CN1847265A - 人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽多聚体及用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽(CTP)多聚体及其制法和用途。本发明的CTP多聚体可重组表达生产，成本低，安全性好，而且免疫抗原强于单聚体。

Description

人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽多聚体及用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地涉及一种人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽多聚体及其制法和用途。

背景技术

恶性肿瘤的预防和治疗是当今世界性的难题之一。多年来，各国科学家都致力于研究开发安全有效而副作用小的癌症治疗手段来取代目前普遍采用的化学疗法或放射疗法。由于化疗或放疗在杀伤癌细胞的同时，正常细胞也会受到不同程度的损伤，因而会引起较大的副反应，降低了病人的生活质量，也不利于康复。

近年来，国外有不少研究发现许多癌细胞也能表达hCG，并随着癌细胞的进一步增殖、扩散，其表达的hCG的量不断增加，在癌细胞发生转移时达到最高值。已经在多种不同组织类型和来源的人癌细胞膜表面可检测到hCG、hCGβ亚基或其特异性的片段相关表位(决定簇)，而在健康的非孕个体中则检测不出。Acevedo及其合作者从美国细胞库随机取癌细胞株，研究了52种癌，10种肉瘤，4种白血病，6种淋巴瘤和2种视网膜胚细胞瘤，发现所有的癌细胞都能分泌hCG或hCGβ、或hCGβ羧基端(CTP)、或hCGα抗原决定簇(Acevedo等，Cancer，1992，69：1829-1842)。一些生殖系统癌症病人的外周血淋巴细胞对hCGβ亚基具有特异的增殖反应。这些都提示hCGβ亚基是一种能诱导细胞介导的免疫反应的癌相关抗原。

各种证据显示，hCG在细胞转化、肿瘤血管生成、肿瘤转移和免疫逃逸中起重要作用(F.Housseau等，Int.J.Cancer，1995，63：633-638；J.Mora，等，1996，British Journal of Cancer，74：1081-1084；PL.Triozzi和VC.Stevens，1999，OncologyReports，6：7-17)。以上研究结果为抗hCG疫苗用于治疗和预防癌症提供了科学依据。

hCG抗癌疫苗则是通过该疫苗刺激患者免疫系统，使自身产生针对hCG的抗体，从而抑制癌细胞的生长。因此hCG抗癌疫苗的特异性强，不会影响正常细胞的生长，是一种理想的癌症治疗手段。

从理论上讲，所有的癌症都能用抗hCG疫苗防治，因为所有的癌细胞都能分泌hCG，但目前首先选择的是发病率较高的前列腺癌、结直肠癌和胰腺癌。

据统计，在导致男性死亡的癌症中，前列腺癌是主要死因之一(上海地区发病率为7.1/10万)，而前列腺增生症被认为与前列腺癌的诱发有关。我国60岁以上男性中，43％患有阻塞性前列腺增生。目前我国人口已呈老龄化的趋势，前列腺的高发病率日益突出，但还没有好的前列腺癌早期诊断手段，一般发现时，已属中晚期。因此，hCG疫苗还可以用于预防前列腺癌。

结直肠癌也是人群中最常见的消化道恶性肿瘤，上海地区男性发病率为16.3/10万，名列癌症第5位；女性发病率为13.8/10万，名列癌症第6位。其治疗以手术为主，但术后5年生存率仅在50％左右，约半数病例在术后5年会出现复发和转移。对失去手术机会或转移性结直肠癌患者，目前主要采用以5-氟尿嘧啶(5-FU)为主的化疗法，其副作用很大，对患者的健康带来极大影响。

胰腺癌在上海地区的发病率位10/10万，名列癌症第8位(Fan Jin，Int.J.Cancer，1999，83：435-440)。

而hCG疫苗免疫已被证明能有效抑制癌细胞的转移、生长，且无明显的副作用，显示了它独特的优越性。

此外，膀胱癌、肺癌等大部分恶性肿瘤细胞也都能表达hCG，在进一步研究的基础上也可以用hCG疫苗进行防治。因此，hCG疫苗在恶性肿瘤的防治中有着十分广阔的应用前景，可产生良好的经济效益和社会效益。

hCGβ CTP37的分子量很小，因此免疫原性较弱。为了提高免疫原性，美国的AVI Biopharma(AVI)和Immunothreapy Corporation(ITC)公司将化学合成的hCGβ亚基羧基端37肽(简称hCGβ CTP37或CTP)与载体蛋白白喉类毒素(DT)偶联做成疫苗hCGβ CTP37/DT。hCGβ CTP37/DT已经用于治疗结直肠癌、前列腺癌和胰腺癌，并已完成了II期临床试验，正着手III期临床试验。试验结果表明，受试病人在注射疫苗后能产生抗hCG抗体，使癌细胞生长停滞或癌细胞坏死，从而使恶性肿瘤变小或消失(Medical/pharmaceutical Industry[MEDICINE]，1998；PL.Triozzi和VC.Stevens，Oncology Reports，1999，6：7-17；HM.Moulton等，Clinical Cancer Research，2002，8：2044-2051)。

此外，hCGβ与绵羊促黄体生成素α亚基(oLHα)经体外反应，相互间以非共价键相连后与破伤风类毒素(TT)和DT偶联形成疫苗HSD/TT(DT)。该疫苗的抗原性远高于hCGβ CTP37/DT(GP.Talwar，Immunology and Cell Biology，1997，75：184-189)，目前被用作抗生育疫苗，但也可用作抗癌疫苗。

这两种疫苗的抗原中，hCGβ CTP37是化学合成的，成本较高。此外，疫苗hCGβ CTP37/DT的抗原性低于HSD/TT(DT)。疫苗HSD/TT(DT)中的hCGβ和oLHα是从天然hCG和oLH经拆分而获得，不仅手续繁，质量难以控制，且十分昂贵。此外，hCGβ CTP37/DT虽然具有专一性高的优点，但其分子量小，免疫原性弱。

另外，人们虽然对重组表达人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽(hCGβCTP37)进行了众多尝试，但是由于种种未知原因一直未能有效地表达和分离出hCGβ CTP37。

另外，国内有报道利用cDNA制备成的DNA疫苗免疫小鼠的报道。但是DNA疫苗作为一种新型疫苗存在其致命的弱点。首先是其安全性问题：DNA在人体存在一段时间，其DNA序列可能会整合到人基因组中；另外，进入人体的DNA是否会产生抗DNA抗体而引起自身免疫病尚不明确。因此蛋白质疫苗仍然是研究的重点方向。

综上所述，本领域迫切需要开发可用于有效治疗恶性肿瘤的、成本低廉的药物，及其制备方法。

发明内容

本发明的目的就是提供一种新的基于hCGβ的新蛋白，该蛋白可作为治疗肿瘤的活性成分，并且可用重组法低廉而方便地制备。

在本发明的第一方面，提供了一种多肽，所述多肽是人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽的多聚体。

在另一优选例中，所述多肽具有式I所示的结构：

                    A-(CTP-B)n-D    式I

式中，CTP是人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽；

A是NH₂、信号肽、或前导肽；

B是连接肽或无；

D是COOH或下游肽；

n是2-30的整数。

在另一优选例中，n是3-15。更佳地，n为4-10。

在另一优选例中，A为NH₂、6His、C3d3、或GST；B为GlySer或无；或者D为COOH、6His或C3d3。

在另一优选例中，所述的多肽具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

在本发明的第二方面，提供了一种DNA分子，它编码本发明上述的多肽。更佳地，所述的DNA具有SEQ ID NO：3所示的核苷酸序列。

在本发明的第三方面，提供了一种表达载体，它含有上述的DNA分子。

在本发明的第四方面，提供了一种宿主细胞，它含有上述的表达载体，或者在其基因组中整合有上述的DNA分子。更佳地，所述的宿主细胞是巴斯德毕赤酵母、大肠杆菌或哺乳动物细胞，如中国仓鼠卵巢(CHO)细胞。

在本发明的第五方面，提供了一种融合蛋白的生产方法，它包括步骤：

(a)培养上述的宿主细胞，从而表达所述的多肽；

(b)分离出所述的多肽。

在本发明的第六方面，提供了一种药物组合物，它含有有效量(如0.01-99.99wt％)的上述的多肽和药学上可接受的载体。

附图说明

图1显示了hCGβ CTP37 cDNA的核苷酸及其编码的氨基酸序列。其中下划线部位分别为限制性内切酶BglII和BamHI的识别位点。SEQ ID NO：2中第3-39为CTP的氨基酸。

图2显示了质粒pBSMR(CTP)₁的构建过程。

图3显示了质粒pBSMR(CTP)₄的结构图。

图4显示了质粒pBSdxxCα(CTP)₄的结构图。

图5显示了质粒pPIC9K Cα(CTP)₄的结构图。

图6显示了酵母表达质粒pPIC9K Cα(CTP)₄中hCGβ(CTP37)₄ cDNA的核苷酸及其编码的氨基酸序列。其中下划线部位分别为限制性内切酶BglII和BamHI的识别位点；波浪线处为BamHI/BglII接头。

图7显示了在毕赤酵母中表达的CTP二聚体、三聚体、四聚体Western印迹分析结果。其中各泳道如下：

泳道1、2：转染pPIC9K-Cα-(CTP)₂的GS115细胞培养上清液；

泳道3、4：转染pPIC9K-Cα-(CTP)₃的GS115细胞培养上清液；

泳道5：转染pPIC9K的GS115细胞培养上清液(空白对照)；

泳道6：hCGβ(对照)；

泳道7、8、9：转染pPIC9K-Cα-(CTP)₄的GS115细胞培养上清液。

图8显示用常规柱层析分离产物流程图。

图9显示了兔抗CTP多聚体血清的Western印迹检测结果。其中各泳道如下：

泳道1：纯化的融合蛋白GST-CTP3；

泳道2：酶切后的融合蛋白GST-CTP3；

泳道3：纯化的CTP3蛋白；

泳道4：纯化的融合蛋白GST-CTP4；

泳道5：酶切后的融合蛋白GST-CTP4；

泳道6：纯化的CTP4蛋白；

泳道7：hCGβ对照；

泳道8：GST对照。

图10显示了质粒pPIC9Khis6(CTP)₄C3d3的结构图。

图11显示了用于改造pBluescriptIIks(简称pBS)的多克隆位点的序列。

具体实施方式

本发明人经过广泛而深入的研究，首次用基因工程的方法构建编码hCGβCTP37的二、三、四聚体基因，并在大肠杆菌和巴氏毕赤酵母中表达到了CTP37的二、三、四聚体。用表达得到的三、四聚体蛋白免疫家兔，获得了滴度较高的特异性抗体，从而克服了hCGβ CTP37分子量小，免疫原性弱的弱点。

如本文所用，术语“人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽”、“hCGβCTP37”、“CTP37”可互换使用，都指人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37个氨基酸所构成的肽。

如本文所用，术语“多聚体CTP融合蛋白”指由多个CTP37串联形成的融合蛋白。

(i)上游肽

在本发明通式如下的融合蛋白中

                    A-(CTP-B)n-D    式I

式中，A是NH2、信号肽、或前导肽。较佳地，A是NH2、6His、或C3d3、GST。更佳地，A是NH2、6His、或C3d3。

(ii)CTP

在本发明，优选的CTP序列是天然的人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽”或其保守性变异形式。

各CTP序列的连接方式没有特别限制，可以头头相连、头尾相连、或尾尾相连。

在本发明融合蛋白中，n为2-30的整数，较佳地，n为3-15的整数，更佳地为4-10的整数。此时，融合蛋白的分子量约为18-60kD，适合巴斯德毕赤酵母和大肠杆菌表达系统。当然，对于其他适合表达系统，n的上限可以超过20，例如25，30，35，40甚至更高。

(iii)接头

在本发明融合蛋白中，B为接头。如本文所用，术语“连接肽”或“接头”(linker)指位于各CTP序列之间的、起连接作用的短肽。连接肽的长度通常为1-20个氨基酸，较佳地为2-10个氨基酸。连接肽的长度也可为0，此时各CTP序列直接相连。关于连接肽的描述，可参见Paul W.Dempsey等人，Science 271(1996)p.346-350。

在优选例中，接头的长度为2-10个氨基酸。长度越短，则CTP在融合蛋白中的比例越高，因此短接头更适用于本发明。一种优选的接头是GlySer。

(iv)下游肽

本发明融合蛋白可以不含有下游肽，也可含有下游肽D。下游肽的作用通常是提供酶切位点，以便于纯化。有时，下游肽的编码序列还可提供用于克隆操作的限制性位点。

合适的下游肽例子包括(但并不限于)：长度1-6个氨基酸的短肽(如6His)以及其他长度更长的肽段(如C3d3)。

(v)融合基因、载体和宿主细胞的构建

编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得CTP的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明融合蛋白的DNA序列。

通常，先根据本发明融合蛋白的氨基酸序列设计出编码DNA。较佳地，可根据选用的宿主细胞如巴斯德毕赤酵母或大肠杆菌，进行密码子优化。

在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞。最后，培养转化后的宿主细胞，通过分离纯化得到本发明的新的融合蛋白。

如本文所用，术语“载体”包括质粒、粘粒、表达载体、克隆载体、病毒载体等。优选的质粒包括(但并不限于)：巴斯德毕赤酵母系统的pPIC9或pPIC9K，或大肠杆菌系统的pET30(a)等，并且根据选定的载体，设计酶切位点。

在本发明中，可选用本领域已知的各种载体如市售的载体。比如，选用市售的载体，然后将编码本发明新融合蛋白的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列，可以形成蛋白表达载体。

如本文所用，“可操作地连于”指这样一种状况，即线性DNA序列的某些部分能够影响同一线性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信号肽DNA作为前体表达并参与多肽的分泌，那么信号肽(分泌前导序列)DNA就是可操作地连于多肽DNA；如果启动子控制序列的转录，那么它是可操作地连于编码序列；如果核糖体结合位点被置于能使其翻译的位置时，那么它是可操作地连于编码序列。一般，“可操作地连于”意味着相邻近，而对于分泌前导序列则意味着在阅读框中相邻。

在本发明中，术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞，昆虫细胞、和哺乳动物细胞。较佳地，该宿主细胞是真核细胞，更佳地是家蚕细胞。

在获得转化的宿主细胞后，可在适合表达本发明融合蛋白的条件下培养该细胞，从而表达出融合蛋白。然后再分离出表达的融合蛋白。

(vi)融合蛋白的生产和纯化

对于转化的表达融合蛋白的宿主细胞，可用常规方法和条件进行培养，从而表达出融合蛋白，并用常规方法(如盐析方法、离心、分子筛层析、吸附层析、离子交换层析、HPLC等)进行分离纯化。

(vii)抗体

另一方面，本发明还包括对CTP多聚体融合蛋白或其编码DNA具有特异性的多克隆抗体和单克隆抗体，尤其是单克隆抗体。这里，“特异性”是指抗体能结合于CTP多聚体融合蛋白。较佳地，指那些能与CTP多聚体融合蛋白结合但不识别和结合于其它非相关抗原分子的抗体。本发明还包括那些能与修饰或未经修饰形式的CTP多聚体融合蛋白结合的抗体。

本发明不仅包括完整的单克隆或多克隆抗体，而且还包括具有免疫活性的抗体片段，如Fab’或(Fab)₂片段；抗体重链；抗体轻链；遗传工程改造的单链Fv分子；或嵌合抗体。

本发明的抗体可以通过本领域内技术人员已知的各种技术进行制备。例如，纯化的CTP多聚体融合蛋白，可被施用于动物以诱导多克隆抗体的产生。与之相似的，表达CTP多聚体融合蛋白的细胞可用来免疫动物来生产抗体。本发明的抗体也可以是单克隆抗体。此类单克隆抗体可以利用杂交瘤技术来制备(见Kohler等人， Nature 256；495，1975；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6.511，1976；Kohler等人， Eur.J.Immunol.6：292，1976；Hammerling等人， In Monoclonal Antibodies and T Cell Hybridomas，Elsevier，N.Y.，1981)。

抗体也可用于设计成针对体内某一特殊部位的免疫毒素。如抗CTP多聚体融合蛋白的单克隆抗体可与细菌或植物毒素(如白喉毒素，蓖麻蛋白，红豆碱等)共价结合。一种通常的方法是用巯基交联剂如SPDP，攻击抗体的氨基，通过二硫键的交换，将毒素结合于抗体上，这种杂交抗体可用于杀灭表达hCG的细胞(例如肿瘤细胞等)。

多克隆抗体的生产可用CTP多聚体融合蛋白或多肽免疫动物，如家兔，小鼠，大鼠等。多种佐剂可用于增强免疫反应，包括但不限于弗氏佐剂等。

本发明的研究表明，四聚体诱导产生的抗体滴度高于三聚体，因此这提示多聚体的免疫原性肯定强于单体，因此多聚体的hCGβ CTP37是一种极具潜力的防治恶性肿瘤和抗生育作用的蛋白疫苗。

另外，本发明蛋白疫苗作用机理非常清楚，安全性方面也有保障。而且通过真核表达系统来表达，表达出来的蛋白会有翻译后修饰(如糖基化等)，使得表达的蛋白在人体内具有更长的半衰期，从而能够延长疫苗的作用时间。

(viii)用途和药物组合物

本发明的融合蛋白或抗体有二大治疗和预防用途：

(1)治疗肿瘤

第一种方式是直接将本发明的融合蛋白作为抗原制成疫苗组合物，然后施用于癌症患者。癌症患者经免疫后产生抗体，使癌细胞生长停滞或癌细胞坏死，从而使恶性肿瘤变小或消失，达到治疗恶性肿瘤的目的。

第三种方式是将本发明特异性针对多聚体CTP融合蛋白的抗体直接施用于癌症患者。

(2)抗生育

本发明的融合蛋白还可作为抗原制成疫苗组合物，然后施用于育龄妇女。育龄妇女在注射疫苗后，产生抗体，使着床的受精卵不能继续生长和发育，导致妊娠中断，从而达到抗生育的作用。

因此，在本发明的另一方面，提供了一种含所述融合蛋白的药物组合物(包括疫苗组合物)。

本发明的药物组合物包括有效量的本发明的多聚体CTP融合蛋白或其特异性抗体，以及至少一种药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在制备这些组合物时，通常将活性成分与赋形剂混合，或用赋形剂稀释，或包在可以胶囊或药囊形式存在的载体中。当赋形剂起稀释剂作用时，它可以是固体、半固体或液体材料作为赋形剂、载体或活性成分的介质。因此，组合物可以是片剂、丸剂、粉剂、、溶液剂、糖浆剂、灭菌注射溶液等。合适的赋形剂的例子包括：乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、等。制剂还可包括：湿润剂、乳化剂、防腐剂(如羟基苯甲酸甲酯和丙酯)、甜味剂等。

组合物可制成单元或多元剂型。各剂型包含为了产生所期望的治疗效应而计算出预定量的活性物质，以及合适的药剂学赋形剂。

配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：肌内、腹膜内、静脉内、皮下、皮内、或局部给药。

使用药物组合物时，是将安全有效量的本发明融合蛋白或其抗体施用于人，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约5毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

此外，本发明的融合蛋白还可与其他治疗药物联用，其中包括(但并不限于)：TNF、IL-2。

简而言之，本发明的主要优点在于：

1、利用生物工程方法表达目的蛋白，生产成本低，安全性好；

2、基因重组表达的多聚体蛋白免疫抗原强于单聚体；

3、设计合成编码hCGβ CTP37多肽的基因序列含有巴斯德毕赤酵母偏爱的密码子，有利于提高表达量；

4、酵母表达蛋白含有糖链，有利于延长疫苗在体内的半衰期。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

实施例1

用多聚酶链反应(PCR)扩增获得编码hCGβ CTP37的cDNA片段

以化学合成的hCGβ CTP37 cDNA(由上海博亚生物技术有限公司合成)为模板，以一对如下所示的合成引物进行PCR扩增：

正向引物P-F：5′-GGA  AGA TCT ACC TGT GAC GAC CCT CG-3′(SEQ IDNO：5，下划线为BglII酶切位点)

反向引物P-R：5′-CG  GGA TCC TTG TGG CAG AAT TGG-3′(SEQ ID NO：6，下划线为BamHI酶切位点)

将扩增获得的hCGβ CTP37 cDNA片段，克隆入pMD18-T(购自Takara公司)中，获得质粒pMD18-T/CTP。经DNA序列测定，结果表明插入的序列是hCGβ CTP37的编码序列。图1显示了hCGβ CTP37 cDNA的核苷酸及其编码的氨基酸序列。

实施例2

CTP多聚体在巴斯德毕赤酵母中的表达

在本实验例中，构建含hCGβ CTP37的二、三、四聚体的cDNA不同的表达载体，并在巴斯德毕赤酵母表达系统中进行表达。用免疫亲和柱及其它常规分离纯化技术，分离纯化重组产物。

(A)构建含编码CTP多聚体的cDNA的巴斯德毕赤酵母表达质粒

对购自Stratagene公司的pBluescriptIIks(简称pBS)的多克隆位点进行改造，获得质粒pBSMR。具体方法是，将pBS多克隆位点XhoI和NotI之间的序列用合成的序列代替。合成序列如图11所示。

对购自Stratagene公司的pBluescriptIIks的多克隆位点进行改造，获得质粒pBSdxx。具体方法是：pBS经XhoI/XbaI酶切后，在4种dNTP存在下，经Klenow大片DNA聚合酶作用，填平末端，再连接形成的质粒即为pBSdxx。

用BglII/BamHI双酶切pMD18-T/CTP，回收CTP/BglII & BamHI片段，克隆入pBSMR的BglII位点。获得质粒pBSMR(CTP)₁。pBSMR(CTP)₁经BglII/BamHI双酶切能切出127bp片段，说明插入方向正确。DNA序列测定进一步证实插入片段的序列正确，方向也符合要求(图2)。

用同样的方法，在pBSMR(CTP)₁的BglII位点插入CTP/BglII&BamHI片段，获得质粒pBSMR(CTP)₂。

在pBSMR(CTP)₂的BglII位点插入CTP/BglII&BamHI片段，获得pBSMR(CTP)₃。

在pBSMR(CTP)₃的BglII位点插入CTP/BglII&BamHI片段，获得pBSMR(CTP)₄(图3)。

用XhoI/NotI分别双酶切pBSMR(CTP)_2-4，获得(CTP)_2-4的cDNA片段，连接上  Cα基因(序列参见熊爱生等，2003，生物化学与生物物理学报，35(2)：154-160。由上海博亚生物技术有限公司合成)后，克隆入pBSdxx的XhoI/NotI位点，获得pBSdxxCα(CTP)_2-4。图4为质粒pBSdxxCα(CTP)₄的示意图。

该质粒经SacI/NotI双酶切，回收Cα(CTP)_2-4 cDNA片段，克隆入pPIC9K(购自Invitrogen公司)的SacI和NotI位点之间，最终获得酵母表达质粒pPIC9K Cα(CTP)_2-4。图5为质粒pPIC9K Cα CTP₄的示意图。

图6为(CTP)₄的cDNA核苷酸及其编码的氨基酸序列。

(B)表达CTP多聚体工程细胞株的建立

用常规的电穿孔法，将表达质粒pPIC9K Cα(CTP)_2-4导入巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115(购自Invitrogen公司)，采用常规的G418选择法，选出含高拷贝外源基因的细胞株，表1为细胞株的筛选情况。

                                   表1不同浓度的G418对转化子的筛选情况

转化子	0.5mg/mLG418			3.0mg/mLG418			6.0mg/mLG418			8.0mg/mLG418
													挑克隆数	阳性数(个)	阳性率(％)	挑克隆数	阳性数(个)	阳性率(％)	挑克隆数	阳性数(个)	阳性率(％)	挑克隆数	阳性数(个)	阳性率(％)
	pPIC9K-Cα-(hCGβ-CTP37)2	1196	356	29.8	356	176	49.4	176	96	54.5	96	44													45.8
pPIC9K-Cα-(hCGβ-CTP37)3													1184	372	31.4	372	152	40.9	152	110	72.4	110	41	37.3
	pPIC9K-Cα-(hCGβ-CTP37)4	1222	229	18.7	229	92	40.2	92	78	84.8	78	38													48.7

(C)CTP多聚体的表达

用摇瓶培养酵母菌，通过甲醇诱导，外源基因得到表达，并且能分泌至培养液中，经过96h-120h培养，其表达量达20～30mg/升或更高。

用发酵罐培养，细胞密度可达400 OD₆₀₀nm或更高，表达量提高5-10倍，达100-200mg/升。

(D)表达产物的鉴定

图7为摇瓶发酵培养液经SDS-PAGE后，转移至硝酸纤维素膜上，先用抗hCG血清反应，再与偶联碱性磷酸单酶的羊抗兔抗体反应，然后加入氯化氮蓝四唑(Nitro Blue Tetrazolium)和5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸二钠盐(5′-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate)进行显色反应。结果表明，抗hCG抗体能专一性地识别酵母中表达CTP二、三、四聚体，其表观分子量分别为21kD、30kD、40kD，比预期的分子量要大，这可能是由于CTP中含4个“O”连接的糖。

由于产物能分泌到培养液中，这将有利于产物的纯化，可采用免疫亲和柱或离子交换树脂和分子筛等常规纯化手段从培养液中纯化表达产物。在本实施例中，用图8所示的用柱层析分离法，分离获得纯化的表达产物。

实施例3

CTP三、四聚体在大肠杆菌中的表达

(A)表达质粒的构建

为了构建以GST融合蛋白形式表达的质粒，用BglII/NotI从pBSMR(CTP)₃和pBSMR(CTP)₄中切出CTP三聚体、四聚体cDNA，克隆入pGEX4T-2(购自Amersham Biosciences公司)的BamHI/NotI位点，获得表达质粒pGEX4T-2(CTP)₃和pGEX4T-2(CTP)₄.，经测序证明，插入的序列是正确的。用上述二质粒分别转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得表达菌株。菌液培养至A₆₀₀ 0.7，在1mM IPGT诱导下，37℃继续培养3-4h，收集菌体。称量菌体重量，菌体于-20℃过夜，冷冻过的菌体拿到室温进行融化，全部融化后每克菌体加入裂解液3ml重悬沉淀，每克加8μL PMSF(50mM)，80μL溶菌酶(10mg/ml)，20分钟内不时搅拌，边搅拌边加入去氧胆酸4mg/克菌，置37℃搅拌直至粘稠，每克菌体加20μL DNaseI酶(1mg/ml)，室温搅拌约25分钟，直至不再粘稠。4℃ 15000rpm离心三次，转移上清，直至不再有多少沉淀。将所有上清倒入一小烧杯，用1X PBS稀释1倍，按终浓度1％加入Triton X-100，充分混匀。采用Amersham pharmacia公司的GST纯化试剂盒分离纯化融合蛋白。

纯化产物GST(CTP)_3 or 4，用凝血酶酶切后，经SDS-PAGE分离，切下胶条带，用PBS浸泡回收CTP三聚体和四聚体。进而免疫新西兰大白兔，经三次免疫(第一次用完全弗氏佐剂，第二、三次用不完全弗氏佐剂)后，放血取血清，用ELISA方法测定抗体效价。结果表明，CTP三聚体和四聚体能有效地产生抗体，以纯化后的CTP三聚体或四聚体包被，其滴度分别为：1∶64万和1∶32万，四聚体的抗原性较三聚体强，产生的抗体滴度较三聚体高，因此这表明四聚体的免疫原性会较单聚体更强，产生的抗体滴度也会比单聚体更高。

以制备所得的兔抗CTP₄抗体作Western blot分析，结果表明抗体不仅能识别CTP₃和CTP₄，且能识别hCGβ(图9)。说明该抗体可以用作制备免疫亲和层析柱，用于酵母表达的CTP多聚体的纯化，而且也表明抗CTP多聚体抗体能专一性识别hCGβ，为基于hCGβ的抗生育/抗肿瘤疫苗的应用奠定了基础。

实施例4

CTP多聚体和C3d3融合蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达

C3d3是血清补体成分裂解过程中的一个片段，是新近发现的一个能显著增强免疫应答的分子佐剂。为了进一步增强疫苗的免疫原性，增强人体免疫应答反应，在本实施例中，在CTP多聚体cDNA后连接了C3d3 cDNA，构建了表达质粒pPIC9KHis6(CTP)_2-4C3d3(见图10)，在巴斯德毕赤酵母中表达了His6(CTP)_{2- 4}C3d3，其N端带His6有利于纯化。

研究表明，C3d增强免疫原性的能力是完全弗氏佐剂(CFA)的100倍，由于C3d3的存在，在免疫时不必与TT或DT偶联，也不必用其他佐剂，而且效果更好。交联了C3d的CTP多聚体的免疫原性有进一步的提高，IgG水平也提高了至少10倍。

实施例5

纯化产物的制剂

对实施例3中获得的纯化后原液加入10％甘露醇，分装，冷冻抽干，制成多聚体CTP融合蛋白的注射用粉针剂。经稳定性试验表明，该粉针剂稳定。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

                                      序列表

<110>上海市计划生育科学研究所

<120>人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽多聚体及用途

<130>052293

<160>6

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>123

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(123)

<223>

<220>

<221>misc_feature

<223>CTP序列

<400>1

aga tct acc tgt gac gac cct cgt ttc caa gac tcc tct tcc tct aag    48

Arg Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

gct cct cca cca tcc ctt cca tct cct tcc aga ttg cct ggt cca tct    96

Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser

            20                  25                  30

gac act cca att ctg cca caa gga tcc                                123

Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser

        35                  40

<210>2

<211>41

<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>CTP序列

<400>2

Arg Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys

1               5                   10                  15

Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser

            20                  25                  30

Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser

        35                  40

<210>3

<211>489

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>CDS

<222>(1)..(483)

<223>

<220>

<221>misc_feature

<223>4聚体CTP

<400>3

tcc aga tct acc tgt gac gac cct cgt ttc caa gac tcc tct tcc tct    48

Ser Arg Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser

1               5                   10                  15

aag gct cct cca cca tcc ctt cca tct cct tcc aga ttg cct ggt cca    96

Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro

            20                  25                  30

tct gac act cca att ctg cca caa gga tct acc tgt gac gac cct cgt    144

Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg

        35                  40                  45

ttc caa gac tcc tct tcc tct aag gct cct cca cca tcc ctt cca tct    192

Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser

    50                  55                  60

cct tcc aga ttg cct ggt cca tct gac act cca att ctg cca caa gga    240

Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly

65                  70                  75                  80

tct acc tgt gac gac cct cgt ttc caa gac tcc tct tcc tct aag gct    288

Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala

                85                  90                  95

cct cca cca tcc ctt cca tct cct tcc aga ttg cct ggt cca tct gac    336

Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp

            100                 105                 110

act cca att ctg cca caa gga tct acc tgt gac gac cct cgt ttc caa    384

Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln

        115                 120                 125

gac tcc tct tcc tct aag gct cct cca cca tcc ctt cca tct cct tcc    432

Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser

    130                 135                 140

aga ttg cct ggt cca tct gac act cca att ctg cca caa gga tct gga    480

Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser Gly

145                 150                 155                 160

tcc taatag                                                         489

Ser

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<212>PRT

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>4聚体CTP

<400>4

Ser Arg Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser

1               5                   10                  15

Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro

            20                  25                  30

Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg

        35                  40                  45

Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser

    50                  55                  60

Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly

65                  70                  75                  80

Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala

                85                  90                  95

Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp

            100                 105                 110

Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser Thr Cys Asp Asp Pro Arg Phe Gln

        115                 120                 125

Asp Ser Ser Ser Ser Lys Ala Pro Pro Pro Ser Leu Pro Ser Pro Ser

    130                 135                 140

Arg Leu Pro Gly Pro Ser Asp Thr Pro Ile Leu Pro Gln Gly Ser Gly

145                 150                 155                 160

Ser

<210>5

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<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>5

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<210>6

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>misc_feature

<223>引物

<400>6

cgggatcctt gtggcagaat tgg                                                      23

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽是人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽的多聚体。

2.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，所述多肽具有式I所示的结构：

                   A-(CTP-B)n-D  I

式中，CTP是人绒毛膜促性腺激素β链羧基端37肽；

A是NH₂、信号肽、或前导肽；

B是连接肽或无；

D是COOH或下游肽；

n是2-30的整数。

3.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，n是3-15。

4.如权利要求1所述的多肽，其特征在于，A为NH₂、6His、或C3d3、GST，B为GlySer或无，D为COOH、6His或C3d3。

5.如权利要求3所述的多肽，其特征在于，所述的多肽具有SEQ ID NO：4所示的氨基酸序列。

6.一种DNA分子，其特征在于，它编码权利要求1所述的多肽。

7.一种表达载体，其特征在于，它含有权利要求6所述的DNA分子。

8.一种宿主细胞，其特征在于，它含有权利要求7所述的表达载体，或者在其基因组中整合有权利要求6所述的DNA分子。

9.一种融合蛋白的生产方法，其特征在于，包括步骤：

(a)培养权利要求6所述的宿主细胞，从而表达权利要求1所述的多肽；

(b)分离出权利要求1所述的多肽。

10.一种药物组合物，其特征在于，它含有有效量的权利要求1所述的多肽和药学上可接受的载体。

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