CN1189213C - 免疫抑制 - Google Patents

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Abstract

这项发明涉及一种改善哺乳动物，特别是人，对异种移植的耐受性的方法。这种方法通过使用一种包含从猪多肽而来的B细胞抗原决定部位和T细胞抗原决定部位的组成物对接受移植的哺乳动物进行免疫。这项发明还包括了免疫原性组成物，它包括所提到的免疫原和监测异种移植状态的方法。

Description

免疫抑制
1.此项发明所属领域
这项发明与免疫抑制有关。具体的说，是与异种移植中的免疫抑制有关。
2.此项发明的背景资料
尽管成功的同种异体的器官移植方法已经被建立起来，但必须要克服日益增长的移植器官需求与供给不平衡这一矛盾。增加同种异体移植器官的供应并不能提供一个令人满意的解决办法，即使全世界所有可供使用的同种异体移植器官都用上，也无法满足现有需求(1，2)。这使得将异种移植(不同种动物之间的器官移植)视作一种可行且具吸引力的替代方法，对它再度引起关注。
异种移植研究近来集中在猪身上，因为猪在尺寸大小、生理性质以及饲养特点等方面(3，4)适合作为一种动物供移植体。但直到最近，当在血管再形成时不可避免产生的体液介导超急性排斥反应(HAR)所导致的器官排斥反应都限制了非一致性异种移植的应用。HAR是大多数异种器官移植最终的结果。最近，对于HAR的免疫生物学机理的认识取得了显著的进步，采用许多手段来克服HAR。具有重大意义的是，多种多样的转基因方法正在应用当中，这其中包括在猪内皮细胞补体活性调节因子的表达(5)。可以预见异种移植物短期存活的目标会很快达到(6)。这些关于攻克HAR的最新进展使得随后有关克服异种移植物长期存活的免疫生物学障碍的工作变得令人瞩目。免疫反应中的体液和细胞群看来是在免疫生物排斥的下游起到作用。很清楚，最重要的是由令人生畏的T细胞介导排斥反应(7-11)的存在，这种T细胞介导排斥反应过去由于HAR所处的主导地位而显得模糊不清。在体外，人T细胞已经表现出在辨认异种基因细胞中起到了核心作用(7，8，12)，随之通过直接和间接的T细胞激活通路产生敏化作用。这在同种异体识别和同种异体移植排斥反应中已被许多资料证明(13)。有关异体移植排斥反应现象下有关细胞机理的知识为研究T细胞介导异种反应提供了一个重要的基础。
目前，防止器官移植中细胞介导的排斥反应，主要的治疗手段是依赖系统性免疫抑制药物或单克隆抗体(Mab)疗法来直接攻击靶体如CD3，CD4，CD25，(14)。如下文献报道在体外实验中会产生强烈的T细胞异种反应(7，8，12)，控制异种移植排斥反应可能需要使用大于现行标准剂量的免疫抑制剂。这种策略在异种移植的环境下是不可取的：药物必须终生服用，它抑制整个免疫系统，会导致受感染的风险加大，且更易患上癌症(14)。对于异种移植的临床应用可行性来说，靶向特定移植在耐受感应/免疫抑制方面无疑具有很高的优越性。当在同种异体中难以达到的时候，异种移植则具有很大潜力：由于种的不同，提供了对反应物生成的选择性，因而真正作到特定化移植。此外，在移植前，能够有机会对猪的来源器官和人类器官接受者的免疫系统进行一些处理(1)。
3.详细背景
3.1 T细胞的激活和增殖
最优的T细胞的增殖，虽然通过与特异性抗原CD3/TCR复合物来启动(信号1)，但其增殖要达到最佳，还需要通常是由抗原存在细胞(APC)提供的额外协同刺激信号(信号2)(15，16，17)。同时T细胞在信号2存在下所产生的抗原刺激导致T细胞激活和增殖(18)，在没有信号2的情况下，T细胞暴露在MHC-抗原复合物下会导致T细胞增殖和克隆无力的发展(19，20)。通过乙醛固定或者加热来处理APC，已经表明会在不改变MHC-II表面表达的水平的同时，消除APC激活同种异体反应的T细胞的能力。所以在T细胞受体的单独占据下是不足以完全激活这些T细胞的(17)。无反应性的T细胞最鲜明的特性就是它们IL-2(白细胞介素-2)制造的缺乏，继而暴露在抗原下，它们仍旧缺乏制造IL-2的能力(22)。由此验证了由Lafferty等人预言的两种激活信号模型(23)。由于T细胞对一种给定的抗体原的刺激产生反应，从APC(23)产生多重激活信号就是不可缺少的。
1986年Jenkins和Schwartz(24)使用化学固定的APC将特异肽引入CD4 T辅助克隆中，最先报道了在缺少第二信号的条件下，体内T细胞无力的现象。从那时起，有大量的体内体外实验数据都支持这一假说，即分离状态下的信号1是不能够激活T细胞的(22)，并且协同刺激信号不是由于可溶性因子在起作用，而是与其他细胞接触所产生的。成纤维细胞转染二级(classII)MHC分子，并不能表达适合的CS信号(缺乏信号2)，但在限定性二级CD4 T细胞克隆群中充分表现出抗原，然而这些却不能促成抗原特异性T细胞的增殖并使得细胞无力。T细胞最初遇到抗原所出现的一系列情况对随之产生的免疫反应具有重要的意义。
由此，协同刺激分子对于T细胞的激活和增殖极为重要，并由此产生T细胞受体与在APC中表达的配体之间的相互作用。然而，协同刺激信号自身却既不是抗原特异性，也不是MHC限定性(25)。近年来，涉及调节协同刺激的分子之间的相互作用已被详细的阐明。两个关键的通道包括(i)B7-1，B7-2(B7家族中的成员)和(ii)CD40，它在APC中被表达，它们的反受体CD28和CD40配体(CD40L)分别在T细胞中表达。在体内和体外实验中，大量证据清楚地证明，在T细胞协同刺激中，B7-1，B7-2和CD40所起到的至关重要的作用(26-36)。此外，在同种异体移植中同时阻断经过CD28-B7和CD40-CD40L的信号，会阻止同种异体移植排斥反应的发作(37，38)。在体内，以B7/CD28为目标攻击已经表现出可以阻止T细胞感受移植抗原，从而延长移植的存活(38，39)。
T细胞被激活抵抗异种抗原，是通过两种通道中的一种来实现。这两种通道为直接和间接通道，它们和已被详细研究的T细胞抗击同种抗原激活通道类似(图1)。直接识别要求接受(移植)者T细胞通过给予者刺激细胞上的肽来识别完整的异种MHC-分子复合物。与之形成对比，间接识别要求接受(移植)者的APC在异种抗原呈现到接受(移植)者MHC II中的T细胞之前对其进行处理，这一MHC II范围内的T细胞具有针对异种抗原的特性，它能够识别肽并产生反应。同时大多数数据报道的是间接异种识别反应，通过直接路径的细胞介导排斥反应也被证实(7，8，9，11，12，40，41，42)。体外实验中，有力的人T细胞反应出旺盛增殖来直接对抗猪组织也被以上实验室和其它实验室所证实。
3.2协同刺激分子
体内和体外实验都充分的说明，对于TCR-CD3受体与MHC和肽的结合，协同刺激分子起到了至关重要的作用。目前正应用对抗协同刺激分子策略针对无论是受体或其配体作为治疗学手段来改变免疫反应。这样的方法已经在移植系统模型上加以验证，改变细胞介导反应从而阻止移植排斥反应。
B7-1(B7/BB1，CD80)和B7-2(CD86)均属于免疫球蛋白总科，而且均为高度糖基化的跨膜蛋白(25)。B7-1，作为B细胞激活分子于1989年首次被确认(27)，接着，B7-2于1993年被确认(49)。人的B7-1和B7-2，以及鼠的同系物都已经被克隆和功能性特性化(25)。B7-1和B7-2在脾脏和血液树突状细胞中构成性表达，并诱导B细胞和单核细胞激活(34，35)。B7-1和B7-2高度同源，并且是T细胞抗原CD28(50)的天然的配体。一种细胞表面糖蛋白，细胞溶解性T淋巴细胞抗原-4(CTLA-4)，已经被确认为B7家族分子的第二受体(51)，它与CD28具有同源性，在顺序上有31％一致。两种同形的B7即，B7-1和B7-2与CTLA-4结合，比起CD28来具有更高的亲和度。同时，无论在体内还是体外，CD28-B7受体结合导致来源于APC的协同刺激信号卷入到抗原特异性白细胞介素-2的产生过程中(53，54)。CTLA4看起来是T细胞激活的负调节因子(55，56，57)。与抗CTLA4抗体的交联表现出对抗CD28联接的作用，此外，CTLA4敲除的小鼠由于无法控制淋巴增生，在生命的最初几周内死亡(59)。因此，CTLA4联接被认为是维持和调节免疫反应所至关重要的。然而，其深一层的机理至今还没有弄清。
在协同刺激分子中，B7家族显得独特，因为CD28无论与B7-1或B7-2的联接，都是防止诱导产生(细胞)无力的充分必要条件(34)。CD28-B7的相互作用被认为是给维持被激活的T细胞的增殖传递了极为重要的信号。体外数据支持这些观察，表明若细胞缺乏B7，无法激活一个主要的MLR的同时，转染子表达高水平的B7，会获得这样的能力：通过同种活化T细胞来刺激白细胞介素-2的生成，并协同刺激培养在固定化抗CD3 Mab上的纯化了的T细胞多克隆株群(31)。持续稳定地用HLA-DR7，B7或两者同用来转染NIH-3T3细胞，产生人造APC，清楚的表明随后加入破伤风毒素，只有在APC和B7都存在的情况下，才能产生最理想化的T细胞增殖及白细胞介素-2的生成。缺少了B7，会产生克隆无力。
猪B7-2(PoB7-2)已经从大动脉内皮细胞中克隆出来(60)。被猪B7-2短暂转染后，人脐带静脉上皮细胞被天然的T细胞强烈地协同刺激以产生白细胞介素-2。这种人T细胞被PoB7-2协同刺激已显示出与人B7-1或B7-2提供的协同刺激信号同样有效，并能被huCTLA4Ig(人CTLA4免疫球蛋白)特异性阻断。由此PoB7-2对猪内皮免疫原性起到很大的作用。
虽然B7-1和B7-2介导的相互作用看起来在T细胞特异性免疫中起到了核心作用，但还是存在另外的重要的协同刺激通道。其中最重要的涉及CD40和CD40配体(CD40L)相互作用(34)。
CD40是一种属于TNF受体总科的50kDa表面糖蛋白。CD40在不同的APC中表达，包括在其它当中，单核细胞，树突状细胞和活化的巨噬细胞。其它细胞类型，包括上皮细胞，也能够表达CD40(34)。它的反受体CD40L(CD154，gp39，TRAP)是一种33kDa类型II的整合膜蛋白(34，36)，在活化的CD4 T细胞中短暂表达。CD40-CD40L相互作用已经表明，它在体液和细胞部队的免疫反应中起着重要作用，这些免疫反应在B细胞激活中成为支配性角色。同时CD40在B细胞上的交联对B细胞的生长和等模式变换极为重要，它也能导致B7表达的正调节(50)。CD40信号之后，单核细胞和树突状细胞的B7表达水平(以及由此而来的APC容量)很明显不受调节(34)。敲除CD40小鼠的实验数据表明，当与CD40联接后，CD40L信号在T细胞激活中起到了重要的作用(61)。用CD40(或用B7-1)转染小鼠P815肥大细胞瘤，能使以前非刺激性的P815细胞去介导多克隆T细胞激活以及细胞因子产生所必须的协同刺激(34)。CD40-CD40L相互作用也被证明在同种异体移植排斥反应中起到至关重要的作用(62，63)。
休眠的B细胞并不在高水平上正常表达B7-1/B7-2，直至它们被激活(50)。MHC肽/TCR和CD40-CD40L同时结合，B细胞随之激活，导致B细胞中B7家族成员正调节，随之增强T细胞的刺激和随后的激活(34，36)。由此，CD40-CD40L的相互作用通过促使B7家族分子和可能的其他协同刺激的分子的表达，来影响协同刺激行为，从而在T细胞激活中充当关键角色。CD40和B7的明显的协同作用表明T细胞依赖型免疫反应的激发和扩增协同刺激通路的重要性(38)。在通过改变树突状细胞功能状态从而产生细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)抗原反应的过程中，CD40-CD40L的相互作用也起到了至关重要的作用(64，65，66)。
广泛研究表明，对于B7与CD28，CD40与CD40L的相互作用，同时或阻断二者之一，对于同种异体和异种移植都是重要的。研究数据强烈支持上述观点，包括使用CTLA4Ig阻断通过CD28-B7的信号，导致移植存活可能性增加，阻止鼠心脏(44，45)和大动脉(43)同种异体移植模型上的慢性排斥反应。在这些模型中，CTLA4Ig给药，通过诱导T细胞无力，造成部分(44)或完全(46)的对移植抗原的耐受。使用抗-B7-2和B7-1抗体对同种异体胰岛移植物进行处理，也表明可以阻止移植排斥反应(14)。在鼠心脏同种异体移植模型上，通过抑制CD40信号造模型，也得到类似的结果(37，47，62)。两个特定同时阻断经过CD28-B7和CD40-CD40L的研究的研究表明能够阻止同种排斥的发生。在小鼠异体模型(37)和皮肤，心脏异体模型(38)中，使两条信号通路的阻断同时延长，能够完全消除慢性排斥反应的发生。
在异种移植领域，Lenshow和他的同事证明，伴随着CTLA4Ig的处理，移植到小鼠中的人胰岛表现出长期的，给予者特异性的耐受(46)。移植特异性耐受被证实是抑制通过B7表达APC的识别所导致的直接结果。此外，Tran等(67)证实通过细胞溶解性T淋巴细胞抗原-Fc处理而导致的短期抑制。可以得到有限的数据，说明在异种移植范围内，同时阻断两条信号通路，可以延长移植到鼠接受(移植)者中的大鼠和猪的皮肤的存活时间(63)。
体外和体内研究数据清楚地表明靶向攻击由CD28-B7通道或CD40-CD40L通道介导，或者是两个通道共同介导的相互作用，能够阻止T细胞对植入组织的同种异体抗原和异种抗原的敏化，从而延长移植的存活时间。
正如上面所提到的，T细胞介导的移植排斥反应被研究得非常详细。免疫系统能够提升替换的或者额外的细胞介导排斥机理。这些机理可以通过被各种各样的分子的功能来阐明，尤其是被内皮细胞所表达的分子。VCAM是一种细胞黏附分子，被内皮细胞所表达，被认为对发炎部位白细胞补充具有一定的作用。VCAM是一种可诱导的跨膜糖蛋白，在静止内皮细胞中具有基础水平的表达，但当暴露在促炎细胞因子(如IL-1，TNFα)时则快速表达。VCAM与白细胞的相互作用是通过在白细胞细胞表面表达的非常晚期的抗原4(VLA-4)。因此内皮细胞表达VCAM，能够去诱导在白细胞中的VLA-4渗透到炎症部位，这些炎症部位增大了对同种异体移植和异种移植的排斥反应。
通常认为猪的VCAM在允许人白细胞通过猪内皮细胞单细胞层的迁移中起到了重要的作用。可以合理地认为，如果阻断这种相互作用，将对异种移植产生有益的结果。猪的VCAM于1994年被克隆出来，它与人的VCAM非常相似(1)。文献1中的数据也提到，在体外研究中有充足的证据表明猪的VCAM能够有效于人白细胞表达反受体，VLA-4。例如，在精制吸附化验中，抗体对VCAM非常有效地阻止人NK和T细胞对猪内皮的结合。由于NK细胞，这种破坏阻止了细胞溶解，而这种情况在吸附在猪内皮单细胞层上时通常会发生。
T细胞介导异种移植排斥反应机理中抗-VCAM抗体的作用比较难预测。在一些啮齿类动物同种异体移植模型中，对抗VCAM的抗体已经被用来延长移植的存活时间。在某些情况下，已经有长期存活和特异性耐受的报道(2，3)，尽管这些研究的确切机理作用还没有被充分阐明。
3.5肽免疫法策略
以前使用合成肽，键合上载体分子，作为免疫原来进行体内研究，这已经展示了制造生物活性抗体产品的能力(68)。现在广泛的文献详细描述肽免疫法策略，表明通过载体表达来制造抗体产品水平的提高(68-72)。由此，合适的T细胞抗原决定部位能被当作最初的T细胞来随后协助B细胞。最新的研究数据已经出版，它报道了使用一种天然的反应抗原与一种载体分子共价结合(70)，随后通过自我反应活性的B细胞制造IgG。由此说明B细胞对同种蛋白的的耐受性是可以被克服的。
如上所述，为了被T细胞识别，抗体(自生或外来)必须被APC进行处理和导入(present)。在抗原通过IgG受体发生内吞作用后，B细胞可充当高度有效的APC。在充分补足激活信号(TCR结合加上协同刺激)的情况下，会发生T细胞激活并导致随后的抗体的生成。
同种蛋白中的肽以和异种蛋白同样的方式被T细胞处理和导入，但是由于T细胞的耐受性，同种肽的导入通常并不能导致T细胞的激活(70)。缺少T细胞的识别可能由此部分地解释为何具有潜在反应性的B细胞却不能响应。
克服B细胞对同种肽的无响应的技巧最近已经被Dalum等(69)所报道。通过以强大的异种载体T细胞抗原决定部位的方式，来供应额外T细胞辅助，会产生出一种自身抗体响应。深入研究表明，如果非常大量的自身反应(self-reactive)B细胞导入(present)到宿主(69，70)，合成肽与T细胞载体分子共轭连接，能够克服B细胞的非响应性。在泛激素的序列中插入单一的异种T细胞抗原决定部位，引起直接对抗自生分子的自生抗体的强烈产生(69)。在Sad所做的精妙的研究工作中，他使用GnRH作为同种蛋白，以化学方法与被用做合成的T细胞抗原决定部位的白喉类毒素(DT)连接，结果产生自生GnRH特异性的自生抗体(71，72)。最初接种之后，继续存在的自生GnRH在体内保持Ab的生成。自生分子持续表达存在以对抗特异性B细胞不断生成抗体，从而维持持续不变的抗GnRH抗体反应，抗体的持续生成造成赋予免疫性的小鼠处于无菌状态。DT携带者激发一种辅助T细胞响应，支持GnRH特异性B细胞，并且破坏B细胞的耐受性。
4.发明陈述
此项发明最广泛的方面是关于对哺乳动物使用免疫原，尤其是人类进行免疫处理。免疫原来自于抗体的生成，抗体对猪抗原决定部位具有特异性，猪抗原决定部位被涉及介导异种组织/器官免疫排斥反应的猪上皮细胞所典型性地，但不是专一性地表达。
免疫原在此被解释为任何抗原决定部位，或者是能够激发免疫反应的抗原决定部位的结合体。抗原决定部位可以是T细胞特异性的，或者是B细胞特异性的。本文中，抗原决定部位被解释为任何多肽，肽，修饰过的多肽，修饰过的肽(例如：可能的具有代表性的修饰如：通过对抗原决定部位的糖基化或磷酸化)。
此项发明具有代表性地包括抗原决定部位，它来源于猪的生物分子，至少从下列中选择一项：CD40；B7-1；B7-2；VCAM。
对于非常熟悉此种领域的人来说，很清楚此项发明通过应用猪的生物分子的一部分——其中包含一个并不在同源哺乳动物多肽中存在的B细胞抗原决定部位——确保在不扩增病人自生功能性抗体等价物和不扩增CD4 T细胞反应的时候能选择性地抗体生成，从而避免了细胞介导的排斥反应。即提供了一种使人的个体——最适宜在异种移植之前——具有免疫性的方法。此外，免疫原提供由接受(移植)者所产生的阻断抗体，消除了介导排斥反应的猪多肽的活性。
对于非常熟悉此种领域的人来说，仍然且更加显而易见，与以前的尝试技巧相比，此项发明具有显著的优越性。这种技巧在猪细胞/组织(移植)之前，对接受(移植)者的免疫系统进行免疫抑制，例如WO97119971公布了使用B7.2或VCAM多肽来生产诊断和治疗抗体，用以监测移植排斥反应和阻断异种移植排斥反应。
它(WO97119971)具有明显的不足，对移植病人使用诸如VCAM或B7.2抗体处理，需要对病人终生定期给药以维持抗体的阻断特性。此外，免疫系统将最终升高针对治疗抗体(抗个体基因型抗体)的抗体，从而导致治疗抗体从病人循环系统中被清除出去。
本项发明不需要定期给药，因为是病人自身免疫系统负责产生对猪多肽的阻断抗体。免疫系统不会将这些抗体视为异物，从而也就不会生成抗个体基因型抗体。
本项发明包括使用一种异种T细胞抗原决定部位，它对分子连接到载体上后产生的反应施加了显著的影响。使用这种方法，自生抗体响应可被用来对抗在异种移植中的猪多肽。
根据本项发明，能够提供一种改善某种具有T细胞介导免疫力的动物，包括人，对异种移植的耐受性的方法。这个方法包括引起动物抗体水平上升，以对抗涉及动物排斥反应生成的某种异体分子。通过使用一种嵌合的多肽来赋予动物免疫性，使得上述抗体水平上升。这个多肽包含一种能够对抗动物具有的免疫力的T细胞抗原决定部位和上述异体分子中的一种B细胞抗体决定部位。
因此，构建嵌合多肽，在移植前激发移植接受(移植)者生成特异性抗移植耐受促进抗体，使用这种多肽，靶向攻击直接T细胞介导反应，从而在移植接受(移植)者体内诱导异种移植的特异性耐受。作为例证，嵌合多肽由一种T细胞抗原决定部位连接到猪多肽B7-1，B7-2，CD40，VCAM序列上。植入组织的存在将会维持并永久保持移植接受者B细胞抗体的生成。
本项发明还提供了一种由T细胞抗原决定部位和B细胞抗原决定部位组成的嵌合多肽。上述T细胞抗原决定部位属于第一种类动物，包括人类；上述B细胞抗原决定部位属于第二种类动物。所谓第一种类和第二种类是指异种移植适合从第二种类动物到第一种类动物。
此外，本项发明提供了使用嵌合多肽以改善动物，包括人类对异种移植的耐受性。嵌合多肽属于上面所定义的范畴。
根据本发明更深入的方面，上述产生免疫原的组成包括至少一个T细胞抗原有效部位和至少一个B细胞抗原有效部位。B细胞抗原有效部位被定义特性为它来源于至少一种涉及到介导异种移植排斥反应的猪多肽，上述T细胞抗原有效部位来源于移植接受者已被免疫的某种分子。
然而本发明更具代表性的体现在于：以上提到过的免疫原成分至少由下列从猪CD40，VCAM，CD86，CD80其中之一而来的免疫抗原肽中的一种所组成。
上面提到的免疫原肽中具有代表性的是从猪CD40中得到的，而从猪CD40氨基末端区域得到的免疫原肽则是理想的，至少也应该是暴露在表达CD40猪细胞的细胞表面的氨基末端的一部分。更理想的上述抗原肽是从图22的肽序列中挑选出来的。
上面提到的免疫抗原肽中具有代表性的是从猪VCAM中得到的，而从猪VCAM氨基末端区域得到的免疫抗原肽则是理想的，至少也应该是暴露在表达VCAM猪细胞的细胞表面的氨基末端的一部分。更理想的上述抗原肽是从图24的肽序列中挑选出来的。
上面提到的免疫抗原肽中具有代表性的是从猪CD86中得到的，而从猪CD86氨基末端区域得到的免疫抗原肽则是理想的，至少也应该是暴露在表达CD86猪细胞的细胞表面的氨基末端的一部分。更理想的上述抗原肽是从图26的肽序列中挑选出来的。
具有代表性的上述抗原肽由至少9个氨基酸残基组成。更理想的上述肽有10-30个氨基酸残基所组成。
根据更广泛的方面本发明提供了产生免疫性的组成物，它根据了本发明中任何早先提到的观点或具体化的东西，上述的组成物更多地由至少一种针对上述的产生免疫性的组成物能够增强免疫反应的介质组成。
本发明具有代表性的体现在上述的介质是一种载体/辅助剂。
众所周知，载体/辅助剂在促进对选择性的抗原的免疫反应中是非常有用的。这些辅助剂既可以与抗体交联或配对连接，也可以和抗体一起对动物共同给药。辅助剂在促进免疫反应中非常有用，这一点在纽约Plenum出版社1995年出版的《疫苗设计：亚基和辅助剂方法》第七章，第141-228页中有详细的描述。可以应用各种不同的载体，赋形剂或稀释剂使得上面提到的免疫原组成物可以被贮藏并且/或者给药。例如，并非为了加以限制，把在脂质体中的免疫原组成物装胶囊便是一个方便的办法。脂质体是基于磷脂化的小囊泡，用做免疫原组成物和同样的物质的载体介质是非常合适的。
根据本发明更加广泛的方面，它提供了一种抗体，或至少一种有效部位，根据本发明，它直接趋向于至少一种猪多肽中的至少一个区域。
本项发明一个具有代表性的体现是上述抗体为一种单克隆抗体，或者至少是其中的一个有效部位。理想化的上述抗体是被标记了的。
对于非常熟悉本领域的人来说，显而易见，根据本发明的抗体将会有监测在猪组织/器官中的猪多肽的表达的应用。
根据本发明更广泛的方面，它提供了一种监测异种移植哺乳动物免疫状态的手段。理想化的监测手段是在体外。
根据本发明更广泛的方面，它提供了一种改善动物对异种移植的耐受性的方法，组成如下：
i)使用根据本发明中任何早先提到的的观点或具体化的东西，对于动物使用至少一种免疫原组成物给药。本项为可选择的。
ii)使用上述免疫原组成物监测上述动物的免疫状态。
iii)将至少一个猪组织或器官移植到上述动物中去，并且是可选择的。
iv)监测动物对上述猪组织或器官的排斥反应。
本发明理想化的方法中，提到的动物指人。
在本发明更具代表性的方法为，上面提到的异体移植为血管移植和/或者免疫原的猪细胞/组织。
本发明更加理想化的方法中，上面提到的异种移植是指猪胰岛。
对于非常熟悉本领域的人来说，显而易见，完成上面的(ii)项，可以通过检测对在血清中协同刺激分子的抗体的存在来完成[例如，通过协同刺激分子细胞表达的ELISA(酶联免疫吸附)或FACS(荧光激活细胞分类)分析方法]；或者作为选择，或者作为附加地通过常规T细胞消散化验，检测被处理动物血液中细胞溶解性的T细胞的存在。
本发明中嵌合多肽的使用其潜在的益处在于可以避免注射阻断抗体或融合蛋白。此外，接受(移植)者的抗体反应的诱导可以克服通常由于异种抗体或融合蛋白给药而带来的问题，即所谓的对给药制剂的免疫对抗。
现在仅应用实例并参照以下表格和附图对本发明做进一步的具体化说明。
表1描述了关于同源性猪CD40与人类CD40的非相同区域。
表2描述了关于同源性猪VCAM与人类VCAM的非相同区域。
表3描述了关于同源性猪CD86与人类CD86的非相同区域。
图1a为直接异种识别的图形化描述；图1b为间接异种识别的图形化描述。
图2描述了猪CD86的核酸顺序。
图3描述了通过反转录猪mRNA，继而使用PCR扩增得到的猪CD86的cDNA顺序。
图4描述了图2中的cDNA核苷顺序与已经发表的猪CD86顺序的比较。
图5描述了图2中的cDNA顺序与已经发表的鼠和人类CD86顺序的比较。
图6描述图2中cDNA的氨基酸翻译顺序与猪、人和鼠氨基酸顺序的比较。
图7描述了有关人和鼠B7.1核酸顺序的猪B7.1寡核苷酸引物的位置。
图8a描述了对于人，鼠和牛CD40核酸顺序的比较；图8b描述了对人，鼠和牛CD40氨基酸顺序的比较。
图9描述了用编码猪CD86(B7.2)的带菌者转染后，对CD86(B7.2)的表达的FACS(荧光激活细胞分类)分析。
图10描述了带有编码猪CD86(B7.2)的带菌者的瞬间转染细胞的CD86(B7.2)的表达的FACS(荧光激活细胞分类)分析。
图11描述了转染猪CD86(B7.2)的细胞的流式细胞测量术分析。
图12描述了在猪CD86(B7.2)序列中，9个CD86(B7.2)来源多肽的位置。
图13描述了对于整个卵清蛋白(ovalbumen)或卵清蛋白(ovalbumen)肽Ova323-339的T细胞增殖反应的比较。
图14a描述了通过肽ELISA(酶联免疫吸附)分析B7.2特异性肽血清或卵清蛋白(ovalbumen)调控血清的不同结合。
图14b描述了被B7.2来源肽4和6所免疫了的鼠血清对B7.2来源肽4和6的体外识别。
图15a描述了通过ELISA(酶联免疫吸附)分析B7.2肽血清和调控卵肽血清的识别。
图15b描述了通过肽4和6血清对直接鼠抗猪T细胞反应的抑制作用，肽4和6血清对鼠CD86的协同刺激没有移植作用。
图16描述了通过肽ELISA(酶联免疫吸附)分析B7.2来源肽4血清或卵调控肽血清的不同结合过程。
图17a描述了使用肽4或调控卵肽血清沾染后，再用猪CD86转染的P815细胞的流式细胞测量术分析。
图17b描述了使用从肽4或肽6中得到的鼠血清沾染鼠CD86后，再用鼠CD86转染猪CD86或CHO细胞，最后对使用鼠CD86或CHO转染的P815细胞进行FACS(荧光激活细胞分类)分析。
图18描述了从一种大白猪中分离的猪胰岛的制备方法。
图19是对镶嵌多肽的免疫接种以及移植步骤的一种概括性描述。
图20显示出抗猪CD86抗血清能够延长移植猪胰岛的存活时间。
图21是猪和人的CD40的氨基酸顺序的比较(标下划线的序列为在表1中已经辨认出的肽)。
图22使猪CD40的翻译后的氨基酸顺序(标下划线的序列为在表1中已经辨认出的肽)。
图23为猪和人VCAM的氨基酸顺序的比较(标下划线的序列为在表2中已经辨认出的肽)。
图24是猪VCAM的翻译后的氨基酸顺序(标下划线的序列为在表2中已经辨认出的肽)。
图25是猪和人CD86的氨基酸顺序的比较(标下划线的序列为在表3中已经辨认出的肽)。
图26是人CD86的翻译后的氨基酸顺序(标下划线的序列为在表3中已经辨认出的肽)。
5.详细具体的表述
5.1克隆猪协同刺激分子
5.1.1克隆猪B7-2
使用标准步骤，从初始化且变换了的猪细胞中提取RNA。mRNA随之反转录，猪B7-2(poB7-2)在56℃，1.5mM镁中，通过35个PCR循环从cDNA中扩增。5’和3’引物GCATGGATCCATGGGACTGAGTAACATTCTCTTTG和GCATGTCGACTTAAAAATCTG TAGTACTGTTGTC分别根据已发表的poB7-2序列(60)来设计，从而覆盖起始和终止密码子(图2)。一段956个碱基对的片段产生出来，并被次级克隆入p蓝本中的BamH1 & Sall限制区域。核苷序列通过使用标准m13正向和逆向引物来确定。通过与已发表的从猪(图4)，人和鼠B7-2(图5)而得到的序列的比较，单一克隆物，CD86(i)在图3中加以说明。从我们得到的克隆物CD86(i)和已发表的序列中检测到在3’引物端，有一个碱基对是不同的。但这似乎并不成为有关poB7-2表达或与其配体结合的很重要的区分点。图6展示了CD86(i)预期的氨基酸顺序，以及与猪，人和鼠的B7-2有关氨基酸顺序的比较。
5.1.2克隆猪B7-1和CD40
使用植物血球凝集素(PHA)或美洲商陆分裂素(PMW)刺激猪PBMC和转化了的猪内皮细胞，从中提取的RNA被用做扩增编码协同刺激分子B7-1和CD40的cDNA。在比较了鼠和人的有关序列(29，49)之后，B7-1引物根据保守区域而设计。外部的(位于编码区域外的)AGACCGTCTTCCTTTAG(3’i)，TTGGATCCTCCATGTTATCCC(3’ii)和AGCATCTGAAGC(5’)和内部的(位于编码区域内的)ATGGATCCTCCATTTTCCAACC(3’)和TTGTCGACATCTACTGGC(5’)引物已经象图7所描述的那样加以设计。产生两种3’引物是由于人和鼠在编码区域中的序列有着显著的差异。PCR的结果片段将按照上面所描述过的那样，通过使用包含在启动子顺序里的BamHI和SalI限制性区域而被再克隆。构件将被送出进行序列确认。
正如图8a和图8b所阐明的，在对人，鼠和牛(73，74，75)的已发表的CD40序列进行顺序排列后，使用类似的方法，CD40引物被设计出来。5’和3’引物序列为GGATCCTCACTGTCTCTCCTGCACTGAGATGCGACTCTCCTCTTTGCCGTCCGTCCTCC和GAATTCATGGTTCTGTTGCCTCTGCAGTG，分别包含BamHI和EcoRI限制性区域。
5.2表达细胞转染子的猪协同刺激分子的生成
poB7-2分子(CD869(i))已经被次级克隆至携带新霉素药物选择性标记的真核表达媒介pci.neo中。现在这正被用来转染通过标准的磷酸钙沉淀法转变的M1和M1.DR1转变鼠细胞系。G418拮抗pci.neo表达细胞将通过使用dynabead纯化方法加以选择，高度表达的克隆株群由限制性稀释法加以选择。通过这一步骤，稳定的poB7-2M1和P815转染子已经被制造出来。在这一步骤中，使用了Maher等人(图9)提供给我们的poB7-2 DNA构件。使用我们的CD86(i)(图10)已经产生出瞬间转染的M1和P815细胞。
在3个特别的化验中使用了CD86(i)转染细胞：(I)在MHC限制范围内的poB7-2和人B7-2的比较协同刺激功能。(II)在已赋予免疫性的小鼠血清中，使用流式细胞测量术分析方法分析特异性的抗poB7-2抗体。(III)特异性抗poB7-2单克隆抗体的生成。
(I)体外比较性分析是通过在人MHC二级(classII)分子HLA-DR1范围内，使用人或猪的响应子的增殖化验确定poB7-2或poB7-1的协同刺激功能来进行的，在DR1中含有人的B7-1或B7-2。
(II)在经受过嵌合肽免疫方法处理的获得免疫力的小鼠血清中检测猪抗B7-2抗体，转染的P815细胞是至关重要的试剂。使用对照或poB7-2转染的P815细胞进行的流式细胞测量术分析反映出血清对B7-2的特异性。在使用所有九种B7-2肽免疫的C57BL-6小鼠所进行的前期研究中，已经揭示出B7-2肽血清对猪B7-2转染P815细胞的优先性结合(图11a和图11b)。
(III)具有对poB7-2的特异性的MAb的产生是通过使用表达P815细胞的poB7-2，使Balb/c小鼠获得免疫性来完成的。免疫小鼠的脾脏通过与NSO融合伴侣融合，通过HAT选择方法的优点来选择成功的融合。使用培养液上清液对poB7-2P815转染子进行流式细胞测量术沾染，使得MAB分泌细胞能够被确认。细胞在培养中生长，在硫酸铵中沉淀后，通过G蛋白，从而对抗体进行纯化。制备单克隆抗体的技术在该领域是很普通的技术，可以参考《Harlow和Lane抗体》；《实验室手册》；《冷泉港实验室》等。
通过使用同样的方法，生产出具有对B7-1和CD40特异性的MAb。在对相关的猪组织中的CS分子的表达的进一步特征确定中，这些MAb将会提供很有价值的反应物。
5.3设计并合成poB7-2/OVA嵌合肽构件
来源于poB7-2的九种不同的肽最初被挑选用于合成。猪B7-2肽，6-22个单元大小，通过对B细胞抗原决定部位的大小的预计从而被选中。这些肽选来用做与T细胞抗原决定部位OVA323-339的结合的合成。B7-2肽根据计算机3D模型(与PaulTravers合作完成)以及使用SeqAid II计算机软件包所预测的抗原性亲水性来完成的挑选。所有九种不同的肽反映了线性的抗原决定部位。九种肽在克隆的poB7-2顺序中的位置被标明(图12)。合成肽的序列在表4中详细列出。
                    表4
肽名称             肽序列     位置
肽1  ISQAVHAAHAEINEAGRSFDQATWTLR     81-90
肽2  ISQAVHAAHAEINEAGRLPCHFTNSQ     32-40
肽3  ISQAVHAAHAEINEAGRKGPHGLVPIHQMS     109-121
肽4  ISQAVHAAHAEINEAGRGLVPIHQMS     113-121
肽5  ISQAVHAAHAEINEAGRVQIKDKGSYQC     94-104
肽6  ISQAVHAAHAEINEAGRCSSTQGYPEPQR     151-162
肽8  ISQAVHAAHAEINEAGRKSQAYFNETGEL     21-32
肽9  ISQAVHAAHAEINEAGRASLKSQAYFNET     17-29
肽10  ISQAVHAAHAEINEAGRYMGRTSFDQATWT     76-88
Ova肽 ISQAVHAAHAEINEAGR     323-339
肽的序列和肽1-10氨基酸位置与猪B7-2中的B7-2肽顺序有关。ova序列中氨基酸位置只与Ova肽有关。鸡蛋白蛋白中的一个17个氨基酸的肽，OVA323-339(ISQAVHAAHAEINEAGR)被选来用做T细胞抗原决定部位。这个抗原决定部位的选择是根据已经发表的报告中对H-2b限制性T细胞反应的生成(76，77)。我们已经证实，在用整个卵清蛋白免疫处理后，C57BL-6鼠(H-2b单倍体型)具有升高对两种天然的分子和对OVA323-339的增殖反应的能力(图13)。肽通过Genosys肽合成仪合成，粗产物肽通过HPLC纯化，使纯度大于70％。OVA对照免疫鼠的血清应该在理想化的状态下不识别323-339序列，表明T细胞抗原决定部位缺乏B细胞决定子。
5.4耐受性的引导
5.4.1体内耐受性的引导策略
对B57BL-6鼠使用CFA中的整体卵清蛋白免疫，既而使用对照肽(OVA肽)或CS肽(OVA-B7-2构件)进行3周的免疫接种处理。杀死鼠后收集其血液，使用常用方法制备血清。特异性鼠抗猪B7-2 IgG和/或IgMAb通过这两个步骤的其中之一而被检测到。
肽ELISA(酶联免疫吸附)被用于血清中抗肽抗体存在与否的筛选。肽依靠乙醛联结从而在平板上覆盖，使得Ab自由接触到肽(78)。平板用单个肽或对照卵蛋白覆盖，使得能够识别令人感兴趣的特异性肽。为了能够检测血清中用PoB7-2转染的P815细胞表面天然的B7-2分子表达的反应，在表面染色后使用了流式细胞测量术。在完成感兴趣的CS肽的识别后[肽ELISA(酶联免疫吸附)阳性且辨认出B7-2]，血清用来抑制体外T细胞增殖反应。这决定了抗体是否为阻断抗体。
通过使用胰岛移植系统开展了在体内的研究。具有识别自生分子但不能阻断增殖反应的抗体是非常有用的多克隆的反应物。
免疫接种使用了两组小鼠，一组接受混合的所有的九种B7-2肽，另一组接受卵对照肽。采集到的血清通过肽ELISA(酶联免疫吸附)(图14a或图14b)筛选，这使得能够识别令人感兴趣的肽。针对肽2，4和6的抗血清明确的表现出和卵对照相比，对B7肽的优先结合。血清还表现出对poB7-2转染细胞的增强结合(图11)。肽4和6被选做候选肽，用于随后的免疫步骤。使用肽4或6进行免疫接种，在免疫了的小鼠(图15a或图15b)血清中明确地在生成了特异性针对肽4和6的显著水平的IgG。针对肽4和6而不针对卵对照的特异性在图16中加以说明。使用肽4和6免疫的小鼠。其血清特异性识别猪B7-2转染的P815细胞表面所表达的自生猪B7-2分子的这种能力在图17a和17b中得到了说明。未被转染的P815对照细胞不使用肽4或6血清染色，无论是在对照还是用卵肽血清培养的转染细胞。在肽2中沿用相似的步骤。这些数据明确地表明这项技术在运用载体T细胞抗原决定部位后，生成直接对抗氨基酸序列的抗肽抗体的能力。
当编码猪CD40和猪B7-1分子的DNA序列被阐明之后，对于基于这些分子所设计的肽将采取与上面相同的策略。
5.4.2功能评估；胰岛异种移植存活时间的延长
非导管的胰岛异种移植完全地被T细胞所介导的机理所排斥(79，80)，因此，提供一个理想化的系统来研究T细胞介导反应的调节，请参看图18。胰岛中细胞介导的排斥反应的特性已经被阐明的非常清楚并且被报道的次数多于与之相比较的同种异体排斥反应(80)。
将猪的胰岛移植到小鼠身上是一个已确定的方法，在文献中已经有很多报道(80-83)。在这些实验室的研究中已经确认：腹膜内给药导致糖尿病的C57BL-6小鼠，在移植了来自大白猪的胰岛至肾囊下后，其高血糖症有所降低(图18)，请参见图19和图20。纯化全功能的胰岛要求进一步的优化的分离步骤(84，85)。在没有任何免疫抑制剂的情况下，移植后的胰岛通常存活6-10天。与合适的对照比较，胰岛的存活是否延长至超过10天，可以用来监测对直接T细胞介导异体排斥反应成功的调节。
迄今为止，用B7-2得到的数据，表明了在体内，联结一个已知的T细胞辅助子抗原决定部位的合成B7-2肽生成抗猪B7-2抗体产物的能力。这些抗体如果导向B7同种型和CD28之间的结合部位，再与导向以对抗CD40-CD40L的抗体相结合，将会通过直接抗猪异种反应来阻断人T细胞的协同刺激，从而延长在异种移植中胰岛的存活时间。
在确定了体内模型中，猪胰岛移植至鼠这一步骤的合理性后，在进行临床实验之前，研究将从猪发展到灵长类移植系统。
5.5这些策略为临床使用所做的改动为临床适用性，下列要求是必要的：
(I)选择合适的T细胞抗原决定部位来替代OVA。一个候选分子为破伤风毒素(TT)，它是一个在人免疫接种策略中被广泛使用的抗原(68，66)。在这个策略中，预先对绝大多数的成人使用TT进行免疫接种有一个额外的好处在于记忆T细胞已经存在于循环中了。
(II)采用有效且快速的筛选方法以检测在缺少由移植接受者产生的，通常会加速移植排斥反应的，特异性B7-2导致的T细胞反应的情况下，抗捐赠者(猪)B7-2抗体的存在。
6.一些特定的具体化的东西的总结
上面的例子是有关采取一个新的策略，通过使用猪细胞来抑制人T细胞对直接的抗猪异体反应的协同刺激。这在猪器官的异种移植中有着特别的重要性，这是由于存在有骨髓来源抗体的猪内皮细胞中的协同刺激分子的表达。
使用混杂的合成肽对器官接受者进行免疫，这些肽包含一个T细胞抗原决定部位，它与猪协同刺激分子CD80，CD86和CD40。肽通过诱导特异性针对协同刺激分子区域的抗体，从而能够阻断协同刺激的传送。这些协同刺激分子卷入了对人细胞(CD28和CD154)上自身反受体的结合。一旦抗体反应被诱导，由于协同刺激分子的表达，移植的器官将会重新引发这些反应，从而维持这些反应，并提供内源性的协同刺激阻断的机制。
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CD40
排列出了人和猪CD40蛋白序列并辨认出了非同源性区域。我们预测肽序列将会来源于些列在下边的区域，或者来源于任何在这些肽之间重叠的区域。
有兴趣预测出包含潜在的抗体抗原决定部位的序列，其选择的根据为序列一致性小于75％。
                    表1
    区域     位置  序列一致性比例
    i     25-48     63％
ii 49-75 74％
iii 93-114 59％
iv 123-139 63％
    v     158-176     68％
    vi     208-227     45％
    vii     231-248     21％
VCAM-1
排列出了人和猪VCAM-1蛋白序列并辨认出了非同源性区域。我们预测肽序列将会来源于些列在下边的区域，或者来源于任何在这些肽之间重叠的区域。
有兴趣预测出包含潜在的抗体抗原决定部位的序列，其选择的根据为序列一致性小于75％。
                 表2
    区域     位置   序列一致性比例
i 1-15 44％
ii 16-33 63％
iii 49-65 58％
iv 74-85 42％
    v     100-117     50％
vi     122-140     56％
vii     144-157     64％
viii     162-191     47％
ix 209-221 62％
    x     290-301     67％
xi     322-342     62％
xii     362-379     67％
    xiii     448-465     67％
CD86(B7-2)
排列出了人和猪CD86蛋白序列并辨认出了非同源性区域。我们预测肽序列将会来源于一些列在下边的区域，或者来源于任何在这些肽之间重叠的区域。
有兴趣预测出包含潜在的抗体抗原决定部位的序列，其选择的根据为序列一致性小于75％。
                表3
    区域     位置   序列一致性比例
    i     18-42     72％
    ii     55-73     55％
    iii     101-127     63％
    iv     136-165     56％
区域(iii)和(iv)包含了在小鼠中辨认出肽4和6的序列。

Claims (4)

1.一种组成物，包含一种免疫原，其特征在于所述免疫原具有一个T细胞抗原决定部位和一个B细胞抗原决定部位，其中B细胞抗原决定部位是GRGLVPIHQMS或GRCSSTQGYPEPQR。
2.根据权利要求1所述的组成物，其中所述T细胞抗原决定部位来源于破伤风毒素。
3.根据权利要求1或2所述的组成物，其中所述组成物进一步含有一种载体，能够增强针对所提到的免疫原所产生的免疫反应。
4.免疫原在制备用于改善对猪的异种移植的耐受性的药物中的用途，其中所述免疫原具有一个T细胞抗原决定部位和一个B细胞抗原决定部位，其中B细胞抗原决定部位是GRGLVPIHQMS或GRCSSTQGYPEPQR。
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