56
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 55
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 55
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 50
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 38
- 239000000047 product Substances 0.000 description 38
- 238000005138 cryopreservation Methods 0.000 description 36
- 235000004400 serine Nutrition 0.000 description 34
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 32
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 31
- 229940088679 drug related substance Drugs 0.000 description 30
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 29
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 26
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 25
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 25
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 25
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 24
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 24
- 229940084986 human chorionic gonadotropin Drugs 0.000 description 22
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 22
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 21
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 21
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 21
- 229920002113 octoxynol Polymers 0.000 description 21
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 20
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 20
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 20
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 19
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 18
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 17
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 17
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 17
- 239000000463 material Substances 0.000 description 17
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 16
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 16
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 16
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 15
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 15
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 108010057821 leucylproline Proteins 0.000 description 15
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 15
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 15
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 14
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 14
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 14
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 14
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 13
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 13
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 13
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 13
- 235000002639 sodium chloride Nutrition 0.000 description 13
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 13
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 12
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 12
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 12
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 12
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 11
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 11
- 238000013411 master cell bank Methods 0.000 description 11
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 11
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 11
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 11
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 11
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 11
- OLVCTPPSXNRGKV-GUBZILKMSA-N Ala-Pro-Pro Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N1[C@H](C(O)=O)CCC1 OLVCTPPSXNRGKV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 10
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 10
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 10
- -1 poly(ethylene glycol) Polymers 0.000 description 10
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 10
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 10
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 10
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 10
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 9
- OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N Ser-Ser-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CO OZPDGESCTGGNAD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 9
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 9
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 9
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 9
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 9
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 9
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 9
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 9
- 108010077112 prolyl-proline Proteins 0.000 description 9
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 9
- PDIYGFYAMZZFCW-JIOCBJNQSA-N Asp-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O PDIYGFYAMZZFCW-JIOCBJNQSA-N 0.000 description 8
- 101000599951 Homo sapiens Insulin-like growth factor I Proteins 0.000 description 8
- 102100037852 Insulin-like growth factor I Human genes 0.000 description 8
- XWEVVRRSIOBJOO-SRVKXCTJSA-N Leu-Pro-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XWEVVRRSIOBJOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 8
- LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N Pro-Ser-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O LNICFEXCAHIJOR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 8
- WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N Ser-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CO)CCCN=C(N)N WDXYVIIVDIDOSX-DCAQKATOSA-N 0.000 description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 239000002552 dosage form Substances 0.000 description 8
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 8
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 8
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 8
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 108010015796 prolylisoleucine Proteins 0.000 description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 8
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 8
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 8
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- PMMMQRVUMVURGJ-XUXIUFHCSA-N Ile-Leu-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O PMMMQRVUMVURGJ-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 7
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 7
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 7
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 7
- SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N Pro-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O SNGZLPOXVRTNMB-LPEHRKFASA-N 0.000 description 7
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 7
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 7
- VTMGKRABARCZAX-OSUNSFLBSA-N Thr-Pro-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O VTMGKRABARCZAX-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 7
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 7
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 7
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 7
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 7
- 235000010980 cellulose Nutrition 0.000 description 7
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 7
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 7
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 238000013365 molecular weight analysis method Methods 0.000 description 7
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 7
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 7
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 7
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 7
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 7
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 7
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 7
- BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N (2s)-1-[2-[[(2s)-pyrrolidine-2-carbonyl]amino]acetyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)CNC(=O)[C@H]1NCCC1 BRPMXFSTKXXNHF-IUCAKERBSA-N 0.000 description 6
- PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 2-Aminobenzamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CC=C1N PXBFMLJZNCDSMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N Arg-Ser-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OQPAZKMGCWPERI-GUBZILKMSA-N 0.000 description 6
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 6
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 6
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 6
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N Leu-Pro-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)NCC(O)=O UCBPDSYUVAAHCD-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 6
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asp Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O GMJDSFYVTAMIBF-FXQIFTODSA-N 0.000 description 6
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 6
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 6
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 6
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 6
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011026 diafiltration Methods 0.000 description 6
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 6
- 108010077515 glycylproline Proteins 0.000 description 6
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 6
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 6
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 6
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 6
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 6
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 6
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- 241000714175 Abelson murine leukemia virus Species 0.000 description 5
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N Arg-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NMRHDSAOIURTNT-RWMBFGLXSA-N 0.000 description 5
- 229920002271 DEAE-Sepharose Polymers 0.000 description 5
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 5
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 5
- RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N Glu-Gly-Ser Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O RAUDKMVXNOWDLS-WDSKDSINSA-N 0.000 description 5
- HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N Gly-Pro-Ser Chemical compound NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O HAOUOFNNJJLVNS-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 5
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 5
- IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N Lys-Ala-Pro Chemical compound C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IXHKPDJKKCUKHS-GARJFASQSA-N 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 5
- XOHJOMKCRLHGCY-UNQGMJICSA-N Phe-Pro-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOHJOMKCRLHGCY-UNQGMJICSA-N 0.000 description 5
- FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N Pro-Pro-Ser Chemical compound OC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1NCCC1 FDMKYQQYJKYCLV-GUBZILKMSA-N 0.000 description 5
- JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N Ser-Ser-Ser-Ser Chemical compound OCC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(=O)NC(CO)C(O)=O JURQXQBJKUHGJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 5
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 5
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 5
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 5
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 5
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 5
- 239000007910 chewable tablet Substances 0.000 description 5
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 5
- 229940014259 gelatin Drugs 0.000 description 5
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 5
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 5
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 5
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 239000006186 oral dosage form Substances 0.000 description 5
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 5
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 5
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 5
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 108010026333 seryl-proline Proteins 0.000 description 5
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 5
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 5
- 239000003826 tablet Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 4
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 4
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 4
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 4
- 239000001856 Ethyl cellulose Substances 0.000 description 4
- ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N Ethyl cellulose Chemical compound CCOCC1OC(OC)C(OCC)C(OCC)C1OC1C(O)C(O)C(OC)C(CO)O1 ZZSNKZQZMQGXPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 description 4
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 4
- JILRMFFFCHUUTJ-ACZMJKKPSA-N Gln-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JILRMFFFCHUUTJ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 4
- GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N Gly-Phe-Ser Chemical compound OC[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)C[NH3+])CC1=CC=CC=C1 GGAPHLIUUTVYMX-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 4
- LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N Gly-Ser-Cys Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O LBDXVCBAJJNJNN-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 4
- 239000007760 Iscove's Modified Dulbecco's Medium Substances 0.000 description 4
- UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N Leu-Arg-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N UILIPCLTHRPCRB-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 4
- AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N Leu-Ile-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O AUBMZAMQCOYSIC-MNXVOIDGSA-N 0.000 description 4
- LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N Leu-Leu-Lys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)N LXKNSJLSGPNHSK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 4
- CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N Leu-Pro-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHJKEDSZNSONPS-DCAQKATOSA-N 0.000 description 4
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 4
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 4
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N Pro-Ser-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GOMUXSCOIWIJFP-GUBZILKMSA-N 0.000 description 4
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010003201 RGH 0205 Proteins 0.000 description 4
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N Ser-Pro-Ser Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O AZWNCEBQZXELEZ-FXQIFTODSA-N 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 4
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 4
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 4
- DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N acetic acid;2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal;sodium Chemical compound [Na].CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O DPXJVFZANSGRMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 4
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 4
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 4
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 4
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 4
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 4
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 4
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 4
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 4
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000013270 controlled release Methods 0.000 description 4
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 4
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 235000019325 ethyl cellulose Nutrition 0.000 description 4
- 229920001249 ethyl cellulose Polymers 0.000 description 4
- 229960004667 ethyl cellulose Drugs 0.000 description 4
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 4
- 108010042598 glutamyl-aspartyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 238000011194 good manufacturing practice Methods 0.000 description 4
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 4
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 4
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 4
- 108010076756 leucyl-alanyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 4
- 239000012669 liquid formulation Substances 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 239000007937 lozenge Substances 0.000 description 4
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 4
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 4
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 4
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 4
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- HMQPEDMEOBLSQB-UHFFFAOYSA-N n-[2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-3-yl]acetamide Chemical group CC(=O)NC1C(O)OC(CO)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HMQPEDMEOBLSQB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001728 nano-filtration Methods 0.000 description 4
- 239000002105 nanoparticle Substances 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 229920005862 polyol Polymers 0.000 description 4
- 150000003077 polyols Chemical class 0.000 description 4
- 108010031719 prolyl-serine Proteins 0.000 description 4
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 4
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 241000894007 species Species 0.000 description 4
- 238000003153 stable transfection Methods 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 4
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 4
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 4
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 4
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 4
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 4
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 4
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N Ala-Phe-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 DHBKYZYFEXXUAK-ONGXEEELSA-N 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920002261 Corn starch Polymers 0.000 description 3
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 3
- HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N Cys-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N HBHMVBGGHDMPBF-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 3
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 3
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 3
- XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N Gln-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XZUUUKNKNWVPHQ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- ARYKRXHBIPLULY-XKBZYTNZSA-N Gln-Thr-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O ARYKRXHBIPLULY-XKBZYTNZSA-N 0.000 description 3
- KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N Glu-Ala-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O KBKGRMNVKPSQIF-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 3
- DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N Glu-Asp-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O DSPQRJXOIXHOHK-WDSKDSINSA-N 0.000 description 3
- LVCHEMOPBORRLB-DCAQKATOSA-N Glu-Gln-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O)C(O)=O LVCHEMOPBORRLB-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N Glu-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O PHONAZGUEGIOEM-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 3
- NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N Glu-Pro-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O NNQDRRUXFJYCCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N Gly-Ser-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YOBGUCWZPXJHTN-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 3
- 229920002907 Guar gum Polymers 0.000 description 3
- OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N His-Asn-Asp Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OMNVOTCFQQLEQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- 229920002153 Hydroxypropyl cellulose Polymers 0.000 description 3
- XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N Leu-Ala-Phe Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XIRYQRLFHWWWTC-QEJZJMRPSA-N 0.000 description 3
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 3
- TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N Lys-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O TWPCWKVOZDUYAA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N Met-Ala-Thr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O HUKLXYYPZWPXCC-KZVJFYERSA-N 0.000 description 3
- 241000702623 Minute virus of mice Species 0.000 description 3
- XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N N-L-cysteinyl-L-phenylalanine Natural products SCC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XZFYRXDAULDNFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100342977 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) leu-1 gene Proteins 0.000 description 3
- WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N Phe-Ala-Asn Chemical compound NC(=O)C[C@@H](C([O-])=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]([NH3+])CC1=CC=CC=C1 WSXKXSBOJXEZDV-DLOVCJGASA-N 0.000 description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 3
- FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N Pro-Leu-Ser Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O FKYKZHOKDOPHSA-DCAQKATOSA-N 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N Ser-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CO FIDMVVBUOCMMJG-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 3
- VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N Ser-Glu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O VQBCMLMPEWPUTB-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 3
- KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N Ser-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N KCGIREHVWRXNDH-GARJFASQSA-N 0.000 description 3
- FVFUOQIYDPAIJR-XIRDDKMYSA-N Ser-Trp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)NC(=O)[C@H](CO)N FVFUOQIYDPAIJR-XIRDDKMYSA-N 0.000 description 3
- BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N Ser-Val-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O BEBVVQPDSHHWQL-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- 229920002125 Sokalan® Polymers 0.000 description 3
- 235000021355 Stearic acid Nutrition 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- VYEHBMMAJFVTOI-JHEQGTHGSA-N Thr-Gly-Gln Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VYEHBMMAJFVTOI-JHEQGTHGSA-N 0.000 description 3
- AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N Thr-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O AHERARIZBPOMNU-KATARQTJSA-N 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 3
- YVXIAOOYAKBAAI-SZMVWBNQSA-N Trp-Leu-Gln Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O)=CNC2=C1 YVXIAOOYAKBAAI-SZMVWBNQSA-N 0.000 description 3
- CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N Tyr-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N 0.000 description 3
- LMSBRIVOCYOKMU-NRPADANISA-N Val-Gln-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N LMSBRIVOCYOKMU-NRPADANISA-N 0.000 description 3
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 3
- 239000000783 alginic acid Substances 0.000 description 3
- 229960001126 alginic acid Drugs 0.000 description 3
- 150000004781 alginic acids Chemical class 0.000 description 3
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 3
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 3
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 3
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 3
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 3
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 3
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 239000008120 corn starch Substances 0.000 description 3
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 3
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 3
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 3
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 3
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 3
- 239000000796 flavoring agent Substances 0.000 description 3
- 235000013355 food flavoring agent Nutrition 0.000 description 3
- 235000003599 food sweetener Nutrition 0.000 description 3
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 3
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 3
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 3
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 3
- 108010082286 glycyl-seryl-alanine Proteins 0.000 description 3
- 235000010417 guar gum Nutrition 0.000 description 3
- 239000000665 guar gum Substances 0.000 description 3
- 229960002154 guar gum Drugs 0.000 description 3
- 239000012510 hollow fiber Substances 0.000 description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 3
- 235000010977 hydroxypropyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 239000001863 hydroxypropyl cellulose Substances 0.000 description 3
- 229940071676 hydroxypropylcellulose Drugs 0.000 description 3
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 3
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 108010044056 leucyl-phenylalanine Proteins 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 244000144972 livestock Species 0.000 description 3
- 239000000314 lubricant Substances 0.000 description 3
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 3
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 3
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 3
- 239000011859 microparticle Substances 0.000 description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 3
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O QIQXTHQIDYTFRH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N octadecanoic acid Natural products CCCCCCCC(C)CCCCCCCCC(O)=O OQCDKBAXFALNLD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 3
- 235000019198 oils Nutrition 0.000 description 3
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 3
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 3
- 230000001817 pituitary effect Effects 0.000 description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 3
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 description 3
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 3
- 230000005588 protonation Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 238000013341 scale-up Methods 0.000 description 3
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 3
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 3
- 235000019812 sodium carboxymethyl cellulose Nutrition 0.000 description 3
- 229920001027 sodium carboxymethylcellulose Polymers 0.000 description 3
- HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L sodium disulfite Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S(=O)S([O-])(=O)=O HRZFUMHJMZEROT-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940001584 sodium metabisulfite Drugs 0.000 description 3
- 235000010262 sodium metabisulphite Nutrition 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 3
- 235000010356 sorbitol Nutrition 0.000 description 3
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 3
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 3
- 229940032147 starch Drugs 0.000 description 3
- 239000008117 stearic acid Substances 0.000 description 3
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 3
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 3
- 239000003765 sweetening agent Substances 0.000 description 3
- RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L thimerosal Chemical compound [Na+].CC[Hg]SC1=CC=CC=C1C([O-])=O RTKIYNMVFMVABJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 3
- 229940033663 thimerosal Drugs 0.000 description 3
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 3
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 3
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 3
- 108010015666 tryptophyl-leucyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 3
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 2
- SBQSMJWMEQRETE-HVYQYDHPSA-N (2r)-2-amino-3-[[(2r)-2-amino-2-carboxyethyl]disulfanyl]-4-oxopentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)C(C(=O)C)SSC[C@H](N)C(O)=O SBQSMJWMEQRETE-HVYQYDHPSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 2
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N Acrylic acid Chemical compound OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZPXCNXMJEZKRLU-LSJOCFKGSA-N Ala-His-Arg Chemical compound NC(N)=NCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CN=CN1 ZPXCNXMJEZKRLU-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 2
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 2
- YFWTXMRJJDNTLM-LSJOCFKGSA-N Arg-Ala-His Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N YFWTXMRJJDNTLM-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 2
- GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N Arg-Ile-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O GXXWTNKNFFKTJB-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N Arg-Lys-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N MJINRRBEMOLJAK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- ORXCYAFUCSTQGY-FXQIFTODSA-N Asn-Ala-Met Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N ORXCYAFUCSTQGY-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N Asn-Tyr-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(O)=O YSYTWUMRHSFODC-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N Asn-Val-Tyr Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 HBUJSDCLZCXXCW-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O PBVLJOIPOGUQQP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N Asp-Lys-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O MYLZFUMPZCPJCJ-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N Asp-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O JDDYEZGPYBBPBN-JRQIVUDYSA-N 0.000 description 2
- 108010011485 Aspartame Proteins 0.000 description 2
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 2
- 241000700199 Cavia porcellus Species 0.000 description 2
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 2
- 206010008723 Chondrodystrophy Diseases 0.000 description 2
- 229920002785 Croscarmellose sodium Polymers 0.000 description 2
- PQHYZJPCYRDYNE-QWRGUYRKSA-N Cys-Gly-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O PQHYZJPCYRDYNE-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 2
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 2
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 2
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 2
- CKNUKHBRCSMKMO-XHNCKOQMSA-N Gln-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O CKNUKHBRCSMKMO-XHNCKOQMSA-N 0.000 description 2
- MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N Gln-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N MADFVRSKEIEZHZ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- LFIVHGMKWFGUGK-IHRRRGAJSA-N Gln-Glu-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N LFIVHGMKWFGUGK-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- XKPACHRGOWQHFH-IRIUXVKKSA-N Gln-Thr-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O XKPACHRGOWQHFH-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 2
- CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N Glu-Gly-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O CUXJIASLBRJOFV-LAEOZQHASA-N 0.000 description 2
- MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N Glu-Leu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MWMJCGBSIORNCD-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N Glu-Phe-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O JDUKCSSHWNIQQZ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N Glu-Thr-Phe Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O CQGBSALYGOXQPE-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 2
- OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N Gly-Arg-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N OVSKVOOUFAKODB-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 2
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 2
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 2
- 238000012855 HCP-ELISA Methods 0.000 description 2
- LRAUKBMYHHNADU-DKIMLUQUSA-N Ile-Phe-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)CC)CC1=CC=CC=C1 LRAUKBMYHHNADU-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 2
- IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N Ile-Pro-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IVXJIMGDOYRLQU-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- NLZVTPYXYXMCIP-XUXIUFHCSA-N Ile-Pro-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O NLZVTPYXYXMCIP-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- KTNGVMMGIQWIDV-OSUNSFLBSA-N Ile-Pro-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KTNGVMMGIQWIDV-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 2
- PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N Ile-Ser-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N PELCGFMHLZXWBQ-BJDJZHNGSA-N 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108020004684 Internal Ribosome Entry Sites Proteins 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- YORLGJINWYYIMX-KKUMJFAQSA-N Leu-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O YORLGJINWYYIMX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- DLCXCECTCPKKCD-GUBZILKMSA-N Leu-Gln-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O DLCXCECTCPKKCD-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N Leu-His-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N BKTXKJMNTSMJDQ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N Leu-Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N DSFYPIUSAMSERP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asn Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O WXUOJXIGOPMDJM-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- SXOFUVGLPHCPRQ-KKUMJFAQSA-N Leu-Tyr-Cys Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(O)=O SXOFUVGLPHCPRQ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001480512 Mammalian orthoreovirus 3 Species 0.000 description 2
- WGBMNLCRYKSWAR-DCAQKATOSA-N Met-Asp-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN WGBMNLCRYKSWAR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 2
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 2
- WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N N-L-arginyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCCN=C(N)N WYBVBIHNJWOLCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N N-Vinyl-2-pyrrolidone Chemical compound C=CN1CCCC1=O WHNWPMSKXPGLAX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 2
- MJAYDXWQQUOURZ-JYJNAYRXSA-N Phe-Lys-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O MJAYDXWQQUOURZ-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- 239000004743 Polypropylene Substances 0.000 description 2
- OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N Pro-Ser-Asn Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O OWQXAJQZLWHPBH-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N Pro-Thr-Pro Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O AIOWVDNPESPXRB-YTWAJWBKSA-N 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- OBXVZEAMXFSGPU-FXQIFTODSA-N Ser-Asn-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CO)N)CN=C(N)N OBXVZEAMXFSGPU-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N Ser-Asp-Ser Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)O MMAPOBOTRUVNKJ-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 2
- BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N Ser-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BTPAWKABYQMKKN-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N Ser-Leu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O IXZHZUGGKLRHJD-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- UPLYXVPQLJVWMM-KKUMJFAQSA-N Ser-Phe-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O UPLYXVPQLJVWMM-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 2
- NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N Ser-Pro-Arg Chemical compound OC[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(O)=O NUEHQDHDLDXCRU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N Thr-Asn-Ser Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O OJRNZRROAIAHDL-LKXGYXEUSA-N 0.000 description 2
- YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N Thr-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N YJCVECXVYHZOBK-KNZXXDILSA-N 0.000 description 2
- FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N Thr-Leu-Met Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O FIFDDJFLNVAVMS-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- KAJRRNHOVMZYBL-IRIUXVKKSA-N Thr-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O KAJRRNHOVMZYBL-IRIUXVKKSA-N 0.000 description 2
- CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N Thr-Tyr-Ser Chemical compound C[C@@H](O)[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CO)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 CYCGARJWIQWPQM-YJRXYDGGSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 241000723873 Tobacco mosaic virus Species 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- HRHYJNLMIJWGLF-BZSNNMDCSA-N Tyr-Ser-Phe Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 HRHYJNLMIJWGLF-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N Val-Glu-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O XWYUBUYQMOUFRQ-IFFSRLJSSA-N 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 2
- 208000008919 achondroplasia Diseases 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 108010077245 asparaginyl-proline Proteins 0.000 description 2
- 239000000605 aspartame Substances 0.000 description 2
- IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N aspartame Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)OC)CC1=CC=CC=C1 IAOZJIPTCAWIRG-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 235000010357 aspartame Nutrition 0.000 description 2
- 229960003438 aspartame Drugs 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 2
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 230000008468 bone growth Effects 0.000 description 2
- 244000309464 bull Species 0.000 description 2
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L calcium sulfate Chemical compound [Ca+2].[O-]S([O-])(=O)=O OSGAYBCDTDRGGQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229960001631 carbomer Drugs 0.000 description 2
- 229910002091 carbon monoxide Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 229940023913 cation exchange resins Drugs 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 2
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 229940075614 colloidal silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 239000003636 conditioned culture medium Substances 0.000 description 2
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 description 2
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- 230000007812 deficiency Effects 0.000 description 2
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 2
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 2
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 2
- FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N diethyl phthalate Chemical compound CCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC FLKPEMZONWLCSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000007884 disintegrant Substances 0.000 description 2
- 231100000673 dose–response relationship Toxicity 0.000 description 2
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 2
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 2
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 2
- 239000012537 formulation buffer Substances 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 125000005456 glyceride group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002868 homogeneous time resolved fluorescence Methods 0.000 description 2
- 239000003906 humectant Substances 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 2
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 2
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 2
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 2
- 238000007913 intrathecal administration Methods 0.000 description 2
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 239000003589 local anesthetic agent Substances 0.000 description 2
- 108010009298 lysylglutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 2
- 108010005942 methionylglycine Proteins 0.000 description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003595 mist Substances 0.000 description 2
- 230000037257 muscle growth Effects 0.000 description 2
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 2
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 2
- 230000003285 pharmacodynamic effect Effects 0.000 description 2
- 108010012581 phenylalanylglutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010051242 phenylalanylserine Proteins 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 description 2
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 2
- 229920001987 poloxamine Polymers 0.000 description 2
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 2
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 2
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 2
- 229920001592 potato starch Polymers 0.000 description 2
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 2
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 2
- 238000004886 process control Methods 0.000 description 2
- 238000011027 product recovery Methods 0.000 description 2
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 2
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 2
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 2
- 239000012264 purified product Substances 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000004017 serum-free culture medium Substances 0.000 description 2
- 108010048818 seryl-histidine Proteins 0.000 description 2
- 239000008159 sesame oil Substances 0.000 description 2
- 235000011803 sesame oil Nutrition 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 2
- 229960001866 silicon dioxide Drugs 0.000 description 2
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000000375 suspending agent Substances 0.000 description 2
- 238000004114 suspension culture Methods 0.000 description 2
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 2
- 235000012222 talc Nutrition 0.000 description 2
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150024821 tetO gene Proteins 0.000 description 2
- UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J tetrasodium;2-[2-[bis(carboxylatomethyl)amino]ethyl-(carboxylatomethyl)amino]acetate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC([O-])=O)CC([O-])=O UEUXEKPTXMALOB-UHFFFAOYSA-J 0.000 description 2
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 2
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 238000011200 topical administration Methods 0.000 description 2
- 230000032258 transport Effects 0.000 description 2
- 238000012384 transportation and delivery Methods 0.000 description 2
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 2
- 235000015112 vegetable and seed oil Nutrition 0.000 description 2
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 2
- 239000004034 viscosity adjusting agent Substances 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N (+)-Neomenthol Chemical compound CC(C)[C@@H]1CC[C@@H](C)C[C@@H]1O NOOLISFMXDJSKH-UTLUCORTSA-N 0.000 description 1
- JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N (2r,3r,4s)-2-[(1r)-1,2-dihydroxyethyl]oxolane-3,4-diol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1OC[C@H](O)[C@H]1O JNYAEWCLZODPBN-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N (2r,3r,4s,5r,6s)-4,5-dimethoxy-2-(methoxymethyl)-3-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trimethoxy-6-(methoxymethyl)oxan-2-yl]oxy-6-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4,5,6-trimethoxy-2-(methoxymethyl)oxan-3-yl]oxyoxane Chemical compound CO[C@@H]1[C@@H](OC)[C@H](OC)[C@@H](COC)O[C@H]1O[C@H]1[C@H](OC)[C@@H](OC)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OC)[C@H](OC)O[C@@H]2COC)OC)O[C@@H]1COC LNAZSHAWQACDHT-XIYTZBAFSA-N 0.000 description 1
- SNHKEQOYVVRBQO-UHFFFAOYSA-N 1,3-benzodioxole-5,6-diamine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC2=C1OCO2 SNHKEQOYVVRBQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 1,3-dihydroxypropan-2-yl formate Chemical compound OCC(CO)OC=O LDVVTQMJQSCDMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxy-2,1-benzoxaborole Chemical compound C1=CC=C2B(O)OCC2=C1 XOQABDOICLHPIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-2,4-dioxo-1,3-diazinane-5-carboximidamide Chemical compound CN1CC(C(N)=N)C(=O)NC1=O IXPNQXFRVYWDDI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 1
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BZSXEZOLBIJVQK-UHFFFAOYSA-N 2-methylsulfonylbenzoic acid Chemical compound CS(=O)(=O)C1=CC=CC=C1C(O)=O BZSXEZOLBIJVQK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100031765 3-beta-hydroxysteroid-Delta(8),Delta(7)-isomerase Human genes 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzoic acid Chemical class OC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 FJKROLUGYXJWQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000215068 Acacia senegal Species 0.000 description 1
- 241000251468 Actinopterygii Species 0.000 description 1
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 1
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- XSTZMVAYYCJTNR-DCAQKATOSA-N Ala-Met-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XSTZMVAYYCJTNR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- BFMIRJBURUXDRG-DLOVCJGASA-N Ala-Phe-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)C)CC1=CC=CC=C1 BFMIRJBURUXDRG-DLOVCJGASA-N 0.000 description 1
- OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N Ala-Phe-Pro Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@@H]([NH3+])C)C(=O)N1[C@H](CCC1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 OSRZOHXQCUFIQG-FPMFFAJLSA-N 0.000 description 1
- RMAWDDRDTRSZIR-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RMAWDDRDTRSZIR-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N Ala-Ser-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O NCQMBSJGJMYKCK-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000252073 Anguilliformes Species 0.000 description 1
- 244000105975 Antidesma platyphyllum Species 0.000 description 1
- 108010053481 Antifreeze Proteins Proteins 0.000 description 1
- PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N Arg-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O OTZMRMHZCMZOJZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N Arg-Leu-His Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N WMEVEPXNCMKNGH-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000006820 Arthralgia Diseases 0.000 description 1
- XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N Asn-Asp-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O XVVOVPFMILMHPX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N Asn-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HDHZCEDPLTVHFZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-His Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N DOURAOODTFJRIC-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N Asn-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O MKJBPDLENBUHQU-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asn-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O YNQIDCRRTWGHJD-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N Asp-Gly-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SNDBKTFJWVEVPO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- ZKAOJVJQGVUIIU-GUBZILKMSA-N Asp-Pro-Arg Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O ZKAOJVJQGVUIIU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- XXAMCEGRCZQGEM-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ser-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O XXAMCEGRCZQGEM-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- UTLCRGFJFSZWAW-OLHMAJIHSA-N Asp-Thr-Asn Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N)O UTLCRGFJFSZWAW-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000004255 Butylated hydroxyanisole Substances 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 101100512078 Caenorhabditis elegans lys-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100297347 Caenorhabditis elegans pgl-3 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100408682 Caenorhabditis elegans pmt-2 gene Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- 241000701489 Cauliflower mosaic virus Species 0.000 description 1
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 1
- 229910052684 Cerium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000283153 Cetacea Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 208000017667 Chronic Disease Diseases 0.000 description 1
- 208000013725 Chronic Kidney Disease-Mineral and Bone disease Diseases 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 1
- 206010056370 Congestive cardiomyopathy Diseases 0.000 description 1
- 208000011231 Crohn disease Diseases 0.000 description 1
- UDDITVWSXPEAIQ-IHRRRGAJSA-N Cys-Phe-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O UDDITVWSXPEAIQ-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- CHRCKSPMGYDLIA-SRVKXCTJSA-N Cys-Phe-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O CHRCKSPMGYDLIA-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 201000003883 Cystic fibrosis Diseases 0.000 description 1
- NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N DL-menthol Natural products CC(C)C1CCC(C)CC1O NOOLISFMXDJSKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 201000010374 Down Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010013883 Dwarfism Diseases 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N Elaidinsaeure-aethylester Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000792859 Enema Species 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 1
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 208000005050 Familial Hypophosphatemic Rickets Diseases 0.000 description 1
- 208000001640 Fibromyalgia Diseases 0.000 description 1
- 238000012413 Fluorescence activated cell sorting analysis Methods 0.000 description 1
- PCKOTDPDHIBGRW-CIUDSAMLSA-N Gln-Cys-Arg Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)CN=C(N)N PCKOTDPDHIBGRW-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ZEEPYMXTJWIMSN-GUBZILKMSA-N Gln-Lys-Ser Chemical compound NCCCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZEEPYMXTJWIMSN-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- DQLVHRFFBQOWFL-JYJNAYRXSA-N Gln-Lys-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)O DQLVHRFFBQOWFL-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- OZEQPCDLCDRCGY-SOUVJXGZSA-N Gln-Phe-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC2=CC=CC=C2)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N)C(=O)O OZEQPCDLCDRCGY-SOUVJXGZSA-N 0.000 description 1
- NHMRJKKAVMENKJ-WDCWCFNPSA-N Gln-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O NHMRJKKAVMENKJ-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N Glu-Gly Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LSPKYLAFTPBWIL-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- SYAYROHMAIHWFB-KBIXCLLPSA-N Glu-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O SYAYROHMAIHWFB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- BPQYBFAXRGMGGY-LAEOZQHASA-N Gly-Gln-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)CN BPQYBFAXRGMGGY-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- VIIBEIQMLJEUJG-LAEOZQHASA-N Gly-Ile-Gln Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O VIIBEIQMLJEUJG-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 1
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 206010056438 Growth hormone deficiency Diseases 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 1
- VHHYJBSXXMPQGZ-AVGNSLFASA-N His-Gln-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N VHHYJBSXXMPQGZ-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 101000866618 Homo sapiens 3-beta-hydroxysteroid-Delta(8),Delta(7)-isomerase Proteins 0.000 description 1
- 101001075374 Homo sapiens Gamma-glutamyl hydrolase Proteins 0.000 description 1
- 101000664737 Homo sapiens Somatotropin Proteins 0.000 description 1
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 description 1
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- JRYQSFOFUFXPTB-RWRJDSDZSA-N Ile-Gln-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N JRYQSFOFUFXPTB-RWRJDSDZSA-N 0.000 description 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- 206010054266 Injection site discomfort Diseases 0.000 description 1
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 1
- 108091092195 Intron Proteins 0.000 description 1
- 208000003456 Juvenile Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 108010076876 Keratins Proteins 0.000 description 1
- 102000011782 Keratins Human genes 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000880493 Leptailurus serval Species 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- OGUUKPXUTHOIAV-SDDRHHMPSA-N Leu-Glu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N OGUUKPXUTHOIAV-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N Leu-Lys-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O RZXLZBIUTDQHJQ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N Leu-Met-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C FLNPJLDPGMLWAU-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N Leu-Ser-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N IDGZVZJLYFTXSL-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N Lys-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O IWWMPCPLFXFBAF-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SSJBMGCZZXCGJJ-DCAQKATOSA-N Lys-Asp-Met Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(O)=O SSJBMGCZZXCGJJ-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 244000246386 Mentha pulegium Species 0.000 description 1
- 235000016257 Mentha pulegium Nutrition 0.000 description 1
- 235000004357 Mentha x piperita Nutrition 0.000 description 1
- FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N Met-Gly-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N FYRUJIJAUPHUNB-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- PZUUMQPMHBJJKE-AVGNSLFASA-N Met-Leu-Arg Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCNC(N)=N PZUUMQPMHBJJKE-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 241001430197 Mollicutes Species 0.000 description 1
- 101000969137 Mus musculus Metallothionein-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N N-[2-(1H-indol-3-yl)ethyl]-N-methylprop-2-en-1-amine Chemical compound CN(CCC1=CNC2=C1C=CC=C2)CC=C GXCLVBGFBYZDAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N N-acetyl-beta-neuraminic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)O[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-PFQGKNLYSA-N 0.000 description 1
- 108010079364 N-glycylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 1
- 101100068676 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) gln-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010029748 Noonan syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000000636 Northern blotting Methods 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 206010030113 Oedema Diseases 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 208000001132 Osteoporosis Diseases 0.000 description 1
- 235000019483 Peanut oil Nutrition 0.000 description 1
- YYRCPTVAPLQRNC-ULQDDVLXSA-N Phe-Arg-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 YYRCPTVAPLQRNC-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 1
- WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N Phe-Asp-Asn Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N WMGVYPPIMZPWPN-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SXJGROGVINAYSH-AVGNSLFASA-N Phe-Gln-Asp Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N SXJGROGVINAYSH-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 241000283216 Phocidae Species 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N Poloxamer Chemical compound C1CO1.CC1CO1 RVGRUAULSDPKGF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920000954 Polyglycolide Polymers 0.000 description 1
- 101710182846 Polyhedrin Proteins 0.000 description 1
- 229920000037 Polyproline Polymers 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N Pro-Arg-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O ZSKJPKFTPQCPIH-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- XZONQWUEBAFQPO-HJGDQZAQSA-N Pro-Gln-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XZONQWUEBAFQPO-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 1
- VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N Pro-Ile-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VZKBJNBZMZHKRC-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 1
- XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N Pro-Lys-Glu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O XQPHBAKJJJZOBX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N Pro-Pro-Pro Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H]1N(C(=O)[C@H]2NCCC2)CCC1 SBVPYBFMIGDIDX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000714474 Rous sarcoma virus Species 0.000 description 1
- 101000849522 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) 40S ribosomal protein S13 Proteins 0.000 description 1
- 206010039491 Sarcoma Diseases 0.000 description 1
- TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N Ser-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TYYBJUYSTWJHGO-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- IAORETPTUDBBGV-CIUDSAMLSA-N Ser-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)N IAORETPTUDBBGV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N Ser-Lys-Phe Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)N WGDYNRCOQRERLZ-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- 206010049416 Short-bowel syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010072610 Skeletal dysplasia Diseases 0.000 description 1
- 240000006394 Sorghum bicolor Species 0.000 description 1
- 241000287486 Spheniscidae Species 0.000 description 1
- 201000010829 Spina bifida Diseases 0.000 description 1
- 208000006097 Spinal Dysraphism Diseases 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 1
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 1
- 241000270666 Testudines Species 0.000 description 1
- 240000006474 Theobroma bicolor Species 0.000 description 1
- ZQUKYJOKQBRBCS-GLLZPBPUSA-N Thr-Gln-Gln Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N)O ZQUKYJOKQBRBCS-GLLZPBPUSA-N 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- RCLOWEZASFJFEX-KKUMJFAQSA-N Tyr-Asp-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 RCLOWEZASFJFEX-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BVDHHLMIZFCAAU-BZSNNMDCSA-N Tyr-Cys-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O BVDHHLMIZFCAAU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N Tyr-Gly-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KCPFDGNYAMKZQP-KBPBESRZSA-N 0.000 description 1
- OHOVFPKXPZODHS-SJWGOKEGSA-N Tyr-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N OHOVFPKXPZODHS-SJWGOKEGSA-N 0.000 description 1
- 108090000848 Ubiquitin Proteins 0.000 description 1
- 102000044159 Ubiquitin Human genes 0.000 description 1
- JXGWQYWDUOWQHA-DZKIICNBSA-N Val-Gln-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N JXGWQYWDUOWQHA-DZKIICNBSA-N 0.000 description 1
- LJSZPMSUYKKKCP-UBHSHLNASA-N Val-Phe-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 LJSZPMSUYKKKCP-UBHSHLNASA-N 0.000 description 1
- VTIAEOKFUJJBTC-YDHLFZDLSA-N Val-Tyr-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N VTIAEOKFUJJBTC-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 1
- GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N Val-Tyr-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](Cc1ccc(O)cc1)C(=O)NCC(O)=O GUIYPEKUEMQBIK-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000031878 X-linked hypophosphatemia Diseases 0.000 description 1
- 208000035724 X-linked hypophosphatemic rickets Diseases 0.000 description 1
- KBGAYAKRZNYFFG-BOHATCBPSA-N aceneuramic acid Chemical compound OC(=O)C(=O)C[C@H](O)[C@@H](NC(=O)C)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO KBGAYAKRZNYFFG-BOHATCBPSA-N 0.000 description 1
- VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N acetic acid 2,3,4,5,6-pentahydroxyhexanal Chemical compound CC(O)=O.OCC(O)C(O)C(O)C(O)C=O VJHCJDRQFCCTHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003916 acid precipitation Methods 0.000 description 1
- 150000001252 acrylic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical class N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004115 adherent culture Methods 0.000 description 1
- 230000000274 adsorptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002528 anti-freeze Effects 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 1
- 239000008135 aqueous vehicle Substances 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004507 artificial chromosome Anatomy 0.000 description 1
- 239000012131 assay buffer Substances 0.000 description 1
- 238000000889 atomisation Methods 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003613 bile acid Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 229960000074 biopharmaceutical Drugs 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 235000019282 butylated hydroxyanisole Nutrition 0.000 description 1
- 229940043253 butylated hydroxyanisole Drugs 0.000 description 1
- CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N butylated hydroxyanisole Chemical compound COC1=CC=C(O)C(C(C)(C)C)=C1.COC1=CC=C(O)C=C1C(C)(C)C CZBZUDVBLSSABA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000001925 catabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000012832 cell culture technique Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 238000011072 cell harvest Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 108091092328 cellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 1
- GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N cerium Chemical compound [Ce] GWXLDORMOJMVQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000037893 chronic inflammatory disorder Diseases 0.000 description 1
- 208000020832 chronic kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 208000022831 chronic renal failure syndrome Diseases 0.000 description 1
- 238000013377 clone selection method Methods 0.000 description 1
- 239000013599 cloning vector Substances 0.000 description 1
- 229940110456 cocoa butter Drugs 0.000 description 1
- 235000019868 cocoa butter Nutrition 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000002648 combination therapy Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 238000009833 condensation Methods 0.000 description 1
- 230000005494 condensation Effects 0.000 description 1
- 238000006482 condensation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 1
- 235000005687 corn oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002285 corn oil Substances 0.000 description 1
- 229940099112 cornstarch Drugs 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 239000002385 cottonseed oil Substances 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 229960005168 croscarmellose Drugs 0.000 description 1
- 229960001681 croscarmellose sodium Drugs 0.000 description 1
- 229960000913 crospovidone Drugs 0.000 description 1
- 235000010947 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001767 crosslinked sodium carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 239000002577 cryoprotective agent Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 238000011157 data evaluation Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011118 depth filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 239000012538 diafiltration buffer Substances 0.000 description 1
- 239000006160 differential media Substances 0.000 description 1
- 201000011304 dilated cardiomyopathy 1A Diseases 0.000 description 1
- 238000007865 diluting Methods 0.000 description 1
- 229940042399 direct acting antivirals protease inhibitors Drugs 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000002270 dispersing agent Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 239000007920 enema Substances 0.000 description 1
- 229940079360 enema for constipation Drugs 0.000 description 1
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 210000003617 erythrocyte membrane Anatomy 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000010944 ethyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001761 ethyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N ethyl oleate Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(=O)OCC LVGKNOAMLMIIKO-QXMHVHEDSA-N 0.000 description 1
- 229940093471 ethyl oleate Drugs 0.000 description 1
- 238000013265 extended release Methods 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000010685 fatty oil Substances 0.000 description 1
- 239000012527 feed solution Substances 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 239000002350 fibrinopeptide Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 239000011888 foil Substances 0.000 description 1
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 1
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008369 fruit flavor Substances 0.000 description 1
- 230000005021 gait Effects 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000010363 gene targeting Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 210000004907 gland Anatomy 0.000 description 1
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 1
- 150000002308 glutamine derivatives Chemical group 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 1
- 239000008062 guanidine hydrochloride buffer Substances 0.000 description 1
- 235000009424 haa Nutrition 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 244000309465 heifer Species 0.000 description 1
- 230000002440 hepatic effect Effects 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 108091008039 hormone receptors Proteins 0.000 description 1
- 235000001050 hortel pimenta Nutrition 0.000 description 1
- 235000003642 hunger Nutrition 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 description 1
- 235000010979 hydroxypropyl methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001866 hydroxypropyl methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920003088 hydroxypropyl methyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N hydroxypropyl methyl cellulose Chemical compound OC1C(O)C(OC)OC(CO)C1OC1C(O)C(O)C(OC2C(C(O)C(OC3C(C(O)C(O)C(CO)O3)O)C(CO)O2)O)C(CO)O1 UFVKGYZPFZQRLF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000010072 hypochondroplasia Diseases 0.000 description 1
- 239000012729 immediate-release (IR) formulation Substances 0.000 description 1
- 230000036737 immune function Effects 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 238000012744 immunostaining Methods 0.000 description 1
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 1
- 238000000099 in vitro assay Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003701 inert diluent Substances 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 208000000509 infertility Diseases 0.000 description 1
- 231100000535 infertility Toxicity 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000007914 intraventricular administration Methods 0.000 description 1
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N isomaltotriose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C=O)O1 FZWBNHMXJMCXLU-BLAUPYHCSA-N 0.000 description 1
- 239000007951 isotonicity adjuster Substances 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 1
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 1
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 1
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 239000002960 lipid emulsion Substances 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000008297 liquid dosage form Substances 0.000 description 1
- 239000006193 liquid solution Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 230000033001 locomotion Effects 0.000 description 1
- 239000012731 long-acting form Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 239000006210 lotion Substances 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 1
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 1
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000002483 medication Methods 0.000 description 1
- 229940041616 menthol Drugs 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 239000006151 minimal media Substances 0.000 description 1
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 1
- 238000012434 mixed-mode chromatography Methods 0.000 description 1
- 108091005601 modified peptides Proteins 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N n-[(2r,3r,4s,5r)-4,5,6-trihydroxy-1-oxo-3-[(2r,3r,4s,5r,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyhexan-2-yl]acetamide Chemical compound CC(=O)N[C@@H](C=O)[C@H]([C@@H](O)[C@H](O)CO)O[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O QCQYVCMYGCHVMR-AAZUGDAUSA-N 0.000 description 1
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 1
- 238000002663 nebulization Methods 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 1
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 description 1
- 231100000028 nontoxic concentration Toxicity 0.000 description 1
- 238000004305 normal phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 210000004940 nucleus Anatomy 0.000 description 1
- 208000030212 nutrition disease Diseases 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 239000002674 ointment Substances 0.000 description 1
- 238000002515 oligonucleotide synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004006 olive oil Substances 0.000 description 1
- 235000008390 olive oil Nutrition 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 239000008012 organic excipient Substances 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 230000016087 ovulation Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010979 pH adjustment Methods 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 235000016236 parenteral nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000312 peanut oil Substances 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 239000007967 peppermint flavor Substances 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000036470 plasma concentration Effects 0.000 description 1
- 239000004014 plasticizer Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 231100000614 poison Toxicity 0.000 description 1
- 230000007096 poisonous effect Effects 0.000 description 1
- 229960000502 poloxamer Drugs 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004633 polyglycolic acid Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000193 polymethacrylate Polymers 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 108010026466 polyproline Proteins 0.000 description 1
- 229920001451 polypropylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 235000013809 polyvinylpolypyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 229920000523 polyvinylpolypyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 230000017363 positive regulation of growth Effects 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 229940069328 povidone Drugs 0.000 description 1
- 238000011045 prefiltration Methods 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 230000002028 premature Effects 0.000 description 1
- 238000002953 preparative HPLC Methods 0.000 description 1
- 238000009516 primary packaging Methods 0.000 description 1
- 239000013587 production medium Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 1
- 235000013772 propylene glycol Nutrition 0.000 description 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 1
- 230000020978 protein processing Effects 0.000 description 1
- 238000004730 pulsed amperometry Methods 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 238000007670 refining Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 201000006409 renal osteodystrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000009256 replacement therapy Methods 0.000 description 1
- 230000001718 repressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000004043 responsiveness Effects 0.000 description 1
- 239000012465 retentate Substances 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 235000019204 saccharin Nutrition 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940081974 saccharin Drugs 0.000 description 1
- 239000000901 saccharin and its Na,K and Ca salt Substances 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 239000006152 selective media Substances 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000013605 shuttle vector Substances 0.000 description 1
- 238000007086 side reaction Methods 0.000 description 1
- 235000010413 sodium alginate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000661 sodium alginate Substances 0.000 description 1
- 229940005550 sodium alginate Drugs 0.000 description 1
- WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M sodium benzoate Chemical compound [Na+].[O-]C(=O)C1=CC=CC=C1 WXMKPNITSTVMEF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000010234 sodium benzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004299 sodium benzoate Substances 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000008109 sodium starch glycolate Substances 0.000 description 1
- 229940079832 sodium starch glycolate Drugs 0.000 description 1
- 229920003109 sodium starch glycolate Polymers 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 1
- 229960004532 somatropin Drugs 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 230000037351 starvation Effects 0.000 description 1
- 239000008227 sterile water for injection Substances 0.000 description 1
- 239000012906 subvisible particle Substances 0.000 description 1
- 229960004793 sucrose Drugs 0.000 description 1
- 125000000185 sucrose group Chemical group 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000829 suppository Substances 0.000 description 1
- 239000002511 suppository base Substances 0.000 description 1
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 239000006188 syrup Substances 0.000 description 1
- 235000020357 syrup Nutrition 0.000 description 1
- 238000007910 systemic administration Methods 0.000 description 1
- 238000012385 systemic delivery Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 229940037128 systemic glucocorticoids Drugs 0.000 description 1
- 238000004885 tandem mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000011287 therapeutic dose Methods 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 239000012049 topical pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000167 toxic agent Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003440 toxic substance Substances 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 1
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 230000014723 transformation of host cell by virus Effects 0.000 description 1
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000003146 transient transfection Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 239000006163 transport media Substances 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000717 tumor promoter Substances 0.000 description 1
- 108010087967 type I signal peptidase Proteins 0.000 description 1
- 238000004704 ultra performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 1
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 1
- 108010009962 valyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 238000011100 viral filtration Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
- 239000008215 water for injection Substances 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004584 weight gain Effects 0.000 description 1
- 235000019786 weight gain Nutrition 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
- C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
- C07K1/34—Extraction; Separation; Purification by filtration, ultrafiltration or reverse osmosis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/475—Growth factors; Growth regulators
- C07K14/505—Erythropoietin [EPO]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/59—Follicle-stimulating hormone [FSH]; Chorionic gonadotropins, e.g.hCG [human chorionic gonadotropin]; Luteinising hormone [LH]; Thyroid-stimulating hormone [TSH]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/575—Hormones
- C07K14/61—Growth hormone [GH], i.e. somatotropin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/6437—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21021—Coagulation factor VIIa (3.4.21.21)
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G06Q10/00—Administration; Management
- G06Q10/06—Resources, workflows, human or project management; Enterprise or organisation planning; Enterprise or organisation modelling
- G06Q10/063—Operations research, analysis or management
- G06Q10/0633—Workflow analysis
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G06Q10/00—Administration; Management
- G06Q10/06—Resources, workflows, human or project management; Enterprise or organisation planning; Enterprise or organisation modelling
- G06Q10/063—Operations research, analysis or management
- G06Q10/0637—Strategic management or analysis, e.g. setting a goal or target of an organisation; Planning actions based on goals; Analysis or evaluation of effectiveness of goals
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G06Q10/00—Administration; Management
- G06Q10/06—Resources, workflows, human or project management; Enterprise or organisation planning; Enterprise or organisation modelling
- G06Q10/063—Operations research, analysis or management
- G06Q10/0639—Performance analysis of employees; Performance analysis of enterprise or organisation operations
- G06Q10/06393—Score-carding, benchmarking or key performance indicator [KPI] analysis
-
- G—PHYSICS
- G06—COMPUTING; CALCULATING OR COUNTING
- G06Q—INFORMATION AND COMMUNICATION TECHNOLOGY [ICT] SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES; SYSTEMS OR METHODS SPECIALLY ADAPTED FOR ADMINISTRATIVE, COMMERCIAL, FINANCIAL, MANAGERIAL OR SUPERVISORY PURPOSES, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
- G06Q30/00—Commerce
- G06Q30/02—Marketing; Price estimation or determination; Fundraising
- G06Q30/0201—Market modelling; Market analysis; Collecting market data
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/31—Fusion polypeptide fusions, other than Fc, for prolonged plasma life, e.g. albumin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Business, Economics & Management (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Human Resources & Organizations (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Strategic Management (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Entrepreneurship & Innovation (AREA)
- Economics (AREA)
- Development Economics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Educational Administration (AREA)
- Theoretical Computer Science (AREA)
- Game Theory and Decision Science (AREA)
- General Business, Economics & Management (AREA)
- Marketing (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Reproductive Health (AREA)
- Quality & Reliability (AREA)
- Tourism & Hospitality (AREA)
- Operations Research (AREA)
- Finance (AREA)
Abstract
본 명세서에는 포유동물 세포 배양계에서 CTP 연장에 의해서 변형된 재조합 인간 성장 호르몬(hGH)을 제조하는 방법이 개시되어 있다.
Description
본 발명은 포유동물 세포 배양계 중에서의 CTP 연장에 의해서 변형된 재조합 인간 성장 호르몬(hGH)의 제조 방법을 제공한다.
성장 호르몬(소마토트로핀)은 주로, 왜소증으로 이어지는 소아의 성장 호르몬 결핍을 치료하기 위해서 50년 넘게 임상 용도로 존재하여 왔다. 1985년에, 재조합 DNA 기원으로부터의 인간 성장 호르몬(hGH)이 사후(pituitary) 뇌하수체 hGH로 대체되었는데, 이것은 그때까지 이용 가능한 물질의 유일한 공급원이었다. hGH 대체 요법은 수만명의 환자를 위한 표준 치유법이었고, 안전하고 효과적이라고 증명되었다. hGH 혈액 수준을 유효 치료창으로 유지시킬 필요성은 매일 또는 격일마다의 피하 또는 근육내 주사를 요구한다. 시판 hGH의 대부분은 박테리아계에서 제조된다.
성장 호르몬(GH)은 인슐린-유사 성장 인자-1(IGF-1)의 간 생산을 자극하고, 순환계로의 방출을 자극하는 191-아미노산 뇌하수체 단백질이다. GH 제제의 대부분은 현재 매일 투여를 요구하고; 따라서 특히 청소년에서, 준수에 어려움이 있을 수 있다. 성인 GH 결핍(GHD)에서, 매일 투여 및 수반되는 부작용(예를 들어, 주사 부위 불편함, 일시적인 부종 및 관절통)이 기존의 제형의 치료 유용성을 제한한다. GH의 장기간-작용성 형태가 더 적은 횟수의 주사를 요구하고, 가능하게는 매일 주사로 인해서 일어나는 혈장 농도의 최대값 및 최저값과 연관된 부작용 보고를 최소화함으로써 불편함을 감소시킬 가능성을 갖는다.
본 명세서에 개시된 방법은 장기간-작용성 hGH(MOD-4023; 도 1)의 생산을 포함하고, 이것은 현재 GHD의 치료를 위해서 요구되는 다수의 횟수의 주사에 대한 필요성을 제거한다. 본 기술은 천연 펩타이드인, 인간 융모성 고나도트로핀(human chorionic gonadotropin: hCG)의 베타쇄의 C-말단 펩타이드(CTP)를 기반으로 하고, 이것은 hCG에 임신을 유지시키기 위해서 요구되는 장기간 수명을 제공한다(초기 T1/ 2 약 10시간, 최종 T1/ 2 약 37시간). CTP는 28개의 아미노산 및 4 내지 6개의 O-연결된 당쇄를 가지며, 이것은 모두 세린 잔기에 연결된다. 배란을 촉발시키는 생식력(fertility) 호르몬인 황체형성 호르몬(LH)의 베타쇄는 hCG과 거의 동일하지만, CTP를 포함하지 않는다. 그 결과, LH는 혈액 중에서 상당히 더 짧은 반감기를 갖는다(초기 T1/2 약 1시간, 최종 T1/2 약 10시간).
MOD-4023은 CTP의 3개의 복사체에 융합된 hGH 분자인데; 3개의 복사체 중 하나는 N-말단에 존재하고, 2개는 C-말단에 존재한다(서열번호 7에 기재된 바와 같은 CTP-hGH-CTP-CTP)(도 1). MOD-4023은 12 내지 18개의 O-연결된 탄수화물을 갖는 275개의 아미노산의 단쇄 단백질이다. 동물 모델(뇌하수체절제된(hypophysectomized) 래트의 체중 증가)에서 예증되는 바와 같이, MOD-4023은 hGH의 매일 주사와 유사한 임상 효능을 가지면서, 1주일에 1회 내지 2주에 1회 주사될 가능성을 가질 수 있다.
일 양상에서, 본 명세서에는 인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드의 제조 방법이 개시되어 있고, 그 방법은 (a) 미리 결정된 수의 세포를 상기 CTP-변형된 인간 성장 호르몬을 코딩하는 코딩부를 포함하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시키는 단계이되, 여기서 상기 형질감염된 세포는 상기 CTP-변형된 hGH를 발현 및 분비하는, 형질감염시키는 단계; (b) 상기 CTP-변형된 hGH를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; (c) 상기 클론을 용액 중에서 미리 결정된 규모로 확장시키는 단계; (d) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; (e) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 (f) 상기 정화된 수확 용액을 정제하여 목적하는 농도의 CTP-변형된 hGH를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 인간 융모성 고나도트로핀 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드를 제조하고, 여기서 상기 CTP-변형된 hGH의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같다. 관련된 양상에서, 상기 제조된 CTP-변형된 hGH는 고도로 글리코실화되어 있다. 관련된 양상에서, 상기 제조된 CTP-변형된 hGH는 고도로 시알릴화되어 있다. 또 다른 관련된 양상에서, 상기 제조된 CTP-변형된 hGH의 글리코실화 패턴은 CTP 당 적어도 4개의 O-연결된 부위에서의 글리코실화를 포함한다.
일 양상에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 제조된 인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드가 개시되어 있다. 관련된 양상에서, CTP-변형된 hGH의 글리코실화는 CTP 당 4개 초과의 O-연결된 글리칸을 포함한다. 관련된 양상에서, 글리코실화는 CTP 단위 당 적어도 4 내지 6개의 O-글리칸을 포함한다.
다른 특징부 및 이점은 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용, 실시예 및 도면으로부터 자명할 것이다. 그러나, 제조 방법 및 이의 생성된 생산물의 실시형태를 나타내면서, 상세한 설명 및 구체적인 실시예는 단지 설명의 방식으로 제공되는데, 이는 본 명세서에 개시된 방법 및 생산물의 사상 및 범주 내의 다양한 변화 및 변형이 이러한 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용으로부터 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이기 때문이다.
재조합 장기간-작용성 인간 융모성 고나도트로핀 카복시-말단 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드(CTP-변형된 hGH) 및 이의 제조 방법으로서 간주된 발명 주제는 본 명세서의 결론 부분에 특히 언급되어 있고, 명백하게 청구되어 있다. 그러나, 대상, 특징부 및 이의 이점와 함께, 구성 및 작동 방법 둘 모두와 관련하여, CTP-변형된 hGH 및 이의 제조 방법은 첨부된 도면을 읽으면, 하기 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용을 참고로 가장 잘 이해될 수 있다:
도 1. MOD-4023(CTP-hGH-CTP-CTP)을 도시한 개략도.
도 2. MOD-4023 pCI-dhfr 플라스미드의 맵.
도 3. CTP-변형된 폴리펩타이드, 예를 들어 MOD-4023의 상류 공정 흐름 제조도.
도 4. CTP 변형된 폴리펩타이드, 예를 들어 MOD-4023의 정제 공정의 흐름도.
도 5. MOD-4023 약물 제품(DP) 제조 공정의 흐름도 개요.
도 6. 제1 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 칼럼에 의한 MOD-4023 고 글리코실화된 형태의 정제를 보여주는 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE. 레인 (1) 수확 전체 단백질, 도 3의 단계 8; 레인 (2) 한외여과(ultrafiltration)/투석여과(diafiltration), 도 4의 단계 1(UFDF1), 농축 및 투석여과된 전체 단백질; 레인 (3) IEX 통과 유동, 도 4의 단계 3; 레인 (4) IEX 세척 물질, 도 4의 단계 3; 및 레인 (5) IEX 용리, 도 4의 단계 3.
도 7. 상이한 배취로부터의 MOD-4023의 견고한 O-글리칸 함량을 보여주는 데이터. MOD-4023 몰 당 O-글리칸 몰 함량은 MOD-4023 약물 물질(DS) 및 약물 제품(DP)의 상이한 배취에 대해서 결정되었다.
도 8. 질량 분석법(MS) 반응을 기초로 한 개별 O-글리코실화된 펩타이드들 간의 배취 대 배취 비교를 나타낸 도면. 칼럼 주석은 O-연결된 글리칸에 대한 약어로서 "O"를 갖는 아미노산 서열이다. 제1 펩타이드의 MS 반응을 데이터 정규화를 위해서 사용하였고, 100%로 설정하였다.
도 9. MOD-4023의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 프로파일. 피크 4는 MOD-4023 주피크에 상응한다. 4개의 소량의 관련된 형태가 또한 존재한다(피크 1, 2, 3 및 5).
도 10. MOD-4023의 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 프로파일. 피크 3은 MOD-4023 단량체에 상응한다. 피크 1 및 2는 각각 MOD-4023 이량체 및 중합체에 상응한다.
도 11. 220nm에서 RP-HPLC에 의해서 분석된 바와 같은 MOD-4023 표준품 SR-929SI.1(상부 프로파일)과 MOD-4023 I15-PP(UFDF1 샘플)(하부 프로파일)를 비교한 도면. 피크 1은 MOD-4023 글리코실화된 형태에 상응하고, 피크 2는 비-글리코실화된 형태에 상응한다.
도 12. 220nm에서 RP-HPLC에 의해서 분석된 바와 같은 MOD-4023 표준품 SR-929SI.1(상부 프로파일)과 MOD-4023 C10-PP(용리 DEAE 세파로스)를 비교한 도면. 제조 공정에서 이 지점에서, 글리코실화된 피크 만이 MOD-4023 샘플에서 관찰된다.
도 13. 안정하게 형질감염된 세포 중에서 MOD-4023에 의한 hGH 수용체의 활성을 나타낸 도면. MOD-4023에 의한 전형적인 용량 반응 활성화 곡선. Baf 세포 상에서 hGH 수용체의 MOD-4023 활성화는 이의 세포 표면 상에서 hGH 수용체를 안전하게 발현함.
도 14. 아벨슨 뮤린 루케미아 바이러스(Abelson Murine Leukemia Virus: A-MuLV), 미세 마우스 바이러스(Minute Virus of Mice: MVM), 리오바이러스(Reovirus) 유형 3(Reo-3) 및 가성광견병 바이러스(Pseudorabies Virus: PrV)를 사용한 바이러스 안전성 평가 연구로부터 유래된 개별 공정 단계 및 전체 공정 클리어런스(clearance) 인자를 나타낸 도면. 용량 당 이론적인 바이러스 로드(load)는 15㎎/용량의 최대 용량으로 계산되었다.
도 15a 및 도 15b. 정상(NP) 칼럼을 사용하여 HPLC 상에서 분리된 제거된 글리칸의 2AB 표지에 의해서 측정된 바와 같은 2개의 MOD-4023 생산물의 O-연결된 글리칸 구조 및 이들의 존재비(도 15a), 마찬가지로 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 상에서 분리된 제거된 시알산의 1,2-다이아미노-4,5-메틸렌다이옥시벤젠.2HCl(DMB) 표지에 의해서 측정된 바와 같은 2개의 MOD-423 생산물 샘플의 시알산 유형의 존재비(도 15B)를 나타낸 도면.
도 16. 3개의 MOD-4023 배취의 트립신에 의한 소화 생산물의 온-라인 액체 크로마토그래프/전자분무 질량 분광학(LC/ES-MS) 분석으로부터 수득된 3개의 전체 이온 전류 크로마토그램의 중첩을 나타낸 도면.
도 17. 적어도 하나의 HexNAc-Hex 잔기에 의해서 변형된 신호에 초점을 맞춘 탈-시알릴화, 환원 및 카복시메틸화된 MOD-4023 단백질 배취(도 16에 도시되고, 실시예 2에 논의된 바와 같음)의 트립신에 의한 소화물의 온-라인 LC/ES-MS 분석으로부터 수득된 신호의 평가를 나타낸 도면.
도 18. MOD-4023 서열번호 7의 아미노산 서열 1 내지 30을 나타낸 도면(여기서 O-글리코실화는 위치 10, 13, 15, 및 21(적색으로 표시됨)에서 세린(S) 잔기 상에서 일어남). 이러한 세린(S) 전부는 서열에서 프롤린(P) 잔기 뒤에 존재한다. 위치 1 내지 4(1 내지 4) 중 적어도 2개는 O-글리코실화 부위(자색으로 표시됨)에 의해서 점유된다.
도 19. MOD-4023 서열번호 7의 아미노산 서열 211 내지 275를 나타낸 도면(여기서 O-글리코실화는 적색으로 표시된 세린(S) 잔기 상에서 일어남). 그러한 세린(S) 전부는 서열에서 프롤린(P) 잔기 뒤에 존재한다. 추가로, 세린 반복 영역에서, S 잔기 중 적어도 2개는 O-글리코실화 부위(자색으로 표시됨)에 의해서 점유된다.
도 20. 탈-시알릴화 후 MOD4023 로트 648-01-10-014A 샘플의 온-라인 LC/ES-MS 분석으로부터 수득된 tR 19.8분에서의 UV 흡수 성분의 용리 동안 얻은 디콘볼루션된(deconvoluted) 질량 스펙트럼.
도 21. 역상(RP)-HPLC를 사용하여 평가된 바와 같은, MOD-4023(DS) 순도를 나타낸 도면.
도 22. 크기 배제 크로마토그래프(SEC)-HPLC을 사용하여 평가된 바와 같은, MOD-4023(DS) 순도를 나타낸 도면.
도 23. 효력(potency) 결과를 나타낸 도면.
도 24. 숙주 세포 단백질(HCP); DNA, 메토트렉세이트(MTX); 프로필렌 글리콜(PG); 트리톤; 인슐린; DMSO; 및 생균수(Bioburden)에 대한 불순물 분석 결과를 나타낸 도면.
설명의 단순화 및 명확화를 위해서, 도면에 도시된 요소는 반드시 축적대로 도시되지는 않는다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 요소 중 일부의 치수는 명확화를 위해서 다른 요소에 비해서 과장될 수 있다. 추가로, 적절하다고 고려되는 경우, 도면 부호는 상응하거나 유사한 요소를 표현하기 위해서 도면에서 반복될 수 있다.
도 1. MOD-4023(CTP-hGH-CTP-CTP)을 도시한 개략도.
도 2. MOD-4023 pCI-dhfr 플라스미드의 맵.
도 3. CTP-변형된 폴리펩타이드, 예를 들어 MOD-4023의 상류 공정 흐름 제조도.
도 4. CTP 변형된 폴리펩타이드, 예를 들어 MOD-4023의 정제 공정의 흐름도.
도 5. MOD-4023 약물 제품(DP) 제조 공정의 흐름도 개요.
도 6. 제1 이온 교환 크로마토그래피(IEX) 칼럼에 의한 MOD-4023 고 글리코실화된 형태의 정제를 보여주는 쿠마시(Coomassie) 염색된 SDS-PAGE. 레인 (1) 수확 전체 단백질, 도 3의 단계 8; 레인 (2) 한외여과(ultrafiltration)/투석여과(diafiltration), 도 4의 단계 1(UFDF1), 농축 및 투석여과된 전체 단백질; 레인 (3) IEX 통과 유동, 도 4의 단계 3; 레인 (4) IEX 세척 물질, 도 4의 단계 3; 및 레인 (5) IEX 용리, 도 4의 단계 3.
도 7. 상이한 배취로부터의 MOD-4023의 견고한 O-글리칸 함량을 보여주는 데이터. MOD-4023 몰 당 O-글리칸 몰 함량은 MOD-4023 약물 물질(DS) 및 약물 제품(DP)의 상이한 배취에 대해서 결정되었다.
도 8. 질량 분석법(MS) 반응을 기초로 한 개별 O-글리코실화된 펩타이드들 간의 배취 대 배취 비교를 나타낸 도면. 칼럼 주석은 O-연결된 글리칸에 대한 약어로서 "O"를 갖는 아미노산 서열이다. 제1 펩타이드의 MS 반응을 데이터 정규화를 위해서 사용하였고, 100%로 설정하였다.
도 9. MOD-4023의 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC) 프로파일. 피크 4는 MOD-4023 주피크에 상응한다. 4개의 소량의 관련된 형태가 또한 존재한다(피크 1, 2, 3 및 5).
도 10. MOD-4023의 크기-배제 고성능 액체 크로마토그래피(SEC-HPLC) 프로파일. 피크 3은 MOD-4023 단량체에 상응한다. 피크 1 및 2는 각각 MOD-4023 이량체 및 중합체에 상응한다.
도 11. 220nm에서 RP-HPLC에 의해서 분석된 바와 같은 MOD-4023 표준품 SR-929SI.1(상부 프로파일)과 MOD-4023 I15-PP(UFDF1 샘플)(하부 프로파일)를 비교한 도면. 피크 1은 MOD-4023 글리코실화된 형태에 상응하고, 피크 2는 비-글리코실화된 형태에 상응한다.
도 12. 220nm에서 RP-HPLC에 의해서 분석된 바와 같은 MOD-4023 표준품 SR-929SI.1(상부 프로파일)과 MOD-4023 C10-PP(용리 DEAE 세파로스)를 비교한 도면. 제조 공정에서 이 지점에서, 글리코실화된 피크 만이 MOD-4023 샘플에서 관찰된다.
도 13. 안정하게 형질감염된 세포 중에서 MOD-4023에 의한 hGH 수용체의 활성을 나타낸 도면. MOD-4023에 의한 전형적인 용량 반응 활성화 곡선. Baf 세포 상에서 hGH 수용체의 MOD-4023 활성화는 이의 세포 표면 상에서 hGH 수용체를 안전하게 발현함.
도 14. 아벨슨 뮤린 루케미아 바이러스(Abelson Murine Leukemia Virus: A-MuLV), 미세 마우스 바이러스(Minute Virus of Mice: MVM), 리오바이러스(Reovirus) 유형 3(Reo-3) 및 가성광견병 바이러스(Pseudorabies Virus: PrV)를 사용한 바이러스 안전성 평가 연구로부터 유래된 개별 공정 단계 및 전체 공정 클리어런스(clearance) 인자를 나타낸 도면. 용량 당 이론적인 바이러스 로드(load)는 15㎎/용량의 최대 용량으로 계산되었다.
도 15a 및 도 15b. 정상(NP) 칼럼을 사용하여 HPLC 상에서 분리된 제거된 글리칸의 2AB 표지에 의해서 측정된 바와 같은 2개의 MOD-4023 생산물의 O-연결된 글리칸 구조 및 이들의 존재비(도 15a), 마찬가지로 초고성능 액체 크로마토그래피(UPLC) 상에서 분리된 제거된 시알산의 1,2-다이아미노-4,5-메틸렌다이옥시벤젠.2HCl(DMB) 표지에 의해서 측정된 바와 같은 2개의 MOD-423 생산물 샘플의 시알산 유형의 존재비(도 15B)를 나타낸 도면.
도 16. 3개의 MOD-4023 배취의 트립신에 의한 소화 생산물의 온-라인 액체 크로마토그래프/전자분무 질량 분광학(LC/ES-MS) 분석으로부터 수득된 3개의 전체 이온 전류 크로마토그램의 중첩을 나타낸 도면.
도 17. 적어도 하나의 HexNAc-Hex 잔기에 의해서 변형된 신호에 초점을 맞춘 탈-시알릴화, 환원 및 카복시메틸화된 MOD-4023 단백질 배취(도 16에 도시되고, 실시예 2에 논의된 바와 같음)의 트립신에 의한 소화물의 온-라인 LC/ES-MS 분석으로부터 수득된 신호의 평가를 나타낸 도면.
도 18. MOD-4023 서열번호 7의 아미노산 서열 1 내지 30을 나타낸 도면(여기서 O-글리코실화는 위치 10, 13, 15, 및 21(적색으로 표시됨)에서 세린(S) 잔기 상에서 일어남). 이러한 세린(S) 전부는 서열에서 프롤린(P) 잔기 뒤에 존재한다. 위치 1 내지 4(1 내지 4) 중 적어도 2개는 O-글리코실화 부위(자색으로 표시됨)에 의해서 점유된다.
도 19. MOD-4023 서열번호 7의 아미노산 서열 211 내지 275를 나타낸 도면(여기서 O-글리코실화는 적색으로 표시된 세린(S) 잔기 상에서 일어남). 그러한 세린(S) 전부는 서열에서 프롤린(P) 잔기 뒤에 존재한다. 추가로, 세린 반복 영역에서, S 잔기 중 적어도 2개는 O-글리코실화 부위(자색으로 표시됨)에 의해서 점유된다.
도 20. 탈-시알릴화 후 MOD4023 로트 648-01-10-014A 샘플의 온-라인 LC/ES-MS 분석으로부터 수득된 tR 19.8분에서의 UV 흡수 성분의 용리 동안 얻은 디콘볼루션된(deconvoluted) 질량 스펙트럼.
도 21. 역상(RP)-HPLC를 사용하여 평가된 바와 같은, MOD-4023(DS) 순도를 나타낸 도면.
도 22. 크기 배제 크로마토그래프(SEC)-HPLC을 사용하여 평가된 바와 같은, MOD-4023(DS) 순도를 나타낸 도면.
도 23. 효력(potency) 결과를 나타낸 도면.
도 24. 숙주 세포 단백질(HCP); DNA, 메토트렉세이트(MTX); 프로필렌 글리콜(PG); 트리톤; 인슐린; DMSO; 및 생균수(Bioburden)에 대한 불순물 분석 결과를 나타낸 도면.
설명의 단순화 및 명확화를 위해서, 도면에 도시된 요소는 반드시 축적대로 도시되지는 않는다는 것을 인식할 것이다. 예를 들어, 요소 중 일부의 치수는 명확화를 위해서 다른 요소에 비해서 과장될 수 있다. 추가로, 적절하다고 고려되는 경우, 도면 부호는 상응하거나 유사한 요소를 표현하기 위해서 도면에서 반복될 수 있다.
하기에 상술된 설명에서, 재조합 장기간-작용성 인간 융모성 고나도트로핀 카복시-말단 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드(CTP-변형된 hGH; MOD-4023; 서열번호 7) 및 이의 제조 방법의 철저한 이해를 제공하기 위해서 다수의 구체적인 상세 사항이 기재되어 있다. 다른 예에서, 널리 공지된 방법, 절차 및 성분은 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 및 이의 제조 방법을 모호하게 하지 않도록 상세하게 기술되지 않았다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 장기간-작용성 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)의 카복시 말단 펩타이드(CTP)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP는 단백질 또는 이로부터 유래된 펩타이드의 분해에 대해서 보호제로서 작용한다. 또 다른 실시형태에서, CTP는 단백질 또는 이로부터 유래된 펩타이드의 순환성 반감기를 연장한다. 일부 실시형태에서, CTP는 단백질 또는 이로부터 유래된 펩타이드의 효력을 향상시킨다.
통상의 기술자는 용어 "CTP 펩타이드", "카복시 말단 펩타이드" 및 "CTP 서열"이 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 카복시 말단 펩타이드는 전장 CTP이다. 또 다른 실시형태에서, 카복시 말단 펩타이드는 절단된 CTP이다.
통상의 기술자는 용어 "신호 서열" 및 "신호 펩타이드"가 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또한, 통상의 기술자는 폴리뉴클레오타이드와 관련되는 경우 용어 "서열"이 폴리뉴클레오타이드 서열의 코딩부를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
통상의 기술자는 용어 "폴리펩타이드", "펩타이드", "관심 펩타이드", "관심 폴리펩타이드" 및 "관심 폴리펩타이드 서열"이 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 관심 펩타이드는 전장 단백질이다. 또 다른 실시형태에서, 관심 펩타이드는 성장 호르몬이다. 또 다른 실시형태에서, 관심 펩타이드는 인간 성장 호르몬이다. 또 다른 실시형태에서, 관심 펩타이드는 인간 성장 호르몬의 단백질 단편이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 성장 호르몬, 인간 성장 호르몬(hGH)의 아미노 말단에 부착된 단일 인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP), 및 GH의 카복시 말단에 부착된 2개의 인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP)로 이루어진 폴리펩타이드가 개시되어 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않고, 상기 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 서열번호 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 GH, GH의 아미노 말단에 부착된 단일 CTP, GH의 카복시 말단에 부착된 2개의 CTP 및 아미노 말단 CTP의 아미노 말단에 부착된 신호 펩타이드로 이루어진 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드가 개시되어 있고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다. 통상의 기술자는 성숙한 분비된 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않는 것을 인지할 것이다
일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 융모성 고나도트로핀 카복시-말단 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드(CTP-변형된 hGH)의 제조 방법이 개시되어 있고, 그 방법은 (a) 미리 결정된 수의 세포를 상기 CTP-변형된 hGH를 코딩하는 코딩부를 포함하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시키는 단계이되, 여기서 상기 형질감염된 세포는 상기 CTP-변형된 hGH를 발현 및 분비하는, 형질감염시키는 단계; (b) 상기 CTP-변형된 hGH를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; (c) 상기 클론을 용액 중에서 미리 결정된 규모로 확장시키는 단계; (d) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; (e) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 (f) 상기 정화된 수확 용액을 정제하여 목적하는 농도의 CTP-변형된 hGH를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하는 단계를 포함하고, 이에 의해서 인간 융모성 고나도트로핀 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드를 제조하고, 여기서 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같다.
또 다른 실시형태에서, 제조 방법은 서열번호 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는 CTP-변형된 hGH를 발현 및 분비하는 클론을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 증가된 글리코실화 함량을 갖는 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 제조 방법이 개시되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 제조된 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 증가된 수의 글리코실화된 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는다. 통상의 기술자는 구 "증가된 수의 글리코실화된 O-연결된 글리코실화 부위"가 또한 "증가된 O-글리칸 점유"로서 표현될 수 있다는 것을 인지할 것이다.
인간 융모성 고나도트로핀 펩타이드(CTP)-변형된 폴리펩타이드
일 실시형태에서, 본 명세서에는 장기간-작용성 GH 폴리펩타이드 및 이의 생산 또는 제조 방법 및 사용 방법이 개시되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 장기간-작용성 폴리펩타이드는 인간 융모성 고나도트로핀(hCG)의 카복시 말단 펩타이드(CTP)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP는 단백질 또는 이로부터 유래된 펩타이드의 분해에 대한 보호제로서 작용한다. 또 다른 실시형태에서, CTP는 단백질 또는 이로부터 유래된 펩타이드의 순환성 반감기를 연장시킨다. 일부 실시형태에서, CTP는 단백질 또는 이로부터 유래된 펩타이드의 효력을 향상시킨다.
통상의 기술자는 용어 "CTP 펩타이드", "CTP", "인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드", "카복시 말단 펩타이드" 및 "CTP 서열"이 본 명세서에서 상호 교환 가능하게 사용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 카복시 말단 펩타이드는 전장 CTP이다. 또 다른 실시형태에서, 카복시 말단 펩타이드는 절단된 CTP이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 GH, GH의 아미노 말단에 부착된 단일 CTP, GH의 카복시 말단에 부착된 2개의 CTP, 및 N-말단 CTP의 아미노 말단에 부착된 신호 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드가 개시되어 있고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 통상의 기술자는 성숙한, 분비된 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않을 수 있다는 것을 인지할 것이다. 따라서, 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 폴리펩타이드는 GH, GH의 아미노 말단에 부착된 단일 CTP, GH의 카복시 말단에 부착된 2개의 CTP로 이루어지고, 신호 펩타이드가 없는 폴리펩타이드가 개시되어 있고, 상기 폴리펩타이드 서열번호 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 GH, GH의 아미노 말단에 부착된 단일 CTP, GH의 카복시 말단에 부착된 2개의 CTP, 및 아미노 말단 CTP의 아미노 말단에 부착된 신호 펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드로 이루어진 폴리펩타이드의 제조 방법이 개시되어 있고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 4에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 GH, GH의 아미노 말단에 부착된 단일 CTP, GH의 카복시 말단에 부착된 2개의 CTP로 이루어지고, 신호 펩타이드가 없는 폴리펩타이드의 제조 방법이 개시되어 있고, 상기 폴리펩타이드는 서열번호 7에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 서열번호 7에 기재된 바와 같은 CTP를 포함하는 GH는 CTP가 없는 동일한 GH에 비해서 향상된 생체내 생물학적 활성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 대상체는 인간 대상체이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 애완동물(pet)이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 포유동물이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 가축이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 개이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 고양이이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 원숭이이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 말이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 암소이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 마우스이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 래트이다. 일 실시형태에서, 대상체는 수컷이다. 또 다른 실시형태에서, 대상체는 암컷이다.
일 실시형태에서, 카복시-말단 펩타이드(CTP) 서열은 서열번호 1: DPRFQDSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILQ(서열번호 1)에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 폴리펩타이드의 아미노 말단 단부 및 폴리펩타이드의 카복시 말단 단부 둘 모두에서 CTP 서열은 단백질의 분해에 대해서 향상된 보호를 제공한다. 일부 실시형태에서, 폴리펩타이드의 아미노 말단 단부 및 폴리펩타이드의 카복시 말단 단부 둘 모두에서 CTP 서열은 부착된 단백질에 연장된 반감기를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 폴리펩타이드의 분해에 대해서 향상된 보호를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 부착된 단백질에 대해서 연장된 반감기를 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 hGH의 향상된 활성을 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 연장된 클리어런스 시간을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 hGH의 향상된 C최대값를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 hGH의 향상된 T최대값를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 hGH의 향상된 T1/ 2을 갖는다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 hGH의 연장된 반감기를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 카복시 말단 펩타이드(CTP) 펩타이드는 서열번호 1에 기재된 바와 같은, 인간 융모성 고나도트로핀의 아미노산 112 내지 위치 145의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 서열번호 2: SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ에 기재된 바와 같은, 인간 융모성 고나도트로핀의 아미노산 118 내지 위치 145의 아미노산 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP 서열은 또한 위치 112 내지 118 중 임의의 위치로부터 시작하고, 인간 융모성 고나도트로핀의 위치 145에서 종결된다. 일부 실시형태에서, CTP 서열 펩타이드는 28, 29, 30, 31, 32, 33 또는 34개의 아미노산 길이이고, CTP 아미노산 서열의 위치 112, 113, 114, 115, 116, 117 또는 118에서 시작한다.
또 다른 실시형태에서, CTP 펩타이드는 미국 특허 5,712,122에 기술된 바와 같이 1 내지 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해서 네이티브(native) CTP와 상이한 융모성 고나도트로핀 CTP의 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 펩타이드는 1개의 보존적 아미노산 치환에 의해서 네이티브 CTP와 상이한 융모성 고나도트로핀 CTP의 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 펩타이드는 2개의 보존적 아미노산 치환에 의해서 네이티브 CTP와 상이한 융모성 고나도트로핀 CTP의 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 펩타이드는 3개의 보존적 아미노산 치환에 의해서 네이티브 CTP와 상이한 융모성 고나도트로핀 CTP의 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 펩타이드는 4개의 보존적 아미노산 치환에 의해서 네이티브 CTP와 상이한 융모성 고나도트로핀 CTP의 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 펩타이드는 5개의 보존적 아미노산 치환에 의해서 네이티브 CTP와 상이한 융모성 고나도트로핀 CTP의 변이체이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 네이티브 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 70% 상동적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 네이티브 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 80% 상동적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 네이티브 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 90% 상동적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 아미노산 서열은 네이티브 CTP 아미노산 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 95% 상동적이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 DNA 서열은 네이티브 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 70% 상동적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 DNA 서열은 네이티브 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 80% 상동적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 DNA 서열은 네이티브 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 90% 상동적이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 펩타이드 DNA 서열은 네이티브 CTP DNA 서열 또는 이의 펩타이드에 대해서 적어도 95% 상동적이다.
일 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 적어도 하나는 절단된다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 둘 모두는 절단된다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 2개는 절단된다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 2개 이상은 절단된다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 전부는 절단된다. 일 실시형태에서, 절단된 CTP는 서열번호 3:SSSSKAPPPSLP의 제1의 10개의 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 절단된 CTP는 서열번호 3의 제1의 11개의 아미노산을 포함한다. 일 실시형태에서, 절단된 CTP는 서열번호 3의 아미노산을 포함한다.
일 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 적어도 하나는 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 둘 모두는 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 2개는 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 2개 이상은 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 전부는 글리코실화되어 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 적어도 하나의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 2개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 3개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 4개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 5개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 6개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 7개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 서열은 8개의 글리코실화 부위를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화 부위는 O-글리코실화 부위이다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화는 세린 잔기에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화는 트레오닌 잔기에 존재한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP)-변형된 폴리펩타이드를 제조하고, 상기 CTP-변형된 폴리펩타이드는 고도로 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 CTP-변형된 인간 성장 호르몬(CTP-hGH)을 제조하고, 여기서 상기 CTP-변형된 hGH는 고도로 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 CTP-변형된 hGH를 제조하고, 여기서 상기 CTP-변형된 hGH는 고도로 시알릴화되어 있다. 시알릴화는, 시알릴화가 더 높을수록, 반감기가 더 연장될 수 있기 때문에 중요하다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 CTP-변형된 hGH를 제조하고, 여기서 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 적어도 하나는 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 둘 모두는 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 2개는 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 CTP-변형된 hGH를 제조하고, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 3개는 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 3개 이상은 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 융모성 고나도트로핀 CTP 아미노산 서열 중 전부는 글리코실화되어 있다.
일 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 적어도 하나의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 적어도 2개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 적어도 3개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 4개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 적어도 5개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 적어도 6개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 적어도 7개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 각각의 CTP 서열은 적어도 8개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화 부위는 O-글리코실화 부위이다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화는 세린 잔기에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화는 트레오닌 잔기에 존재한다.
일 실시형태에서, 제조된 서열번호 7의 CTP-변형된 hGH가 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 CTP, 및 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 CTP로 이루어진 경우, CTP-변형된 hGH는 12 내지 18개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 12 내지 21개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 12 내지 24개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 13 내지 18, 14 내지 18, 15 내지 18, 16 내지 18, 17 내지 18, 13 내지 21, 14 내지 21, 15 내지 21, 16 내지 21, 17 내지 21, 18 내지 21, 19 내지 21, 20 내지 21, 13 내지 24, 14 내지 24, 15 내지 24, 16 내지 24, 17 내지 24, 18 내지 24, 19 내지 24, 20 내지 24, 21 내지 24, 22 내지 24, 또는 23 내지 24개가 존재한다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 12개의 글리코실화 부위에서, 13개의 글리코실화 부위에서, 14개의 글리코실화 부위에서, 15개의 글리코실화 부위에서, 16개의 글리코실화 부위에서, 17개의 글리코실화 부위에서, 18개의 글리코실화 부위에서, 19개의 글리코실화 부위에서, 20개의 글리코실화 부위에서, 21개의 글리코실화 부위에서, 21개의 글리코실화 부위에서, 22개의 글리코실화 부위에서, 23개의 글리코실화 부위에서, 또는 24개의 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함한다. 각각의 가능성은 별개의 실시형태를 대표한다.
또 다른 실시형태에서, 실시형태, CTP-변형된 hGH의 아미노산 서열이 서열번호 7에 기재된 바와 같은 경우, O-연결된 글리코실화는 각각의 CTP 단위 내에 존재하는 사용 가능한 세린(S) 잔기에서 일어난다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP는 4 내지 6개의 O-연결된 글리칸을 함유하고, 여기서 글리코실화는 각각의 CTP 단위 내에 존재하는 세린(S) 잔기에 대한 것이다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 12 내지 18개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 12 내지 21개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 12 내지 24개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 12개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 13개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 14개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 15개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 16개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 17개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 18개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 19개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 20개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 21개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 22개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 23개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP 단위의 세린(S) 잔기에서의 O-연결된 글리코실화는 24개의 O-연결된 당쇄를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH의 hGH 서열(서열번호 8) 상에는 O-연결된 당쇄가 존재하지 않는다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 CTP 당 적어도 4개의 O-글리칸 점유부를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 CTP 당 적어도 5개의 O-글리칸 점유부를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 CTP 당 적어도 6개의 O-글리칸 점유부를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 CTP 당 적어도 7개의 O-글리칸 점유부를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 CTP 당 적어도 8개의 O-글리칸 점유부를 포함한다. 통상의 기술자는 O-글리칸 점유부가 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 내에 포함된 CTP 당 상이할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-hGH-CTP-CTP 폴리펩타이드는 4개 초과의 O-글리칸 점유부를 포함하는 적어도 하나의 CTP를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-hGH-CTP-CTP 폴리펩타이드는 5개 초과의 O-글리칸 점유부를 포함하는 적어도 하나의 CTP를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-hGH-CTP-CTP 폴리펩타이드는 6개 초과의 O-글리칸 점유부를 포함하는 적어도 하나의 CTP를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-hGH-CTP-CTP 폴리펩타이드는 7개 초과의 O-글리칸 점유부를 포함하는 적어도 하나의 CTP를 포함한다.
통상의 기술자는 용어 "상동성"이 결손, 삽입, 또는 치환 변이체(이의 아미노산 치환 및 이의 생물학적 활성 폴리펩타이드 단편 포함)를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일 실시형태에서 치환 변이체는 hGH의 위치 65에서의 글루타민이 발린에 의해서 치환된 것이다[Gellerfors et al., J Pharm Biomed Anal 1989, 7:173-83].
일 실시형태에서, "펩타이드" 또는 "펩타이드 단편"은 복수의 아미노산이 펩타이드 결합에 의해서 연결된 화합물을 포함한다. 본 명세서에서, 비-아미노산이 함유된 경우, 비-아미노산과 인접한 아미노산 사이의 결합이 펩타이드 결합이 아닌 경우가 존재한다. 그러나, 이러한 경우에 화합물을 또한 총괄하여 펩타이드 또는 펩타이드 단편으로서 칭한다.
통상의 기술자는 용어 "보호된 펩타이드 단편"이 펩타이드 단편의 제조 또는 펩타이드 단편의 축합 반응 시에 바람직하지 않은 부 반응을 유발할 수 있는, 펩타이드 단편의 아미노산 또는 비-아미노산의 측쇄의 하이드록시기, 아미노기, 구아니디노기, 이미다졸릴기, 인돌릴기, 머캅토기 및 카복실기로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 반응성 치환기가 보호기로 보호된 펩타이드의 단편을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 이하에서, 그것은 본 명세서에서 "보호된 펩타이드 단편"으로서 약칭된다.
일부 실시형태에서, 인간 성장 호르몬(hGH)은 본 명세서에 개시된 교시에 따라서 사용된다. 일부 실시형태에서, hGH 단백질의 아미노 말단 및 카복시 말단 둘 모두에 대한 CTP 서열(들)의 부착이 증가된 효력을 유발한다. 일부 실시형태에서, hGH 단백질의 아미노 말단 및 카복시 말단 둘 모두에 대한 CTP 서열(들)의 부착이 연장된 생체내 활성을 유발한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 전구체 폴리펩타이드는 서열번호 4에 기재된 바와 같다.
서열번호 4:
MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSASSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ.
통상의 기술자는 구 "인간 성장 호르몬"(hGH)이 hGH 활성(즉, 성장의 자극)을 나타내는, 예컨대 젠뱅크 기탁 번호(Genbank Accession No.) P01241(서열번호 5)에 기재된 바와 같은 신호 펩타이드를 포함하는 전구체 폴리펩타이드를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 서열번호 5: MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSAFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 성숙한 hGH는 서열번호 8:
FPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGF에 기재된 바와 같은 아미노산 서열을 갖는다.
통상의 기술자는 본 명세서에 개시된 "hGH"가 상동체를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성의 GH 아미노산 서열은 디폴트 파라미터를 사용하여 국립 생물기술 정보 센터(National Center of Biotechnology Information: NCBI)의 블라스트(Blast)P 소프트웨어를 사용하여 결정된 바와 같은 본 명세서에 기재된 바와 같은 hGH 서열에 적어도 50% 상동적이다. 또 다른 실시형태에서, % 상동성은 60%이다. 또 다른 실시형태에서, % 상동성은 70%이다. 또 다른 실시형태에서, % 상동성은 80%이다. 또 다른 실시형태에서, % 상동성은 90%이다. 또 다른 실시형태에서, % 상동성은 적어도 95%이다. 또 다른 실시형태에서, % 상동성은 95% 초과이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 발현 및 분비에 이어서, 신호 펩타이드가 전구체 단백질로부터 절단되어 성숙한 단백질을 생성한다. 예를 들어, 서열번호 4에서, 아미노산 1 내지 26, MATGSRTSLLLAFGLLCLPWLQEGSA(서열번호 6)이 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 신호 펩타이드를 나타내고, 아미노산 SSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQFPTIPLSRLFDNAMLRAHRLHQLAFDTYQEFEEAYIPKEQKYSFLQNPQTSLCFSESIPTPSNREETQQKSNLELLRISLLLIQSWLEPVQFLRSVFANSLVYGASDSNVYDLLKDLEEGIQTLMGRLEDGSPRTGQIFKQTYSKFDTNSHNDDALLKNYGLLYCFRKDMDKVETFLRIVQCRSVEGSCGFSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQSSSSKAPPPSLPSPSRLPGPSDTPILPQ(서열번호 7)이 신호 펩타이드가 존재하지 않는 성숙한 조작된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드(MOD-4023)를 나타낸다. 일 실시형태에서, 신호 펩타이드가 없는 CTP-변형된 hGH의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 신호 펩타이드는 서열번호 6에 기재된 바와 같다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 7에 기재된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 서열의 아미노산 29 내지 219가 hGH를 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 서열번호 7에 기재된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 서열의 아미노산 1 내지 28, 220 내지 247, 및 248 내지 275은 CTP-변형된 hGH의 CTP 단위 각각, 즉 hGH에 대한 하나의 N-말단 및 hGH에 대한 2개의 C-말단을 나타낸다.
일 실시형태에서, MOD-4023(서열번호 7)은 2개의 다이설파이드(S-S) 다리를 포함하고, 여기서 S-S 다리 둘 모두는 hGH 분자 내에 존재한다. 또 다른 실시형태에서, 하나의 다이설파이드 다리는 서열번호 7의 시스테인 잔기 81과 시스테인 잔기 193 사이에 존재하고, 제2 다이설파이드 다리는 서열번호 7의 시스테인 잔기 210과 시스테인 잔기 217 사이에 존재한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 근육 성장을 자극하기 위해서 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드를 제공한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제조 방법은 신호 펩타이드가 존재하지 않는 본 명세서에 개시된 성숙한 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 생산한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제조 방법은 서열번호 7에 기재된 바와 같은 성숙한 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 아미노산 서열을 생산한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 근육 성장을 자극하기 위해서 서열번호 7에 기재된 바와 같은 CTP-변형된 hGH폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열의 사용을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 N-말단 상에 하나의 CTP 아미노산 펩타이드를 갖고, C-말단 상에 2개의 CTP 아미노산 펩타이드를 갖는 hGH 펩타이드를 코딩하는 서열번호 9에 기재된 바와 같은 핵산의 사용을 포함한다. 서열번호 9: ATGGCCACCGGCAGCAGGACCAGCCTGCTGCTGGCCTTCGGCCTGCTGTGCCTGCCATGGCTGCAGGAGGGCAGCGCCAGCTCTTCTTCTAAGGCTCCACCCCCATCTCTGCCCAGCCCCAGCAGACTGCCGGGCCCCAGCGACACACCCATTCTGCCCCAGTTCCCCACCATCCCCCTGAGCAGGCTGTTCGACAACGCCATGCTGAGGGCTCACAGGCTGCACCAGCTGGCCTTTGACACCTACCAGGAGTTCGAGGAAGCCTACATCCCCAAGGAGCAGAAGTACAGCTTCCTGCAGAACCCCCAGACCTCCCTGTGCTTCAGCGAGAGCATCCCCACCCCCAGCAACAGAGAGGAGACCCAGCAGAAGAGCAACCTGGAGCTGCTGAGGATCTCCCTGCTGCTGATCCAGAGCTGGCTGGAGCCCGTGCAGTTCCTGAGAAGCGTGTTCGCCAACAGCCTGGTGTACGGCGCCAGCGACAGCAACGTGTACGACCTGCTGAAGGACCTGGAGGAGGGCATCCAGACCCTGATGGGCCGGCTGGAGGACGGCAGCCCCAGGACCGGCCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACACCAACAGCCACAACGACGACGCCCTGCTGAAGAACTACGGGCTGCTGTACTGCTTCAGAAAGGACATGGACAAGGTGGAGACCTTCCTGAGGATCGTGCAGTGCAGAAGCGTGGAGGGCAGCTGCGGCTTCAGCTCCAGCAGCAAGGCCCCTCCCCCGAGCCTGCCCTCCCCAAGCAGGCTGCCTGGGCCCTCCGACACACCAATCCTGCCACAGAGCAGCTCCTCTAAGGCCCCTCCTCCATCCCTGCCATCCCCCTCCCGGCTGCCTGGCCCCTCTGACACCCCTATCCTGCCTCAG.
일 실시형태에서, 방법은 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 코딩하는 코딩부를 포함하는 핵산 서열의 사용을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 서열번호 9에 기재된 바와 같은 핵산 서열의 사용을 포함한다. 통상의 기술자는 핵산 서열이 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 코딩하는 코딩부를 포함하는 발현 벡터의 일부일 수 있다는 것을 인지할 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 본 명세서에 참고로 포함된 미국 특허 8,946,155에 제공된 바와 같은 다수의 적응증에서의 치료 용도를 위해서 CTP-변형된 hGH 펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다. 더욱이, 그러한 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 미국 특허 출원 공개 US-2014-0113860 내지 A1, 미국 특허 8,450,269, 및 미국 특허 8,304,386에 널리 기술되어 있고, 이들 전부는 이의 전문이 본 명세서에 포함된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 폴리펩타이드가 가용성 형태로 존재할 것이 요구되는 요법에서 사용된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 예컨대 표준 고체 상 기술을 사용하여 생화학적으로 합성된다. 일부 실시형태에서, 이러한 생화학적 제조 방법은 완전 고체상 합성법(exclusive solid phase synthesis), 부분 고체상 합성법, 단편 축합, 또는 전통적인 용액 합성법을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이러한 방법은 폴리펩타이드가 비교적 짧고(약 5 내지 15kDa)/짧거나 그것이 재조합 기술에 의해서 제조될 수 없는 경우(즉, 핵산 서열에 의해서 코딩되지 않음) 사용되며, 따라서 상이한 화학을 포함한다.
일부 실시형태에서, 고체상 폴리펩타이드 합성법 절차는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 문헌[John Morrow Stewart and Janis Dillaha Young, Solid Phase Polypeptide Syntheses(2nd Ed., Pierce Chemical Company, 1984)]에 추가로 기술되어 있다. 일부 실시형태에서, 합성 폴리펩타이드는 정제용 고성능 액체 크로마토그래피에 의해서 정제되고[Creighton T. (1983) Proteins, structures and molecular principles. WH Freeman and Co. N.Y.], 이의 조성은 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 방법에 의한 아미노산 시퀀싱을 통해서 확인될 수 있다.
일부 실시형태에서, 재조합 단백질 기술을 사용하여 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 생성한다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질 기술은 비교적 긴 폴리펩타이드(예를 들어, 18 내지 25개의 아미노산보다 더 긴 것)의 생성을 위해서 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 단백질 기술은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 다량의 생성을 위해서 사용된다. 일부 실시형태에서, 재조합 기술은 문헌[Bitter et al., (1987) Methods in Enzymol. 153:516-544], [Studier et al. (1990) Methods in Enzymol. 185:60-89], [Brisson et al. (1984) Nature 310:511-514], [Takamatsu et al. (1987) EMBO J. 6:307-311], [Coruzzi et al. (1984) EMBO J. 3:1671-1680] 및 [Brogli et al, (1984) Science 224:838-843], [Gurley et al. (1986) Mol. Cell. Biol. 6:559-565] 및 [Weissbach & Weissbach, 1988, Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp 421-463]에 기술되어 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드를 사용하여 합성된다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 시스-조절 서열(예를 들어, 프로모터 서열)의 전사 제어를 포함하는, 발현 벡터로 결찰된다. 일부 실시형태에서, 시스-조절 서열은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 구성적 발현을 유도하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 시스-조절 서열은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 조직 특이적인 발현을 유도하기에 적합하다. 일부 실시형태에서, 시스-조절 서열은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 유도성 발현을 유도하기에 적합하다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 발현하는 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 9에 기재된 바와 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드 서열과 함께 사용하기에 적합한 조직-특이적인 프로모터는 특이적인 세포 집단에서 기능성인 서열을 포함하고, 예는 프로모터, 예컨대 간 특이적인 알부민[Pinkert et al., (1987) Genes Dev. 1:268-277], 림프구 특이적인 프로모터[Calame et al., (1988) Adv. Immunol. 43:235-275]; 특히 T-세포 수용체의 프로모터[Winoto et al., (1989) EMBO J. 8:729-733] 및 면역글로불린; [Banerji et al. (1983) Cell 33729-740], 신경-특이적인 프로모터, 예컨대 신경필라멘트 프로모터[Byrne et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:5473-5477], 췌장-특이적인 프로모터[Edlunch et al. (1985) Science 230:912-916] 또는 유샘-특이적인 프로모터, 예컨대 유청(milk whey) 프로모터(미국 특허 4,873,316 및 유럽 특허 출원 공개 264,166)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 본 명세서에 개시된 방법에서 사용하기에 적합한 유도성 프로모터는 예를 들어, 테트라사이클린-유도성 프로모터를 포함한다(Srour, M.A., et al., 2003. Thromb. Haemost. 90: 398-405).
통상의 기술자는 구 "폴리뉴클레오타이드"가 RNA 서열, 상보적 폴리뉴클레오타이드 서열(cDNA), 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열 및/또는 복합 폴리뉴클레오타이드 서열(예를 들어, 상기의 것의 조합)의 형태로 단리 및 제공된 단일 또는 이중 가닥 표준 핵산 서열을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
통상의 기술자는 구 "상보적 폴리뉴클레오타이드 서열"이 역전사효소 또는 임의의 다른 RNA 의존성 DNA 중합효소를 사용하는 메신저 RNA의 역전사로부터 생성된 서열을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 이어서, 서열은 DNA 중합효소를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 증폭될 수 있다.
통상의 기술자는 "게놈 폴리뉴클레오타이드 서열"이 염색체로부터 유래된(단리된) 서열을 포함할 수 있고, 따라서 그것은 염색체의 연속적인 부분을 나타낸다는 것을 인지할 것이다.
통상의 기술자는 "복합 폴리뉴클레오타이드 서열"이 적어도 부분적으로 상보적이고 적어도 부분적으로 게놈성인 서열을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 복합 서열은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 코딩하기 위해서 필요한 일부 엑손 서열, 뿐만 아니라 그들 사이에 삽입된 일부 인트론 서열을 포함할 수 있다. 일 실시형태에서, 인트론 서열은 다른 유전자를 비롯한 임의의 기원으로부터 유래할 수 있고, 전형적으로는 보존된 스플라이싱 신호 서열을 포함할 것이다. 일 실시형태에서, 인트론 서열은 시스 작용 발현 조절 요소를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 분비를 위한 신호 펩타이드를 코딩하는 신호 서열을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 신호 서열은 서열번호 6에 기재된 바와 같은 hGH를 위한 내인성 신호 서열을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에서, 신호 서열은 CTP 서열에 대해서 N-말단에 있고, CTP 서열은 결국 관심 폴리펩타이드 서열에 대해서 N-말단이고; 예를 들어 서열은 (a) 신호 서열- (b) CTP-(c) 관심 서열- (d) 임의로 1개 이상의 추가적인 CTP 서열이다. 또 다른 실시형태에서, 1개 이상의 CTP 서열이 관심 폴리펩타이드 서열의 신호 서열과 관심 폴리펩타이드 서열 자체 사이에 삽입되어, 관심 야생형 서열을 중단시킨다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드 및 이의 제조 방법은 서열번호 7에 기재된 바와 같은 신호 펩타이드가 존재하지 않는 성숙한 CTP-변형된 GH를 제공한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드는 PCR 기술, 또는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 다른 방법 또는 절차를 사용하여 제조된다. 일부 실시형태에서, 절차는 2개의 상이한 DNA 서열의 레게이션(legation)을 포함한다(예를 들어, 문헌["Current Protocols in Molecular Biology", eds. Ausubel et al., John Wiley & Sons, 1992] 참고).
생물학적 활성 및 용도
일 실시형태에서, 본 명세서에는 대상체에게 치료 유효량의 hGH, 상기 GH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP), 및 상기 GH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 CTP로 이루어진 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 GH의 투여 빈도를 감소시키는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않고, 여기서 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같고, 이에 의해서 대상체에서 GH의 투여 빈도를 감소시킨다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 대상체에게 치료 유효량의 hGH, 상기 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP), 및 상기 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 CTP로 이루어진 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 GH의 곡선 아래 면적(area under the curve: AUC)를 개선시키는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않고, 여기서 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같고, 이에 의해서 GH의 곡선 아래 면적(AUC)을 개선시킨다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 GH 요법이 필요한 대상체에게 치료 유효량의 hGH, 상기 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP), 및 상기 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 CTP로 이루어진 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, GH 요법이 필요한 상기 대상체를 치료하는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않고, 여기서 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같고, 이에 의해서 GH 요법이 필요한 상기 대상체를 치료한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 대상체에게 치료 유효량의 hGH, 상기 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP), 및 상기 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 CTP로 이루어진 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1) 수준을 증가시키는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않고, 여기서 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같고, 이에 의해서 대상체에서 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1) 수준을 증가시킨다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 대상체에게 치료 유효량의 hGH, 상기 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP), 및 상기 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 CTP로 이루어진 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1) 수준을 유지시키는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않고, 여기서 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같고, 이에 의해서 대상체에서 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1) 수준을 유지시킨다. 또 다른 실시형태에서, IGF-I 수준은 본 명세서에 추가로 개시된 바와 같이, 규정된 범위에서 유지된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 대상체에게 치료 유효량의 hGH, 상기 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP), 및 상기 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 CTP로 이루어진 폴리펩타이드를 투여하는 단계를 포함하는, 상기 대상체에서 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1) 수준을 규정된 범위 내에서 증가 및 유지시키는 방법이 개시되어 있고, 여기서 상기 폴리펩타이드는 신호 펩타이드가 존재하지 않고, 여기서 상기 폴리펩타이드의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같고, 이에 의해서 대상체에서 인슐린-유사 성장 인자(IGF-1) 수준을 규정된 범위 내에서 증가 및 유지시킨다.
또 다른 실시형태에서, 규정된 범위는 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 투여함으로써 성취되는 치료 용량 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 규정된 범위는 IGF-I의 사인파형 거동의 C최대값 및 C최저값이 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH의 연속적인 투여 이후에 유지되는 것이다. 또 다른 실시형태에서, 규정된 범위는 대상체에서 우수한 반응성을 갖는 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 연속적으로 투여하기 위한 치료 용량 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 규정된 범위는 정상이라고 간주되는 개인에서의 IGF-I 수준의 범위에 대등하다. 또 다른 실시형태에서, 규정된 범위는 정상 개체에서의 IGF-I 수준/값의 정상 범위이다. 또 다른 추가 실시형태에서, 규정된 범위는 IGF-I SDS 값이 ±2 SDS 이내인 경우 정상 범위 이내이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 뼈 성장을 자극하기 위한, 본 명세서에 기술된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 뼈 성장을 자극하기 위한, 본 명세서에 기술된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드를 코딩하는 핵산 서열을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH는 비변형된 GH와 동일한 방식으로 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH는 생체내에서 증가된 순환성 반감기 및 혈장 체류 시간, 감소된 클리어런스, 및 증가된 임상 활성을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 CTP-변형된 hGH의 개선된 특성으로 인해서, 이러한 컨주게이트는 비변형된 GH보다 덜 빈번하게 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 CTP-변형된 GH는 1주일에 1회 내지 2주일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 CTP-변형된 GH는 2주일에 1회 내지 3주일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 CTP-변형된 GH는 하루에 1회 내지 1주일에 3회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 감소된 투여 빈도는 개선된 환자 준수를 유발할 것이고, 이것은 개선된 치료 결과, 뿐만 아니라 환자의 개선된 생활의 질로 이어진다. 또 다른 실시형태에서, 폴리(에틸렌 글리콜)에 연결된 종래의 GH의 컨주게이트에 비해서, 본 명세서에 개시된 컨주게이트의 분자량 및 연결부 구조를 갖는 GH는 개선된 효력, 개선된 안정성, 상승된 AUC 수준, 향상된 순환성 반감기를 갖는 것을 발견하였다. 또 다른 실시형태에서, 폴리(에틸렌 글리콜)에 연결된 GH의 종래의 컨주게이트에 비해서, 본 명세서에 개시된 컨주게이트의 분자량 및 연결부 구조를 갖는 GH CTP 컨주게이트는 개선된 효력, 개선된 안정성, 상승된 AUC 수준, 향상된 순환성 반감기를 갖는 것을 발견하였다. 또 다른 실시형태에서, 치료 유효량의 CTP-변형된 hGH는 생체내에서 측정 가능한 예상되는 생물학적 활성을 위해서 필요한 컨주게이트의 양이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 교시에 따라서 사용되는 GH는 증가된 효력을 나타낸다. 일부 실시형태에서, GH의 아미노 말단 및 카복시 말단 둘 모두에 대한 CTP 서열의 부착은 연장된 생체내 활성을 유발한다.
또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 치료 유효량은 치료될 병태의 실제 유형, 치료될 환자의 상태, 뿐만 아니라 조성물의 다른 성분으로서의 인자에 따라서 결정된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 치료 유효량은 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 0.01 내지 10㎍이다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 치료 유효량은 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 0.1 내지 1㎍이다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 치료 유효량은 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 1㎍ 내지 체중 kg 당 1㎎이다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 치료 유효량은 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 1㎎이다. 또 다른 실시형태에서, 성인 성장 호르몬 결핍 환자에 대한 치료 유효량은 CTP-변형된 hGH 1주일에 1회 투여되는, 1㎎ 내지 15㎎인 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 성인 성장 호르몬 결핍 환자에 대한 치료 유효량은 CTP-변형된 hGH가 1주일에 1회 투여되는, 1㎎ 초과인 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 성장 호르몬 소아 결핍 환자에 대한 치료 유효량은 CTP-변형된 hGH가 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 1㎍ 내지 1㎎/kg 체중 범위인 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 성장 호르몬 결핍 소아 환자에 대한 치료 유효량은 CTP-변형된 hGH가 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 600㎍ 이하인 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 성장 호르몬 결핍 소아 환자에 대한 치료 유효량은 CTP-변형된 hGH가 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 700㎍ 이하인 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 성장 호르몬 결핍 소아 환자에 대한 치료 유효량은 CTP-변형된 hGH가 1주일에 1회 투여되는, 체중 kg 당 600㎍ 내지 체중 kg 당 700㎍인 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH를 포함하는 약제학적 조성물은 인간 환자에게 다양한 수단에 의해서 투여하기에 유효한 농도로 제형화된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법, 폴리뉴클레오타이드, 및 폴리펩타이드는 수의과 의약에서 사용된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 동반자(개, 고양이, 말)로서 사육되거나, 현저한 상업적인 가치를 갖거나(예를 들어, 젖소, 육우, 경주 동물), 현저한 과학적 가치를 갖거나(예를 들어, 멸종 위기에 처한 종의 포획 또는 야생 표본), 또는 다른 가치를 갖는 사육되는 포유동물의 치료가 개시되어 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드, 또는 폴리뉴클레오타이드는 동물(예를 들어, 마우스, 래트, 토끼, 햄스터, 기니아 피그, 돼지, 마이크로-돼지, 닭, 낙타, 염소, 말, 암소, 양, 개, 고양이, 비-인간 영장류 및 인간)에게 투여된다. 일 실시형태에서, 언급된 응용은 다양한 숙주에서 용도를 갖는다. 일부 실시형태에서, 그러한 숙주는 인간, 뮤린, 토끼, 염소, 기니아 피그, 낙타, 말, 마우스, 래트, 햄스터, 돼지, 마이크로-돼지, 닭, 염소, 암소, 양, 개, 고양이, 또는 비-인간 영장류를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 가축이 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 치료된다. 일 실시형태에서, 가축은 돼지, 소, 젖소, 말, 염소, 양, 닭, 칠면조, 거위, 오리 및 관련 종을 포함한다. 일 실시형태에서, 실험 동물이 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 치료된다. 일 실시형태에서, 실험 동물은 래트, 마우스, 기니아 피그, 토끼, 염소, 원숭이, 개, 고양이 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 동물원 동물이 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 치료된다. 일 실시형태에서, 동물원 동물은 동물원에서 사육되는 모든 척추 동물을 포함한다. 일 실시형태에서, 수생 동물(aquatic animal)이 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 치료된다. 일 실시형태에서, 수생 동물은 물고기, 뱀장어, 거북이, 물개, 펭귄, 상어, 고래 및 관련 종을 포함한다. 일 실시형태에서, 사육 동물이 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 치료된다. 일 실시형태에서, 사육 동물은 임의의 애완동물, 예컨대 고양이 및 개, 또는 인간에 의해서 사육되는 동물, 예를 들어, 말, 소, 돼지, 염소, 토끼, 닭, 칠면조, 거위, 오리 등을 포함한다.
통상의 기술자는 용어 "돼지"는 돼지, 새끼 돼지, 식용 돼지, 어린 암퇘지, 거세한 수퇘지, 성숙한 수퇘지 및 성숙한 암퇘지를 포함한다는 것을 인지할 것이다. 유사한 방식에서, 통상의 기술자는 용어 "소"가 송아지, 암소, 젖소, 출산 경험이 없는 암소, 거세된 수소 및 성숙한 수소를 포함한다는 것을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, CTP 서열 변형은 더 낮은 투여량이 사용되는 것을 허용하기에 이롭다.
제조
일 실시형태에서, 본 명세서에는 인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드의 제조 방법이 개시되어 있고, 그 방법은 (a) 미리 결정된 수의 세포를 상기 CTP-변형된 (hGH)를 코딩하는 코딩부를 포함하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시키는 단계이되, 여기서 상기 형질감염된 세포는 상기 CTP-변형된 hGH를 발현 및 분비하는, 형질감염시키는 단계; (b) 상기 CTP-변형된 hGH를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계; (c) 상기 클론을 용액 중에서 미리 결정된 규모로 확장시키는 단계; (d) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 수확하는 단계; (e) 상기 클론을 함유하는 상기 용액을 여과하여 정화된 수확 용액을 수득하는 단계; 및 (f) 상기 정화된 수확 용액을 정제하여 목적하는 농도의 CTP-변형된 hGH를 갖는 정제된 단백질 용액을 수득하는 단계를 포함하고, 여기서 제조물인 CTP-변형된 hGH의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같고, 이에 의해서 인간 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드(CTP)-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드를 제조한다. 대안적인 실시형태에서, 단계 (e)에서, 세포 및 잔해(debris)는 원심 분리에 의해서 제거된다. CTP-변형된 hGH의 제조에서, 형질감염이 초기 단계이다. 또 다른 실시형태에서, 제조 방법은 상기 CTP-변형된 hGH를 발현 및 분비하는 클론을 포함한다. 최종적인 고발현 클론이 선택되면, 각각의 생산은 제조용 세포 은행(WCB)의 해동, 확장, 수확 및 정제를 포함한다. (실시예 참고: 수확을 통한 클론 확장을 기술하는 도 3의 단계 1 내지 8; 정제를 기술하는 도 4의 단계 8 내지 16). 대안적인 실시형태에서, 최종적인 고발현 클론이 선택되면, 각각의 생산은 마스터 세포 은행(MCB)의 해동, 확장, 수확 및 정제를 포함한다. (실시예 참고: 수확을 통한 클론 확장을 기술하는 도 3의 단계 1 내지 8; 정제를 기술하는 도 4의 단계 8 내지 16).
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 발현 벡터(즉, 핵산 구축물) 내로 삽입하여 재조합 폴리펩타이드의 발현을 가능하게 한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터가 원핵생물에서 복제 및 통합되는 것을 적합하게 하는 추가적인 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터가 진핵생물에서 복제 및 통합되는 것을 적합하게 하는 추가적인 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 발현 벡터는 이러한 벡터가 원색생물 및 진핵생물 둘 모두에서 복제 및 통합되는 것을 적합하게 하는 셔틀 벡터를 포함한다. 일부 실시형태에서, 클로닝 벡터는 전사 개시 서열 및 번역 개시 서열(예를 들어, 프로모터, 인핸서) 및 전사 종결 인자 및 번역 종결 인자(예를 들어, 폴리아데닐화 신호)를 포함한다.
일 실시형태에서, CTP-변형된 폴리펩타이드, 예를 들어, CTP-변형된 hGH의 제조 방법은 발현 벡터의 사용을 포함하는 단계를 포함하고, 여기서 상기 발현 벡터는 프로모터, CTP-변형된 폴리펩타이드를 위한 코딩 서열, 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 코딩 서열은 서열번호 9에 기재된 바와 같다. 또 다른 실시형태에서 폴리아데닐화 서열은 유인원 바이러스(SV) 40 폴리아데닐화 서열이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 발현하기 위해서 다양한 진핵 생물 세포가 숙주-발현계로서 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 이들은 미생물; 예컨대 폴리펩타이드 코딩 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 재조합 바이러스 발현 벡터(예를 들어, 콜리플라워 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나, 재조합 플라스미드 발현 벡터, 예컨대 폴리펩타이드 코딩 서열을 함유하는 Ti 플라스미드로 형질전환된 식물 세포계를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 발현하기 위해서 비-박테리아 발현계가 사용된다(예를 들어 포유동물 발현계, 예컨대 CHO 세포 또는 CHO 세포로부터 유래된 세포). 일 실시형태에서, 포유동물 세포에서 본 명세서에 개시된 폴리뉴클레오타이드를 발현하는 데 사용되는 발현 벡터는 CMV 프로모터 및 네오마이신 저항성 유전자를 포함하는 pCI-DHFR 벡터이다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 접착성 세포 배양액으로서 성장된다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 현탁 배양액으로서 성장된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 발현 벡터는 예를 들어, 단일 mRNA, 예컨대, 내부 리보좀 진입 부위(IRES)로부터 몇몇 단백질의 번역을 허용하는 추가적인 폴리뉴클레오타이드 서열 및 프로모터-키메릭 폴리펩타이드의 게놈 통합을 위한 서열을 추가로 포함한다.
일부 실시형태에서, 포유동물 발현 벡터는 인비트로젠(Invitrogen)으로부터 입수 가능한 pcDNA3, pcDNA3.1(+/-), pGL3, pZeoSV2(+/-), pSecTag2, pDisplay, pEF/myc/cyto, pCMV/myc/cyto, pCR3.1, pSinRep5, DH26S, DHBB, pNMT1, pNMT41, pNMT81, 프로메가(Promega)로부터 입수 가능한 pCI, 스트라테젠(Strategene)으로부터 입수 가능한 pMbac, pPbac, pBK-RSV 및 pBK-CMV, 클론테크(Clontech)로부터 입수 가능한 pTRES, 및 이의 유도체를 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다.
일부 실시형태에서, 진핵성 바이러스, 예컨대 레트로바이러스로부터의 조절 요소를 함유하는 발현 벡터가 본 명세서에 개시된 벡터에서 발견될 수 있다. SV40 벡터는 pSVT7 및 pMT2를 포함한다. 일부 실시형태에서, 소 파필로마 바이러스로부터 유래된 벡터는 pBV-1MTHA를 포함하고, 엡스타인 바 바이러스로부터 유래된 벡터는 pHEBO, 및 p2O5를 포함한다. 다른 예시적인 벡터는 pMSG, pAV009/A+, pMTO10/A+, pMAMneo-5, 바큘로바이러스 pDSVE, 및 SV-40 초기 프로모터, SV-40 후기 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 뮤린 유선 종양 프로모터, 라우스 육종 바이러스 프로모터, 폴리헤드린 프로모터, 또는 진핵 세포에서의 발현에 효과적인 것으로 나타난 다른 프로모터의 지시하에 단백질의 발현을 허용하는 임의의 다른 벡터를 포함한다.
일 실시형태에서, 다양한 방법이 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 코딩하는 발현 벡터를 세포 내로 도입하는 데 사용될 수 있다. 진핵 숙주 세포의 폴리뉴클레오타이드 또는 발현 벡터 내로의 "형질감염"(이것은 유전적으로 변형되거나 유전자이식된 세포를 생성함)은 관련 기술 분야에 널리 공지된 임의의 방법에 의해서 수행될 수 있고, 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Springs Harbor Laboratory, New York (1989, 1992)], [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley and Sons, Baltimore, Md. (1989)], [Chang et al., Somatic Gene Therapy, CRC Press, Ann Arbor, Mich. (1995)], [Vega et al., Gene Targeting, CRC Press, Ann Arbor Mich. (1995)], [Vectors: A Survey of Molecular Cloning Vectors and Their Uses, Butterworths, Boston Mass. (1988)] 및 [Gilboa et at. [Biotechniques 4 (6): 504-512, 1986]]에 기술되어 있고, 예를 들어 안정한 또는 일시적인 형질감염법 및 전기천공법을 포함한다. 또한 양성-음성 선택 방법에 대해서는 미국 특허 5,464,764 및 5,487,992를 참고하기 바란다. 형질감염 방법은 리포좀-매개 형질 감염법, 인산 칼슘 공동-침전법, 전기천공법, 폴리양이온법(polycation)(예컨대 DEAE-덱스트란)-매개 형질감염법, 프로토플라스트 융합법, 바이러스 감염법(재조합 바이러스 감염법 포함) 및 마이크로주사법을 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 형질감염은 안정한 형질감염이다. 특별한 숙주 세포계(cell line) 및 유형에서 본 명세서에 개시된 관심 펩타이드를 코딩하는 이종 유전자의 최적의 형질감염 빈도, 및 발현을 제공하는 형질감염 방법이 선호된다. 적합한 방법은 일상적인 절차에 의해서 결정될 수 있다. 안정한 형질감염체를 위해서, 숙주 세포 내에 안정하게 유지되도록 구축물은 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체-미니 염색체 내로 통합되거나 에피솜에 의해서 위치된다.
달리 지시되지 않는 한, 본 명세서에 개시된 방법은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 기술 범위인 세포 생물학, 분자 생물학, 세포 배양학, 면역학 등의 종래의 기술을 사용할 것이다. 이러한 기술은 현재 문헌에 완전하게 개시되어 있다. 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y. (1989)]; [Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology (1987, 개정판)]; [Brown ed., Essential Molecular Biology, IRL Press (1991)]; [Goeddel ed., Gene Expression Technology, Academic Press (1991)]; [Bothwell et al. eds., Methods for Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes, Bartlett Publ. (1990)]; [Wu et al, eds., Recombinant DNA Methodology, Academic Press (1989)]; [Kriegler, Gene Transfer and Expression, Stockton Press (1990)]; [McPherson et al., PCR: A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1991)]; [Gait ed., Oligonucleotide Synthesis (1984)]; [Miller & Calos eds., Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (1987)]; [Butler ed., Mammalian Cell Biotechnology (1991)]; [Pollard et al., eds., Animal Cell Culture, Humana Press (1990)]; [Freshney et al., eds., Culture of Animal Cells, Alan R. Liss (1987)]; [Studzinski, ed., Cell Growth and Apoptosis, A Practical Approach, IRL Press at Oxford University Press (1995)]; [Melamed et al., eds., Flow Cytometry and Sorting, Wiley-Liss (1990)]; [Current Protocols in Cytometry, John Wiley & Sons, Inc. (개정판)]; [Wirth & Hauser, Genetic Engineering of Animals Cells, in: Biotechnology Vol. 2, Piihler ed., VCH, Weinheim 663-744]; 연속 간행물 [Methods of Enzymology (Academic Press, Inc.)], 및 문헌 [Harlow et al., eds., Antibodies: A Laboratory Manual (1987)]을 참고하기 바란다.
본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 코딩하는 관심 이종 유전자는 다양한 방법, 예를 들어 바이러스 형질전환, 형질감염 또는 마이크로주사에 의해서 본 명세서에 개시된 세포 내에 도입될 수 있다. 관심 이종 유전자는 선형 DNA로서 또는 발현 벡터의 일부로서 세포 내에 도입될 수 있다. 다중 클로닝 부위가 하나 이상의 이종 유전자의 삽입 및 이의 발현을 허용하는 다수의 진핵성 발현 벡터가 공지되어 있다. 상업적인 공급원은 다른 것 중에서, 미국 캘리포니아주 라호야 소재의 스트라타겐(Stratagen); 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재의 인비트로젠; 미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가, 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재의 비디 바이오 사이언시스 클론테크(BD Biosciences Clontech)와 같은 회사를 포함한다. 세포를 하나 이상의 관심 유전자에 대해서 코딩하는 발현 벡터 또는 DNA로 형질감염시키는 것은 예를 들어, 문헌[Sambrook et al., 1989] 또는 [Ausubel et al., 1994]에 기술된 바와 같은 종래의 방법에 의해서 수행된다. 적합한 형질감염 방법은 예를 들어 리포좀-매개 형질감염법, 인산 칼슘 공동-침전법, 전기천공법, 폴리양이온법(예컨대 DEAE-덱스트란)-매개 형질감염법, 프로토플라스트 융합법, 마이크로주사법 및 바이러스 감염법을 포함한다. 바람직하게는, DNA 분자가 숙주 세포의 게놈 또는 인공 염색체/미니염색체 내로 통합되거나, 또는 숙주 세포에서 안정한 방식으로 에피솜에 의해서 함유되는 안정한 형질감염이 수행된다. 최적의 형질감염 빈도 및 해당 숙주 세포에서 하나 이상의 관심 이종 유전자의 발현을 제공하는 형질감염 방법이 바람직하다. 일 실시형태에서, 관심 유전자는 본 명세서에 개시된 바와 같은 CTP-변형된 GH를 코딩한다.
일부 실시형태에서, 바이러스 감염에 의해서 핵산을 도입하는 것은 다른 방법, 예컨대 리포펙션 및 전기천공법에 비해서 몇몇 이점을 제공하는데, 그 이유는 더 높은 형질감염 효율이 바이러스의 감염성 본성으로 인해서 얻어질 수 있기 때문이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 또한 상기 본 명세서에 기술된 임의의 적합한 투여 모드(즉, 생체내 유전자 요법)를 사용하여 개체에게 투여되는 핵산 구축물로부터 발현될 수 있다는 것이 인지될 것이다. 일 실시형태에서, 핵산 구축물은 적절한 유전자 전달 비히클/방법(형질감염, 형질도입, 상동적 재조합 등) 및 필요에 따라서 발현계를 통해서 적합한 세포 내로 도입되고, 이어서 변형된 세포는 배양액 중에서 확장되고, 개체에게 재도입된다(즉, 생체외 유전자 요법).
관심 이종 유전자는 통상적으로 관심 유전자의 전사를 가능하게 하는 프로모터, 및 관심 유전자의 전사 및 번역(발현)을 가능하게 하거나 이의 효능을 증가시키는 다른 조절 요소에 기능적으로 연결된다.
통상의 기술자는 용어 "프로모터"가 유전자 또는 그것에 기능적으로 연결된 서열의 전사를 가능하게 하고, 제어하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 프로모터는 RNA 중합효소를 결합하기 위한 인식 서열 및 전사를 위한 개시 부위(전사 개시 부위)를 함유한다. 특정 세포 유형 또는 숙주 세포에서 목적하는 서열을 발현하기 위해서, 적합한 기능성 프로모터가 선택되어야 한다. 통상의 기술자는 다양한 공급원으로부터의 다양한 프로모터(구성적 프로모터, 유도성 프로모터 및 억제성 프로모터)에 친숙할 것이다. 예를 들어, 그것은 데이터은행, 예컨대 젠뱅크에 기탁되어 있고, 상업적인 공급원 또는 개인 공급원으로부터의 폴리뉴클레오타이드 서열 내에 클로닝된 개별 요소 또는 요소들로서 수득될 수 있다. 유도성 프로모터에서 프로모터의 활성은 신호에 대한 반응으로 감소되거나 증가될 수 있다. 유도성 프로모터의 한 예는 테트라사이클린(tet) 프로모터이다. 이것은 테트라사이클린-조절 트랜스작용인자 단백질(tTA)에 의해서 유도될 수 있는 테트라사이클린 작동인자 서열(tetO)을 함유한다. 테트라사이클린의 존재하에서, tetO에 대한 tTA의 결합이 억제된다. 다른 유도성 프로모터의 예는 jun, fos, 메탈로티오네인 및 열 충격 프로모터이다(또한 문헌[Sambrook, J., Fritsch, E. F. & Maniatis, T., Molecular Cloning: A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989]; [Gossen, M. et al, Curr Opi Biotech 1994, 5, 516-520] 참고). 진핵 생물에서 높은 발현에 특히 적합한 프로모터 중에는, 예를 들어 햄스터의 유비퀴틴/S27a 프로모터(WO 97/15664), SV 40 조기 프로모터, 아데노바이러스 주 후기 프로모터, 마우스 메탈로티오네인-1 프로모터, 라우스 육종 바이러스의 긴 말단 반복 영역 및 인간 거대세포바이러스의 조기 프로모터가 있다. 다른 이종 포유동물 프로모터의 예는 액틴, 면역글로불린 또는 열 충격 프로모터(들)이다.
예를 들어, 프로모터는 전사 활성을 증가시키기 위해서 인핸서 서열에 기능적으로 연결될 수 있다. 이를 위해서, 하나 이상의 인핸서 및/또는 인핸서 서열의 몇몇 복사체, 예를 들어 CMV 또는 SV40 인핸서가 사용될 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 전사 활성을 증가시키기 위해서 인핸서 서열에 기능적으로 연결될 수 있다. 이를 위해서, 하나 이상의 인핸서 및/또는 인핸서의 몇몇 복사체, 예를 들어 CMV 또는 SV40 인핸서가 사용될 수 있다.
통상의 기술자는 용어 "인핸서"가 시스 위치에서 프로모터의 활성에 작용하여 이러한 프로모터에 기능적으로 연결된 유전자의 전사를 자극하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 나타낸다는 것을 인식할 것이다. 프로모터와 달리, 인핸서의 효과는 위치 및 배향에 독립적이고, 따라서 그것은 인트론 내에서, 또는 심지어는 코딩 영역 내에서 전사 단위 앞에 또는 뒤에 위치될 수 있다. 인핸서는 전사 단위에 바로 인접하게 그리고 프로모터로부터 상당한 거리에 위치될 수 있다. 프로모터와 물리적이고 기능적인 중첩부를 갖는 것이 또한 가능하다. 통상의 기술자는 다양한 공급원으로부터의 다수의 인핸서(데이터은행, 예컨대 젠뱅크, 예를 들어 SV40 인핸서, CMV 인핸서, 폴리오마 인핸서, 아데노바이러스 인핸서)를 인지할 것이고, 이것은 폴리뉴클레오타이드 서열 내에서 클로닝된 독립적인 요소 또는 요소들(예를 들어 ATCC에 기탁되거나 상업적인 공급원 및 개인 공급원으로부터)로서 입수 가능하다. 다수의 프로모터 서열은 또한 인핸서 서열, 예컨대 빈번하게 사용되는 CMV 프로모터를 함유한다. 인간 CMV 인핸서는 지금까지 확인된 가장 강한 인핸서 중 하나이다. 유도성 인핸서의 일례는 메탈로티오네인 인핸서인데, 이것은 글루코코르티코이드 또는 중금속에 의해서 자극될 수 있다.
기본적으로, 조절 요소는 프로모터, 인핸서, 종결 및 폴리아데닐화 신호 및 다른 발현 제어 요소를 포함한다. 유도성 조절 서열 및 및 구조적 조절 서열 둘 모두는 다양한 세포 유형에 대해서 공지되어 있다. "전사-조절 유소"는 일반적으로 발현될 유전자 서열의 상류에 프로모터, 전자 개시 부위 및 종결 부위 및 폴리아데닐화 신호를 포함한다.
통상의 기술자는 용어 "전사 개시 부위"가 1차 전사물, 즉 mRNA 전구체에 혼입된 제1 핵산에 상응하는 구축물 내의 핵산을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다 . 전사 개시 부위는 또한 프로모터 서열과 중첩될 수 있다.
통상의 기술자는 용어 "전사 종결 부위"가 일반적으로 관심 유전자 또는 전사될 유전자 부분의 3' 단부에 존재하고, RNA 중합효소에 의해서 전사의 종결을 초래하는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
통상의 기술자는 용어 "폴리아데닐화 신호"가 진핵성 mRNA 의 3' 단부에서의 특이적인 부위에서 절단을 유발하고, 절단된 3'-단부에서 약 100 내지 200개의 아데닌 뉴클레오타이드(폴리A 테일)의 서열의 전사후 혼입을 유발하는 신호 서열을 포함한다는 것을 인지할 것이다. 폴리아데닐화 신호는 절단 부위의 상류에서 서열 AATAAA 약 10 내지 30개의 뉴클레오타이드를 포함하고 하류에 위치된 서열을 포함한다. 다양한 폴리아데닐화 요소, 예컨대 tk 폴리A, SV40 후기 및 조기 폴리A 또는 BGH 폴리A(예를 들어 미국 특허 5,122,458에 기술된 바와 같음)가 공지되어 있다.
통상의 기술자는 용어 "번역 조절 요소"가 발현될 각각의 폴리펩타이드에 대한 번역 개시 부위(AUG), 중단 코돈 및 폴리A 신호를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 최적의 발현을 위해서, 전사 또는 발현 수준에서 발현에 영향을 미칠 수 있는 임의의 잠재적으로 적합하지 않은 추가 번역 개시 코돈 또는 다른 서열을 제거하기 위해서, 발현하고자 하는 핵산 서열의 5'- 및/또는 3'-미번역 영역을 제거, 부가 또는 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 발현을 촉진시키기 위해서, 리보솜 합의(consensus) 결합 부위는 대안적으로는 출발 코돈의 상류에서 즉시 삽입될 수 있다. 분비된 폴리펩타이드를 생산하기 위해서, 관심 유전자는 통상적으로 합성된 폴리펩타이드를 ER 막으로 그것을 통해서 이송시키는 신호 전구체 펩타이드에 대해서 코딩하는 신호 서열을 함유한다. 신호 서열은 항상은 아니지만 종종 분비된 단백질의 아미노 말단에 위치되고, 단백질이 ER 막을 통해서 여과된 후 신호 펩티다제에 의해서 절단된다. 유전자 서열은 필수적이지는 않지만 종종 그 자신의 신호 서열을 함유할 것이다. 네이티브 신호 서열이 존재하지 않으면, 이종 신호 서열은 공지된 방식으로 도입될 수 있다. 이러한 부류의 다수의 신호 서열은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 서열 데이터은행, 예컨대 젠뱅크 및 EMBL에 기탁되어 있다.
통상의 기술자는 용어 "폴리펩타이드들", "폴리펩타이드" 또는 이의 문법적인 등가물이 아미노산 서열 또는 단백질에 대해서 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 중합체를 포함한다는 것을 인지할 것이다. 이 용어는 또한 반응, 예컨대 글리코실화, 포스포릴화, 아세틸화 또는 단백질 가공에 의해서 번역 후에 변형된 단백질을 포함한다. 폴리펩타이드의 구조는 이의 생물학적 활성을 보유하면서, 예를 들어, 아미노산의 치환, 결손 또는 삽입 및 다른 단백질과의 융합에 의해서 변형될 수 있다.
세포에서 하나 이상의 관심 유전자 생산물을 생산하기 위해서, 세포는 관심 유전자의 발현을 허용하는 조건하에서 무혈청 배양 배지 및 현탁 배양액 중에서 성장될 수 있다. 예를 들어, 관심 유전자가 구성적 프로모터의 제어하에 있으면, 특별한 인듀서를 첨가할 필요가 없다. 관심 유전자의 발현이 유도성 프로모터의 제어 하에 있으면, 예를 들어, 상응하는 인듀서가 충분하지만, 유독하지 않은 농도로 세포 배양 배지에 첨가되어야 한다. 세포는 바람직한 경우 다양한 하위경로 통과에 의해서 확장되고, 적합한 세포 배양 용기로 전달될 수 있다. 유전자 생산물(들)은 세포 생산물, 막-결합 생산물 또는 분비 생산물로 존재하거나 또는 제조된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH의 제조 단계는 미리 결정된 수의 세포를 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 코딩하는 코딩부를 포함하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시키는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 코딩부의 뉴클레오타이드 서열은 서열번호 9에 기재된 바와 같다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 제조 단계는 세포를 상기 CTP-변형된 hGH를 코딩하는 코딩부를 포함하는 발현 벡터로 안정하게 형질감염시키는 단계를 포함한다. 일 실시형태에서, 세포는 CHO 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 DG44 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 CTP-변형된 hGH의 발현 및 분비에 적합한 관련 기술 분야에 공지된 임의의 세포이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 벡터는 pCI-dhfr-MOD-23 발현 벡터이다(도 2). 또 다른 실시형태에서, 형질감염된 세포는 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 발현한다. 또 다른 실시형태에서, 제조 및 발현된 CTP-변형된 hGH는 상기 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드, 및 상기 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드로 이루어지고, 여기서 성숙전 CTP-변형된 hGH의 아미노산 서열은 서열번호 4에 기재된 바와 같다. 또 다른 실시형태에서, 제조, 발현 및 분비되는 성숙한 CTP-변형된 hGH는 상기 hGH의 카복시 말단에 부착된 2개의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드, 및 상기 hGH의 아미노 말단에 부착된 하나의 융모성 고나도트로핀 카복시 말단 펩타이드로 이루어지고, 여기서 발현 및 분비된 성숙한 CTP-변형된 hGH의 아미노산 서열은 서열번호 7에 기재된 바와 같다. 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 발현은 높은 발현 수준이다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH는 고도로 글리코실화되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 상기 CTP-변형된 hGH는 고도로 시알릴화되어 있다. 상기에 상술된 바와 같이, CTP-변형된 hGH는 상이한 글리코실화 함량 및 패턴을 가질 수 있다. 본 명세서에 개시된 방법에 의해서 제조된 CTP-변형된 hGH는 상기에 개시된 바와 같은 글리코실화 패턴 및 함량 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일반적으로, 본 명세서에 존재하는 제조 방법은 높은 글리코실화 함량 및 높은 백분율의 글리코실화된 글리코실화 자리를 갖는 CTP-변형된 hGH를 제공한다.
일 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 제조 단계는 CTP-변형된 hGH를 발현하는 세포 클론을 수득하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 발현은 최적이다. 일 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 200㎎/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 300㎎/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 400㎎/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 500㎎/L 이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 600㎎/L 이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 700㎎/L 이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 800㎎/L 이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 900㎎/L 이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 1gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 1.2gm/L 이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 1.4gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 1.6gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 1.8gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 2gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 2.2gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 2.4gm/L 이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 2.6gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 2.8gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 발현 수준은 적어도 3gm/L이다. 또 다른 실시형태에서, 단계 (b)에서 클론은 배지 중에서 번식되어 마스터 세포 은행(MCB) 및 제조용 세포 은행(WCB)을 형성한다. 일 실시형태에서, 단계 (c)에서의 클론은 MCB로부터 수득된다. 또 다른 실시형태에서, 단계 (c)에서의 클론은 WCB로부터 수득된다.
본 명세서에는 개시된 성숙한 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 생산물은 분비된 유전자 생산물로서 세포 배양 배지로부터 수득된다. 통상의 기술자는 분비된 유전자 생산물은 전장 번역 생산물 중에 포함되고, 핵산 서열로 코팅되는 신호 펩타이드가 존재하지 않을 것이라는 것을 인식할 것이다. 그러나, 단백질 또는 폴리펩타이드가 분비 신호 없이 발현되는 경우, 유전자 생산물은 또한 세포 용해물로부터 단리될 수 있다. 다른 재조합 단백질 및 숙주 세포 단백질이 실질적으로 존재하지 않는 순수한 균질한 생산물을 수득하기 위해서, 종래의 정제 절차가 수행된다. 먼저, 세포 및 세포 잔해를 세포 배지 또는 용해물로부터 자주 제거한다. 이어서, 목적하는 유전자 생산물을 예를 들어, 면역친화도 및 이온 교환 칼럼 상에서의 분별, 에탄올 침전, 역상 HPLC 또는 세파덱스(Sephadex), 수산화인회석, 실리카, 양이온 교환 수지 예컨대 DEAE 상에서의 크로마토그래피에 의해서 가용성 단백질, 폴리펩타이드 및 핵산으로부터 제거한다(본 명세서 실시예 참고). 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 재조합 숙주 세포에 의해서 발현된 이종 단백질의 정제를 유발하는 방법은 통상의 기술자에게 공지되어 있고, 문헌, 예를 들어 해리스(Harris) 등의 문헌(Harris et al., Protein Purification: A Practical Approach, Pickwood and Hames, eds., IRL Press, Oxford, 1995) 및 스콥스(Scopes)의 문헌(Scopes, R., Protein Purification, Springer Verlag, 1988)에 기술되어 있다. 이러한 방법은 본 명세서에 개시된 방법에서 전체적으로 또는 부분적으로 사용될 수 있다. 본 명세서에 제공된 방법론을 기반으로, 통상의 기술자는 관련 기술 분야의 요구 및 지식을 기초로 하는 특정 크로마토그래피 방법론의 사용을 인지할 것이고, 그것을 개작 및 변형할 수 있을 것이다. 예를 들어, 통상의 기술자는 DEAE 칼럼을 대신하여 대안적인 양이온 교환 칼럼을 선택할 수 있고, 여기서 양이온 교환에 의한 분리 목적이 유지될 것이다. 분별, 면역친화도, 단백질 침전, 핵산 침전, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 또는 세파덱스, 수산화인회석, 실리카, 음이온 교환 또는 양이온 교환 수지 상에서의 크로마토그래피에 대한 관련 기술 분야에 공지된 유사한 대안은 통상의 기술자에게 인식될 것이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 (i) 포유동물 세포가 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드에 대해서 코딩하는 유전자를 함유하고; (ii) 포유동물 세포가 포유동물 세포의 복제를 가능하게 하는 무-혈청 조건하에서 성장되고; (iii) 각각의 경우에 이들 포유동물 세포(들) 중 적어도 하나(1)가 무-혈청 조건하에서 세포 배양 용기에 침착되고; (iv) 적합하게 침착된 포유동물 세포가 무-혈청 조건하에서 복제되고; (v) 복제된 세포가 유전자가 발현되고 CTP-변형된 hGH가 분비되는 무-혈청 조건하에서 배양되고; (vi) 이어서 유전자 생산물이 배양 상청액으로부터 단리되고, 정제되는 것(본 명세서 실시예 참고)을 특징으로 하는, 무-혈청 조건하에서 포유동물 세포에서 하나 이상의 생산물을 제조하는 방법이 개시되어 있다. 또 다른 실시형태에서, 제조 방법은 상기 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드를 발현 및 분비하는 클론을 포함한다. 이러한 공정의 또 다른 실시형태에서, 포유동물 세포는 관심 유전자가 도입된 형질감염된 포유동물 세포이다. 따라서, 본 명세서에 개시된 재조합 유전자 생산물의 제조 방법은 상기에 기술된 공정의 단계 (i) 이전에 포유동물 세포가 관심 유전자에 대해서 적어도 코딩하는 핵산으로 형질감염된 것을 특징으로 할 수 있다. 상응하는 포유동물 세포의 안정한 형질감염이 바람직하다.
무-혈청, 무-단백질 또는 화학적으로 규정된 배지의 예는 예를 들어, 상업적으로 입수 가능한 배지, 함(Ham) F12(시그마(Sigma), 미국 델라웨어주 데이센호펜 소재), RPMI 1640(시그마), 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle's medium: DMEM; 시그마), 최소 필수 배지(Minimal Essential medium: MEM; 시그마), 이스코브 변형된 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's medium: IMDM; 시그마), CDCHO(인비트로젠, 미국 캘리포니아주 칼스배드 소재), CHO-S-SFMII(인비트로젠), 무-혈청 CHO 배지(시그마), CD-파워(Power)CHO2 배지(론자(Lonza)) 및 무-단백질 CHO 배지(시그마)를 포함한다. 이들 배지 각각에는 바람직한 경우 다양한 화합물, 예컨대 호르몬 및/또는 다른 성장 인자(예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 표피 성장 인자, 인슐린-유사 성장 인자), 염(예를 들어, 염화나트륨, 칼슘, 마그네슘, 인산염), 완충제(예를 들어 HEPES), 뉴클레오사이드(예를 들어 아데노신, 티미딘), 글루타민, 글루코스 또는 다른 동등한 영양분, 항생제 및/또는 미량 요소 또는 상업적으로 입수가능한 공급물, 예컨대 파워 피드(Power Feed) A(론자) 또는 셀 부스트(Cell Boost) 6(하이클론(Hyclone))이 보충될 수 있다. 복제 가능한 세포가 하나 이상의 선택 가능한 마커를 발현하는 재조합 세포인 경우, 하나 이상의 적합한 선택제, 예컨대 항생제가 또한 배지에 첨가될 수 있다.
삽입된 코딩 서열(폴리펩타이드를 코딩함)의 전사 및 번역에 필요한 요소를 함유하는 것 이외에, 본 명세서에 개시된 발현 구축물은 또한 안정성, 생산, 정제, 수율 또는 발현된 폴리펩타이드의 활성을 최적화하도록 조작된 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 형질전환된 세포는 많은 양의 재조합 폴리펩타이드의 발현을 허용하는 효과적인 조건하에서 배양된다. 일부 실시형태에서, 효과적인 배양 조건은 단백질 생산을 허용하는 효과적인 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건을 포함하지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 실시형태에서, 효과적인 배지는 세포가 본 명세서에 개시된 재조합 폴리펩타이드를 생산하도록 배양되는 임의의 배지를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 배지는 전형적으로 동화 가능 탄소, 질소 및 인산염 공급원, 및 적절한 염, 광물, 금속 및 다른 영양분, 예컨대 비타민을 갖는 수용액을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포는 종래의 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험 튜브, 마이크로타이터 디쉬 및 페트리 플레이트에서 배양될 수 있다. 일부 실시형태에서, 배양은 재조합 세포에 적절한 온도, pH, 및 산소 함량에서 수행된다. 일부 실시형태에서, 배양 조건은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 지식 범위에 포함된다.
일 실시형태에서, 배양 조건은 약 20 내지 80%의 용존 산소(DO) 함량을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, DO 함량은 약 20 내지 30%이다. 또 다른 실시형태에서, DO 함량은 약 30 내지 40%이다. 또 다른 실시형태에서, DO 함량은 약 40 내지 50%이다. 또 다른 실시형태에서, DO 함량은 약 50 내지 60%이다. 또 다른 실시형태에서, DO 함량은 약 60 내지 70%이다. 또 다른 실시형태에서, DO 함량은 약 70 내지 80%이다.
일 실시형태에서, 배양 조건은 제조 동안 한 온도에서 출발하여 또 다른 것으로 이동하는 pH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, pH는 생물반응기 인큐베이션 동안 약 7.3에서 출발하여 약 6.7로 이동한다. 또 다른 실시형태에서, pH는 생물반응기 인큐베이션 동안 약 7.3, 약 7.2 또는 약 7.1에서 출발하여 약 6.7, 약 6.8, 약 6.9 또는 약 7.0으로 이동한다. 각각의 가능성은 본 명세서에 개시된 실시형태를 대표한다.
일부 실시형태에서, 제조에 사용된 벡터 및 숙주계에 따라서, 본 명세서에 개시된 생성된 폴리펩타이드는 재조합 세포 내에 남아있거나, 배지로 분비된다.
일 실시형태에서, 배양액 중에서의 소정의 시간 이후에, 재조합 폴리펩타이드의 회수가 진행된다.
통상의 기술자는 구 "재조합 폴리펩타이드를 회수하는"은 폴리펩타이드를 함유하는 전체 배지를 수집하는 것을 포함할 수 있고, 분리 또는 정제의 추가적인 단계를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 예컨대 친화도 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 수산화인회석 크로마토그래피, 크로마토 초점 맞춤(chromatofocusing) 및 차동 가용화(differential solubilization)에 제한되지 않는 다양한 표준 단백질 정제 기술을 사용하에 정제된다.
일 실시형태에서, 각각의 칼럼은 제어되는 온도 또는 제어되지 않는 온도 하에서 작동된다.
일 실시형태에서, 회수를 용이하게 하기 위해서, 발현된 코딩 서열은 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드를 코딩하고, 절단 가능한 모이어티에 융합되도록 조작될 수 있다. 일 실시형태에서, 융합 단백질은 폴리펩타이드가 친화도 크로마토그래피; 예를 들어 절단 가능한 모이어티에 특이적인 칼럼 상에서의 부동화에 의해서 쉽게 단리될 수 있도록 설계된다. 일 실시형태에서, 절단 부위는 폴리펩타이드와 절단 가능한 모이어티 사이에서 조작되고, 폴리펩타이드는 적절한 효소 또는 이러한 부위에서 융합 단백질을 특이적으로 절단하는 작용제로의 처리에 의해서 크로마토그래피 칼럼으로부터 방출될 수 있다[예를 들어, 문헌[Booth et al., Immunol. Lett. 19:65-70 (1988)]; 및 [Gardella et al., J. Biol. Chem. 265:15854-15859 (1990)] 참고].
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 "실질적으로 순수한" 형태로 리트리빙(retrieving)된다.
통상의 기술자는 구 "실질적으로 순수한"은 본 명세서에 기술된 응용에 있어서 단백질을 효과적으로 사용할 수 있도록 하는 순도를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러한 형태는 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 고도로 글리코실화된 형태 및 고도로 시알릴화된 형태를 또한 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 시험관내 발현 시스템을 사용하여 합성될 수 있다. 일 실시형태에서, 시험관내 합성 방법은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있고, 시스템의 성분은 구매 가능하다.
일 실시형태에서, 재조합 DNA 기술을 사용한 CTP에 의해서 변형된 GH의 생산이 수행된다.
일부 실시형태에서, 재조합 폴리펩타이드가 합성 및 정제되고, 이의 치료 효능은 생체내 또는 시험관내에서 검정될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP에 의해서 변형된 재조합 GH의 결합 활성은 다양한 검정법을 사용하여 확인될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH의 제조 방법은 상기 WCB로부터 상기 CTP-변형된 hGH를 최적으로 발현 및 분비하는 클론을 수득하고, 상기 클론을 확장시키기 위한 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 제조 방법은 상기 MCB로부터 상기 CTP-변형된 hGH를 최적으로 발현하는 클론을 수득하고, 상기 클론을 확장시키기 위한 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 제조 방법은 상기 CTP-변형된 hGH를 최적으로 발현 및 분비하는 클론을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 세포 클론은 용액 중에서 일련의 계대-배양 단계를 통해서 생산 생물반응기 수준까지 확장된다. 또 다른 실시형태에서, 상기 계대-배양된 클론을 함유하는 용액이 생물반응기에서 시딩된다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 일회용 생물반응기이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 스테인리스강 생물반응기, 로킹 모션(rocking motion) 생물반응기, 예컨대 GE로부터의 웨이브 시스템(Wave system), 관류 생물반응기, 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 생물반응기 시스템을 포함한다. 일 실시형태에서, 생물반응기로부터의 세포의 제거는 일회용 필터 시스템을 사용함으로써 달성된다. 큰 규모 제조가 수행되는 경우, 필터링 시스템을 사용하기 전에 연속적인 원심분리가 사용될 수 있다.
일 실시형태에서, 세포 클론은 목적하는 규모에 도달할 때까지 생물반응기의 크기를 증가시키면서 상기 세포를 순차적으로 배양함으로써 추가로 확장되거나 규모 확대된다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 회분식 모드(fed-batch mode)로 작동된다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 배취 모드로 작동된다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 반복되는-배취 모드로 작동된다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 관류 모드로 작동된다. 상기에 기술된 각각의 가능성은 또다른 실시형태이다.
최대 생 세포(viable cell) 밀도는 사용된 생물반응기의 유형에 따라서 상이하다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제조 방법에서 사용된 생물반응기의 최대 생 세포 밀도는 약 0.2 x 106 내지 1.4 x 106세포/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제조 방법에서 사용된 생물반응기의 최대 생 세포 밀도는 약 0.05 x 106 내지 100 x 106이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기의 최대 생 세포 밀도는 약 0.05 x 106 내지 0.5 x 106이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기의 최대 생 세포 밀도는 약 0.5 x 106 내지 5 x 106이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기의 최대 생 세포 밀도는 약 5.0 x 106 내지 50 x 106이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기의 최대 생 세포 밀도는 약 50 x 106 내지 100 x 106이다. 각각의 가능성은 본 명세서에 개시된 별개의 실시형태를 대표한다.
생물반응기 사용에 대한 공급 스킴은 상이할 수 있고, 예를 들어 특정 날짜로부터 매일 공급을 반복하거나, 또는 몇몇 날짜에 고정될 수 있고, 또한 첨가되는 공급물의 백분율은 수% 내지 심지어는 50% 이상까지 상이할 수 있다. 각각의 가능성은 본 명세서에 개시된 실시형태이다.
관련 기술 분야에 공지된 바와 같이 DMSO가 상이한 농도로 생물반응기에 첨가될 수 있다. 일 실시형태에서, 0.1 내지 3%의 DMSO가 이의 사용 동안 생물반응기에 첨가된다. 또 다른 실시형태에서, 0.1 내지 0.5%의 DMSO가 첨가된다. 또 다른 실시형태에서, 0.5 내지 1.0%의 DMSO가 첨가된다. 또 다른 실시형태에서, 1.0 내지 1.5% DMSO가 첨가된다. 또 다른 실시형태에서, 1.5 내지 2.0%의 DMSO가 첨가된다. 또 다른 실시형태에서, 2.0 내지 2.5%의 DMSO가 첨가된다. 또 다른 실시형태에서, 2.5 내지 3.0%의 DMSO가 첨가된다.
일 실시형태에서, 개시된 CTP-변형된 hGH의 제조 방법은 정제된 단백질 용액을 수득하기 위해서 정화된 수확 용액을 정제하는 단계를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 방법을 사용하여 제조된 정제된 단백질 용액은 적어도 40%의 CTP-변형된 hGH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 50%의 CTP-변형된 hGH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 60%의 CTP-변형된 hGH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 70%의 CTP-변형된 hGH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 80%의 CTP-변형된 hGH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 90%의 CTP-변형된 hGH를 포함한다.
일 실시형태에서, 정화된 수확물은 2 내지 25℃에서 24시간까지 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 정화된 수확물은 5℃에서 1개월까지 저장된다.
일 실시형태에서, 단계 (e)에서 수득된 정화된 수확물은 생균수, 박테리아 엔도톡신, 특이적인 단백질 함량, 잔류하는 DNA, 바이러스, 바이러스-유사 입자 및/또는 마이코플라즈마, 또는 이의 임의의 조합에 대해서 시험된다.
일 실시형태에서, 단계 (f)에서 정화된 수확물의 정제는 (g) 상기 정화된 수확 용액을 농축, 투석여과 및 정제하는 단계(여기서 상기 농축, 투석여과 및 정제는 상기 정화된 수확 용액을 음이온 교환 칼럼 및 소수성 상호작용 칼럼을 통해서 순차적으로 통과시키는 중공 섬유 카세트 또는 탄젠셜 플로우 카세트(tangential flow cassette)에 의해서 달성됨); (h) 단계 이후에 수득된 상기 정화된 수확물을 수득하는 단계; 및 (i) 바이러스에 대해서 유독한 용액 중에서 인큐베이션시킴으로써 상기 정화된 수확물 중에 존재하는 상기 바이러스를 불활성화시키는 단계; (j) 상기 정화된 수확 용액을 (h)로부터 수득하고, 상기 정화된 수확 용액을 농축, 투석여과 및 정제하는 단계(여기서 상기 농축, 투석여과 및 정제에 이어서 상기 정화된 수확 용액을 수산화인회석 혼합-모드 칼럼 및 양이온 교환 칼럼을 통해서 순차적으로 통과시킴); (j) 단계 (i)에 이후에 상기 정화된 수확 용액을 수득하고, 나노여과에 의해서 상기 정화된 수확 용액을 바이러스로부터 물리적으로 제거하는 단계; (k) 단계 (j) 이후에 상기 정화된 수확 용액을 수득하고, 상기 정화된 수확 용액을 농축, 투석여과 및 정제하여 CTP-변형된 폴리펩타이드의 상기 고도로 글리코실화된 형태를 함유하는 최대로 정제된 정화된 수확물에 도달하는 단계를 포함하는 단계를 순차적으로 수행함으로써 달성된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 최종 여과 이전에 원심분리 단계를 포함한다. 통상의 기술자는 원심분리 및/또는 여과가 용액을 정화시키는 방법이라는 것을 인지할 것이다.
일 실시형태에서, 정화된 수확물을 농축 및 여과하기 위한 한외여과 및 투석여과는 중공 섬유 카트리지 또는 동등한 TFF 기재 UFDF 단계를 사용하여 수행될 수 있다. 카트리지 공칭 분자량 컷오프 크기는 10,000 kDa이다. 또 다른 실시형태에서 막 카트리지는 3kDa 내지 30kDa의 컷-오프를 갖는 PES/PS/RC 막을 사용할 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 단계 (g)의 음이온 교환 칼럼은 DEAE-세파로스 패스트 플로우 칼럼(DEAE-Sepharose Fast Flow column)이다. 또 다른 실시형태에서, DEAE 칼럼은 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH의 고도로 글리코실화된 형태를 정제한다. 일 실시형태에서, 글리코실화가 높을수록 CTP-변형된 hGH의 약력학이 양호해진다. 또 다른 실시형태에서, 음이온 교환 칼럼은 관련 기술 분야에 공지된 다른 음이온 교환 칼럼, 예를 들어 캅토(Capto) DEAE 음이온 교환 칼럼 또는 다른 수지, 예컨대 에쉬무노(Eshmuno) Q를 포함할 수 있다.
일 실시형태에서, 단계 (g)의 소수성 칼럼은 페닐 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼이다. 페닐 HIC에 대한 사용 사이클의 수는 약 1 내지 10회 범위일 수 있다. 일 실시형태에서, 1 내지 3회의 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 5회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 6회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 7회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 8회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 9회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 10회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 관련 기술 분야에 공지된 완충제이 세척 및 용리를 위해서 사용된다. 일 실시형태에서, 용리 완충제은 프로필렌 글리콜을 함유한 황산암모늄을 포함한다. 일 실시형태에서, 용래 완충제은 에틸렌 글리콜을 함유한 황산암모늄을 포함한다.
일 실시형태에서, 수산화인회석 혼합-모드 칼럼은 세륨 수산화인회석 혼합-모드 칼럼(CHT)을 포함한다. CHT에 대한 사용 사이클의 수는 1 내지 10회 범위일 수 있다. 일 실시형태에서, 1 내지 3회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 5회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 6회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 7회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 8회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 9회 사이클이 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 1 내지 10회 사이클이 수행된다. CHT 칼럼으로부터의 용리는 약 3 내지 10 칼럼 부피(CV)로 수행될 수 있다. 일 실시형태에서, 용리는 약 3 CV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 용리는 약 4 CV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 용리는 약 5 CV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 용리는 약 6 CV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 용리는 약 7 CV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 용리는 약 8 CV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 용리는 약 9 CV로 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 용리는 약 10 CV로 수행된다.
일 실시형태에서, 오염으로 인해서 정화된 수확물 중에 존재할 수 있는 바이러스는 정화된 수확물 중에서 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 1% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 0.1 내지 2% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 0.2% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 0.5% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 1 내지 4% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 0.2 내지 0.5% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 0.5 내지 1.0% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 2% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 3% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 4% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스는 5 내지 10% 트리톤-X 100 용액을 사용하여 불활성화된다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 100 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 0.5 내지 24시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 0.5 내지 1시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 1 내지 2시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 2 내지 3시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 3 내지 4시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 4 내지 6시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 6 내지 8시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 8 내지 10시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 10 내지 12시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 트리톤-X 용액 중에서의 바이러스 불활성화는 약 12 내지 24시간 동안이다.
통상의 기술자는 관련 기술 분야에서 사용 가능하고, 소듐 클로레이트 및 트윈(Tween) 80을 포함하지만 이에 제한되지 않은, 이러한 바이러스에 대해서 유독한 다른 용액 또는 다른 농도가 본 명세서에 개시된 방법에서 사용될 수 있음을 인지할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 트라이-n-부틸 포스페이트(TNBP)와 폴리소르베이트(Polysorbate) 80(트윈80)의 혼합물이 단계 (h)에서 바이러스를 불활성화시키는 데 사용된다. 또 다른 실시형태에서, 바이러스의 불활성화 방법은 pH를 낮추는 것을 포함한다. 통상의 기술자는 바이러스의 불활성화가 관련 기술 분야에 공지된 바와 같이 용액의 조건을 변경시키는 것을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일 실시형태에서, 바이러스는 나노여과를 사용하여 물리적으로 제거된다. 통상의 기술자는 바이러스를 제거하기 위해서 관련 기술 분야에 공지된 임의의 필터가 본 명세서에 개시된 방법에 적용될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 나노여과는 플라노바(Planova) 또는 플라노바 유형 필터 카트리지(1 내지 60㎟)를 사용하여 수행된다. 그러한 방법 이후에 관련 기술 분야에 공지된 방법을 사용하여 정화된 수확물로부터 바이러스 클리어런스를 확인한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에서 단계 (i)의 양이온 교환 칼럼은 SP-세파로스 패스트 플로우 칼럼이다. 또 다른 실시형태에서, 양이온 교환 칼럼은 CM 세파로스 캅토 S를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 양이온 교환 칼럼은 본 명세서의 목적을 위해서 관련 기술 분야에 공지된 임의의 것을 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH의 적어도 20% 회수율을 성취한다. 또 다른 실시형태에서, 방법은 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH의 적어도 25%, 적어도 30%, 적어도 40%, 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99%, 적어도 99.9%의 회수율을 성취한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH의 정제 이후에, 본 명세서에 개시된 방법은 상기 CTP-변형된 폴리펩타이드를 특징분석하는 단계를 추가로 포함한다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 순도를 측정한다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화 함량을 측정한다. 또 다른 실시형태에서, 글리코실화 부위 점유를 측정한다. 일 실시형태에서, 순도, 글리코실화 함량 및 글리코실화 부위 점유를 제조된 CTP-변형된 hGH에서 측정한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용된 세포 클론은 동결된 세포 은행에 저장된다. 또 다른 실시형태에서, 세포 클론은 동결건조된 세포 은행에 저장된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 세포 은행은 마스터 세포 은행이다. 또 다른 실시형태에서, 세포 은행은 제조용 세포 은행이다. 또 다른 실시형태에서, 세포 은행은 굿 매뉴팩처링 프랙티스(Good Manufacturing Practice: GMP) 세포 은행이다. 또 다른 실시형태에서, 세포 은행은 임상-등급 물질의 제조를 위해서 의도된다. 또 다른 실시형태에서, 세포 은행은 인간 용도를 위한 규제 관행을 따른다. 또 다른 실시형태에서, 세포 은행은 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 유형의 세포 은행이다.
"굿 매뉴팩처링 프랙티스"는 또 다른 실시형태에서 미국 연방 법규 코드(21 CFR 210 내지 211)에 의해서 규정되어 있다. 또 다른 실시형태에서, "굿 매뉴팩처링 프랙티스"는 임상-등급 물질 또는 인간 소비 제품의 생산을 위한 다른 표준; 예를 들어 미국 이외의 국가의 표준에 의해서 규정되어 있다.
또 다른 실시형태에서, 세포를 증식시키는 데 사용되는 배지는 메토트렉세이트(MXT)를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 메토트렉세이트-무함유 배지이다. 또 다른 실시형태에서, 배지 중에 존재하는 MXT의 농도는 약 0.1 내지 2uM이다. 또 다른 실시형태에서, 배지 중에 존재하는 MXT의 농도는 약 0.1 내지 0.5uM이다. 또 다른 실시형태에서, 배지 중에 존재하는 MXT의 농도는 약 0.5 내지 1.0uM이다. 또 다른 실시형태에서, 배지 중에 존재하는 MXT의 농도는 약 1.0 내지 1.5uM이다. 또 다른 실시형태에서, 배지 중에 존재하는 MXT의 농도는 약 1.5 내지 2.0uM이다. 용어 "배지"는 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH를 포함하는 세포의 성장 또는 배양에 적합한 액체 또는 겔 또는 분말을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 그러한 배지는 대안적으로 "성장 배지" 또는 "배양 배지"로 지칭될 수 있고, 영양 배지, 농화 배지(enriched media), 최소 배지, 분별 배지(differential media), 트랜스포트 배지(transport media) 또는 선택 배지를 포함할 수 있지만 이에 제한되는 것은 아니다.
일 실시형태에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 70%의 CTP-변형된 hGH를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 단백질 용액은 적어도 80%의 CTP-변형된 hGH를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 용액은 적어도 90 내지 95%의 CTP-변형된 hGH를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 용액은 95.1 내지 99.9%의 CTP-변형된 hGH를 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 용액은 100%의 CTP-변형된 hGH를 함유한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH는 고도로 글리코실화되어 있다. 통상의 기술자는 수확물 중에 존재하는 수확된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드와 관련되는 경우 용어 "고도로 글리코실화된"이 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 60 내지 80%의 글리코실화 수준을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. (예를 들어 도 11에 도시된 역상 HPLC에 의해서 측정된 바와 같음) 또 다른 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH를 포함하는 수확물은 정제된 용액 중에서 적어도 50%의 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH를 포함하는 수확물은 정제된 용액 중에서 적어도 60%의 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH를 포함하는 수확물은 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 적어도 70%의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH를 포함하는 수확물은 정제된 용액 중에서 적어도 80%의 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 수확물은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 81 내지 90%의 글리코실화 수준을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH를 포함하는 수확물은 정제된 용액 중에서 적어도 90%의 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 글리코실화 수준을 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 수확물은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 91 내지 95의 글리코실화 수준을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 수확물은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 95.1 내지 99%의 글리코실화 수준을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 수확물은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 100%의 글리코실화 수준을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 정제된 CTP-변형된 hGH 용액(약물 물질(DS))은 분자 의 적어도 90%가 고도로 글리코실화된 용액을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 CTP-변형된 hGH 용액(약물 물질(DS))은 분자의 적어도 95%가 고도로 글리코실화된 용액을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 정제된 CTP-변형된 hGH 용액(약물 물질(DS))은 분자의 100%가 고도로 글리코실화된 용액을 포함한다. 통상의 기술자는 정제된 CTP-변형된 hGH 약물 물질(DS)은 각각의 분자가 12 내지 18개의 O-글리칸 점유부를 포함하는 CTP-변형된 hGH를 포함할 수 있다는 것을 인식할 것이다.
통상의 기술자는 용어 "약물 물질"(DS)이 활성 약제학적 성분(API)을 포함하거나 그것에 동등할 수 있음을 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 서열번호 7에 기재된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드인 약물 물질(DS)은 벌크의 정제된 약물을 포함한다. 통상의 기술자는 용어 "약물 제품"(DP)이 무균 조건하에서 최종 용기, 예를 들어 바이알에 분배되는 최종적으로 제형화된 약물을 포함할 수 있다는 것을 또한 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 서열번호 7에 기재된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드인 약물 제품(DP)은 최종적으로 제형화된 CTP-변형된 hGH를 포함한다.
고도로 글리코실화된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 장기간-작용성 hGH(예를 들어 MOD-4023)를 위한 사용 방법에서 이로운 특성을 가질 수 있는데, 이것은 성장 호르몬 결핍 환자의 감소된 투여 빈도, 예를 들어 1주일에 1회 주사를 지지한다. 높은 글리코실화 수준은 재조합 hGH에 비해서, CTP-변형된 hGH, 예를 들어 CTP-변형된 hGH의 유의하게 증가된 약력학 부피에 기여한다. 이는 CTP-변형된 hGH의 길어진 순환성 시간을 유발할 수 있다.
일 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸의 수는 적어도 4 내지 6이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸의 수는 4 내지 6이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸의 수는 적어도 4 내지 8이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸의 수는 4 내지 8이다. 일 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸의 수는 적어도 6 내지 8이다. 일 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸의 수는 6 내지 8이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸의 수는 4, 5, 6, 7 또는 8이다. 각각의 가능성은 CTP O-연결된 글리코실화의 또 다른 실시형태를 대표한다.
일 실시형태에서, 하나의 CTP가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 4 내지 6이다. 또 다른 실시형태에서, 하나의 CTP가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 6 내지 8이다. 또 다른 실시형태에서, 하나의 CTP가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 4 내지 8이다. 또 다른 실시형태에서, 2개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 8 내지 12이다. 또 다른 실시형태에서, 2개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 12 내지 16이다. 또 다른 실시형태에서, 2개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 8 내지 16이다. 또 다른 실시형태에서, 3개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 12 내지 18이다. 또 다른 실시형태에서, 3개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 18 내지 24이다. 또 다른 실시형태에서, 3개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 12 내지 24이다. 또 다른 실시형태에서, 4개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 16 내지 24이다. 또 다른 실시형태에서, 4개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 24 내지 32이다. 또 다른 실시형태에서, 4개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 16 내지 32이다. 또 다른 실시형태에서, 5개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 20 내지 30이다. 또 다른 실시형태에서, 5개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 30 내지 40이다. 또 다른 실시형태에서, 5개의 CTP 단위가 부착된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 당 O-글리칸의 수는 적어도 20 내지 40이다.
또 다른 실시형태에서, 각각의 CTP-hGH-CTP-CTP("MOD-4023"이라고도 공지됨) 당 O-글리칸의 수는 적어도 12 내지 18이다. 또 다른 실시형태에서, MOD-4023 당 O-글리칸의 수는 적어도 18 내지 24이다. 또 다른 실시형태에서, MOD-4023 당 O-글리칸의 수는 적어도 12 내지 24이다. 또 다른 실시형태에서, MOD-4023 당 O-글리칸의 수는 적어도 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 또는 24이다. 각각의 가능성은 CTP O-연결된 글리코실화의 또 다른 실시형태를 대표한다.
일 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸 점유는 적어도 70%이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸 점유는 적어도 80%이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸 점유는 적어도 90%이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 당 O-글리칸 점유는 100%이다.
일 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 고도로 시알릴화되어 있다. 통상의 기술자는 CTP-변형된 hGH와 관련된 경우 용어 "고도로 시알릴화된"이 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 60 내지 80%의 시알릴화 수준을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 시알릴화 수준은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 60 내지 70%이다. 또 다른 실시형태에서, 시알릴화 수준은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 70 내지 80%이다. 또 다른 실시형태에서, 시알릴화 수준은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 80 내지 90%이다. 또 다른 실시형태에서, 시알릴화 수준은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 90 내지 95%이다. 또 다른 실시형태에서, 시알릴화 수준은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 약 95.1 내지 99%이다. 또 다른 실시형태에서, 시알릴화 수준은 정제된 용액의 총 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 100%이다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 중의 O-글리칸은 모노-시알릴화된 코어 1개를 포함한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 인간 GH를 코딩하는 코딩부를 포함하는 발현 벡터는 또한 프로모터, CTP-변형된 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열 및 폴리아데닐화 서열을 포함한다. 일 실시형태에서, 폴리아데닐화 서열은 유인원 바이러스(SV) 40 폴리아데닐화 서열이다.
일 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 600㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 600 내지 700㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 701 내지 800㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 801 내지 900㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 901 내지 1000㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1001 내지 1100㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1101 내지 1200㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1201 내지 1300㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1301 내지 1400㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1401 내지 1500㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1501 내지 1600㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1601 내지 1700㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1701 내지 1800㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1801 내지 1900㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 1901 내지 2000㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2001 내지 2100㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2101 내지 2200㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2201 내지 2300㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2301 내지 2400㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2401 내지 2500㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2501 내지 2600㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2601 내지 2700㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2701 내지 2800㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2801 내지 2900㎎/L의 수준으로 발현된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH는 적어도 2901 내지 3000㎎/L의 수준으로 발현된다.
통상의 기술자는 용어 "발현"이 숙주 세포 내에서의 이종 핵산 서열의 전사 및/또는 번역을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 숙주 세포에서 목적하는 생산물/관심 단백질의 발현 수준은 세포 중에 존재하는 상응하는 mRNA 또는 cDNA의 양, 또는 본 실시예에서와 같은 선택된 서열에 의해서 코딩된 목적하는 폴리펩타이드/관심 단백질의 양을 기초로 측정될 수 있다. 예를 들어, 선택된 서열로부터 전사된 mRNA는 노던 블롯 혼성화(Northern blot hybridization), 리보뉴클레아제 RNA 보호, 세포 RNA에 대한 계내 혼성화 또는 PCR에 의해서 정량분석될 수 있다(문헌[Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987 개정판] 참고). 선택된 서열에 의해서 코딩된 단백질은 다양한 방법, 예를 들어, ELISA, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 방사성면역검정법, 면역침전법, 단백질의 생물학적 활성에 대한 검정법, 단백질의 면역염색법 이후의 FACS 분석법(문헌[Sambrook et al., 1989; Ausubel et al., 1987 개정판]) 또는 균질 시간-분해 형광법(HTRF)에 의해서 정량분석될 수 있다. 일 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 정량분석법은 역상 고성능 액체 크로마토그래피(RP-HPLC)를 사용하는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RP-HPLC는 C-18 칼럼을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, RP-HPLC는 C-8 칼럼을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 RP-HPLC를 사용하여 수확물 중의 CTP-변형된 hGH를 정량분석한다(실시예 단계 3 내지 8 참고). 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 RP-HPLC를 사용하여 제1 정제 단계에서 CTP-변형된 hGH를 정량분석한다(실시예 단계 9 내지 12 참고).
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 은행, 또는 동결된 스톡은 해동 시 90%초과의 생존력을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 무한의 시간 동안이다. 각각의 가능성은 본 명세서에 개시된 별개의 실시형태를 대표한다.
또 다른 실시형태에서, 저장은 2주 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 3주 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 1개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 2개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 3개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 5개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 6개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 9개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저장은 1년 동안이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 은행, 또는 동결된 스톡은 본 명세서에 개시된 규정된 배지 중에서 세포의 배양액을 성장시키고, 글리세롤을 포함하는 용액 중에서 배양액을 동결시키고, 세포 클론을 -20℃ 미만에서 저장하는 것을 포함하는 방법에 의해서 저온보존된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 약 -70 ℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 약 -70 내지 -80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 규정된 배지가 이러한 방법에서 사용될 수 있다. 각각의 규정된 배지는 본 명세서에 개시된 별개의 실시형태를 대표한다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 실시형태에서, 배양액은 세포 은행으로부터 접종된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 동결된 스톡으로부터 접종된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 출발 배양액으로부터 접종된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 콜로니로부터 접종된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 미드-로그(mid-log) 성장상에서 접종된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 대략 미드-로그인 성장상에서 접종된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 또 다른 성장상에서 접종된다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 실시형태에서, 동결을 위해서 사용된 용액은 2 내지 20% 양의 DMSO를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 양은 2%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 20%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 1%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 1.5%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 3%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 4%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 5%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 2%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 2%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 7%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 7.5%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 9%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 10%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 12%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 14%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 16%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 18%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 22%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 25%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 30%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 35%이다. 또 다른 실시형태에서, 양은 40%이다.
또 다른 실시형태에서, 첨가제는 수크로스이다. 또 다른 실시형태에서, 첨가제는 임의의 다른 총괄성 첨가제 또는 관련 기술 분야에 공지된 항-동결 특성을 갖는 첨가제이다. 각각의 가능성이 본 명세서에 개시된 별개의 실시형태를 대표한다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 사용된 동결 용액은 컨디셔닝된 배지 및 DMSO를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 사용된 동결 용액은 약 46.255%의 컨디셔닝된 배지 및 7.5%의 DMSO를 포함한다.
일 실시형태에서, 세포 배양액은 관련 기술 분야에서 일상적인 기술에 의해서 성장된다. 또 다른 실시형태에서, 일정한 pH가 세포 배양액의 성장 동안 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 약 7.0에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 약 6에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 약 6.5에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 약 7.5에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 약 8에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 6.5 내지 7.5에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 6 내지 8에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 6 내지 7에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, pH는 7 내지 8에서 유지된다. 각각의 가능성은 본 명세서에 개시된 별개의 실시형태를 대표한다.
또 다른 실시형태에서, 일정한 온도가 배양액의 성장 동안 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 약 37℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 37℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 25℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 27℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 28℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 30℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 32℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 34℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 35℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 36℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 38℃에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 39℃에서 유지된다.
또 다른 실시형태에서, 일정한 용존 산소 농도가 배양액의 성장 동안 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 용존 산소 농도는 포화상태의 20%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 15%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 16%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 18%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 22%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 25%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 30%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 35%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 40%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 45%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 50%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 55%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화도 60%의 에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 65%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 70%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 75%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 80%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 85%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 90%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 95%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 100%에서 유지된다. 또 다른 실시형태에서, 농도는 포화상태의 100% 근처에서 유지된다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 실시형태에서, 배양액은 용기 당 2리터(L)의 최대 부피를 갖는 배지 중에서 성장된다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 200㎖의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 300㎖의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 500㎖의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 750㎖의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 1L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 1.5 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 2.5 L의 최대 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 3L의 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 5L의 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 적어도 5L의 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 적어도 10L의 부피를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 2L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 500㎖의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 750㎖의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 1L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 1.5L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 2.5L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 3L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 4L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 5L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 6L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 8L의 최소 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 배지는 용기 당 10L의 최소 부피를 갖는다.
또 다른 실시형태에서, 동결 단계는 배양액이 1 x 106 생 세포(VC)/㎖의 밀도를 갖는 경우 수행된다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량(biomass)은 1.5 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 1.5 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 2 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 3 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 4 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 5 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 7 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 9 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 10 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 12 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 15 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 20 x 107VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 25 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 30 x 107VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 33 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 40 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 50 x 106VC/㎖이다. 또 다른 실시형태에서, 생물체량은 50 x 106VC/㎖ 초과이다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 실시형태에서, 세포 배양액은 액체 질소 중에서 플래쉬-동결되고, 이어서 최종 동결 온도에서 저장된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 보다 온화된 방식으로; 예를 들어 최종 저장 온도에서 배양액의 바이알에 넣음으로써 동결된다. 또 다른 실시형태에서, 배양액은 세포 배양액을 동결시키기 위해서 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 방법에 의해서 동결된다.
통상의 기술자는 용어 "세포 배양액" 및 "조직 배양액"은 상호 교환 가능하게 사용될 수 있고, 시험관에서의, 현탁 배지 중에서의, 액체 배지 중에서의 또는 액체 배지가 제공된 표면, 예컨대 유리, 플라스틱 또는 아가 상에서의 세포의 유지를 나타낸다는 것을 이해할 것이다. 일반적으로, "세포 배양액"은 일정한 적합한 pH를 유지시키도록 완충된 배지가 필요하다. 세포 배양 중에서 사용되는 배지는 일반적으로 적절하게 공급된 필요한 영양분을 포함하도록 제형화되고, 유지될 특정한 세포에 대해서 삼투적으로 조정될 수 있고, 온도 및 기체상 또한 적합한 한계치 내에서 제어된다. 세포 배양액은 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morgan et al. 1993 Animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers, Oxford, UK]; 및 [Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, Second Edition, Elsevier]을 참고하기 바란다.
통상의 기술자는 용어 "패시지(Passage)"가 세포 집단을 계대배양시키는 행동을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. "계대배양"은 일 실시형태에서는 새로운 멸균 배지인 멸균 배지를 이전의 배양액으로부터의 샘플로 접종시킴으로써 설정된 세포 배양액을 포함할 수 있다.
통상의 기술자는 용어 "세포주(cell strain)"가 계대배양 기술을 사용하여 1차 배양액으로부터 유래된 세포 집단을 포함할 수 있다는 것을 또한 인지할 것이다. 따라서, 1차 배양액은 둘 이상의 새로운 배양액으로 계대배양될 수 있고, 계대배양은 몇달 동안 주기적인 간격으로 반복되어 세포주를 유지시킨다. 본 명세서에 개시된 방법하에서의 계대배양은 설정된 세포 배양 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
일 실시형태에서, 패시징된 세포주, 및 불멸화된 세포계는 특이적인 기능성 마커, 예컨대 케라틴, 호르몬 및 성장 인자 수용체 등의 발현에 의해서 특징분석될 수 있다.
일부 실시형태에서, 배양은 성장 인자가 첨가된 무-혈청 규정된 배지 중에서 수행될 수 있다. 다른 양상에서, 배지는 성장 인자가 첨가되거나 첨가되지 않은 혈청을 함유한다. 그러한 변형은 세포 증식을 최적화하도록 통상의 기술자에 의해서 경험적으로 결정될 수 있다.
통상의 기술자는 용어 "세포계"가 시험관내에서 무제한 증식에 대한 가능성을 갖는 것을 특징으로 하는 단일 외식편으로부터 유래된 세포 집단을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 본 명세서에 개시된 바와 같이, 세포계는 배양액 중에서 생존하고, 계속 성장하는 이의 능력을 기초로 1차 배양액으로부터 단리될 수 있다. 종양 조직으로부터 본래 유래된 세포계는 생체내에서 형질전환될 수 있지만, 신생물 세포 집단 전부가 시험관내에서 무한하게 성장하는 능력을 갖는 것은 아니다. 추가로, 세포계는 일반적으로 다수의 분할 단계를 통해서 이의 차별화된 특징을 일반적으로 보유한다.
적합한 세포 배양 물질은 일반적으로 멸균될 수 있고, 유독한 인자를 침출하지 않고, 현미경 영상을 왜곡하지 않는 용기이다. 따라서, 유리 및 플라스틱으로부터 형성된 플레이트가 본 명세서에 개시된 방법에서 사용하기에 적합한 물질이다. 플라스틱 용기는 관련 기술 분야에 공지된 기술을 사용하여 세포 부착을 증진시키도록 추가로 처리될 수 있다(Ramsey et al. 1984 In vitro 20:802). 적합한 조직 배양 배지는 일반적으로 에너지 공급을 제공하고, 무기 염, 아미노산, 비타민 및 다양한 보충원과 결합된 등장성이고, 완충된 기본 영양 배지로 이루어진다. 보충원은 혈청(예를 들어, 우태아 혈청), 및 오염을 방지하거나, 선택적인 조건, 부착 및 성장 인자 등을 제공하기 위한 다양한 항생제를 포함할 수 있다. 다수의 배지 제형이 관련 기술 분야에 공지되어 있으며, 이것은 예컨대 최소 필수 배지(MEM), 로즈웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Rosewell Park Memorial Institute: RPMI) 1640 또는 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)를 포함하지만 이에 제한되는 것은 아니다. 적합한 조직 배양 조건은 또한 관련 기술 분야에 공지되어 있다. 예를 들어, 문헌[Morgan et al. 1993 Animal Cell Culture, BIOS Scientific Publishers Ltd., Oxford, UK], 및 [Adams, R. L. P. 1990 Cell Culture for Biochemists, Second Edition, Elsevier]을 참고하기 바란다. 본 명세서에 개시된 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 제조 방법은 무-혈청 공정이다. 본 명세서에 개시된 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH의 제조 방법은 비-동물 유래 공정이다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 실시형태에서, 배양액의 저장 온도는 -20 내지 -80℃(섭씨 온도)이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -20℃보다 상당히 더 낮다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -70℃보다 고온이 아니다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -70℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 약 -70℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -20℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 약 -20℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -30℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -40℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -50℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -60℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -30 내지 -70℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -40 내지 -70℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -50 내지 -70℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -60 내지 -70℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -30 내지 -80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -40 내지 -80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -50 내지 -80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -60 내지 -80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -70 내지 -80℃이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -70℃보다 저온이다. 또 다른 실시형태에서, 온도는 -80℃보다 저온이다.
또 다른 실시형태에서, 저온보존을 위해서, 세포가 저온보호제를 포함하는 배지 중에서 -70℃ 미만의 온도에 도달할 때까지 세포를 천천히 동결시키고, 이어서 바이알을 액체-질소 동결기로 옮기고 그것을 -130℃ 미만의 온도에서 유지시킨다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 24시간 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 2일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 동결 저장은 최대 3일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 4일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 1주일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 2주일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 3주일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 1개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 2개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 3개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 5개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 6개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 9개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최대 1년 동안이다.
또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 1주일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 2주일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 3주일 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 1개월 동안이다 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 2개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 3개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 5개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 6개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 9개월 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 1년 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 1.5년 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 2년 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 3년 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 5년 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 7년 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 최소 10년 동안이다. 또 다른 실시형태에서, 저온보존, 또는 동결 저장은 10년 미만 동안이다.
본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 또 다른 실시형태에서, 세포는 연장된 저온보존 또는 동결 저장 기간에 이어서 해동 후에 성장을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 세포 은행 또는 출발 배양액으로부터의 세포로 새로운 배지를 접종시킨 후에 약 15 내지 22시간 내에 성장을 나타낸다. 또 다른 실시형태에서, 세포는 세포 은행 또는 출발 배양액으로부터의 세포로 새로운 배지를 접종시킨 후에 약 12 내지 20시간 내에 성장을 나타낸다. 일 실시형태에서, 생존력, 유전적 안정성, 및 표현형 안정성을 보장하기 위해서, 세포계는 지수적인(exponential) 성장상(정기적인 계대배양을 통해서)으로 유지될 필요가 있다.
통상의 기술자는 용어 저온보존 또는 동결 저장의 "연장된 기간"이 1개월을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 2개월이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 3개월이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 5개월이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 6개월이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 9개월이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 1년이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 1.5년이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 2년이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 2 내지 7년이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 적어도 7년이다. 또 다른 실시형태에서, 기간은 적어도 10년이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물의 세포는 저온보존에 이어서 해동된 후에 90%를 초과하는 생존력을 보유한다. 또 다른 실시형태에서, 해동 시 생존력은 저온보존 기간에 이어서 100%에 가깝다. 또 다른 실시형태에서, 해동 시 생존력은 90%에 가깝다. 또 다른 실시형태에서, 해동 시 생존력은 적어도 90%이다. 또 다른 실시형태에서, 해동 시 생존력은 80%를 초과한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 세포 은행, 동결된 스톡, 또는 백신 용량의 배취는 규정된 세포 배양 배지 중에서 성장된다. 그러한 배지는 관련 기술 분야에 공지되어 있고, 둘베코 변형된 이글 배지(DMEM)(ATCC(등록상표) 번호 30 내지 2002), 이스코브 변형된 둘베코 배지(IMDM)(ATCC(등록상표) 번호 30 내지 2005), 하이브리-케어 배지(Hybri-Care Medium)(ATCC(등록상표) 번호 46-X), 멕코이(McCoy) 5A 및 RPMI-1640(ATCC(등록상표) 번호 30 내지 2007), 함 영양 혼합물(ATCC(등록상표) CCL-61(상표명)), 화학적으로 규정된 파워CHO(상표명), 무-혈청 CHO 배지(론자 카탈로그 번호 12 내지 771Q); 또는 관련 기술 분야에 공지된 임의의 다른 배지를 포함할 수 있지만, 이에 제한되는 것은 아니다. 또 다른 실시형태에서, 통상의 기술자가 경험적으로 결정할 바와 같이 이러한 배지에는 항생제 또는 동물 혈청이 보충될 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에는 포유동물 세포를 큰 규모 부피로 배양할 수 있게 하는 생물반응기 및 방법이 개시되어 있다. 추가로, 그리고 또 다른 실시형태에서, 상기 생물반응기 및 방법은, 큰 규모 부피에서 성장시키더라도, 포유동물 세포를 최적의 조건하에서 배양할 수 있게 하여, 공정 성능 및 생산물 품질을 생물반응기의 크기에 무관하게 한다. 생물반응기 내에서의 인큐베이션 시간은, 단지 규모 및 생물반응기 시스템을 변화시킴으로써 달라질 수 있고, 예를 들어, 기간은 8 내지 9일일 수 있거나, 그것은 15 내지 16일일 수 있다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기에서의 인큐베이션 기간은 약 7일, 약 8일, 약 9일, 약 10일, 약 11일, 약 12일, 약 13일, 약 14일, 약 15일, 약 16일, 약 17일, 약 18일, 약 19일, 약 20일 또는 그 초과이다. 또 다른 실시형태에서, 관류 생물반응기가 사용되는 경우, 인큐베이션 기간은 7 내지 120일까지 일 수 있다. 상기에 열거된 각각의 가능성은 본 명세서에 개시된 실시형태이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 공정 파라미터, 예컨대 pH, 용존 산소 분압(dissolved oxygen tension: DOT) 및 온도에 대해서 균질한 환경에서 포유동물 세포를 배양할 수 있게 하는 큰-규모 생물반응기가 개시되어 있고, 이것은 잘 혼합된 세포 현탁액을 유지시키고, 생물반응기 내에서 영양 공급물을 블렌딩한다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 일회용 생물반응기이다.
본 명세서에 개시된 제조 방법은 생물반응기의 공급, 생물반응기 시스템 및 진핵 세포, 특히 포유동물 세포의 배양 방법을 제공함으로써 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 제조에서 근본적인 기술적인 문제를 해결한다.
일 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 250리터(L)이다. 또 다른 실시형태에서, 생물반응기는 적어도 500L의 부피를 갖는다. 또 다른 실시형태에서, 부피는 적어도 1000L, 적어도 2000L, 적어도 5,000L, 적어도 10,000L 적어도 12,000L 또는 적어도 15,000L이다.
또 다른 실시형태에서, 생물반응기의 부피를 증가시키면서 세포를 계대배양하였다(본 명세서 실시예 참고).
조성물
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시되고, 본 명세서에 개시된 방법을 사용하여 제조된 CTP-변형된 인간 성장 호르몬(hGH) 폴리펩타이드는 성장 및 체중에 관련된 병태, 예컨대 성장 결핍 장애, AIDS 소모증(AIDS wasting), 노화, HIV-감염된 대상체의 손상된 면역 기능, 이화성 질병(catabolic illness), 수술 회복, 울혈성 심근증, 간 이식, 간 절제술 후의 간 재생, 만성 신부전, 신성 골이영양증, 골다공증, 연골 무형성증(achondroplasia)/연골 형성저하증(hypochondroplasia), 골격 이형성증, 만성 염증성 또는 영양 장애, 예컨대 크론병(Crohn's disease), 단장 증후군(short bowel syndrome), 유년성 만성 관절염(juvenile chronic arthritis), 낭포성 섬유증, 남성 불임, X 염색체 연관성 저인산혈성 구루병(X-linked hypophosphatemic ricket), 다운 증후군, 이분 척추증(Spina bifida), 누난 증후군(Noonan Syndrome), 비만, 손상된 근력 및 섬유근통을 갖는 대상체를 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 그 자체로서 개체에게 제공될 수 있다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드는 약제학적으로 허용 가능한 담체와 혼합된 약제학적 조성물의 일부로서 개체에게 제공될 수 있다.
통상의 기술자는 용어 "약제학적 조성물"이 본 명세서에 기술된 1종 이상의 활성 성분과 다른 화학적 성분, 예컨대 생리학적으로 적합한 담체 및 부형제의 제제를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 약제학적 조성물의 목적은 유기체에 화합물을 투여하는 것을 용이하게 하기 위한 것이다.
본 명세서에 개시된 변형된 펩타이드는 포유동물(예를 들어, 암소, 말, 돼지, 양, 인간)에게 경구로 또는 비경구로 투여될 수 있는 그 자체로 공지된 담체, 희석제 등과 혼합된 적합한 약제학적 제제, 예컨대 캡슐 및 주사로 제형화될 수 있다.
통상의 기술자는 용어 "활성 성분"은 생물학적 효과에 책임이 있는 관심 폴리펩타이드 서열을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물 중 임의의 것은 임의의 형태로 관심 단백질에 결합된 적어도 2개의 CTP 서열을 포함할 것이다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에는 조합 제제가 개시되어 있다. 통상의 기술자는 용어 "조합 제제"는 "부품의 키트"를 포함할 수 있고, 이것은 상기에 규정된 바와 같은 조합 상대가 독립적으로 또는 조합 상대의 양을 달리하는 상이한 고정 조합을 사용하여, 즉 동시에, 공동으로, 개별적으로 또는 순차적으로 투여될 수 있다는 것을 의미한다는 것을 인지할 것이다. 일부 실시형태에서, 이어서 부품의 키트의 부품은 예를 들어, 동시에 또는 시기적으로 엇갈리게, 즉 부품의 키트의 임의의 부품에 대하여 상이한 시점에 동일하거나 상이한 시간 간격으로 투여될 수 있다. 일부 실시형태에서, 조합 상대의 총량의 비율이 조합 제제로 투여될 수 있다. 일 실시형태에서, 조합 제제는 예를 들어, 치료될 환자 하위 집단의 필요 또는 단일 환자의 필요에 대처하기 위하여 번경될 수 있으며, 여기서 상이한 필요는 특정 질환, 질환의 증증도, 연령, 성별 또는 체중에 기인한 것일 수 있고, 이는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 용이하게 이루어질 수 있다.
통상의 기술자는 상호 교환 가능하게 사용될 수 있는 구 "생리학적으로 허용 가능한 담체" 및 "약제학적으로 허용 가능한 담체"는 유기체에 심각한 자극을 유발하지 않고, 투여된 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 훼손하지 않는 담체 또는 희석제를 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 아주반트는 이러한 구에 포함된다. 일 실시형태에서, 약제학적으로 허용 가능한 담체에 포함된 성분 중의 하나는 예를 들어 폴리에틸렌 글리콜(PEG), 유기 배지 및 수성 배지 둘 모두 중에서 다양한 용해도를 갖는 생체적합성 중합체일 수 있다(Mutter et al. (1979).
통상의 기술자는 용어 "부형제"가 활성 성분의 투여를 추가로 용이하게 하기 위해서 약제학적 조성물에 첨가되는 불활성 물질을 포함할 수 있다는 것을 인지할 것이다. 일 실시형태에서, 부형제는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당 및 다양한 유형의 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴, 식물유 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
약물의 제형화 및 투여를 위한 기술은 본 명세서에 참고로 포함된 문헌["Remington's Pharmaceutical Sciences," Mack Publishing Co., Easton, PA, latest edition]에 존재한다.
일 실시형태에서, 적합한 투여 경로는 예를 들어, 경구, 직장, 경점막(transmucosal), 경비(transnasal), 장 또는 비경구 전달, 예를 들어 근육내, 피하 및 척수내 주사뿐만 아니라 척수강내, 직접적 뇌실내, 정맥내, 복강내, 비내 또는 안내 주사를 포함한다.
일 실시형태에서, 전신 방식이 아닌 국소로, 예를 들어 환자 신체의 특정 영역 내에 제제를 직접 주사함으로써 제제가 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 50마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 25마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 50 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 10 내지 50마이크로그램의 투여량으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내(IM) 주사, 피하(SC) 주사, 또는 정맥내(IV)에 의해서 1주일에 1회 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내(IM) 주사, 피하(SC) 주사, 또는 정맥내(IV)에 의해서 1주일에 2회 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내(IM) 주사, 피하(SC) 주사, 또는 정맥내(IV)에 의해서 1주일에 3회 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내(IM) 주사, 피하(SC) 주사, 또는 정맥내(IV)에 의해서 2주일에 1회 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내(IM) 주사, 피하(SC) 주사, 또는 정맥내(IV)에 의해서 17일에 1회 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내(IM) 주사, 피하(SC) 주사, 또는 정맥내(IV)에 의해서 19일 주에 1회 0.1 내지 5㎖ 용액 중의 1 내지 90마이크로그램의 투여량으로 투여된다.
투여량 범위의 다양한 실시형태가 고려된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 폴리펩타이드의 투여량은 0.05 내지 80㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.05 내지 50㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.1 내지 20㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.1 내지 10㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.1 내지 5㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.5 내지 5㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.5 내지 50㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 5 내지 80㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 35 내지 65㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 35 내지 65㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 20 내지 60㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 40 내지 60㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 45 내지 60㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 40 내지 60㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 60 내지 120㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 120 내지 240㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 40 내지 60㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 240 내지 400㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 45 내지 60㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 15 내지 25㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 5 내지 10㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 55 내지 65㎎/일 범위이다.
일 실시형태에서, 투여량은 20㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 30㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 40㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 50㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 60㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 70㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 80㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 90㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 100㎎/일이다.
본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드의 투여량은, 일 실시형태에서, 0.005 내지 100㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.005 내지 5㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.01 내지 50㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.1 내지 20㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.1 내지 10㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.01 내지 5㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.001 내지 0.01㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.001 내지 0.1㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.1 내지 5㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.5 내지 50㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.2 내지 15㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.8 내지 65㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 50㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 5 내지 10㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 8 내지 15㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 20㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 20 내지 40㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 60 내지 120㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 12 내지 40㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 40 내지 60㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 50 내지 100㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 60㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 15 내지 25㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 5 내지 10㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 55 내지 65㎎/주 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 5㎎/주 범위이다.
또 다른 실시형태에서, 대상체에게 제공되는 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드 투여량은 대상체의 동일한 집단(예를 들어, 소아, 노인, 남성, 여성, GH 결핍, 특정 민족성)으로부터의 표준 대상체에 제공되는 표준 투여량의 50%이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 대상체의 특정 집단으로부터의 대상체에게 제공되는 투여량의 30%이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 대상체의 특정 집단으로부터의 대상체에게 제공되는 투여량의 45%이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 대상체의 특정 집단으로부터의 대상체에게 제공되는 투여량의 100%이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 5㎎/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 2㎎/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 4㎎/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1.2㎎/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1.8㎎/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 대략적으로 본 명세서에 기술된 투여량이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 5㎎/투여이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 2㎎/투여이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 4㎎/투여이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1.2㎎/투여이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1.8㎎/투여이다. 일 실시형태에서, 조성물은 1주일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 2주일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물 1개월마다 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 매일 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 비내 투여 형태로 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 주사 가능한 투여 형태로 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 0.0001㎎ 내지 0.6㎎ 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 0.001㎎ 내지 0.005㎎ 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 0.005㎎ 내지 0.01㎎ 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 0.01㎎ 내지 0.3㎎ 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 0.2㎎ 내지 0.6㎎ 범위의 용량으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 1 내지 100마이크로그램 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 10 내지 80마이크로그램 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 20 내지 60마이크로그램 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 10 내지 50마이크로그램 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 40 내지 80마이크로그램 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 10 내지 30마이크로그램 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 30 내지 60마이크로그램 범위의 용량으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서, CTP에 의해서 변형된 GH는 대상체에게 0.2㎎ 내지 2㎎ 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 2㎎ 내지 6㎎ 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 4㎎ 내지 10㎎ 범위의 용량으로 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 5㎎ 내지 15㎎ 범위의 용량으로 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내에 주사된다(근육내 주사). 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 피부 아래에 주사된다(피하 주사). 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 근육내에 주사된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 피부 아래에 주사된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 GH 요법이 필요한 대상체에게 본 명세서에 개시된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드를 제공하고, 이에 의해서 GH 요법의 사용에 있어서 준수를 증가시키는 것을 포함하는, GH 요법의 사용에 있어서 준수를 증가시키는 것을 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 50,000달톤보다 낮은 분자량의 단백질 약물, 예컨대 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 일반적으로 몇 시간의 짧은 순환성 반감기를 갖는, 생체내에서 단기간-생존하는 종이다. 또 다른 실시형태에서, 피하 투여 경로는 일반적으로 순환계에 더 느린 방출을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP 변형된 폴리펩타이드는 50,000달톤보다 낮은 분자량의 단백질 약물, 예컨대 GH의 반감기를 연장시킨다.
또 다른 실시형태에서, CTP 변형된 hGH의 면역원성은 단리된 GH와 동일하다. 또 다른 실시형태에서, CTP 변형된 hGH의 면역원성은 단리된 GH와 대등하다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 GH를 CTP 펩타이드로 변형시키는 것은 GH의 면역원성을 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, CTP 변형된 hGH는 단리된 GH 단백질만큼 활성이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 변형된 hGH 폴리펩타이드는 단리된 GH보다 더 활성이다. 또 다른 실시형태에서, CTP 변형된 hGH는 생물활성 감소를 최소화하면서 분해에 대한 GH 보호 능력을 최대화시킨다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 GH 요법이 필요한 만성 질병을 가진 대상체의 준수를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 GH를 상기 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP로 변형시킴으로써 GH의 투여 빈도를 감소시키는 것을 가능하게 한다. 또 다른 실시형태에서, 용어 준수는 처방 준수(adherence)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법은 GH의 투여 빈도를 감소시킴으로써 GH 요법이 필요한 환자의 준수를 증가시키는 것을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, GH의 투여 빈도 감소는 CTP-변형된 GH를 더 안정하게 하는 CTP 변형으로 인해서 달성된다. 또 다른 실시형태에서, GH의 투여 빈도 감소는 GH의 T1/2 증가로 인해서 달성된다. 또 다른 실시형태에서, GH의 투여 빈도 감소는 GH의 클리어런스 시간 증가로 인해서 달성된다. 또 다른 실시형태에서, GH의 투여 빈도 감소는 GH의 AUC 측정치의 증가로 인해서 달성된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 1일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 2일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 3일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 4일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 5일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 6일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 1주일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 7 내지 14일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 10 내지 20일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 5 내지 15일에 1회 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 대상체에게 15 내지 30일에 1회 투여된다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 50 내지 500㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 50 내지 150㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 100 내지 200㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 150 내지 250㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 200 내지 300㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 250 내지 400㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 300 내지 500㎎/일 범위이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 350 내지 500㎎/일 범위이다.
일 실시형태에서, 투여량은 20㎎/일이다. 일 실시형태에서, 투여량은 30㎎/일이다. 일 실시형태에서, 투여량은 40㎎/일이다. 일 실시형태에서, 투여량은 50㎎/일이다. 일 실시형태에서, 투여량은 0.01㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.1㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.530㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 0.05㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 50㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 20 내지 70㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 5㎎/일이다.
또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/2일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/3일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/4일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/5일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/6일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/9일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/11일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 1 내지 90㎎/14일이다.
또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 투여량은 10 내지 50㎎/일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/2일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/3일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/4일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50마이크로그램 ㎎/5일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/6일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/주이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/9일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/11일이다. 또 다른 실시형태에서, 투여량은 10 내지 50㎎/14일이다.
경구 투여는 일 실시형태에서, 정제, 캡슐, 로젠지(lozenge), 씹는 정제, 현탁액, 에멀젼 등을 포함하는 단위 투여 형태를 포함한다. 그러한 단위 투여 형태는 안전한 유효량의 목적하는 화합물 또는 화합물들을 포함하고, 이들 각각은 일 실시형태에서는 약 0.7 또는 3.5㎎ 내지 약 280㎎/70kg이거나, 또는 또 다른 실시형태에서는, 약 0.5 또는 10㎎ 내지 약 210㎎/70kg이다. 경구 투여를 위한 단위 투여 형태의 제조에 적합한 약제학적으로-허용 가능한 담체는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 정제는 전형적으로 불활성 희석제, 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 만니톨, 락토스 및 셀룰로스; 결합제, 예컨대 전분, 젤라틴 및 수크로스; 붕해제, 예컨대 전분, 알긴산 및 크로스카멜로스; 윤활제, 예컨대 스테아르산 마그네슘, 스테아르산 및 탈크로서 종래의 약제학적으로-상용성인 아주반트를 포함한다. 일 실시형태에서, 글리던트(glidant), 예컨대 이산화규소가 분말-혼합물의 유동 특징을 개선시키기 위해서 사용될 수 있다. 일 실시형태에서, 착색제, 예컨대 예컨대 FD&C 염료가 외관을 위해서 첨가될 수 있다. 감미제 및 향미제, 예컨대 아스파탐, 사카린, 멘톨, 페퍼민트 및 과일 향미제가 씹는 정제를 위한 유용한 아주반트이다. 캡슐은 전형적으로 상기에 개시된 1종 이상의 고체 희석제를 포함한다. 일부 실시형태에서, 담체 성분의 선택은 2차 고려사항, 예컨대 맛, 비용 및 저장 안정성에 좌우되고, 이는 본 명세서에 개시된 목적을 위해서 중요하지 않고, 관련 기술 분야의 통상의 기술자에 의해서 용이하게 행해질 수 있다.
일 실시형태에서, 경구 투여 형태는 미리 규정된 방출 프로파일을 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 경구 투여 형태는 연장된 방출 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹는 정제를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 경구 투여 형태는 느린 방출 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹는 정제를 포함한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 경구 투여 형태는 즉시 방출 정제, 캡슐, 로젠지 또는 씹는 정제를 포함한다. 일 실시형태에서, 경구 투여 형태는 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 공지된 바와 같은 약제학적 활성 성분의 목적하는 방출 프로파일에 따라서 제형화된다.
경구 조성물은, 일부 실시형태에서, 액체 용액, 에멀젼, 현탁액 등을 포함한다. 일부 실시형태에서, 그러한 조성물의 제조에 적합한 약제학적으로-허용 가능한 담체는 관련 기술 분야에 널리 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, 액체 경구 조성물은 약 0.012% 내지 약 0.933%의 목적하는 화합물 또는 화합물들, 또는 또 다른 실시형태에서, 약 0.033% 내지 약 0.7%를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 방법에서 사용하기 위한 조성물은 용액 또는 에멀젼을 포함하고, 이것은 일부 실시형태에서 안전한 유효량의 국소적 비강내 투여가 의도되는 본 명세서에 개시된 화합물, 및 임의로 다른 화합물을 포함하는 수용액 또는 에멀젼이다. 일부 실시형태에서, 조성물은 약 0.01% 내지 약 10.0% w/v의 대상 화합물, 보다 바람직하게는 약 0.1% 내지 약 2.0을 포함하고, 이것은 비강내 경로에 의한 화합물의 전신 전달을 위해서 사용된다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 액체 제제의 정맥내, 동맥내, 또는 근육내 주사에 의해서 투여된다. 일부 실시형태에서, 액체 제형은 용액, 현탁액, 분산액, 에멀젼, 오일 등을 포함한다. 일 실시형태에서, 약제학적 조성물은 정맥내 투여되고, 따라서 정맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 동맥내 투여되고, 따라서 동맥내 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 근육내 투여되고, 따라서 근육내 투여에 적합한 형태로 제형화된다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 신체 표면에 국소적으로 투여되고, 따라서 국소 투여에 적합한 형태로 제형화된다. 적합한 국소 제형은 겔, 연고, 크림, 로션, 드롭(drop) 등을 포함한다. 국소 투여를 위해서, 본 명세서에 개시된 화합물은 추가적인 적절한 치료제 또는 치료제들과 조합되고, 약제학적 담체와 함께 또는 그것 없이 생리학적으로 허용 가능한 희석제 중에서 용액, 현탁액 또는 에멀젼으로서 제조 및 적용된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 약제학적 조성물은 관련 기술 분야에 널리 공지된 공정, 예를 들어 종래의 혼합, 용해, 그래뉼화, 드라제-제조, 레비게이팅(levigating), 유화, 캡슐화, 인트랩핑(entrapping) 또는 동결건조 공정에 의해서 제조된다.
일 실시형태에서, 본 명세서의 개시 내용에 따라서 사용하기 위한 약제학적 조성물은 활성 성분을 약제학적으로 사용될 수 있는 제제로 가공하는 것을 용이하게 하는 부형제 및 보조제를 포함하는 1종 이상의 약리학적으로 허용 가능한 담체를 사용하여 종래의 방식으로 제형화된다. 일 실시형태에서, 제형은 선택된 투여 경로에 좌우된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 주사제는 수용액으로 제형화된다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 주사제는 생리학적으로 상용성인 완충제, 예컨대 행크 용액, 링거 용액 또는 생리학적 염 완충제 중에서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 경점막 투여를 위해서, 투과될 장벽에 적절한 침투제가 제형에서 사용된다. 그러한 침투제는 일반적으로 관련 기술 분야에 공지되어 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 제제는 예를 들어, 볼러스 주사 또는 연속적인 주입에 의해서 비경구 투여를 위해서 제형화된다. 일부 실시형태에서, 주사를 위한 제형은 임의로 첨가된 보존제와 함께 단위 투여 형태로, 예를 들어 엠플 내에 또는 다중용량 용기 내에 제공된다. 일부 실시형태에서, 조성물은 유성 또는 수성 비히클 중의 현탁액, 용액 또는 에멀젼이고, 제형화제(formulatory agent), 예컨대 현탁제, 안정제 및/또는 분산제를 함유한다.
조성물은 또한 일부 실시형태에서, 보존제, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드 및 티머로잘 등; 킬레이트제, 예컨대 에데테이트 나트륨 등; 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트; 긴장성 제제(tonicity agent), 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨 등; 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 아세틸시스틴, 소듐 메타바이설포트 등; 방향족 제제; 점도 조정제, 예컨대 셀룰로스 및 이의 유도체를 비롯한 중합체; 및 폴리비닐 알코올 및 필요에 따라서 이러한 수성 조성물의 pH를 조정하기 위한 산 및 염기를 포함한다. 조성물은 또한 일부 실시형태에서는 국소 마취제 또는 다른 활성제를 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 드롭 등으로서 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 비경구 투여를 위한 약제학적 조성물은 수용성 형태의 활성 제제의 수용액을 포함한다. 추가로, 활성 성분의 현탁액은 일부 실시형태에서는 적절한 유계 또는 수계 주사 현탁액으로서 제조된다. 적합한 친유성 용매 또는 비히클은 일부 실시형태에서 지방 오일, 예컨대 참깨유 또는 합성 지방산 에스터, 예컨대 에틸 올레에이트, 트라이글리세리드 또는 리포좀을 포함한다. 수성 주사 현탁액은 일부 실시형태에서, 현탁액의 점도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 함유한다. 또 다른 실시형태에서, 현탁액은 또한 적합한 안정제, 또는 활성 성분의 용해도를 증가시켜서 고도로 농축된 용액의 제조를 가능하게 하는 작용제를 함유한다.
또 다른 실시형태에서, 활성 화합물은 소포체(vesicle), 특히 리포좀으로 전달될 수 있다(문헌[Langer, Science 249:1527-1533 (1990)]; [Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer, Lopez-Berestein and Fidler (eds.), Liss, New York, pp. 353-365 (1989)]; [Lopez-Berestein, 상기 문헌, pp. 317-327] 참고; 일반적으로 상기 문헌 참고).
또 다른 실시형태에서, 제어되는 방출 시스템으로 전달되는 약제학적 조성물은 정맥내 주입, 이식 가능한 삼투 펌프, 경피 패치, 리포좀, 또는 다른 투여 모드를 위해서 제형화된다. 일 실시형태에서, 펌프가 사용된다(문헌[Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:201 (1987)]; [Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980)]; [Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321:574 (1989)] 참고). 또 다른 실시형태에서, 중합체 물질이 사용될 수 있다. 추가의 또 다른 실시형태에서, 제어되는 방출 시스템은 치료 표적, 즉 뇌에 인접하게 위치될 수 있어서, 단지 전신 용량의 분율이 필요하다(예를 들어, 문헌[Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984)] 참고). 다른 제어되는 방출 시스템은 랑거(Langer)(Science 249:1527-1533(1990))에 의한 검토서에서 논의된다.
일부 실시형태에서, 활성 성분은 적합한 비히클, 예를 들어 멸균의 무-발열성 수계 용액과의 구성을 위해서 사용 전에 분말 형태로 존재한다. 조성물은 일부 실시형태에서 분무화(atomization) 및 흡입 투여를 위해서 제형화된다. 또 다른 실시형태에서, 조성물은 부착된 분무화 수단을 갖는 용기 내에 함유된다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 제제는 예를 들어 좌약 베이스, 예컨대 코코아 버터 또는 다른 글리세리드를 사용하여 직장 조성물, 예컨대 좌약 또는 정체 관장약으로 제형화된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 맥락에서 사용하기에 적합한 약제학적 조성물은 활성 성분이 의도된 목적을 달성하는 유효량으로 함유된 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치료 유효량은 질병의 증상을 예방, 완화 또는 개선하거나, 치료될 대상체의 생존을 연장시키는 데 유효한 활성 성분의 양을 의미한다.
일 실시형태에서, 치료 유효량의 결정은 관련 기술 분야의 통상의 기술자의 능력 범위에 철저히 포함된다.
조성물은 또한 보존제, 예컨대 벤즈알코늄 클로라이드 및 티머로잘 등; 킬레이트제, 예컨대 에데테이트 나트륨 등; 완충제, 예컨대 포스페이트, 시트레이트 및 아세테이트; 긴장성 제제, 예컨대 염화나트륨, 염화칼륨, 글리세린, 만니톨 등; 항산화제, 예컨대 아스코르브산, 아세틸시스틴, 소듐 메타바이설포트 등; 방향족 제제; 점도 조정제, 예컨대 셀룰로스 및 이의 유도체를 비롯한 중합체; 및 폴리비닐 알코올 및 필요에 따라서 이러한 수성 조성물의 pH를 조정하기 위한 산 및 염기를 포함한다. 조성물은 또한 국소 마취제 또는 다른 활성제를 포함한다. 조성물은 스프레이, 미스트, 드롭 등으로서 사용될 수 있다.
약제학적으로-허용 가능한 담체 또는 이의 성분으로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예컨대 락토스, 글루코스 및 수크로스; 전분, 예컨대 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 이의 유도체, 예컨대 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스, 및 메틸 셀룰로스; 분말화된 트라칸스; 말트; 젤라틴; 탈크; 고체 윤활제, 예컨대 스테아르산 및 스테아르산 마그네슘; 황산칼슘; 식물유, 예컨대 땅콩유, 면실유, 참깨유, 올리브유, 옥수수유 및 테오브로마유; 폴리올, 예컨대 프로필렌 글리콜, 글리세린, 소르비톨, 만니톨, 및 폴리에틸렌 글리콜; 알긴산; 유화제, 예컨대 트윈(상표명) 브랜드 유화제; 습윤제, 그러한 소듐 라우릴 설페이트; 착색제; 향미제; 정제화제, 안정제; 항산화제; 보존제; 무-발열성 물; 등장성 염수; 및 포스페이트 완충 용액이다. 화합물과 함께 사용될 약제학적으로-허용 가능한 담체의 선택은 화합물이 투여되려는 방식에 의해서 기본적으로 결정된다. 대상 화합물이 주사되려는 경우, 일 실시형태에서, 약제학적으로-허용 가능한 담체는 pH가 약 7.4로 조정된, 혈액-상용성 현탁제를 갖는 멸균된 생리학적 염수이다.
또한, 조성물은 결합제(예를 들어 아카시아, 옥수수 전분, 젤라틴, 카보머, 에틸 셀룰로스, 구아 검, 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이드록시프로필 메틸 셀룰로스, 포비돈), 붕해제(예를 들어 옥수수 전분, 감자 전분, 알긴산, 이산화규소, 크로스카멜로스 소듐, 크로스포비돈, 구아 검, 소듐 전분 글리콜레이트), 다양한 pH 및 이온 농도의 완충제(예를 들어, 트리스-HCl., 아세테이트, 포스페이트), 첨가제, 예컨대 표면에 대한 흡수를 방지하기 위한 알부민 또는 젤라틴, 세제(예를 들어, 트윈 20, 트윈 80, 플루로닉(Pluronic) F68, 담즙산 염), 프로테아제 저해제, 계면활성제(예를 들어 소듐 라우릴 설페이트), 투과 증진제, 가용화제(예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제(예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트, 부틸화 하이드록시아니솔), 안정제(예를 들어 하이드록시프로필 셀룰로스, 하이록시프로필메틸 셀룰로스), 점도 증가제(예를 들어 카보머, 콜로이드성 이산화규소, 에틸 셀룰로스, 구아 검), 감미제(예를 들어 아스파탐, 시트르산), 보존제(예를 들어, 티머로잘, 벤질 알코올, 파라벤), 윤활제(예를 들어 스테아르산, 스테아르산 마그네슘, 폴리에틸렌 글리콜, 소듐 라우릴 설페이트), 유동-보조제(예를 들어 콜로이드성 이산화규소), 가소제(예를 들어 다이에틸 프탈레이트, 트라이에틸 시트레이트), 유화제(예를 들어 카보머, 하이드록시프로필 셀룰로스, 소듐 라우릴 설페이트), 중합체 코팅(예를 들어, 폴록사머 또는 폴록사민), 코팅 및 막 형성제(예를 들어 에틸 셀룰로스, 아크릴레이트, 폴리메타크릴레이트) 및/또는 아주반트를 추가로 포함한다.
시럽, 엘릭시르, 에멀젼 및 현탁액을 위한 담체의 전형적인 성분은 에탄올, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 액체 수크로스, 소르비톨 및 물을 포함한다. 현탁액의 경우, 전형적인 현탁제는 메틸 셀룰로스, 소듐 카복시메틸 셀룰로스, 셀룰로스(예를 들어 아비셀(Avicel)(상표명), RC-591), 트라칸스 및 알긴산 나트륨을 포함하고; 전형적인 습윤제는 레시틴 및 폴리에틸렌 옥시드 소르비탄(예를 들어, 폴리소르베이트 80)을 포함한다. 전형적인 보존제는 메틸 파라벤 및 벤조산 나트륨을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 경구 액체 조성물은 또한 상기에 개시된 1종 이상의 성분, 예컨대 감미제, 향미제 및 착색제를 함유한다.
조성물은 또한 활성 물질을 중합체 화합물, 예컨대 폴리락트산, 폴리글리콜산, 하이드로겔 등의 미립자 제제 내에 또는 그 상에, 또는 리포좀, 마이크로에멀젼, 미셀, 단층 또는 다층 소포체, 파열 적혈구(erythrocyte ghost), 또는 스페로플라스트(spheroplast) 상에 도입하는 것을 포함한다. 그러한 조성물은 물리적인 상태, 용해도, 안정성, 생채내 방출율 및 생채내 클리어런스율에 영향을 미칠 것이다.
또 다른 실시형태에서, 조성물은 중합체(예를 들어, 폴록사머 또는 폴록사민) 및 조직-특이적인 수용체, 리간드 또는 항원에 대해서 유도되는 항체에 커플링되거나 조직-특이적인 수용체의 리간드에 커플링된 화합물로 코팅된 미립자 조성물을 포함한다.
일부 실시형태에서, 화합물은 수용성 중합체, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카복시메틸 셀룰로스, 덱스트란, 폴리바이닐 알코올, 폴리바이닐피롤리돈 또는 폴리프롤린의 공유 부착에 의해서 변형된다. 또 다른 실시형태에서, 변형된 화합물은 상응하는 비변형된 화합물보다 정맥내 주사 이후에 혈액에서 실질적으로 더 긴 반감기를 나타낸다. 일 실시형태에서, 변형은 또한 수용액 중에서 화합물의 용해도를 증가시키고, 응집을 제거하고, 화합물의 물리적 및 화학적 안정성을 향상시키고, 화합물의 면역원성 및 반응성을 상당히 감소시킨다. 또 다른 실시형태에서, 목적하는 생체내 생물학적 활성은 비변형된 화합물을 사용한 것보다 덜 빈번하거나 더 낮은 용량으로 이러한 중합체-화합물 외전물(abduct)을 투여함으로써 달성된다.
일부 실시형태에서, 제제의 유효량 또는 용량은 시험관내 검정법으로부터 먼저 설정될 수 있다. 일 실시형태에서, 용량은 동물 모델에서 제형화될 수 있고, 그러한 정보를 사용하여 인간에서 유용한 용량을 보다 정확하게 결정할 수 있다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 활성 성분의 독성 및 치료 효능은 세포 배양 또는 실험 동물에서 시험관내 표준 약제학적 절차에 의해서 측정될 수 있다. 일 실시형태에서, 이러한 시험관내 및 세포 배양 검정법 및 동물 연구로부터 수득된 데이터를 사용하여 인간에서 사용하기 위한 투여량 범위를 제형화할 수 있다. 일 실시형태에서, 투여량은 사용되는 투여 형태 및 사용되는 투여 경로에 따라서 달라진다. 일 실시형태에서, 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자의 병태를 고려하여 개별 의사에 의해서 선택될 수 있다[예를 들어, 문헌[Fingl, et al., (1975) "The Pharmacological Basis of Therapeutics", Ch. 1 p.1] 참고].
일 실시형태에서, 치료될 병태의 중등도 및 반응성에 따라서, 투여는 수일에서 수주일까지 지속되는 치료 과정으로, 또는 치유가 달성되거나 질병 상태의 감소가 달성될 때까지 단일 또는 복수의 투여로 이루어질 수 있다.
일 실시형태에서, 투여될 조성물의 양은 물론 치료될 대상체, 침범의 중증도, 투여 방식, 처방 의사의 판단 등에 좌우될 것이다.
일 실시형태에서, 상용성 약제학적 담체 중에서 제형화된 본 명세서에 개시된 제제를 포함하는 조성물이 또한 제조되고, 적절한 용기에 위치되고, 지시된 병태의 치료에 대해서 레이블링된다.
또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 전신 투여를 통해서 투여된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서 기술된 CTP-변형된 hGH는 정맥내, 근육내 또는 피하 주사에 의해서 투여된다. 또 다른 실시형태에서, CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 복잡한 유기 부형제 및 안정제, 예컨대 비이온성 표면 활성제(즉, 계면활성제), 다양한 당, 유기 폴리올 및/또는 인간 혈청 알부민과 조합된 동결건조(즉, 냉동-건조)된 제제이다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사를 위해서 멸균수 중에 기술된 바와 같은 동결건조된 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사를 위해서 멸균 PBS 중에 본 명세서에 기술된 동결건조된 CTP-변형된 hGH를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 주사를 위해서 멸균 0.9% NaCl 중에 본 명세서에 기술된 동결건조된 CTP-변형된 hGH를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH 및 복잡한 담체, 예컨대 인간 혈청 알부민, 폴리올, 당 및 음이온성 표면 활성 안정제를 포함한다. 예를 들어, WO 89/10756(하라(Hara) 등- 폴리올 및 p-하이드록시벤조에이트를 함유함)을 참고한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP-변형된 hGH 및 락토바이온산 및 아세테이트/글리신 완충제를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 동결건조된 GH 및 글리신 또는 인간 혈청 알부민(HSA), 완충제(예를 들어, 아세테이트) 및 등장제(예를 들어, NaCl)를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서에 기술된 바와 같은 동결건조된 CTP에 의해서 변형된 GH 및 포스페이트 완충제, 글리신 및 HSA를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은, 약 4 내지 7.2의 pH를 갖는 완충된 용액 중에 놓이는 경우 안정화된다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 안정제로서 아미노산, 일부 경우에, 염(아미노산이 하전된 측쇄를 함유하지 않은 경우)을 사용하여 안정화된다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 아미노산인 0.3중량% 내지 5중량%의 안정제를 포함하는 액체 조성물이다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 정확성 및 생산물 안정성을 제공한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 주사 가능한 응용에서 사용하기 위해서 생물학적으로 활성인 안정한 액체 제형을 제공한다. 일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 비-점성 액체 제형을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 약제학적 조성물은 본 명세서 기술된 바와 같은 동결건조되지 않은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 투여 이전에 저장 및 운송을 용이하게 하는 액체 상태로 장기간 동안 저장하는 것을 허용하는 액체 제형을 제공한다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 매트릭스 물질로서 고체 지질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 주사 가능한 약제학적 조성물은 매트릭스 물질로서 고체 지질을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 분무 응고화(spray congealing)에 의해서 지질 미세입자를 생산하는 것은 스파이저(Speiser)(Speiser and al., Pharm. Res. 8(1991) 47-54)에 의해서 기술되었고, 이어서 경구 투여를 위한 지질 나노펠렛으로 제조되었다(스파이저 EP 0167825(1990)). 또 다른 실시형태에서, 사용되는 지질은 신체에서 상당히 용인되는 것이다(예를 들어, 비경구 영양 공급을 위한 에멀젼으로 존재하는 지방산으로 구성된 글리세리드).
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀의 형태로 존재한다(J. E. Diederichs and al., Pharm./nd. 56 (1994) 267-275).
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 중합체 미세입자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 주사 가능한 약제학적 조성물은 중합체 미세입자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 나노입자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 리포좀을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 지질 에멀젼을 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 미소구체를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 양친매성 지질을 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 기술된 바와 같은 CTP에 의해서 변형된 GH를 포함하는 약제학적 조성물은 약물, 지질 매트릭스 및 계면활성제를 포함하는 지질 나노입자를 포함한다. 또 다른 실시형태에서, 지질 매트릭스는 적어도 50% w/w인 모노글리세리드 함량을 갖는다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 활성 성분을 함유하는 하나 이상의 단위 투여 형태를 함유하는, 팩 또는 디스펜서 장치, 예컨대 FDA 승인 키트로 제공된다. 일 실시형태에서, 팩은 예를 들어, 금속 또는 플라스틱 포일, 예컨대 블리스터 팩을 포함한다. 일 실시형태에서, 팩 또는 디스펜서 장치는 투여를 위한 지침서가 동반된다. 일 실시형태에서, 팩 또는 디스펜서는 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해서 규정된 형태로 용기에 관련된 통지가 동봉되고, 통지는 조성물의 형태 또는 인간 또는 동물 투여의 정부 기관에 의한 승인을 반영한다. 그러한 통지는 일 실시형태에서, 처방 약물에 대해서 미국 식품의약국에 의해서 승인된 레이블링 또는 승인된 제품 삽입물이다.
일 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 CTP에 의해서 변형된 GH는 각각의 작용제 자체로의 치료에 비해서 개선된 치료 효과를 달성하도록 추가적인 활성제와 함께 개체에게 제공될 수 있다는 것을 인지할 것이다. 또 다른 실시형태에서, 측정치(예를 들어, 상보적 작용제의 투여 및 선택)는 조합 요법과 관련된 유해한 부작용을 최소화하도록 취해진다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에는 본 명세서에 개시된 조성물, 세포, 플라스미드 등, 및 적용기, 및 본 명세서에 개시된 방법의 사용을 기술한 지침서를 포함하는 키트가 개시되어 있다. 모델 키트가 하기에 기술되어 있지만, 다른 유용한 키트의 내용물은 본 개시 내용에 비추어 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 이들 키트 각각은 본 명세서에 개시된 별개의 실시형태를 대표한다.
본 명세서에 개시된 추가 목적, 이점 및 신규 특징부는 제한임을 의도하지 않는 하기 실시예를 검토할 때 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이다. 추가로, 상기 본 명세서에 기술된 바와 같고 하기 청구범위 부분에 청구된 바와 같은 본 명세서에 개시된 다양한 실시형태 및 양상 각각은 하기 실시예에서 실험적인 지지를 발견한다.
실시예
실시예 1
hGH 구축물의 생산
MOD-4023(CTP-hGH-CTP-CTP)의 발현
세포 형질감염( 뉴클레오펙션 ( nucleofection )): MOD-4023 유전자를 표적 세포의 염색체 내로 통합시킴으로써 안정한 발현을 달성하였다: 먼저 유전자를 세포 내로, 이어서 핵 내로 도입하고, 마지막으로 그것을 염색체 DNA 내로 통합시켰다. 유전자 전달 후에, 세포를 선택 마커, 예컨대 다이하이드로폴레이트 리덕타제(DHFR)를 함유하는 배지 중에서 배양하였다. 간략:
pSV2-dhfr 플라스미드로부터의 뮤린 다이하이드로폴레이트 리덕타제(dhfr) 유전자를 pCI-neo 플라스미드 상의 네오마이신 부위 내로 서브클로닝하였다. 변형된 발현 벡터, pCI-dhfr를 생성하기 위함(도 2). 따라서, MOD-4023 발현 벡터는 거대세포바이러스(CMV) IE(급초기(immediate-early)) 인핸서/프로모터 및 세포 선택을 위한 dhfr 유전자를 함유한다. MOD-4023 유전자는 hGH 유전자의 5' 단부에서 시작하는 C-말단 펩타이드(CTP)에 대한 코딩 서열의 하나의 복사체 및 hGH 유전자의 3' 단부 직후의 CTP 코딩 서열의 2개의 복사체를 포함한다. MOD-4023 유전자를 pCI-dhfr의 오픈 리딩 프레임으로 서브클로닝하였다(도 2). 따라서, MOD-4023 발현 카세트는 CMV 프로모터, CTP-hGH-CTP-CTP 유전자 서열, 및 SV40 폴리아데닐화 서열로 구성된다.
클론 선택 - 96-웰 플레이트에 플레이팅함으로써의 단일 세포의 희석을 제한함. 단일 세포 배양에 선택을 적용하였고, 선택을 수회 반복하여 100% 클론 순도를 수득하였다. 성장 곡선, 클론 특징분석, 특이적인 생산성 및 단백질 프로파일을 기초로 최대 생산 클론을 생물반응기에서 접종하기 전에 1L 진탕 플라스크에서 번식시켰다. 간략:
재조합 DNA 기술에 의해서 MOD-4023 단백질-생산 세포계를 제조하였다. 동물 성분-무함유 배지를 마스터 세포 은행 및 제조용 세포 은행(MCB; WCB)의 유도 전체에서 사용하였다. FuGENE-6(로슈 어플라이드 사이언스(Roche Applied Science))을 사용하여 무-단백질 배지 및 현탁액 성장으로 개작된 dhfr-음성 CD DG44 세포(CHO 세포)의 형질감염을 수행하였다. 세포 배양액 중에서 희석 단계를 제한함으로써 안정한 클론을 단리하였다. 메토트렉세이트(MTX)의 농도를 증가시키면서 최대 생산 클론을 증폭시켰다. 선택된 배지 중에서의 클론 집단 배가수(population doubling level: PDL), MOD-4023 생산성(피코그램/세포/일수, PCD), 및 최대 달성된 세포 밀도를 기초로, 최대 생산 클론을 단리하고, 그것을 사용하여 R&D 뱅크를 제조하고, 그 다음 적격 마스터 세포 은행(MCB) 및 제조용 세포 은행(WCB)을 제조하였다.
상류 공정
MOD-4023의 상류 공정은 2가지 유형의 배지 제형으로 이루어졌다; 성장 배지(배지 1) 및 생산 배지(배지 2). 배지 1은 메토트렉세이트(MTX)를 포함하였고, 배지 2는 MTX를 제외하고는 배지 1과 동일하였다. 200리터 생물반응기에 시딩하기 전에 배지 1을 세포 배양 증식(도 3의 단계 1 내지 단계 4)을 위해서 사용하였고, 배지 2를 N-2 단계(최종 생산물 이전의 2회의 증식. N은 최종 생산물을 지칭함), 200리터 생물반응기(도 3의 단계 5 내지 단계 6) 및 생산 생물반응기 1000리터(도 3의 단계 7)에서 사용하였다.
제조 공정: MOD-4023
클론 #28을 무-혈청 배양 배지 중에서 1000-리터(L) 규모로 제조하였다. CHO 세포계의 배양액을 몇몇 단계로 제조용 세포 은행(WCB)의 단일 바이알로부터 최종 생산 배양 부피로 확장시켰다. 생산 세포 배양 상청액을 생균수, 박테리아 엔도톡신, 생산성 및 외래성 바이러스에 대해서 시험하였다. 50리터 및 200리터 시딩 생물반응기 및 규모 확장을 위해서 1000-L 생물반응기를 사용하여 공정을 수행하였다. 모든 생산물 접촉 표면은 일회용이지만, 비-일회용 생산물 접촉 장비는 생산물 전용이다. 이러한 장비 부품을 세척하고, 배취 사이에서 살균하였다. 배양액을 50-L 및 200-L 시딩 생물반응기로 확장시키고 그 후에서 규모 확대를 위해서 1000-L 생물반응기에서 접종하였다. 최종 규모 확장 및 회분식 생물반응기 생산을 일회용 생물반응기 1000L에서 수행하였다. 일회용 필터 시스템(밀리포어 심층 필터(Millipore depth filter))을 사용하여 세포의 제거를 달성하였다.
WCB의 1개 또는 2개의 바이알을 37℃에서 해동시켰다. 세포를 원심분리하고, 세포 펠렛을 10㎖의 신선한 배지를 사용하여 저부피 진탕 플라스크에서 표적 농도로 재현탁시키고, 37±0.5℃, 5±1% CO2에서 인큐베이팅시켰다. 제2 계대배양 후, 더 높은 생존력을 갖는 세포 배양액을 추가로 확장시켰고; 나머지 세포 배양액을 제거하였다. 미리 규정된 단계 파라미터, 예컨대 시딩 농도 및 작업 부피를 사용하여 부피를 증가시키면서 진탕 플라스크에서 4회의 계대배양 단계를 수행하였다. 부피는 전형적인 1000L 생물반응기 실시에 대한 2회의 시딩 생물반응기 단계를 따랐다.
50리터 및 200리터 시드 생물반응기를 시딩 생물반응기로서 사용하였다. 접종 전에, 200L 생물반응기에 대략 50L 파워CHO 2CD 배지 2(w/o MTX)를 채웠다. 공정 제어를 하기와 같은 파라미터로 설정하였다: pH 7, 온도 37℃, DO 50%. 이러한 파라미터를 배지 사전-컨디셔닝 및 시드 트레인 배양 공정에 적용한다.
공정 파라미터가 이의 미리-규정된 범위 내에서 제어되면, 접종물 전달을 시작하였다. 50L 및 200L 시드 생물반응기에서의 세포 물질 확장 동안, 공정에 어떤 공급물 부가도 적용하지 않았다. 시드 생물반응기에서 예상되는 배양 시간은 3 내지 4일이었고, 그 후에 세포를 1000L 생산 생물반응기에 전달하였다. 공정 제어(IPC)를 위한 샘플을 1일 기준으로 취하였다.
생산 1000 L 생물반응기에서의 세포 증식(도 3의 단계 7)
배양액을 37℃, 20% 용존 산소(DO) 및 pH 7.2에서 11일 동안(세포의 생존력에 좌우됨) 생물 반응기에서 인큐베이션시켰다. 제3일에, 수확할 때까지 pH가 6.9로 이동된다. 제4일에, 공급물(지질이 없는 파워 피드 A)을 첨가한다. 공급물 부피는 최종 생물반응기 부피의 33%이다. 제6일에, DMSO를 생물반응기에 첨가한다. 목적하는 농도를 유지시키기 위해서 글루코스 공급 용액을 배양액에 첨가하였고, 목적하는 배양액 농도(HCO3)를 유지시키기 위해서 중탄산나트륨 1M의 볼러스를 첨가하였다. 미리 규정된 기준을 사용하여 수확을 수행하였다. 첫번째 4일 동안, 세포 배양액을 세포수, 생존력 및 대사 분석을 위해서 매일 샘플링하였다. 5일부터는, 배양액을 세포수, 생존력 및 대사 분석을 위해서 1일에 2회 샘플링하였고, 9일부터는, 역상 HPLC에 의해서 특이적인 생산성을 위해서 샘플링하였다. MOD-4023의 생산성은 적어도 500gr/L였고, 고 글리코실화된 형태는 수확물 중의 총 hGH-CTP 단백질의 적어도 70%로 이루어진다.
본 명세서에 제공된 실시예는 회분식 모드를 사용한 제조를 나타내지만, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 일반적으로 유사한 정제 도식을 사용하는 관류 모드를 발전시킬 수 있다. 대안적으로, 관련 기술 분야의 통상의 기술자는 인큐베이션 기간이 심지어는 7 내지 120일까지일 수 있는 관류 방법을 발전시킬 수 있다.
세포 수확 및 저장(도 3의 단계 8)
일회용 여과 공정 트레인을 사용하여 수확을 수행하였다. 수확물을 정화하기 위해서, 심층 여과 및 0.2μm 여과를 수행하였다. 정화에 이어서 0.45/0.2μm 여과를 수행하였다. 심층 필터를 플러싱하고, 잔류하는 액체를 공기를 사용하여 시스템으로부터 배출시켰다. ≤ 15L/min의 펌프 속도 및 최대 규정된 압력을 사용하여 여과 공정을 수행하였다. 그 후에 필터를 트리스-HCl 완충제로 세척하고, 가압 공기를 사용하여 배출시켜 생산물 회수를 증가시켰다.
정화된 수확물을 RP-HPLC, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯, HPC 엘라이사(Elisa) 검정법, 잔류 DNA, 시험관내 바이러스 검정법, 바이러스-유사 입자, S+L- 및 마이코플라즈마에 의해서 생균수, 박테리아 엔도톡신, 특이적인 단백질 함량에 대해서 시험하였다.
정제 공정
정제 도식을 도 4에 기술한다.
한외여과 및 투석여과 1 - UFDF1(단계 8)
정화된 수확물을 농축하고, 중공 섬유 카트리지, 또는 동등한 TFF계 UFDF 단계를 사용하여 투석여과하였다. 카트리지 공칭 분자량 컷오프 크기는 10,000kDa이었다. 농축 및 투석여과된 수확물을 RP-HPLC 및 HCP 엘라이사에 의해서 특이적인 단백질 함량에 대해서 시험하였다.
1% 트리톤-X100과의 인큐베이션에 의한 바이러스 불활성화(단계 9)
물질을 밀리포어 1.55㎡ 필터, 이어서 멸균 사토포어(Sartopore) 2 XLG 10"필터를 통해서 멸균 혼합 백으로 여과하였다(심층 여과 단계). 다음으로, 트리스 / 10% 트리톤 용액을 최종 여과액 부피에 첨가하여, 트리톤 농도 1%(w/w)를 만들었다. 인큐베이션 후, DEAE 칼럼에 로딩하기 전에, 생산물 용액을 0.2μm 필터 유닛으로 여과하였다.
DEAE-세파로스 패스트 플로우 크로마토그래피(단계 10)
DEAE 세파로스 수지로 패킹된 DEAE 칼럼을 이 단계를 위해서 사용하였다. 칼럼을 미리 규정된 층 높이로 패킹하였다. 검정법에서 트리톤에 의해서 유발되는 간섭으로 인해서 트리톤을 첨가하기 전에 로딩물 중의 특이적인 단백질을 측정하였다. DEAE 칼럼을 평형화하고, 바이러스 불활성화 풀로 로딩하고, 이어서 세척하였다. 제2 세척을 수행하였고, 물질을 20mM 트리스-HCl/150mM NaCl pH 8.2로 용리하고, 이어서 다음날 가공하기 위해서 주변 온도(18 내지 26℃)에서 또는 더 긴 시간 동안 2 내지 8℃에서 저장하였다. 모든 크로마토그래피 단계는 하향 유동 모드(down flow mode)로 수행하였다. 대안적으로, 단계를 상향 유동 모드(upflow mode)로 수행할 수 있다. 용리액을 RP-HPLC(표적: 주피크는 단일 피크로서 용리), HCP 엘라이사, SDS-PAGE, 웨스턴 블롯 및 잔류 DNA에 의해서 특이적인 단백질에 대해서 시험하였다.
페닐 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 칼럼 크로마토그래피(단계 11)
AHIC 페닐 수지를 이 단계를 위해서 사용하였다. 칼럼은 미리 규정된 층 길이로 패킹된 칼럼이다. 생산물 품질에 따라서 HIC 크로마토그래피를 1 내지 5회 사이클 동안 수행하였다. 대안적으로, 최대 10회 사이클을 수행할 수 있었다. DEAE 용리액을 황산암모늄을 사용하여 조정함으로써 HIC 로딩물을 제조하였다. 칼럼을 평형화하고, 조정 및 0.2μm 여과된 DEAE 용리액으로 로딩하고, 이어서 프로필렌 글리콜을 함유하는 10mM 인산 나트륨/600mM 황산암모늄(pH 7.3)으로 세척하였다. 물질을 황산암모늄 농도를 감소시키고, 프로필렌 글리콜 농도를 증가시키면서 pH 7.3에서 용리하고, 이어서 추가로 가공할 때까지 2 내지 8℃에서 저장하였다.
HIC 용리액 한외여과 및 투석여과 2(단계 12)
HIC 용리액을 농축하고, 10mM 인산 나트륨 pH 6.8 완충제로 투석여과하여 부피를 감소시키고, CHT 칼럼 단계를 위한 물질을 제조하였다. 카트리지를 10mM 인산 나트륨 pH 6.8로 평형화하였다. HIC 용리액을 농축하고, 인산 나트륨 완충제에 대해서 투석여과하여 6.8 ± 0.1의 pH 및 투석여과 완충제의 전도도의 10% 이내인 전도도를 달성하였다. pH 및 전도도가 이러한 범위 이내인 것으로 측정되면, 시스템을 배출시키고, 멸균 백으로 0.45/0.2μm 여과하였다. 농축 및 투석여과된 HIC 용리액의 최종 부피를 주변 실온(18 내지 26℃)에서 밤새 저장하였다. 잔류물(retentate)을 A280에 의해서 생균수, 박테리아 엔도톡신 및 특이적인 단백질에 대해서 시험하였다.
세라믹 수산화인회석(CHT) 혼합-모드 크로마토그래피(단계 13)
수산화인회석 수지로 패킹된 CHT 칼럼을 이 단계를 위해서 사용하였다. 칼럼은 미리 규정된 층 길이로 패킹된 칼럼이다. 칼럼을 인산 나트륨, pH 6.8을 사용하여 평형화하고, 농축 및 투석여과된 HIC 용리액으로 로딩하고, 4 칼럼 부피(CV)의 인산 나트륨, pH 6.8로 세척하였다. 통과 및 세척 물질을 수집하고, 추가로 가공할 때까지 주변 온도(18 내지 26℃)에서 밤새 유지시켰다.
SP-세파로스 크로마토그래피(단계 14)
SP 세파로스 수지로 패킹된 칼럼을 이 단계를 위해서 사용하였다. 칼럼은 미리 규정된 층 길이로 패킹된 칼럼이었다. CHT 통과 분획을 시트르산을 사용하여 pH 5.0 내지 6.0으로 조정함으로써 SP 로딩물을 제조하였다. pH 조정 이후에 용액을 칼럼 상에 로딩하고, 이어서 세척 단계를 수행하였다. 통과물을 추가 가공을 위해서 수집하였다. pH를 0.1M 염화나트륨을 사용하여 pH 6.0 내지 6.5로 조정하고, 물질을 0.45/0.2μm 필터를 통해서 여과하였다. 물질을 주변 온도(18 내지 26℃)에서 밤새 저장하거나 또는 2 내지 8℃에서 24시간까지 저장하였다. 모든 크로마토그래피 단계는 하향 유동 모드로 수행하였다.
나노여과에 의한 바이러스 불활성화(단계 15)
아사히 플라노바 20N 바이러스 필터를 사용하여 바이러스 여과를 수행하였다. 0.45 / 0.2μm 또는 0.1μm 막을 갖는 사토포어 2 필터를 나노필터의 사전필터로서 사용하였다. 바이러스 필터를 미리 평형화하고, WFI로 제조된 최종 제형으로 프라이밍(primming)하였다. 조정된 SP-플로우-쓰루(SP-Flow-Through)를 지속적인 압력에서 필터 트레인을 통해서 통과시키고, 멸균 생물공정 백에 수집하였다. 필터 트레인을 제형화 완충제로 플러싱하여 생산물 회수를 최대화하였다. 필터를 제조사의 제안된 절차에 따라서 사용 전 및 후에 온전성 시험하였다. 사용 후 시험은 또한 제조사의 절차에 따른 금-입자 시험을 포함한다.
약물 물질의 UFDF3 및 여과 및 저장(단계 16)
바이러스 여과액을 벌크 여과 및 충전을 위한 준비로 표적 최종 DS 농도(이것은 5 내지 100㎎/㎖에서 달라질 수 있음)로 농축하였다. 3 내지 30KDa의 컷-오프를 갖는 1회 사용 또는 재사용 가능 카세트를 이 단계를 위해서 사용하였다. 생산물을 제1 단계에서 5 내지 25㎎/㎖로 농축하였고, 10mM 시트레이트, 147mM NaCl pH 6.4(≥7 DF 부피)로 투석여과하였다. 대안적으로, 생산물을 제1 단계에서 5 내지 25㎎/㎖로 농축하였고, 장치에 의한 반복적인 투여를 지원하기 위한 보존제, 구체적으로 0.3% m-크레졸을 포함하는 10 mM 시트레이트 히스티딘 완충제로 투석여과하였고, 또한 P-188을 0.2%로 첨가하여 응집물 및 가시적이지 않은 입자를 감소시켰다. 최종 생산물 농도를 조정하였고, 밀리팩(Millipak) 100 필터로 여과하였다. 여과된 생산물 용액을 분취하고, -70 ± 5℃의 온도에서 동결시켰다.
MOD-4023 약물 제품 제조
약물 제품(DP)의 제형화 공정을 MOD-4023 DS의 해동으로 시작한다. 약물 물질(DS)을 제형화 완충제를 사용하여 필요한 농도로 희석하고, 무균 여과하고, 표준 2R 바이알 또는 다른 1차 패키징, 예컨대 카트리지 또는 프리-필드 주사기에 충전함으로써 약물 제품을 달성하였다. 특정 공정의 설명을 도 5에 도시한다.
MOD-4023의 특징 분석
수확물 중의 MOD-4023 함량 및 고 글리코실화된 형태의 백분율을 특이적인 RP-HPLC 방법에 의해서 측정하였다. 수확물 중의 전체 단백질을 브라포드(Bradford) 분석법에 의해서 측정하였다. 클론 #28에 의해서 생산된 수확물 중의 특이적인 MOD-4023 단백질 백분율은 수확물 중의 전체 단백질에 대해서 70%를 초과하였다. 특이적인 단백질의 이러한 독특한 높은 수준은 또한 SDS-PAGE 쿠마시 염색에 의해서 분석된 수확물 및 UFDF 샘플 중의 추가적인 숙주 세포 단백질 밴드의 강도와 비교하는 경우 고도로 글리코실화된 MOD-4023 밴드 및 낮게 글리코실화된 MOD-4023 밴드의 강한 강도에 의해서 관찰될 수 있다(도 6). 또한, MOD-4023 제조 상류 공정은 낮게 글리코실화된 형태에 비해서 높은 백분율의 고도로 글리코실화된 MOD-4023 단백질을 가능하게 하도록 발전되었다. 고도로 글리코실화된 형태가 표적 MOD-4023 형태인데, 그 이유는 그것이 GH 반감기를 더 길게 연장하기 때문이다.
O-글리칸 함량
MOD-4023 글리칸을 방출시키고, 이어서 글리칸을 2-아미노벤즈아마이드(2AB)로 표지하고, NP-HPLC에 의해서 세정 및 분석함으로써 글리코프로파일링(glycoprofiling)을 수행하였다. 간략
O-글리칸 함량 검정법을 수행하여 MOD-4023 단백질 몰 당 O-글리칸의 몰수를 계산하였다. O-글리칸의 말단 갈락토스 단위를 β-갈락토시다제에 의해서 단백질로부터 효소에 의해서 절단하였다. 이러한 유리 갈락토스 단위를 카보팩(CarboPac) PA20-칼럼 상에서 분리하고, 펄스형 암페로메트리(pulsed amperometry)를 사용하여 검출하였다. 갈락토스 표준품을 사용한 외부 교정을 사용하여 갈락토스(Gal)를 정량분석하였다. 갈락토스의 함량은 O-글리칸 구조물, Gal-GalNAc의 함량에 직접적으로 관련될 수 있다. 시알산(SA) 함량이 약물 물질(DS) 중에서 측정되는데, 이것은 최종 약물 제품(DP)의 SA 함량과 상이하지 않아야 한다. DS 및 DP 둘 모두를 사용하여 CTP-변형된 hGH의 SA 및 O-글리칸의 수준을 나타낼 수 있다. 도 7에 도시된 5종의 상이한 MOD-4023 약물 물질 및 약물 제품 배취의 분석은 강력한 배취 대 배취 일관성을 예증한다. 이러한 예상치 못한 강력한 글리코실화 함량은 중요한데, 이는 CTP-hGH-CTP-CTP에서 CTP 당 O-글리칸의 수가 관련 기술 분야에 공지된 것에 비해서 개선되었음을 나타낸다. 본 명세서에서 제조된 CTP-hGH-CTP-CTP는 CTP 당 4 내지 6개의 O-글리칸을 갖는데, 이것은 hCG가 단지 4개의 O-글리칸을 갖는 관련 기술 분야에 공지된 수준과 비교된다.
MOD-4023 샘플의 무손상(intact) 분자량 분석
O-연결된 글리코실화 부위의 수에 대한 정보를 얻기 위한 목적으로 4개의 상이한 MOD-4023 DS 배취의 분자량 분석을 수행하였다. (실시예 3에서의 상세한 결과 참고). 무손상 MOD-4023 샘플, 뿐만 아니라, 뉴람니다제(Neuramnidase)를 사용하여 탈-시알릴화된 MOD-4023 샘플, 및 O-글리코시다제를 사용하여 탈-O-글리코실화된 샘플을 온-라인 LC/ES-MS에 의해서 분석하였다. 탈-시알릴화된 샘플의 무손상 질량 측정으로부터 수득된 데이터는, 단백질이 GalNac-Gal의 12 내지 18개의 글리코실화 부위로 변형되고, 15개의 글리코실화 부위로 변형된 단백질이 가장 높은 강도임을 제안하였다. 높은 %의 세린 점유를 나타내는 이러한 결과는 관련 기술 분야에 공지된 수준과 비교하여 예상치 못한 것이었다(본 명세서에서 제조된 CTP-변형된 hGH에서 최대 6개와 비교하여 단지 4개의 세린이 글리코실화됨).
MOD-4023 단백질 샘플의 O-연결된 글리코실화 부위 점유
MOD-4023 분자 당 O-연결된 글리코실화 부위의 수에 대한 정보를 얻기 위한 목적으로 4개의 상이한 MOD-4023 DS 배취의 O-글리코실화 부위 점유를 수행하였다. MOD-4023 샘플을 뉴람니다제를 사용하여 탈-시알릴화하고, 이어서 환원된/카복시메틸화된 MOD-4023 샘플을 트립신에 의해서 소화시켰다. 마지막으로, 처리된 샘플에 대해서 온 라인 LC/ES-MS를 수행하였고, 지정된 소프트웨어를 사용하여 MS 데이터의 해석을 수행하였다. 트립신에 의한 소화물 혼합물의 분석으로부터 입수된 데이터의 평가는 단백질 서열의 100%가 맵핑되는 것을 허용하는 신호를 생성하였다. O-글리코실화는 N-말단 및 C-말단 CTP 영역 둘 모두에서 일어난다. 점유 부위는 프롤린 뒤에 존재하는 세린 잔기로서 식별되었고, 세린 반복부의 영역 내의 4개의 세린 중 2개로서 식별되었다. 총 18개까지의 세린 잔기가 O-글리칸을 위한 부착 부위로서 기능할 수 있다. 도 8에 제공된 바와 같이 배취들 간에는 어떤 유의한 차이도 검출되지 않았다.
MOD-4023 단백질 샘플의 O-연결된 글리코실화 부위 점유
MOD-4023(서열번호 7)은 N-말단에 하나의 CTP 및 C-말단에 탠덤(tandem)으로 2개의 CTP를 함유한다. O-연결된 글리코실화 분석은 각각의 CTP가 4 내지 6개의 O-연결된 글리칸을 함유하고, 모두는 세린(S) 잔기에 연결되었음을 보여주었다. 전체적으로, MOD-4023 당 12 내지 18개의 O-연결된 당쇄가 존재하고, 가장 빈번한 형태는 MOD-4023 당 15개의 O-글리칸을 함유하는 것이다. (하기 실시예 2 및 3의 결과 및 결론 참고). 어떤 당쇄도 GH 서열 상에 존재하지 않았다.
가이드로서 서열번호 7 아미노산 서열을 사용하는 경우, 부위 점유 분석의 결과는, O-글리코실화가 CTP 단위의 위치 10, 13, 15, 21에서의 세린 잔기에서 각각의 CTP 상에서 일어나는 것을 보여주었고, 이러한 위치는 제2 CTP 서열 상의 위치 229, 232, 234, 240, 및 제3 CTP 서열의 경우 257, 260,262 및 268에 상응한다. O-글리코실화 점유의 2개의 추가적인 부위가 식별되었는데, 이것은 N-말단 CTP의 세린 잔기 Ser1 내지 Ser 4 상에서 일어났다(제2 CTP 서열 상의 위치 220 내지 223 및 제3 CTP 서열의 경우 248 내지 251에 상응함). 그러나, 질량 분석법을 통해서는 4개의 세린 잔기 중 어떤 2개가 변형되었는지 측정할 수 없었다. O-글리칸 점유 및 구조의 상세사항은 하기 실시예 2에 제공한다.
O-글리칸 구조
주 O 글리칸 피크는 모노-시알릴화된 코어1(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc)에 상응하였다. 또한 소량의 중성 코어 1(Galβ1-3GalNAc), 모노-시알릴화된 코어 1(Neu5Acα2 내지 6(Galβ1-3)GalNAc) 및 다이-시알릴화된 코어 1(Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc)이 관찰되었다. 샘플에서 대부분의 시알산은 Neu5Ac(NANA)였다. O-연결된 글리칸 및 시알산 유형의 구조를 도 15a 및 도 15b에 각각 나타낸다.
MOD-4023 순도
RP-HPLC는 분자를 그의 극성에 따라서 분리한다. 더 극성인 용매로부터 덜 극성인 용매로의 이동상 구배를 사용하여 강한 극성을 갖는 분자를 덜 극성인 분자보다 빨리 용리하였다. RP-HPLC는 MOD-4023 약물 물질을 21.0 내지 25.0분에 관찰되는 주피크로 그리고 생산물-관련 변이체를 나타내는 부피크로 분리한다(도 9). 관련 형태는 220nm에서의 UV 검출을 사용하여 네이티브 단백질로부터 분리된다. 관련 형태와 주피크의 상대적인 피크 면적(면적%)은 상응하는 피크 면적을 적분함으로써 계산될 수 있다. MOD-4023 약물 물질 및 약물 제품의 주피크는 97%를 초과하는 피크 면적으로 이루어지고, 이는 고도로 정제된 생산물 및 효과적인 공정을 나타낸다(도 21 참고).
크기 배제 HPLC는 크기에 따라서 분자를 분리하는 크로마토그래피 기술이다. 선택된 분별 범위 내에서, 더 큰 분자가 더 작은 분자보다 먼저 용리된다. 분리 메커니즘은 비-흡착성이고, 분자는 등용매(isocratic) 조건하에서 용리된다. SE-HPLC는 단량체가 표적 분자의 더 큰 분자량 형태(예컨대 이량체 및 중합체)로부터 분리되게 한다. SEC 방법을 발전시켜서 약물 물질 및 약물 제품 중의 MOD-4023 이량체 및 중합체의 함량을 분석하였다(도 10). MOD-4023 단량체는 98% 초과의 피크 면적으로 이루어지는데, 이는 고도로 정제된 생산물 및 효과적인 공정을 나타낸다(도 22 참고).
RP-HPLC 함량 시험
이 방법은 역상 크로마토그래피에 의해서 MOD-4023 중간체 샘플의 MOD-4023 함량을 측정하고, 중간체 샘플 중의 %-비글리코실화된 MOD-4023을 측정하기 위해서 사용된다. 역상-HPLC는 분자를 그의 극성으로 인해서 분리한다. 비교적 비-극성인 분자, 예컨대 MOD-4023이 칼럼 물질에 고정되고, 하전된 극성 분자는 칼럼과의 상호작용을 달성하지 않고 용리된다.
고정된 분자를 극성인 용액으로부터 덜 극성인 용액으로의 구배의 도움으로 용리하였다. 먼저 가장 강한 극성을 갖는 분자가 용리되고, 이어서 덜 극성인 분자가 용리된다. 214nm에서의 흡수를 통해서 검출을 수행하였다.
정제의 초기 단계(UFDF1 샘플)에서, 2개의 피크가 관찰되었다. 피크 1은 MOD-4023의 고도로-글리코실화된 형태이고, 피크 2는 낮게-글리코실화된 형태이다(도 11). 2개의 피크의 상대적인 피크 면적(면적%)을 상응하는 피크 면적을 적분함으로써 계산할 수 있다. 피크 I의 상대적인 면적은 75%이다. 제1 정제 단계에서, 칼럼 DEAE 세파로스는 이들 피크를 분리하고, 용리 분획은 MOD-4023 글리코실화된 형태 만(100%)을 함유한다(도 12).
MOD-4023 효력
MOD-4023에 의한 인간 성장 수용체의 활성화를 hGH 수용체를 안정하게 발현하는 Baf 세포를 사용하여 특징분석하였다. 세포를 GH 무함유 배지 중에서 기아상태(starvation), 이어서 세척 단계에 적용하고, 검정 완충제 중에 재현탁하고, 96-웰 플레이트(100μl/웰)로 옮겼다. 37℃에서 30분 동안의 세포 인큐베이션 시간 동안, MOD-4023을 증가된 농도로 첨가하고, 세포를 37℃에서 5% CO2와 함께 밤새 인큐베이션시켰다. 30μl의 셀타이터(CellTiter) 96 애큐어스 원 솔루션 리에이전트(Aqueous One Solution Reagent)(MTS)를 배양 웰에 첨가함으로써 검정을 중단하였다. MTS를 첨가하고 3시간 후, 배양 웰의 광학 밀도(OD)를 492nm에서 측정하였다. 492nm 흡광도는 배양액 중에서 살아있는 세포의 수에 정비례한다. MOD-4023은 전형적인 용량-의존 곡선으로 Baf-hGH 세포에 대한 특이적인 결합을 나타내었다(도 13 및 도 23).
또한, 생물-아이덴터티 시험을 뇌하수체절제된 래트에서 수행하였는데, 여기서 모든 배취에서 MOD-4023 활성은 mg 당 2 미국 약전(United States Pharmacopeia: USP) 소마트로핀 단위 이상이었다(도 23).
바이러스 클리어런스
내인성 및 외래성 바이러스로의 최종 약물 제품의 오염을 해결 및 완화시키는 제조 공정의 능력이 예비 평가 대상이었다. 스파이킹된(spiked) 바이러스 집단을 불활성화 또는 제거하는 이러한 단계의 능력을 정성분석하기 위해서 제조 공정의 규모 축소된 부분으로 스파이킹된 3가지 모델 바이러스를 사용하여 시험용 생산물에 대해서 적용 가능한 가이던스에 따라서 GLP-준수 연구를 수행하였다. log10 조정된 타이터(Adjusted Titre)로서 발현된 바이러스의 양을 사용하여, 입력값으로부터 출력값을 뺄셈함으로써 log10 클리어런스 인자를 단순히 결정한다. log10 수치로서, 클리어런스 인자는 모든 평가된 단계에 대한 전체 클리어런스 인자를 유도하는 데 가산적이다. 개별 단계 클리어런스 인자는 도 14에 계산되어 있다. 아벨슨 뮤린 루케미아 바이러스(A-MuLV), 미세 마우스 바이러스(MVM), 리오바이러스 3(Reo-3) 및 가성광견병 바이러스(PrV)를 사용하여 바이러스 안전성 평가 연구를 수행하였다. 15㎎/용량의 최대 용량에 대해서 용량 당 이론적인 바이러스 로드를 계산하였다. A-MuLV가 CHO 레트로바이러스의 가능한 존재를 나타내는 모델 바이러스인 것으로 간주되며, 오염 A-MuLV 바이러스를 불활성화 및 제거하는 데 취해진 측정치가 적어도 안티log10, 22.74의 클리어런스를 성취하였고, 이는 전체 MOD-4023 공정이 바이러스 제거에 대해서 이례적인 능력을 갖는다는 것을 제안한다.
불순물
정제된 MOD-4023 단백질 중에 존재하는 불순물의 범위에 대한 분석 결과가 도 24에 제공되어 있다. 100ng/㎎(ppm) 이하의 숙주 세포 단백질(HCP)이 발견되었다. DNA의 존재는 10pg/㎎(ppb) 이하였다. 잔류하는 메토트렉세이트(MTX) 수준은 50ng/㎖ 미만이었다. 잔류하는 프로필렌 글리콜(PG)은 60㎍/㎖ 이하였다. 2.5㎍/㎖ 이하의 트리톤이 발견되었다. 마찬가지로, 115pg/㎖ 이하의 인슐린이 최종 정제된 MOD-4023 단백질 중에 존재하였다. 마지막으로, 250㎍/㎖ 미만의 DMSO가 정제된 MOD-4023 단백질 생산물 중에 존재하였다. 생균수 분석의 결과가 또한 도 24에 제공되어 있고, 정제된 약물 제품 중에 10cfu/10㎖ 이하로 존재함을 나타낸다.
실시예 2
MOD-4023 단백질의 글리코실화 부위 점유
목적
연구 목적은 MOD-4023의 글리코실화 부위 점유에 대한 정보를 제공하는 것이었다(대략 12개의 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질).
방법
뉴라미니다제를 사용한 MOD-4023의 탈-시알릴화
대략 21㎎/㎖의 농도를 갖는 Mod-4023 샘플을 사용하였다. 대략 200ug의 샘플을 물로 완충제 교환시키고, 동결 건조하였다. 건조 샘플을 뉴라미니다제 중에 재현탁하고, 37℃에서 인큐베이션시켰다.
환원된/카복시메틸화된 MOD-4023 단백질의 트립신에 의한 소화
탈-시알릴화 후에, 대략 200㎍의 MOD-4023을 트리스/구아니딘 하이드로클로라이드 완충제로 완충제 교환시켰고, 다이티오트레이톨을 사용하여 환원시키고, 아이오도아세트산을 사용하여 카복시메틸화시켰다. 이어서, 샘플을 중탄산 암모늄으로 완충제 교환시키고, 37℃에서 트립신으로 소화시켰다.
온-라인 액체 크로마토그래피/전자분무-질량 분석법 LC/ES-MS
주피터 페노메넥스(Jupiter Phenomenex) 칼럼(C18, 5μ, 250 x 2.1 mm; 실온; 파장 214 nm; 유량 0.2㎖/분)을 사용하여 제공된 그대로의 소화된 샘플의 분취물 상에서 온-라인 액체 크로마토그래피/전자분무-질량 분석법(LC/ES-MS)을 수행하였다. 용매 A는 1L H2O 중의 0.05㎖ 포름산이었다. 용매 B는 100㎖ H2O + 900㎖ 아세토니트릴 중의 0.05㎖ 포름산이었다. 표 1에 하기에 제공된 구배를 무손상 생산물 및 환원된 생산물에 대해서 사용하였다.
질소 무수 기체 및 상승된 공급원 온도의 사용에 의해서 이온화를 향상시켰다. 약간 증가된 콘 전압(cone voltage)을 인가하여 공급원 단편화를 용이하게 하였다. 질량 범위 스캔은 m/z 200 내지 m/z 2000이었다.
데이터 해석
질량 분석법 데이터의 해석은 CTP-변형된 hGH의 단백질 서열(서열번호 7)과 함께 제너럴 프로테인/매스 어날리시스 포 윈도우즈(General Protein/Mass Analysis for Windows: GPMAW) 소프트웨어(라이트하우스(Lighthouse) 데이터)를 사용하여 도움을 받았고, 여기서 O-글리코실화되었다고 예견된 서열은 CTP 단위에 존재하는 것이다.
결과
서열번호 7의 완전한 서열을 분석하였지만, 데이터의 평가는 서열번호 7의 아미노산 37 내지 224 사이의 MOD-4023 단백질의 서열의 완전한 맵핑을 생성하였다.
탈-
시알릴화되고
, 환원되고,
카복시메틸화된
MOD-4023의 트립신에 의한 소화물 혼합물의 LC-ES-MS
온라인 LC/ES-MS를 탈-시알릴화되고, 환원되고, 카복시메틸화된 MOD-4023 상에서 수행하였다. 배취-대-배취 비교를 위해서, 도 16은 3개의 총 이온 전류(Total Ion Current: TIC)의 중첩을 나타낸다. 3개의 배취에 대해서 수득된 데이터는 검출된 펩타이드뿐만 아니라 강도가 상당히 대등하였다.
도 17은 적어도 하나의 HexNAc-Hex 잔기에 의해서 변형된 신호에 초점을 맞춘 탈-시알릴화되고, 환원되고, 카복시메틸화된 MOD-4023 단백질 배취의 트립신에 의한 소화물의 온-라인 LC/ES-MS 분석으로부터 얻은 신호 평가를 나타낸다. 도 17에 제시된 결과는 도 18에 도시된 바와 같은 N-말단 영역에서의 O-연결된 글리코실화 부위 점유를 제안한다. 도 18은 MOD-4023 서열번호 7의 아미노산 서열 1 내지 30을 보여주고, 여기서 O-글리코실화는 위치 10, 13, 15, 및 21(적색으로 표시됨)에서의 세린(S) 잔기 상에서 일어난다. 이러한 세린(S) 모두는 서열에서 프롤린(P) 뒤에 존재한다. 위치 1 내지 4(1 내지 4)에서의 S 잔기 중 적어도 2개는 O-글리코실화 부위에 의해서 점유되어 있다(자색으로 표시됨).
최대 6개의 O-글리코실화 부위를 갖는 서열번호 7의 아미노산 1 내지 36의 예상된 질량과 일치하는 완전한 CTP 단위의 추가 신호가 관찰되었다. 누락된 절단 부위를 함유한 그러한 더 큰 트립신 펩타이드의 존재는 O-글리코실화의 존재에 대한 동의인데, 그 이유는 입체적이고 정전기적인 간섭의 결과로서 아르기닌 또는 라이신 잔기에 인접한 글리칸 잔기가 트립신에 의한 절단을 방해하기 때문이다.
도 17에 제시된 데이터 또한 이전 데이터(도시되지 않음), 즉 MOD-4023의 C-말단 CTP-CTP 영역에 대해서 대등함을 보여준다. 결과로서, O-글리코실화는 도 18 및 도 19에서 프롤린 잔기 뒤에 존재하는 세린 잔기(적색으로 표시됨) 상에서 일어난다고 해석될 수 있다. 추가로, 세린 반복 영역에서, 4개의 세린 중 적어도 2개는 O-글리코실화에 의해서 점유되었다.
수득된 결과로부터, N-말단 CTP-단위와 관련하여 하기 결과가 도출되었다. O-글리코실화는 위치 10, 13, 15, 및 21(서열번호 7의 아미노산 10, 13, 15 및 21)에서의 세린 잔기 상에서 일어났다. 이러한 세린 전부는 서열에서 프롤린 잔기 뒤에 존재하였다. 단백질 N-말단으로부터의 위치 1 내지 4(서열번호 7의 아미노산 1 내지 4) 상의 4개의 세린 잔기로부터, 적어도 2개는 O-글리코실화 부위에 의해서 점유된다. C-말단 CTP-CTP 단위: 서열번호 7의 아미노산 229, 232, 234, 240, 257, 260, 262, 및 268). 추가로, 반복된 세린 영역에서 4개의 세린 중 적어도 2개는 O-글리코실화 부위에 의해서 점유된다(N-말단 CTP 단위의 서열번호 7의 아미노산 1 내지 4, 및 C-말단 CTP-CTP 단위의 서열번호 7의 아미노산 220 내지 223 및 248 내지 251).
많은 수의 O-글리코실화 부위를 갖는 펩타이드는 불량한 이온화로 인해서 질량 분광계 검출을 빠져나갈 수 있다고 이해된다. 이러한 이유로 인해서, 동일한 샘플을 더 많은 양으로 그리고 고질량 트립신 펩타이드에 대해서 선호되는 변형된 이온화 조건으로 주입하였다.
결론
이러한 연구 동안, 결과를 수집하였고, 하기 설명을 지지하였다. 트립신에 의한 소화물 혼합물의 분석으로부터 얻은 데이터의 평가는 단백질 서열의 100%가 맵핑되는 것을 허용하는 신호를 생성하였다. O-글리코실화는 N-말단 및 C-말단 CTP- 및 -CTP-CTP 영역 둘 모두에서 각각 일어난다. 점유 부위는 프롤린 잔기 뒤에 존재하는 세린 잔기뿐만 아니라 세린 반복 영역의 4개의 세린 중 2개였다. 이러한 방식에서, 총 최대 18개의 세린 잔기가 O-글리칸을 위한 부착 부위로서 기능할 수 있다. 따라서, 놀랍고도 예상치 못하게, 본 명세서에 개시된 제조 방법을 사용하면, O-글리칸 점유는 각각의 MOD-4023(CTP-hGH-CTP-CTP 폴리펩타이드)의 CTP 당 최대 6개의 O-글리칸이었다. 탈-시알릴화 후의 MOD-4023 단백질의 분자량 분석은 단백질이 구조 HexNAc-Hex의 12 내지 18개의 글리코실화 부위로 변형되었음을 제안하였다(실시예 3 참고).
실시예 3
MOD-4023의 무손상 분자량 분석
목적
본 연구의 목적은 MOD-4023 단백질의 3개의 배취의 정확한 무손상 분자량 정보를 제공하는 것이었다(대략 12개의 O-연결된 글리코실화 부위를 갖는 당단백질).
방법
제공된 그대로 그리고 처리 후에 샘플의 분자량 분석
분석된 샘플은 21㎎/㎖ 및 41㎎/㎖의 농도였다. 온-라인 LC/ES-MS를 다음 조건을 사용하여 수행하였다:
HPLC: 다음을 포함하는 GE AKTA마이크로(AKTAmicro) 액체 크로마토그래피 시스템
P-905 펌프, UV-900 삼중 파장 흡광도, 전도도
검출기 및 A-905 오토샘플러, 분획 수집기 프락(Frac)-950
MS: 마이크로매스/워터스 Q-TOF 마이크로 쿼드로플-타임 오브 플라이트 매스(Micromass/Waters Q-TOF micro Quadrupole-Time of Flight Mass)
분광계
파장: 280nm
칼럼: 페노메넥스 주피터 3p C18 300A 150 x 2.0 mm
(에스지에스 엠-스캔 게엠베하(SGS M-Scan GmbH) 칼럼 # 74)
냉각 온도 40℃
유량: 0.2㎖/분
용매 A: 1L H20 중의 1.0㎖ FA
용매 B: 100㎖ H20 + 800㎖ 아세토나이트릴 + 100㎖ 테트라하이드로퓨란 중의 1.0㎖ FA
하기에 기술된 구배를 탈-시알릴화된 생산물의 분석을 위해서 사용하였다. 데이터 평가 동안 체류 시간을 구배 시작으로 조정하였다는 것을 주목해야 한다(tRo = 10분에서):
질소 무수 기체 및 상승된 공급원 온도를 사용함으로써 이온화를 향상시켰다. 스캔된 질량 범위는 m/z 350 내지 m/z 3500이었다. MS/MS 모드의 Glu-피브리노펩타이드 단편 이온을 사용하여 장비를 보정하였다.
뉴라미니다제를 사용한 탈-시알릴화
대략 100pg의 샘플을 물로 완충제 교환시키고, 동결 건조하였다. 건조 샘플을 뉴라미니다제 중에 재현탁하고, 37℃에서 인큐베이션시켰다. 이의 대략 10pg을 상기에 기술된 바와 같이 분석하였다.
데이터 해석
질량 분석법 데이터의 해석은 MOD-4023 단백질 서열(서열번호 7)과 함께 GPMAW 소프트웨어(라이트하우스 데이터)를 사용하여 도움을 받았다.
결과
제공된 그대로의 샘플의 무손상 분자량 분석
도 20에 탈-시알릴화 후 MOD4023 로트 648-01-10-014A 샘플의 온-라인 LC/ES-MS 분석으로부터 입수된 tR 19.8분에서의 UV 흡수 성분의 용리 동안 획득된 디콘볼루션된 질량 스펙트럼이 도시되어 있다.
표 3은 탈-시알릴화 후 MOD4023 로트 648-01-10-014A의 온-라인 LC/ES-MS 분석 동안 획득된 질량 분광계 검출로부터 입수된 결과의 요약을 제시한다.
결론
O-연결된 글리코실화 부위의 수에 대한 정보를 얻으려는 목적으로 탈-시알릴화 후 샘플 상에서 MOD4023 단백질의 3개의 배취의 분자량 분석을 수행하였다. 3개의 배취 모두에 대해서 일관되게, 탈시알릴화된 샘플의 무손상 질량 측정으로부터 얻은 데이터는 HexNAc-Hex 구조의 12 내지 18개의 글리코실화 부위를 갖는 MOD4023 단백질의 평균 화학 질량과 일치하는 신호를 생성하였다(기기의 실험 오차 이내). 3개의 배취 모두에 대해서, 15개의 글리코실화 부위로 변형된 단백질이 가장 높은 강도였다.
상응하는 질량 스펙트럼 신호 각각은 대략 +16.5Da에서 위성 신호의 존재에 의해서 특징분석되었다. 이러한 질량 이동은 산소 잔기 또는 NH3 잔기의 부가로 인한 것일 수 있다. 수치는 H+ 양성자화 대신에 NH4 + 양성자화로부터의 기인할 수 있고, 이는 NH3(+17 Da)의 순 부가를 산출한다. 산화는 가능하게는 용리 시간의 이동을 유발할 수 있을 것이기 때문에(18.5분에서의 UV 신호의 존재에 의해서 관찰되는 바와 같음, 주피크 + 1 산소의 질량과 일치함), 데이터는 선호될 때 후자 설명을 제안하였다(위성은 NH4 + 양성자화의 결과임). 그러나, 무손상 질량 측정 단독으로부터, 이것은 결국 해결될 수 없었다.
본 연구로부터 도출된 발견은 최대 18개의 O-글리코실화된 잔기가 또한 발견되었고, 15개의 글리코실화 부위로 변형된 단백질이 가장 강한 강도인 MOD4023단백질의 이전 분석(도시되지 않은 데이터)과 일치하였다.
본 명세서에 개시된 특정 특징부가 본 명세서에 예시 및 기술되어 있지만, 다수의 변형, 치환, 변화 및 등가물이 관련 기술 분야의 통상의 기술자에게 상기될 것이다. 따라서, 첨부된 청구범위는 본 명세서에 개시된 진정한 사상 내에 포함되는 바와 같은 그러한 모든 변형 및 변화를 포함하는 것이 의도된다.
SEQUENCE LISTING
<110> OPKO Biologics Ltd
HERSHKOVITZ, Oren
MOSCHCOVICH, Laura
<120> METHODS OF PRODUCING LONG ACTING CTP-MODIFIED GROWTH HORMONE
POLYPEPTIDES
<130> P-77718-PC
<150> US 62/090,104
<151> 2014-12-10
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 33
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 1
Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser
1 5 10 15
Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu
20 25 30
Gln
<210> 2
<211> 28
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 2
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20 25
<210> 3
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 3
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
1 5 10
<210> 4
<211> 301
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 4
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Ser Ser Ser Ser Lys Ala
20 25 30
Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp
35 40 45
Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe
50 55 60
Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp
65 70 75 80
Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr
85 90 95
Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile
100 105 110
Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu
115 120 125
Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val
130 135 140
Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser
145 150 155 160
Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln
165 170 175
Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile
180 185 190
Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp
195 200 205
Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met
210 215 220
Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu
225 230 235 240
Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu
245 250 255
Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro
260 265 270
Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser
275 280 285
Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
290 295 300
<210> 5
<211> 217
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 5
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala Phe Pro Thr Ile Pro Leu
20 25 30
Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu His Gln
35 40 45
Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile Pro Lys
50 55 60
Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu Cys Phe
65 70 75 80
Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln Gln Lys
85 90 95
Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln Ser Trp
100 105 110
Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser Leu Val
115 120 125
Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp Leu Glu
130 135 140
Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser Pro Arg
145 150 155 160
Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr Asn Ser
165 170 175
His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr Cys Phe
180 185 190
Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val Gln Cys
195 200 205
Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
210 215
<210> 6
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 6
Met Ala Thr Gly Ser Arg Thr Ser Leu Leu Leu Ala Phe Gly Leu Leu
1 5 10 15
Cys Leu Pro Trp Leu Gln Glu Gly Ser Ala
20 25
<210> 7
<211> 275
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 7
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile
20 25 30
Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg Ala His Arg Leu
35 40 45
His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu Glu Ala Tyr Ile
50 55 60
Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro Gln Thr Ser Leu
65 70 75 80
Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg Glu Glu Thr Gln
85 90 95
Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu Leu Leu Ile Gln
100 105 110
Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val Phe Ala Asn Ser
115 120 125
Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp Leu Leu Lys Asp
130 135 140
Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu Glu Asp Gly Ser
145 150 155 160
Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser Lys Phe Asp Thr
165 170 175
Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Tyr
180 185 190
Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe Leu Arg Ile Val
195 200 205
Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys
210 215 220
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
225 230 235 240
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
245 250 255
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
260 265 270
Leu Pro Gln
275
<210> 8
<211> 191
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg
1 5 10 15
Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln Glu Phe Glu
20 25 30
Glu Ala Tyr Ile Pro Lys Glu Gln Lys Tyr Ser Phe Leu Gln Asn Pro
35 40 45
Gln Thr Ser Leu Cys Phe Ser Glu Ser Ile Pro Thr Pro Ser Asn Arg
50 55 60
Glu Glu Thr Gln Gln Lys Ser Asn Leu Glu Leu Leu Arg Ile Ser Leu
65 70 75 80
Leu Leu Ile Gln Ser Trp Leu Glu Pro Val Gln Phe Leu Arg Ser Val
85 90 95
Phe Ala Asn Ser Leu Val Tyr Gly Ala Ser Asp Ser Asn Val Tyr Asp
100 105 110
Leu Leu Lys Asp Leu Glu Glu Gly Ile Gln Thr Leu Met Gly Arg Leu
115 120 125
Glu Asp Gly Ser Pro Arg Thr Gly Gln Ile Phe Lys Gln Thr Tyr Ser
130 135 140
Lys Phe Asp Thr Asn Ser His Asn Asp Asp Ala Leu Leu Lys Asn Tyr
145 150 155 160
Gly Leu Leu Tyr Cys Phe Arg Lys Asp Met Asp Lys Val Glu Thr Phe
165 170 175
Leu Arg Ile Val Gln Cys Arg Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe
180 185 190
<210> 9
<211> 903
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - nucleic acid
<400> 9
atggccaccg gcagcaggac cagcctgctg ctggccttcg gcctgctgtg cctgccatgg 60
ctgcaggagg gcagcgccag ctcttcttct aaggctccac ccccatctct gcccagcccc 120
agcagactgc cgggccccag cgacacaccc attctgcccc agttccccac catccccctg 180
agcaggctgt tcgacaacgc catgctgagg gctcacaggc tgcaccagct ggcctttgac 240
acctaccagg agttcgagga agcctacatc cccaaggagc agaagtacag cttcctgcag 300
aacccccaga cctccctgtg cttcagcgag agcatcccca cccccagcaa cagagaggag 360
acccagcaga agagcaacct ggagctgctg aggatctccc tgctgctgat ccagagctgg 420
ctggagcccg tgcagttcct gagaagcgtg ttcgccaaca gcctggtgta cggcgccagc 480
gacagcaacg tgtacgacct gctgaaggac ctggaggagg gcatccagac cctgatgggc 540
cggctggagg acggcagccc caggaccggc cagatcttca agcagaccta cagcaagttc 600
gacaccaaca gccacaacga cgacgccctg ctgaagaact acgggctgct gtactgcttc 660
agaaaggaca tggacaaggt ggagaccttc ctgaggatcg tgcagtgcag aagcgtggag 720
ggcagctgcg gcttcagctc cagcagcaag gcccctcccc cgagcctgcc ctccccaagc 780
aggctgcctg ggccctccga cacaccaatc ctgccacaga gcagctcctc taaggcccct 840
cctccatccc tgccatcccc ctcccggctg cctggcccct ctgacacccc tatcctgcct 900
cag 903
<210> 10
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 10
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile
1 5 10 15
Pro Leu Ser Arg
20
<210> 11
<211> 31
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 11
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg
20 25 30
<210> 12
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 12
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
1 5 10
<210> 13
<211> 13
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 13
Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys
1 5 10
<210> 14
<211> 51
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 14
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro
20 25 30
Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile
35 40 45
Leu Pro Gln
50
<210> 15
<211> 36
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 15
Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg
1 5 10 15
Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Phe Pro Thr Ile
20 25 30
Pro Leu Ser Arg
35
<210> 16
<211> 23
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 16
Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser
1 5 10 15
Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
20
<210> 17
<211> 64
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Human origin - amino acid
<400> 17
Ser Val Glu Gly Ser Cys Gly Phe Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro
1 5 10 15
Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro
20 25 30
Ile Leu Pro Gln Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro
35 40 45
Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln
50 55 60
Claims (25)
- 직렬로 배열된, 아미노 말단의 융모성 고나도트로핀 카르복시 말단 펩티드(CTP), 인간 성장 호르몬(hGH) 펩티드, 및 2개의 카르복시 말단 융모성 고나도트로핀 CTP
를 갖는 고도로 글리코실화된 폴리펩티드(CTP-변형된 hGH 폴리펩티드)를 포함하는, 정제된 약학적 조성물로서,
상기 CTP-변형된 hGH 폴리펩타이드는 서열 번호 7의 아미노산 서열을 갖고,
상기 약학적 조성물은 0.3% m-크레졸 및 0.2% 폴록사머 188을 포함하며,
상기 약학적 조성물 중 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 75% 이상이 분자당 13 내지 18개의 O-연결된 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함하는,
정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물 중 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 80% 이상이 13 내지 18개의 O-연결된 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물 중 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 85% 이상이 13 내지 18개의 O-연결된 글리코실화 부위에서 글리코실화를 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물 중 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 90% 이상이 13 내지 18개의 O-글리칸 점유로 글리코실화된, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 O-연결된 글리코실화 부위가 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 CTP 상에 위치하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드는 분자당 적어도 15개의 O-연결된 글리칸을 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 각각의 CTP는 4, 5, 또는 6개의 O-연결된 글리칸을 함유하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드 각각은 서열번호 7의 서열의 잔기 10, 13, 15, 21, 229, 232, 234, 240, 257, 260, 262, 및 268에서 O-연결된 글리코실화를 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물이 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드를 포함하는 정화된 수확 용액인, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 약학적 조성물이 피하(SC) 주사용 멸균 수성 조성물인, 정제된 약학적 조성물. - 제1항에 있어서,
상기 CTP-변형된 hGH 리펩티드가 2개의 이황화 가교를 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 글리코실화는
서열번호 7의 아미노산 잔기 1 내지 4에서 선택되는 적어도 2개의 잔기,
서열번호 7의 아미노산 잔기 220 내지 223에서 선택되는 적어도 2개의 잔기,
서열번호 7의 아미노산 잔기 248 내지 251에서 선택되는 적어도 2개의 잔기, 또는
이들의 임의의 조합
의 O-연결된 글리코실화를 더 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
O-연결된 글리칸이 시알릴화된 코어 구조를 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 O-연결된 글리코실화 부위 각각에서의 글리코실화가 모노-시알화된 코어 1(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc), 중성 코어 1(Galβ1-3GalNAc), 모노-시알화된 코어 1(Neu5Acα2-6(Galβ1-3)GalNAc), 및 디-시알화된 코어 1( Neu5Acα2-3Galβ1-3(Neu5Acα2-6)GalNAc)으로 이루어진 군으로부터 선택된 O-글리칸 코어 구조를 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
약제학적으로 허용가능한 담체를 추가로 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적 조성물 중 가장 풍부한 O-글리칸 코어 구조는 모노-시알화된 코어 1(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc)인, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적 조성물에 존재하는 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 가장 풍부한 형태가 15 내지 16개의 O-글리칸을 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적 조성물에 존재하는 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드의 60% 이상이 시알릴화된, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적 조성물 중 가장 풍부한 시알산이 Neu5Ac인, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 약학적 조성물 중의 각각의 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드는 모노-시알화된 코어 1(Neu5Acα2-3Galβ1-3GalNAc)의 O-글리칸 코어 구조를 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
하기의 특징들:
a. 100ng/mg 이하의 숙주 세포 단백질;
b. 10pg/mg 이하의 DNA;
c. 50ng/mL 이하의 메토트렉세이트;
d. 60㎍/mL 이하의 프로필렌 글리콜;
e. 2.5㎍/mL 이하의 Triton;
f. 115pg/mL 이하의 인슐린;
g. 250㎍/mL 미만의 디메틸 설폭사이드(DMSO);
h. Bioburden 분석에서 10 이하의 콜로니 형성 유닛(cfu)/10mL
중 하나 이상을 포함하는, 정제된 약학적 조성물. - 제11항에 있어서,
2개의 이황화 가교 중 하나가 서열번호 7의 서열의 시스테인 잔기 81과 시스테인 잔기 193 사이에 있고, 2개의 이황화 가교 중 다른 하나가 서열번호 7의 서열의 시스테인 잔기 210 및 시스테인 잔기 217 사이에 있는, 정제된 약학적 조성물. - 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 정제된 약학적 조성물이
(a) 미리 결정된 수의 세포를, CTP-변형된 hGH 폴리펩티드를 코딩하는 코딩 부분을 포함하는 발현 벡터로 안정적으로 형질감염시키는 단계로서, 형질감염된 세포는 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드를 발현 및 분비하는, 단계;
(b) CTP-변형된 hGH 폴리펩티드를 과발현하는 세포 클론을 수득하는 단계;
(c) 용액에서 클론을 미리 결정된 규모로 확장하는 단계;
(d) 클론을 함유하는 용액을 수확하는 단계;
(e) 정화된 수확 용액을 얻기 위해 클론을 함유하는 용액을 여과하는 단계; 및
(f) 정화된 수확 용액을 정제하여 원하는 농도의 CTP-변형된 hGH 폴리펩티드를 얻는 단계
를 포함하는 방법에 의해 제조되는,
정제된 약학적 조성물. - 삭제
- 삭제
Applications Claiming Priority (8)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201462090116P | 2014-12-10 | 2014-12-10 | |
US201462090104P | 2014-12-10 | 2014-12-10 | |
US201462090124P | 2014-12-10 | 2014-12-10 | |
US62/090,116 | 2014-12-10 | ||
US62/090,104 | 2014-12-10 | ||
US62/090,124 | 2014-12-10 | ||
PCT/IL2015/051196 WO2016092549A1 (en) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | Methods of producing long acting ctp-modified growth hormone polypeptides |
KR1020207028408A KR20200118505A (ko) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 |
Related Parent Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020207028408A Division KR20200118505A (ko) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
KR20220058564A KR20220058564A (ko) | 2022-05-09 |
KR102527180B1 true KR102527180B1 (ko) | 2023-04-27 |
Family
ID=56106835
Family Applications (3)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177018890A KR102164352B1 (ko) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 |
KR1020227010215A KR102527180B1 (ko) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 |
KR1020207028408A KR20200118505A (ko) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020177018890A KR102164352B1 (ko) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
KR1020207028408A KR20200118505A (ko) | 2014-12-10 | 2015-12-10 | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (3) | US20180111974A1 (ko) |
EP (4) | EP3240564A4 (ko) |
KR (3) | KR102164352B1 (ko) |
CN (1) | CN107438623B (ko) |
AU (2) | AU2015358890B2 (ko) |
CO (1) | CO2017006870A2 (ko) |
EA (1) | EA201791275A1 (ko) |
ES (1) | ES2943359T3 (ko) |
HK (2) | HK1243444A1 (ko) |
HR (1) | HRP20230405T8 (ko) |
IL (2) | IL252778B (ko) |
MX (2) | MX2017007634A (ko) |
NZ (1) | NZ733113A (ko) |
PE (1) | PE20171380A1 (ko) |
PH (1) | PH12017501089A1 (ko) |
PL (1) | PL3230309T3 (ko) |
RU (2) | RU2743295C2 (ko) |
SG (1) | SG11201704706RA (ko) |
SI (1) | SI3230309T1 (ko) |
TW (2) | TWI746427B (ko) |
WO (2) | WO2016092549A1 (ko) |
ZA (1) | ZA201704595B (ko) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9249407B2 (en) | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
US20140113860A1 (en) | 2006-02-03 | 2014-04-24 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
US10221228B2 (en) | 2006-02-03 | 2019-03-05 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
US9663778B2 (en) | 2009-07-09 | 2017-05-30 | OPKO Biologies Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
US20150158926A1 (en) | 2013-10-21 | 2015-06-11 | Opko Biologics, Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
CN107438623B (zh) | 2014-12-10 | 2023-07-14 | Opko生物科学有限公司 | 长效的ctp修饰的生长激素多肽的制备方法 |
US10960058B2 (en) | 2015-06-19 | 2021-03-30 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
TW201808988A (zh) * | 2016-07-11 | 2018-03-16 | 歐科生物製品有限公司 | 長效型凝血因子及其生產方法 |
RU2652884C1 (ru) * | 2016-11-25 | 2018-05-03 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства | Штамм клеток яичников китайского хомячка сно-еро 4а9 - продуцент высокосиалированного эритропоэтина |
US20200262887A1 (en) * | 2018-11-30 | 2020-08-20 | Opko Ireland Global Holdings, Ltd. | Oxyntomodulin peptide analog formulations |
WO2021005604A1 (en) * | 2019-07-11 | 2021-01-14 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting igf-1 or igf-1 variants and methods of producing same |
WO2022197963A1 (en) * | 2021-03-19 | 2022-09-22 | Pfizer Inc. | Long-acting growth hormone compositions |
BR112023018980A2 (pt) * | 2021-03-19 | 2023-12-05 | Opko Biologics Ltd | Métodos de administração de polipeptídeos de hormônio de crescimento de ação prolongada |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090312254A1 (en) * | 2006-02-03 | 2009-12-17 | Fuad Fares | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
WO2014080401A2 (en) * | 2012-11-20 | 2014-05-30 | Prolor Biotech Inc | Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides |
WO2014166836A1 (en) * | 2013-04-05 | 2014-10-16 | Novo Nordisk A/S | Growth hormone compound formulation |
Family Cites Families (31)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE3421468A1 (de) | 1984-06-08 | 1985-12-19 | Dr. Rentschler Arzneimittel Gmbh & Co, 7958 Laupheim | Lipidnanopellets als traegersystem fuer arzneimittel zur peroralen anwendung |
EP0173552B1 (en) | 1984-08-24 | 1991-10-09 | The Upjohn Company | Recombinant dna compounds and the expression of polypeptides such as tpa |
DE122007000007I2 (de) | 1986-04-09 | 2010-12-30 | Genzyme Corp | Genetisch transformierte Tiere, die ein gewünschtes Protein in Milch absondern |
US5118666A (en) | 1986-05-05 | 1992-06-02 | The General Hospital Corporation | Insulinotropic hormone |
US4873316A (en) | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
DE68917883T2 (de) | 1988-05-06 | 1995-02-23 | Toray Industries | Stabile interferon-beta-zusammensetzung. |
EP0461200B1 (en) | 1989-02-21 | 1997-01-22 | Washington University | Modified forms of reproductive hormones |
ATE109507T1 (de) * | 1989-04-28 | 1994-08-15 | Miles Inc | Grossfermenter-inokulation mit gefrorenen zellen. |
US5464764A (en) | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
DE69422169D1 (de) * | 1993-04-20 | 2000-01-20 | Univ St Louis | Modifizierte proteine und peptide enthaltende pharmazeutische mittel |
WO1995035116A1 (en) * | 1994-06-17 | 1995-12-28 | Applied Research Systems | Hgh containing pharmaceutical compositions |
DE19539493A1 (de) | 1995-10-24 | 1997-04-30 | Thomae Gmbh Dr K | Starker homologer Promotor aus Hamster |
KR100467751B1 (ko) * | 2001-12-03 | 2005-01-24 | 씨제이 주식회사 | 생체내 에리스로포이에틴 활성이 증진된 융합단백질 |
CN1847265A (zh) * | 2005-04-15 | 2006-10-18 | 上海市计划生育科学研究所 | 人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽多聚体及用途 |
WO2007092252A2 (en) | 2006-02-03 | 2007-08-16 | Modigene Inc | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
US8048848B2 (en) | 2006-02-03 | 2011-11-01 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting interferons and derivatives thereof and methods thereof |
US20140113860A1 (en) | 2006-02-03 | 2014-04-24 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
US8450269B2 (en) * | 2006-02-03 | 2013-05-28 | Prolor Biotech Ltd. | Long-acting growth hormone and methods of producing same |
US8946155B2 (en) | 2006-02-03 | 2015-02-03 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same |
US8759292B2 (en) * | 2006-02-03 | 2014-06-24 | Prolor Biotech, Llc | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
US8304386B2 (en) | 2006-02-03 | 2012-11-06 | Prolor Biotech, Inc. | Long-acting growth hormone and methods of producing same |
US9249407B2 (en) * | 2006-02-03 | 2016-02-02 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
US8476234B2 (en) * | 2006-02-03 | 2013-07-02 | Prolor Biotech Inc. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
KR101337797B1 (ko) * | 2010-07-14 | 2013-12-06 | 한미사이언스 주식회사 | 지속형 인간 성장 호르몬 결합체 액상 제제 |
WO2012051147A1 (en) * | 2010-10-11 | 2012-04-19 | Abbott Laboratories | Processes for purification of proteins |
BR122021004014B1 (pt) | 2012-02-14 | 2022-12-27 | Opko Biologics Ltd | Métodos para melhorar a área sob a curva (auc), reduzir a frequência da dosagem e reduzir a taxa de liberação de um fator de coagulação |
WO2013152351A2 (en) * | 2012-04-06 | 2013-10-10 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | Fusion polypeptides and methods of use thereof |
US9522945B2 (en) | 2012-04-19 | 2016-12-20 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting oxyntomodulin variants and methods of producing same |
EP2682168A1 (en) * | 2012-07-02 | 2014-01-08 | Millipore Corporation | Purification of biological molecules |
CN107438623B (zh) | 2014-12-10 | 2023-07-14 | Opko生物科学有限公司 | 长效的ctp修饰的生长激素多肽的制备方法 |
US10960058B2 (en) * | 2015-06-19 | 2021-03-30 | Opko Biologics Ltd. | Long-acting coagulation factors and methods of producing same |
-
2015
- 2015-12-10 CN CN201580073554.7A patent/CN107438623B/zh active Active
- 2015-12-10 SI SI201531936T patent/SI3230309T1/sl unknown
- 2015-12-10 WO PCT/IL2015/051196 patent/WO2016092549A1/en active Application Filing
- 2015-12-10 KR KR1020177018890A patent/KR102164352B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-10 KR KR1020227010215A patent/KR102527180B1/ko active IP Right Grant
- 2015-12-10 US US15/533,910 patent/US20180111974A1/en active Pending
- 2015-12-10 AU AU2015358890A patent/AU2015358890B2/en active Active
- 2015-12-10 EP EP15867141.2A patent/EP3240564A4/en not_active Withdrawn
- 2015-12-10 MX MX2017007634A patent/MX2017007634A/es unknown
- 2015-12-10 KR KR1020207028408A patent/KR20200118505A/ko not_active Application Discontinuation
- 2015-12-10 TW TW104141620A patent/TWI746427B/zh active
- 2015-12-10 PE PE2017000987A patent/PE20171380A1/es unknown
- 2015-12-10 EP EP23164376.8A patent/EP4253407A3/en active Pending
- 2015-12-10 WO PCT/IL2015/051197 patent/WO2016092550A2/en active Application Filing
- 2015-12-10 EP EP22209083.9A patent/EP4212546A1/en active Pending
- 2015-12-10 SG SG11201704706RA patent/SG11201704706RA/en unknown
- 2015-12-10 PL PL15828386.1T patent/PL3230309T3/pl unknown
- 2015-12-10 ES ES15828386T patent/ES2943359T3/es active Active
- 2015-12-10 EP EP15828386.1A patent/EP3230309B1/en active Active
- 2015-12-10 NZ NZ733113A patent/NZ733113A/en unknown
- 2015-12-10 RU RU2017123789A patent/RU2743295C2/ru active
- 2015-12-10 TW TW110139563A patent/TW202231657A/zh unknown
- 2015-12-10 EA EA201791275A patent/EA201791275A1/ru unknown
- 2015-12-10 US US14/965,079 patent/US20160168588A1/en not_active Abandoned
- 2015-12-10 HR HRP20230405TT patent/HRP20230405T8/hr unknown
- 2015-12-10 RU RU2021103436A patent/RU2021103436A/ru unknown
- 2015-12-10 MX MX2017007635A patent/MX2017007635A/es unknown
-
2017
- 2017-06-08 IL IL252778A patent/IL252778B/en unknown
- 2017-06-08 IL IL252788A patent/IL252788B/en unknown
- 2017-06-09 PH PH12017501089A patent/PH12017501089A1/en unknown
- 2017-07-07 ZA ZA2017/04595A patent/ZA201704595B/en unknown
- 2017-07-10 CO CONC2017/0006870A patent/CO2017006870A2/es unknown
-
2018
- 2018-03-02 HK HK18103050.1A patent/HK1243444A1/zh unknown
- 2018-05-07 HK HK18105854.4A patent/HK1246322A1/zh unknown
-
2019
- 2019-05-22 AU AU2019203609A patent/AU2019203609B2/en active Active
-
2021
- 2021-02-01 US US17/164,438 patent/US20210371487A1/en active Pending
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US20090312254A1 (en) * | 2006-02-03 | 2009-12-17 | Fuad Fares | Long-acting polypeptides and methods of producing same |
WO2014080401A2 (en) * | 2012-11-20 | 2014-05-30 | Prolor Biotech Inc | Method of increasing the hydrodynamic volume of polypeptides by attaching to gonadotrophin carboxy terminal peptides |
WO2014166836A1 (en) * | 2013-04-05 | 2014-10-16 | Novo Nordisk A/S | Growth hormone compound formulation |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
KR102527180B1 (ko) | 장기간 작용성 ctp-변형된 성장 호르몬 폴리펩타이드의 제조 방법 | |
EP2001903B1 (en) | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same | |
US9908924B2 (en) | Long-acting polypeptides and methods of producing and administering same | |
JP7437865B2 (ja) | 高度にグリコシル化されたヒト絨毛性ゴナドトロピンカルボキシ末端ペプチド(CTP)修飾ヒト成長ホルモン(hGH)ポリペプチドを含む、精製された医薬組成物 | |
CN109563145B (zh) | 长效凝血因子及其制备方法 | |
BR112017012498B1 (pt) | Polipeptídeo de hormônio de crescimento humano (hgh) modificado por peptídeo carboxi terminal (ctp) de gonadotropina coriônica humana,composição purificada, método de preparação dos referidos polipeptídeo e composição e uso do referido polipeptídeo |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A107 | Divisional application of patent | ||
A201 | Request for examination | ||
E902 | Notification of reason for refusal | ||
E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
GRNT | Written decision to grant |